專利名稱：確定細(xì)胞對vegf反應(yīng)的方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及內(nèi)皮細(xì)胞在對VEGF反應(yīng)時的基因表達(dá)譜(profile)，以及該譜在診斷和治療中的用途。
背景技術(shù)：
血管發(fā)生是從預(yù)先存在的血管生成新的毛細(xì)血管的過程，它在生理和病理狀態(tài)下起重要作用。新的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)的生成是一個復(fù)雜過程，它包括基膜降解和細(xì)胞外基質(zhì)水解，伴隨著內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，原基血管結(jié)構(gòu)(rudimentary vascular structures)的形成和細(xì)胞外基質(zhì)的改造(remoulding)。一般認(rèn)為，通過血管發(fā)生誘導(dǎo)物和抑制劑之間的平衡來調(diào)控血管發(fā)生，其中的許多誘導(dǎo)物和抑制劑與目標(biāo)細(xì)胞上的特異受體相互作用。已經(jīng)證明一些肽類和非肽類的因子在體內(nèi)誘導(dǎo)血管發(fā)生表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α(TGFα)和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)、腫瘤壞死因子α(TNFα，體內(nèi))、血管生成因子、酸性和堿性纖維細(xì)胞生長因子(aFGF/bFGF)、血管水平生長因子(VEGF)、PGE2和甘油一丁酸酯。血管生成的抑制劑已經(jīng)被確定，從復(fù)雜的類固醇到多肽，包括鈣結(jié)合糖蛋白(thromospondin)、血小板因子IV、TNF-α(體外)、TGF-β、干擾素、制管張素(angiostatin)、整聯(lián)蛋白抑制劑、16-kD促乳素。
內(nèi)皮在健康成年生物體中通常是靜止的。特別例外的是雌性生殖道，其中由于暫時結(jié)構(gòu)的周期性演變和受損組織的循環(huán)修復(fù)持續(xù)地需要額外的血管系統(tǒng)。最近表明在用血管生成抑制劑AGM-1470處理的小鼠中，雌性生殖道被大范圍和嚴(yán)重地破壞(Klauber N，等，1997，Nature Medicine，4443-446)。這還說明可以完全消除卵巢和子宮內(nèi)膜的周期性以實(shí)現(xiàn)動物不育，而全面阻斷血管生成也可以破壞蛻膜化和胎盤形成。雌性生殖系統(tǒng)中的循環(huán)血管生成事件極有可能與激素協(xié)調(diào)，該血管生成作用可能由直接或間接被激素誘導(dǎo)的血管生成因子調(diào)節(jié)。已經(jīng)證明卵巢組織、子宮組織和胎盤組織中含有和產(chǎn)生血管生成因子和抗血管生成因子。在各種這些血管生成因子中，VEGF具有一些獨(dú)特的特征，表明它在這些組織中起重要作用。特別地，它促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂、提高血管通透性，并且還調(diào)節(jié)大量參與新血管形成過程的蛋白水解酶的生成。因此，它還能夠調(diào)節(jié)新血管形成的所有步驟，并可能在雌性生殖道和其他組織的生理性和病理性血管發(fā)生中起重要作用。在許多成年組織中檢測到VEGF結(jié)合位點(diǎn)，表明VEGF可能不僅在血管發(fā)生中，而且在已有血管的維持中都起重要作用。
VEGF在血管系統(tǒng)發(fā)育中的重要作用還被最新的數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)(Risau 1997，Nature 386671-674最新綜述)。缺乏單個VEGF等位基因?qū)е屡咛ニ劳?，這表明既便是VEGF水平相對適度的下降也具有深遠(yuǎn)的影響。基因敲除試驗(yàn)也已經(jīng)證明Flt-1和KDR(VEGF受體)對于胚胎血管系統(tǒng)的發(fā)育和分化是關(guān)鍵的。缺乏Flk-1基因的小鼠不發(fā)生血管生成并且不形成血島，導(dǎo)致在第8.5-9.5天死亡在子宮中。靶向(targetted)突變Flt-1等位基因的小鼠胚胎純合子在體節(jié)中期死亡在子宮中。
血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是結(jié)合肝素、30-46kDa的分泌型同源二聚體糖蛋白，又被稱作為血管滲透性因子。它是血管內(nèi)皮的有效促有絲分裂原，具有有效提高血管通透性的活性，并且調(diào)節(jié)一些參與血管發(fā)生的蛋白水解酶的表達(dá)，還起到維持新形成的毛細(xì)血管的作用。
對VEGF基因的分析已經(jīng)說明蛋白質(zhì)編碼區(qū)排列在8個外顯子中。通過可選剪接所述外顯子，產(chǎn)生VEGF的5種不同mRNA，分別具有121、145、165、189和206個氨基酸(VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206)。在大多數(shù)組織中，主要是121和165個氨基酸的形式，而145個氨基酸的形式一般很少。這種形式最早被描述存在于人的子宮內(nèi)膜和胎盤組織中(Charnock-Jones DS等，1993 Biology of Reproduction 481120-1128)，最近被證實(shí)具有其他VEGF形式不具有的獨(dú)特性質(zhì)(Poltorak Z等，1997，Journal of Biological Chemistry USA，7151-7158)。預(yù)計(jì)嚙齒類和牛的VEGF少一個氨基酸，但是通常高度保守。近來還確定了一些其他的蛋白質(zhì)，它們與VEGF同源性可觀。它們被稱作為胎盤生長因子(PLGF)(Maglione D等，1993 Oncogene 8 925-931)、VEGFB(Olofsson B等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 932576-2581)、VEGFC(Joukov V等，1996 EMBO Journal 15290-298)和VEGFD(Yamada Y等1997 Genomics 42 483-488)。已經(jīng)證明胎盤生長因子能夠與VEGF形成異二聚體，這些異二聚體能夠與VEGF受體之一結(jié)合。但是，它們促有絲分裂能力比VEGF165同源二聚體低20-50倍。
VEGF通過兩個酪氨酸激酶家族受體起作用，這些受體是c-fms-樣酪氨酸激酶(flt-1)和含有激酶結(jié)構(gòu)域插入片段的受體(KDR)。不同于先前描述具有5個環(huán)的III類受體酪氨酸激酶，flt-1和KDR在其胞外結(jié)構(gòu)域中都具有7個免疫球蛋白(IG)樣環(huán)。它們還有單個跨膜區(qū)和中間被激酶插入片段隔斷的共有酪氨酸激酶序列。Flt-1的第二個IG-樣細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域?qū)τ谂潴w結(jié)合和特異性是關(guān)鍵的。這兩種受體都被證明高親合性地結(jié)合VEGF。Flt-1對VEGF的親合性最高，其Kd為10-20pM，KDR具有較小的100-125pM的Kd。鼠類KDR同系物，胎兒肝臟激酶-1(Flk-1)也被鑒定，與人KDR具有85％序列同一性。在胎兒和成年組織中，F(xiàn)lt-1和KDR/Flk-1的mRNAs主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。它們也存在于非內(nèi)皮細(xì)胞中，包括外周血液單核細(xì)胞、惡性黑素瘤細(xì)胞系、滋養(yǎng)層樣絨毛膜癌細(xì)胞系BeWo和腹水(peritoneal fluid)巨噬細(xì)胞。Flt-4酪氨酸激酶受體與VEGF受體flt-1和KDR相關(guān)，但是不與VEGF結(jié)合，在發(fā)育過程中其表達(dá)主要被限制在淋巴內(nèi)皮中。flt-1、KDR/Flk-1和flt-4的mRNA具有獨(dú)特的表達(dá)譜，一些內(nèi)皮缺乏這三個受體的mRNA中的一種或兩種，表明由該基因家族編碼的受體酪氨酸激酶在調(diào)控血管的生長/分化中具有不同功能。
供應(yīng)大部分成年組織的血管是穩(wěn)定的，其內(nèi)皮細(xì)胞是靜止的，不發(fā)生凋亡。但是在組織改變(remodel)的過程中血管變得有彈性，并且自我改變來滿足其所供應(yīng)的組織的不同需要。這在腫瘤退化和在雌性生殖器官中發(fā)生每月一次的萎縮的過程是最明顯的。這種血管改變中最重要的部分是內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。
在血管改變中，去除存活信號可能增進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。在體外，去除成纖維生長因子(FGF)-I、FGF-II、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-A或血管生成素(Angiopoietin，Ang)-1，會誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。在體內(nèi)，用雄激素消融療法治療人前列腺瘤導(dǎo)致由前列腺上皮細(xì)胞生成的VEGF-A下降，接著引起新形成的腫瘤血管中的內(nèi)皮細(xì)胞選擇性凋亡。重要的是，在這些腫瘤中，由存活因子去除來介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡發(fā)生在贅生性細(xì)胞自身凋亡之前，而腫瘤血管減少發(fā)生在腫瘤變小之前。其他在血管修復(fù)過程中由去除存活信號可能引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的方法，包括乳腺萎縮、胎盤形成和卵巢黃體周期性退化。
調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄豐度可能使已經(jīng)十分清楚的翻譯后路徑與內(nèi)皮細(xì)胞中在去除存活因子后的凋亡程序一致。例如，轉(zhuǎn)錄因子p53的活性受一些促凋亡刺激物(stimuli)誘導(dǎo)，許多最重要的凋亡調(diào)節(jié)劑是p53靶向基因，如p21/WAF-1、14-3-3、Bax、Fas、DR5、PIG3和Tspl。差異顯示(differentialdisplay)和基因陣列試驗(yàn)已經(jīng)鑒定編碼凋亡調(diào)節(jié)劑的轉(zhuǎn)錄本和由p53誘導(dǎo)的機(jī)制。另一個在凋亡過程中調(diào)節(jié)內(nèi)皮基因表達(dá)的已知轉(zhuǎn)錄因子是NFκB。在健康的內(nèi)皮細(xì)胞中，NFκB-激活的抗凋亡基因如TRAF-1、TRAF-2、IAP-1和IAP-2的轉(zhuǎn)錄對于細(xì)胞存活是關(guān)鍵的。當(dāng)脂多糖、腫瘤壞死因子(TNF)-α和表鬼臼毒素亞乙基吡糖苷(etoposide)誘導(dǎo)凋亡時，內(nèi)皮NFκB的活性上升。但是，由于在凋亡過程中半胱天冬酶(caspase)介導(dǎo)的xIAP裂解可能降低NFκB活性，而且NFκB能夠促進(jìn)保護(hù)性基因和促炎基因在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，因此NFκB在內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中所起的作用是復(fù)雜的。其他轉(zhuǎn)錄因子如E2F和Myc家族也在去除存活因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡中起作用。

發(fā)明內(nèi)容
內(nèi)皮細(xì)胞的特化(specialized)性質(zhì)及其受VEGF-A調(diào)控對于生存是重要的。其特化部分取決于上述的翻譯后信號化級聯(lián)的內(nèi)皮特異性組合。但是，這最終取決于獨(dú)特的RNA轉(zhuǎn)錄本群體，即內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)及其調(diào)控。
為了對此進(jìn)行研究，我們分析了大量不同序列(context)的基因表達(dá)。首先，結(jié)合Affymetrix基因陣列表達(dá)數(shù)據(jù)和SAGE數(shù)據(jù)來鑒定在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)中豐度最大的轉(zhuǎn)錄本。其次，比較HUVEC和其他細(xì)胞/組織類型中的相對轉(zhuǎn)錄本豐度來鑒定內(nèi)皮細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄本。
在兩組附加試驗(yàn)中，我們采用Affymetrix陣列雜交來鑒定轉(zhuǎn)錄本豐度的變化，該變化發(fā)生在去除血清后由VEGF-A誘導(dǎo)HUVEC存活和擴(kuò)增時或者加入VEGF刺激一般培養(yǎng)基中的HUVEC時。在本試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)來自不同個體的原代內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物具有真正的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性?；谶@種發(fā)現(xiàn)，我們認(rèn)為采用單一的、特應(yīng)性(idiosyncratic)的原代細(xì)胞培養(yǎng)物的基因組試驗(yàn)可能是誤導(dǎo)的。
總之，在本發(fā)明中，我們采用新的方法學(xué)來鑒定其轉(zhuǎn)錄本水平應(yīng)VEGF-A反應(yīng)被改進(jìn)的內(nèi)皮細(xì)胞中的基因。
雖然在現(xiàn)有技術(shù)中，其他研究人員已經(jīng)鑒定出了其活性相應(yīng)于該因子來改進(jìn)的各種基因，但是本發(fā)明人采用的方法學(xué)在一些顯著方面是不同的。它包括使用原代細(xì)胞培養(yǎng)物；采用五個獨(dú)立的樣本，以及在加入VEGF-A前進(jìn)行血清饑餓。后一步驟特別地用于在一部分細(xì)胞中啟動凋亡，模擬期望的情形，例如治療腫瘤引起腫瘤退化。加入VEGF-A引起細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本水平的調(diào)整。采用嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，我們鑒定了轉(zhuǎn)錄本水平在加入VEGF-A后4小時和24小時被顯著調(diào)整的基因。令人驚奇的是，在這兩個時間點(diǎn)，在4小時時鑒定的轉(zhuǎn)錄本和在24小時時鑒定的轉(zhuǎn)錄本僅有兩個相同。
我們也去除血清48h來使HUVEC細(xì)胞應(yīng)激(stress。確定明顯和可重復(fù)的變化，是內(nèi)皮細(xì)胞命運(yùn)受到威脅時發(fā)生的全面和特異變化的最好指示。
因此，本發(fā)明提供一種方法來分析內(nèi)皮細(xì)胞的命運(yùn)，該法以有用的新方式來監(jiān)控大量疾病狀態(tài)。大量如這些已知基因的和來自ESTs的轉(zhuǎn)錄本的信息，提供新的分析(assay)靶點(diǎn)，并可開發(fā)疾病的新療法。
雖然不希望被任何理論約束，一般認(rèn)為在處理后4小時時被顯著調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本是對VEGF直接反應(yīng)的基因，而在24小時時，轉(zhuǎn)錄本譜除了包括反映VEGF-A直接作用的基因外，還包括反映存活或穩(wěn)態(tài)功能的基因。
除了不同的暫時轉(zhuǎn)錄本譜，我們發(fā)現(xiàn)個體的異質(zhì)性是非常顯著的。因此，發(fā)現(xiàn)一個個體中應(yīng)VEGF可能被上調(diào)和下調(diào)的數(shù)個基因，在其他個體不被持續(xù)調(diào)節(jié)。通過排除這種變化，可能提供一組基因，它們一般被認(rèn)為特別是相互結(jié)合時，用于在人類患者中檢測對VEGF的真正反應(yīng)。
而且，在血清饑餓細(xì)胞和非血清饑餓細(xì)胞中VEGF誘導(dǎo)表達(dá)譜不同，表明人體中細(xì)胞對VEGF反應(yīng)的不同取決于其位置和性質(zhì)。例如，雌性生殖道中的細(xì)胞或進(jìn)行放射治療或其他治療的實(shí)體瘤細(xì)胞具有對VEGF的反應(yīng)譜與血清饑餓細(xì)胞類似，而機(jī)體其他部位的細(xì)胞的反應(yīng)方式可能與非血清饑餓細(xì)胞更類似。
在許多臨床條件下，血管發(fā)生是臨床結(jié)果的顯著標(biāo)記，無論是理想的與否。把凋亡作為發(fā)病的顯著特征或者甚至是關(guān)鍵特征的狀況，包括實(shí)體瘤如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、糖尿病、SLE、腦卒中、阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s)、癡呆、高血壓、子宮內(nèi)膜異位、子宮異常出血、卵巢超刺激綜合癥、肺炎、視網(wǎng)膜病、斑點(diǎn)惡化、不育、排卵、外周血管病、外周神經(jīng)病、動脈粥樣硬化、血管炎、腎小球腎炎、敗血病、敗血性休克、驚厥前期(pre-eclampsia)和子宮內(nèi)生長阻滯。
因此，持續(xù)需要開發(fā)可靠和有效的方法來診斷和預(yù)后人的醫(yī)療狀況，包括VEGF-A相關(guān)狀況、特別是血管發(fā)生和血管生成，包括上面和本文他處描述的狀況。
在本領(lǐng)域仍然還持續(xù)需要鑒定治療性干擾此類疾病的新靶點(diǎn)。此外，需要鑒定具有抗這些靶點(diǎn)活性的治療劑。而且，采用抗這些靶點(diǎn)的這些試劑在治療和診斷這些疾病中是有價值的。
在第一個方面，本發(fā)明提供一種監(jiān)控人類患者中與血管發(fā)生或血管生成相關(guān)的疾病狀態(tài)發(fā)展的方法，所述方法包括定量測定在從所述疾病的部位中得到的細(xì)胞樣本中至少一種表1所示基因的轉(zhuǎn)錄本水平；和比較所述測定的轉(zhuǎn)錄本水平與至少一個得自對照細(xì)胞樣本的基因的轉(zhuǎn)錄本水平。
優(yōu)選地，所述細(xì)胞樣本是內(nèi)皮細(xì)胞。
在另一個方面，本發(fā)明提供一種適合用于上述發(fā)明方法的基因芯片陣列，包含至少一種適合檢測至少一種表1所示基因的核酸；可選一個特異于所述至少一種基因的對照；并可選所述基因芯片的至少一個對照。
在另一方面，本發(fā)明提供血管發(fā)生或血管形成的調(diào)節(jié)劑的分析方法，其中所述方法包括
(a)提供一種由選自表1的基因編碼的蛋白質(zhì)；(b)將所述蛋白質(zhì)與其活性的候選調(diào)節(jié)劑接觸；和(c)確定所述候選調(diào)節(jié)劑是否能夠調(diào)節(jié)所述蛋白質(zhì)的活性；或者其中所述方法包括(a)提供一種培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞；(b)將所述細(xì)胞與血管發(fā)生的候選調(diào)節(jié)劑接觸；和(c)確定所述候選調(diào)節(jié)劑是否能夠調(diào)節(jié)至少一個選自表1的基因的轉(zhuǎn)錄本水平。
通過這種方法獲得的調(diào)節(jié)劑可被用于調(diào)節(jié)人類患者中血管發(fā)生或血管生成的方法。
在另一個方面，確定ESTs可以開發(fā)用于治療性干涉的新的潛在靶點(diǎn)。因此，本發(fā)明提供一種包含來自表1的EST序列的載體，所述EST序列可操作地連接到轉(zhuǎn)錄所述序列的啟動子上。在血管發(fā)生或血管生成的基因分析中，這種載體可用于表達(dá)由ESTs編碼的蛋白質(zhì)，其本身具有直接的治療用途，如作為重組蛋白或在基因治療應(yīng)用中。
在另一個方面，本發(fā)明提供一種監(jiān)控患者對治療與血管發(fā)生或血管生成相關(guān)狀態(tài)的反應(yīng)的方法，該方法包括提供一種來自所述患者的組織樣本，在體外將所述樣本與VEGF接觸，和測定表1中的一個或多個轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。優(yōu)選地，該表達(dá)與用VEGF處理前的樣本中的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)比較。在一個方面，檢測表1a、1b或1f的一個或多個轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。在本發(fā)明的這個方面，其中表達(dá)變化最大的轉(zhuǎn)錄本是表1a或1b的，這表明這些細(xì)胞處于類似于血清饑餓的狀態(tài)。這預(yù)示著一種疾病狀態(tài)，或者例如在治療腫瘤的情況下，指示對抗血管發(fā)生的治療性處理的反應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)表1f的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)變化最大，這指示細(xì)胞不被應(yīng)激，從而表示腫瘤組織或健康組織對治療不反應(yīng)，這視情況而定。
附圖簡述

圖1a-d表示在去除血清后用VEGF-A處理的細(xì)胞中的凋亡和細(xì)胞數(shù)量。
圖2a和b表示在4和24小時時，細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)錄本水平。
圖3表示3個基因的轉(zhuǎn)錄本水平的變化。
圖4表示由SAGE確定的大量轉(zhuǎn)錄本也在基因芯片上被確定。
附表簡述表1a列舉其水平在用VEGF-A處理后4小時的內(nèi)皮細(xì)胞中被調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本。
表1b列舉其水平在用VEGF-A處理后24小時的內(nèi)皮細(xì)胞中被調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本。
表1c列舉其水平在去除血清處理后48h的內(nèi)皮細(xì)胞中被調(diào)節(jié)的EST轉(zhuǎn)錄本。
表1d列舉已經(jīng)被特性描述的轉(zhuǎn)錄本，其水平在去除血清處理后48h的內(nèi)皮細(xì)胞中被調(diào)節(jié)。
表1e列舉其他轉(zhuǎn)錄本，其水平在去除血清處理后48h的內(nèi)皮細(xì)胞中被調(diào)節(jié)。
表1f列舉其水平在添加血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞中受VEGF調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本。
表2列舉大在內(nèi)皮細(xì)胞中豐度大的轉(zhuǎn)錄本。
表3列舉在HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)水平高于子宮內(nèi)膜組織或B淋巴細(xì)胞系Raji的轉(zhuǎn)錄本。
具體實(shí)施例方式
表1本文提及的表1應(yīng)當(dāng)被理解為指表1a、1b、1c、1d、1e和1f的任何之一，除非上下文明確僅指表1的這些組成部分之一(或兩個或三個，視情況而定)。
監(jiān)控疾病發(fā)展的方法在本發(fā)明中，應(yīng)當(dāng)理解，確定“得自患者的疾病部位”的細(xì)胞是指在從機(jī)體取出的樣本中實(shí)施的體外方法。取出機(jī)體的樣本，如活體解剖，不是本發(fā)明的一部分。
如上所述，用于鑒定表1的基因的特定方法是一種監(jiān)控與血管發(fā)生或血管生成相關(guān)的疾病狀態(tài)發(fā)展的有效手段。本發(fā)明得到的數(shù)據(jù)表明一些基因?qū)EGF-A反應(yīng)時被上調(diào)，而其他在導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的條件下被上調(diào)。因此，在治療與不期望的血管發(fā)生相關(guān)的疾病中，臨床醫(yī)生將尋求一種反應(yīng)，其中前一類基因表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄本水平下降，而后者表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄本水平升高。
在治療患者過程中，可以上調(diào)或下調(diào)所確定的基因，以調(diào)整治療效力。例如，許多癌癥治療依賴于不同抗癌劑的混合物(cocktail)。任何一種特定混合物的效力在不同患者或者在患者細(xì)胞對一種或多種藥物產(chǎn)生抗性的治療過程中是不同的。
在本發(fā)明的這個方面，對得自較早時間點(diǎn)，如在治療之前或治療過程之間，的患者疾病部位的轉(zhuǎn)錄本水平進(jìn)行比較?？蛇x地，可對所述患者的未患病組織中的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本水平進(jìn)行比較。另一種選擇是提供對照基線樣本或來自另一個患者的病歷記錄(historical record)，或更加優(yōu)選地，來自患者群體的病歷記錄。優(yōu)選地，所述對照細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞。
在一個優(yōu)選方面，本發(fā)明通過參照大量基因的轉(zhuǎn)錄本譜來實(shí)施。這是由于本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在個體患者中，個體基因的轉(zhuǎn)錄本水平是變化的。例如，在表1a可見，患者2-5中細(xì)胞周期蛋白D1的轉(zhuǎn)錄本水平上升了約1.5-2倍，而在患者1中轉(zhuǎn)錄本水平幾乎沒有升高。因此，期望對幾個基因的轉(zhuǎn)錄本水平進(jìn)行評估。例如，被評估的基因包括至少一個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑；至少一個凋亡調(diào)節(jié)劑，至少一個生長因子或生長因子受體，和至少一個粘著/基質(zhì)蛋白。
一般地，測定至少5個、優(yōu)選至少10個和更優(yōu)選至少20個基因的轉(zhuǎn)錄本水平。
優(yōu)選地，表1a或者表1的其他部分的一種或多種的轉(zhuǎn)錄本水平被確定。
可以通過任何合適的方法測定一個或多個基因的轉(zhuǎn)錄本水平。當(dāng)檢測許多不同的基因轉(zhuǎn)錄本，一種方便的方法是將所述樣本(直接地或在生成cRNA或cDNA后)雜交到基因芯片陣列上。
當(dāng)采用基因芯片技術(shù)時，所述基因(在此所用的該術(shù)語包括表1的ESTs)都存在于可從Affymetrix購買得到的芯片上，這些芯片按照生產(chǎn)商提供的操作使用。一般地，提供微陣列的方法及其用途還可見，如WO84/01031、WO88/1058、WO89/01157、WO93/8472、WO95/18376、WO95/18377、WO95/24649和EP-A-0373203，還可以參考這些以及本領(lǐng)域的其他文獻(xiàn)。
表1提供了基因的名稱，可以用此從數(shù)據(jù)庫如Genbank中獲得其DNA序列。此外，我們所用的Affymetrix芯片上使用的特定序列可以通過表格中提供的Affymetrix參考號來確定，它們是公眾可以獲得的并可能與Genbank參考號直接相關(guān)。所述EST基因序列也由Genbank參考號給出。本領(lǐng)域技術(shù)人員在實(shí)施本發(fā)明時可以查閱Genbank參考號的任一Affymetrix參考號。
可選地，或另外可以采用定量PCR方法，例如基于本領(lǐng)域被廣泛地使用的ABI TaqManTM技術(shù)。其描述見大量現(xiàn)有技術(shù)出版物，例如，可以參考WO00/05409。PCR方法需要靶向目標(biāo)基因的相對雙鏈的引物對，它之間相隔適宜的長度(通常50-300個堿基)。所述引物的適宜靶向序列如上述可以參照Genbank序列來確定。
本發(fā)明的特別應(yīng)用涉及與不期望的細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病的治療和預(yù)后，所述疾病特別是實(shí)體瘤，包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤和肉瘤。這些狀況的發(fā)展依賴于血管發(fā)生，因此阻斷血管發(fā)生或阻止血管維持的治療是理想的。
此外，一些與血管系統(tǒng)缺乏相關(guān)的疾病狀態(tài)，如心血管疾病或其他狀態(tài)參照本文上述的狀態(tài)。本發(fā)明可以監(jiān)控這些狀態(tài)并評價治療方案的效率。
基因芯片雖然現(xiàn)有技術(shù)提供一種基因芯片，它包括表1a、1b、1c、1d、1e和1f中的一個或多個的基因作為龐大的陣列的部分。鑒定在本發(fā)明中用于診斷和預(yù)后的相對小的一組基因，可以產(chǎn)生特別被設(shè)計(jì)適合用于本發(fā)明的小芯片。
因此，本發(fā)明提供基因芯片陣列，它包括適合于檢測表1所示的至少一種基因的至少一種核酸；并可選，對所述至少一種基因特異的對照；并可選所述基因芯片的至少一個對照。理想地，陣列中的序列數(shù)量如下其中適合檢測表1轉(zhuǎn)錄本的核酸數(shù)量為n，對個體轉(zhuǎn)錄本特異的對照核酸數(shù)量為n’，其中n’為從0到2n，和所述基因芯片上的對照核酸的數(shù)量(如用于確定“看家”轉(zhuǎn)錄本，大量內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本(如表2中的那些)，在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)水平較高的轉(zhuǎn)錄本(如表3中的那些)等)為m，其中m是從0到100，優(yōu)選從1到30，因此n+n’+m代表了所述芯片上核酸的至少50％，優(yōu)選70％和更優(yōu)選至少90％。
分析方法本發(fā)明的分析方法可以以許多不同形式進(jìn)行，如在蛋白質(zhì)或核酸成分或在全部培養(yǎng)細(xì)胞中進(jìn)行。
一種分析包括(a)提供由表1的轉(zhuǎn)錄本編碼的一種蛋白質(zhì)；(b)將所述蛋白質(zhì)與其活性的候選調(diào)節(jié)劑接觸；和(c)確定所述候選調(diào)節(jié)劑是否能夠調(diào)節(jié)所述蛋白質(zhì)的活性。
在這種分析方法中，確定活性的調(diào)節(jié)將依賴于被分析蛋白質(zhì)的性質(zhì)。例如，在所述酶的底物存在的情況下分析具有酶促功能的蛋白質(zhì)，因此存在能夠調(diào)節(jié)活性的調(diào)節(jié)劑導(dǎo)致底物的周轉(zhuǎn)更快或更慢。所述底物可以是該酶的天然底物或合成類似物。在任何一種情況下，所述底物可用可檢測的標(biāo)志標(biāo)記來監(jiān)控其轉(zhuǎn)化為最終產(chǎn)物。
對于具有配體結(jié)合功能的蛋白質(zhì)，如受體，以能夠拮抗或激動所述配體結(jié)合性質(zhì)的方式來檢測所述候選調(diào)節(jié)劑的配體結(jié)合功能。
對于具有DNA結(jié)合活性的蛋白質(zhì)，可測定這種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑的DNA結(jié)合或轉(zhuǎn)錄激活活性，其中調(diào)節(jié)劑能夠或增強(qiáng)或降低這種活性。例如，可以在遷移率變動分析中測定DNA結(jié)合。可選地，將所述蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA區(qū)域可以可操作地連接到一個報(bào)道基因上(此外，如果需要，在所述DNA區(qū)域和報(bào)道基因之間有啟動子區(qū)和/或轉(zhuǎn)錄起始區(qū))，從而確定所述基因的轉(zhuǎn)錄，并在該轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)發(fā)生時，可以看到此調(diào)節(jié)。適宜的報(bào)道基因包括例如氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，或更優(yōu)選，熒光報(bào)道基因如綠色熒光蛋白。
候選的調(diào)節(jié)劑化合物可以是用于藥物篩選程序的天然的或合成的化學(xué)物質(zhì)。也可以使用植物、微生物或其他生物體的提取物，其含有確定的或未確定的成分。組合文庫技術(shù)(包括固相合成和平行合成方法)提供有效途經(jīng)來檢測大量潛在的不同物質(zhì)的調(diào)節(jié)相互作用的能力。這種文庫及其用途在本領(lǐng)域是已知的，為天然產(chǎn)物、小分子和肽等的所有形式。許多這種文庫是可以購買得到的，被出售用于由本發(fā)明現(xiàn)在所針對的類型的藥物篩選程序。
還有一類候選調(diào)節(jié)劑是與蛋白質(zhì)靶點(diǎn)結(jié)合的抗體或其結(jié)合片段。
能夠結(jié)合抗原或其他結(jié)合部分(partner)的示例抗體片段，是由VL、VH、Cl和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段；由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；由一個抗體的單個臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；由VH組成的dAb片段；分離的CDR區(qū)域和F(ab′)片段，一個包括在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段。還包括單鏈的Fv片段。對蛋白質(zhì)特異的抗體可以從表達(dá)免疫球蛋白可變區(qū)的重組制備文庫中獲得，如用在其表面具有功能性免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的λ噬菌體或絲狀噬菌體；例如參見WO92/01047。這種技術(shù)快速制備抗一種抗原的抗體，然后這些抗體可以按照本發(fā)明進(jìn)行篩選。
另一類候選調(diào)節(jié)劑是基于被抑制的蛋白質(zhì)序列的片段的肽。特別地，和與其他蛋白質(zhì)或DNA作用的所述蛋白質(zhì)的部分相對應(yīng)的蛋白質(zhì)片段是小分子肽的靶點(diǎn)，該小分子肽作為蛋白質(zhì)功能的競爭性抑制劑。例如，這種肽長度在5-20個氨基酸。
這種肽還提供進(jìn)行模擬設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)。這種模擬將基于對所述肽的分析來確定對于生物學(xué)活性來說是必需和重要的氨基酸殘基或其側(cè)鏈部分，之后建立藥效團(tuán)的模型來設(shè)計(jì)在恰當(dāng)?shù)娜S關(guān)系中保留必需的殘基或其部分的模擬物。本領(lǐng)域存在各種計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)便于這種模擬物的設(shè)計(jì)。
可以形成(configure)基于細(xì)胞的分析方法來在轉(zhuǎn)錄水平或在翻譯水平上確定所述基因的表達(dá)。測定轉(zhuǎn)錄本時，可以采用本發(fā)明上述的第一方面的方法，如基因芯片、多重PCR等來確定。
基于細(xì)胞的分析方法可以如上述用于篩選候選調(diào)節(jié)劑。還可以用于篩選其他類型的候選調(diào)節(jié)劑，包括反義寡核苷酸。這種寡核苷酸通常長12-25，如約15-20個核苷酸，它可以包括被修飾的主鏈結(jié)構(gòu)或由其組成來穩(wěn)定所述寡核苷酸，所述主鏈結(jié)構(gòu)如甲基膦酸酯主鏈和硫代磷酸酯主鏈。所述反義寡核苷酸可來自目標(biāo)基因的編碼區(qū)或來自其5’或3’非翻譯區(qū)。候選的分子還包括RNAi，即短的雙鏈RNA分子，它是對基因轉(zhuǎn)錄特異的序列。
按照本發(fā)明獲得的調(diào)節(jié)劑可用于在人類患者中調(diào)節(jié)血管發(fā)生或血管形成。一般地，所述調(diào)節(jié)劑將用一種或多種藥學(xué)上可接受的載體配制，以適合所選擇的給患者給藥的路徑。對于固體組合物，可以采用常規(guī)的無毒固體載體，包括，例如，制藥級的甘露醇、乳糖、纖維素、纖維素衍生物、淀粉、硬酯酸鎂、糖精鈉鹽(sodium saccharin)、滑石粉、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。制備可藥用的液體組合物的可以例如通過在載體如水、生理鹽水、葡萄糖水溶液、甘油、乙醇等中溶解、分散調(diào)節(jié)劑和可選擇的藥學(xué)佐劑，從而形成一種溶液或懸浮液。如果需要，給藥的藥學(xué)組合物還含有較小量的無毒輔助性物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑等，例如，醋酸鈉、失水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺醋酸鈉、失水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯等。制備這種劑型的實(shí)際方法是已知的，或者對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的；例如，參見Remington’s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，15thEdition，1975。給藥的組合物或制劑在任何情況下含有一定量的活性化合物，其量可有效減輕被治療的患者的癥狀。
盡管由于內(nèi)皮細(xì)胞形成所述血管的內(nèi)層，將其施用到血流中(如通過靜脈注射)是一種可能路徑，給藥路徑可取決于治療的確切狀況。
載體鑒定數(shù)個與通過VEGF調(diào)控的內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的ESTs提供了新的載體系統(tǒng)的基礎(chǔ)，其可用于本發(fā)明上述的方面以及下文描述的其他方面。因此，用于表達(dá)由所述ESTs編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)載體構(gòu)成了本發(fā)明的另一個方面。
優(yōu)選地，本發(fā)明載體中的一種EST被可操作地連接到控制序列上，它能使宿主細(xì)胞表達(dá)所述編碼序列，即該載體是表達(dá)載體。
術(shù)語“可操作地連接”是指一種臨近，其中所述成分處于使它們以確定的方式起作用的關(guān)系中。“可操作地連接”到一條編碼序列上的控制序列是以在與所述控制序列相容的條件下表達(dá)所述編碼序列的方式來連接的。
適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞包括細(xì)菌、真核生物細(xì)胞如哺乳動物和酵母，和桿狀病毒系統(tǒng)。在本領(lǐng)域可得的用于表達(dá)異質(zhì)多肽的哺乳動物細(xì)胞系包括中國倉鼠卵巢細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉鼠(baby hamster)腎細(xì)胞、COS細(xì)胞及許多其它。
所述載體可包括其他序列如啟動子或增強(qiáng)子來表達(dá)所插入的核酸、核酸序列，使得所述多肽作為融合蛋白和/或核酸編碼分泌信號來生產(chǎn)，使得在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的多肽從該細(xì)胞中分泌。
所述載體可含有一個或多個選擇性標(biāo)記基因，例如，用于細(xì)菌質(zhì)粒的氨卡青霉素抗性基因或用于哺乳動物載體的新霉素抗性基因。
所述載體還包括增強(qiáng)子序列，終止子片段、多聚腺苷酸化序列和其他適當(dāng)?shù)男蛄小?br> 所述載體可在體外用于，例如制備RNA或用于轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。該載體還適合體內(nèi)使用，如在基因療法中使用。在各種不同宿主細(xì)胞中克隆和表達(dá)多肽的系統(tǒng)是已知的。所述載體包括基因治療載體，如基于腺病毒、腺伴隨病毒(如HIV或MLV)的載體或α病毒載體。
可選擇啟動子和其他表達(dá)調(diào)控信號來與設(shè)計(jì)表達(dá)載體所針對的宿主細(xì)胞相容。例如，酵母啟動子包括啤酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae，S.Cerevisiae)GAL4和ADH啟動子、稷酒酵母(S.pombe)nmt1和adh啟動子。哺乳動物啟動子包括金屬硫蛋白啟動子，其被包括在對重金屬如鎘的反應(yīng)中。還可以采用病毒啟動子如SV40大T抗原啟動子或腺病毒啟動子。所有這些啟動子在本領(lǐng)域很容易得到。
用于基因治療、制備由本發(fā)明的ESTs編碼的多肽的載體包括含有小基因(mini-gene)序列的載體。
如上述可以轉(zhuǎn)化到適宜的宿主細(xì)胞中的載體可表達(dá)本發(fā)明的多肽。因此，在另一個方面，本發(fā)明提供由本發(fā)明的ESTs所編碼的多肽的制備方法，該方法包括在一定條件下培養(yǎng)用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞來通過此載體表達(dá)編碼所述多肽的編碼序列，并回收所表達(dá)的多肽。也可以采用體外系統(tǒng)如網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物來表達(dá)多肽。
由本發(fā)明的ESTs編碼的基本上為分離形式的多肽或其片段構(gòu)成了本發(fā)明的另一個方面。所述多肽片段優(yōu)選大小至少為20個氨基酸，優(yōu)選從25個氨基酸到所述多肽的全長。
本發(fā)明的另一個方面是編碼所述多肽及其片段的核酸序列。這種核酸序列可能被包括在如上述的那些載體中。
更多細(xì)節(jié)參見例如分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(Molecular CloningaLaboratory Manual)第二版，Sambrook等，1989，冷泉巷實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)。用于核酸處理的許多已知技術(shù)和操作，例如核酸構(gòu)建體的制備，突變，測序，將DNA導(dǎo)入細(xì)胞和基因表達(dá)，和蛋白質(zhì)分析，已經(jīng)在Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等編輯，JohnWiley & Sons，1992中被詳細(xì)描述。
當(dāng)本發(fā)明的EST序列存在于載體中時，將它按閱讀框(in-frame)連接到翻譯起始區(qū)域來翻譯所述序列，或者可選地使它以反義方向轉(zhuǎn)錄反義RNA。
本發(fā)明通過如下實(shí)施例來闡明。
豐度大的內(nèi)皮非線性的(biased)轉(zhuǎn)錄本為了鑒定豐度最大的內(nèi)皮的轉(zhuǎn)錄本，從5個不同個體中分離的HUVEC在其最佳培養(yǎng)基中被培養(yǎng)到第5代。從這些培養(yǎng)物中提取的RNA用于制備復(fù)合cRNA探針，其雜交到12,600個元件的Affymetrix基因陣列芯片上(U95-A)。歸一標(biāo)準(zhǔn)化(normalize)來自五個被雜交的芯片的轉(zhuǎn)錄特異性信號數(shù)據(jù)(參見方法部分)來進(jìn)行芯片間的直接比較，并計(jì)算五個培養(yǎng)物中每個轉(zhuǎn)錄本的中等豐度。將前0.5％的HUVEC轉(zhuǎn)錄本按照功能分類，列于表2中。該試驗(yàn)表明所述五個原代內(nèi)皮培養(yǎng)物(來自不同個體)具有真正的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性。當(dāng)五個HUVEC培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)錄組相互比較時，所述12,600個轉(zhuǎn)錄本的6％-8％在豐度上差別＞1.5倍。
為了定義內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組并確定其如何區(qū)別于其他細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組，我們比較HUVEC的轉(zhuǎn)錄組和B淋巴細(xì)胞系(Raji)和人子宮內(nèi)膜的轉(zhuǎn)錄組。為了最小化上述相互分離的異質(zhì)性的作用，測定每種細(xì)胞/組織類型的數(shù)個樣本的中間歸一標(biāo)準(zhǔn)化的轉(zhuǎn)錄本豐度-HUVEC，五個芯片的中間值Raji，兩種芯片的中間值；子宮內(nèi)膜，兩種芯片的中間值(每種代表從五名患者中收集的組織)。表現(xiàn)為信號在HUVEC中比子宮內(nèi)膜或B淋巴細(xì)胞高10倍的轉(zhuǎn)錄本通過功能分類，列于表3中。在某些情況下，內(nèi)皮細(xì)胞中包括PAI-1、PECAM-1、膠原酶和TSG-14的信號比B淋巴細(xì)胞或子宮內(nèi)膜中高50倍以上。
VEGF-A調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的壽命和轉(zhuǎn)錄本豐度將VEGF-A對內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)的作用與轉(zhuǎn)錄本豐度相關(guān)。VEGF-A在體內(nèi)具有促存活和促有絲分裂的功能。為了在體外研究這兩種功能，在低于最佳生長所需的生長因子和血清濃度下培養(yǎng)五個獨(dú)立的HUVEC的原代分離物24小時。這降低了增殖比例，并誘導(dǎo)約10-16％的低凋亡發(fā)生率。為了檢測VEGF-A恢復(fù)增殖和防止進(jìn)一步凋亡的能力，將所述HUVEC在含有或不含10ng/mL VEGF-A165的相同培養(yǎng)基中再培養(yǎng)4小時或24小時。在這些試驗(yàn)結(jié)束時，計(jì)算凋亡發(fā)生率和總細(xì)胞數(shù)量，并制備總RNA。用VEGF-A培養(yǎng)4小時對于凋亡發(fā)生率或細(xì)胞數(shù)量沒有顯著影響(圖1a和1b)。但是，用VEGF-A培養(yǎng)24小時，顯著降低所有五種HUVEC培養(yǎng)物中的凋亡發(fā)生率(配對T-檢驗(yàn)P＜0.05)，并提高五個HUVEC培養(yǎng)物中的三個的總粘著細(xì)胞數(shù)(配對T-檢驗(yàn)P＜0.05；圖1c和d)。
從這些培養(yǎng)物中提取的RNA被用于制備復(fù)合cRNA探針，其雜交到上述Affymetrix基因陣列上。為了確定VEGF-A處理是否會改變HUVEC中轉(zhuǎn)錄本豐度的整個模式，采用隨機(jī)的效果-模型方差分析(ANOVA)。這表明用VEGF-A培養(yǎng)24小時顯著地改變轉(zhuǎn)錄本豐度的整個模式(F＝4.8；F＞3.9表明P＜0.05)，但是用VEGF-A培養(yǎng)4小時不改變該模式(F＝1.3)。先前指出的原代培養(yǎng)物之間的異質(zhì)性在本發(fā)明中也是明顯的。轉(zhuǎn)錄本豐度的模式在用VEGF-A處理4小時試驗(yàn)的5個對照培養(yǎng)物之間(F＝7.1；F＞2.4表明P＜0.05)，以及在用VEGF-A處理24小時試驗(yàn)中的5個對照培養(yǎng)物之間(F＝9.2；F＞2.4表明P＜0.05)差別顯著。由ANOVA方差組成計(jì)算表明，轉(zhuǎn)錄本豐度模式變化是由于用VEGF-A處理24小時，有意思的是，雖然該變化顯著，但僅為五個原代培養(yǎng)物之間的轉(zhuǎn)錄組差異所導(dǎo)致的作用的五分之一。
對VEGF-A的異質(zhì)反應(yīng)ANOVA表明五個原代培養(yǎng)物對VEGF-A的精確反應(yīng)模式是相互區(qū)別的，這是由于用VEGF-A處理和培養(yǎng)物來源之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)作用是顯著的(在24小時試驗(yàn)中，F(xiàn)＝4.4；F＞2.4表明P＜0.05)。
除了試驗(yàn)“誤差”外(如各個培養(yǎng)物的確切狀態(tài)間的細(xì)微變化)，對VEGF-A的異質(zhì)反應(yīng)是由于HUVEC供體之間的遺傳學(xué)和病史的差別。在任何兩組培養(yǎng)物之間測定對于VEGF-A反應(yīng)差別＞1.5倍的轉(zhuǎn)錄本的百分比。在同一個重復(fù)試驗(yàn)中，來自一個個體(個體3)的兩小管HUVEC被解凍并培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)兩個姐妹培養(yǎng)物對VEGF-A的反應(yīng)模式變化比不相關(guān)的培養(yǎng)物對VEGF-A的反應(yīng)模式變化小。
由VEGF-A調(diào)控的轉(zhuǎn)錄本為了確定由VEGF-A培養(yǎng)4小時或24小時調(diào)控的特異性轉(zhuǎn)錄本，選擇滿足三個標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)錄本(i)在五個對照和被處理培養(yǎng)物中比較轉(zhuǎn)錄本豐度的Baysian T-檢驗(yàn)(CyberT算法；參見方法部分)的結(jié)果表明P＜0.05。(ii)在所述五個培養(yǎng)物中的至少四個的豐度全都一致地受VEGF-A調(diào)控。(iii)由于存在于至少被比較之一的培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)錄組中，轉(zhuǎn)錄本被Affymetrix軟件標(biāo)記。采用這些標(biāo)準(zhǔn)，我們鑒定了可能受VEGF-A培養(yǎng)4小時調(diào)節(jié)的20個已知轉(zhuǎn)錄本和5個ESTs(圖2a和表1a)。我們鑒定了可能受VEGF-A培養(yǎng)24小時調(diào)節(jié)的55個已知轉(zhuǎn)錄本和9個ESTs(圖2b和表1b)。這些轉(zhuǎn)錄本的完全歸一標(biāo)準(zhǔn)化豐度數(shù)據(jù)見表1a和lb。可能被VEGF-A調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本編碼已知調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞壽命的不同蛋白家族的成員，以及未被特性描述的蛋白質(zhì)。溶基質(zhì)素-2及所述轉(zhuǎn)錄因子“tubby”似乎在4小時和24小時的時間點(diǎn)都被VEGF-A調(diào)節(jié)。一些其他轉(zhuǎn)錄本在4小時或24小時的時間點(diǎn)滿足上面列出的標(biāo)準(zhǔn)，但是在另一個時間點(diǎn)不滿足該標(biāo)準(zhǔn)。
為了確定所述Affymetrix陣列，已經(jīng)正確地鑒定受VEGF-A調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本，采用Affymetrix雜交分析的RNAs作為模板進(jìn)行定量實(shí)時PCR(TaqMan)。同時得到所分析的三個基因(tubby、蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶-1B和G-蛋白信號-3調(diào)節(jié)劑)的Affymetrix和實(shí)時PCR的結(jié)果。在大多數(shù)情況下，通過TaqMan測定的由VEGF誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄本豐度的變化大于用Affymetrix陣列分析所測定的變化(圖3)。
SAGE分析為了確定豐度最大的內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本以及它們是否受VEGF-A調(diào)節(jié)，在Affymetrix基因陣列試驗(yàn)的基礎(chǔ)上增加SAGE。如上所述，用或不用VEGF-A精確地培養(yǎng)另一個HUVEC分離物4小時。分離信使RNA然后進(jìn)行SAGE。從VEGF處理的細(xì)胞中總共測序到5380個雙標(biāo)記，而未處理的對照細(xì)胞中6698個雙標(biāo)記。由SAGE和Affymetrix分析檢測的豐度最大的轉(zhuǎn)錄本的目錄大體上是一致的。但是，由SAGE確定的0.5％豐度最大的轉(zhuǎn)錄本中只有5個在由相應(yīng)的Affymetrix試驗(yàn)確定的1％豐度最大的轉(zhuǎn)錄本中(圖4)。在相對小的SAGE試驗(yàn)中計(jì)數(shù)的雙標(biāo)記數(shù)量僅足以可靠地評價所述豐度最大HUVEC的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。但是，與所述Affymetrix的分析一致，所述豐度最大的HUVEC轉(zhuǎn)錄本中只有很少通過VEGF-A培養(yǎng)4小時來調(diào)節(jié)。在所述SAGE試驗(yàn)中計(jì)數(shù)的雙標(biāo)記數(shù)量不足以在豐度適中的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)中檢測VEGF介導(dǎo)的變化，如通過更加靈敏的Affymetrix分析來測定的變化。
總結(jié)內(nèi)皮細(xì)胞具有一個特化的轉(zhuǎn)錄組豐度最大的HUVEC轉(zhuǎn)錄本包括細(xì)胞骨架元件及其調(diào)節(jié)劑、核糖體蛋白、參與糖代謝的酶、泛素系統(tǒng)的成員、涉及各種形式信號的蛋白質(zhì)(表2)。這些豐度大的蛋白質(zhì)在不同的細(xì)胞系中具有重要功能，在各處均被表達(dá)。令人感興趣的是，該目錄中還包括非整聯(lián)蛋白的層粘連蛋白受體和淋巴因子(巨噬細(xì)胞移動抑制，MIF)。
在內(nèi)皮細(xì)胞中比在其他細(xì)胞系中表達(dá)豐度更大的轉(zhuǎn)錄本可能是內(nèi)皮特化性質(zhì)的基礎(chǔ)。這種轉(zhuǎn)錄本在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中高水平地表達(dá)，在子宮內(nèi)膜中中等水平地表達(dá)(由于該組織的血管成分)和在培養(yǎng)的B淋巴細(xì)胞中低水平地表達(dá)。這種分析表明已知形成內(nèi)皮細(xì)胞的特化結(jié)構(gòu)和功能的數(shù)個轉(zhuǎn)錄本按照這種譜來表達(dá)(表2)。它們包括絲氨酸蛋白酶抑制劑PAI-1(調(diào)節(jié)血管愈合和動脈新內(nèi)膜形成；[15])、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(在血管發(fā)生中降解間質(zhì)膠原蛋白；[16])、和Von Willebrand因子(作為凝血因子VIIIC的載體和調(diào)節(jié)血小板和血管壁的相互作用)。其他因子包括ERG(ETS家族的成員)和HHEX(同源框家族的成員)，作為轉(zhuǎn)錄因子，它們本身形成了內(nèi)皮轉(zhuǎn)錄組的特定性質(zhì)。其他按照內(nèi)皮非線性模式表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本編碼細(xì)胞粘著分子，如整聯(lián)蛋白α5和α6B，VE-鈣粘著蛋白[7]和CD31。這些可能是伴隨著毛細(xì)血管形態(tài)發(fā)生和跨內(nèi)皮白細(xì)胞遷移的特化粘著的基礎(chǔ)。內(nèi)皮細(xì)胞特異性反應(yīng)的豐度相對大的生長因子，如VEGF-C、血管生成素-2和PlGF闡明了其自分泌信號和協(xié)同作用對內(nèi)皮細(xì)胞存活的重要性[17]。由這種分析鑒定的ESTs所編碼的蛋白質(zhì)可能具有類似的重要性，但是對于內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)的作用還沒有被確定。
對VEGF-A的反應(yīng)由于VEGF-A促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的存活、增殖、遷移、形態(tài)發(fā)生成為血管并提高血管通透性，它是內(nèi)皮細(xì)胞的關(guān)鍵生長因子。雖然已知內(nèi)皮細(xì)胞對VEGF-A的反應(yīng)依賴于翻譯后的信號級聯(lián)，但是目前特性描述極少的下游轉(zhuǎn)錄組的變化可能起到關(guān)鍵的作用。為了定義這些變化，HUVEC細(xì)胞與VEGF-A一起培養(yǎng)4小時和24小時。在用VEGF-A培養(yǎng)4小時后，極少發(fā)生任何增殖和凋亡的變化，這表明此時明顯的轉(zhuǎn)錄本豐度變化直接對VEGF-A本身反應(yīng)。在用VEGF-A培養(yǎng)24小時后，細(xì)胞存活和增殖已經(jīng)上升。因此，此時的轉(zhuǎn)錄組變化反映除了VEGF-A直接作用之外的這些過程。ANOVA表明用VEGF-A培養(yǎng)4小時對于轉(zhuǎn)錄本豐度的整個模式?jīng)]有顯著影響。然而，鑒定出可能通過VEGF-A培養(yǎng)4小時來調(diào)節(jié)的少數(shù)個體轉(zhuǎn)錄本。暴露于VEGF-A中24小時確實(shí)顯著影響了轉(zhuǎn)錄本豐度的整體模式。但是，由VEGF-A處理24小時所調(diào)節(jié)的整個轉(zhuǎn)錄組變化仍然相當(dāng)小，不如來自不同個體的內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組之間的差別顯著。由于這些試驗(yàn)是設(shè)計(jì)用來研究單個因子對單一細(xì)胞類型的急性作用，發(fā)現(xiàn)僅一小組選擇的轉(zhuǎn)錄本的豐度特異地被VEGF-A調(diào)節(jié)可能并不令人驚奇。這些轉(zhuǎn)錄本中的一些在下文被討論。
VEGF介導(dǎo)調(diào)控編碼細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑的轉(zhuǎn)錄本可能啟動HUVEC的增殖，見圖1所示。例如，細(xì)胞周期蛋白D1(啟動G1/S階段轉(zhuǎn)換)被上調(diào)。E2F-4(結(jié)合到RB、p107和p130來抑制增殖相關(guān)基因的表達(dá))被下調(diào)。
見圖1所示的VEGF-介導(dǎo)的HUVEC的存活可能通過降低編碼促凋亡蛋白的轉(zhuǎn)錄本的豐度來啟動。示蹤信息素(trial)(TNF樣死亡配體[18])的豐度在用VEGF-A培養(yǎng)4小時后下降。在本試驗(yàn)所分析的HUVEC中，DR-5示蹤信息素受體豐度很大(第97個百分位)，而無論是否用VEGF-A處理，示蹤信息素的兩個抑制性誘捕受體(inhibitory decoy receptors)Dcr-1和Dcr-2僅被低水平表達(dá)。因此，示蹤信息素可能以自分泌的方式提高內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的可能性，而VEGF-介導(dǎo)的示蹤信息素轉(zhuǎn)錄本的豐度下降除了促進(jìn)其他局部細(xì)胞如血管平滑肌細(xì)胞和白細(xì)胞存活外，可能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞存活。VEGF-介導(dǎo)的編碼兩種其他促凋亡蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本的下調(diào)也可能具有生物學(xué)意義；p75(增強(qiáng)TNF-RI-介導(dǎo)的凋亡；[19])，和DAXX(與Fas相關(guān)并激活JNK路徑的促凋亡銜接蛋白；[20])。
在此描述的轉(zhuǎn)錄本豐度的變化可能對體內(nèi)VEGF-A促進(jìn)血管形態(tài)發(fā)生起作用。例如，可通過降解蛋白多糖和纖連蛋白而輔助血管發(fā)生的溶基質(zhì)素-2被VEGF-A上調(diào)?？勺鳛檠芷交〖?xì)胞促有絲分裂原促進(jìn)動脈發(fā)生的PDGF II也被上調(diào)。上調(diào)編碼整聯(lián)蛋白β1和α2的轉(zhuǎn)錄本也可能促進(jìn)這一過程。VEGF-A下調(diào)VEGF受體Flt-1起先是令人驚訝的。但是，這可能通過負(fù)反饋限制VEGF刺激的新血管發(fā)生的過程和范圍。受VEGF-A調(diào)節(jié)的大量轉(zhuǎn)錄因子可能將VEGF介導(dǎo)的變化特化(specify)于轉(zhuǎn)錄組，從而最終調(diào)節(jié)內(nèi)皮特異性蛋白質(zhì)組。具有特殊意義的是VEGF介導(dǎo)的雌激素核受體家族hERR1[21]的一個成員的下調(diào)。VEGF-A是由子宮內(nèi)膜的基質(zhì)細(xì)胞循環(huán)生成的。因此，由VEGF-A下調(diào)雌激素受體轉(zhuǎn)錄因子可以進(jìn)行VEGF-A和生殖性類固醇之間的“串話(crosstalk)”，在生殖組織中精確地控制血管發(fā)生。
三組在此鑒定的轉(zhuǎn)錄本的調(diào)控與先前的研究不一致，但是對此似乎有理由。(i)抗凋亡分子Bcl-2和A1之前已經(jīng)被確定是受VEGF調(diào)控的[22]。但是，由于它們的豐度不足以作為Affymetrix比較的可靠內(nèi)含物，所以不適用于(feature in)本分析。(ii)在先前的試驗(yàn)中，用50ng/mL VEGF-A持續(xù)培養(yǎng)對人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC)的588個轉(zhuǎn)錄本豐度的影響甚微[23]。但是，該試驗(yàn)設(shè)計(jì)(研究VEGF-A刺激的長效作用)和所用的細(xì)胞類型(HMEC)可解釋這種不一致。(iii)VEGF-A先前被證明在HUMEC細(xì)胞中上調(diào)Flt-1的表達(dá)[13]。在本試驗(yàn)中，F(xiàn)lt-1的表達(dá)不能通過用VEGF-A處理4小時和24小時改變，但是編碼可溶性flt-1的剪接變體在24小時后被下調(diào)。在本試驗(yàn)系統(tǒng)中，VEGF-A刺激和Flt-1表達(dá)可能是互不關(guān)聯(lián)的。促進(jìn)VEGF介導(dǎo)的Flt-1表達(dá)[16]的Ets-1轉(zhuǎn)錄因子，通過HUMEC培養(yǎng)物在用VEGF-A培養(yǎng)之前去除血清的步驟來下調(diào)(數(shù)據(jù)未顯示)。
雖然，可能本發(fā)明所鑒定的內(nèi)皮特異性和VEGF調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本中的某些對培養(yǎng)體系是特異的，同樣可能的是許多通過本試驗(yàn)所確定的轉(zhuǎn)錄本豐度模式在體內(nèi)發(fā)生，并且在所有內(nèi)皮細(xì)胞中有重要功能。這可以通過各種試驗(yàn)證明，如通過在血管化胚狀體中由本試驗(yàn)所鑒定的大量內(nèi)皮特異性和VEGF調(diào)節(jié)的ESTs的表達(dá)和“敲除”，來評價它們在復(fù)合組織的內(nèi)皮細(xì)胞中的作用。
對去除血清的反應(yīng)令人驚奇的是，極少SFD調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本與應(yīng)激所誘導(dǎo)的保護(hù)性反應(yīng)相關(guān)。被調(diào)節(jié)的包括編碼熱激蛋白27(↑2.3x)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶M4(↑9.5x)和A20(↑1.8x)的轉(zhuǎn)錄本。大部分通常與內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本，包括那些被轉(zhuǎn)錄因子NFκB、p53和HIF-1α和熱激因子上調(diào)的，在本試驗(yàn)中不被上調(diào)-事實(shí)上，數(shù)個被下調(diào)。這可能是由于在本試驗(yàn)中采取延長SFD時間來最大化凋亡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄積累變化。這或許已經(jīng)排除了瞬時應(yīng)激反應(yīng)的檢測。
令人驚訝的是，絕大部分SFD依賴的轉(zhuǎn)錄組變化似乎是直接促凋亡的，或者間接為之后的細(xì)胞凋亡作準(zhǔn)備的。本發(fā)明人認(rèn)為，這些變化構(gòu)成凋亡程序的關(guān)鍵部分。下文將描述這些變化可能促使凋亡的一些機(jī)理。
由去除存活因子誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組變化可能促進(jìn)細(xì)胞死亡由于死亡受體LARD(DR3)被上調(diào)↑2x，而腫瘤壞死因子同源示蹤信息素被上調(diào)↑2.8x，死亡受體信號可能在SFD細(xì)胞中被升高。凋亡“機(jī)制”的組分在SFD細(xì)胞中被上調(diào)，包括Caspase 10(↑1.8x)和Caspase 4(↑1.7x)。在SFD細(xì)胞中，一些編碼抗凋亡蛋白的轉(zhuǎn)錄本被下調(diào)，包括caspase抑制劑cIAP1(MIHB；↓1.9x)和DISC相關(guān)蛋白TRAF-2(↓6.1)。
存活信號下調(diào)數(shù)個轉(zhuǎn)錄組的變化似乎協(xié)同降低SFD EC對細(xì)胞外存活信號的反應(yīng)能力，從而促使細(xì)胞死亡；(i)編碼數(shù)個自分泌/旁分泌EC生長因子和存活因子的轉(zhuǎn)錄本在SFD細(xì)胞中被下調(diào)，包括VEGF-A(↓4.5x)、VEGF-C(↓4.2x)、結(jié)締組織生長因子(↓1.8)和表皮生長因子(EGF；↓5.1x)。(ii)存活因子受體也被下調(diào)。例子包括流動誘導(dǎo)的內(nèi)皮G蛋白偶聯(lián)受體(↓4.9x)、GP130(↓5.8x)和IL1受體組分-L1(↓6.6x)。(iii)通常給EC提供依賴于粘著的存活信號的編碼ECM成分的轉(zhuǎn)錄本也被下調(diào)。例子包括VI型膠原蛋白α2(↓3.4x)和VII型膠原蛋白α1(↓4.3x)。(iv)轉(zhuǎn)導(dǎo)生長/存活信號的粘著分子受體被下調(diào)，包括Nr-CAM(↓5.3)。有意思的是，Nr-CAM是少數(shù)在體外血管發(fā)生過程中被上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本之一。整聯(lián)蛋白α2也被顯著下調(diào)(↓4.1x)。但是，由于其他整聯(lián)蛋白被上調(diào)(如整聯(lián)蛋白α3↑2.9x)，在SFD細(xì)胞中調(diào)節(jié)整聯(lián)蛋白表達(dá)的意義是不清楚的。(v)一些編碼在EC中轉(zhuǎn)導(dǎo)存活信號的細(xì)胞內(nèi)信號分子的轉(zhuǎn)錄本被下調(diào)。例子包括STAT2(↓3.6x)和整聯(lián)蛋白相關(guān)激酶ICAP-1a(↓3.3x)。大量與G蛋白信號相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本也被調(diào)節(jié)；由于Rho/Ras和G-蛋白在決定EC壽命時起關(guān)鍵作用，這可能特別有意義。
在凋亡培養(yǎng)物中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子在控制凋亡程序中起至關(guān)重要的作用。例如NF-κB家族成員通過上調(diào)抗凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)來抑制凋亡。SFD后，NF-κB亞基p65在一定程度上(marginally)被上調(diào)(↑1.5x)，毫無疑問，其在EC對應(yīng)激的反應(yīng)中起先前所描述的作用。但是，NF-κB核定位I-kBα和I-kBε(MAD3)的抑制劑被顯著上調(diào)(分別為2.8x和2.7x)-這可能在SFD細(xì)胞中拮抗NF-κB的促存活作用。編碼Rel-B的轉(zhuǎn)錄本也被上調(diào)(↑3.5x)。Rel B，也稱作為I-Rel，是NF-κB介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活的直接抑制劑。此外，NF-κB p100亞基被上調(diào)(↑4.8x)。所述p100具有I-kB樣活性，含有一個致死結(jié)構(gòu)域。最近它被確定為使細(xì)胞對死亡受體介導(dǎo)的凋亡敏感和激活Caspase 8的復(fù)合物的一個成分。NF-κB依賴的轉(zhuǎn)錄本如cIAP1和TRAF-2在SFD后被下調(diào)，證實(shí)了NF-κB活性在SFD細(xì)胞中被抑制的觀點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄因子JunD也被SFD上調(diào)(↑2.1x)。根據(jù)其促凋亡的同源c-Jun推導(dǎo)，JunD上調(diào)可能促進(jìn)SFD EC的凋亡。編碼轉(zhuǎn)錄和剪接因子的另外26個RNAs的豐度在SFD細(xì)胞中被上調(diào)≥2倍，這可能是由于本文報(bào)道的一些轉(zhuǎn)錄組的變化。
轉(zhuǎn)錄變化可能促進(jìn)凋亡小體(apoptotic body)的吞噬作用凋亡程序的最后階段是凋亡小體被吞噬細(xì)胞吞噬。在健康的EC中檢測不到趨化因子單核細(xì)胞化學(xué)引誘物蛋白(MCP-1)的RNA和蛋白質(zhì)，但是它們在SFD后被顯著上調(diào)。重新表達(dá)MCP-1可能增加巨噬細(xì)胞聚集(recruitment)到EC死亡區(qū)域。SFD介導(dǎo)的Clusterin上調(diào)(↑3.7x)也可能促進(jìn)凋亡細(xì)胞的吞噬。Clusterin(載脂蛋白J)在活細(xì)胞中被凋亡碎片誘導(dǎo)，在鄰近細(xì)胞死亡時產(chǎn)生含有磷脂酰絲氨酸(phospatitidylserine)的脂囊泡，一般認(rèn)為是通過非專一(professional)的吞噬細(xì)胞促進(jìn)凋亡小體的吸收。
有絲分裂所需信號通過去除存活因子被下調(diào)編碼細(xì)胞周期和有絲分裂調(diào)節(jié)劑的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)變化可造成去除血清的細(xì)胞的有絲分裂停滯，這是由于24個細(xì)胞周期相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本在SFD后被下調(diào)≥2倍。細(xì)胞周期相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本都不被上調(diào)。被下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本包括對于G1/S和G2/M階段轉(zhuǎn)換關(guān)鍵的(↓3.8x)的CDC2、細(xì)胞周期蛋白A(↓2.9x)、H(↓2.4x)和E2(↓3.4x)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA；↓3.4x)、DNA聚合酶持續(xù)合成因子(↓3.4x)和在將DNA聚合酶-α加載到染色質(zhì)上時起作用的CDC45(↓3.5x)。
細(xì)胞死亡的數(shù)項(xiàng)其他變化與SFD過程誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄本豐度的相關(guān)性更加準(zhǔn)以評價。它們包括血管生成素-2(血管改變的啟動子；↓5.3x)、連接蛋白43(一種間隙連接成分；↓6.0x)、溶基質(zhì)素II(一種金屬蛋白酶；↓9.1x)和雙糖鏈蛋白聚糖(一種膠原蛋白和TGF-結(jié)合糖蛋白；↑3.4x)。
基于本文提供的數(shù)據(jù)，本發(fā)明人認(rèn)為轉(zhuǎn)錄組和糖組(glycome)的變化可能最后使應(yīng)激細(xì)胞對存活因子耐受(refractory)，直接提高死亡信號和caspase的表達(dá)，促使細(xì)胞周期停滯，將吞噬細(xì)胞集聚在內(nèi)皮損傷區(qū)域并促進(jìn)吞噬過程。
ESTs大量被確定的與本發(fā)明相關(guān)的ESTs特別可作為本發(fā)明的監(jiān)控方法的標(biāo)記，作為分析的靶點(diǎn)和作為治療所用的可能的療法。擴(kuò)增有意義的ESTs并列于在附隨的序列表中。可確定所述ESTs的開放閱讀框，這些開放閱讀框和ESTs或其片段可用于本發(fā)明。其他有意義的ESTs包括AI223047是1.1kb的轉(zhuǎn)錄本，與NADH脫氫酶(泛醌)1α亞復(fù)合物具有同源性，與其383bp的序列的同源性高。
AI813532是3.7kb的轉(zhuǎn)錄本，與TNF-R2的A鏈和R鏈具有同源性(與其長度為1.3kb具有極其高的同源性)，與TNF-R超家族同源。
AL050021是3.1kb的轉(zhuǎn)錄本，與sco-spondin-粘液素樣蛋白同源，與潛在的(M.musculus的)TGF-結(jié)合蛋白具有一定同源性。
AB020649是3.9kb的轉(zhuǎn)錄本，其序列的305bp與一PH結(jié)構(gòu)域同源，其序列的365bp與RUN結(jié)構(gòu)域的同源性極高。
AL049701是648bp的轉(zhuǎn)錄本，編碼假設(shè)蛋白質(zhì)(hypothetical protein)，還與克隆MGC20057相關(guān)。
AI885381(710bp)是另一個與克隆MGC2650相關(guān)的假設(shè)蛋白質(zhì)。
AI214965(4.4kb)與A鏈、C-末端Wd40的晶體結(jié)構(gòu)具有蛋白質(zhì)同源性，與KIAA1006的mRNA同源。
AA492299(5.6kb)與RAP1、GTPase激活蛋白1相似，與其638bp長度具有極高同源性。
AA631972(896bp)與天然殺傷轉(zhuǎn)錄本4、A鏈同源，與其558bp長度具有極高同源性。
D13633(2.6kb)與KIAA0008基因產(chǎn)物相關(guān)。
AI720438(925bp)類似于小的可誘導(dǎo)的細(xì)胞因子亞家族A，與人趨化因子Hcc-2的溶液結(jié)構(gòu)和鏈A、人Mip-1α的Nmr結(jié)構(gòu)具有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域同源性。
M20812(770bp)與Ig kappa鏈具有同源性，與鏈L、與親合成熟抗體復(fù)合的VEGF和鏈J、與中和抗體復(fù)合的VEGF具有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域同源性，與人kappa-免疫球蛋白種系假基因具有單基因同源性(unigene homology)。
AI985964(487bp)與(腸道的)三葉草因子3同源，與A鏈具有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域同源性。
S73591(2.7kb)與被1，25-二羥基維生素D-3上調(diào)的蛋白質(zhì)同源。
AI912041(723bp)與10KD熱激蛋白1類似，與熱激蛋白1的A鏈具有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性。
U41635(2.7kb)是從骨肉瘤中擴(kuò)增的蛋白質(zhì)，與人鳥苷酸結(jié)合蛋白-1的A鏈具有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域同源性。它還與人OS-9前mRNA具有單基因同源性。
U79259(1.7kb)類似于調(diào)理素(trophin)-1-人蛋白質(zhì)。
AI760932(805bp)與前列腺素D2合成酶類似，與人嗜中性粒細(xì)胞的晶體結(jié)構(gòu)、B鏈具有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域同源性。
X66436(1.9kb)與未知功能的人GTP-結(jié)合蛋白樣GTPase同源。
AB014538(5.1kb)與重酶解肌球蛋白(heavy meromysin)的cryo-Em結(jié)構(gòu)、S鏈同源。
AF052106(4.2kb)與假設(shè)蛋白MGC 4614同源。
Y09022(1.4kb)類似非樣蛋白質(zhì)(not-like protein)和與黑色素蛋白的A鏈具有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域同源性。
D80008(3.3kb)與KIAA0186同源。
AI743606(1.9KB)與ras-相關(guān)蛋白同源，與sec4-鳥苷-5′的晶體結(jié)構(gòu)/A鏈具有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域同源性。
AA663800(1.4kb)是一種假設(shè)蛋白質(zhì)。
原代培養(yǎng)物之間的異質(zhì)性本試驗(yàn)中一個有意義的發(fā)現(xiàn)是來自不同個體的原代內(nèi)皮培養(yǎng)物具有真正的轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性。所述異質(zhì)性部分由于所述培養(yǎng)物所源自的個體之間的遺傳的和病史的差異。事實(shí)上，相同個體細(xì)胞的重復(fù)(duplicate)培養(yǎng)物對VEGF-A的反應(yīng)差異小于來自不同個體的培養(yǎng)物的反應(yīng)差異支持了這種觀點(diǎn)。根據(jù)對冠狀動脈[26]和對外周血管疾病[27]的治療，對VEGF-A反應(yīng)的相似差異也可能發(fā)生在用VEGF-A處理的個別患者中。由于相同個體細(xì)胞的重復(fù)培養(yǎng)物仍然具有一些轉(zhuǎn)錄組的差異，轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性的其他部分必須存在的，如培養(yǎng)條件的細(xì)微變化。因此，從采用單一的、可能是特殊的原代細(xì)胞培養(yǎng)物的基因組試驗(yàn)中獲得結(jié)論是極其輕率的。
轉(zhuǎn)錄本豐度數(shù)據(jù)的解析目前，Affymetrix表達(dá)數(shù)據(jù)有時被接受，而不通過另一種技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證[28]。但是，為了確保本發(fā)明的數(shù)據(jù)是可靠的，采用SAGE來證實(shí)一大組高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本的相對豐度，采用定量實(shí)時PCR來證實(shí)三個轉(zhuǎn)錄本被VEGF調(diào)節(jié)。本發(fā)明人認(rèn)為Affymetrix表達(dá)數(shù)據(jù)的可靠性極大地依賴于嚴(yán)格的質(zhì)量控制和對原始數(shù)據(jù)的仔細(xì)的全面和局部的歸一標(biāo)準(zhǔn)化，如在方法部分中所描述。由于大量轉(zhuǎn)錄本通過Affymetrix陣列驗(yàn)證(interrogate)，可以預(yù)料到一些“假陽性”的轉(zhuǎn)錄本豐度的變化意外地共同存在于所有5個VEGF處理的培養(yǎng)物中。這是所有大規(guī)?；蚪M試驗(yàn)中的共同問題?？梢愿鶕?jù)被觀察的基因數(shù)量采用如Bonferroni修正的技術(shù)來提高顯著性所需的P-值，采用如“微陣列的顯著性分析”(Significance Analysis of Microarrays)[29]的方法來評估假發(fā)現(xiàn)率。但是，減少“假陽性”轉(zhuǎn)錄本豐度變化的最有效方法是采用多個獨(dú)立樣本，如本發(fā)明所用。
總結(jié)本發(fā)明已經(jīng)確定受VEGF-A調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本豐度(轉(zhuǎn)錄組)的特化的內(nèi)皮細(xì)胞特異性模式。該獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄組可能造成(underlie)這些細(xì)胞的特化結(jié)構(gòu)，及其在健康和疾病狀態(tài)在體內(nèi)起的獨(dú)特作用。本試驗(yàn)所鑒定的內(nèi)皮特化的和VEGF調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本可分析引起受VEGF調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程(包括內(nèi)皮細(xì)胞存活、組織侵入及與其他類型細(xì)胞互相作用)的翻譯前事件(pre-translational events)。還給治療血管發(fā)生依賴性疾病如癌癥、子宮內(nèi)膜異位和動脈硬化提供新的靶點(diǎn)。本試驗(yàn)還提出一個警示。本發(fā)明人證明令人驚訝的是從不同患者中分離的原代內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組是異質(zhì)的。可能其他細(xì)胞類型的情況也一樣。因此，本發(fā)明人認(rèn)為在單一的(可能是特應(yīng)的)原代細(xì)胞培養(yǎng)物上進(jìn)行的試驗(yàn)可能是誤導(dǎo)的。
材料與方法用于基因陣列試驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)和RNA分離如所述用膠原酶消化從臍帶中分離HUVEC[30]。在培養(yǎng)到第2代后，數(shù)瓶各種HUVEC分離物被冷凍備用。解凍后，在具有5％CO2的濕潤空氣中將HUVEC培養(yǎng)到第5代，采用添加了含有肝素、氫化可的松、EGF、FGF、2％胎牛血清、慶大霉素和兩性霉素的特定混合物的專門培養(yǎng)基(大容器(large vessel)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基；TCS，Botolph，UK)。一旦到了第5代，在含或不含10ng/mL人VEGF165(R&D systems，Abingdon，UK)的情況下，在僅添加了2％木炭剝離(stripped)的FCS(Gibco/BRL UK)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)HUVEC以部分地去除生長因子。每份HUVEC培養(yǎng)物采用相同的匯合和相同批次的培養(yǎng)基、血清和VEGF-A。采用Trizol(Gibco/BRL UK)，接著通過RNeasy柱(Qiagen，UK)和乙醇沉淀來制備總RNA。用Agilent 2100生物分析儀來評估RNA的完整性和濃度。
評估凋亡和細(xì)胞數(shù)用于基因陣列分析的HUVEC分離物同時在48孔平板上采用上述條件進(jìn)行培養(yǎng)。使用落射熒光體視反相顯微鏡(epifluorescent relief-phase contrastmicroscope)(Olympus，UK)計(jì)數(shù)8個重復(fù)孔中的總細(xì)胞和凋亡粘著細(xì)胞。凋亡細(xì)胞定義為排除(exclude)了臺盼藍(lán)(0.2％；Sigma UK)和碘化丙錠(20μg/mL；Sigma)的細(xì)胞，但用被膜連蛋白V標(biāo)記的細(xì)胞(膜連蛋白V-熒光染色試劑盒，按照生產(chǎn)商的說明書使用；Roche UK)和表現(xiàn)凋亡的形態(tài)特征的細(xì)胞。
Affymetrix寡核苷酸基因陣列制備生物素標(biāo)記的cRNA復(fù)合探針，按照Affymetrix方案(Affymetrix，High Wycombe，UK)雜交到Affymetrix人“U95A”基因芯片上。用AffymetrixMicroarray Suite(4.0版本)和dChip[31]軟件評價來自所有芯片的表達(dá)數(shù)據(jù)的質(zhì)量。去除不能通過這些質(zhì)量控制測試的芯片的數(shù)據(jù)。轉(zhuǎn)錄本豐度數(shù)據(jù)(“平均差”)全部用來使各個芯片(除了對照基因)的基因表達(dá)中值以1為尺度。然后需要更小級的局部尺度(scaling)來使所有芯片上的每個表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)都可比。為了達(dá)到這個目的，基于‘NOMAD’方案使用的一種方法(http//pevsnerlab.kennedykrieger.org/)，采用‘R’統(tǒng)計(jì)軟件系統(tǒng)的‘loess’功能(http//www.r-project.org/)。歸一標(biāo)準(zhǔn)化的來自VEGF處理的和未處理的培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)錄本豐度數(shù)據(jù)用CyberT算法(7.03版本；sliding window＝301，Bayes置信估計(jì)＝15)來比較。這種算法是不配對T-檢驗(yàn)，通過基于數(shù)據(jù)組的其他轉(zhuǎn)錄本的方差的Bayesian先驗(yàn)的內(nèi)容(prior)進(jìn)行改進(jìn)[32]。被選擇的基因的詳細(xì)Affymetrix探針組雜交數(shù)據(jù)用Filemaker Pro數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)檢測。該系統(tǒng)可以根據(jù)來自Affymetrix芯片的數(shù)據(jù)(所報(bào)道的轉(zhuǎn)錄本豐度、各個探針組(probe set)的量度等)和已知功能形成分類。然后該系統(tǒng)可以在多種比較情況下(和/或/非)組合這些分類，以獲得更小的數(shù)據(jù)庫，接著被鏈接到網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(如Swiss Prot，BLAST等)來收集序列和功能信息。用于進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析，在Macintosh G4計(jì)算機(jī)中使用‘R’統(tǒng)計(jì)軟件系統(tǒng)和Microsoft Excel2001。
SAGF程序及計(jì)算另一個HUVEC分離物購自TCS(Botolph Claydon，UK)，如上用或不用10ng/mL VEGF-A165培養(yǎng)4小時。采用稍加改進(jìn)的先前描述的SAGE操作從5□g polyA+RNA制備SAGE文庫[33]。捕獲的cDNAs被連接到含有標(biāo)記酶BsmF1(New England Biolabs)的識別位點(diǎn)的接頭上。然后用BsmF1釋放SAGE標(biāo)記，使其末端鈍化，并頭對頭連接形成雙標(biāo)記。通過Nla III消化從接頭釋放，連接(concatenate)并克隆到去磷酸化的由Sph I切開的pGEM-3Zf+上(Promega Life Sciences)，采用Applied Biosystems Prism DyeTerminator反應(yīng)試劑盒，在ABI 373自動測序儀上(Applied BiosystemsWarrington UK)測序。
實(shí)時PCR采用ABI PRISM 7700序列檢測系統(tǒng)(TaqMan)，按照生產(chǎn)商的方案進(jìn)行實(shí)時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。對于用于Affymetrix試驗(yàn)的所有RNAs，比較三個轉(zhuǎn)錄本與親環(huán)蛋白(cyclophilin)。所用的引物和探針為(i)Tubby；正向5’-CCCCCCAGGGTATCACCA-3’(SEQ ID NO4)反向5’-CCCCGGTCCATCCCTTT-3’(SEQ ID NO5)探針FAM-5’-AAATGCCGCATCACTCGGGACAAT-3’-TAMRA(SEQID NO6)(ii)PTP-1B；正向5’-TGATCCAGACAGCCGACCA-3’(SEQ ID NO7)反向5’-CCCATGATGAATTTGGCACC-3’(SEQ ID NO8)探針FAM-5’-AAATGCCGCATCACTCGGGACAAT-3’-TAMRA.(SEQID NO9)(iii)RGS-3正向5’-GGCTGCTTCGACCTGGC-3’(SEQ ID NO10)反向5’-AAGCGAGGGTACGAGTCCTTT-3’(SEQ ID NO11)探針FAM-5’-AGAAGCGCATCTTCGGGCTCATGGT-3’-TAMRA(SEQID NO12)附圖和附表詳述表1a和表1b通過本文描述的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的候選VEGF-調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄本以功能分類被列舉。某些情況下指明了豐度的變化方向?！癇y-P”表示來自Bayesian T-檢驗(yàn)的P值，用于比較5對對照和VEGF處理的培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)錄本豐度。“探針組”表示對應(yīng)于每個轉(zhuǎn)錄本的Affymetrix密碼。完全不被VEGF-A顯著調(diào)節(jié)的親環(huán)蛋白為對照。
表1a列舉了豐度最大的0.5％HUVEC轉(zhuǎn)錄本。豐度指來自不同個體的5個HUVEC培養(yǎng)物的歸一標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)錄本豐度的中值(其中指定豐度位于中值的轉(zhuǎn)錄本的值為1)。探針組表示對應(yīng)于各個轉(zhuǎn)錄本的Affymetrix探針組。
表1b顯示受VEGF調(diào)節(jié)的候選HUVEC轉(zhuǎn)錄本的歸一標(biāo)準(zhǔn)化的轉(zhuǎn)錄本豐度數(shù)據(jù)，該轉(zhuǎn)錄本滿足本文所述的統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)(對于每個芯片，指定豐度位于中值的轉(zhuǎn)錄本的值為1)。1-5表示來自用(VEGF)或不用(con)VEGF-A培養(yǎng)的5個個體的HUVEC。By-P表示來自Bayesian T-檢驗(yàn)的P值，用于比較5對對照和VEGF處理培養(yǎng)物中的轉(zhuǎn)錄本豐度。探針組表示對應(yīng)于各個轉(zhuǎn)錄本的Affymetrix探針組。
表1c和表1d表1c提供本發(fā)明的ESTs，其轉(zhuǎn)錄本水平在去除血清48h后被調(diào)節(jié)。因此，這些ESTs指示凋亡狀態(tài)。表1d顯示具有已知功能的基因也具有顯著被調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本水平。
表1e表1e提供在去除血清48h后被調(diào)整的其他轉(zhuǎn)錄本。它們?nèi)绫疚谋?c所述來測定。
表1f表1f提供了發(fā)現(xiàn)用原代HUVEC的VEGF處理可調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本，該HUVEC通過膠原酶消化從三個個體的臍帶中分離，在5％CO2的完全濕潤的空氣中，在添加了含有肝素、氫化可的松、EGF、FGF、2％胎牛血清(FCS)、慶大霉素和兩性霉素的特定混合物(大容器內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基；TCS，Botolph，UK)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)到第5代。用10ng/ml VEGF 165處理細(xì)胞24小時。分析來自三個樣本的數(shù)據(jù)，在所述表格的最后一列中顯示平均倍數(shù)變化表達(dá)。
表2上述豐度大的轉(zhuǎn)錄本表3列舉了在HUVEC中的豐度至少比B淋巴細(xì)胞和子宮內(nèi)膜中大10倍的轉(zhuǎn)錄本。Et/BL表示HUVEC中歸一標(biāo)準(zhǔn)化的轉(zhuǎn)錄本豐度(5個芯片的中值)與人B-淋巴細(xì)胞系Raji的歸一標(biāo)準(zhǔn)化豐度(2個芯片的中值)的比例。Et/Em表示HUVEC中歸一標(biāo)準(zhǔn)化的轉(zhuǎn)錄本豐度與人子宮內(nèi)膜樣本中歸一標(biāo)準(zhǔn)化的豐度的比例(2個芯片的中值，每個代表采集自5個個體的組織)。
圖1 VEGF-A抑制凋亡并誘導(dǎo)原代內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。(a和b)用(黑色柱)或不用(空心柱)VEGF-A培養(yǎng)HUVEC 4小時。(c和d)用或不用VEGF-A培養(yǎng)HUVEC 24小時。(a和c)平均凋亡發(fā)生率。(b和d)平均細(xì)胞數(shù)。顯示5個分別的表皮細(xì)胞分離物的結(jié)果，誤差條(error bars)表示兩個SD。
圖2 VEGF調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本。用點(diǎn)圖來比較用(Y軸)或不用(X軸)10ng/mL VEGF-A培養(yǎng)的HUVEC的(歸一標(biāo)準(zhǔn)化的轉(zhuǎn)錄本豐度)loge值。(a)VEGF-A培養(yǎng)4小時。(b)VEGF-A培養(yǎng)24小時。下標(biāo)字母(Lower case letters)表示表3所列的轉(zhuǎn)錄本。為延及所述尺度的較低部分，可見未顯示表明豐度最大的轉(zhuǎn)錄本。
圖3定量PCR確定一組來自Affymetrix基因陣列分析的結(jié)果。顯示對照與VEGF處理的HUVEC的轉(zhuǎn)錄本豐度之間的倍數(shù)差異。所述圖代表5個培養(yǎng)物中的豐度中值，并與親環(huán)蛋白的豐度相關(guān)(探針組33667_at；基本不被VEGF-A調(diào)節(jié))。相同的RNAs用于PCR和Affymetrix分析。誤差條表示平均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。被分析的轉(zhuǎn)錄本是tubby(34600_s_at；在用VEGF-A處理4小時和24小時后評價豐度)，蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶-1B(40137_at；VEGF-A處理4小時)和G-蛋白信號-3調(diào)節(jié)劑(36737_at；VEGF-A處理4小時)。
圖4 SAGE確定與Affymetrix分析豐度相同的內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本。所述點(diǎn)圖顯示用(Y軸)或不用(X軸)10ng/mL VEGF-A處理4小時的HUVEC(歸一標(biāo)準(zhǔn)化的轉(zhuǎn)錄本豐度)的loge值。被覆蓋的白圈表示SAGE所檢測的豐度最大的0.5％轉(zhuǎn)錄本在Affymetrix數(shù)據(jù)組(dataset)中的位置。線條標(biāo)記Affymetrix數(shù)據(jù)的第99個百分位。
縮略語基因表達(dá)的系列分析；SAGE血管內(nèi)皮生長因子；VEGF促有絲分裂原激活蛋白激酶；MAPK
應(yīng)激激活蛋白激酶；SAPKc-jun-NH2-激酶；JNK粘著斑(focal adhesion)激酶；FAK人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；HUVEC方差分析；ANOVA人微血管內(nèi)皮細(xì)胞；HMEC參考文獻(xiàn)1.Ferrara N，Carver-Moore K，Chen H，Dowd M，Lu L，O′Shea KS，Powell-Braxton L，Hillan KJ，Moore MWHeterozygous embryonic lethalityinduced by targeted inactivation of the VEGF gene.Nature 1996；380439-442.
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表1a.受VEGF-A處理4小時調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄本 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 By-P Probe setCON VEGCONVEGCONVEGCONVEGCONVEGF F F F F轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑NPW38 3.351.88 3.97 3.13 3.13 1.99 8.10 3.43 4.18 0.47 0.0078 34325_atCDC25 B3.391.75 4.64 3.11 5.37 3.31 3.92 3.71 2.74 0.56 0.0488 1347_at細(xì)胞周期蛋白D1 25.74 26.59 68.59 93.88 40.58 65.21 39.56 67.10 32.86 79.94 0.0134 38418_atHEM45 1.704.01 2.50 3.85 1.32 3.81 2.94 3.66 2.06 3.08 0.0195 33304_attubby轉(zhuǎn)錄因子 5.484.93 5.17 0.52 5.33 2.68 4.93 4.53 4.36 1.34 0.0112 34600_s_at凋亡調(diào)節(jié)劑示蹤信息素 2.921.07 2.54 1.04 1.47 1.11 0.75 0.57 3.24 1.25 0.0153 1715_at
TNF受體II(p75) 6.57 2.073.812.564.132.525.263.295.654.570.0153 33813_at生長因子/受體PDGF 2(c-sis)9.40 20.32 12.79 12.52 13.73 26.01 13.24 17.75 11.77 21.79 0.0087 1573_atIGF-BP10 21.8729.54 25.70 40.11 25.08 40.09 21.38 31.94 25.29 40.13 0.0198 38772_atneuropilin-2 4.15 1.524.440.612.493.091.471.083.392.500.0307 33853_s_at粘著/基質(zhì)溶基質(zhì)素-2 1.16 1.390.522.800.872.251.512.941.131.810.0132 1006_at雜項(xiàng)(Miscellaneous)細(xì)胞角蛋白17 0.44 4.681.364.596.456.831.088.630.539.260.0002 34301_r_atPex142.16 0.551.050.702.590.513.381.151.900.940.0012 33760_atNa，K-ATP酶β-1 5.10 8.007.4717.01 10.04 12.90 8.2116.33 12.16 15.81 0.0121 37669_s_atHsp70-5 32.9546.72 26.81 35.84 38.04 44.61 30.12 58.40 35.75 62.17 0.0207 36614_atcalponin 3 9.89 9.178.5412.13 9.3313.33 10.29 17.53 8.5116.49 0.0308 40953_atPTP 1B 0.45 2.471.631.740.511.281.902.301.263.470.0344 40137_atG-蛋白信號3調(diào)節(jié)劑14.1223.80 13.23 16.45 18.94 24.25 19.61 22.89 19.70 37.30 0.0366 37637_at親環(huán)蛋白(對照) 182.23 169.6 178.6 184.9 182.3 172.0 170.8 186.1 172.1 143.6 0.5526 33667_at8 0 8 9 8 1 0 3 9ESTsEST AA883101 3.65 0.520.520.863.900.525.522.794.210.770.0009 39815_atEST D80007 0.52 2.680.522.720.521.510.520.550.601.370.0020 34731_atEST AF000959 38.2939.37 73.24 40.65 37.82 26.30 48.65 34.26 53.96 22.59 0.0121 38995_atEST AL050021 4.85 7.306.7010.18 7.707.818.0811.75 4.7214.57 0.0174 39748_atEST AF052172 2.43 2.951.322.391.023.001.412.431.132.400.0273 36747_at
表1b受VEGF-A處理24小時調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄本 1 12 2 3 3 4 4 5 5 By-P Probe setCON VEG CONVEGCONVEGCONVEGCONVEGF F F F F轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑hERR1 6.153.20 6.36 3.90 5.05 0.79 6.07 3.57 8.53 5.100.0061487_at原癌基因C-Myc 13.50 12.039.84 8.37 11.33 8.17 8.81 4.93 20.34 7.020.0333 1936_s_atPBX13.462.67 2.01 1.29 2.14 1.60 2.68 0.54 9.47 2.580.0264 32063_atLMO24.307.52 5.89 7.67 5.38 6.23 5.78 9.00 5.07 7.240.0375 32184_atfra-1 3.291.96 2.97 2.43 3.23 2.15 3.90 2.90 6.77 2.750.0476 32271_atTubby 6.754.32 3.54 2.26 4.00 1.56 3.63 1.79 4.77 3.840.0442 34600_s_at神經(jīng)元PAS1 2.590.88 2.33 0.52 1.17 0.52 2.05 2.13 5.02 0.520.0055 34652_atTFHF15.34 10.389.85 9.51 11.91 9.25 10.74 8.41 24.03 9.610.0378 36826_atSCML2 1.392.39 1.06 2.86 1.50 2.38 2.64 3.35 0.39 1.840.0136 38518_atE2F-4 19.37 13.5011.50 11.89 14.61 10.04 10.49 8.01 30.41 11.01 0.0284 38707_r_atDRAP1 7.6912.8811.35 14.18 10.93 17.10 4.59 4.70 9.31 15.55 0.0454 39077_atR kappa B 8.236.06 8.03 4.56 7.88 4.59 7.05 4.84 9.93 4.900.0174 39137_atHOX3D 4.333.44 6.35 1.57 4.46 0.73 5.57 3.93 7.17 3.840.004416_s_atDNA修復(fù)OGG15.852.88 4.62 2.22 5.57 1.45 2.68 1.98 12.01 3.920.0043 34146_at凋亡調(diào)節(jié)劑DAXX8.465.76 6.38 4.15 7.30 4.65 8.56 5.87 12.71 4.930.0155 1754_at生長因子活化素β-C 2.742.75 3.64 1.89 3.52 0.54 2.69 1.50 8.97 2.390.0103 35915_at生長/分化因子1 5.853.40 2.74 2.61 3.44 1.26 3.31 2.51 20.00 3.630.0266 887_at粘著/基質(zhì)溶基質(zhì)素-2 1.353.42 0.98 1.96 4.42 5.21 3.17 4.24 1.62 5.130.0231 1006_at膠原蛋白C-蛋白酶- 3.391.11 2.57 2.32 1.72 0.52 2.77 1.25 14.18 1.730.0132 31609_s_at
轉(zhuǎn)錄本 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 By-P Probe setCON VEG CONVEGCONVEGCONVEGCONVEGF F F F F增強(qiáng)子(enh.)整聯(lián)蛋白β160.23 73.00 75.84 91.95 67.92 80.28 62.31 85.33 57.31 91.49 0.0027 32808_at原膠原蛋白C-蛋白酶 5.612.635.11 4.06 7.31 3.76 8.40 6.44 17.91 3.77 0.0097 39406_at整聯(lián)蛋白α-2 1.133.004.02 5.35 4.78 7.98 1.68 2.69 0.39 2.64 0.0329 41481_at細(xì)胞表面受體B型白細(xì)胞介素-8受體3.792.142.38 1.61 3.04 1.63 2.43 1.56 6.29 2.95 0.0242 1032_atFlt-1 2.311.423.25 1.86 2.24 0.53 2.71 0.89 4.73 2.49 0.0091 1567_atIGF-結(jié)合蛋白-3 6.052.391.51 2.20 3.74 0.79 2.43 0.66 20.70 2.19 0.0116 1586_atLDL受體相關(guān)蛋白3 8.826.085.80 5.64 13.48 3.19 6.16 4.45 34.61 4.36 0.0061 31815_r_at前列腺素E受體EP3 7.394.585.54 4.10 3.55 2.86 5.08 3.76 20.75 5.06 0.0314 32691_s_at多巴胺D4受體 1.250.812.57 0.52 3.37 0.52 3.68 0.52 10.04 2.95 0.0039 35042_at4型谷氨酸鹽受體21.16 16.08 15.46 13.10 19.03 14.34 13.94 11.84 44.46 13.91 0.0199 35485_at白細(xì)胞唾液酸蛋白 2.672.092.29 1.98 2.51 0.53 2.67 1.73 3.87 0.55 0.0137 36798_g_at紅細(xì)胞生成素受體 18.68 14.69 11.17 8.82 12.85 6.08 11.47 9.17 68.03 10.15 0.0158 396_f_at白三烯b4受體 2.585.092.51 4.60 2.34 2.51 2.69 3.44 0.45 4.74 0.0036 39624_atDMBT1 6.294.312.61 2.89 4.67 1.06 4.01 2.41 9.83 3.04 0.0135 41382_at雜項(xiàng)c-Ral 16.26 23.51 20.62 22.34 27.48 34.40 22.52 30.25 18.86 32.63 0.0344 1877_g_atRAP1 6.064.677.40 6.10 5.20 4.84 6.03 3.84 41.79 5.97 0.0365 33080_s_at胞嘧啶脫氨酶 7.715.315.71 2.03 7.48 0.48 4.94 3.93 10.12 4.61 0.0037 1117_at細(xì)胞色素P450 IIA 3.002.081.72 0.52 1.88 0.79 2.00 1.06 2.49 1.53 0.0345 1553_r_at鈣網(wǎng)蛋白 65.41 41.33 39.49 37.99 45.98 18.25 50.46 40.82 62.61 40.92 0.0061 32543_at核糖體S6激酶 4.627.032.68 3.84 5.28 5.33 0.97 2.43 2.58 7.35 0.0334 32892_atHGF激活劑抑制劑6.300.692.49 0.51 1.65 2.83 3.12 1.38 16.66 2.82 0.00933448_at類4(like-4)-ADP-核 2.004.242.21 2.58 1.88 3.79 2.12 3.01 0.42 2.70 0.0063 33796_at
轉(zhuǎn)錄本 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 By-PProbe setCON VEGCONVEGCONVEGCONVEGCON VEGF F F F F糖基化因子BAF170 4.321.08 1.48 1.18 1.79 0.52 3.43 1.97 3.600.680.0031 34690_at細(xì)胞色素c氧化酶 5.137.58 5.41 7.08 5.62 9.59 5.28 7.22 4.547.220.0179 36687_atVIIbGlcNAcα-唾液酸轉(zhuǎn) 3.355.25 0.64 2.55 2.14 4.23 1.53 2.86 0.391.990.006 36916_at移酶FEZ1-T 7.804.34 6.20 4.01 7.05 4.42 5.32 2.68 56.47 5.730.021 37744_r_at膜協(xié)同因子蛋白 8.8312.09 9.43 10.43 10.64 15.54 8.02 13.90 11.80 15.93 0.037 38441_s_at溶酶體酸脂肪酶 2.563.35 1.01 1.80 3.11 4.80 1.90 2.88 0.402.120.0483 38745_at胸腺特異性肽酶 3.511.79 2.08 1.10 2.70 2.33 2.36 1.99 13.60 1.670.0243 39306_atcullin-12.803.69 2.10 4.20 3.52 4.79 3.42 3.99 1.243.170.0451 39724_s_atFzr19.156.04 4.11 3.20 4.34 2.29 5.29 3.02 13.43 4.600.0226 39855_atMAP激酶磷酸酶4 3.850.61 4.02 1.43 3.19 0.71 3.95 2.35 6.800.550.0002 40186_at磷酸二酯酶Iα6.332.87 0.47 0.72 2.11 1.17 3.01 0.57 14.30 4.710.0331 41125_r_at5-核苷酸酶 2.402.77 1.90 3.02 1.78 3.75 2.40 3.23 1.903.250.0343 738_at親環(huán)蛋白(對照) 86.10 73.36 83.25 90.25 76.10 73.76 93.12 80.47 77.19 61.09 0.2545 35823_atESTsEST AB01457415.22 14.04 18.63 11.71 14.77 9.60 17.09 14.29 22.85 13.53 0.039 31826_atEST AL0500652.911.44 2.58 2.03 3.13 1.12 2.25 1.17 2.851.480.0177 34112_r_atEST AA5278803.966.17 4.86 5.76 3.34 4.27 3.94 4.01 1.495.530.0438 35773_i_atEST AB0206490.992.95 1.27 3.94 1.82 4.28 2.99 4.05 0.394.290.0001 36150_atEST AI1408574.483.01 2.38 2.31 2.87 1103.06 1.46 31.98 2.690.0291 37429_g_atEST W28610 9.723.25 7.77 6.28 9.90 5.51 7.20 5.11 11.09 4.710.0054 38942_r_atEST AB0289511.472.71 2.11 3.18 2.78 4.45 2.68 3.38 0.482.000.0348 39417_atEST AB0111481.972.64 2.96 3.44 2.89 4.16 1.44 3.36 1.302.820.0406 40811_at
轉(zhuǎn)錄本 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 By-P Probe setCON VEG CON VEGCON VEGCON VEGCON VEGF F F F FEST W26628 14.77 9.7710.09 6.33 14.71 6.54 14.14 8.81 14.81 9.33 0.00641514_s_at表1c潛在受去除血清48h的處理來調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄本




表1d





表1e


表1f






表2豐度大的內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄本 豐度 探針組G-蛋白信號G-蛋白α亞基S 85.837449 i atRACK1 122.6 34608_at糖代謝醛縮酶A 91.832336_at磷酸甘油酸變位酶1 87.241221_atGAPDH 138.3 M33197_3_at細(xì)胞骨架β-微管蛋白 107.4 151_s_at胸腺素β-4119.7 31557_at肌球蛋白輕鏈 87.833994_g_at波形蛋白 132.4 34091_s_atγ肌動蛋白1 117.5 34160_atβ-肌動蛋白 164.6 X00351_M_at核糖體蛋白核糖體蛋白S3A 83.81653_at核糖體蛋白L10 118.8 2016_s_at核糖體蛋白S19 93.531330_at核糖體蛋白L28 100.9 31385_at核糖體蛋白L8 99.931505_at核糖體蛋白S2 125.2 31527_at核糖體蛋白S18 97.331545_at核糖體蛋白S10 83.631568_at核糖體蛋白L3 93.631722_at核糖體磷蛋白P190.331956_f_at核糖體磷蛋白P1111.1 31957_r_at核糖體蛋白L37a125.8 31962_at核糖體蛋白L32 81.732276_at核糖體蛋白S11 87.732330_at核糖體蛋白S14 93.432412_at核糖體蛋白S5 87.232437_at
核糖體蛋白S20 121.432438_at核糖體蛋白L41 121.932466_at核糖體蛋白S21 84.6 32744_at核糖體蛋白S12 99.6 33116_f_at核糖體蛋白L38 98.3 34085_at核糖體蛋白S17 109.034592_at核糖體蛋白S17 104.034593_g_at核糖體蛋白S4 90.2 34643_at核糖體蛋白S3 108.034645_at核糖體蛋白S28 99.0 347_s_at核糖體蛋白L13a 84.9 35119_at雜項(xiàng)層粘連蛋白受體(非整聯(lián)蛋白) 128.6256_s_at膜連蛋白A2(脂皮質(zhì)蛋白II) 171.8769_s_atMIF90.2 895_at血漿酶原激活劑抑制劑I 111.438125_at延伸因子1-α148.61288_s_at泛素C 91.5 1367_f_at烯醇酶193.6 2035_s_at多泛素UbC 97.9 32334_f_at苯丙二氮受體 88.2 32806_at親環(huán)蛋白A 97.0 33667_at延伸因子1-α144.040887_g_atESTsEST AI535946 114.533412_atEST AI541542 113.835278_atEST U34995 172.435905_s_at
表3內(nèi)皮非線性轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)錄本 Et/BLEt/Em 探針組轉(zhuǎn)錄HHEX(同源異型框) 14 1437497_aterg 265 22914_g_at粘著/基質(zhì)整聯(lián)蛋白α6B 24 1133410_atVE-鈣粘蛋白 110 4437196_atPECAM-1(CD31) 77 1737398_atMMPI 419 757 38428_at整聯(lián)蛋白α5 57 1339753_at生長因子TSG-14404 2294 1491_atVEGF-C17 121934_s_atIGF BP 10 250 1438772_atBMP-6 87 1239279_at血管生成素-2 32 4337461_atP1GF 37 105 793_at受體Eph-A412 181606_atTGF-βRII 92 101814_atPECAM-1 133 61268_atTMP 58 1237762_atIL1受體1 27 1240322_atp27 24 13425_at雜項(xiàng)Ras抑制劑SF4 11 361783_atIPL 27 2231888_s_at溶質(zhì)載體1682 1433143_s_at內(nèi)皮特異性-1 222 344 33534_atRGS 5 62 1133890_atPLOD2 38 1034795_at細(xì)絲蛋白C 23 1735330_at肌球蛋白X 129 1035362_atSCHIP-1 30 2236536_at核糖核酸酶A 60 1537402_at
HERMES 16 8438049_g_atPAI-I 1875238125_at胰蛋白酶原IV16 1240043_at絲氨酸蛋白酶SIG13 3471040078_atMAP 5 13 1141373_s_atVon Willebrand因子 98 18607_s_atESTsEST AL08021513 1132454_atEST AB02315516 1133235_atEST AI67209810 6033407_atEST AB00788923 6137363_atEST Y09836 26 1138396_atEST AB01452017 2338671_atEST AF00095987 2938995_atEST AI74309014 1639549_atEST AF00143610 2541658_at
序列表SEQ ID NO1EST id N42007CCAGCGAGGATGCAGACGAGTTGCACAAAATTTTACTGGAGAAAAAGGATGCCTGAACACGCAAAGTCGGCTGCAGAATTATTGCCAAGTTGCTGCTGCTTCCACCGCCCCTTAGTCAGTTTTTCTTCTCTTCTTTGACATTCTAAGAACTTATAGATAACTTAAAACTTTTGTGAGGAAGATTAATGTGGCCAATAAAACCTTTAAATGTTAAGTGTCAAGAAACTGCACTCTCCCTTCTTAAGAACTGCCTAAAGTGTAAAATACATTTGAATGCAATTTTTGGAAGATTTTTTAATGTTCGTTTATTAAACTAACCCTAAGTGATTTCTTCAAGGACTGCAATCAGGGTATCAATTTGCTTTCCCAAAGGCTCTTCCAACCCGTGGGTTTTGGGGTCCACCGCCACCACCAGAGAGGCTTTTGAACAGGTGCCTGGCTGTGTTCAGAAGGAAGCTGGCCTGTGTGCTTCTCTCCGGTGGGCTCAGCCGACGTGTGAGACTTGTTCTGTTACCAAATGAACCGGGCTGCCACGCTGTGACAGGCGTTTGTCCTCTGCTTTATTTTTACTTTGAAGCTCAAATGCGAGTACTAAGTGTTCACCTCAGCGTTCGAATCATGTAACCCTGTGGGCTGCTTCACGAGAATTCAGGACCTGCATTTTCATTCTAAAAAGAAATGAACAGCTTGTGAAGGAGTTTTTTGGCTTCATAGTTTCTATTCATGAGGTAGTGTTACTTCTTTATCCCCCTAAAGACAAAATGAAGATAAAGGGGGATTGCCAGGAATGGGTTTAAAAGCACAAATGTGGTAGCTTATCATCTACACCATGGAGAGTGAACCCTTACGAAATGAAAGTCAAATGAGACCATCCGAGAAAAAGATGCGCATAGGCATTTGTACCATGATCAACCCCACGCACATGAAAACTGTGACCAAGTGACGTGCCTGGGAGCTTTGACACACGAGCCGTGTGAATTCACTAGGAAACATGTAATAAAGTCATGGAAGAGAAAATCGTGTGTAAATTTTGCCTTTAACTTTAGACCGCAGTATATTATAATACATTTGATATCTGAAATATCTTTACTTTTTTAAGAGTAAGATTCCATATGTCTGTCTGGAAGGGAGCCATGGTTATTCACACGAATATCCCTGTCACTTCTCCAGAGGTGTCAGGTAACTAACACGAGCATTCTTTGAAGACTCTGGGCACATGAATGATACACAGAATTGAATGTTTAAATTTCCACTTTGAGTCCTCATGAATCATTTGAGACTAGTACCAGCTGATCTTGTGTACAGGCTCAGGGTCAGTGCCCAAGGGCTCCCGCGTGTGTGTTCTGATCTTCAGTGCGTAGCACATTCTCCATTTAGAAAAGAGTGGTCAGAATAATTGTGGACGGTACAGTGGCTTTTTAAAACTACAGTCTTTAGGTGTAAGGTTTGGCGCCGGGAGCAATTTTATGATCAAATATGATGAACTCCTAAGTCACTGAGGTGTGATTGGGCCAATGTTGGCATGAGGTTCTTGCTCTACTTCCAGTGTTTTGATTCCACTGGGAGAATTTGGCCTAGTGTGTGGCTTTGGATGAATCCGTGTAGAGAGAGGTGAGCTTGTCCTGTTACAGATGCTGTCAGACATAGCGATAGTAGGCACCTAGGGAGGAAGTGGCCGTTAGTTTTACACTGACTTTTTAAGAATGGAGAATGCACGTGGGTTTCTGTTGCGGATGATTCATAGTAAGCAAGCGGTTGATGCTGTTAATACCGGCCCCACCCGATTGACATTAAGTTTATTCAGCTTTTAAAAWGATGAAGAACTARGGGGAACAAATTTAAGTTTGTTGCAACTTAGCCACACATGCTTCCCTGGTACCAGCTGGAATCAGCAGCTCACAGGCATCTTCAGGACACTTCAGTGTATATGACACAGTACTTTGTTAGCGTCTGCGTGTGTATGGAAAGTTGACAAAAAATGGCATGAAAAGATCATGATTGGATTTTCTTTTAAACCTGCCCTTCTGTAAAAAATAGTTTATATATTTTTAAATTAGTAGGTATGTGTGGCTTCCTTTTTTCCTAACATTCCCAGCAAATTTTTGCTGCTAAGACTATCACTGTTAAAGTGAAAATTACAGGGAAAAATGTGAT
GAATATACCGTAACTCAAAATGTGATATTTTCTTAAAATCACTCTTTTATGCTTTAGGAACTGGTTGGTCTCCACTTTGATTATTAGTGTAAAGAGCCTGAGTATACGTGGATTTCATTGTAAAATTTAACTCCTTGTCTTTTACTTGGGGCACGGGGCCCCTGGAGGGCTTCCCTACTTTCCCCACTATGTTAACAGGTAATTCTGATTTATGCGTTTAGTTTGACTTATTTTTAACAAAATATTAGAAGTTATGCTTTAAAATGTTTAATGTGGACTGAAATTTTCATCTTTTGTTTGAGAATCTATGAAGTGTATCATATACGTGGCCTAAAGCAAGGTGTGTATTTTGTTATTCTGAAATTGTTTTGCATCTGGACAAATACTAAATATCCCAGTGGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAACCTGTGTATCCATCTCATCCTTTTGCGCATTCCTAGTAAGCAAAAAAATTTGTTATGCCATCTTCATTATTCGAATTACAGACTGAAAAAATATGGCCAGTTTTTAAAGAAGTTTAGATTATGTTTTCCATGGAAGGACAAGTCTGACTGTTCATAGGCTGATTTTCTTTAAGAGGATTATTCTGTTTTACAATTTCAATTCTAGATCACATTTTATATATGCTGCATGCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAASEQ ID NO2EST id AA663800GAGCAGACTATTGCTGATATGTTGGTTTTAATTCAAAAGAAACGATGATGCCAAATGGTTTGGAATTGACAGCAGCTAAGGAGGAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGAAAAAAAGAAAAGGCTGGTGACACCCCCCTGGCGTGGTTGACCTGGTCCCAGTCGCAGTCCCTATGGCAGCAGGCACGCGTAAAACAGAACCTGATGACGGCTGAAAATCAAGCCAGACTGCTGTGCGGCTAGCTTGCCGCCGTGGAATGCCTTGTGTCTTGGCCATGTCCAGCCAAGGGTACAACGTGCTTGTTCCCGATCACCCAGGTTTGCCATTGGAAGTCAAAGACAGAATCGCTTCATGGCACTACAGATGTGGAAAAATAAAAATCTCAGCTAGAAAGAACGTCCGATTTGGAGATAGCGGGAGGACACGAAGGAGTGGGGGCCATTTTGGTGCTGAGAGGAGGGTGCCCCAACTTCAGGAGGACCATGTGACGGCTGTGGTTGTTTTCGGGGTCACTTGCAGCACACACAGCGTCCCCTTGATGCTCGATGGGGACCGCAGACGGGCTGCAGACCTAACCCCTGGCTGTGGACAGAGAGGCTGCTCCAGGCTTCTTTCCTTCTCAATGCTTTACACAGGATTTCCTTCATTTGTGCTTTCCTTTGGTTTAACAGTTAAAAAAGAAGAGTGAGGGGGCAAAATGGTTTGTCACTTGTCCAAAACTGAGAGAAGAGGTGGAAGTGGGCGCCAAATCTCCTGGGTGATGCTTCCTGGTCCTGGCGATCGGTTGCTTGCTCAGGGTTTGGGAGCTGTTGCTCTGGAACCACCGCTGGCCTTCTGGGACCTCGCTTCCGTGGTAGGGGACGTGAACCAGCCTCCTGGTGGAGCTTTGTGTTGCAGTGAGGCCACAAAGCAAAGGCCCAGGAGCAGAGGCCTGACACTGGCTGTGGTCGACGGTCACACCTTGACTCCCTCTCTCTCTCTGAATATACAACGTGTGGGTGGGCCCGTTCAGCAGATGTTACAGGAAAAATAGCAAATTTTTAACTTATTCCATCTCCAAAGTTGAAAAAGATCAGACAGTTACTAAAATAAACGATTTCTCAATTGCATTCTGGTGCCGKGGCCCGGTGGCCGCGGCGTGGGCGGGGCGTTGGAGGTGGGAGGGCCCCGGCTGAGTGAGGGGCTCACTCARAACAGGCACAGTCAGCTGGGCTGAGCGAGGCTCARAGTAAGGCGGTGTTCCTCACAGAAGAACACATCGGAAAAAGCTGCTCCTCTTCTGCTGGTCCGGTGTGATTTTGACTCCCTGGTTGCTCCCTGGGGCTGTTGCCTTCCATTTTTTGTCCATTTTTGCTTTGATATCTCTGGCGAGAGTGAAAAATGCATTTTCCACATTGATGTTGGCCTTCGCGCTGGTCTCCATGAACTTGATTCCATAGTCGAGGGCCAGCTTTTCTCCCCGTTCCTTGGAAACTTGTCTCTTGTCATTCACATCACACTTGT
TCCCAAGTATCATCTTTTCGACGTCTGCAGAGGCGTGCTCCTCAATGTTGCGAATCCAGTTCCGGATGTTGTCGAAGGACTTCTCGTTGGTGATGTCGTAGACCAGCATGATGCCCATTGCACCCCTGTAGTAGGCCGTTGTGATCGTCCGAAACCGTTCCTGACCGGCTGTGTCCCATATCTGCAGTTTAATTCTCTTGCCATCGAGCTCTATGGKCCTAATTTAAAGTCAATTCCTATGGTGGAGATAAAAGTKGAGTTGAAGCGTCCTYSGAGAAGCGGAACAGGACACAGGTCTTYCCCACCCCSKAGTCCCCGATCAGCAGCAGCTTGAACAGGTAATCGTAGGTCTTCGCCATSEQ ID NO3Est id AA492299GGCCCTAACAGGAATGAAACTGAGGTGTCAAGAGGGCTCTCTGTGCACACTTTTGGCCATGACCCAGTGTCTTCTGCAGTCCTTACGCAGCCACATGAGGACACTCAGCACAGAGCAGCCTGTGTGTCCCAGAGAGTGAGAGAACTGAAGTGGTGTCCCCAAGGCCACCCGGCAAGTTGGTGGCAGAGCCAATACCTGAGCTACCCTTAGGCCCCGTATGTACCTGCTTCTCATGTGACGCACAGGGAAATTGAGGCCTGGCCCCACCTCCCTCTGTTGCCCTGCTGGCCACATGCCCAGGGGAAGGGATTTCCAGGGCTTACCCAGAGTGGCATTGCTGGGGAGAGACCAGATGCCTGGGCTCCTGGGTTTCCCCAAGGGGACGGCCCTTAGGAATCCTGTGCCTCCTCCACTGCCACCCCCTTCACAGCGGGTCATCCGGAGCCGCAGCCAGTCCATGGATGCCATGGGGCTGAGCAACAAGAAGCCCAACACCGTGTCCACCAGCCACAGCGGGAGCTTCGCGCCCAACAACCCCGACCTGGCCAAGGCGGCTGGAATAGTGAGTGCCCTCCCCCTCCCCAGGCCCCGGCCCCTCCCTGGGGGGCCCTCAGCTCTCCTCTGCCTCCTGAGGCCTGACTCCAACTCTCTCTGTTGCCCTGCTGCCCACATGCCCATCCTAGGCTCTGGATTTGGTCTAGCCACTACTTTCCATGGGAGGGGGGTGAAGTGCCCAGGCCAGGACACTGCGGTGCTGACAGCTTGCAGCCTGCAGCCCCTTCCCAAGCTCCTTGGCCCTCCCCTCCTCCTGGCCCTTTATGCATTGAGGTGTGACTTCCTGCAGGTCAGCCCTGGGACAGCCTCTGTGTCTCATTCCTTATTGAGTATCTATCTGTTTGCTGGGGACTGGGCTGCTGTGTGGGCACCTACTGTCAAGCCTTGGGTTTCTGGGAGCACCTACTGTGTGTCGGGCTGTGGGCACCCACTGTGTGTCAGGCCCTGGGCTGCTGTGTGGACATGCACTCTGTGAGCATCTACTGTGGGCCTGGCCCTGAGTACCTGTGAGCACCCACTGTGTGTCAGGTCCTGGGCTGCTGTGTGGGCATCAACTCTGTGAGCGCCTACTGTGTGCGCAGCCCTGGGCTGCTGTGTGAGAACCTACTGTGTGTCAGAAAATGGACTGCTATGTGAGCACATCGTGTGTGATAAGCCCTAGATGTCAGTGAACACCTACTGTGTGTCAGGAAGTGAGCTGTTGTGTGGGTACTTTCTCTGTGAGCACCTCCTACTGTGTGTCCGCAGCAGCCAGGGCCTCTGTGGTGTGGCTGCCTATTGTGTGTCGGGAATCTGGCTTCTGTGTGAGCATCTCCAGAGGGAGCACCTCCTGTGTGATCACTGACTGTTGTCCAGGTTCTGGGATTCTGCTGCTCACACTCAGGAGTGCTGGGCACATGGATGAATACGGCCTATGGCTGTGGGCCTCACTGCTGTCCACTGCCTAGTGGCCACCCCAGGACACTGCACCCACTGCTGTGCTCCCCACCCATCCATCCAGCCACCCATCCATCCACCCACCCATCCATCCATCCACCCACCCATCCACCCATCTAGCTATCCACCCACCCACCCATCCACCCACCTACCCATCTACCCATCCACCCACCCACCCACTCATCCATCCACCCACCCATCCACCCACCCATCCACCCATCAATCCATCCATCCACCCACCCATCCACCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCCATCTCTATCCATCCCTCTATCTCCATCCATCCATCCACCCACCCACCGATCCATCCATCCATCCATCCTTTATTG
ACTGTCTACTGCATGCCAAGCCCTGCGCTCAGTGCTGTGAGGCTATGTCACGTGGCAGGAGGGAATTCCCCGACCTCTGCTGTCCAGCAGTCACCAAGCACACTGTCATGCGAGGAGCAGGCCCAACCTCCCCCAACCCAGTTTTATCAACCACTCCCTTCCTCTCCACCAGAGTGACCCAGCCTCCTGTGGGTGGCCGAGAGGGGCCCCAGGGACAGGACCAGGCCAGCAGCACCCACCATGGCAGTAACCGGACCCATTTCTGTTTTGTTTTTGCACAACTCTCCCTCTCTCTGTGTTTCCTCCTTTCATTCTACTCTCTCTCCTTGTTTTTTTGTTCCCTCCTCCCTTCCCTTTCCCCGTCCTGTGGCCTCTCTGCCCTTTGGCTCTCTGTTTCTCCTTCCTTCTTGCACCTGTCTTTTTTTGCTCCCTCTCCTCCTTCCCTTCTCCGCTCTTCTCACCCTCGCTTTTTCCTTTCGGCCTTCCCCTGGCTTCCTTCTCTGTCTCTGACCCTCCCTGGGCCTGTGTCTGTGTCCTTGCGTCCCTGTCTCTCTGGATTTCCCTCTGTGCCCATCTGGTGTGCCCTCGCTGGCTCACGCGTGTCCCTGTCTCCGGGTAACTGTCTGTCCATCTCTCCCCCGTCTCCCTTGTCCTCTGTCTCTCCTTGTGCTTCTCGCCTTCCTTTCCCCGGCCCTATCTCTCCCATTGCCTCCTGCACCGTTCTCTTCCTTTTTCTGTCTGTCTTCCTCCTTTCCCTGCCTCTCCTCCTCTCTGTGTCTCCCTCCCACCATCTCTCTTGCTCTCTGACTCTCTCTCTGTCTCTCTCTCTCTGCCCCCGCCCTCTGCTGCTTGCCAGTCATTGCTTATTCCTGGGAAAAGTGCGAGTAGATTCGGACGCCGGGGCAGTGCCATAGGCATAGGAACCGTGGAAGAGGTTGTCGTCCGCGGGGCCGCCGGCTCTGGAGGCTGCCTGCACGCGCTGTTCTCTGCTCGCTCTCAGGACGGAGGCCATATTGGGGACGTTGCCCCTCTGCCCCCGGGACAGGCCCCAGGGCGTGCGGGATGGAGTGGCGGCAGCTCCGATGGCACTCAGCACCTGCTTTGGGGCCTGGTACCTGTGCCAGAGCCAGTGCCCCTCACCAGGGGCTTCTGGCCCTGCCTTGGCCCCTGGGACCCTGGCCCAGTCCCTGCCAGGATCCGGTACCCAAAGGCCCTACACCCAGCCGCACGTCCCCCAATATCGCCGGTCTGCATGGAGCGCCATCCCTCTCCTCTGCCCTGACTCCTCCTCCCCGCCACGAAGTGACCTGGGGTCCTACCCCTTCCTGCCTCCAGAGAAGCTGGGGGCGGGCTTCTGGGGCCTGGGGCATCCCAGCACAGTGTGTGGGAAGCTGGGGGAGTCTTCCAGCTGCTGGGCCAGAACCTCCCCCAGCCAATTTGGAGGTTCCGGGGAGGGGCCCTAGCTGGCACGGGGTGGGACTTGGGTTGCTACACTGCCCTCTGACCACTGCCCTTAGGCTGCAGATCCCACAGAGCCCTGGGGGGCGGGGAGCGGTAGCCATTCTGAGGACTCGGCCTCCTCCCACCCTAGCCCCCTCAGGATGCTGTCCTAATCCTGGGCCAGTATTGACGTGCAGTCCTGCCGTGTGAGCTCGGGAGAGCCCCTTGCCCTCCTGGGGACTGTTTCCCTTTCGTAAACTGGGAGGCTGTCTCTGGGAATGGATATCTTCTCTCGTTCTTTCTTGCTCATCAACTCTGCTTCAGGGCCTGGGGCAGCAGGATCCCCAGAGGGGATGTGGGGGGGCACTGGGGCTCCCAGGTAAGGTGGCACTGAGTTGGGGCCTCTCCCCACAGTCACTGATTGTCCCTGGGAAGAGCCCCACGAGGAAGAAGTCGGGCCCGTTCGGCTCCCGCCGCAGCAGCGCCATTGGCATCGAGAACATACAGGAGGTGCAGGAGAAGAGGTGGGTGAGTGGGGGACAGTGCCCCATTCCCCTGCACCCCCATCCCTGAGCCCCATTCGGTGGCAAAGCAAGGCAGGCAGAAGGGAGTGCCCGCCCCTCTGCCTCTCCATCCCCACTAGTGACAGCTGTGTGGTCAAGTCCCTGCTGCGTGTCGGGCACCAGGGCCAGCACGTCACCTAACGTGCCACATGCAGATCAAGAAGCGGTAGGTCAGAGGAGTCAAGGGGCTTGCCCAGATCACACAGCCAGTGATGGGCAGAGCTAGGATCTGAGCCCTGATCTGTCTAGGGCCAGCATCCGTGCTCTTCCCACGGCCCCAGCGCATGTGGGAGGGCCTAGTGCTGGTTTTCAGGGTGGCCACAGATGGGCCTGGGGGGTCCATGAGTGTGGGCAGCATGAGGGCAGTGAGCCCAGGCCAGCAGCAGGGCTGCCCCCG
GACATCAGAGGCTAGCTCCCGGCTGCCTCCCCGATATTAACCATGTGTGACCTTGGGCGAGTCACTGACCTCCTCTGAGCCTTACTGTCCCAACCTGGAAAAGGGACAAGAACACAACCCATGGCATGGGGCTGCTGTGGGGACTCAGGGCACTGCGTGTGAGGCCAGGGCCAGGTCCCCTGAGAGGGCTCCAGGACGGGAGTGGGCATTGTCCTTGCTGCTGCCAGAGCTCCGCATGCTGTGAGTCCTGGGTTCAGGTCTTGGCACTGCCACGTCCTAGCTGTGCGTCCCTGGGCAGGTTCCTTATCCATAATGGGACAGCTATACCTGCTCCTGTGGAGAGGACCTGGGAGGAGTCCCATCCTGTCCCATATAGCCCCATCAGTGCCAACCCCATCACTGGCCAGGCTAGCCAGGGAGCCCACAAGACTGCTCCAGGGCTGGCCCTGAGTATAGGGGCGTGGGTATGGGGCAGGAGGCACCGTGACTCCCCTCACCGCCTGGGCCTCACGCTACGCCTGATGCCAGGCCTGGTGCTGAATCCCCCCGCTGCCCCCGTGTGCCCCGCAGGGAGAGCCCTCCGGCTGGTCAGAAGACCCCAGACAGCGGGCACGTCTCACAGGAGCCCAAGTCGGAGAACTCATCCACTCAGAGCTCCCCAGAGATGCCCACGACCAAGAACAGGTTGGGGCTCAGGGCACGTGGGGCTTGGGGGCTTGGGAGTGGTGAACCGTCCTTCCCCTCCCCTGCCTGGGCCCGGGACAGCACAGGAGCCTTGACTSTGCCACAGCAGGGTGTCAGGGGGACCTGGGCATTCTCTGGGGCCCTCCTTTGACATATACCCAGCGAGCACTTTGTCACGCCCAGCCCCGCGCCCGRCTCTGGAGCACAGAGGTGCCTGCGCATAGGTCCCCGCTCACGGCGCAGTCCATCAGAACGCGGCTCATAGGTGTTGCGGATCATGGTGATAGGAGGAACCCGAAGCAGGGTTGGGGGRATGAAGARGGACTGGGGGCAGAGGTGTTTTAGATGSGTCCTCGGGGAGRCACCTCCATGGGGTGACATTTGAATTGGGAACTGAACCAGCCCTGCTAGGACTGGCATGGCAGAGGAGCTCGGCCAGTGCAGAGGCCTGGGGCACACTCCAGGGACAGAAAGAAGGGTGGCTGGGAGTGGTGACGTATGCCTGGAGTCCACCTACCTGGGAGGCTGAAGCAGGAGGATGATTTTAGCCAGGAGTTGGAGCTGCAGTGAGCTATGATCATGCTGTAATAGCACTGCACTCTAGCTGGACATCATAGCAAGACTCCATTGCTC
權(quán)利要求
1.一種監(jiān)控疾病狀態(tài)發(fā)展的方法，所述疾病與人類患者中的血管發(fā)生或血管形成相關(guān)，所述方法包括定量測定樣本中至少一種表1所示基因的轉(zhuǎn)錄本水平，該樣品包含從所述疾病的部位獲得的細(xì)胞；和比較如此測定的轉(zhuǎn)錄本水平與至少一個得自細(xì)胞對照樣本的基因的轉(zhuǎn)錄本水平。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述對照樣本是在較早時間點(diǎn)從所述患者的疾病部位上獲得的。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述對照樣本是從所述患者的未患病組織的內(nèi)皮細(xì)胞中獲得的。
4.權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)的方法，其中所述測定是在所述患者的一個療程后進(jìn)行。
5.前述權(quán)利要求的任何一項(xiàng)的方法，其中測定了至少一個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑、至少一個凋亡調(diào)節(jié)劑、至少一個生長因子或生長因子受體和至少一個粘著/基質(zhì)蛋白的轉(zhuǎn)錄本水平。
6.前述權(quán)利要求的任何一項(xiàng)的方法，其中測定了至少5個基因的轉(zhuǎn)錄本水平。
7.權(quán)利要求6的方法，其中測定了至少10個基因的轉(zhuǎn)錄本水平。
8.前述權(quán)利要求的任何一項(xiàng)的方法，其中測定了表1a中至少一個基因的轉(zhuǎn)錄本水平。
9.前述權(quán)利要求的任何一項(xiàng)的方法，其中通過雜交到基因芯片來測定轉(zhuǎn)錄本水平。
10.權(quán)利要求1-8的任何一項(xiàng)的方法，其中通過定量PCR來測定轉(zhuǎn)錄本水平。
11.前述權(quán)利要求的任何一項(xiàng)的方法，其中所述疾病狀態(tài)是與不期望的細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病，包括實(shí)體瘤。
12.權(quán)利要求1-11的任何一項(xiàng)的方法，其中所述疾病狀態(tài)與血管系統(tǒng)缺乏相關(guān)。
13.一種適合用于前述權(quán)利要求的任何一項(xiàng)的方法的基因芯片陣列，其包括至少一種適合檢測至少一種表1所示基因的核酸；可選對所述至少一種基因特異的對照；并可選所述基因芯片的至少一個對照。
14.一種血管發(fā)生或血管生成的調(diào)節(jié)劑的分析方法，其中所述方法包括(a)提供一種選自表1的蛋白質(zhì)；(b)將所述蛋白質(zhì)與其活性的候選調(diào)節(jié)劑接觸；和(c)確定所述候選調(diào)節(jié)劑是否能夠調(diào)節(jié)所述蛋白質(zhì)的活性。
15.按照權(quán)利要求14的分析方法，其中所述候選調(diào)節(jié)劑是結(jié)合所述蛋白質(zhì)的抗體或其結(jié)合片段。
16.按照權(quán)利要求14的分析方法，其中所述候選調(diào)節(jié)劑是所述蛋白質(zhì)或其模擬物的片段。
17.一種血管發(fā)生或血管生成的調(diào)節(jié)劑的分析方法，其中所述方法包括(a)提供培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞；(b)將所述細(xì)胞與血管發(fā)生的候選調(diào)節(jié)劑接觸；和(c)確定所述候選調(diào)節(jié)劑是否能夠調(diào)節(jié)選自表1基因的至少一個基因的轉(zhuǎn)錄。
18.按照權(quán)利要求17的分析方法，其中所述候選調(diào)節(jié)劑是反義寡核苷酸。
19.從權(quán)利要求14-18的任何一項(xiàng)的分析方法獲得的調(diào)節(jié)劑的用途，其用在調(diào)節(jié)人類患者的血管發(fā)生或血管生成的方法中。
20.一種載體，其包括來自表1的EST序列，其中所述EST序列可操作地與轉(zhuǎn)錄該序列的啟動子連接。
21.權(quán)利要求20的載體，其中所述EST序列按閱讀框與翻譯起始區(qū)域連接來翻譯所述序列。
22.權(quán)利要求20的載體，其中所述EST序列處于反義方向。
全文摘要
本發(fā)明提供在人類患者中監(jiān)控與血管發(fā)生或血管生成相關(guān)的疾病狀態(tài)的發(fā)展的方法，其中定量測定在包含從所述疾病部位獲得的細(xì)胞的樣本中至少一個表1所示(是指表1a－1f的任何一個或多個)的基因的轉(zhuǎn)錄本水平，并與至少一個得自對照細(xì)胞樣本的基因的轉(zhuǎn)錄本水平比較。在各種不同條件下，包括去除血清后，表1的轉(zhuǎn)錄本以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性方式對VEGF反應(yīng)。本發(fā)明還提供可被用于所述方法中、由所有或一些轉(zhuǎn)錄本以及適當(dāng)對照組成的基因芯片陣列。
文檔編號A61P35/00GK1646700SQ03807601
公開日2005年7月27日 申請日期2003年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月7日
發(fā)明者斯蒂芬·D·查諾克瓊斯, 斯蒂芬·K·史密斯, 克里斯汀·G·普林特 申請人:劍橋大學(xué)技術(shù)服務(wù)有限公司