專利名稱：通過4－1bb和/或cd40的體內(nèi)觸發(fā)誘導抗腫瘤ctl免疫的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及治療腫瘤或感染性疾病的方法和組合物，其中所述組合物包含一種激動性抗CD40抗體或其片段和/或激動性抗4-1BB抗體或其片段。所述組合物可進一步包含具有或編碼I類MHC或II類MHC限制性T細胞表位的多肽或核酸序列。
背景技術：
許多腫瘤逃離我們的免疫系統(tǒng)的監(jiān)視。在癌癥患者中，免疫系統(tǒng)消除腫瘤細胞的特異性機制中顯然存在數(shù)量和/或質量上的缺陷。這些機制之一是由胞毒性T細胞(CTL)提供的，其能識別并殺死病毒感染的細胞或者轉化為癌細胞的細胞。先前推測樹突細胞(DC)刺激T輔助細胞，該輔助細胞反過來又有助于CTL的激活。本發(fā)明人證實了T輔助細胞對CTL不(通過IL2的分泌)直接提供輔助信號，而是T輔助細胞對DC提供一個信號，該信號誘導仍未鑒定的細胞表面和/或可溶分子，這些分子在沒有T輔助細胞的情況下可激活CTL。由T輔助細胞提供給DC的信號由CD40L-CD40的相互作用而介導。這個新發(fā)現(xiàn)為癌癥的免疫學治療提供了獨特的機會。
當自體細胞被病毒感染或者當它們轉化為癌細胞時，免疫系統(tǒng)能殺死這些自體細胞。這種潛在的危險機制顯然必須在嚴密的控制之下。免疫系統(tǒng)的CTL作為失活的前體處于循環(huán)之中。為了被激活，前體T殺傷細胞必須識別其特異性抗原肽，所述抗原肽以MHC I類分子在專職APC上存在。然而，為引發(fā)(prime)這些T細胞，APC還需要以由共刺激(costimulatory)表面分子B7.1和B7.2等及淋巴因子IL-12提供的合適共刺激關系呈遞該抗原。
直到最近仍認為需要識別相同APC上相同抗原的T輔助細胞以充分激活CTL。特異性T輔助細胞供給CTL激活所需要的細胞因子如IL-2。然而Guerder和Matzinger(J.Exp.Med.176553(1992))提出CTL激活的“許可”模型。在這個模型中，他們提出當T輔助細胞識別其在專職APC上的抗原時，將一個激活信號輸送給APC，結果隨后能激活CTL而不需要存在T輔助細胞。只是在最近才闡明了許可模型的分子學機制。Schoenberger等(Nature 393480(1998))描述了在許可模型中CD40L-CD40途徑的作用。T輔助細胞與DC之間通過CD40-CD40L結合的相互作用導致DC激活，從而使得DC有效引發(fā)原初(naive)CTL。
DC通過機體的組織循環(huán)并以此方式可以集合、加工及呈遞抗原。在集合抗原之后，它們遷移至引流淋巴結(draining lymph node)，在此將抗原呈遞給T細胞。本領域熟知DC需要被激活以最佳發(fā)揮作用。靜息的DC細胞僅表達中等水平的MHC和共刺激分子，而且是T細胞的弱刺激物。DC可以由炎性細胞因子和細菌產(chǎn)物激活，導致MHC和共刺激分子的正調節(jié)。DC激活為表達最佳水平的MHC分子、共刺激分子及淋巴因子如IL-12的完全成熟DC，需要通過CD40受體額外觸發(fā)這些細胞。結果，炎性細胞因子在抗原吸收位點的組合及在T輔助細胞相互作用期間的CD40L-CD40相互作用導致許可DC激活CTL的最佳能力。
許多腫瘤通過特異性CTL機制逃避免疫監(jiān)視。如果DC在非炎癥條件下聚積腫瘤抗原，則被激活的T輔助細胞的數(shù)目可能太低而不能誘導足夠的CTL被激活從而誘導適當?shù)目鼓[瘤應答。這個觀念促使研究人員通過給予直接刺激CTL活性的細胞因子如IL-2和IL-12或者通過給予用GM-CSF轉染的腫瘤細胞加強抗原呈遞以幫助免疫系統(tǒng)。這些策略獲得了多變的但鼓舞人心的結果。
顯然仍強烈需要發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生和/或增強包括細胞免疫和體液免疫的保護性抗腫瘤應答的方式。發(fā)現(xiàn)CD40激活途徑是產(chǎn)生初級體液和細胞免疫應答的一種主要免疫調節(jié)途徑。如上所述，DC上的CD40途徑與誘導抗腫瘤CTL應答相關。另外，巨噬細胞上CD40途徑的激活刺激一種強力殺腫瘤活性。
通過CD40L+Th細胞或通過激動性抗CD40 Ab(在不可獲得足夠的T細胞幫助的情況中)引起的CD40觸發(fā)的主要作用是DC的成熟，這賦予這些細胞以呈遞抗原從而引發(fā)原初CTL所需要的共刺激信號的能力(5)。對由均在成熟DC上高水平表達的CD80和CD86遞送給T細胞上CD28受體的共刺激信號已經(jīng)加以最廣泛的研究(參見(6，7))，盡管這個信號在T細胞激活中起關鍵作用，但在這個過程中還有許多額外的共刺激途徑也起作用。其中之一包括4-1BB/4-1BBL受體-配體對。4-1BB是TNF受體(TNFR)家族的一個成員并在激活的CD8+和CD4+T細胞上表達(8，9)。其天然配體4-1BBL在B細胞、巨噬細胞和DC上表達(10-12)。體外研究示出用激動性抗-4-1BB Ab刺激T細胞提高TCR誘導的增殖及T細胞產(chǎn)生的細胞因子。盡管CD4+Th細胞和CD8+CTL在這種途徑中均可被共刺激，但CD8+T細胞與CD4+T細胞相比對4-1BB觸發(fā)更敏感(8，13)。因此，在體外阻斷4-1BB共刺激示出抑制APC-介導的T細胞激活(14，15)，而且4-1BBL缺陷小鼠示出產(chǎn)生抗病毒感染的CTL免疫的能力下降(16-18)。相反，給予小鼠激動性抗4-1BB Ab示出在移植物抗宿主病的小鼠模型中增強CTL產(chǎn)生(13)，而且還導致在攜帶腫瘤的小鼠中較少的免疫原性腫瘤排斥(19)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及CD40結合分子以及4-1BB結合分子，它們可以單獨應用或者與CTL激活肽包括腫瘤抗原或感染因子(infectious agent)抗原一起用于藥物組合物中。這種組合物可用于增強肽腫瘤疫苗的抗腫瘤作用，或者用于激活CTL以便激活的CTL可以發(fā)揮抗腫瘤或感染的細胞的作用。CD40和/或4-1BB結合分子可包括抗體分子以及其同源物、類似物及修飾的或衍生的形式，包括免疫球蛋白片段如Fab、(Fab′)2和Fv，以及結合CD40或4-1BB并激活CTL應答的小分子包括肽、寡肽、肽模擬物及有機化合物。CTL-激活肽包括腺病毒衍生的E1A肽，其具有序列SGPSNTPPEI(SEQ ID NO2)，及衍生自人乳頭瘤病毒16型的HPV16 E7肽，其具有序列RAHYNIVTF(SEQ IDNO3)。
CD40結合分子、4-1BB結合分子及CTL激活肽可以通過合適方式包括注射方式給予患者，或者可以給予編碼這種分子和肽的基因構建體，從而在體內(nèi)或在體外(ex vivo)產(chǎn)生所述分子和肽。這種基因治療根據(jù)本領域熟知的方法進行。如果所述基因構建體的轉染或感染在體外(ex vivo)進行，則感染或轉染的細胞可以給予患者，或者這些步驟可以在體內(nèi)進行，由此所述分子和肽內(nèi)源性產(chǎn)生。如果在體外(ex vivo)進行轉染或感染，則可以通過常規(guī)方法進行，所述方法包括電穿孔、磷酸鈣轉染、微注射或者通過將所述基因構建體摻入合適的脂質體中?？梢允褂幂d體包括反錄病毒、腺病毒或細小病毒載體或者質粒以摻入所述基因構建體，所述構建體然后在體內(nèi)或體外表達。
本發(fā)明證實T細胞幫助CTL引發(fā)是通過CD40-CD40配體(CD40L)相互作用介導的，而且在沒有CD4+T細胞的情況下CTL的引發(fā)不足可以通過在存在CTL激活肽包括腫瘤抗原的情況下，單克隆抗體(mAb)介導CD40激活骨髓衍生的APC而恢復。另外，由CD4+T細胞表達的CD40L的阻斷導致不能產(chǎn)生CTL免疫。這種缺陷可以通過體內(nèi)CD40觸發(fā)而克服。CD40的體內(nèi)觸發(fā)可明顯增強基于肽的抗腫瘤疫苗的效力，或者激活CTL以導致抗腫瘤或抗感染細胞反應。
還注意到CTL激活肽可以成為耐受原性的，這意味著在沒有抗CD40的情況下，宿主對抗表達這種肽的細胞的反應被抑制。然而，這種肽與一種激活的抗CD40抗體組合可以將耐受轉變?yōu)閺奀TL激活。另外，如上所示，CD40連接可以為已具保護性的腫瘤特異性肽疫苗提供在攜帶腫瘤的小鼠體內(nèi)誘導治療性CTL免疫的能力。
這些發(fā)現(xiàn)共同證實了CD40-CD40配體對可發(fā)揮開關作用，以確定原初外周CTL是否被引發(fā)或耐受。因此CD40結合因子如單克隆抗體及其它刺激配體可以與CTL激活肽組合而有效應用。
本發(fā)明進一步證實通過激動性抗4-1BB抗體觸發(fā)4-1BB為CTL輸送一個強共刺激信號，該信號可有效代替交叉引發(fā)抗原特異性CTL免疫所需要的CD4+T細胞幫助。4-1BB可以將一種另外的耐受原性肽疫苗轉變?yōu)槟苡行бl(fā)CTL的形式。原初CTL的初始激活可以在沒有4-1BB共刺激的情況下發(fā)生，但這個信號使抗原刺激的CTL的存活增加。通過4-1BB共刺激觸發(fā)的T輔助細胞不依賴性CTL免疫需要預先刺激TCR及CD-28依賴性共刺激。4-1BB介導的存活信號因此位于抗原特異性TCR觸發(fā)及CD-28依賴性原初CTL的共刺激的下游。4-1BB結合分子本身或與CD40結合分子和/或CTL激活肽組合因此可用于制備誘導、擴增及持續(xù)抗原特異性CTL應答的藥物，例如用于提高抗腫瘤疫苗的效力。
附圖簡述

圖1E1B-特異性CTL的交叉引發(fā)(cross-priming)需要CD4+T輔助細胞測試取自正常小鼠(a)或用Ad5E1-BALB/c MEC免疫的CD4-耗竭的B6小鼠(b)的脾細胞在各種效應物/靶比率下對荷載E1B192-200肽(實線所示)或者Dd-限制的對照肽HPV-16 E749-57肽(虛線所示)的同源(syngeneic)MEC靶細胞的裂解，所述E1B192-200肽衍生自人腺病毒并具有序列VNIRNCCYI(SEQ ID NO1)。每條線均代表一只小鼠。所示數(shù)據(jù)代表所進行的具有相似結果的三個實驗之一。
圖2CD40激活代替CD4+T輔助細胞將取自CD4-耗竭的(a，b)或者II類缺陷的I-Ab-剔除(KO)(c，d)B6小鼠的脾細胞用Ad5E1-BALB/c MEC免疫并用CD40-激活抗體(Ab)FGK45(a，c)或者同種型(isotype)對照抗體(b，d)處理。測試這些脾細胞對荷載E1B192-200肽(實線所示)或者HPV-16E749-57對照肽(虛線所示)的同源MEC靶細胞的E1B-特異性CTL活性。每條線均代表一只小鼠。所示數(shù)據(jù)來自兩個獨立的實驗。E/T比率即效應物/靶比率。
圖3B細胞不是交叉引發(fā)APC或者抗CD40介導的交叉引發(fā)恢復所必需的脾細胞取自未處理的小鼠(a)及用Ad5E1-BALB/c MEC免疫并接受同種型對照抗體(b)或CD激活抗體FGK45(c)的CD4-耗竭的B-細胞缺陷的B6 MT小鼠(b，c)。測試這些脾細胞對荷載E1B192-200肽(實線所示)或者HPVE749-57對照肽(虛線所示)的同源MEC靶細胞的E1B-特異性CTL活性。每條線均代表一只小鼠。所示數(shù)據(jù)代表所進行的具有相似結果的兩個實驗之一。
圖4CD40L阻斷能防止E1B-特異性CTL的交叉引發(fā)脾細胞取自用Ad5E1-BALB/c MEC免疫的并用CD40L-封閉性抗體MR-1(a)或者對照抗體(b)處理的B6小鼠，或者取自在免疫后24小時用CD40L-封閉性抗體MR-1組合CD40-激活抗體FGK45(c)處理的小鼠。測試這些脾細胞對荷載E1B192-200肽(實線所示)或者HPV-16E749-57對照肽(虛線所示)的同源MEC靶細胞的E1B-特異性CTL活性。每條線均代表一只小鼠。所示數(shù)據(jù)代表所進行的具有相似結果的三個實驗之一。E/T比率即效應物/靶比率。
圖5經(jīng)皮下注射E1A肽的小鼠不再能引發(fā)E1A特異性CTL將C57BL/6小鼠用20μg于IFA中的E1A特異性肽(a，b)或對照肽(c，d)經(jīng)皮下注射兩次(間隔1周)，并在1天后經(jīng)i.p.注射SAMB7(b，d)加以攻擊，所述SAMB7是高表達E1A肽的細胞系。測試衍生自這些小鼠的大批培養(yǎng)物對用E1A肽(-■-)或HPV16 E7-肽(-○-)脈沖的靶細胞的E1A特異性胞毒性。圖中示出了在不同效應物/靶(E/T)比率下的代表性大批培養(yǎng)物的特異性裂解。將這個實驗重復4次獲得相似結果。
圖6耐受性E1A肽在于IFA中經(jīng)皮下注射后迅速全身性分布將衍生自未處理的C57BL/6小鼠(-)或提前16小時經(jīng)皮下注射于IFA中的100μg E1A或HPV16 E7肽的小鼠的脾細胞用作E1A特異性CTL克隆的刺激細胞。針對不同的效應物/刺激物的濃度示出[3H]-胸苷摻入(cpm)+/-S.E.M.，不用減去背景計數(shù)。結果是5個獨立實驗的代表。
圖7在體內(nèi)CD40觸發(fā)之后，CTL耐受誘導轉變?yōu)镃TL引發(fā)為野生型C57BL/6小鼠(a，b)及H-2bCD40-/-小鼠(c，d)經(jīng)皮下注射20μg于IFA中的單獨的E1A肽(c)，E1A肽組合大鼠IgG2a對照抗體(a)，或者E1A肽組合抗CD40 mAb FGK-45(b，d)。測試來自這些小鼠的大批培養(yǎng)物對用E1A肽(-■-)、HPV16 E7肽(-○-)或Ad5E1轉化的腫瘤細胞(-◆-)脈沖的靶細胞的E1A特異性胞毒性。圖中示出了在不同E/T比率下代表性大批培養(yǎng)物的特異性裂解。將這個實驗分別重復18次(B6小鼠)和2次(CD40-/-小鼠)，獲得相似結果。在(e)中，示出了在E/T為60的情況下分別衍生自用在IFA中的單獨E1A肽(左側)或者E1A肽與抗CD40 mAb組合(右側)注射的小鼠的23和37個大批CTL培養(yǎng)物的特異性裂解百分比。圖中示出了每組的平均值加上標準誤差(E1A對E1A+抗CD40p＜0.01，t-檢驗)。
圖8通過組合肽處理及體內(nèi)CD40觸發(fā)對HPV16 E6和E7轉化的細胞的治療將小鼠經(jīng)皮下注射25.000個HPV16轉化的同源細胞(TC-1)。將C57BL/6小鼠不加處理(-○-)，或者在6天后經(jīng)i.p.接受于IFA中100μgHPV16 E7肽(-□-)，于IFA中的100μg HPV16 E7肽組合抗CD40 mAbFGK-45(-■-)，或者于IFA中的對照肽組合抗CD40 mAb FGK-45(-●-)。攜帶腫瘤的小鼠的百分比針對不同處理組在(a)中加以描繪(n＝10)。HPV16肽加抗CD40mAb處理組與其它三組之間的差異是有統(tǒng)計學意義的(p＜0.01)(Log-Rank試驗)。在(b)中示出了存活動物的百分比(E7肽處理組對E7肽加抗CD40處理組p＝0.002，Log-Rank檢驗)。
圖9在沒有T細胞幫助下通過4-1BB的體內(nèi)觸發(fā)恢復了Ad5特異性CTL的引發(fā)將CD4+T細胞未耗竭(a)或耗竭(b，c，d)的B6小鼠用107TAP k.o.Ad5E1 MEC s.c.組合全身劑量的對照Ab(b)，抗CD40 Ab(c)或抗4-1BB Ab(d)進行接種。在一個單獨的實驗中，正常的B6小鼠接受與全身劑量的對照Ab(e)，抗CD40(f)或者抗4-1BB Ab(g)組合的于IFA中的20μg E1A肽。將來自免疫小鼠的脾細胞在體外再刺激6天，隨后測試對荷載E1B肽(a-d)或E1A肽(e-g)(■)，HPV16 E7肽(口)或Ad5E1MEC(●)的靶細胞的抗原特異性胞毒性。4-1BB Ab對由腫瘤細胞及肽疫苗所致的Ad5-特異性CTL的引發(fā)的刺激作用均已經(jīng)在3個獨立實驗中可再現(xiàn)地觀測到。
圖10全身性給予抗4-1BB Ab在體內(nèi)不誘導DC激活。
a為B6小鼠注射兩次100μg的對照Ab(淺灰色柱狀圖)、抗CD40Ab(暗灰色，左側)或者抗4-1BB Ab(暗灰色，右側)。3天后分離脾細胞并用抗CD11c和抗CD86染色。圖中描述的是在脾中CD11c+細胞上CD86的表達水平。b分離B6小鼠骨髓并在體外在含有GM-CSF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天。在第7天，將細胞通過加入10μg/ml Poly IC而激活或者不加處理。48小時后，分析細胞的4-1BB表達(黑線)或者將細胞用對照Ab染色(淺灰色實線)。PolyIC處理的BMDC的激活通過測定CD86的表達而證實(未示出)。
圖11通過4-1BB的共刺激是抗原依賴性的并導致抗原特異性T細胞存活力提高a為B6小鼠注射在體外用CFSE標記的5×106個Ad5E1A-特異性TCR轉基因CD8+T細胞。3天后，這些小鼠接受如圖所示E1A肽疫苗與Ab組合。肽接種包括經(jīng)皮下單一注射于IFA中20μg肽，在肽接種后連續(xù)3個工作日經(jīng)i.p.給予100μg Ab。在注射所述肽后第三天，分離脾細胞并通過FACS分析CD8+/CFSE+T細胞的存在情況。柱狀圖示出CD8+T細胞的CFSE強度。b為B6 Thy1.1小鼠注射源自B6 Thy1.2的5×106個E1A肽特異性TCR轉基因CD8+T細胞。3天后，這些小鼠接受如圖所示的E1A肽疫苗及Ab組合(劑量及時間如上)。在注射所述肽疫苗11天后，取血樣并通過FACS分析(E1A-肽特異性TCR轉基因來源的)CD8+/Thy1.2+T細胞的存在情況。
圖124-1BBL對激活的DC是正調節(jié)的分離B6小鼠骨髓并在含有GM-CSF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天。在第7天，將細胞不加處理(a)或者用10μg/ml Poly IC(b)或者2μg/ml鼠CD40L三聚體(c)激活。48小時后，將細胞用CD11c組合對照Ab(黑線)或抗4-1BBL Ab(灰色實線)染色。柱狀圖示出CD 11c+細胞群。
圖13CD28和4-1BB均有助于腫瘤特異性CTL的交叉引發(fā)將B6不加處理或者如圖所示經(jīng)皮下用107個Ad5E1轉化的腫瘤細胞組合封閉性抗4-1BBLAb、同種型對照Ab和/或CTLA4-Ig免疫。在免疫10天后分離脾細胞并在體外再刺激6天。在用1μg/ml E1B編碼的CTL表位刺激過夜之后，通過用抗CD8抗體和抗INFγ Ab雙重染色分析大批培養(yǎng)物的抗原特異性CTL的存在情況。示出的數(shù)據(jù)是三個獨立實驗的平均值。誤差桿示出S.E.M.值。
圖14通過CD28信號傳導(signalling)引起的共刺激是抗4-1BBAb處理生效的先決條件將未耗竭(a)或耗竭CD4+細胞(b-d)的B6小鼠經(jīng)皮下接種107Ad5E1MEC組合對照Ab(b)，抗4-1BB Ab(c)或者抗4-1BB Ab與CTLA4-Ig組合(d)。在接種后10天收獲脾細胞并在體外再刺激7天。測試大批培養(yǎng)物對荷載E1B肽(■)、HPV16 E7肽(口)或Ad5E1-轉化的腫瘤細胞(●)的靶細胞的E1B特異性胞毒性。(e)示出了在效應物/靶比率為60∶1時這些大批培養(yǎng)物對荷載E1B肽的靶細胞的平均裂解程度。誤差桿代表來自兩個獨立實驗的6只小鼠的S.E.M.值。
圖15CD28共刺激促進TCR觸發(fā)的T細胞上4-1BB表達的誘導將B6脾細胞在存在指定量的平板結合的抗CD3 Ab和/或抗CD28 Ab(5μg/ml)的情況下培養(yǎng)。在24小時后，分析CD8+T細胞的4-1BB表達情況。
圖164-1BB信號傳導與CD40信號傳導在體內(nèi)誘導E1A特異性CTL中具協(xié)同作用將C57BL/6小鼠經(jīng)皮下接種E1A肽及于PBS中的100μg抗CD40Ab FGK-45，抗4-1BB Ab 3H3或者這兩者組合。10天后，分離脾細胞并通過用CD8-APC和Db-E1A四聚體染色分析E1A特異性CTL的存在情況。圖中描述了脾細胞中CD8+T細胞的絕對值(上組)及這個CD8+群內(nèi)E1A特異性CTL的百分比(下組)。
圖17體內(nèi)CD40連接導致確立的腫瘤消除為小鼠注射表達Ad5E1A的腫瘤細胞。在小鼠已經(jīng)產(chǎn)生明顯腫瘤時，將小鼠不加處理(實心圓)或者經(jīng)i.v.注射CD40激活抗體(空心圓)。當腫瘤大小超過1cm3時將小鼠處死，以避免不必要的痛苦。
圖18體內(nèi)CD40激活導致腫瘤特異性CTL全身性分布為小鼠注射表達Ad5E1A的腫瘤細胞。在小鼠已經(jīng)產(chǎn)生明顯腫瘤時，將小鼠不加處理或者用抗CD40 mAb處理。注射抗CD40 10天后，將小鼠處死并對血液、脾和淋巴結進行FACS分析。在30％以上的未處理的小鼠中(n＝23只)，僅在腫瘤引流淋巴結(tumor-draininglymph node)中檢測到E1A特異性CTL(A)，而在該組的其它動物中未觀測到E1A特異性CTL(未示出)。相反，E1A特異性CTL在用抗CD40mAb處理的攜帶腫瘤的小鼠中易于檢測到(n＝29只，B)。C描述了血液中E1A特異性CD8+T細胞與總CD8+T細胞的百分比(平均值+SEM)。圖中示出了4個實驗中的一個代表性實驗。*Student′s T-檢驗p＜0.01。
圖19E1A衍生的CTL表位僅在腫瘤引流淋巴結中檢測到將4×106個CFSE標記的E1A特異性轉基因T細胞經(jīng)i.v.注射入攜帶表達AdSE1A的腫瘤的小鼠中。7天后，取脾、腫瘤引流淋巴結及非引流淋巴結，通過FACS分析E1A特異性CTL的分區(qū)。圖中示出了得自腫瘤引流淋巴結(黑色區(qū))和脾(灰色線)的結果，這是12只小鼠的代表性結果。結果與抗CD40處理的小鼠和未處理的小鼠相似。
圖20體內(nèi)CD40觸發(fā)導致Ad5E1A特異性CTL腫瘤侵潤為小鼠注射表達Ad5E1A的腫瘤細胞。當產(chǎn)生明顯腫瘤時，將小鼠不加處理或者經(jīng)靜脈內(nèi)用CD40激活抗體處理。5天后，將小鼠處死并通過FACS分析確定E1A特異性CTL的腫瘤侵潤。右上角的數(shù)代表TM陽性細胞與總CD8+細胞的百分比。
圖21局部CD40激活導致全身性抗腫瘤免疫在小鼠身體兩側注射表達Ad5E1A的腫瘤細胞。當在兩側均已經(jīng)產(chǎn)生明顯腫瘤時，對其中之一的腫瘤經(jīng)腫瘤內(nèi)給予抗CD40或者作為對照的PBS。A)在處理10天后取血樣并通過FACS分析以確定E1A特異性CTL的存在情況。結果代表E1A特異性CD8+T細胞與總CD8細胞的百分比(平均值+SEM，7只)。*student′s T-檢驗p＜0.05；**student′s T-檢驗p＞0.01，經(jīng)腫瘤內(nèi)及經(jīng)靜脈內(nèi)抗CD40處理無顯著差異。B)在處理側攜帶腫瘤的小鼠的百分比，p＜0.01。C)在未處理側攜帶腫瘤的小鼠的百分比。p＝0.05。
圖22在體內(nèi)CD40連接后，CD8+T細胞而不是CD4+T細胞對腫瘤根除是至關重要的為小鼠注射表達Ad5E1A的腫瘤細胞。在小鼠已經(jīng)產(chǎn)生明顯腫瘤時，開始處理。將小鼠不加處理、用抗CD40 mAb處理、或者用抗CD40 mAb與CD8或CD4耗竭的Ab組合處理。當腫瘤大小超過1cm3時，將小鼠處死以避免不必要的痛苦。
圖23表達Ad5E1A的腫瘤不表達CD40對用PE標記的抗CD40抗體(粗線)或同種型對照抗體(灰色區(qū))染色的細胞進行FACS分析。LPS激活的樹突細胞用作陽性對照(點劃線)。
詳細描述本發(fā)明的CD40和41-BB結合分子可以通過常規(guī)的生產(chǎn)和篩選技術產(chǎn)生。大鼠和倉鼠抗小鼠CD40單克隆抗體(Mab)在《自然》393474-77(1998)中加以描述并可以商購(Pharmingen，Inc.，CA)。在以下實驗中使用的稱為FGK45的抗小鼠CD40 Mab由Rolink.A.等在Immunity 5，319-330(1996)中加以描述。激動性抗4-1BB抗體由Hurtado等(1997)及Shuford等(1997)描述。抗人CD40 Mab以及抗人4-1BB Mab可以根據(jù)本領域熟知的技術產(chǎn)生，如G.Kohler及C.Milstein所述(Nature，1975256495-497)。Mab可以通過用在細胞上表達的或純化自人血漿或尿液的天然CD40 or4-1BB或者用在真核或原核系統(tǒng)中表達的重組CD40或4-1BB或其片段免疫嚙齒動物(例如小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠)而產(chǎn)生。其它動物可用于免疫，例如非人靈長類動物、表達人免疫球蛋白的轉基因小鼠及用人B淋巴細胞移植的重度免疫缺損(SCID)小鼠。雜交瘤可以通過常規(guī)方法產(chǎn)生，如通過融合來自免疫的動物的B淋巴細胞與骨髓瘤細胞(例如Sp2/0和NSO)而產(chǎn)生，如G.Kohler和C.Milstein，如上所述。另外，抗CD40和抗4-1BB Mab可以通過篩選來自噬菌體展示系統(tǒng)中人B淋巴細胞的重組單鏈Fv或Fab文庫而產(chǎn)生。CD40或4-1BB的Mab的特異性可以通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、Western免疫印跡或者其它免疫化學技術測試?？贵w組合CTL激活肽對CTL的激活活性可以使用以下實施例所述分析確定。
為對人進行處理，抗CD40和/或4-1BB Mab優(yōu)選用作嵌合的、Deimmunised的、人源化的或人抗體。這種抗體可以降低免疫原性并因此避免人抗小鼠抗體(HAMA)應答。優(yōu)選所述抗體是IgG4、IgG2或其它遺傳突變的IgG或IgM，其不增加抗體依賴性細胞胞毒性(S.M.Canfield and S.L.Morrison，J.Exp.Med.，19911731483-1491)及補體介導的細胞裂解(Y.Xu et al.，J.Biol.Chem.，19942693468-3474；V.L.Pulito etal.，J.Immunol.，1996；1562840-2850)。
嵌合抗體通過本領域熟知的重組方法產(chǎn)生，并具有一個動物可變區(qū)和一個人恒定區(qū)。人源化抗體比嵌合抗體具有較高程度的人肽序列。在一個人源化抗體中，只有對抗原結合和特異性相關的互補決定區(qū)(CDRs)是動物衍生的并具有一個相應于所述動物抗體的氨基酸序列，而且基本上所述分子的所有剩余部分(在一些情況中除外可變區(qū)內(nèi)的少部分框架區(qū))均是人衍生的并相應于人抗體的氨基酸序列。見L.Riechmann et al.，Nature，1988；332323-327；G.Winter，美國專利No.5,225,539；C.Queen等，美國專利No.5,530,101所述。
Deimmunised抗體是其中T和B細胞表位已經(jīng)消除的抗體，如國際專利申請PCT/GB98/01473所述。當這些抗體在體內(nèi)應用時會降低免疫原性。
人抗體可以通過一些不同方式產(chǎn)生，包括使用人免疫球蛋白表達文庫(Stratagene Corp.，La Jolla，California)以產(chǎn)生人抗體的片段(VH、VL、Fv、Fd、Fab或(Fab′)2)，并使用與生產(chǎn)嵌合抗體相似的技術用這些片段構建完整人抗體。人抗體還可以在轉基因小鼠中利用人免疫球蛋白基因組產(chǎn)生。這種小鼠可得自Abgenix，Inc.，F(xiàn)remont，California，和Medarex，Inc.，Annandale，New Jersey。
還可以產(chǎn)生單肽鏈結合分子，其中重鏈和輕鏈Fv區(qū)被連接在一起。單鏈抗體(ScFv)及其構建方法見美國專利No.4,946,778所述?；蛘撸梢酝ㄟ^相似方法構建并表達Fab(M.J.Evans etal.，J.Immunol.Meth.，1995；184123-138)。完全及部分人抗體均比完整鼠Mab的免疫原性低，而且片段及單鏈抗體的免疫原性也較低。所有這些類型的抗體因此均不太可能激發(fā)免疫或變態(tài)反應。因此，它們比完全動物抗體更適于體內(nèi)給予人體，特別是當需要重復或長期給予時。另外，較小大小的抗體片段可以有助于改善組織生物利用度，這一點對于在急性疾病適應癥例如腫瘤治療中更好的劑量積累是關鍵的。
基于抗CD40和/或抗4-1BB mAb的可變區(qū)或已知CTL激活肽的分子結構，可以使用分子建模及合理的分子設計以產(chǎn)生并篩選模擬所述抗體或肽的結合區(qū)的分子結構并激活CTL的分子。這些小分子可以是肽、肽模擬物、寡核苷酸或其它有機化合物。所述模擬分子可用于治療癌癥及感染?；蛘?，可以使用本領域通用的大規(guī)模篩選程序從化合物的文庫中分離合適的分子。
因此本發(fā)明的一個方面涉及一種組合物，其包含激動性抗4-1BB抗體或其刺激4-1BB受體的片段。
優(yōu)選地，所述組合物進一步包含一種激動性抗CD40抗體或其刺激CD40受體的片段。
本發(fā)明另一個方面涉及一種組合物，其包含(a)激動性抗4-1BB抗體，或其刺激4-1BB受體的片段，或(b)激動性抗CD40抗體，或其刺激CD40受體的片段，(c)或這兩者，所述組合物進一步包含選自具有編碼I類MHC或II類MHC限制的T細胞表位的蛋白質、多肽、肽、病毒或核酸序列的一或多種分子。
選擇及產(chǎn)生合適的I類MHC和/或II類MHC限制性T細胞表位的方法例如WO01/41440和WO02/070006所述。
優(yōu)選地，合適的I類MHC和/或II類MHC限制性T細胞表位是肽。優(yōu)選地，所述肽的長度為至少8個氨基酸，更優(yōu)選至少22個氨基酸。優(yōu)選的肽的長度為8-10個氨基酸，更優(yōu)選為22-45個氨基酸。
本發(fā)明的另一個方面涉及(a)激動性抗4-1BB抗體，或其刺激4-1BB受體的片段，或(b)激動性抗CD40抗體，或其刺激CD40受體的片段，(c)或者這兩者在制備誘導針對一抗原的全身性T細胞免疫(systemic T cell immunity)的藥物中的應用。所述藥物可進一步包含選自具有或編碼MHC I類或MHC II類限制性T細胞表位的蛋白質、多肽、肽、病毒或核酸序列的一或多種分子。所述抗原優(yōu)選是MHC I類或MHC II類限制性T細胞表位。所述抗原優(yōu)選是腫瘤或腫瘤細胞的抗原，更優(yōu)選所述抗原是腫瘤特異性抗原?；蛘?，所述抗原可以是感染因子抗原。一優(yōu)選的抗原是HPV抗原，更優(yōu)選所述HPV抗原是具有序列RAHYNIVTF(SEQ ID NO3)的一種肽。本發(fā)明的再一方面涉及激動性抗CD40抗體，或其刺激CD40受體的片段在制備通過誘導全身性T細胞免疫而治療腫瘤或感染因子的藥物中的應用，其中所述治療不包括用腫瘤或感染因子的抗原免疫(例如接種)。
本發(fā)明的分子的劑量可易于通過從以下所述的體外測試和分析、或者從動物實驗或從人體臨床實驗外推而確定。當本發(fā)明的分子是抗體或蛋白質時，優(yōu)選通過注射給藥，當然某些小分子也可以適于口服給藥。證實本發(fā)明功效的分析和測試如下所述。
實施例實施例1通過CD40的信號傳導在CTL引發(fā)中可以代替CD4+輔助T細胞使用一種完全建立的模型系統(tǒng)探查T細胞幫助體內(nèi)CD8+CTL應答的初級激活的機制。用表達人腺病毒5型早期區(qū)1的異源BALB/c(H-2d)小鼠胚胎細胞(MEC)(Ad5EI-BALB/c MEC)免疫接種的C57BL/6(具有主要組織相容性復合物(MHC)H-2b)小鼠產(chǎn)生針對腺病毒EIB蛋白(EIB192-200)的H-2Db限制性表位的強CTL應答(圖1a)。由于由Ad5EI-BALC/c MEC表達的異源H-2dMHC分子不能引發(fā)H-2b限制性宿主CTL，因此E1B特異性CTL的產(chǎn)生必須需要交叉引發(fā)，即通過宿主APC進行抗原的攝入和H-2b限制性再呈遞。EIB特異性CTL的交叉引發(fā)是嚴格的輔助細胞依賴性的(圖1b)，因為耗竭CD4+T-輔助(Th)細胞的小鼠在免疫接種之前不再引發(fā)E1B特異性CTL應答。
為研究通過CD40的信號傳導在CTL引發(fā)中是否能代替CD4+輔助T細胞，將小鼠在用Ad5E1BALB/c MEC免疫接種之前在體內(nèi)耗竭CD4+T細胞。在免疫接種一天后，小鼠接受單次注射激活的抗體抗小鼠CD40 mAb FGK45，或者同種型匹配的對照抗體。為CD4耗竭的免疫的小鼠給予FGK45導致有效恢復E1B特異性CTL應答(圖2a)，而用對照抗體處理則無此作用(圖2b)。E1B特異性CTL的引發(fā)在僅用FGK45處理的天然小鼠中檢測不到(未示出)。為確定FGK45的作用是通過用抗CD4抗體處理而未耗竭的剩余CD4+細胞而介導的可能性，將缺乏成熟的功能性CD4+周圍T細胞的B6I-Ab剔除小鼠用Ad5EI-BALB/c MEC免疫接種。這些小鼠中對免疫接種的應答反映出在CD4耗竭的小鼠中所見應答，即E1B特異性CTL僅在接受CD40激活抗體的小鼠中可檢測到(圖2c)，在接受對照抗體的那些小鼠中不可檢測到(圖2d)。
還研究了在CD4耗竭的小鼠中引發(fā)CTL所需的抗CD40抗體在用Ad5EI-BALB/c MEC免疫接種后是否可以由一種強力促炎細胞因子誘導劑細菌脂多糖(LPS)(50μg靜脈內(nèi)給藥)代替，或者通過給予IL-2(于不完全Freund佐劑中1×105單位，皮下給藥)而代替。而用FGK45處理的CD4耗竭的小鼠呈現(xiàn)強E1B特異性CTL活性，LPS或IL-2處理均未產(chǎn)生可檢測到的CTL引發(fā)(未示出)。
B細胞上CD40的連接正調節(jié)其共刺激活性，提示這些細胞在通過用CD40激活抗體處理而恢復CTL引發(fā)的作用。為確定這個問題，將缺乏成熟B細胞的B6 MT小鼠用異源Ad5E1-BALB/c MEC免疫接種。E1B特異性CTL的交叉引發(fā)不需要成熟B細胞(圖3a)。然而，當CD4+細胞耗竭時，B細胞缺陷的小鼠不產(chǎn)生E1B-特異性CTL應答(圖3b)。通過CD40與FGK45單克隆抗體的激活完全恢復CD4耗竭的MT小鼠引發(fā)E1B特異性CTL的能力(圖3c)。因此在這個模型系統(tǒng)中交叉引發(fā)不需要B細胞作為APC或附加細胞，在沒有輔助T細胞的情況中CD40介導的交叉引發(fā)的恢復也不需要其。這些結果表明骨髓衍生的APC通過CD40的激活在交叉引發(fā)E1B特異性CTL中可以不需要CD4+T輔助細胞。
實施例2在正常小鼠中封閉CD4+輔助T細胞通過CD40L-CD40途徑與APC相互作用的能力防止抗原特異性CTL應答如果CD40L-CD40相互作用代表通過CD4+輔助T細胞以幫助CTL所利用的生理學途徑，則封閉CD4+T細胞通過CD40L-CD40相互作用與APC的相互作用的能力期望在正常小鼠中能消除引發(fā)E1B特異性CTL應答。將B6小鼠用Ad5E1-BALB/c MEC免疫，然后用CD40L封閉抗體MR1或對照抗體處理。與在接受對照抗體的小鼠中所見的有效CTL引發(fā)(圖4b)相比，對CD40L的封閉顯著降低E1B-特異性CTL應答(圖4a)。由對CD40L的封閉誘導的引發(fā)缺陷在通過FGK45導致的CD40信號傳導之后完全恢復(圖4c)。因此，對CD40L的封閉誘導的CTL引發(fā)缺陷在于TH細胞不能傳遞而不是不能接受CD40L介導的信號。
實施例3在給予肽之后的E1A特異性CTL無應答性使用一種先前描述的模型系統(tǒng)(Toes等，J.Immunol.1563911(1996))。已經(jīng)示出在IFA中經(jīng)皮下接種Ad5E1A衍生的CTL表位SGPSNTPPEI(SEQ ID NO2)可以控制小鼠表達E1A的腫瘤生長。這表明E1A/IFA疫苗誘導抑制而不是誘導E1A特異性CTL免疫。另外，將E1A/IFA疫苗給予表達E1A特異性CTL克隆的TCRα和β鏈的T細胞受體(TCR)轉基因小鼠，顯著抑制腫瘤特異性CTL介導的免疫。這些實驗檢驗了肽給予單克隆CTL群體的作用。為確定皮下接種E1A肽在多克隆CTL水平是否也誘導E1A特異性CTL耐受，為野生型(wt)C57BL/6小鼠注射E1A肽(圖5a和5b)或者對照肽(圖5c和5d)。一天后，將小鼠用在其表面表達高水平E1A肽的一種同源細胞系加強(圖5b和5d)。將該細胞系注射入用對照肽引發(fā)的小鼠中易于誘導E1A特異性免疫(圖5d)。然而，小鼠引發(fā)E1A特異性CTL應答的能力在注射E1A/IFA疫苗之后消除(圖5b)。這些數(shù)據(jù)表明注射E1A肽不僅在TCR轉基因小鼠中而且在表達多克隆E1A肽特異性T細胞所有成分的小鼠中也產(chǎn)生E1A特異性耐受(圖7c和7d)。
由于皮下注射E1A/IFA疫苗導致全身性CTL耐受，我們研究了E1A肽是否全身性分布并在周邊呈遞為前體CTL。因此，為小鼠皮下注射于IFA中乳化的E1A肽或人乳頭瘤病毒(HPV)16E7衍生的對照肽。16小時后從這些小鼠中分離脾細胞并用作體外E1A特異性CTL克隆的刺激細胞。來自經(jīng)皮下注射E1A肽的小鼠的脾細胞誘導特異性增殖，而來自用E7肽注射的小鼠的脾細胞則不能如此(圖6)。另外，一對照CTL克隆在衍生自E1A注射的小鼠的脾細胞上不增殖(數(shù)據(jù)未示出)。因此，這些數(shù)據(jù)表明經(jīng)皮下注射于IFA中的E1A肽通過脾細胞而在周邊全身性呈遞。
參考上述E1A肽疫苗的耐受作用，有一個問題是體內(nèi)CD40觸發(fā)是否足以防止CTL的周圍耐受并恢復CTL引發(fā)。因此研究了注射耐受肽及體內(nèi)CD40觸發(fā)是否可防止周圍CTL耐受的誘導而引起腫瘤特異性CTL免疫。
在實施例1和2中，示出體內(nèi)CD40觸發(fā)在輔助細胞依賴性CTL應答的引發(fā)中可代替CD4+T輔助細胞的需要。由于CD4+T細胞介導的輔助活性參與阻止周圍CTL耐受誘導，因此本發(fā)明人研究了體內(nèi)CD40觸發(fā)是否足以阻止周圍E1A特異性CTL耐受這一問題。為此，將小鼠注射E1A/IFA疫苗及激活抗CD40 mAb FGK-45。接受這種組合的小鼠引發(fā)強E1A特異性CTL應答(圖7b和7e)，而接受E1A/IFA疫苗的小鼠(圖7e)或單獨mAb(未示出)的小鼠則不。E1A/IFA疫苗與抗CD40 mAb的組合在CD40缺陷的中不能激發(fā)CTL(圖7c和)。另外，聯(lián)合注射E1A/IFA疫苗及同種型匹配的對照mAb(圖6a)或者IL-2不能將E1A/IFA疫苗誘導的CTL耐受轉變?yōu)镃TL引發(fā)(未示出)。圖7e示出了對僅是E1A肽或者E1A肽加上抗CD40接種的動物中E1A表位應答的范圍和變化。因此，全身性CD40激活可以將肽誘導的周圍CTL耐受逆轉為肽和腫瘤特異性CTL介導的免疫。
E1A特異性免疫的誘導與接種的小鼠脾中存在CD8+T細胞密切相關，所述脾細胞用含有E1A肽的PE綴合的H-2-Db四聚體(Db/E1A)染色。在接種后10天內(nèi)，在E1A肽和抗CD40 mAb注射的小鼠中可以通過流式細胞計量術檢測到用Db/E1A四聚體染色的CD8+T細胞，但在僅用E1A肽注射的小鼠中檢測不到(未示出)。在用E1A肽注射的小鼠中，用Db/E1A四聚體染色的CD8+細胞的百分比接近3％。在用誘導強力E1A特異性免疫的完整腺病毒接種的小鼠中，檢測到相當量的Db/E1A四聚體反應性CD8+脾細胞。這些結果表明接受E1A/IFA疫苗及抗CD40 mAb的小鼠中對E1A特異性CD8+T細胞的擴增是顯著的并且與在病毒接種的動物中發(fā)現(xiàn)的結果相同。
實施例4CD40觸發(fā)顯著增強基于肽的抗癌疫苗的效力盡管上述發(fā)現(xiàn)示出通過CD40觸發(fā)所提供的幫助足以在給予耐受原性肽疫苗之后防止CTL耐受化，但未解決正常誘導保護性免疫而非耐受性的抗癌疫苗的功效是否可以通過CD40激活而增強這一問題。檢測了體內(nèi)CD40觸發(fā)是否有益于用HPV16 E7衍生的肽接種的結果。用這種肽接種誘導針對HPV16轉化的腫瘤細胞攻擊的保護性CTL介導的免疫。另外，當這種肽加樣于體外激活的DC上時可用于治療方案中，提示當被激活的DC呈遞時抗腫瘤應答程度增強。
與僅用E7肽處理的小鼠相比，接受E7肽及CD40觸發(fā)的小鼠產(chǎn)生更強的CTL應答(數(shù)據(jù)未示出)，表明CD40觸發(fā)也增強HPV16 E7肽疫苗的效力并證實了用上述E1A肽得出的發(fā)現(xiàn)。另外，經(jīng)皮下注射CD40陰性轉化的腫瘤細胞及單獨的HPV16 E7肽而處理6天的小鼠(空心方塊)能夠減慢腫瘤生長，但是最終大多數(shù)動物還是死于腫瘤(圖8)。然而當HPV 16 E7肽與抗CD40 mAb組合接種時，腫瘤生長明顯降低而且10只小鼠中有7只小鼠排斥腫瘤，而用對照肽和抗CD40 mAb注射的動物不能控制腫瘤的生長。這些結果示出當免疫接種與體內(nèi)CD40觸發(fā)組合時，接種方案的效果可以顯著增強。這些數(shù)據(jù)提供了開發(fā)用于癌癥病人的非常強的新抗腫瘤疫苗的基礎。
實施例5通過4-1BB體內(nèi)觸發(fā)可以殺死原初CTL通過給予激動性抗CD40抗體(Ab)進行的APC的體內(nèi)CD40觸發(fā)在交叉引發(fā)Ad5特異性CTL中可以代替對CD4+T輔助(Th)細胞活性的需要。將Ad5E1轉化的小鼠胚胎細胞(Ad5MEC)與抗CD40或抗4-1BB Ab組合注射入同源的CD4+Th細胞耗竭的C57BL/6(B6)小鼠中。這些Ad5E1MEC衍生自TAP-缺陷的小鼠，并因此在其自身MHC中不能呈遞Ad5E1編碼的CTL表位(20)。
因此，在這個方案中Ad5E1特異性CTL的引發(fā)依賴于宿主APC對腫瘤抗原的交叉呈遞。Ad5E1B特異性CTL的誘導是CD4+Th依賴性的，因為CD4+T細胞耗竭的小鼠不能引發(fā)E1B特異性CTL應答(圖9b)。在這些CD4耗竭的動物體內(nèi)全身性給予激動性抗CD40Ab恢復了E1B特異性交叉引發(fā)(圖9c)。令人感興趣地，全身性給予激動性抗4-1BB Ab在沒有CD4+T細胞的幫助下產(chǎn)生同樣有效的E1B特異性CTL引發(fā)(圖9d)。誘導抗腫瘤的抗原特異性CTL免疫的一種不同的方法是通過用在佐劑(IFA)中的最小肽表位接種而進行。令人矚目地，在表位衍生自Ad5E1A和E1B時，這種肽基疫苗誘導CTL耐受而非引發(fā)，除非共給予激動性抗CD40 Ab(4)。因此我們研究了在這個方案中通過4-1BB的一種觸發(fā)劑是否能通過為B6小鼠注射E1A肽疫苗及抗4-1BB Ab，抗CD40 Ab或對照抗體而使得CTL引發(fā)。事實上，不僅共注射抗CD40而且共注射抗4-1BB均將耐受原性肽疫苗轉變?yōu)槊庖咴耘浞?圖1E-G)。當通過用H-2Dd/E1A肽四聚體染色脾細胞而監(jiān)測E1A特異性CTL免疫性時獲得相似結果(未示出)。因此4-1BB的體內(nèi)觸發(fā)可防止肽特異性耐受的誘導，取而代之是導致強E1A特異性CTL應答的引發(fā)?？偠灾@些數(shù)據(jù)表明4-1BB信號有效提供了CTL可以殺死并因此可代替對通過Th細胞或給予激動性抗CD40 Ab進行CD40觸發(fā)的需要。
實施例6抗4-1BB Ab不誘導DC激活CD40和4-1BB的表達模式的現(xiàn)有知識表明由體內(nèi)給予抗CD40Ab提供的信號輸送至APC，而給予抗4-1BB Ab提供的信號直接輸送至CTL。為排除是抗4-1BB抗體而不是直接刺激抗原特異性T細胞以間接方式通過激活抗原呈遞DC而介導其對CYL引發(fā)的作用(圖9)的可能性，我們研究了注射抗4-1BB抗體是否在體內(nèi)激活DC。為B6小鼠注射抗4-1BB，抗CD40或對照抗體及CD86(B7.2)，分析在分離自這些小鼠的脾的CD11c+DC上的表達。正如所期望的，CD40的體內(nèi)觸發(fā)導致CD86的表達增強，表明DC的體內(nèi)激活。相反，在體內(nèi)4-1BB觸發(fā)或者給予對照大鼠抗體之后，DC上的CD86的表達不提高(圖10a)?？?-1BB Ab不能應答DC激活與不成熟的及成熟的DC均不表達可檢測水平的4-1BB這一事實相關，提示DC不能接受4-1BB觸發(fā)(圖10b)。因此，抗4-1BB抗體未表現(xiàn)出影響DC種群，但是通過直接刺激CD8+T細胞而介導其對CTL觸發(fā)的刺激作用。
實施例7通過4-1BB的共刺激導致抗原刺激的CTL的存活提高為研究激動性抗4-1BB Ab以何種方式允許T輔助細胞非依賴性Ad5特異性CTL引發(fā)，我們使用來自Ad5E1A肽特異性T細胞受體(TCR)轉基因小鼠的過繼轉移的T細胞群(21)。以兩種不同的方式進行這些T細胞的體內(nèi)跟蹤。首先，將TCR轉基因T細胞用染料CFSE進行熒光標記并轉移進正常B6小鼠中，之后將這些小鼠用在IFA中的Ad5E1A肽接種并進行或不進行抗4-1BB Ab處理。令人感興趣地，所得數(shù)據(jù)表明TCR轉基因T細胞的增殖在已經(jīng)接受E1A肽及進行或不進行抗4-1BB Ab處理的小鼠中同樣觸發(fā)(圖11a)。因此抗4-1BB Ab不能通過提高抗原特異性T細胞的初始激活或增殖能力而使得CTL引發(fā)。
在第二種方案中，我們將來自B6Thy1.2的Ad5E1A特異性TCR轉基因T細胞轉移進B6Thy 1.1同類系小鼠中。這些小鼠用在IFA中的Ad5E1A肽接種并進行或不進行抗4-1BB Ab處理。圖3b示出在接種11天后，在用E1A肽接種及進行抗4-1BB Ab處理的小鼠中觀測到來自TCR轉基因小鼠的CD8+T細胞的大量擴增，但在僅接受E1A肽或者抗4-1BB Ab處理的小鼠中未觀測到此結果。因此，E1A特異性CTL的積累需要存在4-1BB共刺激信號。另外，通過4-1BB對CD8+CTL免疫的刺激依賴于存在抗原特異性觸發(fā)劑?？偠灾?，圖3中的數(shù)據(jù)表明4-1BB觸發(fā)對初始CTL激活是非必需的，但促進抗原刺激的CTL的存活，從而使得這些CTL擴增。
實施例8CTL引發(fā)中包含4-1BBL/4-1BB相互作用因為體內(nèi)4-1BB觸發(fā)在沒有CD40依賴性DC激活信號時允許CTL引發(fā)(圖9)，這提示非激活的DC對抗原的呈遞及激活抗4-1BBAb足以有效進行CTL引發(fā)。需要共給予抗4-1BB Ab還表明非激活的DC顯然不能通過4-1BB刺激CTL。因此，我們分析了這種受體的天然配體4-1BBL在不成熟的和成熟的DC上的表達。非激活的DC表達低水平的4-1BBL(圖12a)，而這個分子的表達在存在CD40L-三聚體或者Poly I:C時在激活之上而顯著提高(分別見圖12b和c)。4-1BBL的這種誘導在體內(nèi)DC的CD40觸發(fā)之上觀測到。4-1BBL表達提高與激活的DC上CD86水平提高相似。這提示這兩種共刺激信號有助于成熟DC誘導CTL免疫的能力，非成熟DC則相反。
我們在正常的CD4+Th細胞proficient B6小鼠中進行腫瘤細胞免疫實驗，其中CTL交叉引發(fā)需要的Th-依賴性DC成熟信號是完整的。CD28和4-1BB信號的封閉通過分別給予封閉性抗4-1BBL Ab或CTLA4-Ig而進行。將B6小鼠用Ad5E1MEC及全身性應用劑量的抗4-1BBL Ab和/或CTLA4-Ig免疫。令人感興趣地，抗4-1BBL的體內(nèi)封閉導致腫瘤細胞疫苗誘導的抗原特異性CTL數(shù)明顯減少(圖13)。CD28共刺激的封閉完全抑制CTL誘導并因此額外的4-1BBL封閉及CTLA4-Ig無額外作用。這些數(shù)據(jù)表明4-1BBL/4-1BB相互作用對抗原特異性CTL的交叉引發(fā)是重要的，因為這些分子之間的相互作用的封閉明顯減少持續(xù)的腫瘤特異性CTL數(shù)。然而在沒有正確激活的DC提供的通過CD28的共刺激信號時，由4-1BBL提供的信號顯然不能使得CTL引發(fā)并因此抗腫瘤CTL免疫的誘導被完全消除。
實施例9依賴于CD28共刺激的4-1BB信號體內(nèi)封閉實驗提示超過4-1BB信號的CD28共刺激的優(yōu)勢。因此，我們研究了在沒有CD28共刺激時給予抗4-1BB Ab是否仍提供具有殺死性的CTL。B6小鼠被耗竭CD4+T細胞并用Ad5E1MEC免疫及給予抗4-1BB Ab和/或CTLA4-Ig。接受抗4-1BB Ab的小鼠激發(fā)強E1B特異性CTL應答，但另外接受CTLA4-Ig的小鼠不能這樣(圖14)。這些數(shù)據(jù)表明4-1BB觸發(fā)對CTL免疫的誘導的陽性作用依賴于存在完整的CD28共刺激信號。另外，這些數(shù)據(jù)提示由非激活的DC表達的CD80/CD86的基本水平通過CD28提供足夠的共刺激以允許通過4-1BB途徑的額外的共刺激。
體外研究表明在原初T細胞上的4-1BB表達是不存在的，而且通過抗CD3 Ab的交聯(lián)引起的TCR觸發(fā)導致4-1BB表面表達快速增加(8)。由于我們的數(shù)據(jù)支持通過CD28共刺激是4-1BB信號傳導的先決條件這一結論，我們研究了CD28觸發(fā)是否有助于正調節(jié)原初T細胞上的4-1BB。因此，將原初脾細胞在體外用板結合的抗CD3 Ab刺激并在24小時后分析4-1BB表達(圖16)。很明顯通過TCR(高濃度的抗CD3 Ab)引起的強信號在24小時內(nèi)足以誘導4-1BB表達。然而，當用較低濃度的抗CD3刺激T細胞時，其正調節(jié)4-1BB的能力最大程度喪失(圖16)。這些較低濃度的抗CD3 Ab提供了一種微弱TCR觸發(fā)劑，其很可能與腫瘤細胞疫苗提供的體內(nèi)信號的性質相似。重要的是在更生理的條件下，通過CD28受體的共刺激恢復T細胞表達高水平4-1BB的能力。這些發(fā)現(xiàn)與體內(nèi)CD28途徑的封閉消除通過4-1BB的共刺激的事實一致(圖14和15)。另外，這些事實強化了這樣的觀念，即抗原刺激的T細胞的CD28共刺激對原初T細胞上正調節(jié)是一重要信號，從而使這些細胞對4-1BB觸發(fā)敏感。
實施例10通過給予協(xié)同的抗CD40與抗4-1BB Ab經(jīng)腫瘤細胞或肽基疫苗使得CTL引發(fā)因為抗CD40 Ab和抗4-1BB Ab通過E1A肽疫苗以相似方式使得CTL引發(fā)，而4-1BB觸發(fā)依賴于CD28共刺激，我們研究了這兩種Ab的組合是否導致更強的CTL免疫誘導。我們的數(shù)據(jù)表明E1A肽疫苗與這兩種Ab的組合對CTL應答的誘導確實具有強協(xié)同作用。在接受這兩種Ab的小鼠中，與僅接受一種Ab的小鼠相比四聚體陽性的CD8+細胞的絕對以及相對數(shù)增加至少5-10倍(圖17)。
實施例11通過為攜帶腫瘤的個體給予激動性抗CD40 Ab誘導治療性抗腫瘤免疫因為通過注射抗CD40 Ab引起的APC的體內(nèi)激活使得在腫瘤細胞免疫的CD4+T細胞耗竭的小鼠中腫瘤特異性CTL交叉引發(fā)，這個程序還促進攜帶腫瘤的動物中抗腫瘤免疫的誘導。在攜帶腫瘤的小鼠中抗腫瘤CTL應答的開始最可能受到?jīng)]有正確激活的APC的呈遞抗原的限制。這可以歸因于在腫瘤部位無足夠的APC募集和/或荷載腫瘤抗原的APC不能激活及再分布于引流淋巴結，該部位發(fā)生并原初T細胞引發(fā)。特別是沒有炎癥危險信號、沒有腫瘤特異性T細胞幫助及腫瘤分泌免疫調節(jié)細胞因子導致APC不能交叉引發(fā)抗腫瘤CTL應答(22)。
參考這些事項，我們用抗CD40 Ab注射攜帶(皮下)Ad5轉化的細胞的腫瘤的免疫感受態(tài)B6小鼠。然而，在對照動物中腫瘤進行性生長，抗CD40處理的小鼠能排斥其腫瘤(圖18)。令人感興趣地，在對照動物中我們在引流淋巴結中僅檢測到少量E1A特異性CTL，而抗CD40處理的小鼠在輸出和co-lateral淋巴結中以及在周圍血中均明顯呈現(xiàn)大量的E1A特異性CTL(圖19a-c)。
重要的是抗原呈遞的定位與在抗CD40處理的及對照的小鼠中是相似的，在這兩種情況中僅在腫瘤引流淋巴結中檢測到，而在淋巴結中未檢測到(圖20)。如上所述，在對照動物中由于沒有炎癥危險信號，APC顯然不能交叉引發(fā)抗腫瘤CTL應答。相反，在抗CD40 Ab處理的小鼠中，CD40信號使這些APC能有效引發(fā)Ad5E1A特異性CTL免疫，結果這些CTL能離開引流淋巴結并進入其它周圍淋巴器官以及腫瘤中。后者通過A5E1A特異性CTL主要在抗CD40 Ab處理的小鼠的腫瘤中檢測到這一事實而證實(圖21)。抗CD40處理導致有效的全身性CTL免疫這一觀點由這樣的事實進一步證實，即將抗CD40 Ab經(jīng)腫瘤內(nèi)注射進一側的腫瘤內(nèi)，通過CD40的局部體內(nèi)觸發(fā)，也引起另一側未處理的腫瘤的排斥(圖22a-c)。這個實驗也表明在全身及局部給予抗CD40 Ab之后可以實現(xiàn)有效的抗腫瘤治療。
兩個另外的實驗進一步提供了對抗CD40 Ab注射導致腫瘤排斥的機制的認識。首先，這些CTL在腫瘤根除中的作用通過這樣的事實證實，即用抗CD40 Ab進行的抗腫瘤治療在耗竭其CD8+T細胞的小鼠中無效，而在耗竭其CD4+T細胞的小鼠中仍有效(圖23)。其次，應注意其它人員發(fā)現(xiàn)抗CD40 Ab抑制表達CD40的腫瘤生長，通過直接誘導腫瘤細胞編程性死亡而進行(23-25)。重要的是我們的腫瘤細胞沒有缺乏CD40表達(圖24)。因此，抗CD40 Ab的治療作用通過誘導殺腫瘤的CTL應答而起作用。
實施例12為攜帶腫瘤的個體給予抗CD40和抗4-1BB Ab的協(xié)同組合物對治療性抗腫瘤免疫的誘導我們的數(shù)據(jù)示出給予激動性抗CD40 Ab除了使CTL針對腫瘤細胞和肽基疫苗而引發(fā)之外，還可以使免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對現(xiàn)有腫瘤的治療性CTL免疫。因為抗CD40和4-1BB Ab相似地能刺激CTL免疫并在刺激肽疫苗誘導的應答中協(xié)同起作用(見上述)，我們期望一種非常強的治療能力，這種強Ab組合誘導攜帶腫瘤的小鼠中CTL免疫。
前文中的描述、術語、表達式及實施例僅是例證而無限制之意。本發(fā)明包括前述實施方案的已知和未知的所有等價物。本發(fā)明僅通過以下權利要求加以限制，而非由該文獻的任何其它部分或任何其它來源的文獻中的任何闡述限制。
參考文獻1.Schoenberger，S. P.，R. E.Toes，E.I.van der Voort，R.Offringa，C.J.Melief.1998.T-cell help for cytotoxic T lymphocytes is mediated byCD40-CD40L interactions.Nature.393480-3.
2.Ridge，J. P.，F(xiàn). Di Rosa，P.Matzinger.1998.A conditioned dendriticcell can be a temporal bridge between a CD4+ T-helper and a T-killer cell.Nature.393474-8.
3.Bennett，S.R.，F(xiàn).R.Carbone，F(xiàn).Karamalis，R.A.Flavell，J.F.Miller，W.R.Heath.1998.Help for cytotoxic-T-cell responses ismediated by CD40 signalling. Nature. 393478-80.
4.Diehl，L.，A.T.den Boer，S.P.Schoenberger，E.I.van der Voort，T.N.Schumacher，C.J.Melief，R.Offringa，R.E.Toes.1999.CD40activation in vivo overcomes peptide-induced peripheral cytotoxicT-lymphocyte tolerance and augments anti-tumor vaccine efficacy.NatMed.5774-9.
5.Banchereau，J.，F(xiàn).Briere，C.Caux，J.Davoust，S. Lebecque，Y.J.Liu，B.Pulendran，K.Palucka.2000.Immunobiology of dendritic cells.Annu Rev Immunol.18767-811.
6.Lenschow，D.J.，T.L.Walunas，J.A.Bluestone.1996.CD28/B7system of T cell costimulation.Annu Rev Immunol.14233-587.Chambers，C.A.，J.P.Allison.1999.Costimulatory regulation ofT cell function.Curr Opin Cell Biol.11203-10.
8.Hurtado，J.C.，Y.J.Kim，B.S.Kwon.1997.Signals through4-1BB are costimulatory to previously activated splenic T cells andinhibit activation-induced cell death.J Immunol.1582600-9.
9.Takahashi，C.，R.S.Mittler，A.T.Vella.1999.Cutting edge4-1BB is a bona fide CD8 T cell survival signal.J Immunol.1625037-40.
10.Goodwin，R.G.，W.S.Din，T.Davis-Smith，D.M.Anderson，S.D.Gimpel，T.A.Sato，C.R.Maliszewski，C.I.Brannan，N.G.CopE1And，N.A.Jenkins，et al.1993.Molecular cloning of a ligand for the inducibleT cell gene4-1BBa member of an emerging family of cytokines withhomology to tumor necrosis factor.Eur J Immunol.232631-41.
11.Alderson，M.R.，C.A.Smith，T.W.Tough，T.Davis-Smith，R.J.Armitage，B.Falk，E.Roux，E.Baker，G.R.Sutherland，W.S.Din.1994.Molecular and biological characterization of human4-1BB and its ligand.Eur J Immunol.242219-27.
12.DeBenedette，M.A.，A.Shahinian，T.W.Mak，T.H.Watts.1997.Costimulation of CD28-T lymphocytes by4-1BB ligand.J Immunol.158551-9.
13.Shuford，W.W.，K.Klussman，D.D.Tritchler，D.T.Loo，J.Chalupny，A.W.Siadak，T.J.Brown，J.Emswiler，H.Raecho，C.P.Larsen，T.C.Pearson，J.A.Ledbetter，A.Aruffo，R.S.Mittler.1997.4-1BB costimulatory signals preferentially induce CD8+ T cellproliferation and lead to the amplification in vivo of cytotoxic T cellresponses. J Exp Med.18647-55.
14.DeBenedette，M.A.，N.R.Chu，K.E.Pollok，J.Hurtado，W.F.Wade，B.S.Kwon，T.H.Watts.1995.Role of4-1BB ligand incostimulation of T lymphocyte growth and its upregulation on M12Blymphomas by cAMP.J Exp Med.181985-92.
15.Hurtado，J.C.，S.H.Kim，K.E.Pollok，Z.H.Lee，B.S.Kwon.1995.Potential role of 4-1BB in T cell activation.Comparison with thecostimulatory molecule CD28.J Immunol.1553360-7.
16.DeBenedette，M.A.，T.Wen，M.F.Bachmann，P.S.Ohashi，B.H.Barber，K.L.Stocking，J.J.Peschon，T.H.Watts.1999.Analysis of4-1BB ligand(4-1BBL)-deficient mice and of mice lacking both 4-1BBLand CD28 reveals a role for 4-1BBL in skin allograft rejection and in thecytotoxic T cell response to influenza virus.J Immunol.1634833-41.
17.Tan，J.T.，J.K.Whitmire，R.Ahmed，T.C.Pearson，C.P.Larsen.1999.4-1BB ligand，a member the TNF family，is important for thegeneration of antiviral CD8 T cell responses.J Immunol.1634859-68.
18.Tan，J.T.，J.K.Whitmire，K.Murali-Krishna，R.Ahmed，J.D.Altman，R.S.Mittler，A.Sette，T.C.Pearson，C.P.Larsen.2000，4-1BBcostimulation is required for protective anti-viral immunity after peptidevaccination.J Immunol.1642320-5.
19.Melero，I.，W.W.Shuford，S.A.Newby，A.Aruffo，J.A.Ledbetter，K.E.Hellstrom，R.S.Mittler，L.Chen.1997.Monoclonalantibodies against the 4-1BB T-cell activation molecule eradicateestablished tumors.Nat Med.3682-5.
20.Schoenberger，S.P.，E.I.van der Voort，G.M.Krietemeijer，R.Offringa，C.J.Melief，R.E.Toes.1998.Cross-priming of CTL responsesin vivo does not require antigenic peptides in the endoplasmic reticulumof immunizing cells.J Immunol.1613808-12.
21.Toes，R.E.，R.Offringa，R.J.Blom，C.J.Melief，W.M.Kast.1996.Peptide vaccination can lead to enhanced tumor growth throughspecific T-cell tolerance induction.Proc Natl Acad Sci U S A.937855-60.
22.Melief，C.J.，R.E.Toes，J.P.Medema，S.H.van der Burg，F(xiàn).Ossendorp，R.O ffringa.2000.Strategies for immunotherapy of cancer.Adv Immunol.75235-82.
23.Hess，S.，H.Engelmann.1996.A novel function of CD40induction of cell death in transformed cells.J Exp Med.183159-67.
24.Hirano，A.，D.L.Longo，D.D.Taub，D.K.Ferris，L.S.Young，A.G.Eliopoulos，A.Agathanggelou，N.Cullen，J.Macartney，W.C.Fanslow，W.J.Murphy.1999.Inhibition of human breast carcinomagrowth by a soluble recombinant human CD40 ligand.Blood.932999-3007.
25.Young，L.S.，A.G.Eliopoulos，N.J.Gallagher，C.W.Dawson.1998.CD40 and epithelial cellsacross the great divide.Immunol Today.19502-6.
權利要求
1.一種組合物，其包含刺激4-1BB受體的一種激動性抗4-1BB抗體或其片段。
2.權利要求1的組合物，其中所述組合物進一步包含刺激CD40受體的激動性抗CD40抗體或其片段。
3.權利要求1或2的組合物，其中所述組合物進一步包含選自具有或編碼I類MHC或II類MHC限制性T細胞表位的蛋白質、多肽、肽、病毒或核酸序列的一或多個分子。
4.權利要求1-3任一項的組合物，其中所述抗4-1BB抗體或其片段是人的、人源化的、嵌合的或DeimmunisedTM的。
5.權利要求2-4任一項的組合物，其中所述抗CD40抗體或其片段是人的、人源化的、嵌合的或DeimmunisedTM的。
6.刺激4-1BB受體的激動性抗4-1BB抗體或其片段在生產(chǎn)誘導針對一抗原的全身性T細胞免疫的藥物中的應用。
7.刺激CD40受體的激動性抗CD40抗體或其片段在生產(chǎn)誘導針對一抗原的全身性T細胞免疫的藥物中的應用。
8.權利要求6的應用，其中所述抗4-1BB抗體或其片段與所述抗CD40抗體或其片段組合用于生產(chǎn)誘導針對I類MHC或II類MHC限制性T細胞表位的全身性T細胞免疫的藥物。
8.權利要求6或8的應用，其中所述抗4-1BB抗體或其片段和/或抗CD40抗體或其片段與選自具有或編碼I類MHC或II類MHC限制性T細胞表位的蛋白質、多肽、肽、病毒或核酸序列的一或多個分子組合用于生產(chǎn)誘導針對抗原的全身性T細胞免疫的藥物。
9.權利要求6-8任一項的應用，其中所述抗原是腫瘤或腫瘤細胞抗原。
10.權利要求6-8任一項的應用，其中所述抗原是感染因子的抗原。
11.權利要求9或10的應用，其中所述抗原是HPV抗原。
12.權利要求11的應用，其中所述抗原是具有序列RAHYNIVTF(SEQ ID NO3)的肽。
全文摘要
本發(fā)明揭示了一種治療腫瘤或感染性疾病的方法和組合物，其中所述組合物包含一種激動性抗CD40抗體或其片段和/或一種激動性抗4－1BB抗體或其片段。所述激動性抗體分子包括片段如Fab、(Fab′)
文檔編號A61P35/00GK1646566SQ03807877
公開日2005年7月27日 申請日期2003年4月4日 優(yōu)先權日2002年4月4日
發(fā)明者琳達·迪爾, 海爾特杰·范米爾洛, 科內(nèi)利斯·J·M·梅爾利夫, 勒內(nèi)·托斯, 瑞恩克·奧弗林加 申請人:萊頓大學醫(yī)學中心