專利名稱：哮喘或過敏癥的治療的制作方法
政府利益本發(fā)明得到國家健康研究所/國家過敏癥和傳染病研究所(National Institutes of Health/National Institute of Allergy and InfectiousDiseases)的政府基金支持，基金號為R01AI42242-04。政府擁有本發(fā)明的權(quán)利。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明的實施方案一般涉及用來治療或檢測哮喘或過敏癥的組合物及方法。
相關(guān)技術(shù)說明哮喘是一種慢性損傷性疾病，有時可引起致死性肺部炎癥，其影響著1千5百萬美國人的健康，每年花費約127億美元的衛(wèi)生保健經(jīng)費。雖然目前進行了廣泛的研究，但哮喘的發(fā)病率仍在上升。研究人員不能發(fā)現(xiàn)有效治療哮喘的方法，這很大程度上是由于這種疾病的復(fù)雜性。因為哮喘由廣泛的多種因素致病，所以發(fā)現(xiàn)具有廣泛適用性的有效治療異常困難。例如多種特異的炎癥途徑中很多并不清楚，而認為是通過它們之間的相互作用產(chǎn)生癥狀，并通過此癥狀來診斷患者的哮喘。此外，這些途徑在哮喘患者中的相對重要性可能不同，使得研究更為復(fù)雜。有關(guān)哮喘領(lǐng)域的實驗大多集中于對致敏性動物(主要是小鼠)和人體中過敏原暴露所誘導的細胞和分子事件的分析。這些研究已證實在哮喘反應(yīng)中出現(xiàn)IgE含量升高、粘液分泌過多、氣道阻塞、炎癥及對致痙藥增強的支氣管反應(yīng)性。臨床和實驗研究證明，CD4+2型T輔助淋巴細胞(Th2細胞)的存在與疾病的嚴重程度密切相關(guān)，這表明這些細胞在哮喘的病理生理過程中全程發(fā)揮作用。人們認為，Th2細胞通過分泌直接和間接活化炎癥和居宿效應(yīng)因子途徑的大批細胞因子來誘導哮喘。特別地，在哮喘肺中可產(chǎn)生高水平的白介素4(IL-4)和白介素13(IL-13)，并被認為是此疾病許多特征性表現(xiàn)的中心調(diào)控因子。
精氨酸代謝L-精氨酸是參與兩種生化途徑(如

圖1所示的瓜氨酸-氧化氮(NO)循環(huán)和尿素循環(huán))的半必需堿性氨基酸。多數(shù)的尿素循環(huán)在肝中進行，肝是包含尿素循環(huán)所必須的全部酶系統(tǒng)的主要器官。精氨酸酶是唯一的尿素循環(huán)酶，其有兩種異構(gòu)體(60％氨基酸同源性)，這兩種異構(gòu)體可由不同染色體上不同的基因編碼，分別稱為I型和II型。精氨酸酶I為細胞漿蛋白，主要在肝臟中表達；而精氨酸酶II為線粒體蛋白，可在各種組織特別是腎臟和前列腺中表達。下游酶(鳥氨酸脫羧酶(ODC)和L-鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(OAT))分別在胞漿和線粒體中有特定表達，這表明與兩種異構(gòu)體酶的生物化學鏈有關(guān)。人體中精氨酸酶I缺失可導致高精氨酸血癥和通常是致命的進行性神經(jīng)退變。精氨酸酶I缺失的轉(zhuǎn)基因小鼠在出生后9-11天死亡，而精氨酸酶II缺失的小鼠卻非常正常。近些年來有關(guān)L-精氨酸代謝的一個進展是發(fā)現(xiàn)在各種細胞因子和試劑中暴露后，精氨酸酶可在多種類型的組織和細胞中表達。在所發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)精氨酸的細胞因子中，特別是在巨噬細胞中，IL-4、IL-10和IL-13的作用明顯。盡管兩種精氨酸酶在離體時可被多種刺激誘導，但精氨酸酶I可由Th2細胞因子更強烈地誘導。然而還沒有就此對除巨噬細胞之外的其它細胞類型進行廣泛研究。精氨酸酶在肝外組織中的確切功能還不十分清楚。然而精氨酸酶產(chǎn)物L-鳥氨酸是生成多胺(如腐胺、亞精胺和精胺)和脯氨酸的前體，而多胺和脯氨酸可分別控制細胞的增殖和膠原的產(chǎn)生。事實上，僅增加精氨酸酶I的表達就足以增加血管平滑肌和內(nèi)皮細胞的增殖率。因此，精氨酸酶活性與細胞生長和結(jié)締組織的產(chǎn)生具有潛在的密切關(guān)系，特別需注意的是這兩種過程是慢性哮喘和過敏癥的病理學特性標志(圖1)。除代謝產(chǎn)生L-鳥氨酸外，L-精氨酸也是NO的前體，而NO是一種參與廣泛的生物學過程的自由基分子。L-精氨酸經(jīng)酶NOS作用產(chǎn)生NO。NOS有三種異構(gòu)體。NOS1與NOS3為組成型表達，并為鈣依賴型活性。NOS1在神經(jīng)元中表達，并被認為在神經(jīng)傳遞中發(fā)揮作用；而NOS3或稱內(nèi)皮性NOS在平滑肌和支氣管舒張中發(fā)揮作用。誘導性NOS(iNOS)的NOS2為鈣非依賴型，在諸如內(nèi)毒素和干擾素-γ等炎癥誘導劑的作用下表達上調(diào)，從而導致大量NO的產(chǎn)生。圖1中說明了陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運因子-2(CAT2)在精氨酸酶途徑中的作用。細胞外的L-精氨酸對于從L-精氨酸持續(xù)合成的NO和L-鳥氨酸是必要的，這表明L-精氨酸對跨質(zhì)膜轉(zhuǎn)運具有重要作用。在介導L-精氨酸攝取的這些轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中，系統(tǒng)y+被廣泛表達，并被認為是多數(shù)細胞和組織中的主要L-精氨酸轉(zhuǎn)運因子。由陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運因子CAT1、CAT2和CAT3編碼的系統(tǒng)y+是Na+-非依賴性的高親和性陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。除肝臟外，CAT1在幾乎所有組織中表達，而且對生存是必需的，而CAT2只在有限數(shù)量的組織中表達；CAT3主要表達在腦中。由于兩個外顯子的不同拼接，CAT2 mRNA存在有兩種異構(gòu)體主要表達在肝臟中的低親和性轉(zhuǎn)運因子CAT2A和高親和性的CAT2(CAT2B)。CAT1與CAT2為同源蛋白，其缺少信號肽但含12個跨膜掃描區(qū)和細胞內(nèi)氨基末端。有趣的是，CAT2最早是從淋巴細胞系cDNA中克隆的，且因為它早期誘導正常T細胞向有絲分裂原反應(yīng)而被命名為Tea(T細胞早期活化因子)。然而，除了初步的研究表明這種分子在實驗性自身免疫性腦炎中發(fā)揮重要作用外，未見報道CAT2在T細胞免疫反應(yīng)中的作用。前炎癥分子(如脂多糖[LPS])調(diào)節(jié)CAT2表達的發(fā)現(xiàn)，首次顯示出CAT2可能參與iNOS或精氨酸酶底物的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)。相反，cat-l基因是“看家基因”，在誘導CAT2的條件下不能誘導其表達。嗜伊紅細胞陽離子蛋白能抑制巨噬細胞對L-精氨酸的攝取的發(fā)現(xiàn)揭示了其間更令人感興趣的關(guān)系。最近對CAT2缺失小鼠的分析表明，巨噬細胞中NO的持續(xù)合成需要CAT2的作用。CAT2缺失的巨噬細胞對L-精氨酸的攝取降低95％，這表明CAT2是巨噬細胞中L-精氨酸的主要轉(zhuǎn)運因子。CAT2最早是從淋巴細胞系cDNA中克隆的，且因為它早期介導正常T細胞向有絲分裂原反應(yīng)而被命名為Tea(T細胞早期活化因子)(MacLeod et al.，J Exp Biol，196109-21(1994))。然而，以往有關(guān)CAT2在免疫反應(yīng)中作用的研究主要限制于對產(chǎn)生NO所起的作用(Nicholson et al.，J Biol Chem，27615881-5(2001))。因而進一步準確確定哪一種CAT2異構(gòu)體在哮喘肺中被表達是很重要的。根據(jù)外顯子7(2B型)或外顯子8(2A型)的特定利用，CAT2被表達為兩種獨立的異構(gòu)體(Nicholson et al.，J BiolChem，27615881-5(2001))。CAT2A對L-精氨酸的親和性較低，并被認為主要表達在肝臟中(MacLeod et al.，J Exp Biol，196109-21(1994))。由于哮喘和過敏癥的發(fā)病率正在上升，所以需要對這種疾病進行更好地了解和治療的研究。因此，本領(lǐng)域急需的是治療哮喘或過敏癥患者的新方法、鑒定可能患有哮喘和過敏癥的個體的新方法以及表型患者的新方法(例如預(yù)測患者的預(yù)后和對治療的反應(yīng))。
發(fā)明概要本發(fā)明的一個實施方案是一種治療哮喘或過敏癥患者的方法，包括鑒定需要哮喘或過敏癥治療的個體；及給予能夠降低參與精氨酸代謝的蛋白產(chǎn)生的分子。另一實施方案是檢測患有哮喘或過敏癥的患者的方法，包括測量參與該患者中精氨酸代謝的至少一種基因產(chǎn)物的水平；測量參與精氨酸代謝的至少一種基因產(chǎn)物的遺傳多樣性(表達或基因序列)；及將測量結(jié)果與對照個體的測量結(jié)果進行比較，其中與對照個體相比該至少一種基因表現(xiàn)出較高水平的患者被確定為患有哮喘或過敏癥。另一實施方案是治療哮喘或過敏癥的治療性組合物，其包括含在藥物上可接受的載體中的精氨酸酶抑制劑。另一實施方案是治療哮喘或過敏癥的治療性組合物，其包括在藥物上可接受的載體中的CAT2活性抑制劑。另一實施方案是鑒定可能患有哮喘或過敏癥的個體的方法，包括鑒定仍沒表現(xiàn)出哮喘或過敏癥癥狀的個體，測量精氨酸酶途徑中基因產(chǎn)物的水平；及將該產(chǎn)物水平與對照個體的測量結(jié)果進行比較，其中該產(chǎn)物表現(xiàn)出較高水平的患者被確定為可能患有哮喘或過敏癥。另一實施方案是治療哮喘或過敏癥患者的方法，包括鑒定需要哮喘或過敏癥治療的個體；及給予該患者能夠降低ADAM8蛋白的活性的分子。另一實施方案是治療哮喘或過敏癥患者的方法，包括鑒定需要哮喘或過敏癥治療的個體；及給予該患者能夠降低SPRR2A、SPRR2B或相關(guān)SPRR家族成員蛋白的活性的分子。另一實施方案是檢測可能發(fā)展為哮喘的患者的方法，包括提供該患者的生物樣品；及檢測該生物樣品中如表1所示的基因亞組的表達水平，其中與對照生物樣品相比，該基因亞組表達水平的提高表明該患者發(fā)展為哮喘的可能增加。另一實施方案是檢測可能發(fā)展為過敏癥的患者的方法，包括提供該患者的生物樣品；及檢測該生物樣品中如表2所示的基因亞組的表達水平，其中與對照生物樣品相比，該基因亞組表達水平的提高表明該患者發(fā)展為過敏癥的可能增加。另一實施方案是發(fā)現(xiàn)可有效治療哮喘或過敏癥的化合物的方法，包括提供候選化合物；檢測該化合物是否抑制精氨酸代謝，其中對精氨酸代謝的抑制表明該化合物可有效治療哮喘或過敏癥。
附圖簡要說明圖1為精氨酸代謝途徑的示意圖。圖2A為過敏原致敏試驗方法的一個實施方案的示意圖。在第0天和第14天兩次給小鼠腹腔內(nèi)注射卵清蛋白(OVA)(100μg)和明礬(1mg)。隨后，經(jīng)鼻腔內(nèi)給予小鼠OVA(50μg)或鹽水進行致敏，在第一次或第二次過敏原致敏后的3小時或18小時進行分析。圖2B為柱狀圖，表明對鹽水和OVA處理的小鼠的嗜酸性細胞活化趨化因子-1(eotaxin-1)的信號定量分析，誤差柱代表標準偏差。圖3為維恩圖，說明在OVA處理的小鼠的實驗性哮喘的特定階段中誘導的基因的交迭。圖4為維恩圖，說明經(jīng)OVA過敏原和煙曲霉菌抗原誘導的小鼠基因表達的交迭。圖5說明精氨酸代謝酶的表達結(jié)果。在過敏原致敏的小鼠中，通過基因芯片分析檢測的精氨酸酶I和iNOS的表達分別如圖5A和圖5B所示。圖中給出了經(jīng)鹽水(灰色柱)和過敏原(黑色柱)致敏后的雜交信號的平均差異。誤差柱代表標準偏差。時間點為3H-1致敏，3h；18H-1致敏，18h；2C-2致敏，18h；asp-曲霉菌。精氨酸代謝途徑的示意圖如圖5C所示?；蛐酒猩蠜]有的基因用白色方塊表示，芯片列上有但沒有顯著增加的基因用灰色方塊表示，顯著增加的基因用黑色方塊表示。在圖5D中，表明經(jīng)鹽水和OVA致敏的小鼠肺中的精氨酸活性。通過血液尿素氮試劑檢測肺裂解液中的精氨酸酶的活性。作為對照，鹽水和OVA致敏的小鼠在肝臟中的精氨酸酶活性分別為1522±183和1390±78。圖6為柱狀圖，說明通過基因芯片分析檢測的過敏原致敏的小鼠中ADAM-8的誘導。圖中給出了經(jīng)鹽水(灰色柱)和過敏原(黑色柱)致敏后的ADAM-8雜交信號的平均差異，誤差柱代表標準偏差。時間點為3H-1致敏，3h；18H-1致敏，18h；2C-2致敏，18h。圖7表明通過基因芯片分析檢測的卵清蛋白(OVA)和煙曲霉菌(Asp)致敏的小鼠中L-精氨酸代謝酶(精氨酸酶I(圖7A)、精氨酸酶II(圖7B)、CAT2(圖7C))的表達。圖中給出了經(jīng)鹽水(灰色柱)和過敏原(黑色柱)致敏后的雜交信號的平均差異，誤差柱代表標準偏差。圖8說明IL-13和STAT6對精氨酸酶的調(diào)節(jié)。圖8A為柱狀圖，表明肺中IL-13誘導的氣道高反應(yīng)性(AHR)的動力學特點和精氨酸mRNA的水平。按Penh記錄(可產(chǎn)生最大反應(yīng)的甲膽堿量為25mg/ml)，在氣管內(nèi)給予小鼠(n＝4-10/組)一次劑量的IL-13(10μg)或PBS，并分析各時間點的AHR。在圖的下部分，肺中RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并用來作精氨酸酶I(ArgI)、精氨酸酶II(ArgII)或?qū)φ沾吸S嘌呤磷酸核糖體轉(zhuǎn)移酶(HPRT)的PCR分析?！皩φ铡庇镜啦缓琧DNA模板。圖8B為柱狀圖，說明經(jīng)鹽水和OVA致敏的野生型(WT)和STAT6-缺失型(STAT6-KO)小鼠肺中的精氨酸酶活性。通過血液尿素氮試劑檢測肺裂解液中的精氨酸酶活性。圖9為用于確定實驗性哮喘中CAT2(特別是CAT2A與CAT2B異構(gòu)體)參與度的方法的示意圖。通過RT-PCR方法從過敏原致敏小鼠肺中擴增CAT2，并將其亞克隆到pCR2.1載體中。隨后克隆物用EcoRI或EcoRI/BamHI限制性酶切，來分別分化CAT2A亞型和CAT2B亞型。圖10為說明人哮喘中的精氨酸酶I蛋白表達的示意圖。分別對過敏癥型哮喘患者和健康對照者進行纖維支氣管鏡的檢查，同時也為精氨酸酶I的免疫組化分析了BALF。免疫陽性細胞的數(shù)量用占細胞總數(shù)的百分比表示。圖11A和圖11B為線型圖，說明用N(ω)-羥基-L-精氨酸(NOHA)處理肺裂解液的結(jié)果。用NOHA離體處理卵清蛋白致敏的小鼠肺裂解液的結(jié)果如圖11A所示。用NOHA離體處理白介素4過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)果如圖11B所示。圖12為線型圖，說明用氣管內(nèi)NOHA處理的哮喘小鼠(IL4/IL5雙轉(zhuǎn)基因肺小鼠)中氣道高反應(yīng)性的檢測結(jié)果(按Penh記錄)。
詳細說明本發(fā)明的實施方案涉及對參與哮喘和過敏癥的基因的發(fā)現(xiàn)。因此，本發(fā)明的一個實施方案涉及發(fā)現(xiàn)一組291個“標記”基因(表1)，在疾病的哮喘模型中這些基因被持續(xù)調(diào)控。此外，發(fā)現(xiàn)一亞組59個基因(表2)在與參與的組織(肺與腸)無關(guān)的多種過敏性疾病中持續(xù)升高，這提供了普遍性的過敏癥遺傳“標記”。據(jù)此，可依據(jù)每個標記基因的表達或遺傳多樣性對患者進行基因分型，來確定其發(fā)展為哮喘或過敏癥的可能。此外，可以通過檢測哮喘或過敏癥患者的這些標記基因表達來更準確地預(yù)測其預(yù)后和對治療方案的反應(yīng)。此外，可將每個基因作為用于干預(yù)/治療過敏癥的可能藥物的目標。盡管本發(fā)明的實施方案涉及到通過將患者的哮喘或過敏癥標記基因的表達水平與表1和表2所示的基因表達水平相比來確定該患者發(fā)展為哮喘或過敏癥的可能，但在本發(fā)明的范圍內(nèi)并不要求其有準確的關(guān)系。例如，確認患者只表現(xiàn)出某些標記基因表達的增加后，仍可預(yù)示患者有發(fā)展為過敏癥或哮喘的可能。因此，從患者身上采集的生物樣品被檢測到有如1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的標記基因的表達增加后，仍可確定其有過敏癥或哮喘的可能。標記基因的基因表達方式與每個基因的表達水平的組合被用來表明測試者發(fā)展為過敏癥或哮喘的可能。為此，本發(fā)明的范圍不限于通過匹配所有291個哮喘標記基因的表達水平來確定患者有患哮喘的可能。相似地，不要求使所有59個過敏癥標記基因的表達水平匹配來確定患者發(fā)展為過敏癥的可能。為此，不需要患者的基因表達分布與過敏癥標記基因或哮喘標記基因準確匹配來預(yù)測現(xiàn)有患者的預(yù)后或?qū)χ委煼桨傅姆磻?yīng)。此外，本發(fā)明的實施方案涉及發(fā)現(xiàn)肺精氨酸酶信號途徑與哮喘之間的關(guān)系。所描述的方法用來揭示精氨酸酶途徑參與了實驗性哮喘和人的哮喘。一些重要的包括那些編碼CAT2、精氨酸酶I和精氨酸酶II蛋白在內(nèi)的精氨酸酶代謝基因的表達增加與哮喘和過敏癥密切相關(guān)。同時還發(fā)現(xiàn)，由IL-4/IL-13信號誘導的精氨酸酶不僅是過敏性氣道反應(yīng)的標志，而且精氨酸酶參與了哮喘的多方面的發(fā)病機理。據(jù)此，改變這些精氨酸酶的途徑基因或其產(chǎn)物可用于設(shè)計治療哮喘或過敏癥的治療和診斷策略。本發(fā)明的實施方案還涉及發(fā)現(xiàn)明顯的精氨酸酶參與的精氨酸代謝，此過程在哮喘和相關(guān)疾病的表現(xiàn)中是重要的作用機制。由此，精氨酸代謝途徑是治療所有過敏性肺病的重要治療性干預(yù)策略。通過抑制精氨酸酶本身的活性或抑制精氨酸酶途徑的其它成員的活動可控制精氨酸酶途徑，并可能提供有效的哮喘治療。此外，對肺精氨酸酶途徑的控制對預(yù)防哮喘的發(fā)作也有效。同樣，通過計量哮喘代謝途徑酶或產(chǎn)物的水平可用來分析參與精氨酸代謝的基因，這可用于診斷哮喘或過敏癥的發(fā)病。本發(fā)明的另一個實施方案涉及到發(fā)現(xiàn)標記基因之一的ADAM8，該基因與哮喘和過敏癥密切相關(guān)。因此本發(fā)明的實施方案包括試劑盒、系統(tǒng)及通過鑒定患者ADAM8水平來診斷哮喘的方法。此外，預(yù)測到通過給予治療有效劑量的可抑制ADAM8的化合物能用來治療哮喘或過敏癥。Schlomann等(Schlomann，et al.，J Biol Chem 2002 Dec 13；277(50)48210-9)報道了一種此類化合物的實例，即巴馬司他(batimastat，BB-94)。據(jù)此，本發(fā)明的一個實施方案是通過給予患者治療有效量的巴馬司他以對哮喘或過敏癥進行治療。本發(fā)明的另一個實施方案涉及到發(fā)現(xiàn)含有分子家族的標記基因，該分子以前并不與哮喘相關(guān)而被稱為富含脯氨酸的小分子蛋白(SPRR)，特別是SPRR2A和SPRR2B。已知SPRR蛋白家族參與角狀上皮細胞的分化和生長(Tesfaigzi J，Carlson DM，Cell Biochem Biophys 1999；30(2)243-65，Expression，regulation，and function of the SPR family ofproteins.綜述)SPRR2A和SPRR2B與哮喘和過敏癥密切相關(guān)。此外，用被認為是哮喘的核心調(diào)節(jié)因子的IL-13處理野生型小鼠后，可顯著增加肺中SPRR2水平(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，本發(fā)明的實施方案包括試劑盒、系統(tǒng)及通過鑒定患者SPRR蛋白或基因的水平和多樣性(遺傳或蛋白水平)來診斷哮喘的方法。此外，預(yù)測到通過給予可改變SPRR蛋白功能的化合物能用來治療哮喘或過敏癥。如下所述通過芯片分析程序?qū)τ貌煌愋偷目乖幚淼男∈筮M行分析，其結(jié)果初步確定了哮喘發(fā)病機制中基因表達的上調(diào)。
實驗性哮喘動物基因表達的芯片分析此處所述的經(jīng)受實驗性哮喘的小鼠DNA芯片譜分析揭示了以往未進行深入研究的參與發(fā)病機制的復(fù)雜途徑。所檢測基因組的～6％基因的動力學表達與哮喘反應(yīng)有關(guān)，這種檢測結(jié)果顯示出有大量的基因產(chǎn)物參與發(fā)病機制。在肺過敏癥中發(fā)現(xiàn)不僅有如表1所示的一組一般性“哮喘標記基因”的參與，而且還有根據(jù)疾病誘導的類型而決定的特定基因轉(zhuǎn)錄譜的參與。以所揭示的CAT2介導的精氨酸代謝途徑和精氨酸酶途徑為例，鑒定出以往未發(fā)現(xiàn)其在哮喘發(fā)病中有作用的多種基因。為在已建立的哮喘模型中可重復(fù)地、準確地鑒定差異表達的基因，在以14天為分界的兩個時間點上腹腔給予小鼠過敏原卵清蛋白(OVA)與明礬佐劑以進行致敏(圖2A和實施例1)。隨后，在以3天為分界的兩個時間點上對復(fù)制的小鼠鼻腔內(nèi)給予OVA或鹽水(對照)致敏。最后一次過敏原致敏后18h，取一葉小鼠的肺用于組織學分析，剩下的肺組織用于RNA分析。如所預(yù)料的，組織學分析結(jié)果表明，與以往報道(Rothenberg，M.E.，MacLean，J.A.，Pearlman，E.，Luster，A.D.，and Leder，P.1997.Targeted disruption of the chemokine eotaxin partially reducesantigen-induced tissue eosinophilia.J Exp Med 185785-790)相同，過敏原致敏的小鼠具有明顯的富含嗜伊紅細胞炎癥反應(yīng)。為驗證過敏原誘導的mRNA轉(zhuǎn)錄的存在，通過Northern blot方法對RNA進行檢測，分析其中嗜酸性細胞活化趨化因子-1的誘導作用，先前已證明了過敏原致敏對趨化因子有明顯的誘導作用(Rothenberg，etal.，1997，supra)。發(fā)現(xiàn)過敏原致敏的肺中嗜酸性細胞活化趨化因子-1mRNA表達豐富，而經(jīng)鹽水處理的小鼠只表達很低的水平，此結(jié)果驗證了試驗誘導方案。下一步，利用AFFYMETRIX芯片U74Av2對RNA進行基因芯片分析，該芯片含有代表12,422個遺傳單元(實施例2)的寡核苷酸探針。根據(jù)實施例4提供的方法對基因芯片數(shù)據(jù)做進一步分析。兩個鹽水致敏的小鼠間的相互比較和兩個過敏原致敏小鼠間的相互比較顯示，＞2倍變化的基因為≤1％。對現(xiàn)有基因的散點分析顯示超出2倍范圍的點幾乎沒有。相反，對過敏原致敏小鼠與鹽水致敏小鼠的平行比較顯示，＞2倍變化的基因占6.5±0.8％。如圖所示，在過敏原誘導的基因中，嗜酸性細胞活化趨化因子-1為可再生性表達(2B)。對過敏原與鹽水致敏的嗜酸性細胞活化趨化因子-1平均差異表達信號的定量分析顯示，其間存在25倍的誘導(P＝0.001)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)驗證了根據(jù)試驗所作的分析并證明了所應(yīng)用科學方法的潛在價值，因此為以下的實驗奠定了基礎(chǔ)。
哮喘的遺傳控制基因表達與交迭誘導的基因其它試驗是在實驗性哮喘區(qū)域的急性和慢性階段對較大一組的小鼠肺中mRNA轉(zhuǎn)錄類型進行鑒定。其假說是，與接受第二次致敏的后一時間點比較，第一次過敏原致敏后能急性誘導特定的一組基因。首先檢測了在第一次過敏原介入后的早期時間點(3h)，其依據(jù)是這個檢測能夠?qū)^敏原暴露后肺的初始反應(yīng)提供更深的理解。事實上，早期過敏原介入后，只有100個基因被誘導(圖3)。下一步，檢測了第一次過敏原致敏后18h誘導的基因。在較晚的時間點，有132個進行性誘導增加的基因，其中很多沒有在過敏原致敏后的急性反應(yīng)中出現(xiàn)。事實上，有41個早期活化基因仍保持升高水平，而另有91個基因表達增加(圖3)。與急性反應(yīng)時間點不同，與兩個過敏原致敏后18h誘導的基因比較，沒有出現(xiàn)特定的“遺傳標記”。事實上，在第一次過敏原致敏18h后被誘導的基因大多數(shù)在隨后的第二次致敏中進一步升高。為了深入理解慢性過敏性肺反應(yīng)的發(fā)病機制，對實驗性哮喘相對“慢性”階段誘導的基因表達特點進行分析。在實驗性哮喘的慢性階段中，作為適應(yīng)性免疫反應(yīng)的擴展指示，免疫相關(guān)基因與降低組(4.4％)相比較，增加組(44％)占據(jù)主導地位。相反，在發(fā)展和穩(wěn)態(tài)的基因中，降低的基因占多數(shù)(54％)，而增加的基因只占20％。
過敏原特異基因的比較OVA與Asperigillus誘導的哮喘下面針對兩個獨立的哮喘模型進行全部轉(zhuǎn)錄譜的比較。，由于煙曲霉菌(Aspergillus Fumigates)抗原誘導的實驗性哮喘模型與OVA模型相比具有唯一的粘膜感受途徑(鼻腔內(nèi)途徑)(Huang，W.W.，Garcia-Zepeda，E.A.，Sauty，A.，Oettgen，H.C.，Rothenberg，M.E.，and Luster，A.D.1998.Molecular and biological characterization of the murine leukotriene B4receptor expressed on eosinophils.J.Exp.Med.1881063-1074)，而且煙曲霉菌還是普遍存在的通用氣源性致敏原，因此對煙曲霉菌抗原誘導的實驗性哮喘進行了分析。重要的是，兩種哮喘模型具有相似的表型，包括Th2相關(guān)的嗜伊紅細胞炎癥反應(yīng)、粘液產(chǎn)生及氣道的高反應(yīng)性。與最后一次OVA致敏18h后的分析相同，在九次劑量的鼻腔內(nèi)煙曲霉菌過敏原致敏18h后，對肺中RNA進行基因芯片分析和數(shù)據(jù)處理分析。與鼻腔內(nèi)鹽水致敏的小鼠比較，煙曲霉菌致敏的小鼠有527個誘導的基因(圖4)。在兩個實驗性哮喘模型之間，多數(shù)誘導的轉(zhuǎn)錄基因發(fā)生交迭(OVA中的63％和Aspergillus中的61％)，然而，有182個基因(占兩次OVA致敏后的496個增加基因的37％)和208個基因(占Aspergillus致敏的增加基因的39％)分別為OVA和煙曲霉菌模型所獨有。對兩種哮喘模型誘導的基因進行比較，發(fā)現(xiàn)在一些信號途徑的上游存在有特殊的不規(guī)律調(diào)節(jié)的基因，如OVA模型中的12-脂質(zhì)氧化酶。因此，雖然這兩種模型的哮喘表型大致相似，但這兩種獨立的哮喘模型卻以眾多獨特的不規(guī)律調(diào)節(jié)基因為特征。這表明個體的過敏性氣道炎癥反應(yīng)狀態(tài)可能具有大量不同遺傳標記和實施途徑。
實驗性哮喘與參與L-精氨酸代謝基因的誘導有關(guān)試驗結(jié)果鑒定出一組291個基因(表1)，其是通常參與疾病發(fā)病機制過程的基因，而不是過敏原或疾病誘導類型的特殊基因。這些哮喘標記基因為確定過敏性氣道炎癥反應(yīng)的發(fā)病機制中的新信號途徑提供了有價值的契機。作為實例，參與L-精氨酸代謝的基因的高水平轉(zhuǎn)錄非常顯著。
表1哮喘標記基因 如表1所示，精氨酸酶I(Genbank登錄號NM_007482)、精氨酸酶II(Genbank登錄號NM_009705)及L-精氨酸轉(zhuǎn)運因子陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運因子CAT2(Genbank登錄號NM_007514)的表達明顯增加。其它參與精氨酸代謝的酶，如精氨基琥珀酸酯合成酶、L-鳥氨酸脫羧酶和L-鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在經(jīng)鹽水和過敏原致敏的小鼠中沒有顯著差異。有趣的是，基因芯片分析顯示，與氧化氮合成酶(NOS)比較，精氨酸酶表現(xiàn)為非常特殊的非規(guī)律性調(diào)節(jié)。例如，在鹽水和過敏原致敏的肺中，內(nèi)皮細胞NOS和神經(jīng)元NOS的雜交信號均低于背景信號(數(shù)據(jù)未顯示)。盡管在多數(shù)條件下能檢測到誘導性的NOS(iNOS)mRNA，但在鹽水致敏和過敏原致敏之間沒有顯著變化。隨后的Northern blot分析(實施例3)表明，在OVA誘導的實驗性哮喘的進行中精氨酸酶I的表達表現(xiàn)出時間和劑量的依賴關(guān)系；在第一次過敏原致敏18h后，精氨酸酶I表達增加，而且在兩次過敏原致敏后表達進一步增加。此外，盡管精氨酸酶II mRNA的誘導弱于精氨酸酶I的誘導，但其在實驗性哮喘的發(fā)展中更早地被誘導。例如，在第一次過敏原致敏3h后，精氨酸酶II易被檢測到。此外，Northern blot分析證明過敏原致敏可誘導CAT2，并在第一次過敏原致敏后3h已有明顯的表達。iNOS mRNA信號很難被檢測到而且沒有明顯被OVA誘導。此外，與九次劑量的鼻腔內(nèi)鹽水致敏小鼠比較，煙曲霉菌(Aspergillus Fufnigatus)致敏小鼠的精氨酸酶I、精氨酸酶II及CAT2表達明顯。與OVA模型的結(jié)果相同，只有很低水平的iNOS mRNA誘導表達。因此，由過敏原致敏的精氨酸酶和CAT2的誘導表達對于所使用的抗原不具特異性，但表現(xiàn)為實驗性哮喘的部分遺傳程序。此外，表2所示為通過實施例14的方法建立的胃腸過敏癥模型中顯著上調(diào)的基因。
表2過敏癥標記基因
哮喘中精氨酸酶的增加此外還發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)實驗性哮喘誘導后，肺中精氨酸酶活性顯著增加。與對照組小鼠肺中沒有精氨酸mRNA的結(jié)果一致，鹽水致敏的肺中的精氨酸酶活性水平接近背景水平。作為對照，經(jīng)鹽水和OVA致敏的小鼠肝臟中的精氨酸酶活性分別為1522±183nmol/min/mg蛋白和1390±78nmol/min/mg蛋白。因此表明，在哮喘小鼠肺中精氨酸由精氨酸酶(至少是部分由精氨酸酶)代謝。此外，哮喘中NO水平的變化可間接表明精氨酸酶活性，精氨酸酶是可通過底物去除作用來抑制NOS酶的功能的酶(Morris，S.M.，Jr.Annual Review of Nutrition 22，87-105(2002)；Mills，C.D.Crit RevImmunol 21，399-425(2001))。此外，由于發(fā)現(xiàn)了哮喘中精氨酸酶I和精氨酸酶II為上調(diào)的，有可能針對精氨酸酶途徑中的反應(yīng)物和產(chǎn)物的多樣性來發(fā)現(xiàn)靶向藥物，從而為哮喘和過敏癥提供治療方法。例如，精氨酸酶的下游產(chǎn)物是調(diào)節(jié)細胞生長和結(jié)締組織重新塑型的多胺和脯氨酸。已知這些途徑參與了哮喘的病理生理過程，抑制精氨酸酶途徑的任何部分將有可能抑制哮喘或過敏癥。
精氨酸酶I mRNA的原位雜交為開始確定這些分子的細胞來源，進行了精氨酸酶I mRNA的原位雜交，如下面的實施例7所示。對兩次劑量的OVA或鹽水致敏的OVA/明礬敏感的小鼠檢測其精氨酸酶I反義(AS)和正義(S)探針的雜交信號。在第二次用鹽水或過敏原致敏后18h，對組織進行分析。反義染色的哮喘肺在血管周圍和支氣管周圍的炎癥灶中顯示出較強水平的精氨酸酶I。在OVA致敏的小鼠中沒有發(fā)現(xiàn)正義探針的特異性染色。將鹽水致敏肺中反義和正義探針的雜交信號與背景信號作比較。在具有大部分與巨噬細胞相同的豐富細胞漿的大單核細胞亞群中，存在反義探針的特異性染色。嗜伊紅細胞亞群表達較少量的精氨酸酶I。此外，反義探針可與肺泡巨噬細胞和粘膜下梭形細胞雜交(與肌成纖維細胞或平滑肌細胞一致)。
通過給予可降低或抑制肺中精氨酸酶的組合物來治療或預(yù)防哮喘或過敏癥本發(fā)明的一個實施方案是通過給予需要治療的個體治療有效量的精氨酸酶抑制劑來抑制哮喘的方法(實施例15-20)。例如，L-精氨酸轉(zhuǎn)運因子CAT2和精氨酸酶下游酶L-鳥氨酸脫羧酶(ODC)是治療的目標。例如二氟甲基鳥氨酸(DFMO)為ODC的抑制劑，其可用于抑制哮喘和過敏癥(實施例17-19)。因此，本發(fā)明的一個實施方案是通過已知的鳥氨酸脫羧酶(ODC)抑制劑二氟甲基鳥氨酸(DFMO)來治療哮喘或過敏癥。本發(fā)明的另一個實施方案包括對患有哮喘或過敏癥的個體給予有效劑量的DFMO。此處使用的抗精氨酸酶化合物是能抑制或降低精氨酸酶作用的化合物。在一個實施方案中，精氨酸酶抑制劑是精氨酸酶途徑中的小分子或基因的反義抑制劑。在本發(fā)明的另一實施方案中，精氨酸酶抑制劑是精氨酸酶I或精氨酸酶II的抑制劑。精氨酸酶抑制劑優(yōu)選給藥至個體的肺部，但其它治療方式也可達到預(yù)期效果。優(yōu)選的精氨酸酶抑制劑是小分子，例如N(ω)-羥基-L-精氨酸(NOHA)、N-羥基-去-L-精氨酸(nor-NOHA)及諸如2(S)-氨基-6-二羥硼己酸(ABH)和S-(2-二羥硼乙基)-L-半光氨酸(BEC)等的硼酸基過渡態(tài)類似物。其它的抑制劑是由Que等(Nitric Oxide.2002 Feb；6(1)1-8)所公開的那些。如實施例15所示，NOHA可以阻斷哮喘肺中的精氨酸酶活性，以及在實施例20中其可阻斷過敏原誘導的氣道高反應(yīng)性的發(fā)展。因此，本發(fā)明的一個實施方案通過給予治療有效量的NOHA來治療哮喘。此外，一些NO合成酶抑制劑可阻斷精氨酸轉(zhuǎn)運因子CAT2，并由此通過減少精氨酸的可用水平來產(chǎn)生預(yù)期的降低哮喘作用。據(jù)此，本發(fā)明的一個實施方案是通過給予哮喘或過敏癥個體有效劑量的化合物來治療哮喘或過敏癥，其中該化合物可降低個體的ArgI、ArgII或CAT2的水平或功能。本發(fā)明的另一個實施方案是一種用于治療哮喘或過敏癥的治療組合物，其包括在藥學上可接受的載體中的精氨酸酶抑制劑。其它的實施方案包括抑制性治療組合物，其包括在藥學上可接受的載體中的ADAM8抑制劑。這種ADAM8抑制劑例如可通過將ADAM8從跨膜形式轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙庑问絹砀淖傾DAM8的構(gòu)象或結(jié)構(gòu)。此處使用的術(shù)語“治療(treat)”或“治療(treatment)”均指治療性處理和防病或預(yù)防的措施，其目的是防止或減緩(減輕)不希望的生理性變化或失調(diào)，如癌癥的發(fā)展或擴散。術(shù)語“治療(treat)”還指疾病的類型或嚴重程度的特征，該疾病在預(yù)后過程中可能有分支表現(xiàn)或需要特殊的治療。為此發(fā)明目的，有益或所期望的臨床結(jié)果包括但不限于無論是可檢測到的還是不可檢測到的癥狀的緩解、疾病程度的消失、疾病的穩(wěn)定(即不惡化)、疾病發(fā)展的延遲或減慢、疾病狀態(tài)的改善或減輕以及疾病的免除(部分或全部)?！爸委?treatment)”還指與未接受治療所預(yù)計的存活率相比延長的存活率。需要治療的人包括那些已經(jīng)處于疾病狀態(tài)或失調(diào)的人以及有發(fā)展為疾病狀態(tài)或失調(diào)傾向的人，或應(yīng)預(yù)防這種疾病狀態(tài)或失調(diào)的人。通過將具有所需純度的抗精氨酸酶化合物與可選擇的生理上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(RemingtonThe Science and Practice ofPharmacy，19th Edition，Alfonso，R.，ed，Mack Publishing Co.(Easton，PA1995))混合能夠制備抗精氨酸酶或抗ADAM8化合物的治療性制劑，并可以凍干塊或水溶液的形式儲存。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所應(yīng)用的劑量和濃度下對受者是無毒性的，其包括諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸等的緩沖劑；包括抗壞血酸在內(nèi)的抗氧化劑；低分子量(殘基約少于10個)的多肽；諸如血清白蛋白、凝膠或免疫求蛋白等的蛋白；諸如聚乙烯吡咯烷酮等的親水性聚合物；諸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸或賴氨酸等的氨基酸；包括葡萄糖、甘露糖或糊精等的單糖、二糖和其它碳水化合物；諸如EDTA等的螯合劑；諸如甘露醇或山梨醇等的糖醇；諸如鈉的成鹽抗衡離子；和/或諸如吐溫(Tween)、聚醚或聚乙二醇(PEG)等的非離子表活性面劑。在體給藥的抗精氨酸酶、抗CAT2或抗ADAM8化合物必須經(jīng)滅菌。此步驟在凍干和復(fù)原之前或之后，可以很容易地通過無菌濾膜過濾來完成。此化合物通常以凍干或溶液形式儲存。通常將治療性的抗精氨酸酶、抗CAT2或抗ADAM8化合物放入帶有無菌接入口的容器中，例如帶有通過皮下注射針能夠刺破的塞子的靜脈內(nèi)注射溶液袋或小瓶。給予化合物的途徑與已知的方法一致，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、腦內(nèi)、皮下、皮上、鼻腔內(nèi)、氣管內(nèi)、霧化、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、動脈內(nèi)、腦脊髓腔內(nèi)或病灶內(nèi)注射或輸注，或如下文所述的緩釋給藥系統(tǒng)。適宜的緩釋制劑的實例包括成形物形式的半滲透性聚合基質(zhì)，例如薄膜或微囊。緩釋基質(zhì)包括聚酯、水凝膠、聚交酯(U.S.3,773,919，EP 58,481)、L-谷氨酸和γ-L-谷氨酸乙酯的共聚物(Sidman et al.，Biopolymers，22547-556(1983))、聚(2-甲基丙烯酸羥乙酯)(Langer et al.，J.Biomed.Mater.Res.，15167-277(1981)和Langer，Chem.Tech.，1298-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer et al.，supra)或聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)。緩釋化合物還可包含脂質(zhì)體俘獲組合物。可通過DE3,218,121；Epstein et a1.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688-3692(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，774030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本專利申請83-118008；U.S.4,485,045和4,544,545；以及EP 102,324所公布的方法制備含脂質(zhì)體的化合物。通常脂質(zhì)體為小的(約200-800埃)單載體類型，其中脂質(zhì)含膽固醇量大于約30mol.％，所選擇的比例應(yīng)滿足最佳的治療效果。抗精氨酸酶、抗CAT2或抗ADAM8化合物還能通過吸入給藥。商業(yè)銷售的液體制劑噴霧器(包括噴射噴霧器和超聲噴霧器)均可用于給藥。液體制劑可直接霧化，凍干粉可在復(fù)原后霧化?？蛇x擇地，這些化合物能應(yīng)用氟碳化合物制劑和計量吸入器使其煙霧化，或以凍干粉和研碎粉吸入。用于治療的化合物的“有效量”取決于例如治療目的、給藥途徑、所使用化合物的類型以及患者的病情。據(jù)此，為實現(xiàn)理想的治療效果，治療者有必要根據(jù)需要選擇劑量和改變給藥途徑。一般地，臨床醫(yī)生將給予化合物到能夠獲得理想效果的劑量為止。這種治療過程很容易通過常規(guī)分析來監(jiān)控。在應(yīng)用抗精氨酸酶、抗CAT2或抗ADAM8化合物對哮喘或過敏癥的治療和預(yù)防中，化合物的組方、劑量和給藥方式應(yīng)與有效的醫(yī)學實踐相一致。此過程要考慮的因素包括被治療的哮喘/過敏癥的程度、患者的臨床情況、化合物的給藥點、化合物的特定類型、給藥方法、給藥療程以及開業(yè)醫(yī)生已知的其它因素。這種欲給予的化合物的“治療有效量”應(yīng)結(jié)合這些因素來監(jiān)控，并且應(yīng)是預(yù)防、改善或治療哮喘必需的最小量。此量優(yōu)選應(yīng)低于對宿主產(chǎn)生毒性的量或低于導致宿主明顯易于感染的量。通常建議腸道外給藥的抗精氨酸酶、或抗ADAM8化合物的初始藥物上的有效量優(yōu)選約為0.1～50mg/kg體重/天，典型的化合物初始范圍優(yōu)選為0.3～20mg/kg/天，更優(yōu)選為0.3～15mg/kg/天。根據(jù)醫(yī)生所希望實現(xiàn)的藥代動力學衰減形式，可以通過一次給藥、多次給藥或連續(xù)輸入給藥來給予所要求的劑量。然而如上所述，化合物的這些建議的量需要經(jīng)過許多的治療驗證，包括使用的化合物的類型。選擇合適劑量和療程的關(guān)鍵因素是按上述得到的結(jié)果。例如，此化合物可選擇性地可與一種或多種目前使用的預(yù)防或治療哮喘的藥物一起組方。這種其它藥物的有效量取決于制劑中存在的化合物的量、哮喘的臨床程度和上述討論的其它因素。它們通常以相同的劑量使用，并且與上文使用的給藥途徑相同，或以約為1～99％的以前使用的劑量使用。
通過在特定的組織中增加精氨酸酶而在其它組織中降低精氨酸酶來治療哮喘或過敏癥本發(fā)明的另一個實施方案包括在患者特定的組織中增加精氨酸酶水平來提供保護性反應(yīng)。這涉及到增加精氨酸酶可通過功能性地(直接或間接地)抑制NO合成酶來減少NO的合成的事實。因為NO的氧化產(chǎn)物可誘導多種炎癥反應(yīng)，所以肺中的精氨酸酶的合成可通過降低NO依賴性炎癥反應(yīng)的方式來增加其保護性，但其在肺的慢性變化(如平滑肌細胞生長和纖維化)中有損傷性。本發(fā)明的一個實施方案包括給予患者可增加肺中特異型細胞(巨噬細胞)中的精氨酸酶、但降低肺中其它細胞(內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、平滑肌細胞)中的精氨酸酶的化合物。
與精氨酸酶I、精氨酸酶II、CAT2或ADAM8基因或蛋白相互作用或與其結(jié)合的分子的篩選本發(fā)明的其它實施方案提供篩選或鑒定能誘導或抑制精氨酸酶I基因和蛋白表達的蛋白、小分子或其它化合物的方法。此分析可通過離體使用轉(zhuǎn)形或非轉(zhuǎn)形細胞、永生細胞系或通過在體使用轉(zhuǎn)形哺乳動物細胞來進行。特別地，此分析以mRNA表達的增加或降低、精氨酸酶I蛋白水平的增加或降低或諸如腐胺或鳥氨酸等的精氨酸酶途徑產(chǎn)物表達水平的增加或降低為基礎(chǔ)，來確定精氨酸酶I基因或精氨酸酶I蛋白表達的增加或降低。此外，可以用來源于呼吸道的生物液體(如肺提取物、痰、支氣管肺泡灌洗液)或血液樣品(白細胞)來分析精氨酸酶活性，并隨后用于酶活性抑制劑的篩選。例如，對已知為表達精氨酸酶I多肽的分離細胞或轉(zhuǎn)化為表達精氨酸酶I多肽的分離細胞進行培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中加入一種或多種試驗化合物。給化合物一段充分長的時間來誘導或抑制精氨酸酶I的表達后，例如在0-72h內(nèi)的任意時間點或更長，可檢測出從已確立的基線開始的表達水平的任何變化。本發(fā)明的另一個實施方案提供一種鑒定能結(jié)合精氨酸酶I蛋白或直接與其相互作用的蛋白和其它化合物的方法。這些蛋白和化合物包括在體與精氨酸酶I相互作用的內(nèi)源性細胞組分，并因此能夠提供藥物的新目標；同時還包括具有精氨酸酶I結(jié)合能力的重組、合成和其它外源性化合物，并因此能夠成為抑制哮喘反應(yīng)的候選物質(zhì)。因此，在一系列實施方案中，高通量篩選(HTS)蛋白或DNA芯片、細胞裂解液或組織勻漿可用來篩選能夠與精氨酸酶I基因/蛋白、精氨酸酶II基因/蛋白、CAT2基因/蛋白、ADAM8基因/蛋白相結(jié)合的蛋白或其它化合物?？蛇x擇地，可對多種天然存在的和/或合成的外源性化合物中的任意化合物(例如小分子庫或肽庫)的精氨酸結(jié)合能力進行篩選。在各種實施方案中，為確定精氨酸酶I、精氨酸酶II、CAT2、ADAM8和其它部分的結(jié)合能力需進行分析。在這些分析中的精氨酸酶I、精氨酸酶II、CAT2、ADAM8可以是任何含有或來源于正常或突變精氨酸酶I蛋白的多肽，包括精氨酸酶I、精氨酸酶II、CAT2或ADAM8融合蛋白的功能區(qū)或抗原決定區(qū)?？梢酝ㄟ^非特異方法(例如，可以通過差異顯示、雙向凝膠電泳、差異雜交或SAGE方法檢測的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)變化、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變、其它下游基因表達的多肽產(chǎn)物或變化)或通過直接方法(如免疫共沉淀、生物分子間相互作用分析(BIAcore)或蛋白凝膠電泳變化方法)檢測結(jié)合能力。優(yōu)選的方法包含了以下技術(shù)的變體(1)通過親合性色譜直接提??；(2)通過免疫共沉淀共同分離精氨酸酶I組分和結(jié)合蛋白或其它化合物；(3)BIAcore分析；及(4)酵母雙雜交系統(tǒng)。本發(fā)明的另一個實施方案提供鑒定能夠改變正?；蜃儺惖木彼崦窱、精氨酸酶II、CAT2或ADAM8的活性的蛋白、小分子和其它化合物的方法。本發(fā)明的另一個實施方案是提供鑒定化合物的方法，該方法以化合物影響精氨酸酶I、精氨酸酶II、CAT2或ADAM8的表達、精氨酸酶I活性、其它精氨酸酶I調(diào)節(jié)的基因活性或與正?；蜃儺惥彼崦窱蛋白相互作用的蛋白活性的能力來進行的。對精氨酸酶I基因或精氨酸酶I蛋白具有活性的化合物的鑒定方法可通過使用正常細胞、重組細胞或使用本文所述的小鼠實驗性哮喘模型來進行。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的蛋白可作為合理化學設(shè)計的起點，來設(shè)計配體或其它類型的小化學分子。可選擇地，通過上述篩選方法鑒定的小分子或其它化合物在哺乳動物精氨酸酶I途徑的調(diào)節(jié)劑設(shè)計中可用作“先導化合物”。
精氨酸酶的檢測和定量可用于患者哮喘或過敏癥的診斷本發(fā)明的另一實施方案是通過測量個體的生物液體/組織(如肺、痰、支氣管肺泡灌洗液、血液、血漿、尿或鼻分泌物/洗液)中精氨酸酶水平來檢測個體哮喘的方法。精氨酸酶水平高于正常表明該個體患有哮喘。此外，精氨酸酶水平可以是具有診斷價值的表型標記。例如，精氨酸酶活性升高的患者很大程度上具有過敏性病因、近期過敏原暴露或疾病嚴重的可能性。
細胞因子與精氨酸酶I誘導間的關(guān)系如上所述，本發(fā)明的實施方案涉及發(fā)現(xiàn)了在哮喘中精氨酸酶I和精氨酸酶II的明顯上調(diào)，如下面的實施例8所示。精氨酸酶可催化反應(yīng)L-精氨酸+水→L-尿氨酸+尿素。已知的是精氨酸酶參與Krebs-Henseleit尿素循環(huán)并在哺乳動物肝臟中高度濃縮。此外，還發(fā)現(xiàn)信號-傳感器和催化劑轉(zhuǎn)錄6(STAT-6)依賴形式中的細胞因子白介素-4(IL-4)和細胞因子白介素-13(IL-13)能顯著誘導肺中的精氨酸酶I。如上所述，如下面的實例9所示，已發(fā)現(xiàn)IL-4和IL-13在激活炎癥和居宿效應(yīng)因子途徑中具有重要作用，因而可導致臨床上哮喘和過敏癥發(fā)病。因此，阻斷IL-4、IL-13、STAT6的藥物有可能降低精氨酸酶水平，從而對哮喘或過敏癥患者發(fā)揮治療作用。因此，在諸如血液、痰、肺液、活檢樣品等生物液體中的精氨酸酶活性的降低可以視為諸如糖皮質(zhì)激素或抗IL-4、抗IL-13或抗STAT6化合物的藥物陽性反應(yīng)的表現(xiàn)。
過敏性氣道炎癥反應(yīng)與肺腐胺產(chǎn)生的增加有關(guān)本發(fā)明的其它實施方案涉及發(fā)現(xiàn)了Th2細胞因子介導的過敏癥可能與明顯由精氨酸酶誘導的精氨酸代謝相關(guān)。為驗證在過敏癥肺中精氨酸酶下游產(chǎn)物為過表達，我們檢測了多胺腐胺(一種精氨酸酶依賴的精氨酸代謝物)。我們發(fā)現(xiàn)，當對全肺組織進行分析時，OVA致敏小鼠的腐胺水平顯著增加(在鹽水和OVA致敏的小鼠中分別為14.7±5.6和32±13nmol/g組織[P＜0.05])?？紤]到全肺的檢測，2倍的腐胺增加是非常明顯的。因氣道的炎癥反應(yīng)與肺腐胺產(chǎn)生的增加有關(guān)，所以本發(fā)明的一個實施方案是降低肺中腐胺的水平來為患有過敏癥肺的個體提供有效的治療。據(jù)此，本發(fā)明的一個實施方案是通過使用可降低肺中腐胺水平的組合物來治療過敏癥肺。此外，本發(fā)明的另一實施方案是通過檢測肺中腐胺的增加水平來鑒定和/或診斷過敏癥肺。
人哮喘中精氨酸酶的誘導實驗性小鼠哮喘模型中的結(jié)果被證明與人哮喘有關(guān)(圖10)。為將小鼠模型結(jié)果翻譯為人的結(jié)果，分析了哮喘患者和對照組患者的支氣管肺泡灌洗液細胞中的精氨酸酶I蛋白表達(實例13)。利用免疫組化方法，發(fā)現(xiàn)哮喘組中精氨酸酶I表達的細胞數(shù)量明顯增加(圖10)。在兩組中，免疫陽性細胞主要為有巨噬細胞形態(tài)特征的單核細胞。在哮喘組中出現(xiàn)少量的免疫陽性粒細胞。此外，精氨酸酶I正義探針的原位雜交顯示，與非哮喘肺(對照組)相比哮喘肺中的精氨酸酶ImRNA表達水平增加。哮喘肺中的精氨酸酶I陽性細胞包括上皮細胞及粘膜下細胞(如平滑肌細胞和滲透性髓樣細胞)。
CAT2參與實驗性哮喘的變化過程本發(fā)明的另一個實施方案涉及發(fā)現(xiàn)氨基酸轉(zhuǎn)運因子CAT2也通過精氨酸酶途徑參與哮喘的發(fā)病機制。為確定在哮喘肺中表達的是那種CAT的異構(gòu)體，我們通過PCR克隆肺中的CAT2cDNA(圖9)。我們隨后將PCR產(chǎn)物克隆到TA載體中(pCR2.1，Invitrogen，Inc)，并利用EcoRI(特異酶切外顯子8)和BamHI(特異酶切外顯子7)酶切插入片段(圖9)。所有對克隆插入片段的分析(n＝6)表明用BamHI酶切可得到所希望的片段，而用EcoRI不能。作為對照，來源于肝臟的cDNA通過EcoRI單酶切后可得到所希望的4kb載體及600和100bp插入產(chǎn)物片段，這表明為CAT2A異構(gòu)體。這些結(jié)果表明，過敏癥肺中的CAT2以高親合性的CAT2B異構(gòu)體為主。研究表明，來源于CAT2缺失小鼠的巨噬細胞的L-精氨酸的攝取降低95％，并且NO的產(chǎn)生也明顯降低(Nicholson et al.，J Biol Chem，27615881-5(2001))。為分析CAT2在實驗性哮喘中的作用，對CAT2缺失小鼠(和其同窩出生的對照小鼠)給予OVA誘導的實驗性哮喘處理。利用基因芯片檢測通過分析這些過敏原致敏后的小鼠轉(zhuǎn)錄譜，來篩選一大批可能的內(nèi)標。值得注意的是與野生型小鼠相比CAT2缺陷小鼠的過敏原誘導的基因產(chǎn)物水平降低6.8％。這些產(chǎn)物中的一種為CAT2本身，也驗證了基因組分析的可靠性。有趣的是，CAT2缺失小鼠誘導在過敏性氣道反應(yīng)中公知的關(guān)鍵分子(包括趨化因子TARC)(Lloyd et al.，J Exp Med，191265-74(2000)；Kawasaki et al.，J Immunol，1662055-62(2001))和15-脂質(zhì)氧化酶(Sigal et al.，J Lipid Mediat，675-88(1993)；Kuitert et al.，Thorax，511223-8(1996)；Bradding et al.，Am J Respir Grit Care Med，1511201-4(1995))的能力減弱。此外，CAT2缺失小鼠誘導小分子富含脯氨酸(SPR)蛋白2A(一種由上皮細胞分泌的分子，已知其對細胞外基質(zhì)的完整性起重要作用)的能力減弱(Cabral et al.，J Biol Chem，27619231-7(2001)；DeHeller-Milev et al.，Br J Dermatol，143733-40(2000))。對于每個基因，通過Northern blot分析確實了CAT2為適當?shù)倪^敏原誘導所必需的分子。盡管CAT2最初被描述為T細胞活化分子，但其在T細胞介導的免疫反應(yīng)中的作用此前仍未見報道(MacLeod et al.，J Exp Biol，196109-21(1994))。CAT2可能參與iNOS或精氨酸酶的可用底物關(guān)鍵性調(diào)節(jié)的第一個證據(jù)是對前炎癥分子(如脂多糖)調(diào)節(jié)CAT2表達的發(fā)現(xiàn)(MacLeod et al.，J Exp Biol，196109-21(1994))。最近發(fā)現(xiàn)，CAT2缺失的巨噬細胞的精氨酸攝取和NO合成能力明顯減弱，這有力地支持了CAT2在免疫反應(yīng)中的作用(Nicholson et al.，J Biol Chem，27615881-5(2001))。盡管通過CAT2的氨基酸轉(zhuǎn)運對與哮喘有關(guān)的生化途徑可能影響，但基因芯片分析被用于確定CAT2是否影響哮喘肺中的基因表達。確實我們發(fā)現(xiàn)在過敏原誘導基因(包括TARC和15-脂質(zhì)氧化酶以及編碼蛋白的基因)的選擇亞群中的減弱已證實其參與某些過敏性氣道反應(yīng)(Kawasaki et al.，JImnunol，1662055-62(2001)；Sigal et al.，J Lipid Mediat，675-88(1993)；Bradding et al.，Am J Respir Crit Care Med，1511201-4(1995))。CAT2可調(diào)節(jié)基因表達并通過多種機制在哮喘中發(fā)揮作用(包括對轉(zhuǎn)錄的直接影響或可選擇地通過級聯(lián)的下游生化信號事件介導的間接影響)。
降低或抑制肺中CAT2的方法可用于治療或預(yù)防哮喘或過敏癥由于CAT2在哮喘中的作用，通過能夠降低或抑制肺中CAT2的組合物可治療哮喘或過敏癥。例如，向肺給予CAT2抑制劑可能實現(xiàn)這一目的。也可通過向肺中給予CAT2基因序列的反義片段或給予能夠釋放這種反義片段的核酸載體序列來實現(xiàn)這一目的。任何能夠降低CAT2表達或功能的方法都可用于治療哮喘或過敏癥。
通過在特定組織中增加CAT2來治療哮喘或過敏癥本發(fā)明的另一個實施方案包括在患者特定的組織中增加CAT2的水平來提供與通過eNOS產(chǎn)生的氣管舒張劑NO有關(guān)的保護反應(yīng)。這涉及到增加CAT2水平或功能會增加NO合成的事實。本發(fā)明的一個實施方案包括給予患者能夠增加肺特定細胞(如內(nèi)皮細胞)中的CAT2水平而降低肺其它細胞中的精氨酸酶的化合物。
ADAM-8與哮喘的關(guān)系本發(fā)明的另一個實施方案涉及發(fā)現(xiàn)了在特殊哮喘模型中的ADAM-8(也稱CD156)的誘導，該模型是通過用氣源性過敏原煙曲霉菌重復(fù)粘膜過敏原致敏所誘導的。已鑒定ADAM-8作為與抗原誘導的氣道炎癥有關(guān)的遺傳程序的一部分，并與特異參與其表達調(diào)節(jié)的信號分解有關(guān)。通過向肺中傳輸IL-4和IL-13可明顯增加ADAM-8的表達，而且這種誘導作用很大程度上是STAT-6非依賴的。因此，減少患者ADAM-8水平的治療預(yù)計能產(chǎn)生有益的治療效果。此外，通過患者ADAM-8水平增加的發(fā)現(xiàn)可診斷哮喘和過敏癥，其中這種增加的水平是哮喘或過敏癥的提示。ADAM-8屬于ADAM(一種去整合蛋白和金屬蛋白酶)家族中的I型跨膜蛋白(Yamamoto，S.，Higuchi，Y.，Yoshiyama，K.，Shimizu，E.，Kataoka，M.，Hijiya，N.，and Matsuura，K.1999.ADAM family proteins inthe immune system.Immunol Today 20278-284)。盡管ADAM 1～ADAM 7主要在生殖器官中表達并在精卵融合和精子發(fā)生中發(fā)揮重要作用，但此家族的其它成員表達更加廣泛。已證實ADAM家族的特殊成員(ADAM-10和ADAM-17)在免疫系統(tǒng)中的作用，其中它們參與了細胞表面TNF-α前體形式的發(fā)展。ADAM-8在免疫系統(tǒng)中的作用與其相似。這種蛋白從巨噬細胞的cDNA庫中被鑒定，并記錄在小鼠和人的PMN和巨噬細胞中(Yoshiyama，K.，Higuchi，Y.，Kataoka，M.，Matsuura，K.，andYamamoto，S.1997.CD 156(human ADAM8)expression，primary aminoacid sequence，and gene location.Genomics 4156-62)。在肝臟和腎臟中表達ADAM-8細胞外組分的轉(zhuǎn)基因小鼠研究顯示，在噁唑酮介導的接觸超敏性后有中性粒細胞滲出。研究還表明，LPS和IFN-γ誘導后ADAM-8基因表達上調(diào)(Kataoka，M.，Yoshiyama，K.，Matsuura，K.，Hijiya，N.，Higuchi，Y.，and Yamamoto，S.1997，Structure of the murine CD 156 gene，characterization of its promoter.and chromosomal location.J.Biol.Chem.27218209-18215)。然而，ADAM-8在過敏癥中的作用機制至今并不清楚。盡管上述的基因芯片包括ADAM家族的18個成員，但只有一個ADAM基因被明顯誘導表達。與鹽水處理小鼠比較，重復(fù)鑒定表明這個基因在每個過敏原處理的小鼠中高水平表達。此外，因ADAM家族成員的I型跨膜蛋白具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用(如細胞表面TNF-α前體的蛋白水解過程)(Black，R.A.，Rauch，C.T.，Kozlosky，C.J.，Peschon，J.J.，Slack，J.L.，Wolfson，M.F.，Castner，B.J.，Stocking，K.L.，Reddy，P.，Srinivasan，S.，et al.1997.A metalloproteinase disintegrin that releases tumour-necrosisfactor-alpha from cells.Nature 385729-733)，這種分子代表實驗性哮喘中的可能的重要途徑。與其在肺、脾、睪丸中的低水平的基礎(chǔ)性表達比較，隨后的Northern blot分析進一步肯定了ADAM-8是由過敏原致敏誘導的。
哮喘特定模型中ADAM-8的誘導我們對ADAM-8與實驗性哮喘模型的關(guān)系是否限定于使用OVA的特定模型進行了驗證。據(jù)此，我們通過鼻腔內(nèi)給予重復(fù)劑量的抗原煙曲霉菌來誘導實驗性哮喘模型(Huang，w.W.，Garcia-Zepeda，E.A.，Sauty，A.，Oettgen，H.C.，Rothenberg，M.E.，and Luster，A.D.1998.Molecular and biological characterization of the murine Leukotriene B4receptor expressed on eosinophils.J Exp.Med.1881063-1074.)。值得注意的是，這種模型并沒有使用腹腔內(nèi)致敏，并且煙曲霉菌是普遍通用的氣源性過敏原。鼻腔內(nèi)給予9次劑量的煙曲霉菌18h后，肺總RNA用來作Northern blot分析和用作ADAM-8的探針。與9次劑量的鼻腔內(nèi)鹽水致敏的小鼠比較，煙曲霉菌致敏小鼠的ADAM-8mRNA表達明顯增加，因此過敏原致敏對ADAM-8的誘導對所用的抗原不具特異性，而是參與實驗性哮喘的遺傳程序的基因(圖6和表1)。
ADAM-8表達調(diào)控鑒定ADAM-8為過敏性氣道反應(yīng)的新基因后，我們對參與ADAM-8調(diào)節(jié)的分子進行了研究。因過敏癥的主要特征是諸如IL-4和IL-13等Th2細胞因子的過度表達，于是我們對這些細胞因子是否直接誘導ADAM-8的表達進行了檢測。為驗證這一假說，我們檢測了肺中特異IL-4過度表達的轉(zhuǎn)基因小鼠中的ADAM-8表達。與野生型小鼠比較，IL-4肺轉(zhuǎn)基因小鼠的ADAM-8mRNA表達明顯升高。于是我們檢測了在肺中給予IL-13對ADAM-8的誘導能力。與鹽水處理的動物比較，通過鼻腔內(nèi)途徑將IL-13向肺給藥可誘導ADAM-8mRNA表達水平的升高。IL-4和IL-13共用通用的受體信號途徑，該途徑包括STAT-6依賴和非依賴的受體后事件。因此我們對STAT-6在ADAM-8誘導中是否是必需的進行了分析。為驗證這一假說，我們對STAT-6野生型或缺失型的IL-4肺轉(zhuǎn)基因小鼠中的ADAM-8表達進行了分析。有趣的是，Northern blot分析表明，IL-4誘導的ADAM-8表達很大程度上是STAT-6非依賴性的。
通過改變肺中ADAM-8的表達水平來治療哮喘或過敏癥據(jù)此，本發(fā)明的另一個實施方案是通過給予患者能夠降低患者中ADAM-8水平的組合物來治療哮喘或過敏癥的方法。例如，可通過向肺中給予ADAM-8基因序列的反義片段或給予能夠釋放這種反義片段的核酸載體序列來實現(xiàn)這一目的。任何能夠降低ADAM-8表達的方法都可用于治療哮喘或過敏癥。此外，患者中ADAM-8水平或基因序列的多樣性檢測和定量分析可用于診斷哮喘或過敏癥的存在或嚴重程度。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不脫離本發(fā)明的精神下可作出多種不同的改變。結(jié)合下面的具體實施例可對本發(fā)明有更加全面的理解，本文提供的實施例僅是為了說明本發(fā)明而不意圖限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1小鼠實驗性哮喘的誘導從國家癌癥研究所(National Cancer Institute，F(xiàn)rederick，MD)獲得Balb/c小鼠，并在無病原體的條件下飼養(yǎng)。哮喘模型按如下過程誘導在第0天和第14天腹腔注射OVA和1mg氫氧化鋁(明礬)，隨后在第24天和第27天鼻腔內(nèi)給予OVA或鹽水致敏(在促進蛋白向肺內(nèi)釋放的條件下)，煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus)抗原誘導的哮喘是在麻醉小鼠鼻腔內(nèi)重復(fù)使用這種蛋白超過3周的過程中誘導的，見如下的報道Huang，W.W.，Garcia-Zepeda，E.A.，Sauty，A.，Oettgen，H.C.，Rothenberg，M.E.，and Luster，A.D.1998.Molecular and biological characterization of themurine Leukotriene B4 receptor expressed on Eosinophils.J.Exp.Med.1881063-1074及Mishra，A.，Weaver，T.E.，Beck，D.C.，and Rothenberg，M.E.2001.Interleukin-5-mediated allergic airway in flammation inhibits thehuman surfactant protein C promoter in transgenic mice.J.Biol.Chem.2768453-8459。
實施例2RNA的制備和芯片雜交根據(jù)制造商的指導，使用Trizol試劑提取RNA。用Trizol純化后，用苯酚-氯仿提取法和乙醇沉淀法再次純化RNA。通過兒童醫(yī)院醫(yī)療中心的AFFYMETRIX基因芯片中心設(shè)備進行芯片雜交。簡單講，先用Agilent生物分析儀(Agilent technologies，Palo Alto，CA)對RNA的質(zhì)量進行分析，只有28S/18S比值為1.3-2的樣品才能在隨后的試驗中使用。通過用于cDNA合成的Superscript選擇(Invitrogen，Carlsbad，CA)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后使用Enzo High Yield RNA轉(zhuǎn)錄標記試劑盒(Enzodiagnostics，F(xiàn)armingdale NY)將其反轉(zhuǎn)錄為生物素化的cRNA。與小鼠U74Av2基因芯片(Affymetrix，Santa Clara，CA)雜交后，通過射流系統(tǒng)自動沖洗基因芯片，并用鏈親霉素-藻紅蛋白(streptaVidin-phycoerythrin)染色。用Hewlett Packard GeneArray掃描儀對芯片進行掃描。此分析按每個芯片一只小鼠進行(每個過敏原致敏組n≥3；每個鹽水致敏對照組n≥2)。
實施例3Northern blot與RT-PCR分析從野生型Balb/c小鼠的肺中、從含STAT-6野生型或缺失基因拷貝(Shimoda et al.，Nature，380630-3(1996))的IL-4Clara細胞10肺轉(zhuǎn)基因小鼠(Rankin et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America，937821-7825(1996))的肺中以及從用鹽水或重組小鼠IL-13處理(此前有報道，Yang et al.，Am J Respir Cell Mol Biol，25522-30(2001)；Pope et al.，J Allergy Clin Immunol，108594-601(2001))的小鼠肺中提取RNA。通過PCR產(chǎn)生的或商業(yè)銷售載體(從美國組織培養(yǎng)保藏中心(American Tissue Culture Collection)獲得的圖像集，Rockville，MD or Incyte Genomics，Palo Alto，CA)制備的cDNA探針被測序驗證、用32P進行放射性標記，并在常規(guī)條件下雜交。利用基因特異引物通過的常規(guī)方法以肺cDNA為模板進行RT-PCR。
實施例4數(shù)據(jù)分析針對基因芯片的數(shù)據(jù)圖像文件，利用Microarray Analysis SuiteVersion 4軟件(Affymetrix)中的算法，對基因的轉(zhuǎn)錄水平進行分析。為比較芯片與芯片間的基因進行全比例縮放(Global scaling)，因此每個芯片標準化到一個任意值(1500)。每個基因通常由一組16-20個探針對代表。每個探針對由完全匹配的寡核苷酸和在中心位置含一個不匹配堿基的不匹配寡核苷酸組成。使用完全稱謂和平均差異(absolute call and averagedifference)兩種基因表達的檢測方法。完全稱謂是一種定性檢測方法，其中根據(jù)RNA與探針組的雜交信號，將每個基因指定為表達、邊緣或不表達的稱謂。平均差異是一種基因表達水平的定量檢測方法，其中利用每個探針對中完全匹配和不匹配間的差異并平均全部探針組的差異來計算。還通過GeneSpring軟件(Silicon Genetics，Redwood City，CA)對用鹽水和OVA處理的小鼠間的差異進行了分析。將每個過敏原致敏的時間點數(shù)據(jù)標準化為鹽水處理小鼠的平均值。將P＜0.05且＞2倍變化的基因列于基因表中。通過GenBank從未知的表達序列標簽中確定cDNA的名稱。根據(jù)從NetAfix服務(wù)器(www.netaffx.com)獲得的基因存在論分類方法(GeneOntology classification)(Ashbumer，2000 #2003)和GenBank中的公共信息進行功能分類。通過Student′s非配對t檢驗對試驗組的平均值差異的顯著性進行分析。數(shù)值以平均值±平均值的標準誤差(SEM)來表示。當P＜0.05時，認為平均值具有顯著性差異。
實施例5體積描記法檢測通過大氣壓體積描記法使用Buxco(Troy，NY)提供的儀器和軟件，分析清醒的無限制的小鼠中甲膽堿的氣道反應(yīng)性。此系統(tǒng)能夠產(chǎn)生用于經(jīng)驗地監(jiān)測氣道功能的所謂增強脈沖(Penh)的無因次參數(shù)，該參數(shù)通過與早期、晚期呼吸的定時比較相結(jié)合的體積描記室來反應(yīng)壓力信號的波形變化。根據(jù)Yang，M.等(Am J Respir Cell Mol Biol 25，522-30(2001))和Hamelmann，E.等(American Journal of Respiratory & Critical CareMedicine 156，766-75(1997))所述的方法進行檢測。簡單講，將小鼠放入室中，讀取基線值并平均3分鐘內(nèi)的值。將霧化的甲膽堿(溶液中的濃度范圍為3.125-50mg/ml)從入口釋放入室中達2分鐘，然后平均每次給藥劑量3分鐘時間段內(nèi)的讀數(shù)。
實施例6精氨酸酶活性和腐胺水平的檢測根據(jù)Wei，L.H.，et al.，Proc Natl Acad Sci U S A 98，9260-4.(2001)；Li，H.et al.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 282，R64-R69.(2002)；Wei，L.H.et al.，Am J Physiol Cell Physiol 279，C248-56.(2000)中所建立的技術(shù)，利用血液尿素氮試劑(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)對精氨酸酶活性進行檢測。酸提取后的腐胺水平通過離子對反相高效液相色譜進行檢測。
實施例7通過原位雜交定位精氨酸酶I mRNA為確定精氨酸酶I mRNA的細胞分布，進行了原位雜交分析。在第二次鹽水或過敏原致敏后的第18h分析組織。為制備探針，先將質(zhì)粒pCMV-SPORTT6(Incyte Genomics，St.Louis，MO)中的小鼠精氨酸酶IcDNA通過EcoRI或NotI酶切線性化。分別通過T7和T3 RNA聚合酶(Riboprobe Gemini Core System II轉(zhuǎn)錄試劑盒；Promega，Madison，WI)生成反義和正義RNA探針。通過可控制的堿性水解將放射性標記的[αS35-UTP]探針還原到200個堿基的平均長度。對兩種劑量的OVA或鹽水致敏的OVA/明礬敏感小鼠中的精氨酸酶I反義(AS)和正義(S)探針的雜交信號進行檢測。在高度嚴格的條件下沖洗雜交玻片。以鹽水致敏肺的反義和正義探針雜交信號為對比背景。
實施例8精氨酸酶I表達的分析在一次致敏后第3小時或者一次或兩次致敏后的第18小時，通過上述基因芯片的分析方法來檢測編碼精氨酸代謝酶精氨酸酶I和iNOS的基因表達。此外，精氨酸酶I和iNOS表達的Northern blot分析表明，OVA-誘導的過敏癥使得在第3小時時精氨酸酶I沒有顯著的表達，但在第18小時時有相當?shù)谋磉_，當進行最初的兩次致敏時第18小時出現(xiàn)高水平表達。相比而言，在iNOS的Northern blot檢測中，未見其表達。通過血液尿素氮試劑檢測在鹽水和OVA致敏的小鼠肺中的精氨酸酶在肺裂解液中的活性。作為對照，鹽水和OVA致敏的小鼠在肝臟中的精氨酸酶活性分別為1522±183和1390±78。
實施例9IL-4和IL-3相關(guān)的精氨酸酶I的分析為揭示肺中誘導精氨酸酶的哮喘相關(guān)信號，本研究集中于確定精氨酸酶I是否為Th2細胞因子IL-4和IL-13的下游信號。對IL-4肺轉(zhuǎn)基因小鼠和IL-13處理的肺中的精氨酸酶I做Northern blot分析。與野生型小鼠比較，IL-4肺轉(zhuǎn)基因小鼠的精氨酸酶I表達水平明顯增加。此外，與鹽水處理的動物比較，對肺的IL-13藥理性給藥可增加精氨酸酶I的mRNA水平。IL-4與IL-13具有部分相似的信號需要，如使用IL-4Rα鏈及誘導雙面(janus)激酶1和信號傳感器和轉(zhuǎn)錄催化劑(STAT)6。為證明精氨酸酶I的誘導是否具有STAT6依賴性，對含野生型或基因靶的STAT6的IL-4肺轉(zhuǎn)基因小鼠進行分析。發(fā)現(xiàn)IL-4誘導的精氨酸酶I表達具有STAT-6依賴性。此外，發(fā)現(xiàn)過敏原誘導的精氨酸酶I誘導也具有STAT-6依賴性。這些研究結(jié)果與離體條件下巨噬細胞中IL-4和IL-13誘導精氨酸酶的能力一致，因而限制了NOS依賴的NO的合成。這些發(fā)現(xiàn)不能否定氧化氮在哮喘中的作用，相反我們認為精氨酸的代謝很大程度上依賴哮喘肺中的精氨酸酶。最近的發(fā)現(xiàn)支持了這一觀點，即在與小鼠Th1和Th2相關(guān)的肉芽腫反應(yīng)中，NOS和精氨酸酶分別有不同的調(diào)節(jié)途徑。
實施例10IL-4的過表達可在體內(nèi)有效誘導肺精氨酸酶由于哮喘是與Th2細胞相關(guān)的發(fā)展過程，并且已證實IL-4在多種離體細胞系(如巨噬細胞、平滑肌細胞)中能夠誘導精氨酸酶(Munder，M.et al.J Immunol 163，3771-7(1999)；Wei，L.H.，et al.，Am J Physiol CellPhysiol 279，C248-56(2000))，我們對IL-4的過表達、特別是在肺中的過表達足以誘導精氨酸酶的假說進行了研究。肺上皮細胞IL-4過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠(在Clara細胞的10個啟動子的控制下)具有多種哮喘特征，包括嗜伊紅炎癥細胞侵潤、粘液產(chǎn)生、基線氣道狀態(tài)變化的(Rankin，J.A.et al.Proc.Nat.Acad.Sci U.S.A.93，7821-7825(1996))。我們假定IL-4轉(zhuǎn)基因能夠誘導精氨酸酶mRNA的表達。實際上，IL-4肺轉(zhuǎn)基因小鼠能使兩種精氨酸酶異構(gòu)體的mRNA的表達水平明顯增加。此外，在IL-4肺轉(zhuǎn)基因小鼠中CAT2也同時被誘導。
實施例11IL-13在期限內(nèi)可快速誘導與氣道高反應(yīng)性(AHR)有關(guān)的精氨酸酶為驗證肺精氨酸酶是否也由IL-13(一種細胞因子，已證明其在實驗性哮喘幾種特征的形成中起關(guān)鍵作用(Wills-Karp，M.，J AllergyClin Immunol 107，9-18(2001)；Grunig，G.et al.Science 282，2261-3(1998))誘導，并在離體細胞系中誘導精氨酸酶的表達(Wei，L.H.，et al.，Am JPhysiol Cell Physiol 279，C248-56(2000)；Rutschman，R.et al.J Immunol166，2173-7(2001))，我們對麻醉小鼠進行IL-13鼻腔內(nèi)重復(fù)給藥。此試驗方法可誘導包括嗜伊紅細胞炎癥反應(yīng)、化學運動的誘導、粘液產(chǎn)生和AHR在內(nèi)的多種實驗性哮喘特征(Grunig，G.et al.Science 282，2261-3(1998)；Yang，M.et al.Am J Respir Cell Mol Biol 25，522-30(2001))。與鹽水處理的對照小鼠比較，給予IL-13可誘導精氨酸酶I mRNA的表達水平。與IL-4轉(zhuǎn)基因小鼠增加精氨酸酶II mRNA的表達水平的結(jié)果相一致，IL-13也可增加精氨酸酶II mRNA的表達水平。氣管內(nèi)給予IL-13一次在12h內(nèi)可明顯誘導AHR；IL-13誘導的AHR反應(yīng)先于白細胞向氣道的聚集(Yang，M.et al.Am J Respir CellMol Biol 25，522-30(2001)，這表明IL-13誘導早期AHR的能力與白細胞的侵潤無關(guān)。因此，進行了IL-13對精氨酸酶誘導的動力學分析。顯然，在給予一次劑量的IL-13后，I型同功酶mRNA在12小時的時間點有誘導(圖8A)；而II型異構(gòu)體則為基礎(chǔ)表達，只有較小程度的誘導。在早期AHR發(fā)展中可以檢測到精氨酸酶的誘導表達。精氨酸酶和AHR的早期誘導先于白細胞聚集(Yang，M.et al.，supra)。我們推測，IL-13對AHR的誘導可能與精氨酸酶通過底物消耗而功能性地抑制氣管舒張劑NO的合成的能力有關(guān)(Morris，S.M.，Jr.Annual Review of Nutrition 22，87-105(2002)和Mills，C.D.Crit Rev Immunol 21，399-425(2001))。
實施例12在體肺精氨酸酶的誘導主要為STAT6依賴性IL-4和IL-13具有相似的信號需要，如使用IL-4Rα鏈及janus激酶1和STAT6的誘導等。研究表明，它們反應(yīng)中的一部分為STAT6依賴型(Shimoda，K.et al.Nature 380，630-3(1996)；Ihle，J.N.Curr Opin CellBiol 13，211-7(2001))。為驗證STAT6對在體精氨酸酶I的誘導作用，我們對包括野生型或基因靶的STAT-6的IL-4肺轉(zhuǎn)基因小鼠進行了研究。盡管IL-4肺轉(zhuǎn)基因小鼠含有豐富的精氨酸酶I mRNA，但缺失STAT6將使IL-4對精氨酸酶I mRNA的誘導作用完全喪失。有趣的是，STAT6缺失的小鼠中，IL-4轉(zhuǎn)基因誘導的精氨酸酶II mRNA信號只被部分抑制(不是全部)，這顯示出精氨酸酶II與精氨酸酶I相比其主要是STAT6非依賴的。這些發(fā)現(xiàn)支持了離體研究的結(jié)果，該研究發(fā)現(xiàn)這兩種同功酶有不同的信號需要(Morris，S.M.，Jr.Annual Review of Nutrition 22，87-105(2002))。以下的試驗用于驗證過敏原誘導的精氨酸酶是否為STAT6依賴型。此研究將確定過敏原誘導的精氨酸酶在IL-4和IL-13信號途徑的下游是否占主導地位。很明顯，STAT6缺失的小鼠在過敏原誘導的肺精氨酸酶活性上降低了90％(圖8B)，這顯示出精氨酸酶I在哮喘肺中是誘導的主要酶類型。綜合上述結(jié)果，這些發(fā)現(xiàn)表明在過敏原肺炎癥反應(yīng)中精氨酸酶的誘導很大程度上是IL-4、IL-13和STAT6的下游。這些結(jié)果與近來發(fā)現(xiàn)的IL-4和IL-13在巨噬細胞中通過STAT6-依賴途徑抑制NO合成的結(jié)果一致(Rutschman，R.et al.J Immunol 166，2173-7(2001)。與這些發(fā)現(xiàn)相一致的是，小鼠精氨酸酶I啟動子含有一個對IL-4反應(yīng)所必需的STAT6位點(Morris，S.M.，Jr.Annual Review of Nutrition 22，87-105(2002)。
實施例13人支氣管肺泡灌洗液細胞的分析如之前的報道(Olivenstein et al.，J Allergy Clin Immunol 103，238-45(1999))，在經(jīng)過敏性哮喘患者(12周未服用糖皮質(zhì)激素)和健康對照者同意后，對他們進行支氣管鏡的檢查。通過1/100稀釋的小鼠IgG1抗人精氨酸酶I單克隆抗體(BD Biosciences)對涂片(經(jīng)甲醇/丙酮固定后)進行染色，實施免疫組化分析。按Hamid，Q.Immunohistochemistry.inAllergy and Allergic Disease，1775-778(Blackwell Science Ltd，London，1997)所述的方法，在快紅(Fast Red)(Sigma Chemical)中，有左旋咪唑(levamisole)存在下處理玻片。在陰性對照制備中，用鹽水或非免疫小鼠IgG1代替一抗。隨機分析細胞涂片上的最少1000個細胞來進行陽性細胞記數(shù)，結(jié)果以陽性細胞占總細胞百分比表示。
實施例14過敏癥標記基因的確定通過腹腔內(nèi)注射給予50μg卵清蛋白(OVA grade V；SIGMAA-5503)和1mg硫酸鉀鋁佐劑(明礬AlK(SO4)2-12H2O；SIGMAA-7210)使小鼠致敏兩次，兩周一次。在每次胃內(nèi)致敏之前，將小鼠禁食3-4h。一周三次，將小鼠置于仰臥姿勢，口服給予溶解在250μl 0.9％的無菌鹽水中的OVA。用胃內(nèi)給食針(22G-1.5in-1.25mm ball；Fisher 01-290-2B)致敏?？诜旅艉螅^測1h內(nèi)小鼠的腹瀉情況。在Trizol提純后，用苯酚-氯仿提取液和乙醇沉淀來再次純化RNA。其后，將從4只鹽水處理和4只OVA致敏小鼠得到的純化RNA(10OVA或鹽水致敏后90分鐘內(nèi)獲得)合并在一起，并通過兒童醫(yī)院醫(yī)療中心的Affymetrix基因芯片中心設(shè)備進行處理。簡單講，先用Agilent生物分析儀(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)分析RNA的質(zhì)量，只有28S/18S的比值在1.3-2之間的樣品才能在隨后的試驗中使用。通過用于cDNA合成的Superscript選擇(Invitrogen，Carlsbad，CA)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后使用Enzo High Yield RNA轉(zhuǎn)錄標記試劑盒(Enzo diagnostics，F(xiàn)armingdale NY)將其反轉(zhuǎn)錄為生物素化的cRNA。與小鼠U74Av2基因芯片(Affymetrix，Santa Clara，CA)雜交后，通過射流系統(tǒng)自動沖洗基因芯片，并用鏈親霉素-藻紅蛋白染色。用Hewlett Packard GeneArray掃描儀對芯片進行掃描。針對基因芯片的數(shù)據(jù)圖像文件，利用Microarray Analysis Suite Version 4軟件(Affymetrix)中的算法，對基因的轉(zhuǎn)錄水平進行分析。使用完全稱謂和平均差異兩種基因表達的檢測方法。完全稱謂是一種定性檢測方法，其中根據(jù)RNA與探針組的雜交信號，將每個基因指定為表達、邊緣或不表達的稱謂。平均差異是一種基因表達水平的定量檢測方法，其中利用每個探針對中完全匹配和不匹配間的差異并平均全部探針組的所有差異來計算。還通過GeneSpring軟件(Silicon Genetics，Redwood City，CA)對用鹽水和OVA處理的小鼠間的差異進行了分析。將數(shù)據(jù)標準化為鹽水處理小鼠的平均值。將P＜0.05且＞2倍變化的基因列于基因表中(使用雜交信號中表達稱謂的基因)。隨后，將基因表中哮喘“標記”基因和GI過敏癥“標記”基因疊加得出一組公用的一般性“過敏癥”標記基因。
實施例15離體和在體NOHA對肺精氨酸酶的抑制IL-4肺轉(zhuǎn)基因小鼠具有顯著升高的肺精氨酸酶mRNA水平和活性，并被用來觀察離體和在體NOHA的作用(圖11)。在圖11A中，顯示了用NOHA孵育的IL-4肺轉(zhuǎn)基因小鼠肺裂解液及不同劑量的NOHA(x軸)和精氨酸條件下的精氨酸酶活性變化。在圖11B中，顯示了IL-4肺轉(zhuǎn)基因小鼠用氣管內(nèi)NOHA處理(兩種劑量10和100mcg)及4h后肺精氨酸酶活性的分析結(jié)果。如圖所示，當IL-4肺轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)氣管內(nèi)NOHA處理后，NOHA可有效地降低肺裂解液中精氨酸酶的活性。
實施例16用抗精氨酸酶化合物治療患者鑒定患有哮喘的患者。給予患者治療有效劑量的N(ω)-羥基-L-精氨酸來降低哮喘的癥狀。吸入這種化合物后，患者的哮喘癥狀減輕。
實施例17調(diào)節(jié)精氨酸酶下游產(chǎn)物的其它化合物二氟甲基鳥氨酸(DFMO)為ODC的抑制劑，并預(yù)期可在抑制哮喘或過敏癥的治療中發(fā)揮作用。其它可能有用的化合物包括但不限于有可能抑制哮喘癥狀的N(ω)-羥基-L-精氨酸及諸如2(S)-氨基-6-二羥硼己酸(ABH)和S-(2-二羥硼乙基)-L-半光氨酸(BEC)的硼酸基過渡態(tài)類似物。其它的抑制劑是由Que等(Nitric Oxide.2002Feb；6(1)1-8)所公開的那些。
實施例18精氨酸酶途徑抑制劑DFMO對免疫發(fā)病機制的作用對精氨酸酶途徑中的下游精氨酸酶作用的阻斷對小鼠實驗性哮喘有重要的作用。DFMO是一種可阻斷鳥氨酸脫羧酶(ODC)作用的不可逆抑制劑，該作用為催化前體分子鳥氨酸合成腐胺的生化步驟。DFMO是一種商業(yè)銷售的藥物(Sigma and llex Oncology，Inc)，已在包括小鼠在內(nèi)的很多物種中進行了充分的研究(Prakash，et al(1978)Cancer Res 383059-3062；Meyskens and Gerner(1999)Clin.Cancer Res 5945-951)。
實施例19在實驗性哮喘小鼠模型中進行哮喘誘導后給予精氨酸酶途徑抑制劑DFMO的作用一旦在患者肺中建立其作用機制，可阻斷肺中精氨酸酶途徑的試劑可用于緩解或降低哮喘的作用。為驗證阻斷精氨酸酶途徑是否起作用，通過常規(guī)方法將精氨酸酶途徑活性示例性抑制劑DFMO給予患者。我們發(fā)現(xiàn)，與經(jīng)鹽水處理的患者比較，接受DFMO的患者表現(xiàn)出較低的哮喘作用。
實施例20給予精氨酸酶I抑制劑NOHA對過敏原誘導的氣道高反應(yīng)性發(fā)展的作用通過大氣壓體積描記法使用Buxco(Troy，NY)提供的儀器和軟件，分析清醒的無限制的小鼠中甲膽堿的氣道反應(yīng)性。此系統(tǒng)能夠產(chǎn)生用于經(jīng)驗地監(jiān)測氣道功能的所謂增強脈沖(Penh)的無因次參數(shù)，該參數(shù)通過與早期、晚期呼吸的定時比較相結(jié)合的體積描記室來反應(yīng)壓力信號的波形變化。根據(jù)Yang，M.等(Am J Respir Cell Mol Biol25，522-30(2001)和Hamelmann，E.等(American Journal of Respiratory & Critical CareMedicine 156，766-75(1997))所述的方法進行檢測。簡單講，將小鼠放入室中，讀取基線值并平均3分鐘內(nèi)的值。將霧化的甲膽堿(溶液中的濃度范圍為3.125-50mg/ml)從入口釋放入室中達2分鐘，然后平均每次給藥劑量3分鐘時間段內(nèi)的讀數(shù)。為研究NOHA的作用，在IL-4/IL-5轉(zhuǎn)基因肺(經(jīng)Penh檢測證實其氣道高反應(yīng)性得到提高)中經(jīng)氣管給予NOHA(100mcg)，并記錄4h后的Penh檢測結(jié)果(圖12)。作為對照，列出了未處理的IL4/IL5肺轉(zhuǎn)基因小鼠的Penh值。盡管在此已經(jīng)充分完全地描述了本發(fā)明所包括的優(yōu)選實施方案，但本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員應(yīng)該理解在不脫離本發(fā)明精神下可做出各種修改。因此，盡管以某些特定的優(yōu)選實施方案說明了本發(fā)明，但本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員參照本文的說明所做出的其它顯而易見的實施方案也在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍僅由所附的權(quán)利要求及其等價物所限定。
權(quán)利要求
1.能夠降低參與精氨酸代謝的蛋白產(chǎn)生的化合物在制備用于治療哮喘或過敏癥的藥物中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的蛋白選自CAT2、精氨酸酶I和精氨酸酶II。
3.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的分子通過抑制編碼所述蛋白的基因來降低所述蛋白的產(chǎn)生。
4.如權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述的化合物是N(ω)-羥基-L-精氨酸(NOHA)。
5.如權(quán)利要求1所述的化合物，其混合有藥學上可接受的載體。
6.一種檢測患有哮喘或過敏癥的患者的方法，包括測量參與所述患者中精氨酸代謝的至少一種基因產(chǎn)物的水平；測量參與精氨酸代謝的至少一種基因產(chǎn)物的遺傳多樣性(表達或基因序列)；及將所述的測量結(jié)果與對照個體的測量結(jié)果進行比較，其中與對照個體相比所述的至少一種基因表現(xiàn)出較高水平的患者被確定為患有哮喘或過敏癥。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的至少一種基因選自CAT2、精氨酸酶I和精氨酸酶II。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的產(chǎn)物是mRNA。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述的產(chǎn)物是蛋白。
10.一種鑒定可能患有哮喘或過敏癥的個體的方法，包括鑒定仍沒表現(xiàn)出哮喘或過敏癥癥狀的個體，測量精氨酸酶途徑中基因產(chǎn)物的水平；及將所述的產(chǎn)物水平與對照個體的測量結(jié)果進行比較，其中所述產(chǎn)物表現(xiàn)出較高水平的患者被確定為可能患有哮喘或過敏癥。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中精氨酸酶途徑中的所述基因選自精氨酸酶I、精氨酸酶II和CAT2。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的產(chǎn)物是mRNA。
13.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的產(chǎn)物是蛋白。
14.一種治療哮喘或過敏癥患者的方法，包括鑒定需要哮喘或過敏癥治療的個體；及給予所述患者能夠降低ADAM8蛋白的活性的分子。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的分子可改變ADAM8的結(jié)構(gòu)。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的分子將ADAM8從跨膜形式轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙庑问健?br> 17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的分子通過抑制編碼ADAM8蛋白的基因來降低ADAM8蛋白的活性。
18.如權(quán)利要求14所述的方法，還包括給予能夠降低或抑制肺白介素-4或白介素-13水平的化合物。
19.一種治療哮喘或過敏癥患者的方法，包括鑒定需要哮喘或過敏癥治療的個體；及給予所述患者能夠降低SPRR2A、SPRR2B或相關(guān)SPRR家族成員蛋白的活性的分子。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的分子通過抑制編碼SPRR2A蛋白的基因來降低SPRR2A蛋白的活性。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的分子通過抑制編碼SPRR2B蛋白的基因來降低SPRR2B蛋白的活性。
22.一種檢測可能發(fā)展為哮喘的患者的方法，包括提供所述患者的生物樣品；及檢測所述生物樣品中如表1所示的基因亞組的表達水平，其中與對照生物樣品相比，所述基因亞組表達水平的提高表明所述患者發(fā)展為哮喘的可能增加。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的亞組包含如表1所示基因的至少1％。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的亞組包含如表1所示基因的至少30％。
25.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的亞組包含如表1所示基因的至少50％。
26.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的亞組包含如表1所示基因的至少80％。
27.一種檢測可能發(fā)展為過敏癥的患者的方法，包括提供所述患者的生物樣品；及檢測所述生物樣品中如表2所示的基因亞組的表達水平，其中與對照生物樣品相比，所述基因亞組表達水平的提高表明所述患者發(fā)展為過敏癥的可能增加。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述亞組包含如表2所示基因的至少1％。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述亞組包含如表2所示基因的至少30％。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述亞組包含如表2所示基因的至少50％。
31.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述亞組包含如表2所示基因的至少80％。
32.一種發(fā)現(xiàn)可有效治療哮喘或過敏癥的化合物的方法，包括提供候選化合物；檢測所述化合物是否抑制精氨酸代謝，其中對精氨酸代謝的抑制表明所述化合物可有效治療哮喘或過敏癥。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的化合物是精氨酸酶I活性的抑制劑。
34.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的化合物是精氨酸酶II活性的抑制劑。
35.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的化合物是CAT2活性的抑制劑。
36.一種治療哮喘或過敏癥患者的方法，包括鑒定需要哮喘或過敏癥治療的個體；及給予能夠降低參與精氨酸代謝的蛋白產(chǎn)生的分子。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的蛋白選自CAT2、精氨酸酶I和精氨酸酶II。
38.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的分子通過抑制編碼所述蛋白的基因來降低所述蛋白的產(chǎn)生。
39.如權(quán)利要求36所述的方法，還包括給予能夠降低或抑制肺白介素-4或白介素-13水平的化合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了哮喘或過敏癥患者肺中幾種基因的上調(diào)。哮喘中許多上調(diào)的基因參與肺中精氨酸的代謝。此外，發(fā)現(xiàn)一組291個標記基因可用來表明患者發(fā)展為哮喘的傾向或表明患者的患病程度。此外，發(fā)現(xiàn)一組59個標記基因可用來表明患者發(fā)展為過敏癥的傾向。許多與哮喘有關(guān)的上調(diào)基因來自于精氨酸代謝途徑。其它基因如ADAM8、SPRR2A和SPRR2B在哮喘中也明顯上調(diào)。通過給予能夠降低肺中精氨酸酶I、精氨酸酶II、CAT2或其它精氨酸酶途徑成員的水平的組合物可實現(xiàn)哮喘的治療。此外，對這些蛋白或編碼這些蛋白的mRNA的變化水平的檢測可用于診斷患有哮喘的患者。
文檔編號A61K31/00GK1692161SQ03808582
公開日2005年11月2日 申請日期2003年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月1日
發(fā)明者馬克·羅滕伯格, 尼韋斯·齊默爾曼 申請人:兒童醫(yī)院醫(yī)療中心