專利名稱：應(yīng)用抗體分子對腫瘤血管進行選擇性定向的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用抗體分子對腫瘤血管系統(tǒng)進行定向(targeting)。特別的，本發(fā)明涉及與纖連蛋白的ED-B結(jié)合且被證實其能用于腫瘤定向的抗體分子的用途。在本發(fā)明的不同的實施方案中，采用了不同分子形式的抗體分子。在某些實施方案中，抗體分子包括人IgG1。在其他的實施方案中，抗體分析是小免疫球蛋白(mini-immunoglobulin)，例如通過將scFv抗體分子融合到在COOH末端天然地含有半胱氨酸的分泌型IgE異構(gòu)體的恒定CH4結(jié)構(gòu)域生成這種小免疫球蛋白，這形成一個共價連接的二聚體。在例如腫瘤定向的本發(fā)明的不同方面和實施方案中利用了血漿清除率、體內(nèi)穩(wěn)定性和其他有用的特性。根據(jù)臨床的需要和疾病，可以將不同抗體分子形式的不同的體內(nèi)特性用于不同的診斷和/或治療目的。
由于非人源化的單克隆抗體具有免疫原性(1 Shawlert et al.，1985；2Miller et al.，1983)、差的藥代動力學(xué)特性(3 Hakimi et al.，1991；4 Stephenset al.，1995)以及對所補充的效應(yīng)物功能無效(5 Riechmann et al.，1988；6Junghens et al.，1990)，因此盡管它們具有用作治療藥物的巨大潛能，但是在臨床試驗中很少地采用非人源化的單克隆抗體(mAbs)。最近對來源于噬菌體展示庫的分離的人抗體片段的研究解決了這些問題，再次激活了這些研究并再燃起利用這些藥物治療重大疾病的希望。事實上，這些分子可用作新的診斷和治療工具的理想構(gòu)架(11 Reichert，2001；12 Huls etal.，1999)。此外，這些抗體可以被“成熟”為達到(即使沒有必要，但也至少是合意的)用于臨床的微微摩爾范圍內(nèi)的親和力(13 Pini et al.，1998)。
然而，用于選擇性轉(zhuǎn)送診斷劑或治療劑的人抗體片段的臨床應(yīng)用需要高度特異的靶。對于腫瘤，最常用的靶是細胞表面抗原，但它常既不豐富也不穩(wěn)定。而在腫瘤進展過程中，腫瘤周圍的微環(huán)境發(fā)生了巨大的改變，它形成了具有用于基于抗體的腫瘤治療的靶的“腫瘤環(huán)境”(14Neriand Zardi，1998)。事實上，變化的腫瘤微環(huán)境本身是個可以被定向的致癌物的概念正逐漸成為一致的意見。因此，能有效地將治療藥物轉(zhuǎn)送到腫瘤微環(huán)境的分子代表著腫瘤治療的有希望的和重要的新工具(15 Bissel，2001；14 Neri and Zardi，1998)。
纖連蛋白(FN)是一種細胞外基質(zhì)(ECM)成分，它廣泛地表達于各種正常的組織和體液中。通過對FN前mRNA(pre-mRNA)的不同的剪切可以生成不同的FN異構(gòu)體，這個過程是被細胞因子和細胞外pH值所調(diào)節(jié)的(16 Balza et al.，1988；17 Carnemolla et al.，1989；18 Borsi et al.，1990；19 Borsi et al.，1995)。FN分子可以完全地包含或不包含完整的III型重復(fù)ED-B，也稱為外型III型重復(fù)B(EIIIB)(20 Zardi et al.，1987)。ED-B在不同的物種中是高度保守的，因此在廣泛被研究的哺乳動物中有著100％同源性(人、兔、鼠、狗)以及與雞的相似結(jié)構(gòu)域有著96％同源性。在正常成人組織中免疫組化不能測定到含有ED-B的FN異構(gòu)體(B-FN)，除非是遭受生理重建(例如，子宮內(nèi)膜和卵巢)及傷口愈合期間的組織(17 Carnemolla et al.，1989；21ffrench-Constant，et al.，1989)。相反的，它在腫瘤和胎兒組織中是高表達的(17 Carnemolla et al，1989)。此外，已經(jīng)證實B-FN是血管生成的標記物(22 Castellani et al.，1994)以及內(nèi)皮細胞沿著含有B-FN的ECM纖維游走并侵入腫瘤組織(23 Tarli et al.1999)。
已經(jīng)描述了應(yīng)用特異于BF-N異構(gòu)體(24 Carnemolla et al.，1996；23Tarli et al.，99；25 Viti et al.，99；26 Neri et al.，97；27 Demartis et al.，2001)的人重組抗體，scFv(L19)(13 Pini et al.，98)對腫瘤血管進行選擇性定向?？贵w可應(yīng)用于將治療性放射性核素或毒性物質(zhì)選擇性轉(zhuǎn)送到腫瘤血管的體內(nèi)診斷性(免疫閃爍描繪術(shù))和治療性方法中。另外，Birchler et al.(28 1999)顯示將化學(xué)結(jié)合于光敏劑的scFv(L19)選擇性地聚集于血管生成的鼠角膜模型的新生的血管中，在用近紅外線照射后，它導(dǎo)致了眼新生血管的完全和選擇性阻塞。
更最近的，Nilsson et al.(29 2001)報道了scFv(L19)與組織因子的細胞外結(jié)構(gòu)域的免疫綴合物介導(dǎo)了不同類型的鼠腫瘤模型的選擇性梗死。此外，scFv(L19)和IL-2或IL-12的融合蛋白已經(jīng)顯示出增強了這兩種細胞因子的治療作用(30 Halin et al.，submitted；31 Carnemolla et al.，2002)。也可參見WO01/62298中融合蛋白在包括腫瘤的病理性血管發(fā)生病變治療上的用途。最后，既然L19與鼠及人的ED-B有著同等好的反應(yīng)，因此它可以被用于臨床前和臨床研究。
也見于PCT/GB97/01412、PCT/EP99/03210、PCT/EP01/02062和PCT/IB01/00382。
不同的抗體形式已經(jīng)顯示在體內(nèi)穩(wěn)定性、清除率和對腫瘤定向的作用上有著不同的特性(32 Wu et al.，2000)。Li(33 Li et al.，1997)描述了小免疫球蛋白或小免疫蛋白(SIP)。
本發(fā)明涉及scFv、小免疫球蛋白和完整IgG1等不同形式的L19人抗體分子的制備、特征以及體內(nèi)生物分布的研究。


圖1顯示了舉例說明不同蛋白結(jié)構(gòu)的模型。AFN亞基的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的模型。用灰色顯示了進行選擇性剪切的蛋白序列。如所示的，重組抗體L19的抗原決定簇定位于重復(fù)ED-B內(nèi)。B-D相應(yīng)地用于表示L19(scFv)(B)、L19-SIP(C)、和L19-IgG1/κ構(gòu)建體的圖解。
圖2顯示了SK-MEL-28瘤在裸鼠中的生長曲線(三角)以及F9瘤在129小鼠品系中(圓圈)的生長曲線。繪制了體積(mm3)對時間(天)的曲線。每個數(shù)據(jù)點為六只鼠的平均值±SD。
圖3顯示了不同的L19形式的體積排阻(size exclusionchromatography)色譜的結(jié)果。在圖A、B和C中相應(yīng)地顯示了在放射性碘標記后L19形式的scFv、小免疫球蛋白及IgG1的體積排阻色譜值(Superdex 200)。圖D、E和F相應(yīng)地顯示了靜脈注射放射性碘標記的L19形式的scFv、小免疫球蛋白及IgG1后的所示時間內(nèi)血漿的體積排阻色譜值(Superdex 200)。在注射后的不同時間點，被測血漿中L19-SIP或L19-IgG1的曲線值沒有測定到變化，而在注射L19(scFv)2后3h觀察到了更高分子量的第二個峰。
圖4顯示了用不同的放射性碘標記的L19抗體分子形式在SK-MEL-28腫瘤負荷鼠的生物分布試驗的結(jié)果。報告了在i.v.注射后的所示時間內(nèi)腫瘤內(nèi)(圖4A)和血液內(nèi)(圖4B)％ID/g的差異。在圖4C中繪制了腫瘤-血％ID/g比例曲線。L19(scFv)曲線用棱形表示，而L19小免疫球蛋白曲線用正方形表示，以及L19 IgG1用三角形表示。
圖5顯示了用放射性碘標記的L19(scFv)(正方形)與L19小免疫球蛋白(棱形)在F9腫瘤負荷鼠的生物分布試驗結(jié)果。報告了在i.v.注射后的所示時間時腫瘤內(nèi)(A)和血液內(nèi)(B)％ID/g的差異。
在一個方面，本發(fā)明提供了一種與人纖連蛋白的ED-B結(jié)合的特異性結(jié)合構(gòu)件(member)，它包括L19 VH結(jié)構(gòu)域和一個VL結(jié)構(gòu)域、任意的一個L19 VL結(jié)構(gòu)域，并且其中特異性結(jié)合構(gòu)件包含包括與εs2-CH4融合的所述抗體VH結(jié)構(gòu)域和抗體VL結(jié)構(gòu)域并二聚體化的小免疫球蛋白，或包含整個IgG1抗體分子。
在Pini et al.(1998)J.Biol.Chem.27321769-21776中揭示了L19 VH結(jié)構(gòu)域和L19 VL結(jié)構(gòu)域的序列，Pini et al.的這些序列在此完全并入作為參考。
通常地，一個VH結(jié)構(gòu)域與一個VL結(jié)構(gòu)域的配對提供了一個抗體的抗原結(jié)合位點。在一個優(yōu)選的實施方案中，L19 VH結(jié)構(gòu)域與L19 VL結(jié)構(gòu)域配對，因此形成了包括L19 VH與L19 VL結(jié)構(gòu)域的抗體的抗原結(jié)合位點。在其他的實施方案中，L19 VH與除L19 VL以外的其他VL結(jié)構(gòu)域配對。輕鏈的雜亂性(promiscuity)在本領(lǐng)域是熟知的。
可以從L19 VH或VL結(jié)構(gòu)域得到一個或更多個CDR并將其結(jié)合到合適的框架中。下面將進一步地討論這個問題。SEQ ID NO.1、2、和3相應(yīng)地顯示了L19 VH CDR 1、2、和3。SEQ ID NO.1、2、和3相應(yīng)地顯示了L19 VL CDR 1、2、和3。
在此展示了VH和VL結(jié)構(gòu)域的變體以及它們的CDR的序列，它們可以應(yīng)用于針對ED-B的特異性結(jié)合構(gòu)件中，利用序列變更或突變以及篩選方法的方式可以生成這些變體。
如所討論的，根據(jù)本發(fā)明可以采用任一VH和VL結(jié)構(gòu)域的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列變體，在此特異性地闡述了它們的序列。特殊變體可以包括一個或多個氨基酸序列變更(一個氨基酸殘基的添加、缺失、取代和/或插入)，可以是小于20個變更、小于15個變更、小于10個變更或小于約5個變更、4、3、2或1個變更。變更可以發(fā)生于一個或多個框架區(qū)域和/或一個或多個CDR。
根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合構(gòu)件可以是與能結(jié)合于ED-B并包含L19VH結(jié)構(gòu)域和L19 VL結(jié)構(gòu)域所形成的抗原結(jié)合位點的特異性結(jié)合構(gòu)件競爭性結(jié)合抗體的構(gòu)件。體外容易測定結(jié)合構(gòu)件之間的競爭，例如利用ELISA和/或通過將特殊的報告分子標記于結(jié)合構(gòu)件，并在存在有其他非標記的結(jié)合構(gòu)件時測定該標記的構(gòu)件，這樣能鑒別與相同的抗原決定簇或重疊的抗原決定簇相結(jié)合的特異性結(jié)合構(gòu)件。
因此，本明的進一步的方面采用了含有人抗體的抗原結(jié)合位點的特異性結(jié)合構(gòu)件，它與L19競爭性結(jié)合到ED-B。
根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合構(gòu)件至少可以以L19的親和力與ED-B結(jié)合，在適當?shù)臈l件下可以比較不同的結(jié)合構(gòu)件的結(jié)合親和力。
除了抗體序列，根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合構(gòu)件可以包括其他的氨基酸，例如形成肽或多肽，例如折疊結(jié)構(gòu)域、或是賦予分子除了與抗原結(jié)合的能力外的其他功能特征。本發(fā)明的特異性結(jié)合構(gòu)件可以具有可測定的標記物，或可以綴合一種毒素或酶(例如通過肽鍵或連接體)。
對于病理性血管生成疾病或病變的治療，本發(fā)明的特異性結(jié)合構(gòu)件可以綴合一種毒素分子，例如一種殺生物劑分子或細胞毒性分子，它們可以選自白介素-2(IL-2)、阿霉素、白介素-12(IL-12)、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)以及組織因子(優(yōu)選的為截斷的組織因子(truncated tissue factor)，例如殘基1-219)。見，例如WO01/62298。
在更多的方面，本方面提供了一種包含編碼根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合構(gòu)件的序列的分離的核酸，以及制備特異性結(jié)合構(gòu)件的方法，它包括在能生成所述特異性結(jié)合構(gòu)件并將其回收的條件下表達所述核酸。
根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合構(gòu)件可以用于人體或動物體的治療或診斷方法，例如治療(可以包括預(yù)防性治療)人患者的疾病或病變的方法，包括給所述患者施用有效量的本發(fā)明的特異性結(jié)合構(gòu)件。根據(jù)本發(fā)明的治療病變包括腫瘤，尤其是實體瘤，以及其他的病理性血管生成病變，包括類風濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性、以及血管瘤。
在另一個方面，提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明的特異性結(jié)合構(gòu)件的方法，該方法包括引起編碼核酸的表達。這樣一種方法可以包括在生產(chǎn)所述特異性結(jié)合構(gòu)件的條件下培養(yǎng)宿主細胞。
生產(chǎn)方法可以包括產(chǎn)物的分離和/或純化步驟。
生產(chǎn)方法可以包括將產(chǎn)物加工成含有至少一種附加成分例如藥用可接受賦形劑的組合物。
下面進一步地詳細闡述了本發(fā)明的這些和其他的方面。
術(shù)語特異性結(jié)合構(gòu)件(Specific binding member)它描述了一對彼此具有結(jié)合特異性的分子中的一個構(gòu)件。特異性結(jié)合對的構(gòu)件可以是天然起源的或是整個地或部分地合成生產(chǎn)的。分子對的一個構(gòu)件在它的表面或穴內(nèi)具有能特異性結(jié)合并互補于該分子對的另一個構(gòu)件的特殊的空間或極性組合的區(qū)域。因此，分子對的構(gòu)件具有能彼此特異性結(jié)合的特性。特異性結(jié)合對類型的實例為抗原-抗體、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受體、受體-配體、酶-底物。本應(yīng)用是有關(guān)于抗原-抗體類型的反應(yīng)。
抗體分子它描述了一種無論是天然的或部分或整個合成生產(chǎn)的免疫球蛋白。該術(shù)語也覆蓋了任何含有抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽或蛋白。含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體片段是那些Fab、scFv、Fv、dAb、Fd以及微型雙功能抗體。本發(fā)明是有關(guān)于完整IgG1抗體分子及如所述的含有εs2-CH4的小免疫球蛋白。
可以用DNA重組技術(shù)的方法從原始的抗體分子生成保持有原始抗體分子的特異性的其他抗體分子。這些技術(shù)可以包括將編碼抗體的免疫球蛋白可變區(qū)、或互補決定區(qū)(CDR)的DNA引入到不同的免疫球蛋白的恒定區(qū)，或恒定區(qū)加上框架區(qū)域。見，例如，EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400。
可以用多種方法改造抗體，術(shù)語“抗體分子”應(yīng)當被理解為覆蓋所有的具有所需特異性的抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合構(gòu)件或物質(zhì)。因此，該術(shù)語覆蓋了抗體片段和衍生物，包括任何含有免疫球蛋白的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，無論它是天然的或整個或部分合成的。所以還包括含有與另一個多肽融合的免疫球蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其等價物的嵌合分子。EP-A-0120694和EP-A-0125023描述了對嵌合抗體的克隆和表達。
抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域它描述了抗體分子的一部分，包括能特異性結(jié)合并互補于抗原的一部分或全部的區(qū)域。其中如果抗原是巨大的，那么抗體可以只結(jié)合于抗原的特殊部分，這部分被稱為抗原決定簇?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域可以被一個或多個抗體的可變區(qū)所提供(例如稱為含有VH結(jié)構(gòu)域的Fd抗體片段)。優(yōu)選地，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和抗體重鏈可變區(qū)(VH)。
特異性它所指的是特異性結(jié)合對中的一個構(gòu)件沒有顯示出對除它的特異性結(jié)合配體外的其他分子任何顯著結(jié)合的狀態(tài)。術(shù)語可適用于例如抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是特異于多種抗原所攜帶的特殊的抗原決定簇，其中具有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特異性結(jié)合構(gòu)件能結(jié)合攜帶有抗原決定簇的各種抗原。
包含常用的意思是包括，也就是說容許存在一或多種特征或成分。
分離的這指的是根據(jù)本發(fā)明發(fā)明的特異性結(jié)合構(gòu)件或編碼這些結(jié)合構(gòu)件的核酸通常所處的狀態(tài)。構(gòu)件或核酸是游離的，或基本游離于它們所天然相關(guān)的物質(zhì)，例如其他的多肽或游離于在它們的天然環(huán)境中所發(fā)現(xiàn)的核酸、或游離于當用DNA重組技術(shù)進行體外或體內(nèi)制備時所制備它們的環(huán)境(例如細胞培養(yǎng)基)。可以用稀釋物或佐劑加工構(gòu)件和核酸分子以及因為實踐目的仍保持其為分離的，例如如果將構(gòu)件用于包被用于免疫檢測的微量滴定板時，一般將構(gòu)件和凝膠或其他載體混合；或者當構(gòu)件用于診斷或治療時，用藥用可接受載體與其混合。特異性結(jié)合構(gòu)件可以被天然地或通過異種真核細胞體系(例如CHO或NSO(ECACC 85110503)細胞)糖基化，或它們可以是非糖基化(例如如果通過原核細胞內(nèi)表達生成)。
“基本如同展示的”指的是本發(fā)明的的CDR或VH或VL結(jié)構(gòu)域與在此所展示的序列的特定區(qū)域完全一致或高度相似?！案叨认嗨啤币馑际窃贑DR和/或VH或VL結(jié)構(gòu)域可以發(fā)生從1個到5個，優(yōu)選的從1個到4個例如1到3或1或2、或3或4個取代。
用于攜帶本發(fā)明的CDR的結(jié)構(gòu)一般是抗體的重鏈或輕鏈序列或它們的主要部分，其中CDR定位于對應(yīng)于重組免疫球蛋白基因所編碼的天然發(fā)生的VH和VL抗體可變結(jié)構(gòu)域的CDR位點。參照于Kabat，E.A等(Sequences of Proteins of Immunological Interest.5th Edition.USDepartment of Health and Human Services.1991)及其更新(現(xiàn)可自互聯(lián)網(wǎng)查到http//immuno.bme.nwu.edu，或使用任何搜索工具查找″Kabat″)可以測定出免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和位點。
優(yōu)選地，攜帶基本如同展示的CDR氨基酸序列作為人可變結(jié)構(gòu)域或它們的主要部分的CDR?；救缤故镜腖19 VH CDR3和/或L19 VLCDR3可以被用于本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中，以及優(yōu)選的它們中的每個CDR3都可被用作為人重鏈或輕鏈或它們的主要部分的可變結(jié)構(gòu)域。
免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的主要部分將包括至少三個CDR區(qū)域，以及它們之間的框架區(qū)域。優(yōu)選地，該部分也將包括第一和第四框架區(qū)域的每個區(qū)域或兩個區(qū)域的至少約50％、這50％將是第一框架區(qū)域的C末端50％以及第四框架區(qū)域的N末端50％?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的主要部分的N末端或C末端附加殘基可以是那些一般與天然發(fā)生的可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域不相關(guān)的殘基。例如，利用DNA重組技術(shù)制成的本發(fā)明特異性結(jié)合構(gòu)件的構(gòu)建體可以造成引入所導(dǎo)入的促進克隆或其他操作步驟的連接劑所編碼的N或C末端殘基。其他的操作步驟包括引入連接劑，將本發(fā)明的可變結(jié)構(gòu)域進一步地連接到包括免疫球蛋白重鏈、其他可變結(jié)構(gòu)域或如下所詳細描述的蛋白標記物的蛋白序列。
在根據(jù)本發(fā)明的IgG1抗體中，VL結(jié)構(gòu)域可以以C末端連接到包括人Cκ或Cλ鏈，優(yōu)選的CK鏈的抗體輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域。
可以用可測定的或功能性的標記物標記本發(fā)明的特異性結(jié)合構(gòu)件。下面描述了可測定的標記物，它包括放射性標記物，例如锝、銦、釔、銅、镥或錸的放射性同位素，特別是94mTc、99mTc、186Re、188Re、111In、86Y、88Y、177Lu、64Cu和67Cu，利用在此所描述的抗體成像領(lǐng)域中已知的傳統(tǒng)化學(xué)將它們連接到本發(fā)明的抗體上。
標記物也包括酶標記物，例如辣根過氧化物酶。標記物進一步地包括可以被與例如標記的抗生物素蛋白的特異可測定亞基結(jié)合測定的化學(xué)亞基例如生物素。
在此所闡述的特異性結(jié)合構(gòu)件(L19-SIP)特別地適合于用例如94mTc、99mTc，186Re、188Re、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、111In、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、90Y、121Sn、161Tb、153Sm、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F同位素進行放射性標記，以及隨后用于放射性診斷和放射性治療。99mTc是特別優(yōu)選的用于標記的放射性同位素，下面的試驗部分描述了一個合適方案。
為了直接地標記特異性結(jié)合構(gòu)件，首先用例如氯化錫(II)、Tris(2-羧乙基)膦(TECP)的適當?shù)倪€原試劑還原半胱氨酸橋接的分子并生成游離的半胱氨酸SH基團，它可以與例如Tc或Re同位素反應(yīng)。在這個特殊的過程中，在存在有例如酒石酸鈉和API的輔助配體時，用例如氯化錫(II)的還原試劑還原從即時反應(yīng)體系中生成的permetalates(在下面的試驗部分提供有細節(jié))。
利用預(yù)先與螯合配體的結(jié)合可以進行用例如銦、釔、鑭系元素或锝和錸直接標記特異性結(jié)合構(gòu)件的氨基或巰基。螯合配體優(yōu)選的來自乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、環(huán)己基1，2-二氨五乙酸(CDTA)、乙烯甘油-O，O’-雙(2-氨乙基)-N，N，N′，N′-乙酰乙酸(HBED)、三乙烯四氨基己乙酸(TTHA)、1，4，7，10--四氮雜環(huán)十二烷-N，N，N-四乙酸(1，4，7，10-tetraazacyclododecane-N，N′，N″-tetraacetic acid，DOTA)、1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷-N，N′，N″-三乙酸(1，4，7-triazacyclononane-N，N′，N′-triaceticacid，NOTA)、1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷-N，N′，N″，N-四乙酸(1，4，8，11-tetraazacyclotetradecane-N，N′，N″，N-tetraacetic acid，TETA)、巰基乙酰二甘氨酸(mercaptoacetyl diglycine，MAG2)、巰基乙酰三甘氨酸(mercaptoacetyl triglycine，MAG3)、巰基乙酰甘氨酰半胱氨酸(mercaptoacetyl glycyl cysteine，MAGC)、半胱氨酸甘氨酰半胱氨酸(cysteinyl glycyl cysteine，CGC)。螯合配體具有適宜的結(jié)合基團，例如活性酯基、馬來酰亞胺、硫氨基甲醛或α-鹵化乙酰胺基團。對于將螯合配體結(jié)合到例如賴氨酸殘基的ε-NH2基團，不需要對L-19-SIP的預(yù)先還原。
將本發(fā)明的特異性結(jié)合構(gòu)件設(shè)計用于針對人或動物對象的診斷或治療方法，優(yōu)選以人為對象。
因此，本發(fā)明的進一步的方面提供了治療方法，包括施用所提供的特異性結(jié)合構(gòu)件及包含該特異性結(jié)合構(gòu)件的藥用組合物，以及提供了該特異性結(jié)合構(gòu)件在生產(chǎn)用于施用的藥物中的用途，例如用于制備藥物或含有用藥用可接受賦形劑加工的特異性結(jié)合構(gòu)件的藥用組合物的方法。
本發(fā)明的特異性結(jié)合構(gòu)件所能提供治療價值的臨床適應(yīng)證包括腫瘤例如實體腫瘤、也包括其他的病理性血管生成病變，包括類風濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性以及血管瘤。
根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合構(gòu)件可以用于治療人或動物身體的方法，例如治療(可以包括預(yù)防性治療)人患者的疾病或病變的方法，它包括給所述患者施用有效量的本發(fā)明的特異性結(jié)合構(gòu)件。在別處討論了根據(jù)本發(fā)明所治療的病變。
因此，本發(fā)明的進一步的方面提供了治療方法包括施用所提供的特異性結(jié)合構(gòu)件、含有這種特異性結(jié)合構(gòu)件的藥用組合物，以及這種特異性結(jié)合構(gòu)件用于生產(chǎn)施用的藥物的用途，例如用于制備藥物或含有用藥用可接受賦形劑加工的特異性結(jié)合構(gòu)件的藥用組合物的方法。
根據(jù)本發(fā)明，可以將所提供的組合物施用于個體。施用量優(yōu)選的是“治療有效量”，就是足以顯示出對患者有益療效的量。這些有益療效可以是至少改善至少一個癥狀。確切的給藥量以及給藥速度和給藥時間將依賴于所治療疾病的性質(zhì)和嚴重性。例如決定劑量的治療處方是在全科醫(yī)生和其他醫(yī)生的職權(quán)范圍內(nèi)。抗體的合適劑量是本領(lǐng)域熟知的，見Ledermann J.A.et al.(1991)Int J.Cancer 47659-664；Bagshawe K.D.et al.(1991)Antibody，Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4915-922所述。
可以單獨施用或和其他的治療同步或序貫地聯(lián)合施用組合物，這依賴于所治療的病變。
本發(fā)明的特異性結(jié)合構(gòu)件包括那些含有抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的構(gòu)件，可以通過任何合適的途徑，通常是通過注射到血液和/或直接注射到需治療的部位例如腫瘤而施用于所需要治療的患者。精確的劑量依賴于多種因素治療途徑、治療區(qū)域(例如腫瘤)的大小和定位、抗體確切的性質(zhì)(例如，整個IgG1抗體分子、小免疫球蛋白分子)以及連接于抗體分子的任何可測定標記物或其他分子的性質(zhì)。常用的抗體劑量是在10-50mg范圍內(nèi)。
這是單次治療成人患者的劑量，它可按比例地調(diào)整以用于治療兒童和嬰兒，也可以根據(jù)分子量比例調(diào)整其他抗體形式的劑量。根據(jù)醫(yī)生的判斷，可以每天、每周兩次、每周或每月間隔地重復(fù)治療。
通常以藥用組合物形式施用本發(fā)明的特異性結(jié)合構(gòu)件，它包括至少一種除特異性結(jié)合構(gòu)件以外的成分。
因此根據(jù)本發(fā)明的藥用組合物以及根據(jù)本發(fā)明用法的組合物可以包括除了活性成分以外的藥用可接受的賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或其他本領(lǐng)域人員所熟知的其他材料。這些材料應(yīng)當是無毒的且不干擾活性成分的療效。載體或其他材料的準確性質(zhì)依賴于給藥的途徑、它可以是口服的或例如經(jīng)靜脈內(nèi)注射的。
對于靜脈內(nèi)注射或病變局部注射，活性成分應(yīng)當是可腸外給藥的水溶液形式，它應(yīng)是無熱原的并具有合適的pH值、滲透壓和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域相關(guān)人員能制備所用的適宜的溶液，例如等滲介質(zhì)，例如氯化鈉注射液、Ringer注射液、加入乳酸鹽的Ringer注射液?？梢园葱璋蟹栏瘎?、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其他添加劑。
可以單獨施用或和其他治療同步或序貫地聯(lián)合施用組合物，這依賴于所治療的病變。其他治療可以包括施用適宜劑量的疼痛緩解藥物例如非甾體類抗炎藥物(例如阿斯匹林、撲熱息痛、布洛芬或酮洛芬)或阿片類例如嗎啡、或止吐藥。
本發(fā)明提供了一種包括引起或容許在此所提供的特異性結(jié)合構(gòu)件與ED-B結(jié)合的方法。要注意的是，這樣的結(jié)合可以發(fā)生在體內(nèi)，例如在施用特異性結(jié)合構(gòu)件之后、或施用編碼特異性結(jié)合構(gòu)件的核酸后，或結(jié)合可以發(fā)生在體外，例如ELISA、Western印跡、免疫細胞化學(xué)法、免疫沉淀或親和色譜法中。
可以測定與ED-B結(jié)合的特異性結(jié)合構(gòu)件的量。該量可能與測試標本中抗原的量相關(guān)，標本可以是診斷相關(guān)的標本，可以是治療相關(guān)的標本。
通過適當?shù)姆椒梢詼y定標本中的抗體反應(yīng)性。放射免疫法(RIA)是一種可能的方法。將放射活性標記的抗原與未標記的抗原(測試標本)混合并容許其與抗體結(jié)合。將結(jié)合抗原和非結(jié)合抗原完全分開并測定與抗體結(jié)合的放射活性抗原的量。測試標本中抗原越多那么與抗體結(jié)合的放射活性抗原就越少。利用結(jié)合有報告分子的抗原或類似物，用非放射活性抗原也可以進行競爭性結(jié)合檢測。報告分子可以是熒光染料、具有獨立吸收或發(fā)射光譜特性的發(fā)光或激光染料。適宜的熒光染料包括熒光素、羅丹明、藻紅蛋白和得克薩斯紅。適宜的顯色染料包括二氨基聯(lián)苯胺。
其他報告物包括大分子膠狀粒子或特殊材料例如被染色的乳膠珠、磁性或常磁性的、能直接或間接地形成可肉眼觀察到的可測定信號的生物或化學(xué)活性物質(zhì)、電可測定的或其他可記錄的物質(zhì)。例如這些分子可以是催化發(fā)生或改變顏色或引起電特性改變的反應(yīng)的酶。它們可以是分子可激動的，使得能量狀態(tài)之間的電轉(zhuǎn)換可以造成特征性的吸收或發(fā)射光譜。它們可以包括用于和生物傳感器相結(jié)合的化學(xué)實體。可以采用生物素/抗生物素蛋白或生物素/抗生物素鏈菌素蛋白以及堿性磷酸酶檢測系統(tǒng)。
可以用單個抗體-報告物綴合物所生成的信號獲得標本中(正常或測試標本)相關(guān)結(jié)合抗體的定量的絕對或相對數(shù)據(jù)。
本發(fā)明可以進一步擴展到與任何特異性結(jié)合構(gòu)件競爭地與ED-B結(jié)合的特異性結(jié)合構(gòu)件，該特異性結(jié)合構(gòu)件與抗原結(jié)合并包括一個V結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包括基本如同在此所展示的氨基酸的CDR，優(yōu)選包括含有SEQ ID NO.3的VH CDR3的VH結(jié)構(gòu)域。體外容易測定結(jié)合構(gòu)件之間的競爭，例如通過在存在其他未標記結(jié)合構(gòu)件時，用特異的報告物分子標記一個能測定的結(jié)合構(gòu)件，這能鑒別與相同抗原決定簇或重疊抗原決定簇結(jié)合的特異性結(jié)合構(gòu)件。利用例如Carnemolla等(24 1996)所描述的ELISA可以測定競爭性。
本發(fā)明進一步提供了編碼本發(fā)明的特異性結(jié)合構(gòu)件的分離的核酸。核酸可以是DNA或RNA。
本發(fā)明也提供了包括至少一個同上的多核苷酸的質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄或表達盒形式的構(gòu)建體。
本發(fā)明也提供了一種含有一種或多種所述的構(gòu)建體的重組宿主細胞。編碼所提供的特異性結(jié)合構(gòu)件的核酸本身形成了本發(fā)明的一個方面，生產(chǎn)該編碼產(chǎn)物的方法也同樣形成了本發(fā)明的一個方面，方法包括從編碼核酸中表達。通過在適宜的條件下培養(yǎng)含有核酸的重組宿主細胞可以容易地獲得表達。在表達生成之后，然后適當?shù)厥褂萌我缓线m的技術(shù)可以分離和/或純化特異性結(jié)合構(gòu)件。
根據(jù)本發(fā)明可以提供分離的和/或游離于它們的天然環(huán)境的基本純化或同源形式的特異性結(jié)合構(gòu)件和編碼核酸分子及載體，或者對于核酸，它是游離于或基本游離于除外編碼所需功能的多肽的核酸的原始核酸或基因。根據(jù)本發(fā)明核酸可以包括DNA或RNA以及可以是全部或部分合成的核酸。參照于在此所展示的核苷酸序列包括具有特異性序列的DNA分子，以及包括具有特異性序列的RNA分子，其中U取代了T，除非文中有其他的需要。
在各種不同的宿主細胞中克隆和表達多肽的體系是熟知的。適宜的宿主細胞包括細菌、哺乳動物細胞、酵母和昆蟲桿狀病毒體系。本領(lǐng)域可獲得的用于異種多肽表達的哺乳動物細胞系包括中國倉鼠卵巢細胞、HeLa細胞、幼年倉鼠腎臟細胞、NSO小鼠黑色素瘤細胞和許多其他的細胞。常用的并優(yōu)選的細菌宿主是大腸桿菌。
本領(lǐng)域已經(jīng)較好地建立了抗體和抗體片段在例如大腸桿菌的原核細胞中的表達。有關(guān)綜述見例如Pluckthun，A.Bio/Technology 9545-551(1991)。本領(lǐng)域人員也可進行在真核細胞培養(yǎng)中的表達，并作為一種生產(chǎn)特異性結(jié)合構(gòu)件的選擇，見最近的綜述例如M.E.(1993)Curr.OpinionBiotech.4573-576；Trill J.J.et al.(1995)Curr.Opinion Biotech 6553-560。
可以選擇或構(gòu)建含有包括啟動子序列、終止子序列、多腺苷序列、增強子序列、標記基因和其他適宜的序列的適當?shù)恼{(diào)節(jié)序列的適宜載體。載體可以是適宜的質(zhì)粒、病毒噬菌體或噬菌體質(zhì)粒。進一步的詳細說明見，例如，Molecular Cloninga Laboratory Manual3nd edition，Sambrook etal.，2001，Cold Spring Harbor Laboratory Press。
在Current Protocols in Molecular Biology，Second Edition，Ausubel etal.eds.，John Wiley & Sons，1992中詳細地描述了許多已知的擴增核酸的技術(shù)和方法，例如制備核酸構(gòu)建體、生成突變、測序、將DNA導(dǎo)入到細胞以及基因表達、和蛋白分析。在此一并參考Sambrook et al.和Ausubelet al.的闡述。
因此，本發(fā)明的進一步的方面提供了含有在此所闡述的核酸的宿主細胞。仍是進一步的方面提供了一種包括將這樣的核酸導(dǎo)入到宿主細胞的方法。導(dǎo)入可以采用任何一種可獲得的技術(shù)。對于真核細胞，合適的技術(shù)可以包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-Dextran、電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染以及利用逆轉(zhuǎn)錄病毒或例如牛痘的其他病毒對昆蟲細胞和昆蟲桿狀病毒的轉(zhuǎn)化。對于細菌細胞，合適的技術(shù)可以包括氯化鈣轉(zhuǎn)化、電穿孔和利用細菌噬菌體的轉(zhuǎn)染。
在導(dǎo)入后緊接著的是引起或容許核酸的表達，例如通過在容許基因表達的條件下培養(yǎng)宿主細胞。
在一個實施方案中，將本發(fā)明的核酸整合到宿主細胞的基因組中(例如染色體)。根據(jù)標準技術(shù)通過將促進重組的序列包含于基因組中可以促進整合。
本發(fā)明也提供了一種方法，包括在表達體系中用如上所述的構(gòu)建體表達所述的特異性結(jié)合構(gòu)件或多肽。
根據(jù)說明書包括以下實驗性實施例所揭示的內(nèi)容，本發(fā)明的進一步的方面和實施方案對于本領(lǐng)域人員是顯而易見的。
本申請中任何地方所提及的所有文獻均并入一并作為參考。
實施例材料和方法scFv、小免疫蛋白(SIP)和IgG1構(gòu)建體scFv(L19)的制備和表達scFv(L19)是一種特異性針對于纖連蛋白ED-B結(jié)構(gòu)域的親和力成熟(Kd＝5.4×10-11M)的抗體片段(13 Pini et al.，1998)。將scFv(D1.3)(7McCafferty et al.；26 Neri et al.，1997)，即小鼠抗雞卵清溶菌酶scFv，作為對照。根據(jù)Pini et al.(34 1997)在大腸桿菌株HB2151(Maxim Biotech，San Francisco CA)中表達這些scFv。
小免疫球蛋白(Mini-immunoglobulin)為了構(gòu)建L19小免疫蛋白(L19-SIP)基因(圖1C)，利用相應(yīng)地含有ApaLI和BspEI限制性位點的引物BC-618(gtgtgcactcggaggtgcagctgttggagtctggg-SEQ ID NO.8)及BC-619(gcctccggatttgatttccaccttggtcccttggcc-SEQ ID NO.9)，根據(jù)廠家的說明書用Pwo DNA聚合酶通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增編碼scFv(L19)的DNA序列。將擴增產(chǎn)物插入到pUT-εSIP載體的ApaLI/BspEI位點，它提供了具有細胞外介質(zhì)蛋白分泌所需的分泌信號的scFv基因。在用人IgE分泌型異構(gòu)體IgE-S2(εs2-CH4；35 Batista et al.，1996)的CH4結(jié)構(gòu)域取代人恒定γ1-CH3結(jié)構(gòu)域后，從先前描述的pUT-SIP-long(33 Li et al.，1997)可生成pUT-εSIP載體。CH4是一種容許IgE分子二聚體化的結(jié)構(gòu)域，這些εs2異構(gòu)體在其末端含有半胱氨酸，它可以通過鏈間二硫鍵穩(wěn)定IgE二聚體。在最終的SIP分子中，通過短GGSG連接體將ScFv(L19)連接到εs2-CH4結(jié)構(gòu)域上。為了得到構(gòu)建體pcDNA3-L19-SIP，用HindIII和EcoRI限制性酶從質(zhì)粒pUT-εSIP-L19中分離出SIP基因，并將其克隆進哺乳動物表達載體pcDNA3(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)中，該載體含有巨細胞病毒(CMV)啟動子，以便生成構(gòu)建體pcDNA3-D1.3-SIP。
用引物BC-721(ctcgtgcactcgcaggtgcagctgcaggagtca-SEQ ID NO.10)和BC-732(ctctccggaccgtttgatctcgcgcttggt-SEQ ID NO.11)擴增編碼scFv(D1.3)的DNA序列，并將其插入到PUT-SIP載體的ApaLI/BspEI位點，然后用HindIII和EcoRI限制性酶從質(zhì)粒pUT-εSIP-D1.3中分離出D1.3-SIP基因，并將其克隆進pcDNA3。
將這些構(gòu)建體用于按生產(chǎn)商所優(yōu)化的粘附細胞的方案用FuGENE 6轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染SP2/0鼠黑色素瘤細胞(ATCC，American Type CultureCollection，Rockville，MD，USA)。將轉(zhuǎn)染瘤(transfectoma)生長于補充有10％FCS和選擇性應(yīng)用750μg/ml慶大霉素(G418，Calbiochem，San Diego，CA)的DMEM中。
IgG1為了制備完整的IgG1，用HindIII和XhoI從先前描述的L19-pUTeSIP分離出L19重鏈(L19-VH)的可變區(qū)以及它的分泌肽序列，并將它們插入到含有完整人γ1恒定重鏈基因的pUC-IgG1載體中。然后用HindIII和EcoRI從pUC-IgG1-L19-VH中分離出重組IgG1基因并將其克隆到pcDNA3中，得到構(gòu)建體pcDNA3-L19-IgG1。
為了制備完整的L19輕鏈，用相應(yīng)地含有ApaLI和BsiWI限制性位點的引物BC-696(tggtgtgcactcggaaattgtgttgacgcagtc-SEQ ID NO.12)和BC-697(ctctcgtacgtttgatttccaccttggtcc-SEQ ID NO.13)通過PCR從L19-pUT-εSIP(上述的)擴增出L19-VL。在用ApaLI和BsiWI消化后，將擴增產(chǎn)物插入到含有分泌信號序列及人恒定κ輕鏈序列的載體pUT-SEC-hCκ中。然后用HindIII和XhoI從pUT-SEC-hCκ-L19-VL分離出重組輕鏈基因并將其插入到通過將維持基因轉(zhuǎn)移到G418而來源于pcDNA3載體的哺乳動物表達載體pCMV2Δ中，以獲得構(gòu)建體CMV2Δ-L19-κ。
如上所述用這些等摩爾量(equimolar amount)的構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染SP2/0鼠黑色素瘤細胞。在ELISA中篩選慶大霉素選擇克隆的分泌嵌合免疫球蛋白、完整重鏈及輕鏈的能力。
利用Maxiprep體系從Qiagen(Hilden，Germany)純化所有的DNA構(gòu)建體，并用ABI PRISM dRhodamine Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kit(Perkin Elmer，F(xiàn)oster City，CA)確定構(gòu)建體雙鏈的DNA序列。除BsiWI(New England Biolabs，Beverly，MA)以外的所有限制性酶都來自Roche Diagnostics(Milan，Italy)，在RE消化后，利用Qiaquick方法(Qiagen)從瓊糖膠中還原插入物和載體。
抗體的純化和質(zhì)控根據(jù)Carnemolla et al.(24 1996)所描述的方法，用免疫親和色譜法純化不同的抗體。
按照生產(chǎn)商的說明書(24 Carnemolla et al.，96)用與瓊脂糖4B(Amersham Pharmacia Biotech.，Uppsala，Sweden)綴合的ED-B免疫純化所有不同的L19抗體形式，而用與瓊脂糖4B(Amersham Pharmacia)綴合的雞卵清溶菌酶分離柱純化D1.3抗體。
免疫純化的抗體形式L19-SIP和L19-IgG1不需要進一步的純化，用pH值為7.4的PBS在4℃將其透析。因為從免疫親和色譜法獲得的scFv包含有兩種形式，單體的和二聚體的，因此需要如Demartis et al.(27 2001)所描述的第二個純化步驟來分離后一種形式。制備成批的不同的抗體形式，并利用在還原和非還原條件下的SDS-PAGE、免疫組化、體積排阻色譜(Superdex 200，Amersham Pharmacia Biotech)以及ELISA試驗對其進行分析。
十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、體積排阻色譜和免疫組化依照Carnemolla et al.(24 1996)在給定條件的培養(yǎng)介質(zhì)中進行篩選ELISA試驗。為了揭示不同的L19抗體形式的表達，將含有包含有L19所識別的抗原決定簇的FN的ED-B結(jié)構(gòu)域的重組片段7B89(24Carnemolla et al.，1996)固定于Maxisorp免疫板(Nunc，Roskilde，Denmark)。為了測定ELISA試驗中的D1.3抗體，將雞卵清雞溶菌酶(Sigma)固定于EIA板的NH2表面(Costar，Cambridge，MA)。將按照生產(chǎn)商的說明書稀釋的綴合了過氧化物酶的兔抗人IgE(Pierce，Rockford，IL)用作為檢測SIP的第二抗體。對于IgG1，使用綴合過氧化物酶的兔抗人IgG(Pierce)。對于含有標記序列FLAG的scFv，相應(yīng)地將鼠抗人FLAG單克隆抗體(M2，Kodak)和綴合過氧化物酶的山羊抗鼠抗體(Pierce)用作為第二和第三抗體。在所有的情況中，利用過氧化物酶的底物ABTS(Roche)測定固定抗原的免疫反應(yīng)性，并測定了在405nm的分光光度吸光度。
利用快速蛋白液態(tài)色譜法(FPLC；Amersham Pharmacia)用Superdex200(Amersham Pharmacia)色譜柱分析純化的抗體在天然條件下的凝膠濾過值。如Castellani et al.(22 1994)所描述的進行不同組織晶體切片上的免疫組化，在還原或非還原條件下依照Carnemolla et al.(17 1989)進行4-18％梯度的SDS-PAGE。
動物和細胞株無胸腺裸鼠(8周大裸/裸CD1雌性)來自Harlan Italy(Correzzana，Milano，Italy)，129(克隆SvHsd)株鼠(8-10周大小，雌性)來自HarlanUK(Oxon，England)。鼠胚胎畸胎癌細胞(F9)、人黑色素瘤來源細胞(SK-MEL-28)及鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)購自American Type CultureCollection(Rockville，MD)。為了誘導(dǎo)腫瘤，用16×106SK-MEL-28細胞皮下注射裸鼠，以及用3×106F9細胞處理129株鼠。用下面的公式測定腫瘤體積(d)2×D×0.52，其中d和D分別是用測徑器測量的腫瘤的短徑和長徑。依照國內(nèi)立法(Italian law no.116 of 27 January，1992)并參照于用于科學(xué)目的的動物保護方法飼養(yǎng)、處理和處死動物。
重組抗體的放射性碘標記依照生產(chǎn)商的說明書利用IODO-GEN預(yù)先包被的碘標記的管(Pierce)激活Na125I(NEN Life Science Products，Boston，MA)，按照Chizzonite間接方法(36 Riske et al.，1991)完成蛋白的放射性碘標記。在報道的實施方案中，用1.0mCi Na125I碘標記的0.5mg蛋白。利用0.25％BSA預(yù)先處理及PBS平衡的PD10柱(Amersham Pharmacia)從游離125I中分離出放射性標記的分子。用晶體γ計數(shù)器(Packard Instruments，Milano，Italy)測定標本的放射活性。對放射性標記蛋白的免疫反應(yīng)性檢測在用200μl含0.25％BSA的PBS溶液飽和的ED-B瓊脂糖柱中進行。將200μl含0.25％BSA PBS溶液的已知量的放射性碘標記的抗體應(yīng)用于柱的頂部并容許其進入柱。然后用1.5ml 0.25％BSA PBS溶液洗脫柱以去除非特異性結(jié)合的抗體。最后用1.5ml 0.1M pH11的TEA洗脫免疫反應(yīng)性的結(jié)合材料。計數(shù)未結(jié)合和結(jié)合材料的放射性活性并計算出免疫反應(yīng)性抗體的百分比。免疫反應(yīng)性一直高于90％。
為了進一步分析放射性碘標記的抗體，將200μl已知量的放射性標記的蛋白加入到Superdex 200柱中。放射性碘標記后不同蛋白的儲存體積沒有不同。對于三種碘標記的L19抗體形式以及它們的陰性對照，從Superdex 200柱的放射活性收復(fù)率是100％(圖3A、3B和3C)。
生物分布試驗為了阻斷125I在胃的非特異性聚集以及在甲狀腺的濃聚，在注射放射性標記的抗體前30分鐘讓鼠口服溶于20mg水性高氯酸鈉(Carlo Erba，Italy)。在生物分布試驗期間每24h間隔重復(fù)該步驟。用100μl鹽水中的0.1nmol不同的放射性標記的抗體(相應(yīng)的為6μg scFv、8μg SIP和18μgIgG)注射到瘤負荷鼠的尾部靜脈。在每個時間點處死三只動物，取出含有腫瘤的不同器官，稱重并在γ計數(shù)器計數(shù)，然后用5％甲醛pH值7.4的PBS溶液固定，用于依照Tarli et al.(23 1999)進行的微量自動放射性顯像。
取出的血液標本也將其用于血漿制備，利用已經(jīng)描述的免疫反應(yīng)性檢測和凝膠濾過分析測定放射性標記的分子在血液中的穩(wěn)定性。在兩種測定中都使用200μl血漿。不同器官的放射活性成分表示為每克注射劑量的百分比(％ID/g)。使用MacIntosh Program Kaleidagraph(SynergySoftware，Reading PA，USA)，通過最小平方極小化處理(a least squaresminimization procedure)計算放射性碘標記的抗體的血液清除參數(shù)，公式為X(t)＝A exp(-(αt))+B exp(-(βt)其中X(t)為放射性標記的抗體在時間t的％ID/g。該公式描述了雙指數(shù)的血清除值，其中α期的幅度被定義為A×100/(A+B)以及β清除期的幅度被定義為B×100/(A+B)。α和β是與相應(yīng)的血液清除相的半衰期相關(guān)的速度參數(shù)。T1/2(α期)＝ln2/α＝0.692.../α；T1/2(β期)＝ln2/β＝0.692.../β；對應(yīng)于每只小鼠的2.5ml體積的血液，假定X(0)等于40％。
結(jié)果抗體的制備應(yīng)用不同的L19(13 Pini et al.，1998)抗體形式(scFv、小免疫球蛋白和完整的人IgG1)以及它們在體內(nèi)對腫瘤血管進行定向中的作用。
圖1顯示了用于表達不同的L19抗體形式的構(gòu)建體。利用特異于非相關(guān)抗原的scFv的可變區(qū)(D1.3；7 McCafferty；26 Neri et al.，1997)制備相似的構(gòu)建體。
為了生成SIP和IgG1，用圖1所示的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染SP2/0鼠骨髓瘤細胞并用G418選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染瘤。通過ELISA確定出最佳生產(chǎn)者并將這些克隆擴增用于抗體純化。所有的三種L19抗體形式的純化是依據(jù)利用與瓊脂糖綴合的重組ED-B的免疫親和色譜。ScFv(L19)的產(chǎn)量為約8mg/l，L19-SIP為10mg/l，L19-IgG1為3mg/l。對于所用的特異于雞蛋溶菌酶的scFv(D1.3)的陰性對照，利用scFv D1.3的可變區(qū)構(gòu)建了D1.3-SIP。在與瓊脂糖綴合的雞蛋溶菌酶上純化這兩種抗體。相應(yīng)的產(chǎn)量是8和5mg/l。我們將商品化可獲得的人IgG1/κ(Sigma)用作為L19 IgG1的對照。
在還原和非還原條件下都進行了對三種純化L19形式的SDS-PAGE分析。對于scFv(L19)，如期望的一樣在還原和非還原條件下(未顯示)顯示的分子量都為約28kDa。L19-SIP在非還原條件下表現(xiàn)為近80kDa的分子量，而在還原條件下分子量為約40kDa。這些結(jié)果表明超過95％的天然分子以共價連接的二聚體形式存在。如所期望的那樣，L19-IgG1在非還原條件下顯示出約180kDa的主帶，而在還原條件下顯示出兩條對應(yīng)于約55kDa重鏈和約28kDa輕鏈的條帶。
通過體積排阻色譜分析獲得了三種L19抗體形式的洗脫值。在所有的三種情況中都測定到代表著大于98％的正常分布的單一峰值。利用標準校對曲線，scFv(L19)2的外顯分子量為60kDa，L19-SIP為80kDa，以及L19-IgG1為180kDa。此外，證實不存在經(jīng)常出現(xiàn)于重組蛋白制備中并可能使得體內(nèi)研究所獲得的結(jié)果無效的分子聚集。對純化的對照蛋白進行的SDS-PAGE和體積排阻色譜(Superdex 200)給出了相似的結(jié)果。
利用這三種不同的L19抗體形式，對裸鼠中所誘導(dǎo)的SK-MEL-28人黑色素瘤細胞以及129株鼠中所誘導(dǎo)的F9鼠畸胎癌細胞的晶體切片進行免疫組化分析。在0.25-0.5nM低的濃度得到了最佳結(jié)果。所有的三種純化的L19抗體識別完全一致的結(jié)構(gòu)。
放射性標記的L19抗體形式的體內(nèi)穩(wěn)定性將SK-MEL-28人黑色素瘤和F9鼠畸胎瘤用于體內(nèi)生物分布研究。SK-MEL-28瘤有著相對緩慢的生長速度，而F9瘤卻生長迅速(圖2)。因此，使用SK-MEL-28瘤能進行長時間的試驗(最長到144h)，而F9瘤用于短時間的生物分布研究(最長到48h)。當腫瘤生長到近0.1-0.3cm3進行所有的生物分布試驗。為了比較不同的抗體形式，注射了100μl無菌鹽水的相同摩爾量的抗體形式。在注射前，將放射性碘標記的化合物用0.22μm濾過，并檢測了免疫反應(yīng)性以及凝膠濾過值(見材料和方法)。放射性標記蛋白的免疫反應(yīng)性始終大于90％。
圖3A-C報告了對放射性碘標記的L19抗體形式的凝膠濾過分析(Superdex 200)的數(shù)值。
在距離注射的不同時間間隔時從治療動物中取出血液標本，并用凝膠濾過色譜分析血漿中所存在的放射活性的免疫反應(yīng)性。所有的三種L19抗體形式的凝膠濾過值都顯示為單一主峰，具有注射蛋白的分子量。僅僅scFv的數(shù)值顯示出具有更高分子量的第二峰，提示有聚集的形成(圖3D-F)。此外，在scFv(L19)2中觀察到形成了不能從Superdex 200柱上洗提的大分子量的聚集物。事實上，當L19SIP和L19-IgG從Superdex 200柱的回收率為所應(yīng)用的放射活性的90-100％時，scFv(L19)2的放射活性的產(chǎn)量為約55％。僅僅在用0.5M NaOH洗滌色譜柱后才回收到剩余的放射活性，這表明大的聚集物被阻滯于柱濾器中(表1)。
表1也報告了血漿中所進行的免疫反應(yīng)性測定的結(jié)果(見材料和方法)。在試驗結(jié)束后，血漿中的L19-SIP和L19-IgG1保持了與初始試劑一樣的免疫反應(yīng)性。相反的，在注射3h后，血漿中的scFv(L19)2的免疫反應(yīng)性減少到小于40％。
比較生物分布試驗表2a、b、c和圖4報告了放射性標記的L19抗體在SK-MEL-28瘤負荷鼠的生物分布試驗中所得到的結(jié)果。
表2a、b、c顯示了在距離靜脈注射放射性標記的抗體的不同時間時，組織和器官包括腫瘤的％ID/g的平均值(SD)。
圖4顯示了在試驗的不同時間時腫瘤和血中不同抗體形式的％ID/g的差異，以及腫瘤和血％ID/g之間的比值。所有的三種L19抗體形式都選擇性地聚集于腫瘤內(nèi)，表3中報告了腫瘤和其他器官的％ID/g的比值。
如微量自動放射顯像所證實的那樣，抗體只聚集在腫瘤血管上，其中可以見無在正常器官血管的特異性聚集。相反的，在腫瘤或在正常組織內(nèi)都沒有發(fā)現(xiàn)放射性碘標記的對照分子的特異性聚集(表2a、b、c)。
如同通過計數(shù)尿標本所證實的那樣，所有三種抗體形式都顯示出清除主要是由腎臟介導(dǎo)的。和所預(yù)期的一樣，scFv(L19)2的清除是更快的，而完整L19-IgG1的清除是更慢的。通過雙指數(shù)函數(shù)曲線計算生成了表4所報告的半衰期值。
圖5描述了用放射性碘標記的scFv(L19)2和L19SIP在F9畸胎瘤腫瘤模型上所獲得的腫瘤和血％ID/g(SD)的差異。因為F9畸胎瘤的高血管生成活性，在i.v.注射3和6個小時時，腫瘤中所聚集的放射活性分子是SK-MEL-28瘤內(nèi)的3到4倍，并且持續(xù)更高達48h的試驗持續(xù)時間。和SK-MEL-28瘤一樣，用微量自動化放射顯像證實了在腫瘤血管內(nèi)的特異性聚集，而在注射對照分子后沒有發(fā)現(xiàn)特異性的腫瘤聚集。在表5中報告了在i.v.注射后的不同時間時F9腫瘤和其他器官內(nèi)的L19(scFv)和L19SIP的％ID/g。
還原型L19-SIP的合成將422μl含有375μg(5nmol)L19-SIP的PBS溶液加入到50μl TCEP溶液(14.34mg TCEP xHCl/5ml Na2HPO4水溶液，0.1M，pH＝7.4)中。在37℃輕輕地搖晃反應(yīng)混合物1個小時。用NAP-5柱(Amersham，洗提液PBS)通過凝膠色譜法純化還原型L19-SIP。對分離產(chǎn)物的SDS-PAGE分子證實L19-SIP定量轉(zhuǎn)換定為還原型L19-SIP。
產(chǎn)量100.3μg/200μl PBS(26.7％)。
Tc-99m-L19-SIP的合成將3.0mg L-酒石酸二鈉放置于小瓶中，緊接著加入200μl含有100.3μg還原型L19-SIP的PBS溶液，并用100μl Na2HPO4緩沖水溶液(1M，pH＝10.5)稀釋。加入85μl Tc-99m發(fā)生器洗脫液(24h)和10μlSnCl2溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)。在37℃搖晃反應(yīng)混合物半小時。用NAP-5柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠色譜法純化Tc-99m標記的L19-SIP。
放射化學(xué)產(chǎn)率35.6％。
放射化學(xué)純度90.2％(SDS-PAGE)。
特異活性26.4MBq/nmol。
免疫反應(yīng)性91.4％。
Tc-99m-MAG2-L19-SIP羧基甲基-t-丁基二硫化物的合成將1L含有21.75ml(0.312mol)1-巰基乙酸、43.5ml(0.312mol)三乙胺和100g(0.312mol)N-(叔-丁基巰基)-N，N′-雙-BOC-肼(N-(tert.-butylthio)-N，N′-di-BOC-hydrazine)的EtOH(abs.)溶液在逆流下加熱60h。在加壓下蒸發(fā)EtOH使得最終的體積為約200ml。將剩余物倒入到1.81H2O中并用5摩爾NaOH將所得到的懸浮液的pH值調(diào)整為7.14。濾除Di-BOC-肼并用半量濃度的HCl將所得溶液的pH值調(diào)整為2.2。用600ml CH2Cl2從水中提取粗材料3次。在MgSO4上干燥混合有機層，并在減壓下蒸發(fā)溶劑得到41.1g黃色油。該材料對于進一步的分析是足夠純的。
N-(芐氧羰基-Gly)Gly叔-丁酯(Z-(N-Gly)Gly叔-丁酯(N-(benzyloxycarbonyl-Gly)Gly t-butyl ester(Z-(N-Gly)Gly t-butyl ester)將1.41含有35.02g(114mmol)Z-Gly-O琥珀酰亞胺及15g(114mmol)Gly-O-tBu的CH2Cl2液在室溫N2氣下攪拌20h。用250ml 1％水性檸檬酸洗滌有機層3次，用200ml半飽和水性NaHCO3洗滌2次以及用200ml水洗滌1次。在非水性的MgSO4上干燥有機層。在減壓下蒸發(fā)CH2Cl2得到36.5g(99％)黃色油狀的Z-Gly-Gly-O-tBu。粗材料對于進一步的分析是足夠純的。
Gly-Gly叔-丁酯將36.5g(113mmol)Z-Gly-Gly-O-tBu溶解于11THF中，緊接著加入3.65g活性碳鈀(10％)。在室溫H2氣下攪拌混合物3h。用N2凈化懸浮液、過濾(PTFE濾膜0.45nm)并在減壓下濃縮濾過液得到20.3g(95％)黃色油狀的Gly-Gly-O-tBu。粗材料對于進一步的分析是足夠純的。羧基甲基-t-丁基二硫化物甘氨酰甘氨酸t(yī)-丁酯(Carboxy methyl-t-butyldisulfide glycyl glycine t-butylester)將430ml含有23.85g(115.6mmol)DDC的CH2Cl2溶液逐滴加入到11含有21.76g(115.6mmol)Gly-Gly-O-tBu、20.84(115.6mmol)羧基甲基-t-丁基二硫化物及13.3g(115.6mmol)NHS的CH2Cl2溶液中。將所得到的懸浮液在室溫N2氣下攪拌過夜。將所得到的溶液過濾后，用400ml半飽和水性NaHCO3洗滌三次和用400ml水洗滌一次。在減壓下將干有機層(MgSO4)蒸發(fā)。用梯度范圍從CH2Cl2/MeOH 99∶1到CH2Cl2/MeOH98.5∶1.5的溶劑在硅膠上通過層析法純化粗產(chǎn)物。分離到26.1g(64％)的黃色油狀物。
巰基乙酰甘氨酰甘氨酸(Mercaptoacetyl glycyl glycine)將26.32g(75.09nmol)羧基甲基-t-丁基二硫化物甘氨酰甘氨酸-丁酯在N2氣下溶解于233ml TFA中。在室溫下攪拌所得溶液20分鐘。在減壓(5-10×10~2mbar)下蒸發(fā)TFA，并另外攪拌干燥所得油2h(5-10×10~2mbar)。加入250ml Et20后，沉淀出白色粉末以及攪拌懸浮液3h。濾過沉淀物并重懸于100ml Et20中。攪拌所得懸浮液過夜，濾過產(chǎn)物并在減壓下室溫中干燥產(chǎn)物得到20.46g(92.5％)白色粉末。
巰基乙酰甘氨酰甘氨酸NHS酯將巰基乙酰甘氨酰甘氨酸(1g，3.4mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(391mg，3.4mmol)混合于干燥的平底燒瓶中并溶解于無水的DMF(4ml)。在攪拌反應(yīng)混合物的同時加入含有DDC(700mg，3.4mmol)的無水二惡烷。在15分鐘內(nèi)開始形成沉淀(DCU)。1h后通過真空過濾去除沉淀物。用冷二惡烷洗滌沉淀物。從濾過液中去除二惡烷。通過加入二乙醚從剩余的DMF溶液中沉淀出產(chǎn)物。過濾分離產(chǎn)物，用冷二乙醚洗滌，并在真空干燥器中干燥。產(chǎn)量為1.33(99％)。
Tc-99m-MAG2-ε-HN(Lys)-L19-SIP的合成用300μl四硼酸鈉緩沖液(0.1M，pH8.5)稀釋111μl含有200μg(2.66nmol)非還原型L19-SIP的PBS，并利用Slide-A-Lyzer 10,000MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)用200ml磷酸緩沖液(0.1M，pH8.5)透析兩個1h。加入50μl巰基乙酰甘氨酰甘氨酸NHS酯溶液(0.5mg溶解于500μl磷酸緩沖液，0.1M，pH8.5)并在37℃加熱反應(yīng)混合物3h。并利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)，每次用200ml磷酸緩沖液(0.1M，pH8.5)透析兩個1h及1個17h(過夜)。往小瓶中加入3.0mg L-酒石酸二鈉后加入90μl Tc-99m發(fā)生器洗脫液(每天洗脫)以及加入25μl SnCl2溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)。在37℃搖晃反應(yīng)混合物0.5h。用NAP-5柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠色譜法純化Tc-99m標記的L19-SIP。
放射化學(xué)產(chǎn)率55.1％。
放射化學(xué)純度94.5％(SDS-PAGE)。
特異性活性15.2MBq/nmol。
免疫反應(yīng)性81.1％。
Re-188-L19-SIP的合成將3.0mg L-酒石酸二鈉放置于小瓶中，緊接著加入310μl含有150μg還原型L19-SIP的PBS溶液，并用100μl Na2HPO4緩沖水溶液(1M，pH＝10.5)稀釋。加入100μl Tc-99m發(fā)生器洗脫液(24h)和50μl SnCl2溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)。在37℃搖晃反應(yīng)混合物1.5小時。用NAP-5柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠色譜法純化Tc-99m標記的L19-SIP。
放射化學(xué)產(chǎn)率34.8％。
放射化學(xué)純度97.2％(SDS-PAGE)。
特異活性13.5MBq/nmol.。
免疫反應(yīng)性91.7％。
合成用于將EDTA、CDTA、TETA、DTPA、TTHA、HBED、DOTA、NOTA、D03A、以及類似類型的螯合劑綴合于半胱氨酸SH基團的還原型L19-SIP將50μl TECP溶液(14.34mg TCEP xHCl/5ml水性Na2HPO4，0.1M，pH＝7.4)加入到422μl含有375μg(5nmol)L19-SIP的PBS溶液中。在37℃輕輕地搖晃反應(yīng)混合物1小時。用NAP-5柱(Amersham，洗脫液乙酸鈉緩沖液，0.1M，pH5.0)通過凝膠色譜法純化Tc-99m標記的還原型L19-SIP。對分離產(chǎn)物的SDS-PAGE分子證實L19-SIP定量轉(zhuǎn)換定為還原型L19-SIP。產(chǎn)量105.7μg/200μl(28.2％)。
In-111-MX-DTPA-馬來酰亞胺-S(Cys)-L19-SIP-R(R＝還原型)的合成將200μl含有105μg(2.8nmol)還原型L19-SIP的乙酸鈉緩沖液(0.1M，pH5.0)與50μl溶解的1，4，7-三氮-2-(N-馬來酰亞胺乙烯基p-氨基)芐基-1，7-雙(羧甲基)-4-羧甲基6-甲基庚烷(1，4，7-triaza-2-(N-maleimidoethylene p-amino)benzyl-1，7-bis(carboxymethyl)-4-carboxymethyl 6-methylheptane)(500μl 0.1M，pH5.0乙酸鈉緩沖液中含有0.25mg DTPA-馬來酰亞胺)在37℃反應(yīng)3h。利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)用200ml乙酸鈉緩沖液(0.1M，pH6)透析兩次各1h。加入80μl[In-111]InCl3溶液(HCl，1N，40MBq，Amersham Inc.)并在37℃加熱反應(yīng)混合物30分鐘。
用NAP-5柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠色譜法純化In-111標記的DTPA-馬來酰亞胺-S(Cys)-L19-SIP。
放射化學(xué)產(chǎn)率51.6％。
放射化學(xué)純度97.2％(SDS-PAGE)。
特異性活性7.9MBq/nmol。
免疫反應(yīng)性88.5％。
合成MX-DTPA-馬來酰亞胺(1，4，7-三氮-2-(N-馬來酰亞胺乙烯基p-氨基)芐基-1，7-雙(羧甲基)-4-羧甲基6-甲基庚烷)將512mg(1mmol){[3-(4-氨基-苯基)-2-(雙-羧甲基-氨基)-丙基]-[2-(雙-羧甲基-氨基)-丙基]-氨基}乙酸(Macrocyclics Inc.Dallas，TX，U.S.A.)和707mg(7mmol)三乙胺溶解于3ml干DMF中。逐滴加入1ml含有400mg(1.5mmol)3-(2，5-Dioxo-2，5-二氫-吡咯-1-基)-丙酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯(Aldrich)的干DMF。在50℃攪拌溶液5h。緩慢加入30ml二乙醚。將反應(yīng)混合物進一步攪拌30min。過濾收集沉淀物。用RP-HPLC(乙氰-∶水-∶三氟乙酸/3∶96.9∶0.1→99.9∶0∶0.1)。產(chǎn)率61％(405mg，0.61mmol)。MS-ESI664＝M++1。
In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP的合成用300μl四硼酸鈉(0.1M，pH8.5)稀釋111μl含有200μg(2.66mmol)非還原型L19-SIP的PBS溶液，并利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)用200ml四硼酸鈉緩沖液(0.1M，pH8.5)透析兩次各1h。加入50μl 1，4，7-三氮-2-(p-異硫氰酰)芐基-1，7-雙(羧甲基)-4-羧甲基-6-甲基庚烷(MX-DTPA)(0.33mg MX-DTPA溶解于500μl四硼酸鈉緩沖液0.1M，pH8.5)并將反應(yīng)混合物在37℃加熱3h。利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)每次各用200ml乙酸鈉緩沖液(0.1M，pH6.0)透析1h兩次以及17h一次(過夜)。
加入80μl[In-111]InCl3溶液(HCl, 1N，40MBq，Amersham Inc.)并在37℃加熱反應(yīng)混合物30分鐘。用NAP-5柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠色譜法純化In-111標記的MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP。
放射化學(xué)產(chǎn)率72.4％。
放射化學(xué)純度80.3％(SDS-PAGE)。
特異性活性8.8MBq/nmol。
免疫反應(yīng)性77.5％。
In-111-DOTA-C-Benzyl-p-NCS-E-HN(Lys)-L19-SIP的合成用300μl四硼酸鈉(0.1M，pH8.5)稀釋108μl含有200μg(2.66mmol)非還原型L19-SIP的PBS溶液，并利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)用200ml四硼酸鈉緩沖液(0.1M，pH8.5)透析1h兩次。加入50μl 1，4，7，10-四氮-2-(p-異硫氰酰)芐基環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(芐基-p-SCN-DOTA)(Macrocyclics Inc.，Dallas TX，U.S.A.)(1.5mg芐基-p-SCN-DOTA溶解于5ml四硼酸鈉緩沖液0.1M，pH8.5)并將反應(yīng)混合物在37℃加熱3h。利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)每次各用200ml乙酸鈉緩沖液(0.1M，pH6.0)透析1h兩次以及17h一次(過夜)。
加入80μl[In-111] InCl3溶液(HCl，1N，40MBq，Amersham Inc.)并在37℃加熱反應(yīng)混合物30分鐘。用NAP-5柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠色譜法純化In-111標記的DOTA-C-Benzyl-p-NCS--HN(Lys)-L19-SIP。
放射化學(xué)產(chǎn)率70.8％。
放射化學(xué)純度92.1％(SDS-PAGE)。
特異性活性10.1MBq/nmol。
免疫反應(yīng)性75.1％。
Y-88-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP的合成用300μl四硼酸鈉(0.1M，pH8.5)稀釋110μl含有200μg(2.66mmol)非還原型L19-SIP的PBS溶液，并利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)用200ml四硼酸鈉緩沖液(0.1M，pH8.5)透析1h兩次。加入50μl MX-DTPA溶液(0.33mg MX-DTPA溶解于500μl四硼酸鈉緩沖液0.1M，pH8.5)并將反應(yīng)混合物在37℃加熱3h。利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)每次各用200ml乙酸鈉緩沖液(0.1M，pH6.0)透析1h兩次以及17h一次(過夜)。
加入100μl[Y-88] YCl3溶液(HCl，1N，75MBq，Oak Ridge NationalLab.)并在37℃加熱反應(yīng)混合物30分鐘。用NAP-5柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠色譜法純化Y-88標記的Y-88-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP。
放射化學(xué)產(chǎn)率68.1％。
放射化學(xué)純度91.5％(SDS-PAGE)。
特異性活性11.4 MBq/nmol。
免疫反應(yīng)性70.5％。
Lu-177-DOTA-C-Benzyl-p-NCS-ε-HN(Lys)-L19-SIP的合成用300μl四硼酸鈉(0.1M，pH8.5)稀釋120μl含有200μg(2.66mmol)非還原型L19-SIP的PBS溶液，并利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)用200ml四硼酸鈉緩沖液(0.1M，pH8.5)透析1h兩次。加入50μl芐基-p-SCN-DOTA溶液(1.5mg溶解于5ml四硼酸鈉緩沖液0.1M，pH8.5)并將反應(yīng)混合物在37℃加熱3h。利用Slide-A-Lyzer 10,000 MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)每次各用200ml乙酸鈉緩沖液(0.1M，pH6.0)透析1h兩次以及17h一次(過夜)。
加入200μl[Lu-177] LuCl3溶液(HCl，1N，80MBq，NRH-Petten，Netherlands)并在37℃加熱反應(yīng)混合物30分鐘。用NAP-5柱(Amersham，洗脫液PBS)通過凝膠色譜法純化Lu-177標記的DOTA-C-Benzyl-p-NCS-E-HN(Lys)-L19-SIP。
放射化學(xué)產(chǎn)率72.2％。
放射化學(xué)純度94.9％(SDS-PAGE)。
特異性活性18.3MBq/nmol。
免疫反應(yīng)性73.4％。
給腫瘤負荷裸鼠單次靜脈注射In-111-MX-DTPA-L19-SIP后的器官分布及排泄給F9(畸胎瘤)負荷動物(體重約25g)靜脈注射約37kBq劑量的本發(fā)明的標記肽。在施用該肽后的不同時間點，用γ計數(shù)器測定了不同器官內(nèi)的放射活性以及排泄物的放射活性。
表6顯示了In-111-MX-DTPA-L19-SIP在F9(畸胎瘤)負荷裸鼠的生物分布(平均值±SD，n＝3)。
給腫瘤負荷裸鼠單次靜脈注射Tc-99m-L19-SIP后的器官分布及排泄給F9(畸胎瘤)負荷動物(體重約25g)靜脈注射約56kBq劑量的標記肽。在施用該肽后的不同時間點，用γ計數(shù)器測定了不同器官內(nèi)的放射活性以及排泄物的放射活性。另外，依照腫瘤和血液的肽濃度測定了不同時間的腫瘤血液比。
表7顯示了Tc-99m-L19-SIP在F9(畸胎瘤)負荷裸鼠的生物分布(平均值±SD，n＝3)。
表8顯示了Tc-99m-L19-SIP在F9(畸胎瘤)負荷裸鼠的腫瘤血液比(平均值±SD，n＝3)。
在動物試驗中證實放射性標記肽具有有利的特性。例如，Tc-99m-L19-SIP和In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP表現(xiàn)出高水平的腫瘤聚集，在注射后(p.i.)1小時為每克注射劑量的17.2(Tc-99m)或12.9(In-111)％(ID/g)。在p.i.24小時時觀察到顯著的腫瘤滯留為9.4(Tc-99m)或13.0(In-111)％ID/g。因此，腫瘤對其的攝取比其他已知的In-111或Tc-99m標記的抗體片段更高(e.g.Kobayashi et al.，J.Nuc.Med.，Vol.41(4)，pp.755-762，2000；Verhaar et al.，J.Nuc.Med.，Vol.37(5)，pp.868-872，1996)。在24hp.i.化合物的血液清除使得它們的腫瘤/血液比相應(yīng)的為13∶1和6∶1。
最顯著的，In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP(22.5％ID/g)比Kobayashi et al.描述的其他高滯留的In-111標記的重組抗體片段(120％ID/g)表現(xiàn)出明顯更低的腎臟攝取和滯留。在24hp.i.腎臟的滯留是非常常見的問題并常阻礙了鑭系元素標記的化合物在放療中的應(yīng)用。
試驗結(jié)果表明在此所描述的放射性免疫綴合物具有對于診斷性和治療性應(yīng)用的杰出潛能，優(yōu)選的通過腸外給藥而施用于患者。討論關(guān)于細胞毒性抗腫瘤藥物在正常組織中的分布比在腫瘤中更為有效的觀察(37 Bosslet et al.，1998)引起了探索將藥物選擇性轉(zhuǎn)送到腫瘤的可能性的一系列研究。然而，對腫瘤進行有效的定向有著兩個主要的要求1)腫瘤內(nèi)的靶是特異的、充足的、穩(wěn)定的并容易被來自血液的配體分子利用，以及2)具有適當?shù)乃幋鷦恿W(xué)特性的配體分子，它容易從血液彌散到腫瘤并與靶具有高親和力以保證它在腫瘤內(nèi)有效且選擇性聚集。
由于具有與眾不同的特性，腫瘤微環(huán)境是一種可能的泛腫瘤靶(pan-tumoral target)。事實上，腫瘤進展誘導(dǎo)了(以及隨后需要)腫瘤環(huán)境成分的顯著變化，特別是那些細胞外基質(zhì)(ECM)。構(gòu)成實體瘤ECM的分子與正常ECM的分子有著數(shù)量和質(zhì)量上的差異。另外，所有的實體瘤都具有了多種這類腫瘤的ECM成分，這些成分代表了例如細胞侵襲(正常細胞侵襲到腫瘤組織和腫瘤細胞侵襲到正常組織中)和血管生成的常見性能和功能。本發(fā)明者已經(jīng)關(guān)注到組成變化的腫瘤ECM的多種分子的含有ED-B結(jié)構(gòu)域(B-FN)的FN異構(gòu)體。
BF-N廣泛地表達于所有實體瘤的ECM中，因此它被廣泛地研究以及始終與血管生成過程相關(guān)(22 Castellani et al.，1994)，而且不存在于正常的成人組織中(17 Carnemolla et al.，1989)。將治療藥物靶向轉(zhuǎn)送到內(nèi)皮下ECM克服了與實體瘤的間質(zhì)高血壓(interstitial hypertension)相關(guān)的問題(38 Jain et al.，1988；39 Jain，1997；40 Jain RK，1999)。
L19(13 Pini et al.1998；25 Viti，Canc.Res.，23 Tarli，et al.，1999)，一種與FN的ED-B結(jié)構(gòu)域具有高親和力的scFv，體內(nèi)選擇性地并優(yōu)選地聚集于腫瘤新生血管周圍，并且能將與它綴合的許多治療分子的任何一種分子選擇性地轉(zhuǎn)送并聚集到腫瘤實體中(28 Birchler et al.，1999；29 Nilsson，etal.，2001；30 Halin et al.2002；31 Carnemolla et al.，2002)。利用閃爍描繪術(shù)已經(jīng)證實L19具有選擇性地定向腫瘤的能力。
本說明書報道了三種不同的L19抗體形式scFv、小免疫球蛋白/小免疫蛋白(SIP)和完整IgG1對腫瘤血管定向的作用，以及其藥代動力學(xué)。
通過將scFv(L19)與人IgE的分泌型異構(gòu)體S2的εCH4結(jié)構(gòu)域融合生成SIP分子。該εCH4是容許IgE分子二聚體化的結(jié)構(gòu)域，以及S2異構(gòu)體在其COOH末端含有半胱氨酸，它能通過鏈間二硫鍵穩(wěn)定二聚體(35Batista et al.，1996)。IgE的FcεRI結(jié)合位點位于CH3結(jié)構(gòu)域(41 Turner andKinet，1999；42 Vangelista et al.，1999；43 Garman et al.，2000)，所以根據(jù)本發(fā)明的實施方案，scFv與εCH4結(jié)構(gòu)域的融合將不會激活任何導(dǎo)致高敏反應(yīng)的信號。
已經(jīng)研究了三種形式在兩種不同腫瘤模型中的表現(xiàn)鼠F9畸胎瘤和人SK-MEL-28黑色素瘤。第一種是快速生長的腫瘤，一旦種植在約2周時間內(nèi)導(dǎo)致動物死亡。另一方面，SK-MEL-28表現(xiàn)為雙期生長曲線，具有早期的快速生長期，隨后為第二個慢生長期。先前已經(jīng)顯示F9畸胎瘤中的ED-B量在腫瘤生長期間保持恒定(23Tarli，et al.，1999)；相反，聚集于SK-MEL-28黑色素瘤的ED-B與腫瘤生長的能力成正比(23 Tarli etal.，1999)，在第一期發(fā)現(xiàn)有豐富的ED-B，而在第二期的量較少。應(yīng)用SK-MEL-28黑色素瘤可以進行長時間的生物分布研究，且沒有能引起曲解結(jié)果的腫瘤實體的動態(tài)差異(圖2)。
對三種L19抗體形式的體內(nèi)穩(wěn)定性的比較研究顯示，血漿L19-SIP和L19-IgG1在這個試驗期間保持有與注射前相同的免疫反應(yīng)性和分子量。相反的，血漿scFv(L19)快速地散失了它的免疫反應(yīng)性，并生成了太大而不能進入凝膠過濾層析柱的聚集物。這樣的scFv聚集物非常可能造成了腫瘤和肺的％ID/g之間的比率，因為聚集物可以聚集于肺的微血管中(表3)。對于所有的三種形式，血漿清除主要是通過腎臟清除，表現(xiàn)為具有α和β期的雙期曲線，如表4所報告的，它與分子大小成反比。
所研究的不同的抗體形式在腫瘤的聚集是分子的清除率和體內(nèi)穩(wěn)定性的結(jié)果。利用scFv，在注射放射性標記的抗體3h后觀察到每克注射劑量的最大百分比(％ID/g)，然后迅速減少。利用SIP，腫瘤內(nèi)的％ID/g比scFv的高2-5倍，并在注射后4-6小時達到最高值。在F9和SK-Mel-28瘤中都觀察到了這種模式。相反的，在試驗期間IgG1在腫瘤內(nèi)的聚集持續(xù)增高。然而，因為它的緩慢清除，比較于相同時間后的scFv的10比率以及SIP的70，144小時后％ID/g的腫瘤-血液比僅僅是3(圖4)。
在此所研究的三種抗體形式所表現(xiàn)出的體內(nèi)穩(wěn)定性、清除率和腫瘤定向能力的同樣出色的特性已經(jīng)被用于各種診斷和/或治療目的，這依賴于臨床的需要和疾病。例如，在注射后即刻顯示出好的腫瘤-器官和腫瘤-血液比率的放射性標記的抗體對于體內(nèi)診斷性閃爍描繪術(shù)是必需的，主要是因為在這些分析中使用短半衰期的同位素。
將抗體作為一種治療藥物的載體的不同嘗試是有可能的轉(zhuǎn)送到達它們的靶后才表現(xiàn)出它們的治療作用的物質(zhì)(例如僅僅在靶才激活光敏物)，對此與轉(zhuǎn)送到腫瘤的絕對量是相關(guān)的；轉(zhuǎn)送甚至在到達靶之前就發(fā)揮出它們的治療和毒性作用的物質(zhì)(例如發(fā)射物釔-90)，對此必須特別地關(guān)注于作為時間函數(shù)的腫瘤和血液聚集曲線下面積的比例，使得全身毒性最小化和抗腫瘤治療作用最大化。
例如，L19-SIP似乎是分子穩(wěn)定性、清除率和腫瘤聚集的最佳的協(xié)調(diào)分子。已經(jīng)描述(44 Hu.et al，1996；33 Li et al.，1997)了由scFv抗體片段與二聚體結(jié)構(gòu)域結(jié)合構(gòu)成的相似的融合蛋白，但是兩者都將γ1CH3用作為二聚體結(jié)構(gòu)域。人εs2CH4的應(yīng)用提供了一種生成共價穩(wěn)定的二聚體的簡便方法。此外，在輕微充分的條件下可以容易地還原C末端半胱氨酸殘基所形成的二硫鍵橋以保持分子的整體結(jié)構(gòu)，因此提供了用于易獲得的放射性標記或化學(xué)結(jié)合的反應(yīng)基團。這個特性對于臨床應(yīng)用似乎是特別有作為的。
L19-IgG1大量地聚集于腫瘤內(nèi)，盡管這種聚集可以被緩慢的血液清除所抵消，可以利用去除循環(huán)抗體的三步方法使得它不僅可以用于治療目的也可以用于診斷性免疫閃爍描繪術(shù)(45 Magnani et al.2000)。
參考文獻1.Shawler et al.J.Immunol.，1351530-1535，19852.Miller et al.Blood，62988-995，1983.
3.Hakimi et al.J.Immunol.，1471352-1359，1991.
4.Stephens et al.Immunology，85668-674，1995.
5.Riechmann et al.Nature，332323-327，1988.
6.Junghans et al.Cancer Res.，501495-1502，1990.
7.McCafferty et al.Nature，348552-554，1990.
8.Lowman et al.Biochemistry，3010832-10838，19919.Nilsonn et al.Advanced Drug Delivery Reviews，43165-196，2000.
10.Winter et al.Annu.Rev.Immunol.，12433-455，1994.
11.Reichert.Nature Biotech.，19819-822，2001.
12.Huls et al.Nature Biotech.，17276-281，1999，13.Pini et al.J Biol Chem，27321769-21776，1998.
14.Neri and Zardi.Advanced Drug Delivery Reviews，3143-52，1998.
15.Bissel and Radisky.Nature Reviews-Cancer.，146-54，200116.Balza et al.FEBS Lett.，22842-44，198817.Carnemolla et al.J.Cell.Biol.，1081139-1148，198918.Borsi et al.FEBS Lett.，261175-178，199019.Borsi et al.J.Biol.Chem.，2706243-6245，1995.
20.Zardi et al.EMBO J.，62337-2342，1987.
21.ffrench-Constant et al.J.CellBiol.，109903-914，1989.
22.Castellani et al.Int J Cancer，59612-618，199423.Tarli et al.Blood，94192-198，1999.
24.Carnemolla et al.Int J Cancer，68397-405，199625.Viti et al.Cancer Res，59347-353，1999.
26.Neri et al.Nature Biotechnol，151271-1275，1997.
27.Demartis et al.Eur J Nucl Med，284534-4539，2001.
28.Birchler et′al.Nat Biotechnol，17984-988，199929.Nilsson et al.Cancer Res.，61711-716，2001.
30.Halin et al.Nature Biotechnol.In the press.2002.
31.Carnemolla et al.Blood，99，200232.Wu et al.Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，978495-8500，2000.
33.Li et al.Protein Engineering，10731-736，199734.Pini et al.J.Immunol.Methods，206171-183，1997.
35.Batista et al.J.Exp.Med.，1842197-205，1996.
36.Riske et al.J.Biol.Chem.，26611245-11251，1991.
37.Bosslet et al.Cancer Res.，581195-1201，1998.
38.Jain and Baxter.Cancer Res.，487022-7032，1988.
39.Jain.Vascular and interstitial physiology of tumors.Role in cancerdetection and treatment.InR.Bicknell，C.E.Lewis and N.Ferrara(eds).Tumour Angiogenesis，pp.45-59.New YorkOxford University Press，1997.
40.Jain.Annu.Rev.Biomed.Eng.，1241-263，1999.
41.Turner and Kinet.Nature，402 Suppl.，B24-B30，1999.
42.Vangelista et al.Jour.Clin.Invest.，1031571-1578，1999.
43.Garman et al.Nature，406259-266，2000.
44.Hu et al.Cancer Res.，563055-3061，1996.
45.Magnani et al.Br.J.Cancer，82616-620，2000.
表1.在i.v.注射后不同時間點放射性標記抗體的免疫反應(yīng)性(I*)和從superdex200的放射活性回收率(R)

如材料和方法所述的測定了血漿的免疫反應(yīng)性(％)和從superdex200的放射活性回收率(％)。
*為達到標準化，免疫反應(yīng)性測定結(jié)果指的是i.v.注射前的免疫反應(yīng)性的百分比數(shù)值。
Nd未測定表2a.放射性標記的L19和D1.3抗體片段在SK-MEL-28瘤負荷鼠中的生物分布試驗L19(scFv)

D1.3(scFv)

結(jié)果表示為每克注射劑量的組織抗體的百分比(％ID/g)±SDnd未測定
(表32)


(表33)


表2c.放射性標記的L1-IgG1和hIgG1κ在SK-MEL-28瘤負荷鼠中的生物分布試驗L19IgG1

hIgG1κ

結(jié)果表示為每克注射劑量的組織抗體的百分比(％ID/g)±SDnd未測定表3.放射性標記的L19抗體在SK-MEL-28瘤負荷鼠中的器官-腫瘤％ID/g比

表4.三種L19抗體形式血液清除的動力學(xué)參數(shù)

a)兩個半衰期部分的相對數(shù)量表5.放射性標記的L19(scFv)和L19 SIP在F9瘤負荷鼠中的生物分布試驗L19(scFv)

L19 SIP

結(jié)果表示為每克注射劑量的組織抗體的百分比(％ID/g)±SDnd未測定表6

表7

表8

權(quán)利要求
1.一種與人ED-B結(jié)合的特異性結(jié)合構(gòu)件，包含一個包含抗體VH結(jié)構(gòu)域和抗體VL結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合位點，其中抗體VH結(jié)構(gòu)域選自由L19VH結(jié)構(gòu)域、和包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH結(jié)構(gòu)域所組成的組，其中VH CDR3是SEQ ID NO.3的L19 VH CDR3，VH CDR1任選地是SEQ ID NO.1的L19 VH CDR1，而VH CDR2任選地是SEQ IDNO.2的L19 VH CDR2；且其中抗體VL結(jié)構(gòu)域任選地選自由L19 VL結(jié)構(gòu)域、和包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL結(jié)構(gòu)域所組成的組，其中VL CDR3是SEQ ID NO.6的L19 VL CDR3，VL CDR1任選地是SEQ ID NO.4的L19 VL CDR1，VL CDR2任選地是SEQ ID NO.5的L19 VL CDR2；所述的L19 VH結(jié)構(gòu)域和L19 VL結(jié)構(gòu)域序列是Pini等(1998)J.Biol.Chem.27321769-21776所公開的序列；其中所述的特異性結(jié)合構(gòu)件包含一種小免疫球蛋白或包含一種完整的IgG1抗體分子，所述小免疫球蛋白包含與εs2-CH4融合的并二聚體化的所述抗體VH結(jié)構(gòu)域和抗體VL結(jié)構(gòu)域。
2.權(quán)利要求1的特異性結(jié)合構(gòu)件，包含一種抗體VH結(jié)構(gòu)域，所述抗體VH結(jié)構(gòu)域包含具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的氨基酸序列的VH CDR，該特異性結(jié)合構(gòu)件與包含L19 VH結(jié)構(gòu)域和L19 VL結(jié)構(gòu)域的抗體的ED-B結(jié)合結(jié)構(gòu)域競爭性結(jié)合ED-B。
3.權(quán)利要求1或2的特異性結(jié)合構(gòu)件，包含L19 VH結(jié)構(gòu)域。
4.權(quán)利要求3的特異性結(jié)合構(gòu)件，包含L19 VL結(jié)構(gòu)域。
5.前述權(quán)利要求中任一項的特異性結(jié)合構(gòu)件，其是包含εs2-CH4的小免疫球蛋白。
6.權(quán)利要求5的特異性結(jié)合構(gòu)件，其中抗體VH結(jié)構(gòu)域和抗體VL結(jié)構(gòu)域存在于與εs2-CH4融合的scFv抗體分子內(nèi)。
7.權(quán)利要求6的特異性結(jié)合構(gòu)件，其中所述scFv抗體分子通過連接肽與εs2-CH4融合。
8.權(quán)利要求7的特異性結(jié)合構(gòu)件，其中所述連接肽具有氨基酸序列GGSG(SEQ ID NO.7)。
9.權(quán)利要求1到4中任一項的特異性結(jié)合構(gòu)件，其包含完整的IgG1抗體分子。
10.權(quán)利要求1到9中任一項的特異性結(jié)合構(gòu)件，其綴合了一種放射性同位素。
11.權(quán)利要求10的特異性結(jié)合構(gòu)件，其中放射性同位素是Tc、Re、In、Y或Lu中的一種放射性同位素。
12.權(quán)利要求10的特異性結(jié)合構(gòu)件，其中放射性同位素選自由94mTc、99mTc，186Re、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、111In、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、90Y、121Sn、161Tb、153Sm、166Ho、105Rh、177Lu、172Lu和18F組成的組。
13.一種分離的核酸，其包含編碼權(quán)利要求1到9中任一項的特異性結(jié)合構(gòu)件的一或多種核苷酸序列。
14.用權(quán)利要求13的核酸轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
15.一種生產(chǎn)特異性結(jié)合構(gòu)件的方法，所述方法包括在用于生產(chǎn)所述特異性結(jié)合構(gòu)件的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求14的宿主細胞。
16.權(quán)利要求15的方法，進一步包括分離和/或純化所述特異性結(jié)合構(gòu)件。
17.權(quán)利要求15或16的方法，進一步包括將所述特異性結(jié)合構(gòu)件配制成包括至少一種附加成分的組合物。
18.權(quán)利要求15到17中任一項的方法，進一步包括將特異性結(jié)合構(gòu)件結(jié)合于ED-B或ED-B的片段。
19.一種方法，包括將權(quán)利要求1到9中任一項的結(jié)合ED-B的特異性結(jié)合構(gòu)件結(jié)合于ED-B或ED-B的片段。
20.權(quán)利要求18或19的方法，其中所述結(jié)合在體外進行。
21.權(quán)利要求18到20中任一項的方法，包括確定特異性結(jié)合構(gòu)件與ED-B或ED-B的片段的結(jié)合的量。
22.一種包含權(quán)利要求1到9中任一項的特異性結(jié)合構(gòu)件的組合物，用于治療人體或動物體的治療方法。
23.權(quán)利要求22的組合物，用于病理性血管生成病變的治療方法。
24.權(quán)利要求22的組合物，用于腫瘤的治療方法。
25.權(quán)利要求1到9中任一項的特異性結(jié)合構(gòu)件在生產(chǎn)用于治療病理性血管生成病變的藥物中的用途。
26.權(quán)利要求1到9中任一項的特異性結(jié)合構(gòu)件在生產(chǎn)用于治療腫瘤的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用針對纖連蛋白的血管生成標記物ED－B結(jié)構(gòu)域的人重組scFv，L19，在體內(nèi)對腫瘤血管進行選擇性定向。在優(yōu)選的實施方案中，使用具有L19可變區(qū)的完整人IgG1。在其他的實施方案中，采用了通過scFv L19和分泌型IgE異構(gòu)體的恒定CH4結(jié)構(gòu)域融合所生成的小免疫球蛋白，該恒定CH4結(jié)構(gòu)域在其COOH末端天然地含有半胱氨酸并形成共價連接的二聚體。依賴于臨床的需要和疾病，可開發(fā)出具有不同體內(nèi)性能的抗體形式，用于不同的診斷性和治療性目的。這些抗體可以如所述進行標記。
文檔編號A61K38/00GK1639195SQ03805705
公開日2005年7月13日 申請日期2003年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月11日
發(fā)明者勞拉·博爾西, 芭芭拉·卡爾內(nèi)莫拉, 恩里卡·巴爾扎, 帕特里齊亞·卡斯泰拉尼, 盧恰諾·扎爾迪, 馬蒂亞斯·弗里貝, 克里斯托夫-斯特凡·希爾格 申請人:菲洛根股份公司, 舍林股份公司