專利名稱：脂質(zhì)體懸浮液制造方法及含該法所制脂質(zhì)體懸浮液的產(chǎn)物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用以制造脂質(zhì)體懸浮液的方法，以及含有由該方法所制得的脂質(zhì)體懸浮液的產(chǎn)物(特別是脂質(zhì)體包封的藥物)。
背景技術：
自1960年代，英國的Alec D.Bangham博士揭示脂質(zhì)體的概念與技術以來，脂質(zhì)體已成為藥物傳遞系統(tǒng)技術領域中的一個重要研究目標。脂質(zhì)體主要由磷脂構成，主要是利用磷脂具有由非極性或疏水性的長形結構以及位于該長形結構的一端的極性或親水性的端部結構所造成的兩性特性，借此，可形成具有該親水性結構被包覆在內(nèi)的核心區(qū)域的膠粒。呈膠粒狀的脂質(zhì)體可具有小至20nm的粒徑，而于藥物制造上適用作為將具有生物活性的物質(zhì)帶入至人或動物體內(nèi)的載體。
脂質(zhì)體依粒徑以及包覆層數(shù)可被區(qū)分為粒徑落在大約0.1至1μm的范圍內(nèi)的多層胞囊(multilamellar vesicle，MLV)；粒徑落在大約0.1-1μm的范圍內(nèi)的寡層胞囊(oligolamellar vehicle，OLV)；粒徑落在20至100nm的范圍內(nèi)的單層小胞囊(small unilamellar vesicle，SUV)；粒徑約為1000nm的單層大胞囊(large unilamellar vesicle，LUV)；以及粒徑落在大約1至2μm的范圍內(nèi)并且內(nèi)部含有數(shù)個較小胞囊的大胞囊。有關脂質(zhì)體的一般性回顧，可以參見，例如R.R.C.New，ed.Liposomesa practical approach(1990)，Oxford。
關于脂質(zhì)體的制備，目前已知的方法有，例如，水合法、超聲法、透析與稀釋法、逆相蒸發(fā)法(參見，例如，US 4,235,871)、表面活性劑處理法、干燥水合法(dehydration-rehydration)或干燥水合法(dry-reconstitution)、凍結及融解法(參見，例如US 6,355,267)、孔擠壓法以及高壓均質(zhì)法等等(參見，例如，A.D.Bangham，M.M.Standish，J.C. Watkins，J.Mol.Biol.，13，238-252，1965；R.R.C.New，ed.Liposomesa practical approach(1990)，Oxford；G.Gregoriadis，ed.Liposome Technology，Vol.1，1993，CRC.，H.Talsma and D.J.A.Crommelin，Pharmaceutical Technology，96-106，Oct.1992)。在這些已知方法當中，孔擠壓法與高壓均質(zhì)法被認為較有產(chǎn)業(yè)上的潛力來供大規(guī)模制造脂質(zhì)體。而若進一步考慮經(jīng)濟效益，孔擠壓法被認為是更佳的選擇。
US 4,737,323公開了利用擠壓法來制造脂質(zhì)體懸浮液的方法，該脂質(zhì)體具有均勻的尺寸以及不大于0.4μm的平均粒徑，該方法包括下列步驟提供含有尺寸不一的脂質(zhì)體的懸浮液，該等脂質(zhì)體的主要部分具有大于1.0μm的尺寸；以及在加壓下使該懸浮液通過一個不對稱的陶瓷過濾器，該過濾器的內(nèi)表面孔徑大于所期望的平均脂質(zhì)體尺寸且不大于大約1.0μm。依據(jù)此件美國專利的揭示，將有機溶劑，例如該專利實施例1所示的氯仿用來溶解脂質(zhì)組份。接著，在真空或惰性氣體下將該有機溶劑除去，而形成由脂質(zhì)所構成的干薄膜。繼而將水性基質(zhì)加至該薄膜上以使脂質(zhì)膨脹開來，因而于該水性基質(zhì)內(nèi)形成尺寸不一的脂質(zhì)體。
授予Steven Lehigh的US 5,004,611與US 5,053,217揭示用以制備含有具生物活性的化合物的脂質(zhì)體的水性分散體的方法，其基本上由下列步驟所構成將呈重量比例為40∶1至1∶20的組份(a)至少一部分的雙層形成膜脂質(zhì)(bilayer forming membrane lipid)以及組份(b)至少一種基本上由作為該脂質(zhì)的溶劑的與水可互溶的有機液體所構成的非水性液體混合以足量的水，借此，脂質(zhì)體自發(fā)性地形成，該具生物活性的化合物是在水加入之前、當時或之后被加入，并且其最終存在的量足以使得該具生物活性的化合物的生物有效劑量被締合以脂質(zhì)體。依據(jù)這兩件美國專利的實施例1的揭示，首先在50～60℃下制備出預-脂質(zhì)體組合物(pro-liposome composition)，其中該脂質(zhì)組份(a)(例如卵磷脂)先被溶于該組份(b)(例如乙醇)內(nèi)；接著將水分成兩個部分來予以加入，其中第一個部分的水中可含有該具生物活性的化合物(例如葡萄糖)，而第二部分的水被用來制造出最后的配方。該預-脂質(zhì)體組合物經(jīng)過在氮氣下予以平衡后被冷卻至25℃，接著分兩個階段來加入磷酸鹽緩沖液并予以振蕩，如此即形成散浮有內(nèi)含該具生物活性的化合物的脂質(zhì)體的水性分散體。因此，依據(jù)此二件美國專利的揭示，所用的乙醇會以特定量被包含在所形成的脂質(zhì)體水性分散體內(nèi)。
授予Francis C.Szoka，Jr.的US 5,077,057、US 5,277,914以及US5,549,910公開了用以制造脂質(zhì)體懸浮液的方法，該脂質(zhì)體具有所界定的粒徑且包封有有用的化合物，該化合物于水、醇或鹵化烴溶劑內(nèi)展現(xiàn)出不良的溶解度。依據(jù)此三件美國專利的揭示，將溶解度不佳的化合物連同包封量的脂質(zhì)溶于非質(zhì)子性溶劑(諸如DMSO)內(nèi)，而若有需要，可額外地使用低級烷醇(例如乙醇)來幫助脂質(zhì)的溶解。接著將所形成的混合物擠壓或注射至合適的水性溶液內(nèi)并予以攪拌，即形成脂質(zhì)體懸浮液。所用的擠壓裝置可為注射筒、有孔的盤或管或其它可提供大約0.05～5mm的孔洞的合適裝置。特別地，此三件美國專利的實施例2例示阿霉素的包封，其中將阿霉素溶于DMSO內(nèi)，并將其加入至含有卵磷脂酰甘油(EPG)∶卵磷脂酰膽堿(EPC)∶膽固醇(7∶3∶6)的乙醇溶液內(nèi)。接著，將脂質(zhì)-阿霉素混合物在30℃下注射至由140mM NaCl-10mM Tris-HCl，pH4.0所構成的水相內(nèi)，繼而將所形成的脂質(zhì)懸浮液透析，并利用管柱層析法將被脂質(zhì)體包封的阿霉素分離出。此實施例所制得的脂質(zhì)體粒徑為227nm，且有41.2％的阿霉素被包封在脂質(zhì)體內(nèi)。
另外，對于含有親脂性、溶解性差的活性化合物(特別是具有如EP-A-560 138中所揭示的化學式的二氫吡啶化合物)的冷凍-干燥的脂質(zhì)體制劑，US 5,653,998(對應于TW 359616)公開了使用具有特定化學式的短鏈脂肪酸(含有不超過10個碳原子)或其鹽類作為穩(wěn)定劑，以供形成將該親脂性、溶解性差的活性化合物包封在磷脂膜內(nèi)的可供非經(jīng)腸道給藥穩(wěn)定的脂質(zhì)體藥物制劑。
于授予Martin C.Woodle等人的US 5,013,556中所揭示的脂質(zhì)體包含有1～20wt％的經(jīng)聚烷基醚(polyalkylether)予以衍生化的親水疏水兩親性脂質(zhì)，此可以經(jīng)聚乙二醇予以衍生化的磷脂酰乙醇胺為例。該經(jīng)衍生化的脂質(zhì)可以使脂質(zhì)體的循環(huán)期間增進數(shù)倍。
于授予Francis J.Martin等人的US 5,213,804的實施例10中進一步公開了利用US 5,013,556中所公開的脂質(zhì)體來制備阿霉素脂質(zhì)體，其中將選用的脂質(zhì)組份以選定的比例溶于氯仿內(nèi)，并添加配于氯仿/乙醇溶液內(nèi)的α-生育酚，然后除去氯仿溶劑而形成脂質(zhì)薄膜。該脂質(zhì)薄膜接著以含有1mM甲磺酸去鐵胺的125mM硫酸銨水溶液予以水合，而該水合處理借由使用液態(tài)氮與溫水浴的凍結及融解法進行。之后，進行擠壓處理來調(diào)節(jié)脂質(zhì)體的尺寸，繼而于5％的蔗糖溶液內(nèi)進行透析。接著將阿霉素溶液與經(jīng)透析的脂質(zhì)體制備物混合，并于60℃的水浴下予以振搖溫育，而使得阿霉素被包封于脂質(zhì)體內(nèi)。
授予Yechezkel Barenolz等人的US 5,192,549公開了將親水疏水兩親性藥物裝填至脂質(zhì)體內(nèi)的方法，其中包括在銨溶液內(nèi)形成脂質(zhì)體，隨后將存在于脂質(zhì)體的外部水相內(nèi)的銨移除或稀釋，因而于脂質(zhì)體的內(nèi)部與外部水相的間生成pH梯度，而使得該親水疏水兩親性藥物被攝入脂質(zhì)體內(nèi)，而且該親水疏水兩親性藥物存在于脂質(zhì)體內(nèi)部的最終量比存在于脂質(zhì)體外部的量高。
以上所提到的所有文獻、專利前案以及當中所引述的文獻的全部公開內(nèi)容在此引入本案以作為參考資料。
就申請人所知，在上述文獻或?qū)＠鞍钢兴_的方法中，有的在操作上涉及到氯仿或其它有毒的有機溶劑的移除；有的在溶液注射法(solvent injection)上有諸多限制而不利于無菌制劑的操作，特別是所采用的溶液轉(zhuǎn)速、注射速率、溶劑比例、注射針孔徑等操作條件都會非常容易地影響到微脂體的均一性以及品質(zhì)；有的在擠壓過程中會使操作壓力高達150～250psi，而更非為所期望的是擠壓速率非常低(約為0.1～0.2L/min)，若要付諸實際量產(chǎn)，這會使得制作過程冗長而完全不符合無菌針劑的生產(chǎn)要求。有鑒于上述文獻或?qū)＠鞍钢兴_的方法無一能應用于脂質(zhì)體懸浮液的大規(guī)模生產(chǎn)上，本領域仍存在有需要來開發(fā)快速且經(jīng)濟的方法以供脂質(zhì)體的大規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，為了能夠大規(guī)模生產(chǎn)脂質(zhì)體懸浮液，且不涉及有毒的有機溶劑的移除，在第一個方面，本發(fā)明提供一種用以制造脂質(zhì)體懸浮液的方法，其包括下列步驟(a)將下列組份加入至適量的醇溶劑中以形成混合物(i)選自下列的磷脂化合物卵磷脂、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇、神經(jīng)鞘磷脂(SM)、磷脂酸，前述化合物的二(C12-C18)?；苌?，以及它們的組合，(ii)膽固醇，以及(iii)選自下列的聚乙二醇衍生的化合物聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(mPEG-PE)，前述化合物的二(C12-C18)酰基衍生物，以及它們的組合，其中組份(i)、(ii)與(iii)的量呈5～10∶2～10∶1的摩爾比例，而且組份(i)、(ii)與(iii)的總量相對于該醇溶劑的量呈1∶5以上(w/v)的比例；(b)使得自步驟(a)的混合物直接與硫酸銨水溶液混合，其中該得自步驟(a)的混合物與該硫酸銨((NH4)2SO4)水溶液的量呈1∶2～10(v/v)的比例；(c)對步驟(b)所形成的混合物進行孔擠壓處理；(d)以5％～15％的蔗糖水溶液來透析從步驟(c)所得到的經(jīng)孔擠壓處理的混合物，借此，得到含有脂質(zhì)體粒子散浮在內(nèi)的脂質(zhì)體懸浮液。
由本發(fā)明的方法所制得的脂質(zhì)體懸浮液可用來包封親水疏水兩親性藥物，因此，在第二個方面，本發(fā)明提供一種用以制造脂質(zhì)體包封的藥物的方法，其包括下列步驟將選定的藥物與由上述方法所制得的脂質(zhì)體懸浮液混合，借此，將該親水疏水兩親性藥物包封在該脂質(zhì)體懸浮液中的脂質(zhì)體粒子內(nèi)。
本發(fā)明的其它目的、特征及優(yōu)點，在參照以下詳細說明與優(yōu)選實施例后，將變得明顯。
具體實施例方式
申請人發(fā)現(xiàn)，目前被本領域技術人員用來生產(chǎn)脂質(zhì)體懸浮液或脂質(zhì)體包封的藥物的方法，在制造過程上常常涉及到要將用來溶解脂質(zhì)組份的有害有機溶劑(諸如氯仿或DMSO等等)移除的步驟，且這些方法幾乎都無法做到脂質(zhì)體的大規(guī)模生產(chǎn)。為克服這些問題，申請人研究出一種改良方法，其在操作上不需要用到諸如氯仿或DMSO的有害有機溶劑，且其可大規(guī)模地生產(chǎn)出所期望的脂質(zhì)體懸浮液，進而供應用于選定藥物的包封。
于是，本發(fā)明提供一種用以制備脂質(zhì)體懸浮液的方法，其包括下列步驟(a)將下列組份加入適量的醇溶劑中以形成混合物(i)選自下列的磷脂化合物卵磷脂、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇、神經(jīng)鞘磷脂(SM)、磷脂酸，前述化合物的二(C12-C18)?；苌铮约八鼈兊慕M合，
(ii)膽固醇，以及(iii)選自下列的聚乙二醇衍生的化合物聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(mPEG-PE)，前述化合物的二(C12-C18)?；苌铮约八鼈兊慕M合，其中組份(i)、(ii)與(iii)的量呈5～10∶2～10∶1的摩爾比例，而且組份(i)、(ii)與(iii)的總量相對于該醇溶劑的量呈1∶5以上(w/v)的比例；(b)使得自步驟(a)的混合物直接與硫酸銨水溶液混合，其中該得自步驟(a)的混合物與該硫酸銨((NH4)2SO4)水溶液的量呈1∶2～10(v/v)的比例；(c)對步驟(b)所形成的混合物進行孔擠壓處理；(d)以5％～15％的蔗糖水溶液來透析從步驟(c)所得到的經(jīng)孔擠壓處理的混合物，借此，得到含有脂質(zhì)體粒子散浮在內(nèi)的脂質(zhì)體懸浮液。
在本發(fā)明的方法的步驟(a)中所用的醇溶劑是可與水互溶的無毒性醇溶劑，且優(yōu)選地選自脂族醇(諸如甘油、丙二醇)、乙醇、異丙醇、甲醇、乙二醇，以及它們的混合物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選具體例中，在本發(fā)明的方法的步驟(a)中所用的醇溶劑是乙醇。
優(yōu)選地，用于本發(fā)明的方法的步驟(a)中的組份(i)選自磷脂酰膽堿(PC)、二月桂酰PC、二肉豆蔻酰PC、二棕櫚酰PC、二硬脂酰PC(DSPC)、二油酰PC、二亞麻酰PC(dilinoleoyl PC)、1-棕櫚酰-2-油酰PC，以及它們的組合。在本發(fā)明的一個優(yōu)選具體例中，用于本發(fā)明的方法的步驟(a)中的組份(i)是DSPC。
優(yōu)選地，用于本發(fā)明的方法的步驟(a)中的組份(iii)選自PEG-2000-PE、PEG-3000-PE、PEG-4000-PE、PEG-5000-PE、mPEG-2000PE、mPEG-3000PE、mPEG-4000PE、mPEG-5000PE，前述化合物的二(C12-C18)酰基衍生物，以及它們的組合。
該等二(C12-C18)酰基衍生物的實例包括，但不限于，PEG-2000-DSPE、PEG-3000-DSPE、PEG-4000-DSPE、PEG-5000-DSPE、1，2-二酰基-SN-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]、1，2-二酰基-SN-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-3000]，其中該酰基是肉豆蔻酰、棕櫚?；⒂仓；蛴王！Ｔ诒景l(fā)明的一個優(yōu)選具體例中，用于本發(fā)明的方法的步驟(a)中的組份(iii)是PEG-2000-DSPE。
優(yōu)選地，用于本發(fā)明的方法的步驟(a)中的組份(i)、(ii)與(iii)的總量相對于該醇溶劑的量呈1∶5以上(w/v)的比例，且更優(yōu)選為1∶7～10(w/v)。
在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的具體例中，于本發(fā)明的方法的步驟(a)中，使用DSPC、膽固醇以及PEG-2000-DSPE來作為脂質(zhì)體粒子的構成組份并將它們?nèi)苡谝掖既軇﹥?nèi)。
本發(fā)明的方法的步驟(a)在45～70℃的溫度范圍下進行，優(yōu)選為55～65℃，更優(yōu)選為60℃。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選具體例中，將DSPC、膽固醇以及PEG-2000-DSPE溶于乙醇中，并于60℃的水浴內(nèi)均勻混合。
在本發(fā)明的方法的步驟(b)中，不像以往方法要使用注射器來將脂質(zhì)/有機溶劑混合物以小量分次地注射至水性溶液內(nèi)，以形成脂質(zhì)體散浮液，可在攪拌下將硫酸銨水溶液直接加入至得自步驟(a)的混合物內(nèi)，或是將得自步驟(a)的混合物直接加入至硫酸銨水溶液內(nèi)。
優(yōu)選地，本發(fā)明的方法的步驟(b)在45～70℃的溫度范圍下進行，優(yōu)選為55～65℃，更優(yōu)選為60℃。在此操作溫度下，于混合物內(nèi)初形成的脂質(zhì)體粒子的雙層脂質(zhì)膜結構是松散的，且該等脂質(zhì)體粒子會將少量的硫酸銨水溶液包封在內(nèi)。
優(yōu)選地，用于本發(fā)明的方法的步驟(b)中的硫酸銨水溶液的當量濃度為0.2～0.8N，更優(yōu)選為0.4～0.6N。
優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法的步驟(b)中，該得自步驟(a)的混合物與硫酸銨水溶液的量呈1∶2～10(v/v)的比例，更優(yōu)選為1∶4～8(v/v)。
優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法的步驟(c)中，該孔擠壓處理通過使步驟(b)所形成的混合物通過一個孔徑范圍為0.05～0.45μm的擠壓器而進行。
適用于本發(fā)明的擠壓器可為任一種可提供大約0.05～0.45μm的擠壓孔徑的注射筒、裝有過濾膜的過濾裝置、有孔的盤或管或是其它合適的裝置。該過濾膜可為陶瓷過濾膜或聚碳酸酯過濾膜。
優(yōu)選地，在本發(fā)明的方法的步驟(c)中，先使于步驟(b)所形成的混合物通過擠壓孔徑較大的過濾器，繼而通過擠壓孔徑較小的過濾器而進行兩階段的擠壓。在本發(fā)明的一個優(yōu)選具體例中，在所用的操作溫度(例如，60℃)下，先使于步驟(b)所形成的混合物通過擠壓孔徑為0.1μm的過濾器，繼而通過擠壓孔徑為0.05μm的過濾器而進行兩階段的擠壓。
優(yōu)選地，本發(fā)明的方法的步驟(d)是在環(huán)溫下進行，這時脂質(zhì)體粒子的雙層脂質(zhì)膜結構會變成緊密的，而使得被包封在脂質(zhì)體粒子內(nèi)的硫酸銨水溶液不會因為透析處理而從脂質(zhì)體粒子的內(nèi)部全部地流失至蔗糖溶液內(nèi)。
由本發(fā)明的方法的步驟(d)所得到的脂質(zhì)體懸浮液可被馬上應用，也可被直接低溫保存(例如，保存在5℃下)，或是經(jīng)冷凍干燥處理后再予儲存于低溫(例如，5℃)下以供日后使用。
與以往方法相較，依據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)體懸浮液制備方法可在相對低壓(約40～140psi)下進行，而使操作速率得以大幅提升(約為2～10升/分鐘)。因此，本發(fā)明能以快速且經(jīng)濟的方法來供脂質(zhì)體的大規(guī)模生產(chǎn)。
依據(jù)本發(fā)明的方法而被制得的脂質(zhì)體懸浮液可供應用于藥物、化妝品等產(chǎn)業(yè)上，特別是被用來包封選定的藥物，包括，但不限于，蒽環(huán)類抗生素、喜樹堿類抗癌藥。
因此，本發(fā)明也提供一種用以制造脂質(zhì)體包封的藥物的方法，其包括下列步驟使選定的藥物與由上述方法所制得的脂質(zhì)體懸浮液混合，借此，將該藥物包封在該脂質(zhì)體懸浮液中的脂質(zhì)體粒子內(nèi)。
優(yōu)選地，將依據(jù)本發(fā)明的方法制得的脂質(zhì)體懸浮液用來包封阿霉素、柔紅霉素、伊立替康以及長春瑞賓。
優(yōu)選地，該藥物以超過90μg藥物/μmol脂質(zhì)的量被包封在脂質(zhì)體內(nèi)，更優(yōu)選為120～180μg藥物/μmol脂質(zhì)。
優(yōu)選地，該藥物與脂質(zhì)體懸浮液的混合在45～70℃的溫度范圍下進行，優(yōu)選為55～65℃，更優(yōu)選為60℃。于該溫度下，脂質(zhì)體粒子的雙層脂質(zhì)膜結構會變成較松散的，而容許該藥物進入至脂質(zhì)體粒子的內(nèi)部，進而有可能與被包封在內(nèi)硫酸銨形成離子鍵。之后，將混合物降溫至環(huán)溫，這時脂質(zhì)體粒子的雙層脂質(zhì)膜結構即再度成為緊密的，借此，被包封在內(nèi)的藥物即不會滲漏出去。
優(yōu)選地，在進行藥物包封時，可同時使用制藥上可接受的添加劑，例如低溫防護劑，包括多元醇(諸如甘油)、單醣(諸如葡萄糖)、二醣(諸如蔗糖、乳糖、海藻糖)以及蛋白質(zhì)或氨基酸(諸如組氨酸)；穩(wěn)定劑，諸如抗氧化劑形式的穩(wěn)定劑，例如丁基化羥基苯甲醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、α-生育酚及其鹽類、抗壞血酸及其鹽類與酯類，優(yōu)選為抗壞血酸及其鹽類；pH-調(diào)節(jié)劑，諸如緩沖物、酸或堿，特別是抗壞血酸與氫氧化鈉；滲透活性劑，諸如甘油、甘露糖醇與葡萄糖。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選具體例中，將依據(jù)本發(fā)明的方法制得的脂質(zhì)體懸浮液用來包封阿霉素，同時使用組氨酸作為穩(wěn)定劑。
本發(fā)明將就下面實施例來作進一步說明，但應了解的是，這些實施例只為例示說明使用，而不應被解釋為本發(fā)明的實施的限制。
實施例實驗材料的制備A.硫酸銨水溶液將158g硫酸銨(Showa Co.，日本)加入至注射用水中并調(diào)節(jié)體積至6L，接著以Posydine(Whatman Inc.，德國)薄膜(142mm，0.22μm)予以過濾并保存在6℃下備用。在使用前，將該硫酸銨水溶液的溫度調(diào)節(jié)至60℃。
B.9％(w/w)蔗糖溶液將4500g蔗糖加入至適量注射用水中溶解并稀釋至50L，以Posydine薄膜(142mm，0.22μm)予以過濾后備用。
C.組氨酸-蔗糖溶液將12.6g的組氨酸一水合物(Ajinomoto Co.，日本)溶于90mL 9％的蔗糖溶液中，以1N NaOH將pH值調(diào)至6.2～6.6之間后，加入9％蔗糖溶液至300mL并混合均勻，繼而以Posydine薄膜(47mm，0.22μm)予以過濾后備用。
實施例1.脂質(zhì)體懸浮液的制備于一玻璃容器內(nèi)，將PEG-2000-DSPE(16g)(Genzyme Co.，美國)、膽固醇(15.2g)(NOF Co.，日本)以及DSPC(46.4g)(NOF Co.，日本)加入至600mL的乙醇內(nèi)，并在加熱至大約為60℃的溫度下混合，以使它們形成均勻混合液。
將上述混合液在大約60℃下持續(xù)攪拌，并直接加入4L的先前已備妥且溫度維持為60℃的硫酸銨水溶液中。所形成的混合物接著于60℃下使用1.5L過濾組(Advantec Toyo Kaisha，Ltd.，日本)來進行下列的孔擠壓處理(1)于該過濾組內(nèi)裝配一個0.1μm 142mm濾膜，并將混合物過濾10次；以及
(2)將一個0.05μm 142mm濾膜改裝配于該過濾組內(nèi)，再將混合物過濾10次，其中將擠壓壓力控制為3～10kg/cm2(流速約為2～10L/min)。
從上述孔擠壓處理所收集到4500mL的過濾液于環(huán)溫下利用一個30KD的空心管(Hollow Fiber，A/G Technology，UFP-30-C-6A，30,000NM，4800cm2)以及大約30L的先前已備妥的9％(w/w)蔗糖溶液來進行透析，而收集到容積約為3000mL的不含乙醇的脂質(zhì)體懸浮液。
產(chǎn)品品質(zhì)分析對于實施例1所制得的脂質(zhì)體懸浮液，取出樣品并以GC分析儀(Varian，Inc.，美國)來進行分析，結果顯示該樣品內(nèi)的脂質(zhì)體懸浮液不含乙醇；另取樣品并以Particle size analyzer(Beckman coulter，Inc.)來進行粒徑分析，檢測結果顯示該樣品內(nèi)所含有的脂質(zhì)體的平均粒徑為72.9nm。
實施例2.制備脂質(zhì)體包封的阿霉素將實施例1所得到的3000mL脂質(zhì)體懸浮液加入至一個內(nèi)裝有8000mg鹽酸阿霉素(紅色粉末)的玻璃容器內(nèi)，繼而加入200mL先前制備的組氨酸-蔗糖溶液。將所形成的混合物置于60℃的水浴中并振搖30分鐘。之后，將混合物冷卻至大約35℃，并以先前制備的9％蔗糖溶液稀釋至4L并混合均勻。由此即得到所期望的脂質(zhì)體包封的阿霉素。將所形成的產(chǎn)物進一步分裝于無菌玻璃小瓶中，而制作成含有2.0mg鹽酸阿霉素/mL的注射制劑。
產(chǎn)品品質(zhì)分析對于實施例2所制得的脂質(zhì)體包封的阿霉素注射制劑，觀察被封裝在玻璃小瓶內(nèi)的內(nèi)含物的色澤，結果發(fā)現(xiàn)這些玻璃小瓶都是包含外觀看來呈橘紅色至紅色的注射液。取適量樣品以HPLC分析儀(WatersCo.，美國)來進一步與標準品作比較，結果顯示測試樣品內(nèi)所含的鹽酸阿霉素的保留時間與洗脫圖譜(elution profile)跟標準品所具者一致。
另外分析實施例2所制得的脂質(zhì)體包封的阿霉素注射制劑的藥物包覆率，而發(fā)現(xiàn)測試樣品的藥物包覆率是為99.61％。而以Particlesize analyzer(Beckman coulter，Inc.)所進行的粒徑檢測顯示，樣品內(nèi)所含有的脂質(zhì)體平均粒徑為91.0nm。
將實施例2所制得的脂質(zhì)體包封的阿霉素注射制劑儲存于2～8℃下歷經(jīng)一段達30個月的期間后，這些制劑經(jīng)檢測試驗被確認是穩(wěn)定的(表1)，而且這些制劑在脂質(zhì)體的粒徑上也未產(chǎn)生明顯的變化。
表1.實施例2的脂質(zhì)體包封的阿霉素注射制劑的穩(wěn)定性濃度mg/mL粒徑大小(nm)時間在5℃±3℃下 在5℃±3℃下開始1.99±0.02 91.0±22.2第1個月 1.97±0.05 95.2±24.1第12個月1.95±0.07 90.4±18.3第24個月1.96±0.03 96.3±23.1第30個月1.98±0.01 93.3±26.6本說明書中引述的所有專利和文獻以其整體被引入本案作為參考資料。若有所沖突時，本案詳細說明(包含界定在內(nèi))將占上風。
雖然本發(fā)明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發(fā)明的范圍和精神的下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發(fā)明只受如隨文所附的權利要求所示者的限制。
權利要求
1.一種用以制備脂質(zhì)體懸浮液的方法，其包括下列步驟(a)將下列組份加入適量的醇溶劑中以形成混合物(i)選自下列的磷脂化合物卵磷脂、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇、神經(jīng)鞘磷脂(SM)、磷脂酸，前述化合物的二(C12-C18)?；苌铮约八鼈兊慕M合，(ii)膽固醇，以及(iii)選自下列的聚乙二醇衍生的化合物聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(mPEG-PE)，前述化合物的二(C12-C18)?；苌?，以及它們的組合，其中組份(i)、(ii)與(iii)的量呈5～10∶2～10∶1的摩爾比例，而且組份(i)、(ii)與(iii)的總量相對于該醇溶劑的量呈1∶5以上(w/v)的比例；(b)將得自步驟(a)的混合物直接與硫酸銨水溶液混合，其中該得自步驟(a)的混合物與該硫酸銨((NH4)2SO4)水溶液的量呈1∶2～10(v/v)的比例；(c)對步驟(b)所形成的混合物進行孔擠壓處理；(d)以5％～15％的蔗糖水溶液透析從步驟(c)所得到的經(jīng)孔擠壓處理的混合物，借此，得到含有脂質(zhì)體粒子散浮在內(nèi)的脂質(zhì)體懸浮液。
2.如權利要求1的方法，其特征在于其中步驟(a)中所使用的醇溶劑選自脂族醇、甘油、丙二醇、乙醇、異丙醇、甲醇、乙二醇，以及它們的混合物。
3.如權利要求2的方法，其特征在于其中步驟(a)中所使用的醇溶劑是乙醇。
4.如權利要求1的方法，其特征在于其中用于步驟(a)中的組份(i)選自磷脂酰膽堿(PC)、二月桂酰PC、二肉豆蔻酰PC、二棕櫚酰PC、二硬脂酰PC(DSPC)、二油酰PC、二亞麻酰PC、1-棕櫚酰-2-油酰PC，以及它們的組合。
5.如權利要求4的方法，其特征在于其中用于步驟(a)中的組份(i)是DSPC。
6.如權利要求1的方法，其特征在于其中用于步驟(a)中的組份(iii)選自PEG-2000-PE、PEG-3000-PE、PEG-4000-PE、PEG-5000-PE、mPEG-2000PE、mPEG-3000PE、mPEG-4000PE、mPEG-5000PE，前述化合物的二(C12-C18)?；苌?，以及它們的組合。
7.如權利要求6的方法，其特征在于其中用于步驟(a)中的組份(iii)選自PEG-2000-DSPE、PEG-3000-DSPE、PEG-4000-DSPE、PEG-5000-DSPE、1，2-二?；?SN-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]、1，2-二?；?SN-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-3000]，其中該?；侨舛罐Ⅴ?、棕櫚酰基、硬脂?；蛴王！?br> 8.如權利要求6的方法，其特征在于其中用于步驟(a)中的組份(iii)是PEG-2000-DSPE。
9.如權利要求1的方法，其特征在于其中在步驟(a)中，組份(i)、(ii)與(iii)的總量相對于該醇溶劑的量呈1∶7～10(w/v)的比例。
10.如權利要求1的方法，其特征在于其中在步驟(a)中，將DSPC用作組份(i)，將PEG-2000-DSPE用作組份(iii)，并將乙醇用作溶劑。
11.如權利要求1的方法，其特征在于其中步驟(a)在45～70℃的溫度范圍下進行。
12.如權利要求11的方法，其特征在于其中步驟(a)在55～65℃的溫度范圍下進行。
13.如權利要求11的方法，其特征在于其中步驟(a)在60℃的溫度下進行。
14.如權利要求1的方法，其特征在于其中步驟(b)在45～70℃的溫度范圍下進行。
15.如權利要求14的方法，其特征在于其中步驟(b)在55～65℃的溫度范圍下進行。
16.如權利要求14的方法，其特征在于其中步驟(b)在60℃的溫度下進行。
17.如權利要求1的方法，其特征在于其中用于步驟(b)中的硫酸銨水溶液的當量濃度為0.2～0.8N。
18.如權利要求17的方法，其特征在于其中用于步驟(b)中的硫酸銨水溶液的當量濃度為0.4～0.6N。
19.如權利要求1的方法，其特征在于其中在步驟(b)中，得自步驟(a)的混合物與硫酸銨水溶液的量呈1∶4～8(v/v)的比例。
20.如權利要求1的方法，其特征在于其中在步驟(c)中，該孔擠壓處理通過使步驟(b)所形成的混合物通過孔徑范圍為0.05～0.45μm的擠壓器而進行。
21.如權利要求20的方法，其特征在于其中在步驟(c)中，該孔擠壓處理使用選自下列的擠壓器可提供大約0.05～0.45μm的擠壓孔徑的注射筒、裝有陶瓷過濾膜或聚碳酸酯過濾膜的過濾裝置，以及有孔的盤或管。
22.如權利要求1的方法，其特征在于其中步驟(c)中的孔擠壓處理為包括下列的兩階段孔擠壓處理使步驟(b)所形成的混合物通過擠壓孔徑較大的過濾器，繼而通過擠壓孔徑較小的過濾器。
23.如權利要求22的方法，其特征在于其中步驟(c)中的孔擠壓處理為包括下列的兩階段孔擠壓處理使步驟(b)所形成的混合物通過擠壓孔徑為0.1μm的過濾器，繼而通過擠壓孔徑為0.05μm的過濾器。
24.如權利要求1的方法，其特征在于其中步驟(d)在環(huán)溫下進行。
25.如權利要求1的方法，其特征在于其中將步驟(d)所得到的脂質(zhì)體懸浮液進一步冷凍干燥。
26.一種用以制造脂質(zhì)體包封的藥物的方法，所述方法包括下列步驟使選定的藥物與由權利要求1至25中任一項的方法所制得的脂質(zhì)體懸浮液以一方式混合，借此，將該藥物包封在該脂質(zhì)體懸浮液中的脂質(zhì)體粒子內(nèi)。
27.如權利要求26的方法，其特征在于其中該選定的藥物選自蒽環(huán)類抗生素以及喜樹堿類抗癌藥。
28.如權利要求27的方法，其特征在于其中該選定的藥物選自阿霉素、柔紅霉素、伊立替康以及長春瑞賓。
29.如權利要求27的方法，其特征在于其中該選定的藥物是阿霉素。
30.如權利要求26的方法，其特征在于其中將該藥物與脂質(zhì)體懸浮液在45～70℃的溫度范圍下混合，繼而將混合物降溫至環(huán)溫，借此，將該藥物包封在該脂質(zhì)體懸浮液中的脂質(zhì)體粒子內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可以大規(guī)模地制造脂質(zhì)體懸浮液的方法，其中將三種選定的脂質(zhì)組份以預定的比例溶于醇溶劑內(nèi)，以形成混合物，接著以預定的比例將該混合物直接混合以硫酸銨水溶液對所形成的混合物進行孔擠壓處理(pore－extrusion treatment)，繼而以5％～15％的蔗糖水溶液來透析該經(jīng)孔擠壓處理的混合物，借此，得到含有脂質(zhì)體粒子散浮在內(nèi)的脂質(zhì)體懸浮液?？蓪⑷绱酥频玫闹|(zhì)體懸浮液用來包封選定的藥物，特別是鹽酸阿霉素(doxorubicin HCl)。
文檔編號A61K9/127GK1568939SQ03178458
公開日2005年1月26日 申請日期2003年7月17日 優(yōu)先權日2003年7月17日
發(fā)明者胡宇方, 黃堯焜, 林春綢, 康吉良 申請人:臺灣東洋藥品工業(yè)股份有限公司