專利名稱：透明質(zhì)酸介導的腺病毒轉(zhuǎn)導的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學、基因治療和病毒疾病治療領(lǐng)域。更明確的講，本發(fā)明涉及治療腺病毒感染和疾病的方法，涉及用腺病毒和相關(guān)載體導入細胞中的轉(zhuǎn)基因表達的改進方法，和應用這種方法改進基因治療(效果)的方法。
相關(guān)專業(yè)的描述野生型腺病毒和許多種人類疾病相關(guān)，包括呼吸道、眼睛和胃腸道感染。這些感染是兒童學校缺課和成人喪失勞動力的主要原因。在免疫損害的個體中，對腺病毒感染目前還沒有有效的抗病毒療法，通常是致命的。因此，腺病毒感染對于已經(jīng)接受化療、骨髓移植、其他器官移植或患有AIDS的免疫損害病人來說，也許是致命的。小兒骨髓移植病人特別易感，有10-30％發(fā)生腺病毒感染。
沒有能有效抵抗腺病毒感染的抗病毒化合物。因此，該領(lǐng)域需要開發(fā)一種治療腺病毒感染的有效方法，尤其是對于免疫損害的個體。
相比之下，無-致病性復制缺陷性腺病毒載體可用于許多臨床前和臨床基因治療。人類基因治療是治療人類疾病的一種方法，它的基礎是修飾病人細胞中的基因表達。在過去十年中，已經(jīng)變得明顯的是，作為治療遺傳性疾病、癌癥和其他遺傳功能障礙策略的基因療法獲得成功的一個最顯著障礙，是(需要)開發(fā)有用的基因轉(zhuǎn)移和表達的運載體。真核性病毒已經(jīng)用作人體基因治療的運載體。通常用于基因治療研究的病毒載體是腺病毒。
修飾的沒有復制能力的因此沒有致病性的腺病毒，正在許多代謝和腫瘤疾病中用作輸送治療基因的運載體。這些腺病毒載體可能特別適合的疾病，例如最好是通過瞬時治療基因表達而能治療的癌癥，因為DNA不必整合入宿主基因組，而使轉(zhuǎn)基因的表達有限。腺病毒載體在基因替代治療中也是特別有意義的，其中遺傳或代謝缺陷或缺乏可通過提供替代基因的表達而糾正，該替代基因編碼的產(chǎn)物可糾正此種缺陷或缺乏。
可以修飾腺病毒而將治療性或報告轉(zhuǎn)基因有效輸送給多種類型的細胞。導致人類呼吸道疾病的重組腺病毒類2型和5型(分別是Ad2和AdV5)，是目前正在開發(fā)作基因治療的那些腺病毒。Ad2和AdV5均屬于腺病毒的亞類，與人類惡性腫瘤不相關(guān)。近來，已開發(fā)了雜交腺病毒載體AdV5/F35，并證明其在基因治療和相關(guān)研究中有重大意義(Yotnda等，2001)。
重組腺病毒能夠提供極高水平的轉(zhuǎn)基因輸送。此系統(tǒng)在糾正遺傳不平衡的體內(nèi)輸送治療性轉(zhuǎn)基因中的效果已經(jīng)在各種疾病的動物模型中得到證明(Watanabe，1986；Tanzawa等，1980；Golasten等，1983；Ishibashi等，1993；以及S.Ishibashi等，1994)。事實上，編碼囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)劑(CFTR)cDNA的重組復制缺陷性腺病毒已經(jīng)被批準在至少兩個人類CF臨床試驗中使用(Wilson，1993)。Hurwitz等，(1999)已證明了腺病毒介導的基因治療在小鼠癌癥(成視網(wǎng)膜細胞瘤)模型中的治療效果。
不幸的是，腺病毒載體雖然轉(zhuǎn)導靶細胞有效，但不一定會在靶細胞和組織中產(chǎn)生理想水平的轉(zhuǎn)基因表達。已注意到在眼內(nèi)環(huán)境中觀察到的相對高水平的轉(zhuǎn)基因表達是一個例外。
因此需要有效的治療野生型腺病毒的感染，尤其是在免疫損害個體中的感染。也需要有能有效提高導入多種細胞類型和組織中的轉(zhuǎn)基因表達的方法和組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及可用于腺病毒介導疾病和腺病毒感染治療的組合物和方法，以及利用腺病毒和相關(guān)載體提高輸入細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)基因表達的組合物和方法。
因此，本發(fā)明一優(yōu)選的實施方案是一種治療腺病毒疾病的方法，該方法包括鑒定需要治療腺病毒疾病的對象，以及給予該對象一種含有腺病毒抑制劑的組合物，基團量足以抑制或預防腺病毒疾病。另一優(yōu)選的實施方案是一種抑制腺病毒感染的方法，該方法包括給予細胞一種含有腺病毒抑制劑的組合物，其用量足以抑制腺病毒感染的發(fā)展。
一相關(guān)實施方案是治療腺病毒疾病的方法，該方法包括鑒定需要治療腺病毒感染的對象，以及給予該對象的細胞一種含腺病毒抑制劑的組合物，其用量足以抑制腺病毒感染的發(fā)展，從而抑制腺病毒的感染。另一優(yōu)選的實施方案是治療腺病毒疾病的方法，該方法包括鑒定需要治療的對象，以及給予該對象的腺病毒載體轉(zhuǎn)導細胞腺病毒介導轉(zhuǎn)基因表達的抑制劑。
一優(yōu)選實施方案是一種抑制轉(zhuǎn)基因表達的方法，該方法包括獲得用腺病毒或腺病毒載體轉(zhuǎn)導的細胞，并使該細胞與腺病毒-介導轉(zhuǎn)基因表達的抑制劑接觸。在咖一優(yōu)選方面，所述細胞是組織的一部分。其他優(yōu)選的實施方案包括所述細胞是脊椎動物細胞，哺乳動物細胞，靈長動物細胞或人類細胞的那些方案。當然，所述細胞也可以是非-人類的。在特別優(yōu)選的實施方案中，治療的對象是人。在其他方案中，治療的對象是非-人類。
在特別優(yōu)選的實施方案中，所述腺病毒抑制劑包含低分子量透明質(zhì)酸。認為低分子量的透明質(zhì)酸是平均分子量范圍從少于750,000Da至透明質(zhì)酸的最低分子量，例如一個重復單位的透明質(zhì)酸。因此，據(jù)認為低分子量透明質(zhì)酸酶的平均分子量可低于750,000；650,000；550,000；500,000；450,000；400,000；350,000；300,000；250,000；200,000；150,000；100,000；50,000Da或更低，或任何可從中推論出的范圍。
本發(fā)明實施方案中考慮低分子量透明質(zhì)酸的另外方法是表現(xiàn)出比高分子量透明質(zhì)酸低得多分子量的低分子量透明質(zhì)酸。在具體實施方案中，當通過瓊脂糖凝膠電泳作比較時，該低分子量透明質(zhì)酸表現(xiàn)出比高分子量透明質(zhì)酸低得多的分子量。
在本發(fā)明其他的實施方案中，所述腺病毒抑制劑包含高分子量透明質(zhì)酸的降解產(chǎn)物。這些降解產(chǎn)物可通過許多方法獲得。在一實施方案中，所述降解產(chǎn)物包括過時的透明質(zhì)酸。過時的透明質(zhì)酸定義為過期的透明質(zhì)酸，它作為臨床組合物或用作高分子量的透明質(zhì)酸是不可接受的。這種過時通常由制造者在透明質(zhì)酸商業(yè)樣品上提供，但也可用常規(guī)實驗確定。相似的，在另一實施方案中，所述抑制劑包括玻璃體的降解產(chǎn)物。在一種這樣的實施方案中，該降解產(chǎn)物是過時的玻璃體。
在其他實施方案中，所述腺病毒抑制劑包括用裂解酶或透明質(zhì)酸酶處理高分子量透明質(zhì)酸獲得的產(chǎn)物。相似的，在一實施方案中，所述抑制劑包括用裂解酶或透明質(zhì)酸酶處理的玻璃體。
在其它優(yōu)選實施方案中，將要處理的細胞在含有該抑制劑的溶液中培育。在其具體實施方案中，所述抑制劑是低分子量的透明質(zhì)酸。低分子量透明質(zhì)酸的濃度范圍可從大約30mg/100ml溶液至240mg以上/100ml。因此，低分子量透明質(zhì)酸的濃度可以是30mg/100ml，60mg/100ml，120mg/100ml或240mg/100ml或從中可推論出的任何濃度。另外，在具體實施方案中，低分子量透明質(zhì)酸的濃度可接近飽和。
由于本發(fā)明的范圍包括提高腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達的方法和組合物，一優(yōu)選實施方案是提高細胞中轉(zhuǎn)基因表達的方法，該方法包括獲得用腺病毒載體轉(zhuǎn)導的細胞并使該細胞與腺病毒介導轉(zhuǎn)基因表達的增強劑相接觸。
在某些實施方案中，可使所述細胞在轉(zhuǎn)導后2-20小時或任何可從中推論的時間范圍內(nèi)與增強劑接觸。優(yōu)選的實施方案包括使所述細胞在轉(zhuǎn)導后2-4、6或8小時或其中任何更短的時間，與該增強劑接觸。在某些實施方案中，使所述細胞在轉(zhuǎn)導2小時后與增強劑接觸。當然，在其他某些實施方案中，使所述細胞基本上在轉(zhuǎn)導的同時與增強劑接觸。在其他優(yōu)選的實施方案中，使所述細胞從轉(zhuǎn)導起持續(xù)與增強劑接觸。
在與腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達增強相關(guān)的本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，所述增強劑包括玻璃體、高分子量透明質(zhì)酸，或它們的混合物。在具體實施方案中，所述增強劑包括低分子量的透明質(zhì)酸聯(lián)合玻璃體。在其他具體實施方案中，所述增強劑是玻璃體。在其他某些優(yōu)選實施方案中，所述增強劑是高分子量的透明質(zhì)酸。
優(yōu)選的相關(guān)實施方案包括將腺病毒或腺病毒載體轉(zhuǎn)導的細胞在含增強劑的組合物中培育的步驟。當增強劑是玻璃體時，具體的施方案包括組合物中的玻璃體濃度在0.5％-5％(v/v)范圍之間的那些方案。具體實施方案包括組合物中的玻璃體濃度大約是0.5％、2.5％或5％的那些方案。
在其他優(yōu)選實施方案中，所述增強劑包括高分子量的透明質(zhì)酸。高分子量透明質(zhì)酸的分子量考慮是透明質(zhì)酸的平均分子量范圍從大于750,000Da至透明質(zhì)酸的最高分子量，例如超過數(shù)百萬Da或更大。因此，考慮高分子量透明質(zhì)酸的平均分子量可大于650,000；750,000；1,000,000Da或更高，或任何可從中推論的范圍。
在本發(fā)明的實施方案中，所考慮的高分子量透明質(zhì)酸的另外方法是該高分子量透明質(zhì)酸表現(xiàn)出比低分子量透明質(zhì)酸高得多的分子量。在具體實施方案中，當通過瓊脂凝膠電泳作比較時，所述高分子量的透明質(zhì)酸表現(xiàn)出大大高于低分子量透明質(zhì)酸的分子量。
當所述增強劑是高分子量透明質(zhì)酸時，某些實施方案包括在細胞溫育的組合物中高分子量透明質(zhì)酸的濃度范圍從10微克/100微升至100微克以上/100微升。
本發(fā)明的實施方案不受所用的具體腺病毒或腺病毒載體的限制。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種方法，可增強或抑制腺病毒感染以及該腺病毒和載體通常所引起的轉(zhuǎn)基因表達。當然，在具體實施方案中，是使所述增強劑與腺病毒感染的細胞相接觸。在其他具體實施方案中，考慮所述腺病毒載體衍生自腺病毒5型或腺病毒2型以及它們的相關(guān)者。當然，當將腺病毒構(gòu)建物配制入載體時，可包含能在細胞內(nèi)表達的轉(zhuǎn)基因。
考慮可通過本發(fā)明的方法和組合物來增強或抑制其表達的具體轉(zhuǎn)基因，它們包括但不限于在癌癥治療中所應用的轉(zhuǎn)基因。在其他具體實施方案中，所述轉(zhuǎn)基因是成視網(wǎng)膜細胞瘤(RB)基因或胸苷激酶(TK)基因。在其他實施方案中，所述轉(zhuǎn)基因是腫瘤抑制基因。在具體實施方案中，所述腫瘤抑制基因編碼p53。在其他優(yōu)選的實施方案中，所述轉(zhuǎn)基因編碼-報告基因。報告基因是該專業(yè)技術(shù)人員熟知的，報告基因的選擇不限于本發(fā)明(所用的)。實施方案包括轉(zhuǎn)基因是熒光素酶、綠熒光蛋白質(zhì)，或β-半乳糖苷酶基因的那些方案。
本發(fā)明提供了細胞中腺病毒-介導的轉(zhuǎn)基因表達的增強。在具體實施方案中，所述細胞是一種組織的一部分。在其他實施方案中，所述細胞是脊椎動物細胞，哺乳動物細胞，靈長動物細胞或人類細胞。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)CD44蛋白質(zhì)在透明質(zhì)酸或玻璃體存在時調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達的作用。因此，一實施方案是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達的一種方法，該方法包括使轉(zhuǎn)染的細胞與腺病毒載體以及至少一種抗CD44特異性抗體接觸。相關(guān)的實施方案包括的步驟為使所述細胞與至少一種抗CD44特異性抗體接觸之前、接觸時或之后與高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體相接觸。在某些實施方案中，所述抗體包括至少一種單克隆抗體。在其他實施方案中，所述抗體是KM114。
本發(fā)明其它實施方案包括一種增加轉(zhuǎn)基因表達的試劑盒，其包括高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體，以及用于腺病毒載體轉(zhuǎn)染的組分。
其它實施方案包括篩選透明質(zhì)酸形式的方法。如該專業(yè)那些技術(shù)人員所知道的，透明質(zhì)酸的形式可根據(jù)它們的化學結(jié)構(gòu)、化學特性、物理特性以及本文中它們對腺病毒-介導的轉(zhuǎn)基因表達的作用分類。這些形式的非限制性實例是高分子量透明質(zhì)酸、低分子量的透明質(zhì)酸、能有效抑制腺病毒-介導的轉(zhuǎn)基因表達的透明質(zhì)酸，和能有效增強腺病毒-介導的轉(zhuǎn)基因表達的透明質(zhì)酸，以及能有效治療腺病毒疾病的透明質(zhì)酸。
因此，某些實施方案包括獲得透明質(zhì)酸的第一樣品(a)；獲得已知形式透明質(zhì)酸的第二樣品(b)；并且比較(a)中獲得的樣品與(b)中獲得的樣品對腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達的作用，其中增強了轉(zhuǎn)基因表達表明是表達增強形式的透明質(zhì)酸，抑制了轉(zhuǎn)基因表達表明是表達抑制形式的透明質(zhì)酸。相似的，某些實施方案包括通過凝膠電泳比較樣品(a)和(b)的步驟，以及將樣品(a)和(b)的電泳移動度與它們對腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達作用相關(guān)的步驟。特別優(yōu)選的實施方案包括瓊脂糖凝膠電泳。
遵照長期的專利條款，在權(quán)利要求書和說明書中單詞“a”和“an”，當和單詞“包括”一起應用時，代表一個或多個。
附圖的簡要說明下面的附圖組成了本說明書的一部分，并包括在本說明書中以進一步闡明本發(fā)明的某些方面。通過這里提供的具體實施方案的詳細描述并聯(lián)合參考這些附圖的一個或多個圖可更好的了解本發(fā)明。


圖1.玻璃體增加了腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達。直方圖代表平均值的標準誤差。
圖2.透明質(zhì)酸裂解酶消除了玻璃體增強的腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達。
圖3.增強的轉(zhuǎn)基因表達不依賴于腺病毒的結(jié)合或內(nèi)化。
圖4A、4B、4C和4D。玻璃體增強了用另一種腺病毒受體轉(zhuǎn)導的細胞中腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達。將WERI-Rb細胞(1×104細胞/孔)培育在沒有血清的介質(zhì)中，含有(C，D)或不含有(A，B)0.5％的玻璃體。所述細胞用嵌合的腺病毒(AdV5/F35)以5vp/細胞的比率轉(zhuǎn)導，該嵌合腺病毒中AdV35的纖維/球節(jié)結(jié)構(gòu)域替代了AdV5的纖維/球節(jié)結(jié)構(gòu)域。顯示了代表性區(qū)域的明亮區(qū)(A，C)和熒光區(qū)(B，D)圖。
圖5.玻璃體介導的轉(zhuǎn)基因表達增強玻璃體加入的時間依賴性。參考線顯示了在缺少玻璃體時的基線轉(zhuǎn)基因表達。
圖6.玻璃體介導的轉(zhuǎn)基因表達增強玻璃體加入的時間依賴性。參考線表示在整個20小時培育期間連續(xù)接觸0.5％玻璃體的細胞中轉(zhuǎn)基因的表達。
圖7.透明質(zhì)酸激活腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達。直方圖代表平均值的標準誤差。
圖8.“廢棄”的透明質(zhì)酸抑制腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達。直方圖代表平均值的標準誤差。
圖9.PMA-激活的CD44對于增強腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達十分重要。直方圖代表平均值的標準誤差，用配對Student t檢驗測定是否有意義。
圖10.抗CD-44抑制了腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達。直方圖代表平均值的標準誤差。
圖11.煮沸的玻璃體對于增強腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達的作用。
圖12.結(jié)合的玻璃體和低分子量透明質(zhì)酸對增強腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達的作用。
圖13.玻璃體對人結(jié)膜外植體中腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達的作用。
圖14.高分子量(HMW)透明質(zhì)酸的裂解酶消化。
圖15.裂解酶消化的透明質(zhì)酸酶對腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達的作用。
發(fā)明詳述本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，眼睛玻璃體的一種重要成分，透明質(zhì)酸，能調(diào)節(jié)通過腺病毒載體導入細胞的轉(zhuǎn)基因的表達以及野生型腺病毒的傳染性。本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，高分子量的透明質(zhì)酸本身或作為玻璃體的一種成分，在體內(nèi)和體外能增強通過腺病毒載體從眼外環(huán)境導入細胞的功能性轉(zhuǎn)基因的表達。這種表達的增強不依賴于腺病毒載體附著和進入細胞。
更令人驚奇和有意義的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)低分子量透明質(zhì)酸能抑制腺病毒感染和腺病毒載體的轉(zhuǎn)導。最有意義的是，低分子量的透明質(zhì)酸，或通過酶促反應或其他處理已經(jīng)過修飾或降解的低分子量透明質(zhì)酸，都可用來治療腺病毒感染疾病。因此，低分子量或修飾的透明質(zhì)酸或玻璃體可作為治療腺病毒感染的預防性或治療性組合物。
抑制作用指一種制劑部分或完全阻止、限制、減慢、減少、延遲、降低、抑制、壓制或干擾某生物學過程，以任何程度，部分或完全。因此，抑制劑是能夠部分或完全阻止、限制、減慢、減少、延遲、約束、降低、抑制、壓制或干擾某生物學過程，例如生物化學反應，病毒或細胞生長或其他生理過程，包括但不限于感染或疾病過程，疾病或生命循環(huán)過程，器官功能或性能等等的制劑。
本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，透明質(zhì)酸通過與CD44作用可激活一系列細胞內(nèi)活動，CD44是許多類型細胞上常見的粘附分子家族的一個成員。因此，能特異性結(jié)合于透明質(zhì)酸結(jié)合功能域并阻斷CD44的透明質(zhì)酸激活的抗體，同時抑制了玻璃體-增強的和基線腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達。經(jīng)工程改進而能表達CD44的Jurkat細胞，但不是已知不表達CD44或任何其他透明質(zhì)酸結(jié)合受體的野生型Jurkat細胞，可能顯示在存在玻璃體或高分子量透明質(zhì)酸時能抑制腺病毒載體輸送的轉(zhuǎn)基因表達的增強。佛波醇酯大大增強了玻璃體所產(chǎn)生的作用。以前的報導顯示PMA可導致CD44的寡聚化和激活?？梢杂昧呀饷概嘤齺懋a(chǎn)生(或用過時的或降解的透明質(zhì)酸)的低分子量透明質(zhì)酸，不僅不能增強腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達，而且令人吃驚和出乎意料地抑制了基線腺病毒載體介導的轉(zhuǎn)基因表達。
上述增強效應不依賴所用的啟動子或轉(zhuǎn)基因，但對腺病毒載體來說是特異的，即使它們利用不同的結(jié)合性或內(nèi)化受體。這種效應的時間進程提示透明質(zhì)酸對于腺病毒介導轉(zhuǎn)基因表達的增強發(fā)生在病毒結(jié)合和內(nèi)化之后。
以前的報導已經(jīng)證明高分子量的透明質(zhì)酸可結(jié)合和激活CD44信號轉(zhuǎn)導，但低分子量透明質(zhì)酸可結(jié)合但不激活相同的機制。因此低分子量透明質(zhì)酸起了CD44功能抑制劑的作用。高分子量透明質(zhì)酸增強了腺病毒介導轉(zhuǎn)基因的表達，然而低分子量的透明質(zhì)酸酶抑制了基線腺病毒轉(zhuǎn)導。形成透明質(zhì)酸基本單元的葡萄糖醛酸-N-乙酰葡萄糖胺雙糖可激活CD44但僅僅在細胞內(nèi)注射時。CD44有許多復雜的細胞功能，包括起細胞轉(zhuǎn)運蛋白的功能，控制細胞骨架結(jié)構(gòu)和運動性，并且通過控制微管和肌動蛋白的裝配調(diào)節(jié)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運。通過低分子量G-蛋白介導的CD44調(diào)節(jié)性級聯(lián)反應可能影響到許多這些功能。
1.腺病毒腺病毒包含線性雙鏈DNA，基因組的大小為30-35kb(Reddy等，1998；Morrison等，1997；Chillon等，1999)。存在50種以上的血清型的人類腺病毒，以及80種以上的相關(guān)形式，它們可根據(jù)免疫、分子和功能標準分為6個家族(Wadell等，1980)。物理學上，腺病毒是一種中等大小的二十面體病毒，含有一個雙鏈線性DNA基因組，例如腺病毒5型，有35,935個堿基對(Chroboczek等，1992)。腺病毒需要進入宿主細胞并且將病毒基因組轉(zhuǎn)移至細胞核才能感染細胞并復制病毒。
腺病毒基因組的顯著特征是一個早期區(qū)域(E1、E2、E3和E4基因)，一個中間區(qū)域(pIX基因、Iva2基因)，一個晚期區(qū)域(L1、L2、L3、L4和L5基因)，一個主要晚期啟動子(MLP)，倒置-末端-重復區(qū)(ITRs)以及一個Ψ序列(Zheng等，1999；Robbins等，1998；Graham和Prevec，1995)。所述早期基因E1、E2、E3和E4在感染后從病毒表達，其編碼的多肽能調(diào)節(jié)病毒基因的表達、細胞基因的表達、病毒復制并且抑制細胞凋亡。進一步在病毒感染期間，MLP被激活，這導致了晚期(L)基因的表達，編碼的多肽的腺病毒衣殼化所需。所述的中間區(qū)編碼腺病毒衣殼組分。腺病毒倒置的末端重復區(qū)(ITRs；100-200bp長度)，是順式元件，起著復制起始的作用，為病毒DNA復制所必需。所述Ψ序列是腺病毒基因組包裝所必需的。
腺病毒，特別是腺病毒血清2型和5型感染的機制已經(jīng)受到廣泛研究。已鑒定到一種宿主細胞表面蛋白質(zhì)命名為CAR(柯薩廳腺病毒受體)是這些腺病毒的主要結(jié)合受體。CAR的細胞內(nèi)源性功能還沒有闡明。纖維球節(jié)和CAR之間的相互作用足以使腺病毒結(jié)合至細胞表面。然而，隨后腺病毒的五鄰體堿基和其他細胞表面蛋白質(zhì)，αv整聯(lián)蛋白家族的成員之間的相互作用是病毒有效內(nèi)化所必需的。腺病毒(組分)的解離在內(nèi)化期間開始；纖維蛋白質(zhì)留在細胞表面結(jié)合于CAR，腺病毒的其余組分隨著病毒顆粒被轉(zhuǎn)運通過細胞質(zhì)以逐步方式解離在核膜處形成孔復合體。病毒DNA排出通過核膜進入核，病毒DNA在核中復制，表達病毒蛋白質(zhì)，裝配成新的病毒顆粒。腺病毒感染機制中的特殊步驟可作為調(diào)節(jié)病毒感染和基因表達的潛在靶標。
2.基因工程改進的腺病毒和腺病毒載體在具體實施方案中，考慮用腺病毒表達載體來輸送表達構(gòu)建物?！跋俨《颈磉_載體”或“腺病毒載體”包括那些足以(a)支持所述構(gòu)建物的包裝以及(b)最終表達的含腺病毒序列的構(gòu)建物，已被克隆在組織或細胞特異性結(jié)構(gòu)中。因此，腺病毒載體可包括任何含腺病毒序列的工程發(fā)行發(fā)行改造的載體。
本發(fā)明的腺病毒表達載體包含腺病毒的基因工程改造形式。腺病毒載體的性質(zhì)不認為是成功實施本發(fā)明的關(guān)鍵。腺病毒可以是任何所知的血清型和/或亞群A-F之一。為了獲得可用于本發(fā)明中腺一種病毒載體，亞群C的腺病毒5型是優(yōu)選的起始材料。這是因為腺病毒5型是一種人腺病毒，關(guān)于其的大量生物化學和遺傳信息已經(jīng)知道，并且它在歷史上已經(jīng)被用于大多數(shù)采用腺病毒作為載體的結(jié)構(gòu)中。
腺病毒基因轉(zhuǎn)移的優(yōu)點有能夠感染范圍廣泛的細胞類型(包括非分裂性細胞)，中等大小的基因組，操作簡單，高感染性，以及它們能夠以高滴度增殖(Wilson，1996)。另外，宿主細胞的腺病毒感染不會導致染色體整合，因為腺病毒DNA可以游離方式復制，沒有與其他病毒載體相關(guān)的潛在基因毒性。腺病毒在結(jié)構(gòu)上也是穩(wěn)定的(Marienfeld等，1999)，并且在大量擴增后沒有測到基因組的重排(Parks等，1997；Bett等，1993)。
腺病毒的生長和操作是該領(lǐng)域技術(shù)員知道的，并顯示有著廣闊的體外和體內(nèi)宿主范圍(美國專利5,670,488；美國專利5,932,210；美國專利5,824,544)。此群病毒可以高滴度獲得，例如109-1011空斑形成單位/ml，它們具有高度感染性。腺病毒的生命周期不需要整合入宿主細胞基因組中。腺病毒載體輸送的外來基因是游離基因，因此對于宿主細胞是低基因毒性。
雖然腺病毒載體和其他載體系統(tǒng)相比提供了數(shù)種獨特的優(yōu)點，但它們的應用經(jīng)常受到載體的免疫原性、重組基因插入的大小約束，復制水平低、以及轉(zhuǎn)基因表達水平低的限制。應用腺病毒載體的一個主要關(guān)心點是在包裝細胞系中載體產(chǎn)生期間或基因治療個體期間，是否產(chǎn)生了復制活性病毒。復制活性病毒的產(chǎn)生可能會對病人造成未預計到的病毒感染和病理結(jié)果的嚴重威脅。Armentano等描述了復制缺陷性病毒載體的制備，聲稱能消除復制活性腺病毒無意中產(chǎn)生的潛在可能性(美國專利第5,824,544號)。此種復制缺陷腺病毒的方法包括刪除E1區(qū)域和重置蛋白質(zhì)IX基因，其中所述載體能表達異源哺乳動物基因。
一種產(chǎn)生可用作基因轉(zhuǎn)移運載體腺病毒的常用方法是刪除E1基因(E1)，這涉及E2、E3和E4啟動子的誘導(Graham和Prevec，1995)。然后將治療基因重組插入取代E1基因，其中治療性基因的表達受E1啟動子或異源啟動子驅(qū)動。接著在“輔助手”細胞系中增殖E1-復制缺陷性病毒，該輔助細胞系可提供反式E1多肽(例如人胚胎腎細胞系293)?；蛘?，可刪除E3區(qū)域，部分E4區(qū)域或兩者，將可在真核細胞中操作的啟動子控制下的異源核酸序列插入到腺病毒基因組中，用于基因轉(zhuǎn)運(美國專利第5,670,488號；美國專利第5,932,210號)。
當然，在本發(fā)明具體實施方案中，考慮可將低分子量的或經(jīng)修飾的透明質(zhì)酸或玻璃體用于治療這種不經(jīng)意下產(chǎn)生的復制活性腺病毒。如上所述，考慮本發(fā)明應采用的載體是復制缺陷性的。然而，也考慮到含有復制活性腺病毒載體的方法可能會導致所謂的擴增。因此，考慮具體的實施方案是，可通過應用低分子量或經(jīng)修飾的透明質(zhì)酸或玻璃體來調(diào)節(jié)復制活性病毒載體的擴增程度和速率。
已經(jīng)產(chǎn)生了一類嵌合性腺病毒載體(AdV5/F35，例如)，它們能夠?qū)⑥D(zhuǎn)基因輸送給造血祖代細胞。AdV5/F35載體將轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)運給原始祖代細胞時十分有效(Yotnda等，2001)。這些載體也能夠感染骨髓細胞的煙酸己可堿陰性‘副群’。由這些載體輸送的免疫調(diào)節(jié)基因能夠轉(zhuǎn)導并以一定水平表達大約5天以上。在本發(fā)明一優(yōu)選實施方案中，用透明質(zhì)酸處理通過這種嵌合腺病毒載體導入的轉(zhuǎn)基因(例如但不限于AdV5/F35)，能充分增強轉(zhuǎn)基因的表達。
3.用腺病毒和腺病毒相關(guān)載體進行基因治療在某些實施方案中，本發(fā)明人考慮用透明質(zhì)酸或玻璃體以及相關(guān)化合物來增強導入細胞中的轉(zhuǎn)基因的表達，從而達到基因治療的目的。
基因治療通常包括將轉(zhuǎn)基因?qū)爰毎D(zhuǎn)基因的表達結(jié)果是減輕或治療了疾病或遺傳疾病。所包括的轉(zhuǎn)基因可以是那些編碼蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)性或酶活性RNAs、抑制產(chǎn)物例如反義RNA或DNA，或其他任何基因產(chǎn)物。表達是這種基因產(chǎn)物的產(chǎn)生過程或是這種基因產(chǎn)物產(chǎn)生所發(fā)生的效應。因此，增強表達包括產(chǎn)生更多的某轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物或促進該產(chǎn)物在限定的細胞、組織、器官內(nèi)或機體狀態(tài)中的作用。通過腺病毒載體輸送轉(zhuǎn)基因包括被稱為的細胞轉(zhuǎn)導。如本文所用，轉(zhuǎn)導定義為通過腺病毒或相關(guān)載體將轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物導入細胞。
許多實驗、新發(fā)明、臨床前期研究和臨床試驗目前正處于采用腺病毒作為基因輸送載體的研究階段。例如，正在開發(fā)以腺病毒基因輸送為基礎的基因療法用于治療肝病(Han等，1999)，精神疾病(Lesch，1999)，神經(jīng)疾病(Smith，998；Hermens和Verhaagen，1998)，冠狀動脈疾病(Feldman等，1996)，肌肉疾病(Petrof，1998)，以及各種癌癥例如結(jié)腸直腸癌(Dorai等，1999)，膀胱癌(Irie等，1999)，前列腺癌(Mincheff等，2000)，頭頸癌(Blackwell等，1999)，乳腺癌(Stewart等，1999)，肺癌(Batra等，1999)以及卵巢癌(Vanderkwaak等，1999)。在本發(fā)明具體實施方案中，采用高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體來提高腺病毒載體輸送的轉(zhuǎn)基因的表達。
因此，本發(fā)明的目標可以通過提高包含在基因輸送系統(tǒng)中的治療性基因的表達而實現(xiàn)，該輸送系統(tǒng)例如是重組腺病毒載體輸送系統(tǒng)，制備的該系統(tǒng)能使被轉(zhuǎn)導細胞接觸表達增強劑，例如高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體，并導致該治療性基因的增強表達。
所述被轉(zhuǎn)導細胞可存在于細胞培養(yǎng)物中或體內(nèi)。在體內(nèi)，如本發(fā)明所考慮的那樣，細胞可位于相關(guān)機體的任何組織或器官中。組織可包含宿主細胞或待轉(zhuǎn)的細胞或與核酸輸送組合物和/或其他制劑接觸的細胞。所述組織可以是機體的一部分或從其分離得到的。在某些實施方案中，組織和它的組成細胞可包括但不限于，血液(例如造血細胞(例如人造血祖代細胞、人造血干細胞、CD34+細胞、CD4+細胞)，淋巴細胞和其他血譜系細胞)，骨髓、腦、干細胞、血管、肝、肺、骨、乳房、軟骨、子宮頸、結(jié)腸、角膜、胚胎、子宮內(nèi)膜、內(nèi)皮、上皮、食管、筋膜、成纖維細胞、濾泡、神經(jīng)節(jié)細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、杯狀細胞、腎、淋巴結(jié)、肌肉、神經(jīng)元、卵巢、胰腺、外周血管、前列腺、皮膚、小腸、脾、胃、睪丸。
在某些實施方案中，所述宿主細胞或組織包含在至少一個機體中。在某些實施方案中，該機體可是人、靈長動物或小鼠。在其他實施方案中，該機體可以是任何易受腺病毒和相關(guān)病毒或腺病毒載體感染的或轉(zhuǎn)導的真核生物或真核細胞。該領(lǐng)域的技術(shù)人員會進一步明白應在什么條件下培育上述宿主細胞，從而保存它們并使得它們分裂形成代。
已開發(fā)了用于癌癥治療的基因治療策略。已開發(fā)了根據(jù)基因轉(zhuǎn)動方法的不同的方法來治療腫瘤。已開發(fā)了方法來糾正所確定的基因位點的特殊損害，這種損害可使腫瘤轉(zhuǎn)化和發(fā)展(Spandidos等，1990；Banerjee等，1992)?？刹捎眉夹g(shù)使顯性致癌基因過度表達以抑制轉(zhuǎn)化基因或基因產(chǎn)物。腫瘤抑制基因功能的喪失可采用方法來恢復野生型腫瘤抑制基因的功能。除了這些實現(xiàn)突變補償?shù)姆椒ㄍ?，已?jīng)開發(fā)了遺傳技術(shù)來特異性和選擇性根除腫瘤細胞。這些分子化學治療方法依賴于腫瘤細胞中毒素基因的特異性表達(Abe等，1993)。最后，基因轉(zhuǎn)移方法已經(jīng)被用來實現(xiàn)抗腫瘤免疫接種。這些遺傳性免疫增強方法采用了遺傳調(diào)節(jié)技術(shù)，來提高對腫瘤的免疫識別。結(jié)果，已開發(fā)了多種不同方法來實現(xiàn)癌癥的基因治療，所有的方法都采用腺病毒載體轉(zhuǎn)導細胞。
Hurwitz等(1999)描述了一種含有單純瘡疹(病毒)胸苷激酶基因的腺病毒載體，當將其體外轉(zhuǎn)導入Y79Rb人成視網(wǎng)膜細胞瘤細胞中用前體藥物丙氧鳥苷治療時，能有效促進對那些成視網(wǎng)膜細胞瘤細胞的殺傷。一種通過玻璃體內(nèi)注射Y79Rb細胞制造的成視網(wǎng)膜細胞瘤的小鼠模型，也對轉(zhuǎn)導和治療有反應。因此，基因治療可有效降低人成視網(wǎng)膜細胞瘤小鼠模型中的腫瘤負荷。顯然，腺病毒載體輸送的轉(zhuǎn)基因的增強表達會進一步增加此療法的殺傷效果。具體說，在眼內(nèi)環(huán)境即玻璃體中，腺病毒載體的表達增強是有利的。更普遍的是，AdV-TK/丙氧鳥苷自殺基因治療已經(jīng)顯示在動物模型中治療多種腫瘤是有效的。見例如Eastham等，1996(前列腺)；Chen等，1994(腦)；Chen等，1995(肝)；O’Malley等，1995和Goebel等，1996(頸)；Behbakht等，1996和Rosenfeld等，1996(卵巢)；Esandi等，1997(間皮瘤)。本發(fā)明的具體實施方案包括采用透明質(zhì)酸來增強或促進AdV-TK/丙氧鳥苷基因治療的(效果)。
腺病毒載體輸送的具體轉(zhuǎn)基因沒有限制包括那些可用于各種治療和研究目的轉(zhuǎn)基因，以及報告基因和報告基因系統(tǒng)，和用來跟蹤轉(zhuǎn)基因表達和腺病毒與腺病毒載體轉(zhuǎn)導有效性的構(gòu)建物。因此，作為實例，下面是可能用本發(fā)明的組合物和方法來增強表達的可能的基因類型發(fā)育基因(例如粘附分子、細胞周期調(diào)節(jié)蛋白激酶抑制劑、Wnt家族成員、Pax家族成員、Winged螺旋家族成員、Hox家族成員、細胞因子/淋巴因子和它們的受體，生長或分化因子和它們的受體，神經(jīng)遞質(zhì)和它們的受體)，致癌基因(例如ABLI、BLC1、BCL6、CBFA1、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETV6、FGR、FOX、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3和YES)，腫瘤抑制基因(例如APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC、NF1、NF2、RB1、TP53和WT1)，酶(例如ACP去飽和酶和羥化敏，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、ATP酶、醇脫氫酶、淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、過氧化氫酶、纖維素酶、環(huán)加氧酶、脫羧酶、糊精酶、酯酶、DNA和RNA聚合酶、透明質(zhì)酸合成酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、GTP酶、解旋酶、半纖維素酶、透明質(zhì)酸酶、整合酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、激酶、乳糖酶、脂酶、脂氧合酶、裂解酶、溶菌酶、果膠酯酶、過氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶和肽酶、支鏈淀粉酶、重組酶、反轉(zhuǎn)錄酶、拓撲異構(gòu)酶、木聚糖酶)，以及報告基因(例如綠熒光蛋白質(zhì)和它的多種顏色變異體，熒光素酶、CAT報告系統(tǒng)，β-半乳糖苷酶等等)。
腫瘤抑制基因的功能是抑制過廢的細胞增殖。這些基因的滅活破壞了它們的抑制活性，導致了無節(jié)制的增殖。腫瘤抑制劑p53、p16和C-CAM在下面描述。
目前認為p53是腫瘤抑制基因。已發(fā)現(xiàn)高水平的p53突變體存在于許多經(jīng)化學致癌作用、超聲放射和多種病毒包括S40轉(zhuǎn)化的細胞中。p53基因常常是各種各樣人腫瘤中突變滅活的目標，并已證明為常見人癌癥中最頻繁突變的基因。它在超過50％的人NSCLC中(Hollstein等，1991)和廣范的其他腫瘤中發(fā)生突變。
p53基因編碼一種393-氨基酸磷蛋白，能與宿主蛋白質(zhì)，例如大-T抗原和E1b形成復合物。該蛋白質(zhì)見于正常組織和細胞中，但與轉(zhuǎn)化細胞或腫瘤組織相比，濃度是極低。令人感興趣的是，野生型-p53看來在調(diào)節(jié)細胞生長和分裂中是重要的。在一些病例中已經(jīng)顯示野生型-p53的過度表達在人腫瘤細胞系中具有抗增殖性。因此，p53可能起著細胞生長負調(diào)節(jié)劑的作用(Weinberg，1991)，可能直接抑制失控性細胞生長或間接激活抑制這種生長的基因。因此，野生型-p53基因的缺乏或失活可能導致轉(zhuǎn)化。然而，一些研究表明p53突變體的存在可能是該基因轉(zhuǎn)化潛能完全表達所必需的。
野生型-p53被認為是許多細胞類型中的一種重要生長調(diào)節(jié)劑。錯義的突變常見于p53基因，是致癌基因轉(zhuǎn)化能力所必需的。由點突變引起的單個基因改變可產(chǎn)生致癌性p53。然而，不象其他的致癌基因，據(jù)所知p53點突變至少發(fā)生在30個不同的密碼子中，常產(chǎn)生顯性等位基因而發(fā)生細胞表型的改變，但不會還原為純合性。此外，許多這些顯性負等位基因看來可被機體耐受并在種系中傳代。各種突變體等位基因似乎范圍從最小的功能障礙到強烈的外顯顯性負等位基因之間(Weinberg，1991)。
Casey和同事們報導將編碼野生型-p53的DNA轉(zhuǎn)染入兩種人類乳腺癌細胞系中，恢復了這種細胞生長抑制的控制(Casey等，1991)。也已證明野生型而不是突變體p53轉(zhuǎn)染進入人肺癌細胞系具有相似作用(Takahasi等，1992)?？磥韕53優(yōu)于突變基因，當用突變基因轉(zhuǎn)染細胞時將會選擇它來抵抗增殖。轉(zhuǎn)染p53的正常表達不會影響含有內(nèi)源性p53細胞的生長。因此，這樣的構(gòu)建物可被正常細胞攝取而沒有副作用。因此，提出用野生型p53治療p53相關(guān)癌癥將減少惡性細胞的數(shù)量或降低它們的生長速率。
真核細胞周期的主要過渡受依賴細胞周期調(diào)節(jié)蛋白的激酶或CDK的觸發(fā)。一種CDK，細胞周期調(diào)節(jié)蛋白依賴性激酶4(CDK4)通過G1調(diào)節(jié)其發(fā)展。CDK4的活性受活性亞單位、D-型細胞周期調(diào)節(jié)蛋白和抑制性亞單位p16INK4的控制。p16INK4經(jīng)生物化學特性鑒定為一種能夠特異性結(jié)合并抑制CDK4的蛋白質(zhì)，因此可調(diào)節(jié)Rb的磷酸化(Serrano等，1993；Serrano等，1995)。由于p16INK4蛋白是CDK4抑制劑(Serrano，1993)，這種基因的缺失會增加CDK4的活性，導致Rb蛋白質(zhì)的高磷酸化。也知道P16能調(diào)節(jié)CDK6的功能。
p16INK4屬于一類新近描述的CDK-抑制性蛋白質(zhì)，也包括p15INK4B、p21WAF1和p27KIP1。p16INK4基因圖位于9p21，一個在許多類型腫瘤中經(jīng)常缺失的染色體區(qū)域。p16INK4基因的純合性缺失和突變在人腫瘤細胞系中常見。這種事實提示p16INK4基因是一種腫瘤抑制基因。然而，這種解釋已經(jīng)受到了挑戰(zhàn)，因為觀察到p16INK4基因在原代未培養(yǎng)腫瘤中的改變頻率比在培養(yǎng)的細胞系中低得多(Caldas等，1994；Cheng等，1994；Hussussian等，1994；Kamb等，1994；Mori等，1994；Okamoto，1994；Nobori等，1995；Orlow等，1994；Arap等，1995)。然而，后來顯示雖然p16基因在許多原代腫瘤中是完整的，但存在其他機制阻止p16蛋白質(zhì)在一些腫瘤類型的大多數(shù)中表達。P16啟動子的高甲基化是這些機制中的一個(Merlo等，1995；Herman，1995；Gonzalez-Zulueta，1995)。通過質(zhì)粒表達載體轉(zhuǎn)染恢復野生型p16INK4的功能可減少一些人癌細胞系的集落形成(Okamoto，1994；Arap，1995)。用腺病毒載體輸送p16可抑制一些人癌細胞系的增殖并降低人腫瘤異種移植物的生長。
C-CAM實際上在所有上皮細胞中都有表達(Odin和Obrink，1987)。C-CAM，表觀分子量105kD，通過與能中和細胞凝集的特異性抗體反應(Obrink，1991)最初分離自大鼠肝細胞的胞質(zhì)膜。近來的研究表明，在結(jié)構(gòu)上，C-CAM屬于免疫球蛋白(Ig)超家族，它的序列與癌胚抗原(CEA)高度同源(Lin和Guidotti，1989)。采用桿狀病毒表達系統(tǒng)(Cheung等，1993)表明C-CAM的第一Ig區(qū)域是細胞粘附活性至關(guān)重要的。
已知細胞粘附分子，或CAM’s參與在分子間相互作用的復雜網(wǎng)絡，此網(wǎng)絡調(diào)節(jié)器官發(fā)衣和細胞分化(Edelman，1985)。最近的數(shù)據(jù)表明CAM’s的異常表達可能參與數(shù)種腫瘤的發(fā)生過程；例如，主要在上皮細胞中表達的E-鈣粘著蛋白表達的降低，與數(shù)種腫瘤的發(fā)展相關(guān)(Edelman和Crossin，1991；Frixen等，1991；Bussemakers等，1992；Matsura等，1992；Umbas等，1992)。同樣，(Giancotti和Ruoslahti，1990)證明體內(nèi)通過基因轉(zhuǎn)移提高α5β1整合素的表達可降低中國倉鼠卵巢細胞的腫瘤發(fā)生。現(xiàn)已證明C-CAM能抑制體外和體內(nèi)的腫瘤生長。
黑色素瘤分化相關(guān)(MA)基因與人黑色素瘤細胞生長和分化相關(guān)，或直接影響它們(Su等，1998)。近來研究證明MDA家族成員的抗-致腫瘤活性不限于黑色素瘤。MDA-7的表達抑制了體外成膠質(zhì)細胞瘤、骨肉瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌、子宮頸癌和鼻咽癌的生長(Jiang等，1996)。MDA-7的表達通過誘導調(diào)亡作用抑制了體外人乳腺癌細胞的生長，和體內(nèi)異種移植物模型的生長(Su等，1998)。
本發(fā)明其他可采用的腫瘤抑制劑包括BRCA1、BRCA2、zac1、p73、MMAC-1、ATM、HIC-1、DPC-4、FHIT、NF2、APC、DDC、PTEN、ING1、NOEY1、NOEY2、PML、OVCA1、MADR2、WT1、53BP2和IRF-1。
本發(fā)明其他可采用的基因包括Rb、APC、DCC、NF-1、NF-2、WT-1、MEN-I、MEN-II、zac1、p73、VHL、MMAC1/PTEN、DBCCR-1、FCC、rsk-3、p27、p27/p16融合物、p21/p27融合物、抗血栓形成基因(例如COX-1、TFPI)，PGS、Dp、E2F、ras、myc、neu、raf、erb、fms、trk、ret、gsp、hst、abl、E1A、p300，參與血管發(fā)生的基因(例如VEGF、FGF、血小板反應素、BAI-1、GDAIF或它們的受體)以及MCC。
4.透明質(zhì)酸透明質(zhì)酸有許多特性，它們在其他醫(yī)學治療和生物過程中可能是有利的。實際上，透明質(zhì)酸酶在疾病、感染的治療以及其他應用是普遍的。這些應用的范圍從簡單的潤滑，到藥物的輸送，到逆轉(zhuǎn)錄酶病毒感染的治療。例如見，美國專利第6,194,392號、第6,218,373號、第6,271,216號、第4,840,941號。同樣見Hoekstra，(1999)和Lee和Spicer，(2000)。
透明質(zhì)酸、透明質(zhì)烷或透明質(zhì)酸是一種天然存在多聚糖(氨基葡聚糖)，由葡萄糖醛酸和N-乙酰-葡萄糖胺通過β1-3糖苷鍵連接的重復單元而形成。這些單元通過β1-4糖苷鍵連接形成沒有分支的分子鏈。當葡萄糖醛酸的羧基電離時此鏈負電荷。它發(fā)生在生理pH值下產(chǎn)生透明質(zhì)酸鈉。透明質(zhì)酸非常擅長保持水分。
眼睛玻璃體中透明質(zhì)酸的分子量和濃度是可不同，取決于它存在的機體物種，眼睛中透明質(zhì)酸的部位，以及分析分子量的方法。因此，透明質(zhì)酸的分子量可以從50,000Da以上不同，它可形成高粘度的溶液。它是人體最豐富的化合物之一，通常用于細胞外基質(zhì)中以支持和保護細胞。它存在于所有的體液中，但在眼睛的玻璃體液，關(guān)節(jié)骨液和臍帶中特別多。透明質(zhì)酸是親水性并且十分潤滑。
Merck指數(shù)確定了透明質(zhì)酸的分子量在50,000至8×106道爾頓(Da)范圍之內(nèi)，取決于來源、制備方法和測定方法。Merck出版物將透明質(zhì)酸講授為一種眼外科的輔助物。美國專利第4,801,619號揭示了關(guān)節(jié)內(nèi)給予的透明質(zhì)酸分子量大約是3×106Da或更高。
透明質(zhì)酸可分離自脊椎動物組織(例如人臍帶、公雞雞冠)或產(chǎn)生菌株的培養(yǎng)物中。各種級別的透明質(zhì)酸可從商業(yè)上獲得。例如見Sigma的透明質(zhì)酸目錄條目。一種高純度、非炎性形式描述于美國專利第4,141,973號。一種商業(yè)產(chǎn)品，HealonTM可從Pharmacia AB(Uppsala，Sweden)獲得。此制劑中的透明質(zhì)酸據(jù)說分子量超過750,000Da(可進一步超過1,200,000Da)，并提出可應用于各種關(guān)節(jié)情況的治療。
全世界有許多透明質(zhì)酸制造商。這些包括Anika(Woburn，MA)，Biomatrix Inc.(Ridgefield，NJ)，Bio-Technology General Corp.(IselinNJ)，F(xiàn)idia AdvancedBiopolymers(Brindisi，Italy)，Genzyme Corp.(FraminghamMA)，Kibun Food ChemifaCo.(Tokyo，Japan)，Lifecore Biomedical(Chaska，MN)和Seikagaku Corp.(Tokyo，Japan)。
高分子量聚合透明質(zhì)酸的低分子量前體的天然合成認為是由玻璃體細胞產(chǎn)生的。高分子量的透明質(zhì)酸形成于細胞外間隙，大多數(shù)情況下是通過透明質(zhì)酸合成酶的作用。存在著多種透明質(zhì)酸合成酶，可用于產(chǎn)生從低分子量前體到高分子量形式的透明質(zhì)酸(Spicer和Mcdonald，1998)。透明質(zhì)酸合成酶的活性可以很容易測定(Spicer，2001)。
高分子量透明質(zhì)酸可以用酶處理，通過透明質(zhì)酸酶或裂解酶(EC4.2.2.1)導致回收其衍生物或低分子量形式。見美國專利第6,258,791號。透明質(zhì)酸酶綜述見Kreil(Protein Sci，1995，41666-1669)。透明質(zhì)酸酶可以是來自哺乳動物、爬行動物或膜翅目昆蟲透明質(zhì)酸聚糖水解酶，來自水蛭唾液腺的透明質(zhì)酸聚糖水解酶，或來自細菌，特別是鏈球菌、肺炎球菌和梭狀芽胞桿菌透明質(zhì)酸裂解酶。透明質(zhì)酸酶從商業(yè)供應商廣泛獲得。例如見，Sigma-Aldrich中的透明質(zhì)酸酶條目(2002)。
5.用透明質(zhì)酸或玻璃體調(diào)節(jié)腺病毒介導的基因表達和在腺病毒感染中的應用本發(fā)明人取得了令人驚奇和出乎預料的發(fā)現(xiàn)，高分子量透明質(zhì)酸的衍生物即低分子量透明質(zhì)酸，“過期的”高分子量透明質(zhì)酸，用裂解酶或透明質(zhì)酸酶處理的高分子量透明質(zhì)酸，或經(jīng)過這樣處理的玻璃體，能顯著抑制腺病毒和腺病毒載體的細胞轉(zhuǎn)導。這些組合物出乎意料的特性使得能夠治療腺病毒感染，復制活性腺病毒載體的感染和調(diào)節(jié)腺病毒載體的轉(zhuǎn)導。
低分子量透明質(zhì)酸，正本發(fā)明中所考慮，包含接觸過能降解高分子量形式或玻璃體環(huán)境的高分子量透明質(zhì)酸的產(chǎn)物。這種降解可以通過酶處理或通過使高分子量形式的透明質(zhì)酸或玻璃體接觸空氣足夠長的時間而實現(xiàn)，或者選擇比臨床應用許可日期更老化的透明質(zhì)酸或玻璃體。這種降解產(chǎn)物可通過用凝膠電泳方法分析完整的、未修飾的或新鮮的透明質(zhì)酸與降解產(chǎn)物的比較而識別。
具體說，這種比較的一種非限制性實例包括進行相關(guān)樣品的電泳，通過1X Tris醋酸EDTA緩沖液配的0.5％瓊脂糖(TAE，見Sambrook 2001)。可將樣品加入瓊脂糖凝膠的孔中，用7體積樣品加入到1體積的8x加樣緩沖液中(2M蔗糖；1.5M NaCl)并暴露于80-100伏特4-6小時。電泳后，在黑暗中用50％乙醇配的0.005％StainsAllTM(4，5，4’，5’-二苯-3，3’-二乙基-9-甲基-硫代羰氰溴化物；3，3’-二乙基-9-甲基-4，5，4’，5’-二苯硫代羰氰；1-乙基-2-[3-(3-乙基萘[1，2-d]噻唑啉-2-亞烯基)-2-甲丙烯基]萘[1，2-d]噻唑鎓溴化物，Sigma-Adrich Co.，Inc.)處理12小時或過夜。接著用水清洗凝膠去除未結(jié)合染料?？赏ㄟ^將這樣處理的凝膠暴光30分鐘而顯現(xiàn)透明質(zhì)酸。正如該領(lǐng)域技術(shù)人員所知到的，其他比較透明質(zhì)酸酶樣品的分子量和其他特性的方法是該領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，可用于本發(fā)明的上下文中，以鑒定那些能有效抑制腺病毒感染或腺病毒載體介導的轉(zhuǎn)基因表達的樣品。
具體說，本發(fā)明人在這里提供了篩選合適的透明質(zhì)酸酶樣品的方法，用作腺病毒感染或腺病毒介導轉(zhuǎn)基因表達的抑制劑或增強劑。因此，可以篩選高分子量透明質(zhì)酸，或接觸或處理過的高分子量透明質(zhì)酸因而產(chǎn)生了低分子量透明質(zhì)酸或其它衍生物的樣品，它們的抑制腺病毒介導轉(zhuǎn)基因表達或腺病毒感染的能力。進行這種篩選過程通常是通過將這種樣品與已知對于腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達或感染有效的組合物作比較，已知有效的組合物將在本說明書和實施例中提供。
一種典型但非-限制性的實施例包括使含有懷疑樣品的組合物與腺病毒載體或腺病毒轉(zhuǎn)導的或被腺病毒感染的細胞接觸，同樣使含有已知對腺病毒介導轉(zhuǎn)基因表達或感染有效的樣品(如本文提供的高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體)與相同的細胞接觸。比較與所述樣品接觸的效果，可采用一些可得到的方法來測定感染性、轉(zhuǎn)導率或基因表達水平的方法。腺病毒感染或轉(zhuǎn)基因表達的抑制可通過懷疑樣品中感染或基因表達水平的下降而顯示。同樣，可以測定樣品增強轉(zhuǎn)基因表達的能力。
轉(zhuǎn)基因表達的水平可通過特異性測定所涉及的具體轉(zhuǎn)基因存在的方法來測定，例如抗體、酶試驗等等。
在具體實施方案中，腺病毒感染的治療包括用足量的腺病毒抑制劑處理細胞、組織、器官或各個機體，從而抑制存在的感染，防止感染擴散到其它細胞，或預防任何細胞的原發(fā)感染。所述抑制劑可包括透明質(zhì)酸衍生物、低分子量透明質(zhì)酸、“過時的”透明質(zhì)酸、“過時的”玻璃體或經(jīng)透明質(zhì)酸酶處理過的玻璃體等等。
所述細胞與低分子量透明質(zhì)酸或高分子量的透明質(zhì)酸或玻璃體衍生物的接觸可發(fā)生在細胞與載體或病毒接觸后的一段時間之后，因為細胞先與載體或病毒接觸，或基本上與細胞感染同時。細胞與載體或病毒接觸后可經(jīng)過一段時間，使細胞與低分子量透明質(zhì)酸或高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體的衍生物接觸的時間范圍可從幾秒鐘至數(shù)分鐘至數(shù)小時。因此，所經(jīng)過的時間可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59或60秒鐘或更少。相似的，所經(jīng)過的時間可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59或60分鐘或更少。同樣，所經(jīng)過的時間可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時，以及可從中推論出的任何時間范圍。
細胞與低分子量透明質(zhì)酸或高分子量的透明質(zhì)酸或玻璃體衍生物接觸時間的范圍可從幾分鐘或更少至數(shù)小時或更長。因此，所述細胞接觸的時間可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59或60秒鐘或更少。相似的，這段時間可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59或60分鐘或更少。同樣，此接觸時間可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23，24小時或更長，以及可從中推論出的任何時間范圍。特別考慮細胞與低分子量透明質(zhì)酸或高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體衍生物的接觸時間可以是一天或許多天。
所應用的低分子量透明質(zhì)酸或高分子量的透明質(zhì)酸或玻璃體衍生物的濃度范圍可以從小于10μg/100ml到至少240μg/100ml或更高。因此，低分子量透明質(zhì)酸或高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體衍生物每100μl溶液中的量可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、150、200、240μg或更高，以及可從中推論出的任何濃度范圍。
顯然，當目的是治療腺病毒感染或復制活性腺病毒載體產(chǎn)生的感染時，所述治療的具體時間和治療開始的時間將由適當?shù)尼t(yī)學實踐和經(jīng)驗決定。
為了增強低分子量透明質(zhì)酸或高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體衍生物的有效性，理想的是將本發(fā)明的這些組合物和方法與治療其它疾病和病癥有效的制劑聯(lián)用。在一些實施方案中，考慮可將常規(guī)的治療或制劑包括但不局限于藥物治療劑、外科治療藥物(例如外科手術(shù))或它們的聯(lián)合，與給予低分子量透明質(zhì)酸或高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體衍生物聯(lián)合。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明的治療方法可包括聯(lián)合其他治療藥物給予本發(fā)明的低分子量透明質(zhì)酸或高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體衍生物。
這個過程包括將細胞同時與某藥物和低分子量透明質(zhì)酸或高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體衍生物接觸，或者在一段時間內(nèi)，分別將低分子量透明質(zhì)酸或高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體衍生物以及某藥物給予細胞、組織或機體，從而產(chǎn)生理想的治療效果。術(shù)語“接觸”和“暴露”，當用于細胞、組織或機體時，用來描述治療性構(gòu)建物或治療藥物輸送給靶細胞、組織或機體的過程，或者是將它們與靶細胞、組織或機體直接并置的過程?？墒辜毎?、組織或機體(例如通過給藥)與一種組合物或，含有低分子量透明質(zhì)酸或高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體衍生物以及一種或多種藥物的藥物制劑接觸，或通過使細胞與兩種或多種不同的組合物或制劑接觸，其中一種組合物包含低分子量透明質(zhì)酸或高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體衍生物，其它組合物包含一種或多種藥物。
低分子量透明質(zhì)酸或高分子量的透明質(zhì)酸或玻璃體衍生物可在其他藥物之前、同時和/或之后給藥，間隔幾分鐘到幾周。在低分子量透明質(zhì)酸或高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體衍生物以及其他藥物分別應用于細胞、組織或機體的實施方案中，通常應保證在每次輸送之間不會明顯過期，這樣低分子量透明質(zhì)酸或高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體衍生物以及藥物仍能對細胞、組織或機體發(fā)揮有利的聯(lián)合作用。例如，在這樣的實例中，考慮一可使細胞、組織或機體，基本上同時接觸二、三、四種或更多種藥物(例如在不到1分鐘內(nèi))，與低分子量透明質(zhì)酸或高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體衍生物。在其他方面，一種或多種藥物的給藥時間從基本同時至大約1鐘，大約5鐘，大約10分鐘，大約20分鐘，大約30分鐘，大約45分鐘，大約60分鐘，大約2小時，大約3小時，大約4小時，大約5小時，大約6小時，大約7小時，大約8小時，大約9小時，大約10小時，大約11小時，大約12小時，大約13小時，大約14小時，大約15小時，大約16小時，大約17小時，大約18小時，大約19小時，大約20小時，大約21小時，大約22小時，大約23小時，大約24小時，大約25小時，大約26小時，大約27小時，大約28小時，大約29小時，大約30小時，大約31小時，大約32小時，大約33小時，大約34小時，大約35小時，大約36小時，大約37小時，大約38小時，大約39小時，大約40小時，大約41小時，大約42小時，大約43小時，大約44小時，大約45小時，大約46小時，大約47小時，大約48小時，大約1天，大約2天，大約3天，大約4天，大約5天，大約6天，大約7天，大約8天，大約9天，大約10天，大約11天，大約12天，大約13天，大約14天，大約15天，大約16天，大約17天，大約18天，大約19天，大約20天，大約21天，大約1天，大約1周，大約2周，大約3周，大約4周，大約5周，大約6周，大約7周，大約8周，大約1個月，大約2個月，大約3個月，大約4個月，大約5個月，大約6個月，大約7個月，大約8個月，大約9個月，大約10個月，大約11個月或大約12個月，和可從其推論出的任何時間范圍，在給予低分子量透明質(zhì)酸或高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體衍生物之前和/或之后。
可采用多種低分子量透明質(zhì)酸或高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體衍生物與一種或多種藥物的聯(lián)合療法。這種聯(lián)合的非限制性例子顯示如下，其中包含低分子量透明質(zhì)酸或高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體衍生物的組合物是“A”，藥物為“B”A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/BB/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/AB/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A將包含低分子量透明質(zhì)酸或高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體衍生物給予細胞、組織或機體可遵循治療給藥的通用方案，如果有的話要考慮到毒性。預計如果需要可重復治療周期。在具體實施方案中，考慮多種其他藥物可與本發(fā)明聯(lián)合應用。
調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達的組合物包含各種聯(lián)合的透明質(zhì)酸或玻璃體溶液。透明質(zhì)酸或玻璃體可與各種相容性介質(zhì)組合輸入細胞、組織等等。這些介質(zhì)包括但不限于無血清細胞培養(yǎng)基和水。所考慮的實施方案包括其他任何與透明質(zhì)酸相容的合適稀釋劑或介質(zhì)，或其他與玻璃體相容的介質(zhì)或稀釋劑。如下面所述，這種組合物可包括因為各種目的加入的其他成分，例如防腐劑等等，只要它們不損害其中所提供的活性成分的作用。
本發(fā)明人取得了令人驚奇和出乎預料的發(fā)現(xiàn)高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體能明顯增強腺病毒和腺病毒載體導入的轉(zhuǎn)基因的表達。這些組合物的未料到的特性使得可以調(diào)節(jié)腺病毒和腺病毒相關(guān)載體導入的基因。在具體實施方案中，細胞與高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體接觸，這樣增強了腺病毒轉(zhuǎn)基因的表達。
細胞與高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體接觸可發(fā)生在細胞與載體或病毒接觸一段時間之后，因為細胞先與載體或病毒接觸，或基本上與細胞轉(zhuǎn)導同時。細胞與載體或病毒接觸后經(jīng)過一段時間后，使細胞與高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體接觸，該時間范圍可從幾秒鐘至數(shù)分鐘或至數(shù)小時。因此，這段時間可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59或60秒鐘或更少。相似的，這段時間可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59或60分鐘或更少。同樣，這段時間可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小時，以及可從中推論出的任何時間范圍。
細胞與高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體接觸的時間可從幾分鐘或更少至幾個小時或更多。因此，細胞的接觸時間可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59或60秒鐘或更少。相似的，這段時間可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59或60分鐘或更少。同樣，這段時間可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23，24小時或更長，以及可從中推論出的任何時間范圍。
高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體所應用的濃度范圍從小于10μg/100ml到至少100μg/100ml或更高。因此，高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體在每100ml溶液中的含量可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100μg或更高。相似的，這些濃度可以表達為百分數(shù)、重量/體積。
調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達的組合物包含各種組合的高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體溶液。當高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體與各種相容性介質(zhì)組合提供時，可將它們輸入細胞、組織等等。包括但不限于無血清細胞培養(yǎng)基和水?？紤]的實施方案包括其他任何與透明質(zhì)酸相容的合適稀釋劑或介質(zhì)，或者其他與玻璃體相容的介質(zhì)或稀釋劑。如下面所述，這樣的組合物可包括為了各種目的而加入的其他成分，例如防腐劑等，只要它們不損害其中提供的活性成分的作用。
6.藥物制劑藥物治療劑以及給藥的方法，劑量等等是該領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(例如見，“Physicians Desk Reference”，Goodman和Gilman的“The Pharmacological Basisof Therapeutics”，“Remington’s Pharmaceutical Sciences”和“The Merk Index，第11版”，本文納入相關(guān)部分作參考)，可以根據(jù)本文公開的內(nèi)容和本發(fā)明相結(jié)合。一些劑量變化將是必然的，這取決于待治療者的情況。負責給藥的人無論如何要確定各患者的合適劑量，這種個體劑量的確定是該專業(yè)普通技術(shù)人員的技術(shù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的藥物組合物僅包含有效量的透明質(zhì)酸或玻璃體，或存在的其他藥物(例如，腺病毒載體)溶解或分散在藥學上可接受的運載體中。詞組“藥物的或藥學上可接受的”指分子實體以及不會產(chǎn)生副反應、過敏或其他不良反應的組合物，當它們給予動物例如人類來說是合適的。包含至少一種腺病毒載體、透明質(zhì)酸、玻璃體或其他活性成分的藥物組合物的制備根據(jù)本發(fā)明揭示的內(nèi)容是該專業(yè)那些技術(shù)人員知道的，例子見Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack PrintingCompany，1990。而且，對于動物(例如人)給藥，應該明白所述制劑應符合FDA當局生物學標準所要求的無菌、致熱原性、總體安全和純凈的標準。
如本文所用，“藥學上可接受的運載體”包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗菌劑、抗真菌劑)，等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥物、藥物穩(wěn)定劑、凝膠、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、調(diào)味劑、染料等類似物質(zhì)和它們的組合，如該專業(yè)普通技術(shù)人員所知道的(見，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company，1990，1289-1329頁)。除了迄今與該活性成分不相容的任何常規(guī)運載體，均考慮其在治療性和藥物組合物中的應用。
本發(fā)明的組合物可包括不同類型的運載體，取決于它是以固體、液體還是氣溶膠形式給藥，以及給藥途徑如注射時它是否需要無菌。本發(fā)明的給藥途徑可以是靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、病損內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻腔內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、局部、腫瘤內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、囊內(nèi)、粘膜、心包內(nèi)、臍帶內(nèi)、眼內(nèi)、口服、局部、吸入(例如氣溶膠吸入)，注射、滴注、連續(xù)滴注、局部灌注直接淋浴靶細胞，通過插管、灌洗、以乳劑，以脂質(zhì)組合物(例如脂質(zhì)體)，或通過其他方法或上述方法的組合，如該領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知那樣(見，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，MackPrinting Company，1990)。
給予動物病人本發(fā)明組合物的實際劑量可由物理和生理因素所決定，例如體重、疾病的嚴重性、待治療疾病的類型、先前或同時的治療干預，病人的特發(fā)病以及給藥的途徑。負責給藥的醫(yī)生無論如何將要確定組合物中活性成分的濃度，以及該個體的合適劑量。
在某些實施方案中，藥物組合物可包含，例如至少0.1％的活性化合物。在其他實施方案中，每次給藥可含有活性化合物大約2％-75％重量單位，或者大約在25％-60％之間，以及可從中推論出的任何范圍。在其他非限制性實例中，一個劑量可含有大約1微克/kg/體重、大約5微克/kg/體重、大約10微克/kg/體重、大約50微克/kg/體重、大約100微克/kg/體重、大約200微克/kg/體重、大約350微克/kg/體重、大約500微克/kg/體重、大約1mg/kg/體重、大約5mg/kg/體重、大約10mg/kg/體重、大約50mg/kg/體重、大約100mg/kg/體重、大約200mg/kg/體重、大約350mg/kg/體重、大約500mg/kg/體重，至大約1000mg/kg/體重或更高，以及可從中推論出的任何范圍。在非限制性的實例中，從這里列出的數(shù)量衍生的給藥范圍是，大約5mg/kg/體重至大約100mg/kg/體重、大約5微克/kg/體重至大約500mg/kg/體重等等，可根據(jù)上面描述的數(shù)量給藥。
在任何情況下，所述組合物可含有各種抗氧化劑以延緩一種或多種成分的氧化。此外，微生物作用的預防可通過應用防腐劑，例如各種抗菌和抗真菌劑，包括但不限于對羥苯甲酸酯類(例如甲基對羥苯甲酸酯、丙基對羥苯甲酸酯)，三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或它們的組合。
本發(fā)明的透明質(zhì)酸可配制入自由堿、中性或鹽形式的組合物中。藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽，例如那些與蛋白質(zhì)組合物的自由氨基形成的，或與無機酸(例如鹽酸或磷酸)形成的，或與有機酸(如醋酸、草酸、酒石酸或苦杏仁酸)形成的鹽。與自由羧基形成的鹽也可衍生自無機堿，例如鈉、鉀、銨、鈣或鐵氫氧化物；或有機堿如異丙基胺、三甲基胺、組胺或普魯卡因。
在所述組合物是液體形式的實施方案中，運載體可以是一種溶劑或分散介質(zhì)，包含但不限于水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙烯二醇、液體聚乙烯二醇等等)，脂類(例如甘油三酯、植物油、脂質(zhì)體)以及它們的組合。維持適當?shù)牧鲃有钥赏ㄟ^應用包衣，例如卵磷脂；通過分散在運載體例如液態(tài)多元醇或脂質(zhì)中，維持所需的微粒大小；通過應用表面活性劑，例如羥丙基纖維素；或這些方法的聯(lián)合。在許多情況下，優(yōu)選包含等滲劑，例如糖、氯化鈉或它們的組合。
在其他實施方案中，可在本發(fā)明中應用眼滴液、滴鼻溶液或噴霧，氣溶膠或吸入劑。這種組合物通常設計為與靶組織類型相容。在非限制性實例中，滴鼻溶液通常是水溶液，設計為以滴液或噴霧施加到鼻道。滴鼻溶液應配制，成在許多方面與鼻分泌物相似，這樣可保留正常的纖毛運動。因此，在優(yōu)選的實施方案中，含水的滴鼻溶液通常是等滲的或輕微緩沖的以保持大約5.5-6.5的pH值。此外，和那些應用于眼科制劑中相似的抗菌防腐劑，藥物或合適的藥物穩(wěn)定劑，如果需要也可包含在所述制劑中。例如，各種商品化滴鼻制劑已為人所知，包含有諸如抗生素或抗組胺等藥物。
在某些實施方案中，制備的本發(fā)明組合物可通過口服途徑給藥。在這些實施方案中，所述固體組合物可包括，例如溶液、懸浮液、乳劑、片劑、藥丸、膠囊(例如硬或軟的明膠殼膠囊)，持續(xù)釋放的制劑，口含劑組合物、片劑、糖錠、酏劑、懸浮液、糖漿劑、糯米紙囊劑或它們的組合。口服組合物可直接摻入膳食中的食物?？诜o藥的優(yōu)選運載體包括惰性稀釋劑、可同化可食用運載體或它們的組合。本發(fā)明的其他方面，可將口服的組合物配制為糖漿劑或酏劑。糖漿劑或酏劑，也可包含例如至少一種活性藥物、增甜劑、防腐劑、調(diào)味劑、染料、防腐劑或它們的組合。
在某些優(yōu)選的實施方案中，口服組合物可包含一種或多種粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、調(diào)味劑和它們的組合。在某些實施方案中，組合物可包含一種或多種以下物質(zhì)粘合劑例如西黃蓍膠、阿拉伯膠樹、玉米淀粉、明膠或它們的組合；賦形劑例如磷酸二鈣、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂或它們的組合；崩解劑例如玉米淀粉、土豆淀粉、褐藻酸或它們的組合；潤滑劑，例如硬脂酸鎂；增甜劑，例如蔗糖、乳糖、糖精或它們的組合；調(diào)味劑例如薄荷、冬青油、櫻桃調(diào)味劑、橙調(diào)味劑等等；或上述的組合。當劑量單位形式是膠囊時，除了上述類型的材料，還可包含運載體，例如液體運載體。其他多種材料可以包衣的形式存在，或修飾所述劑量單位的物理形式。例如，片劑、藥丸或膠囊可用蟲膠、糖或兩者包裹。
適合其他給藥方式的制劑包括栓劑。栓劑是多種重量和形狀的固體劑量形式，通常加入藥物，插入直腸、陰道或尿道。在插入之后，栓劑在體腔液中變軟、融化或溶解。對于栓劑，通常傳統(tǒng)的運載體包括例如聚烷撐二醇、甘油三酯或它們的組合。在某些實施方案中，栓劑可通過含有例如活性成分的混合物形成，活性成分的范圍是大約0.5％-10％，優(yōu)選大約1％-2％。
無菌注射溶液的配制是通過將所需量的活性化合物加入到合適的溶劑中，該溶劑含有以上列舉的各種其他成分，如果需要隨后過濾除菌。通常，分散液是通過將各種無菌活性成分加入到含有基礎分散介質(zhì)和/或其他成分的無菌運載體中而配制的。在用無菌粉末配制無菌可注射溶液、懸浮液或乳劑的情況中，配制的優(yōu)選方法是真空干燥或冷凍干燥技術(shù)，可生產(chǎn)活性成分加來自前面無菌過濾后液體介質(zhì)的其他所需成分的粉末。如果需要該液體介質(zhì)應該適當緩沖，在注射前用足夠的鹽水或葡萄糖先使得該液體稀釋液等滲。也考慮配制用作直接注射的高濃度組合物，其中采用DMSO作為溶劑預想能導致十分快速的滲透，將高濃度的活性藥物輸入一塊小區(qū)域。
美國專利第4,808,576號提示了透明質(zhì)酸，一種眾所周知的當直接應用于受傷組織時能減少哺乳動物關(guān)節(jié)組織中創(chuàng)傷結(jié)局的制劑，如果將它應用于遠離受傷組織的部位，它將通過哺乳動物的自然過程運輸?shù)皆撌軅M織。因此，根據(jù)該專利，可以任何治療上可接受的形式通過通常的遠離途徑給予透明質(zhì)酸，包括靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和局部。這種特性使得透明質(zhì)酸的應用大為方便和有吸引力。例如，根據(jù)該專利用透明質(zhì)酸治療馬或人關(guān)節(jié)炎時，不再需要更因難的關(guān)節(jié)內(nèi)注射。
在制造和存儲條件下，所述組合物必須是穩(wěn)定的，并能受到保護不受微生物例如細菌和真菌的污染。應知道內(nèi)毒素污染應該保持最小，在安全的水平，例如低于0.5ng/mg蛋白質(zhì)。
在具體實施方案中，可通過在該組合物中應用延遲吸收的制劑使可注射組合物延長吸收，例如膠原、單硬脂酸鋁、白明膠或它們的組合。
實施例下面的實施例包括顯示本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。本領(lǐng)域那些技術(shù)人員應知道實施例中公開的技術(shù)，遵循了本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的代表性技術(shù)，在實施本發(fā)明中運作良好，因此可以認為構(gòu)成了實施本發(fā)明優(yōu)選方式。然而，本領(lǐng)域的那些技術(shù)員，根據(jù)本文公開的內(nèi)容，應該知道可在所公開的具體實施方案中做許多變化，仍能獲得同樣的或相似的結(jié)果，而不背離本發(fā)明的思路和范圍。
實施例1-5中采用的材料和方法學細胞系將WERI-Rb細胞(來自人成視網(wǎng)膜細胞瘤)，Jurkat細胞(人急性T-細胞淋巴瘤)，經(jīng)基因工程改造而能表達CD44，以及將HeLa細胞(人子宮頸上皮樣癌)保存在培養(yǎng)基中，采用添加了5％FCS的Minimal Essential培養(yǎng)基。通過用含有CD44微小基因(Brian Seed，Harvard University)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(用CellFECTINTM，GibcoBRL)Jurkat細胞建立Jurka-CD44細胞系。72小時后，用G418(800μg/ml)選擇表達CD44的細胞，并通過稀釋克隆建立穩(wěn)定的細胞系。將EpH4細胞(由L.Huber，IMP，Vienna，Austria提供的小鼠上皮細胞)培養(yǎng)于添加有10％FBS和葡萄糖(4.5g/l)的Dulbeco’s MinimalEssential培養(yǎng)基中?？娠@示血清對于腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達有作用，然而這種作用不如玻璃體強，血清的作用也不受裂解酶消化的抑制。這里報導的實驗是用培養(yǎng)于無血清或0.5％血清的細胞進行，以分辨玻璃體的作用。所有細胞培養(yǎng)物維持在37℃5％的CO2中。
腺病毒構(gòu)建物含有螢火蟲熒光素酶(AdV-Iuc)或綠熒光蛋白質(zhì)(AdV-GFP)報告基因或表達腺病毒35(AdV5/F35)纖維結(jié)構(gòu)域的腺病毒5(AdV)構(gòu)建物由Baylor醫(yī)學院的細胞和基因治療中心提供。表達突變纖維/球節(jié)或五鄰體堿基結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建物由T.Wickham提供(Gen Vec Corp)。
抗體和試劑抗小鼠CD44的透明質(zhì)酸酶結(jié)合位點的KM114單克隆抗體獲自BD BiosciencesPharMingen。玻璃體可從新鮮或冷凍的牛眼睛中收獲(Ladpak Slaughterhouse，Needville，TX)。用19-號針頭剪切玻璃體降低其粘度，離心澄清，然后用無血清培養(yǎng)基稀釋。透明質(zhì)酸裂解酶和膠原酶從SIGMATM購買(Sigma-Aldrich Co.，Inc.)。高分子量透明質(zhì)酸(HealonTM，1％透明質(zhì)酸鈉)獲自Pharmacia，Corp。用熒光素酶試驗系統(tǒng)TM(Promega)定量測定表達的熒光素酶活性。
實施例1玻璃體增強腺病毒-介導的轉(zhuǎn)基因表達當采用AdV-Iuc，一種含報告基因--螢火蟲熒光素酶基因的腺病毒載體來轉(zhuǎn)導成視網(wǎng)膜細胞瘤細胞系時，低濃度的玻璃體顯著增強了腺病毒-介導的轉(zhuǎn)基因表達。將WERI-Rb細胞(1×104細胞/孔)與AdV-Iuc(200病毒微粒(vp/細胞))以及0％(對照)、0.1％、0.5％、2.5％和5％新鮮配制的牛玻璃體一起培育18小時。收獲細胞并測定熒光素酶活性。培養(yǎng)物分成一式三份進行試驗。圖1顯示轉(zhuǎn)基因表達的增加是玻璃體濃度的直接函數(shù)。這種增強比存在血清時觀察到的要高。
實施例2透明質(zhì)酸裂解酶消除了玻璃體的增強作用為了考察玻璃體的兩種主要成分膠原或透明質(zhì)酸的潛在作用，在與成視網(wǎng)膜細胞瘤細胞和病毒載體培育之前用膠原酶或透明質(zhì)酸裂解酶消化玻璃體。將玻璃體或血清以無血清培養(yǎng)液稀釋至1％，接著用透明質(zhì)酸裂解酶(Streplytica，10單位)37℃處理1小時。將處理過的玻璃體或血清在無血清加入在無血清培養(yǎng)液中的WERI-Rb細胞(1.2×104細胞/孔)，至最終濃度為0.5％。加入AdV-luc(500vp/細胞)，培養(yǎng)細胞18小時。收獲細胞并測定熒光素酶活性。
用膠原酶消化玻璃體對報告基因表達的增強沒有作用。然而，用透明質(zhì)酸裂解酶消化(500微升1％的玻璃體中有10單位裂解酶)消除了玻璃體的作用(圖2)。煮沸滅活裂解酶不會抑制玻璃體增強的腺病毒介導的熒光素酶表達(沒顯示數(shù)據(jù))。
實施例3增強表達不依賴于腺病毒結(jié)合或內(nèi)化為了測定玻璃體是否能增強腺病毒的結(jié)合或內(nèi)化，用35S-蛋氨酸標記腺病毒載體，接著在存在或缺少0.5％玻璃體的情況下與HeLa細胞(已知有CAR和αv整合素，并且容易被腺病毒感染)一起培育。培育后，洗滌細胞并測定總的放射活性。6小時后，定量測定的35S量沒有差異，這表明增強不發(fā)生在結(jié)合和內(nèi)化階段，而是在轉(zhuǎn)基因表達的一些后續(xù)步驟(沒有顯示數(shù)據(jù))。
采用的腺病毒載體中的纖維/球節(jié)蛋白質(zhì)或五鄰體堿性蛋白質(zhì)是突變的，從而強化了這些結(jié)論。將WERI-Rb細胞(1×104細胞/孔)在無血清培養(yǎng)液中與野生型腺病毒突異五鄰體或纖維突變體(1000vp/細胞)，在存在或缺少0.5％的玻璃體時，一起培育18小時。收獲細胞并測定熒光素酶的活性。腺病毒結(jié)合(突變的纖維/球節(jié))或內(nèi)化(突變的五鄰體堿基)結(jié)構(gòu)域的破壞降低了腺病毒進入細胞的能力，但不抑制玻璃體增強熒光素酶轉(zhuǎn)基因表達的能力(圖3)。
用另外一種修飾的腺病毒載體進一步確認這些觀察。AdV血清5型需要用作結(jié)合的CAR受體以及用作內(nèi)化的αv整合素；AdV血清35型利用一種不同的機制。通過基因工程改造而含AdV35纖維蛋白質(zhì)的AdV5(AdV5F35)輸入成視網(wǎng)膜細胞瘤細胞的GFP表達，在0.5％玻璃體存在下也增加了。
將WERI-Rb細胞(1×104細胞/孔)在無血清培養(yǎng)液中，和(C，D)或不和(A，B)0.5％的玻璃體一起培育。用嵌合的腺病毒(AdV5/F35)以5vp/細胞的比率轉(zhuǎn)導細胞，該嵌合病毒中AdV35的纖維/球節(jié)區(qū)域替代了AdV5的纖維/球節(jié)區(qū)域。顯示了代表性區(qū)域的明亮區(qū)(A，C)和熒光區(qū)(B，D)圖(圖4)。因此，只要腺病毒可結(jié)合和內(nèi)化，玻璃體即可增強轉(zhuǎn)基因的表達而不論所用的受體。
實施例4玻璃體增強作用的時間依賴性將WERI-Rb細胞和AdV-luc(200vp/細胞)一起在無血清培養(yǎng)液中培育2小時，使得有時間讓病毒結(jié)合和內(nèi)化。洗滌細胞，重懸浮在新鮮的無血清培養(yǎng)液中，并以1×104細胞/孔等分的入96-孔微滴定平板的孔中。在所示時間加入玻璃體，使得最終濃度為0.5％。加入AdV-luc20小時后進行熒光素酶測定。如果在去除腺病毒后至少6小時加入玻璃體可獲得腺病毒-介導轉(zhuǎn)基因表達的最大增強(圖5)。
相反，當人人培養(yǎng)物去除腺病毒時加入玻璃體，然后通過洗滌細胞在隨后的不同時間間隔去除玻璃體，能夠增強轉(zhuǎn)基因的表達至少6小時。將WERI-Rb細胞和AdV-luc(200vp/細胞)一起在無血清培養(yǎng)液中培育2小時，使得有時間讓病毒結(jié)合和內(nèi)化。清洗所述細胞，重懸浮在新鮮的無血清培養(yǎng)液加0.5％的玻璃體中，繼續(xù)培育。在所示時間，回收細胞、洗滌并以無血清培養(yǎng)液中重懸浮，然后以1×104細胞/孔等分加入96-孔微滴定平板的孔中。在加入AdV-luc20小時后進行熒光素酶測定(圖6)。
實施例5透明質(zhì)酸增強了腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達高分子量透明質(zhì)酸增強了腺病毒輸送的轉(zhuǎn)基因表達。將WERI-Rb細胞(1×104細胞/孔)和AdV-luc(200vp/細胞)以及濃度從0-100微克透明質(zhì)酸/100微升的新鮮稀釋的高分子量透明質(zhì)酸(平均M.W.650,000kDa)一起培育18小時。收集細胞并測定熒光素酶活性。將培養(yǎng)物分為三等份進行(圖7)。轉(zhuǎn)基因表達可增強高達20倍。
實施例6腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達愛到降解的或修飾的透明質(zhì)酸抑制已經(jīng)受到裂解酶有限消化的透明質(zhì)酸不僅不能激活，而且實際上抑制了基線腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達。將WERI-Rb細胞(1×104細胞/孔)和AdV-luc(200vp/細胞)以及濃度0-240微克/100微升的“過時的”透明質(zhì)酸一起培育18小時。收集細胞并測定熒光素酶活性。將培養(yǎng)物分為三等份進行。圖8顯示即使部分被裂解酶消化，也會導致構(gòu)形改變的透明質(zhì)酸，其能有效抑制腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達。
實施例7CD44參與腺病毒介導轉(zhuǎn)基因表達的調(diào)節(jié)由于玻璃體誘導的腺病毒介導轉(zhuǎn)基因表達的增強可通過用透明質(zhì)酸裂解酶消化玻璃體來消除，并可通過純化的大分子量透明質(zhì)酸實現(xiàn)，因此檢驗了透明質(zhì)酸結(jié)合受體CD44的潛在作用。將Jurkat和Jurkat-CD44細胞與PMA(10ng/ml)一起培育激活CD44。洗滌細胞重懸于無血清培養(yǎng)液中，并且以1×104細胞/孔等分加入96-孔微滴定平板中。加入AdV-luc(1000vp/細胞)，在存在或缺少新鮮稀釋的透明質(zhì)酸(100微克/孔)然后測定熒光素酶活性時培育細胞18小時。Jurkat細胞表達CAR但不表達CD44或其他透明質(zhì)酸結(jié)合受體，也不表達αv整合素，不易被AdV5轉(zhuǎn)導，并不受玻璃體的影響(圖9)。然而，用CD44表達質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Jurkat細胞可被AdV5轉(zhuǎn)導，并且轉(zhuǎn)基因的表達在透明質(zhì)酸存在時可增強(圖9)。
為了進一步驗證CD44的作用，檢驗了能阻斷透明質(zhì)酸結(jié)合的小鼠CD44抗體(KM114)，以確定它對玻璃體增強的作用。采用CD44表達小鼠細胞系EpH4作為靶細胞。將小鼠EpH4細胞(CD44陽性)預先培育在存在過量KM114(一種CD44特異性單克隆抗體)或同型-匹配的IgG1對照抗體的無血清培養(yǎng)液中。洗滌細胞并重懸于無血清培養(yǎng)液中，以1×104細胞/孔等分加入96-孔微滴定平板。加入AdV-luc(200vp/細胞)并繼續(xù)培育18小時然后測定熒光素酶活性。將培養(yǎng)物分為三等份進行。玻璃體在同型匹配對照抗體存在下增強了轉(zhuǎn)基因表達(圖10)。在KM114存在時，不僅僅玻璃體增強的轉(zhuǎn)基因表達受到抑制，而且基線轉(zhuǎn)基因表達也受到抑制(圖10)。這些結(jié)果證實了CD44和它的配體透明質(zhì)酸在調(diào)節(jié)腺病毒介導轉(zhuǎn)基因中的作用。
實施例8透明質(zhì)酸形式的篩選通過1X Tris醋酸EDTA緩沖液(TAE，見Sambrook 2001)配的0.5％瓊脂糖進行相關(guān)樣品的電泳。采用7體積樣品加1體積8x加樣緩沖液(2M蔗糖；1.5M NaCl)將樣品加入瓊脂糖的孔中，并暴露于80-100伏特電壓4-6個小時。電泳后，在黑暗中用50％乙醇配的0.005％StainsAllTM(SIGMATM)處理凝膠12小時或過夜，接著用水洗滌去除未結(jié)合鏈。將處理過的凝膠暴光30分鐘使得透明質(zhì)酸顯現(xiàn)。
測定樣品對腺病毒介導轉(zhuǎn)基因表達的作用在上述實施例中提供的材料和方法中進行。即，將WERI-Rb細胞和AdV-luc(200vp/細胞)以及濃度為0-100微克透明質(zhì)酸/100微升的受試透明質(zhì)酸樣品一起培育18小時。收獲細胞并測定熒光素酶活性。
實施例9玻璃體可修復低分子量的透明質(zhì)酸圖12顯示玻璃體的增強作用修復了低分子量透明質(zhì)酸。低分子量透明質(zhì)酸和玻璃體的聯(lián)合作用是倍增的，導致轉(zhuǎn)基因表達增加將近1000-倍。將WERI-Rb細胞和AdV-luc(200vp/細胞)，以及對照、新鮮稀釋的玻璃體、低分子量的透明質(zhì)酸酶，聯(lián)合低分子量透明質(zhì)酸的玻璃體，以100微克透明質(zhì)酸/100微升，一起培育18小時。收獲細胞并測定熒光素酶活性。
圖12的小插圖顯示了和大圖一樣的數(shù)據(jù)，但其大小可顯示玻璃體單獨產(chǎn)生的增強作用和低分子量透明質(zhì)酸單獨產(chǎn)生的抑制作用。所有都和表達對照的表達水平明顯不同。
將新鮮的人結(jié)膜處植物培育于100μl無血清培養(yǎng)液中，如所示該培養(yǎng)液含有0.5％玻璃體或100μg已用10單位裂解酶消化1小時的透明質(zhì)酸。24、48和72小時后在共聚焦顯微鏡下檢查培養(yǎng)物。
實施例10玻璃體有效增強了表達，低分子量透明質(zhì)酸有效抑制了人結(jié)膜外植物中腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達圖13顯示了結(jié)膜組織與玻璃體一起培育增強了人結(jié)膜外植物中腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達。同樣顯示低分子量透明質(zhì)酸抑制了腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達。用裂解酶處理玻璃體消除了玻璃體的作用。和實施例9結(jié)果相似，玻璃體和低分子量透明質(zhì)酸聯(lián)合導致轉(zhuǎn)基因表達的數(shù)倍增強。
本文所公開和主張的所有組合物和/或方法無須過多的實驗，只根據(jù)所提供的公開內(nèi)容即可進行和實施。雖然本發(fā)明的組合物和方法已通過優(yōu)選的實施方案作了描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員明白上述組合物和/或方法和步驟，以及本文所述方法步驟的順序都可以改變，而不背離本發(fā)明的概念、思路和范圍。更具體說，顯然某些化學和生理都相關(guān)的制劑可替代本文所述的制劑，而可獲得相同或相似的結(jié)果。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白所有這些相似的替代和修改都視為在本發(fā)明的思路、范圍和概念之內(nèi)，如附帶的權(quán)利要求所確定的那樣。
參考文獻下面的參考文獻納入本文作參考，它們提供了可仿效的程序或其他細節(jié)，作為本文給出的補充。
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權(quán)利要求
1.一種治療腺病毒疾病的方法，其特征在于，該方法包括(a)鑒定需要這種治療的患者；(b)給予該患者一種含有透明質(zhì)酸的組合物，其用量足以抑制或預防腺病毒疾病。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述腺病毒抑制劑包含低分子量透明質(zhì)酸。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述透明質(zhì)酸的平均分子量小于750,000Da。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述透明質(zhì)酸的平均分子量在50,000Da至750,000Da范圍之間。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述透明質(zhì)酸的平均分子量在50,000Da至300,000Da范圍之間。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述腺病毒抑制劑包含高分子量透明質(zhì)酸的降解產(chǎn)物或玻璃體的降解產(chǎn)物。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述腺病毒抑制劑進一步定義為用裂解酶或透明質(zhì)酸酶處理高分子量透明質(zhì)酸而獲得的產(chǎn)物。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述患者是人。
9.一種抑制腺病毒感染的方法，其特征在于，該方法包括對細胞施用一種含有透明質(zhì)酸的腺病毒抑制劑的組合物，其用量足以抑制腺病毒感染的發(fā)展。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述腺病毒抑制劑包含低分子量透明質(zhì)酸。
11.一種調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達的方法，其特征在于，該方法包括獲得用腺病毒或腺病毒載體轉(zhuǎn)導的細胞，并使所述細胞與含透明質(zhì)酸的腺病毒介導轉(zhuǎn)基因表達的調(diào)節(jié)劑接觸。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑包含高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑含有低分子量透明質(zhì)酸或高分子量透明質(zhì)酸的降解產(chǎn)物或玻璃體降解產(chǎn)物。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)劑進一步定義為用裂解酶或透明質(zhì)酸酶處理高分子量透明質(zhì)酸而獲得的產(chǎn)物。
15.如權(quán)利要求11所述的方法，該方法還包括將所述細胞與含有調(diào)節(jié)劑的溶液中一起培育的步驟。
16.一種制造治療腺病毒感染藥物的方法，其特征在于，該方法包括獲得含透明質(zhì)酸的腺病毒抑制劑并與藥學上可接受的運載體配制成所述抑制劑。
17.一種提高細胞中轉(zhuǎn)基因表達的方法，其特征在于，該方法包括獲得腺病毒載體轉(zhuǎn)導的細胞并使所述細胞與含透明質(zhì)酸的腺病毒介導轉(zhuǎn)基因表達增強劑接觸。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中使所述細胞在轉(zhuǎn)導后2-20小時期間與所述增強劑接觸。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其中使所述細胞在轉(zhuǎn)導后2小時與所述增強劑接觸。
20.如權(quán)利要求17所述的方法，其中使所述細胞基本上在轉(zhuǎn)導的同時與所述增強劑接觸。
21.如權(quán)利要求17所述的方法，其中使所述細胞在轉(zhuǎn)導后持續(xù)與所述增強劑接觸。
22.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述增強劑包含玻璃體。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述組合物中的玻璃體濃度在0.5％-5％(v/v)范圍之間。
24.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述增強劑包含高分子量透明質(zhì)酸。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述組合物中高分子量透明質(zhì)酸的濃度在從10微克/100微升至大于100微克/100微升的范圍之內(nèi)。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述透明質(zhì)酸的濃度大約是0.5％。
27.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述增強劑含玻璃體和高分子量透明質(zhì)酸的混合物。
28.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述腺病毒載體衍生自腺病毒5或腺病毒2或是腺病毒。
29.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述載體進一步定義為包含轉(zhuǎn)基因。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因可用于治療癌癥。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述癌癥是成視網(wǎng)膜細胞瘤。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因是成視網(wǎng)膜細胞瘤基因或胸苷激酶基因。
33.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因是腫瘤抑制基因。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述腫瘤抑制基因編碼p53。
35.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼—報告基因。
36.一種調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達的方法，其特征在于，該方法包括使轉(zhuǎn)染的細胞與腺病毒載體和抗CD44特異性抗體接觸。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，該方法還包括使所述細胞與高分子量透明質(zhì)酸或玻璃體接觸的步驟。
38.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述抗體是單克隆抗體。
39.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述抗體是KM114。
40.一種提高轉(zhuǎn)基因表達的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括高分子量的透明質(zhì)酸或玻璃體，以及用于腺病毒載體轉(zhuǎn)染的組分。
41.一種篩選透明質(zhì)酸形式的方法，包括(a)獲得第一樣品；(b)獲得已知形式透明質(zhì)酸酶的第二樣品；比較在(a)中獲得的樣品與在(b)中獲得的樣品對于腺病毒介導的轉(zhuǎn)基因表達的作用，其中增強的轉(zhuǎn)基因表達表明是表達增強形式的透明質(zhì)酸，抑制的轉(zhuǎn)基因表達表明是表達抑制形式的透明質(zhì)酸。
全文摘要
本發(fā)明提供治療腺病毒介導疾病的方法，用腺病毒和相關(guān)載體轉(zhuǎn)導細胞的改進方法，和利用此類方法作基因治療的改進方法。
文檔編號A61K31/728GK1642560SQ03807181
公開日2005年7月20日 申請日期2003年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月15日
發(fā)明者S·R·昌德胡里, R·L·赫特維茨, M·Y·赫維茨, V·赫爾科比, K·T·馬庫斯 申請人:研究發(fā)展基金會