專(zhuān)利名稱(chēng)：用于預(yù)防或治療由eNOS表達(dá)而引起的疾病的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種含有以下式(I)所示化合物或其藥用鹽作為活性成分的藥物 其中每個(gè)符號(hào)代表在下文中記載的定義，所述藥物有效預(yù)防或改善與eNOS增加有關(guān)的疾病或病理狀況，或者盡管eNOS蛋白的量和NO的產(chǎn)生是過(guò)量的或充足的卻仍進(jìn)展的病理狀況，其中所述預(yù)防或改善是通過(guò)抑制所述病理狀況的進(jìn)展或從所述病理狀況進(jìn)展得到恢復(fù)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，或者是通過(guò)恢復(fù)eNOS的最初功能從而增強(qiáng)針對(duì)所述疾病或病理狀況的治療效應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
背景技術(shù)：
已知血管內(nèi)皮是在血管緊張或血栓形成過(guò)程中起著重要作用的部位。1980年首次報(bào)道了存在著內(nèi)皮細(xì)胞舒血管因子(EDRF)。此后，在1987年，EDRF的身份被證實(shí)是一氧化氮(NO)。NO是在L-精氨酸通過(guò)NG-羥基-L-精氨酸被氧化成L-瓜氨酸時(shí)產(chǎn)生的。該反應(yīng)被稱(chēng)作NO合酶(NOS)的酶所催化。NOS存在于多種器官如血管內(nèi)皮、神經(jīng)系統(tǒng)、腎、血小板、心肌和平滑肌中。所產(chǎn)生的NO具有多種作用，并且在控制全身循環(huán)中起著重要的作用。
編碼NOS的基因已被克隆而且進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)NOS不僅具有與輔酶如鈣調(diào)蛋白(CaM)、黃素和NADPH的結(jié)合位點(diǎn)，而且還具有與(6R)-L-赤型-5，6，7，8-四氫生物蝶呤(在下文當(dāng)中被稱(chēng)作“BH4”)的結(jié)合位點(diǎn)，該化合物落入作為本發(fā)明的活性成分的式(I)中。而且，還提示BH4實(shí)際上參與對(duì)NOS功能的調(diào)控。也就是說(shuō)，NOS在有BH4存在的條件下通過(guò)偶聯(lián)形成二聚體，從而使NOS能夠產(chǎn)生NO(Kekkan(Blood Vessel)200124(2)，63-67)。到目前為止，公開(kāi)號(hào)為10-338637的日本專(zhuān)利公開(kāi)了BH4能夠激活NOS的功能從而提供了針對(duì)由于NOS功能減低而引起的疾病的預(yù)防或治療作用。同樣，公開(kāi)號(hào)為11-246410的日本專(zhuān)利公開(kāi)了BH4能夠激活NOS的功能從而提供了針對(duì)伴有與胰島素抵抗相關(guān)的血管功能異常的疾病的預(yù)防或治療作用。WO99/43324也公開(kāi)了BH4能夠激活NOS的功能從而提供了針對(duì)藥物腎病的預(yù)防或治療作用。
因此，在多種疾病如動(dòng)脈硬化、高脂血癥、心衰、高血壓和糖尿病中，內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張反應(yīng)減弱。已經(jīng)清楚NO通過(guò)降低心肌局部缺血的發(fā)生危險(xiǎn)或通過(guò)逆轉(zhuǎn)由這些疾病引起的運(yùn)動(dòng)耐受力降低而在改善這些疾病中發(fā)揮作用。而且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于NO的多種作用，NO與血管構(gòu)造的維持并進(jìn)一步與血管重建有著密切的關(guān)聯(lián)。已經(jīng)提出了NO有可能作為生物體內(nèi)的抗動(dòng)脈硬化因子。例如，據(jù)報(bào)道作為動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的內(nèi)皮NO合酶(eNOS)基因-缺陷小鼠(ApoE-KO/eNOS-KO)不能足量產(chǎn)生NO，而且在這種小鼠中動(dòng)脈硬化進(jìn)一步加快(Kuhlencordt PJ等，載脂蛋白E/內(nèi)皮氧化氮合酶雙敲除小鼠體內(nèi)加快的動(dòng)脈粥樣硬化、主動(dòng)脈動(dòng)脈瘤形成和缺血性心臟病，Circulation 2001；104448-454)。
然而，另一方面，已發(fā)現(xiàn)了動(dòng)脈粥樣硬化在ApoE-KO/eNOS-Tg(eNOS超表達(dá)小鼠)體內(nèi)也進(jìn)一步加速(美國(guó)心臟協(xié)會(huì)的科學(xué)會(huì)議，2001年11月16日。文摘號(hào)1312，內(nèi)皮氧化氮合酶的超表達(dá)加快了ApoE-缺陷小鼠體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化損傷發(fā)生)。
而且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)cNOS(構(gòu)成型NO合酶)在患有遺傳性高脂血癥的兔子(Watanabe可遺傳性高血脂兔WHHL)的動(dòng)脈粥樣硬化血管的內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)不但沒(méi)有在mRNA和蛋白質(zhì)水平降低，反而增加。由此認(rèn)為在動(dòng)脈粥樣硬化血管中內(nèi)皮-依賴(lài)性血管舒張反應(yīng)減弱的機(jī)理不是由NOS本身的減少而造成的(NO to Byotai/Chiryo(NO和病理狀況/治療)，第36頁(yè)，1995，Kawashima)。而且，據(jù)報(bào)道在動(dòng)脈粥樣硬化血管中減弱的內(nèi)皮-依賴(lài)性血管舒張反應(yīng)可伴有NO在其中產(chǎn)生增加(Harrison等，JCI 862109-2116，1990)。因此，還沒(méi)有弄清e(cuò)NOS的增加與NO之間的關(guān)系以及eNOS的增加與病理狀況之間的關(guān)系。
對(duì)于以下藥物來(lái)說(shuō)，據(jù)說(shuō)這些藥物通過(guò)增加eNOS基因的表達(dá)或穩(wěn)定eNOS mRNA而增加eNOS用于治療高脂血癥的他丁(statin)藥物(Laufs U等，通過(guò)HMG Co A還原酶抑制劑上調(diào)內(nèi)皮氧化氮合酶，Circulation 1998；971129-1135)、用于治療高血壓和心衰的ACE抑制劑、AT1拮抗劑(Onozato ML等，大鼠糖尿病腎病中的氧化應(yīng)激和氧化氮合酶ACEI和ARB的作用。Kidney Int.2002；61186-194)、Ca拮抗劑(Ding Y等，硝苯地平和地爾硫_而不是維拉帕米上調(diào)了內(nèi)皮氧化氮合酶的表達(dá)。J Pharmacol Exp Ther.2000；292606-609)等藥物。然而，這些藥物分別通過(guò)以下作用來(lái)顯示其藥效他丁藥物抑制3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)，ACE抑制劑抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，AT1拮抗劑拮抗血管緊張素受體以及Ca拮抗劑控制Ca離子通過(guò)Ca通道流入細(xì)胞內(nèi)。因此，這些藥物針對(duì)目標(biāo)疾病或病理狀況的效力不能歸因于通過(guò)增加eNOS基因表達(dá)或穩(wěn)定eNOS mRNA而增加eNOS的機(jī)制。
近幾年來(lái)，已經(jīng)進(jìn)行了將eNOS基因引入生物體內(nèi)，從而恢復(fù)或增強(qiáng)在血管中的NO產(chǎn)生能力的嘗試。Channon等顯示了將eNOS基因或nNOS基因引入兔體內(nèi)導(dǎo)致NO在動(dòng)脈粥樣硬化血管中產(chǎn)生血管舒張作用(Channon等，Circulation 981905-1911，1998)。
而且，Qian等顯示了當(dāng)eNOS基因被引入采用高膽固醇飲食喂養(yǎng)的兔子體內(nèi)時(shí)，細(xì)胞粘附因子的表達(dá)和炎癥細(xì)胞在頸動(dòng)脈血管中的浸潤(rùn)被降低(Qian等，Circulation 992979-2982，1999)。然而，有關(guān)這些發(fā)現(xiàn)的一些評(píng)論綜述指出，提出的只是短期和局部的效應(yīng)，而沒(méi)有進(jìn)行長(zhǎng)期和全身效果的研究。而且，Kawashima等已經(jīng)發(fā)現(xiàn)eNOS基因的過(guò)量表達(dá)進(jìn)一步加重動(dòng)脈粥樣硬化(美國(guó)心臟協(xié)會(huì)的科學(xué)會(huì)議，2001年11月16日，文摘號(hào)1312)。他們的發(fā)現(xiàn)表明存在著不可否認(rèn)的可能性，即如果實(shí)施eNOS基因療法來(lái)實(shí)現(xiàn)其治療效應(yīng)，eNOS基因的長(zhǎng)期表達(dá)或局部過(guò)量表達(dá)可能會(huì)使疾病進(jìn)一步惡化。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供一種不良作用可忽略不計(jì)的安全的治療劑，該治療劑激活增加的eNOS的功能，由此治療或預(yù)防由eNOS基因的表達(dá)產(chǎn)物不展示其固有功能的條件而引起的疾病或病理狀況。
此外，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種不良作用可忽略不計(jì)的安全的治療劑，該治療劑可被用作在治療多種疾病的方法中的第二種藥物，所述方法包括通過(guò)施用藥劑或基因療法使eNOS基因進(jìn)行表達(dá)或促進(jìn)eNOS基因的表達(dá)或穩(wěn)定eNOS mRNA來(lái)增加eNOS，通過(guò)其能力激活被表達(dá)的或被增加表達(dá)的eNOS的功能。
而且，本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種不良作用可忽略不計(jì)的安全的治療劑，該治療劑可被用作在治療多種疾病的方法中的第二種藥物，所述方法包括使eNOS基因進(jìn)行表達(dá)或促進(jìn)eNOS基因的表達(dá)，通過(guò)其能力長(zhǎng)期和/或持久地維持由表達(dá)或增加的表達(dá)所提供的療效。
就是說(shuō)，本發(fā)明致力于提供一種不良作用可忽略不計(jì)的安全的治療劑，該治療劑有效地預(yù)防或改善與下列狀況有關(guān)的疾病或病理狀況其中eNOS不展示其固有功能，或者當(dāng)eNOS蛋白的量是過(guò)量或足量時(shí)病理狀況進(jìn)展，或者所述治療劑在通過(guò)增加eNOS而治療疾病或病理狀況的過(guò)程中將eNOS產(chǎn)生NO的功能維持在良好狀況，從而所述治療劑提高了患者的日常生活質(zhì)量。
附圖的簡(jiǎn)要描述

圖1顯示在eNOS轉(zhuǎn)基因ApoE-缺陷小鼠(ApoE-KO/eNOS-Tg)體內(nèi)eNOS的過(guò)量表達(dá)；圖2顯示ApoE-KO/eNOS-Tg小鼠擴(kuò)大的損傷面積；圖3顯示通過(guò)施用BH4減小了ApoE-KO/eNOS-Tg小鼠的損傷面積；圖4顯示通過(guò)施用BH4，降低了用高膽固醇飲食飼養(yǎng)的ApoE-KO/eNOS-Tg小鼠的斑塊區(qū)域中超氧化物的產(chǎn)生；和圖5顯示通過(guò)施用BH4，顯著減少了ApoE-KO/eNOS-Tg小鼠體內(nèi)NO的產(chǎn)生。

發(fā)明內(nèi)容
生物體內(nèi)的eNOS通過(guò)產(chǎn)生NO在多種類(lèi)型的調(diào)節(jié)中起作用。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)eNOS發(fā)揮作用需要的條件是生物體內(nèi)NO和活性氧的濃度被維持在良好的狀態(tài)。他們還發(fā)現(xiàn)一旦失去這種良好狀態(tài)，eNOS不能充分地發(fā)揮其適當(dāng)?shù)拿缸饔?，或者即使其發(fā)揮了作用，生物體內(nèi)活性氧增加，而增加的活性氧加重處于治療當(dāng)中的疾病或?qū)е滦碌募膊?。就是說(shuō)，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)即使eNOS基因的表達(dá)和NO的產(chǎn)生是過(guò)量或充足的，過(guò)量的活性氧在疾病或病理狀況(例如動(dòng)脈硬化)加重的狀態(tài)下產(chǎn)生。
為了治療和/或預(yù)防上述疾病，本發(fā)明人已經(jīng)將注意力集中在NOS當(dāng)處于非偶聯(lián)形式(在該狀態(tài)下NOS不形成二聚體)時(shí)產(chǎn)生活性氧的事實(shí)上。然后，本發(fā)明人做了以下假設(shè)偶聯(lián)反應(yīng)(二聚體的形成)中所涉及的最重要因素BH4是一種能夠解決上述問(wèn)題的物質(zhì)。當(dāng)由于eNOS基因的過(guò)量或額外表達(dá)或eNOS mRNA的穩(wěn)定化而造成大量eNOS存在的時(shí)候，BH4的供給將出現(xiàn)短缺，即BH4的量變得不足。因此認(rèn)為，在這種條件下，NOS處于非偶聯(lián)形式并且產(chǎn)生活性氧。因此，本發(fā)明人認(rèn)為eNOS的功能可以通過(guò)施用BH4來(lái)恢復(fù)正常。
作為深入研究的結(jié)果，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)當(dāng)將BH4施用給由eNOS基因過(guò)量表達(dá)而引起的動(dòng)脈硬化或血管動(dòng)脈粥樣化的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型時(shí)，阻止了這些疾病的進(jìn)展。他們由此發(fā)現(xiàn)BH4對(duì)增加的eNOS的功能的激活作用可用于治療和預(yù)防由eNOS的增加而引起的疾病或病理狀況，從而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明涉及一種用于治療或預(yù)防由eNOS的增加而引起的疾病或病理狀況的藥物，該藥物含有一種由下式(I)表示的化合物或其藥用鹽作為活性成分
其中R1和R2各自代表一個(gè)氫原子，或R1和R2共同形成一個(gè)單鍵，當(dāng)R1和R2各自同時(shí)代表一個(gè)氫原子時(shí)，R3代表-CH(OH)CH(OH)CH3、-CH(OCOCH3)CH(OCOCH3)CH3、-CH3、-CH2OH或一個(gè)苯基，而當(dāng)R1和R2共同形成一個(gè)單鍵時(shí)，R3代表-COCH(OH)CH3。
由于eNOS的增多而導(dǎo)致eNOS不展示其固有功能的情形所引起的疾病或病理狀況的實(shí)例可包括(1)由于eNOS基因的異常表達(dá)而造成eNOS的過(guò)量表達(dá)所引起的疾病或病理狀況；(2)當(dāng)在基因治療過(guò)程中eNOS基因被從外引入時(shí)所觀察到的狀況(例如，當(dāng)對(duì)心血管疾病或動(dòng)脈硬化進(jìn)行治療時(shí))，并且在這種情況下，eNOS被過(guò)量表達(dá)或被表達(dá)的eNOS不展示其固有功能，因而不能得到預(yù)期的治療效果或病理狀況加重；和(3)當(dāng)通過(guò)施用他丁藥物、ACE抑制劑、AT1拮抗劑或Ca拮抗劑而增加的eNOS不展示預(yù)期的功能，從而不能得到治療效果或病理狀況加重時(shí)所觀察到的狀況。
本發(fā)明的藥物被用于治療性或預(yù)防性施用BH4來(lái)治療由于eNOS的增多而導(dǎo)致eNOS不展示其固有功能的狀況、其中eNOS基因過(guò)量表達(dá)的狀況或預(yù)計(jì)上述狀況會(huì)發(fā)生的情況；或者被用于與引入eNOS基因相聯(lián)合施用BH4。當(dāng)與引入eNOS基因相聯(lián)合施用該藥物時(shí)，該藥物可在引入基因之前，基本上同時(shí)或之后施用。該藥物的施用可以在引入基因后持續(xù)很長(zhǎng)的時(shí)間。
由于eNOS的增多或eNOS基因過(guò)量表達(dá)而引起eNOS不展示其固有功能從而需要本發(fā)明藥物的狀況形式將是心血管疾病、動(dòng)脈硬化、肺動(dòng)脈高血壓等。對(duì)于這些疾病，為了診斷在生物體內(nèi)eNOS是否過(guò)量表達(dá)或其是否發(fā)揮固有功能，可以采用組織化學(xué)的方法測(cè)定組織(例如，血管組織)中的活性氧含量。
為了與增加eNOS的藥物如他丁藥物、ACE抑制劑、AT1拮抗劑或Ca拮抗劑相結(jié)合施用本發(fā)明的藥物，可以在施用這些藥物之前、過(guò)程中或之后施用本發(fā)明的藥物，或者本發(fā)明藥物也可以作為與這些藥物的混合物施用。例如他丁藥物包括atrovastatin、flavastatin、simbastatin、米法斯丁等。ACE抑制劑包括阿拉普利、米達(dá)普利、依那普利、卡托普利、喹那普利、群多普利、培哚普利、雷米普利等。AT1拮抗劑包括氯沙坦等，以及Ca拮抗劑包括硝苯地平、地爾硫_等。這些藥物被用來(lái)抑制諸如動(dòng)脈硬化、高脂血癥、高血壓、心衰和缺血性心臟病這些疾病中的血管重建并且被用來(lái)治療糖尿病腎病。
作為本發(fā)明治療劑的活性成分的上述式(I)所示的化合物是已知的。已知它們用作惡性高苯丙氨酸血癥、抑郁癥、帕金森病以及其它疾病的治療劑。為了獲得進(jìn)一步的信息，參見(jiàn)例如日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)59-25323、59-76086、61-277618和63-267781。所述化合物能作為合適的鹽來(lái)使用。這種鹽的實(shí)例可包括藥理學(xué)上無(wú)毒的酸的鹽，所述藥理學(xué)上無(wú)毒的酸包括無(wú)機(jī)酸如鹽酸、磷酸、硫酸或硼酸，以及有機(jī)酸如乙酸、甲酸、馬來(lái)酸、富馬酸或甲磺酸。
作為本發(fā)明的活性成分的式(I)所示的化合物的具體實(shí)例包括下列化合物和其藥用鹽(6R)-L-赤型-5，6，7，8-四氫生物蝶呤(BH4) (6R，S)-5，6，7，8-四氫生物蝶呤，1’，2’-二乙?；?5，6，7，8-四氫生物蝶呤，
墨蝶呤， 6-甲基-5，6，7，8-四氫生物蝶呤， 6-羥甲基-5，6，7，8-四氫生物蝶呤，和 6-苯基-5，6，7，8-四氫生物蝶呤， 在上述化合物中，優(yōu)選的化合物是5，6，7，8-四氫生物蝶呤及其鹽。而且，在它們當(dāng)中，最優(yōu)選的化合物是BH4或其鹽。
本發(fā)明的治療劑是通過(guò)常規(guī)技術(shù)將式(I)所示的化合物與用于普通藥物制劑的載體混合，從而將其轉(zhuǎn)化成適于口、直腸和腸胃外(包括靜脈內(nèi)和脊柱內(nèi))給藥的藥劑而制得的。
用于藥物制劑的載體可以隨著劑型的不同而不同，但是這種載體的普通實(shí)例可以包括賦形劑、粘合劑和崩解劑。
賦形劑的典型實(shí)例包括淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和纖維素，粘合劑的實(shí)例包括聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、蔗糖、羥丙基纖維素和阿拉伯膠。崩解劑的實(shí)例包括淀粉、瓊脂、明膠粉、纖維素和CMC。然而，也可以使用除上述以外的其它賦形劑、粘合劑和崩解劑，只要它們是常用的。
除上述載體之外，本發(fā)明的治療劑優(yōu)選地含有用于穩(wěn)定活性成分的抗氧化劑。所使用的抗氧化劑可以適當(dāng)?shù)剡x自藥物制劑通常使用的那些抗氧化劑。所述抗氧化劑的實(shí)例可以包括抗壞血酸、N-乙酰半胱氨酸、L-半胱氨酸、dl-α-生育酚和天然生育酚。它們可以以穩(wěn)定所述活性成分(一種或多種類(lèi)型)所必需的量來(lái)使用。通常，抗氧化劑優(yōu)選地以相對(duì)于所述活性成分0.2至2.0∶1的重量比來(lái)使用。
適于口服的本發(fā)明藥物可以片劑、舌下片劑、膠囊、粉劑、粉狀藥物、顆粒劑或丸劑的形式來(lái)提供，或者以糖漿、乳液或在非水液體中的混懸劑如飲劑的形式來(lái)提供。
例如顆粒劑可以通過(guò)以下步驟來(lái)制備將一種或多種活性成分與一種或多種輔助成分如上述的載體、抗氧化劑均勻地混合在一起，將得到的混合物制粒并利用篩子調(diào)節(jié)粒徑。片劑可以通過(guò)對(duì)一種或多種活性成分與必要的一種或多種輔助成分一起進(jìn)行壓片或模壓來(lái)制得。膠囊可以通過(guò)以下步驟來(lái)制備將一種或多種活性成分與必要的一種或多種輔助成分均勻混合，從而獲得粉劑或顆粒劑，然后利用填充機(jī)等將該粉劑或顆粒劑填充到合適的膠囊中。適于直腸用藥的制劑可通過(guò)以下步驟來(lái)制備將活性成分與常用載體如可可脂混合，以便能夠以栓劑的形式來(lái)提供。腸胃外用藥的制劑可以通過(guò)將干燥固體形式的一種或多種活性成分包封到用氮清潔的無(wú)菌容器中來(lái)制備。這種干燥固體制劑可以分散或溶解在任意給定量的無(wú)菌水當(dāng)中以便對(duì)患者進(jìn)行腸胃外給藥。
在生產(chǎn)這些藥劑的過(guò)程中，上述抗氧化劑可以?xún)?yōu)選地被添加到活性成分和常用載體當(dāng)中。而且，如果需要，還可以向其中添加選自緩沖液、香味添加劑、表面活性劑、增稠劑、潤(rùn)滑脂和潤(rùn)滑劑中的一種或多種輔助成分。
有待施用的活性成分(即由式(I)所示的化合物)的量自然取決于用藥途徑、待治療的癥狀和待治療的患者，但是在任何情況下，用藥量將由醫(yī)師來(lái)確定。
例如，合適的劑量在0.1至50mg/kg(體重)/天范圍內(nèi)，通常優(yōu)選的劑量是在0.5至10mg/kg(體重)/天范圍內(nèi)。
所需劑量的上述活性成分可以每天用藥一次，或者可以以適當(dāng)?shù)拈g隔每天分成兩次至四次用藥。
用藥周期可以適當(dāng)?shù)芈?tīng)從醫(yī)囑，同時(shí)觀察采用本發(fā)明藥物治療的癥狀。當(dāng)本發(fā)明的藥物與被認(rèn)為增加eNOS的藥物如他丁藥物、ACE抑制劑、AT1拮抗劑或Ca拮抗劑共同施用時(shí)，本發(fā)明藥物的施用周期幾乎與這些藥劑的使用周期相同。然而，施用周期也可以被設(shè)置成比上述施用周期更長(zhǎng)或更短，并且該周期也包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
所述活性成分可以單一施用而不與其它成分混合。然而，為了容易地控制劑量或因?yàn)槠渌?，還可以根據(jù)待治疾病，將其它活性成分作為藥物施用。
而且，本發(fā)明的藥物可以含有選自L-精氨酸、黃素(例如FAD，F(xiàn)MN等)和鈣中的至少一種作為輔助活性成分，所述物質(zhì)是NOS的底物、輔酶或輔因子，以及作為活性成分的式(I)化合物。通過(guò)將這些活性成分進(jìn)行混合，可以預(yù)計(jì)能夠得到比單一使用式(I)化合物更為優(yōu)異的治療效果。對(duì)含在本發(fā)明藥物當(dāng)中的上述各種活性成分的比例沒(méi)有特別的限制。例如，選自L-精氨酸、黃素和鈣中的至少一種物質(zhì)與式(I)化合物的重量比可以是0.1至10，優(yōu)選地是0.5至2。
當(dāng)這種混合制劑被用于治療時(shí)，其合適的劑量范圍是0.1至50mg/kg(體重)/天的活性成分總量，并且優(yōu)選地是0.5至10mg/kg(體重)/天。
對(duì)于治療，考慮到年齡、癥狀等因素，醫(yī)師將適當(dāng)?shù)剡x擇使用哪種制劑；該制劑只含有式(I)化合物作為活性成分，或者該制劑含有上述化合物和其它活性成分。
本發(fā)明使用的活性成分最優(yōu)選地是(6R)-L-赤型-5，6，7，8-四氫生物蝶呤(BH4)或其鹽。然而，還可以使用其類(lèi)似物如(6R，S)-5，6，7，8-四氫生物蝶呤、1’，2’-二乙?；?5，6，7，8-四氫生物蝶呤、墨蝶呤、6-甲基-5，6，7，8-四氫生物蝶呤、6-羥甲基-5，6，7，8-四氫生物蝶呤、6-苯基-5，6，7，8-四氫生物蝶呤或其鹽。然而，不用說(shuō)，作為存在于生物體內(nèi)的天然物質(zhì)的BH4是優(yōu)選的。BH4二鹽酸鹽在大鼠中的急性毒性是對(duì)于口服而言2g/kg(體重)或者更高，因此，幾乎沒(méi)有發(fā)現(xiàn)毒性。另外，從日本專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)59-25323中對(duì)于治療帕金林病的描述中可以清楚看到，(6R，S)-5，6，7，8-四氫生物蝶呤即非旋光純物質(zhì)的毒性非常弱。因此，在本發(fā)明當(dāng)中也可使用該化合物用于治療。除了上述化合物之外的其他式(I)化合物幾乎不具有急性毒性。
本發(fā)明將在下列實(shí)施例中進(jìn)行進(jìn)一步的描述。然而，所述實(shí)施例的意圖并不在于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1(顆粒劑，丸劑)將1份(重量份)的聚乙烯吡咯烷酮(Coridon 30)溶于無(wú)菌純凈水中。然后，向其中加入10份的抗壞血酸和5份的L-半胱氨酸鹽酸鹽，從而獲得一種均相溶液。接著再向其中加入10份的BH4二鹽酸鹽從而得到一種均相溶液。
將所獲得的溶液加入59份的賦形劑(甘露醇或乳糖)和15份的崩解劑[玉米淀粉或羥丙基纖維素(LH-22)]。對(duì)該混合物進(jìn)行揉捏、制粒并干燥，然后用篩子分大小。
實(shí)施例2(片劑)將58份的乳糖和15份的微晶纖維素混合到實(shí)施例1中所述活性成分的均相溶液中。然后，再向其中加入1份的硬脂酸鎂，接著進(jìn)行混合，并將該混合物制成片劑。
實(shí)施例3(膠囊)將作為潤(rùn)滑劑的0.2％硬脂酸鎂混合到實(shí)施例1中所制備的顆粒劑中，然后將該顆粒劑填充到膠囊中。
實(shí)施例4(注射劑)BH4二鹽酸鹽 1.5g抗壞血酸 1.5gL-半胱氨酸鹽酸鹽 0.5g甘露醇6.5g將上述組分溶于無(wú)菌純凈水中從而制得100ml的溶液。對(duì)該溶液進(jìn)行滅菌，并將各1或2ml的溶液裝入小瓶或安瓿中，接著進(jìn)行凍干和密封。
實(shí)施例5(注射劑)在無(wú)氧條件下將2.0g的BH4二鹽酸鹽溶于無(wú)菌純凈水中從而制得100ml的溶液。對(duì)該溶液進(jìn)行滅菌，并以與實(shí)施例4相同的方式對(duì)該溶液進(jìn)行密封。
實(shí)施例6(栓劑)BH4二鹽酸鹽 150份抗壞血酸150份L-半胱氨酸鹽酸鹽50份將上述成分混合從而制得均質(zhì)粉狀物。然后將該粉狀物分散到9950份的可可脂中。
實(shí)施例7(顆粒劑)BH4二鹽酸鹽 5份抗壞血酸5份L-半胱氨酸鹽酸鹽2份將上述成分混合從而制得均相溶液。
將55份的甘露醇、1份的聚乙烯吡咯烷酮、14份的羥丙基纖維素和5份的L-精氨酸或鈣均勻地混合，并向其中加入上述溶液。對(duì)由此獲得的混合物進(jìn)行揉捏、制粒并干燥，然后用篩子分大小。
實(shí)施例8(顆粒劑)BH4二鹽酸鹽 5份抗壞血酸 5份L-半胱氨酸鹽酸鹽 5份甘露醇52份聚乙烯吡咯烷酮(Coridon 30)1份羥丙基纖維素(LH-22) 12份L-精氨酸或鈣 10份以與實(shí)施例7相同的方式使用上述成分，并進(jìn)行制粒和通過(guò)篩分類(lèi)分大小。
實(shí)施例9(顆粒劑)BH4二鹽酸鹽 5份抗壞血酸 5份L-半胱氨酸鹽酸鹽 2份將上述成分混合從而制得均相溶液。
將10份的L-精氨酸或鈣、50份的甘露醇、1份的聚乙烯吡咯烷酮(Coridon 30)和9份的羥丙基纖維素(LH-22)均勻地混合，并向其中加入上述溶液。對(duì)由此獲得的混合物進(jìn)行揉捏、制粒并干燥，然后用篩子分大小。
實(shí)施例10 eNOS表達(dá)的證實(shí)使eNOS轉(zhuǎn)基因小鼠與ApoE-缺陷小鼠(ApoE-KO純合子)進(jìn)行雜交，從而產(chǎn)生了一種eNOS轉(zhuǎn)基因ApoE-缺陷小鼠(ApoE-KO/eNOS-Tg)，該小鼠過(guò)量表達(dá)eNOS(美國(guó)心臟協(xié)會(huì)科學(xué)會(huì)議，2001年11月16日，文摘號(hào)1312)。eNOS轉(zhuǎn)基因ApoE-缺陷小鼠可以通過(guò)按照基因擴(kuò)增方法(PCR方法)擴(kuò)增eNOS基因并測(cè)定擴(kuò)增的基因量來(lái)進(jìn)行篩選。從12周齡的ApoE-KO/eNOS-Tg小鼠的主動(dòng)脈中提取蛋白質(zhì)，并通過(guò)免疫印跡，利用光密度計(jì)來(lái)測(cè)定eNOS的表達(dá)。結(jié)果見(jiàn)圖1。在該圖中，WT、eNOS-Tg、ApoE-KO和ApoE-KO/eNOS-Tg分別表示野生型、eNOS轉(zhuǎn)基因、ApoE-缺陷和eNOS轉(zhuǎn)基因ApoE-缺陷小鼠。該圖顯示6次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。星號(hào)表示相對(duì)于WT p＜0.01，十字符號(hào)表示相對(duì)于WT p＜0.05，以及雙十字符號(hào)表示相對(duì)于ApoE-KO p＜0.05。
結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因小鼠的eNOS蛋白質(zhì)的量明顯大于野生型小鼠，轉(zhuǎn)基因小鼠過(guò)量表達(dá)eNOS。
實(shí)施例11主動(dòng)脈竇的損傷面積(1)使實(shí)施例10中產(chǎn)生的37只小鼠(ApoE-KO/eNOS-Tg)在4周齡時(shí)斷奶，然后用高膽固醇飲食(1.25％膽固醇，7.5％可可脂，7.5％酪蛋白和0.5％膽酸鈉)喂養(yǎng)12周。
之后，將16周齡的小鼠用戊巴比妥麻醉，用含有10U/ml肝素的生理鹽水灌注主動(dòng)脈。此后，將對(duì)應(yīng)于從左心室中心至髂動(dòng)脈分叉部位的部分的主動(dòng)脈切除下來(lái)并用4％的低聚甲醛固定過(guò)夜。將周?chē)M織從切下來(lái)的主動(dòng)脈的遠(yuǎn)端(從主動(dòng)脈弓至髂動(dòng)脈分叉部位)除去。將主動(dòng)脈縱向切開(kāi)并固定在涂有硅酮的平皿上，然后用蘇丹III染色。利用NIH 1.61 Imaging軟件對(duì)所獲得的光學(xué)顯微鏡圖像進(jìn)行分析。損傷形成面積表示為損傷面積/主動(dòng)脈的總面積。結(jié)果見(jiàn)圖2。在該圖中，*代表相對(duì)于ApoE-KO雄性小鼠p＜0.0001，十字符號(hào)代表相對(duì)于ApoE-KO雌性小鼠p＜0.001。
發(fā)現(xiàn)在eNOS轉(zhuǎn)基因ApoE-KO小鼠體內(nèi)損傷面積增大而且由此促進(jìn)了動(dòng)脈硬化。
實(shí)施例12主動(dòng)脈竇的硬化損傷面積(2)每組使用6至8只實(shí)施例10中產(chǎn)生的小鼠(ApoE-KO/eNOS-Tg)。BH4非施用組采用高膽固醇飲食來(lái)飼養(yǎng)(參照實(shí)施例10)，而B(niǎo)H4施用組采用其中加入了10mg/kg/天的BH4的高膽固醇飲食來(lái)飼養(yǎng)。進(jìn)行與實(shí)施例11相同的實(shí)驗(yàn)，切除主動(dòng)脈并進(jìn)行同樣的圖像分析。結(jié)果見(jiàn)圖3。在該圖中，*代表相對(duì)于沒(méi)有施用BH4的雄性ApoE-KO/eNOS-Tg小鼠p＜0.05，十字符號(hào)代表相對(duì)于沒(méi)有施用BH4的雌性ApoE-KO/eNOS-Tg小鼠p＜0.01。
在施用了BH4的ApoE-KO/eNOS-Tg小鼠中，損傷面積減小，而且動(dòng)脈硬化得到了抑制。
實(shí)施例13超氧化物的產(chǎn)生分組，每組由6至8只小鼠(12周齡，ApoE-KO/eNOS-Tg)組成，其中按照與實(shí)施例12相同的方式用添加了BH4或沒(méi)有添加BH4的高膽固醇飲食將所述小鼠喂養(yǎng)8周。從這些小鼠身上切下主動(dòng)脈，去除周?chē)M織，將剩余部分放置在充滿了pH為7.4的PBS的黑硅酮平皿上。所述樣品被放在避光盒子中以避免外部光線的干擾，然后向盒腔內(nèi)加入MCLA直至終濃度達(dá)到20μm/L。接著，對(duì)MCLA(2-甲基-6-(4-甲氧基苯基)-3，7-二氫咪唑[1，2-a]吡嗪-3-酮-鹽酸鹽)與超氧化物陰離子間反應(yīng)所產(chǎn)生的光發(fā)射進(jìn)行5分鐘的測(cè)量。將該測(cè)量重復(fù)3次。
將光發(fā)射數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)中，所獲得的非線性灰度圖像被轉(zhuǎn)化成偽彩色圖像。利用WinLight 32軟件對(duì)由超氧化物所致的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行分析。斑塊區(qū)域定義為被蘇丹III染色的區(qū)域。從每只小鼠隨機(jī)選出約10個(gè)斑塊區(qū)域和10個(gè)非斑塊區(qū)域(0.0012-0002cm2)，接著進(jìn)行測(cè)量。從每個(gè)化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度中減去本底水平。圖4顯示通過(guò)將野生型小鼠的測(cè)量值設(shè)置在1.0而計(jì)算得到的結(jié)果，該結(jié)果顯示為相對(duì)值。該圖顯示了每組的6至10只小鼠的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。在該圖中，*代表相對(duì)于沒(méi)有施用BH4的ApoE-KO/eNOS-Tg小鼠p＜0.01。
在BH4施用組中，在以高膽固醇飲食飼養(yǎng)的ApoE-KO/eNOS-Tg小鼠中，斑塊區(qū)域中的超氧化物產(chǎn)生被顯著降低，因此表明BH4具有超氧化物抑制作用。
實(shí)施例14 NO的產(chǎn)生從每只用高膽固醇飲食喂養(yǎng)了8周的12周齡小鼠(ApoE-KO/eNOS-Tg)身上切下包含從主動(dòng)脈弓至髂動(dòng)脈分叉部位的部分的主動(dòng)脈。然后立即在pH為7.4的PBS中去除周?chē)糠?。將該樣品放置在充滿了含1.5mmol/L氯化鈣的磷酸鹽緩沖液(pH為7.4)的黑色平皿上，然后將該平皿放置在避光的盒子中從而避免外部光線的干擾。
向其中加入二氨基熒光素-2二乙酸酯(DAF-2 DA)直至終濃度達(dá)到10μmol/L。然后，將樣品置于室溫下5分鐘，接著用485nm的藍(lán)光進(jìn)行激發(fā)。利用裝備了中心為532nm的帶通濾波器的發(fā)光掃描儀檢測(cè)由DAF-2 DA與NO之間的反應(yīng)所產(chǎn)生的熒光，在515nm波長(zhǎng)的強(qiáng)度下進(jìn)行1秒鐘的測(cè)量。為了檢測(cè)由主動(dòng)脈內(nèi)皮產(chǎn)生的NO，將樣品在1μmol/L乙酰膽堿溶液中放置5分鐘，然后測(cè)定熒光圖像。完成每個(gè)實(shí)驗(yàn)后，為了確定被測(cè)定樣品是斑塊區(qū)域還是非斑塊區(qū)域，將該樣品進(jìn)行蘇丹III染色并觀察。將測(cè)量數(shù)據(jù)輸入到計(jì)算機(jī)中，并利用由NightO WL-顯像系統(tǒng)提供的WinLight 32軟件對(duì)非斑塊區(qū)域進(jìn)行分析。為了消除主動(dòng)脈的膠原纖維的非特異性光發(fā)射或反射，從DAF反應(yīng)后的測(cè)量值中減去本底測(cè)量值。隨機(jī)選取了至少10個(gè)非斑塊區(qū)域(0.0005至0.001cm2)，測(cè)定由于與NO反應(yīng)所產(chǎn)生的熒光。產(chǎn)生NO的量被表示為皮瓦/cm2。由內(nèi)皮產(chǎn)生的NO量通過(guò)以下方式來(lái)獲得從將樣品置于乙酰膽堿溶液后獲得的測(cè)量值中減去在樣品沒(méi)有被置于乙酰膽堿溶液中的條件下獲得的測(cè)量值。結(jié)果見(jiàn)圖5。該圖顯示6次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。在圖中，*表示相對(duì)于沒(méi)有施用BH4的ApoE-KO/eNOS-Tg小鼠p＜0.01。
在ApoE-KO/eNOS-Tg小鼠中，在被分析區(qū)域(非斑塊區(qū)域)中NO的產(chǎn)生明顯增加，因此表明BH4具有促進(jìn)NO產(chǎn)生的作用。
本發(fā)明的效果本發(fā)明提供了一種預(yù)防性或治療性藥物，該藥物有效對(duì)抗其中由于eNOS的增多而使得eNOS不發(fā)揮其原有功能的狀況、其中eNOS基因過(guò)量表達(dá)的狀況或由這種狀況引起的多種疾病。
權(quán)利要求
1.一種用于預(yù)防或治療由內(nèi)皮NO合酶(eNOS)的增加而引起的疾病或病理狀況的預(yù)防性或治療性藥物，該藥物含有由下式(I)表示的化合物或其藥用鹽作為活性成分 其中R1和R2各自代表一個(gè)氫原子，或R1和R2共同形成一個(gè)單鍵，當(dāng)R1和R2各自代表一個(gè)氫原子時(shí)，R3代表-CH(OH)CH(OH)CH3、-CH(OCOCH3)CH(OCOCH3)CH3、-CH3、-CH2OH或苯基，而當(dāng)R1和R2共同形成一個(gè)單鍵時(shí)，R3代表-COCH(OH)CH3。
2.如權(quán)利要求1所述的預(yù)防性或治療性藥物，其中由eNOS的增加而引起的疾病或病理狀況是心血管疾病。
3.如權(quán)利要求1所述的預(yù)防性或治療性藥物，其中由eNOS的增加而引起的疾病或病理狀況是動(dòng)脈硬化。
4.一種用于預(yù)防或治療由eNOS的增加而引起的疾病或病理狀況的惡化的預(yù)防性或治療性藥物，該藥物含有如權(quán)利要求1所述的化合物或其藥用鹽作為活性成分。
5.如權(quán)利要求4所述的預(yù)防性或治療性藥物，其中由eNOS的增加而引起的疾病或病理狀況是心血管疾病。
6.如權(quán)利要求4所述的預(yù)防性或治療性藥物，其中由eNOS的增加而引起的疾病或病理狀況是動(dòng)脈硬化。
7.一種用于提高針對(duì)由eNOS的增加而引起的疾病或病理狀況的治療效果的治療劑，該治療劑含有如權(quán)利要求1所述的化合物或其藥用鹽作為活性成分。
8.如權(quán)利要7所述的治療劑，其中針對(duì)由eNOS的增加而引起的疾病或病理狀況的治療效果被提供用于心血管疾病。
9.如權(quán)利要7所述的治療劑，其中針對(duì)由eNOS的增加而引起的疾病或病理狀況的治療效果被提供用于動(dòng)脈硬化。
10. 如權(quán)利要求1至9中的任一項(xiàng)所述的預(yù)防性或治療性藥物，其中R3是L-赤型-CH(OH)CH(OH)CH3。
11.如權(quán)利要求1至10中的任一項(xiàng)所述的預(yù)防性或治療性藥物，其中eNOS的增加是由eNOS基因表達(dá)的增加所引起的。
12.如權(quán)利要求1至11中的任一項(xiàng)所述的預(yù)防性或治療性藥物，其中eNOS的增加與eNOS基因的引入有關(guān)。
13.如權(quán)利要求1至11中的任一項(xiàng)所述的預(yù)防性或治療性藥物，其中eNOS的增加是由施用促進(jìn)eNOS增加的藥物所引起的。
14.如權(quán)利要求1至11中的任一項(xiàng)所述的預(yù)防性或治療性藥物，其進(jìn)一步含有促進(jìn)eNOS增加的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種不良作用可忽略不計(jì)的安全的治療劑，該治療劑激活eNOS以使其最佳地發(fā)揮作用，并由此治療或預(yù)防由于eNOS基因的表達(dá)產(chǎn)物不展示其固有功能的情況所引起的疾病或病理狀況。更具體地，本發(fā)明涉及一種用于治療或預(yù)防由eNOS的增加而引起的疾病或病理狀況的藥物，該藥物含有由右式(I)表示的化合物或其藥用鹽作為活性成分，其中R
文檔編號(hào)A61K31/525GK1533277SQ0380056
公開(kāi)日2004年9月29日 申請(qǐng)日期2003年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月22日
發(fā)明者川島成乃亮, 橫山光宏, 宏 申請(qǐng)人:第一三得利制藥株式會(huì)社