專(zhuān)利名稱(chēng)：組織修復(fù)基質(zhì)的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及用于骨組織修復(fù)的材料。
迄今已研制出多種引發(fā)骨修復(fù)和/或儲(chǔ)存或替代缺損骨的材料，以解決在特定部位刺激骨形成的問(wèn)題。
在用于解決此問(wèn)題的方法中，有一種是借由植入材料的構(gòu)造方法，這些植入材料通常由金屬陶瓷或其它無(wú)機(jī)材料制成，模仿缺損骨的形狀，植入在需要替換的骨的位置。此方法存在一種風(fēng)險(xiǎn)，即接受者會(huì)排斥這種材料，或者植入物質(zhì)與正常骨組織整合失敗。有些陶瓷材料，如磷酸三鈣陶瓷，雖然對(duì)于受者和骨組織是生物相容的，但用作植入材料時(shí)，似乎缺少足夠的骨骼作為一般用途的機(jī)械性能，而且骨骼不能始終如一地長(zhǎng)入而與植入物合成一體。
另一種辦法包括用一種基質(zhì)替換缺損骨組織，該基質(zhì)起到支撐作用，使新骨在其中生長(zhǎng)。原理是此基質(zhì)吸引成骨路徑的細(xì)胞，通過(guò)被稱(chēng)為骨骼傳導(dǎo)的步驟，新骨在基質(zhì)中生長(zhǎng)或穿過(guò)基質(zhì)生長(zhǎng)。此方法使用異源的骨(非宿主自身的骨)移植物，然而這存在相當(dāng)高的失敗率。即使宿主接受了此移植的異源骨，與同源骨(宿主自身的骨)移植相比，與骨的結(jié)合和恢復(fù)機(jī)械應(yīng)力的愈合時(shí)間長(zhǎng)。使用異源骨還存在傳入病毒的問(wèn)題。
第三種方法包括已知的骨誘導(dǎo)方法，此方法的進(jìn)行是在一種材料的誘導(dǎo)下，在宿主未分化細(xì)胞或組織中生長(zhǎng)新骨，這些骨通常圍繞著臨時(shí)性的基質(zhì)生長(zhǎng)。許多化合物被認(rèn)為具有此種能力。參見(jiàn)以下美國(guó)專(zhuān)利4,440,750，專(zhuān)利權(quán)人Glowacki；4,294,753和4,455,256，專(zhuān)利權(quán)人Urist；4,434,094和4,627,982，專(zhuān)利權(quán)人Seyedin等。這些化合物中最有效的似乎是促進(jìn)成骨作用的蛋白質(zhì)。然而，如果用自然資源進(jìn)行合成，由于其含量極低，需要大量的原料才能獲得極少量的用于實(shí)驗(yàn)的材料。通過(guò)重組方法制備這樣的蛋白質(zhì)可使這些蛋白質(zhì)本身具有更高的實(shí)際價(jià)值。然而，這樣的蛋白質(zhì)可能仍需要置于適當(dāng)?shù)幕|(zhì)中，以運(yùn)送到所要求的位點(diǎn)。
已公開(kāi)包含膠原蛋白和多種形式的磷酸鈣的組合物，其有助于愈合和骨生長(zhǎng)。
Bauer等人的專(zhuān)利5,338,772公開(kāi)了一種復(fù)合材料，包含磷酸鈣陶瓷微粒和一種生物可吸收聚合體，其中磷酸鈣陶瓷按重量計(jì)算，含量至少為50％，這些微粒通過(guò)聚合體交聯(lián)鍵相連。所公開(kāi)的磷酸鈣陶瓷微粒的大小約20微米到約5mm。
Piez等人的專(zhuān)利4,795,467公開(kāi)了一種組合物，其包括混合有atelopeptide重建的纖絲狀膠原蛋白的磷酸鈣礦質(zhì)微粒。所公開(kāi)的磷酸鈣礦質(zhì)微粒大小在100-2,000微米范圍內(nèi)。
Sauk等人的專(zhuān)利4,780,450公開(kāi)了一種用于骨修復(fù)的組合物，其包括有微粒多晶體的磷酸鈣陶瓷、一種phosphophorin鈣鹽和一種I型膠原蛋白，重量比為775-15∶3-0.1∶1。公開(kāi)的陶瓷微粒是致密的羥基磷灰石，直徑大約1到10微米，或直徑大于100微米的更大的致密羥基磷灰石陶瓷微粒。
Ammann等人的PCT申請(qǐng)WO94/15653公開(kāi)了配方，其包括磷酸三鈣(TCP)、TGF-β和任選的膠原蛋白。公開(kāi)的TCP作為T(mén)GF-β的運(yùn)送載體，TCP的粒徑大于5微米，優(yōu)選大于大約75微米。所公開(kāi)的最優(yōu)選的TCP顆粒大小范圍是125-250微米。
PCT申請(qǐng)WO95/08304公開(kāi)了羥基磷灰石與不溶性的膠原蛋白混合的多礦質(zhì)的微粒前體。該多礦質(zhì)微粒前體的粒徑范圍是0.5微米到5微米。通過(guò)水解，該前體礦質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基磷灰石。此過(guò)程被認(rèn)為將礦質(zhì)熔化形成整體的羥基磷灰石。
FMC公司的英國(guó)專(zhuān)利說(shuō)明書(shū)1,271,763公開(kāi)了磷酸鈣和膠原蛋白的復(fù)合物。
發(fā)明概要提供了一種組織修復(fù)基質(zhì)，該基質(zhì)多孔、可生物降解、三維固定并具有形狀記憶功能，植入后可在一定時(shí)間內(nèi)保持結(jié)構(gòu)完整性和多孔性，足以加強(qiáng)組織的替換過(guò)程。該基質(zhì)包括礦化纖絲狀不溶性膠原蛋白、膠原蛋白衍生物或改良的明膠，用一種粘合劑粘結(jié)。在一個(gè)實(shí)施方式中，該礦質(zhì)包括在基質(zhì)內(nèi)部固定的磷酸鈣。得到的產(chǎn)物經(jīng)凍干、交聯(lián)、干燥和滅菌，形成一種多孔基質(zhì)。此基質(zhì)可用作組織修復(fù)材料和/或生物活性因子的運(yùn)送載體。此基質(zhì)可移植，用于骨再生，并在植入后保持多孔性和物理性狀完整的時(shí)間超過(guò)14天。
具體實(shí)施例方式
的描述該基質(zhì)用一種不溶于水的可生物降解的生物聚合體，如膠原蛋白、膠原蛋白衍生物或改良的明膠生產(chǎn)。如果用明膠，應(yīng)將其改造為在水環(huán)境中不溶性的。所述膠原蛋白可以來(lái)自礦化或未礦化膠原蛋白來(lái)源，通常使用未礦化膠原蛋白來(lái)源。因此，膠原蛋白可以來(lái)自骨、腱、皮等，優(yōu)選I型膠原蛋白，其包括兩股α2和一股α1的膠原蛋白鏈的結(jié)合。該膠原蛋白可來(lái)源于幼年或成年的動(dòng)物，如小?；?歲及大于2歲的母牛。膠原蛋白的來(lái)源可以是任何易得的動(dòng)物來(lái)源，哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)類(lèi)，并且可以包括牛，豬，馬，小雞，火雞或其它馴養(yǎng)動(dòng)物的膠原蛋白。所用不溶性膠原蛋白組織通常被分散在一種被提高了pH值的介質(zhì)中，pH至少約為8，更常用的大約為pH11-12。雖然可以使用其它氫氧化物，如其它堿金屬氫氧化物或氫氧化銨，但常用氫氧化鈉。
按本發(fā)明的方法，可用天然膠原蛋白。天然膠原蛋白的每一端含有無(wú)三聯(lián)體甘氨酸序列的區(qū)域。這些區(qū)域(端肽)被認(rèn)為是形成與大多數(shù)膠原蛋白制劑相關(guān)聯(lián)的免疫原性的原因。通過(guò)用蛋白水解酶消化，如用胰蛋白酶和胃蛋白酶，除去這些區(qū)域可以減輕上述免疫原性，而生產(chǎn)出缺失肽-膠原蛋白。
用于礦化膠原蛋白濃度通常在大約0.1-10％(重量百分?jǐn)?shù))范圍之內(nèi)，更常用的大約在1-5％(重量百分?jǐn)?shù))。膠原蛋白介質(zhì)的堿濃度范圍通常約為0.0001-0.1N。在反應(yīng)過(guò)程中pH通常保持在約10-13，優(yōu)選約12。
優(yōu)選用不溶性的纖絲狀膠原蛋白，可用常規(guī)方法制備。典型方法是先與異丙醇(IPA)、乙醚、己烷、乙酸乙酯或其它適當(dāng)?shù)娜軇┗旌?，然后分離膠原蛋白。pH通常降到大約3，然后冷卻到約4℃，并且使其溶脹。得到的淤漿可以被均化，直到達(dá)到想要的粘度。
將均化的勻漿加入溶劑攪拌，并且提升pH至大約7。分出纖絲狀膠原蛋白，用去離子水沖洗，并且凍干。為了生產(chǎn)礦化纖絲狀膠原蛋白，可將精制的不溶性膠原蛋白纖維放入反應(yīng)器均化，在攪拌下控制速度向反應(yīng)器中加入氯化鈣(典型地為0.05m)和磷酸三鈉(典型地為0.03m)。在這期間，根據(jù)需要用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至11.0±0.5。在礦化以后，用去離子水或磷酸鹽緩沖液沖洗膠原蛋白，與粘合劑結(jié)合，并調(diào)節(jié)PH為8.0±2.0。加入磷酸鹽和鈣離子的方法參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,231,169的描述。
所述磷酸鈣可以包含其它離子，比如碳酸鹽、氯化物、氟化物、鈉或銨。碳酸鹽的存在導(dǎo)致產(chǎn)生一種具有碳酸磷灰石(碳酸羥基磷灰石)性質(zhì)的產(chǎn)物，而氟化物產(chǎn)生氟化磷灰石性質(zhì)的產(chǎn)物。碳酸鹽的重量百分含量通常不超過(guò)10％，氟化物的重量百分含量通常不超過(guò)2％，優(yōu)選在0至1之間。這些離子可以與鈣和/或磷酸鹽源結(jié)合而存在，只要這些離子相容，且不在試劑溶液中導(dǎo)致沉淀。
鈣和磷酸鹽離子加入的速度通常是大約1小時(shí)并且不超過(guò)72小時(shí)，以使粒徑達(dá)到約5微米或更小。通常，加入時(shí)間大約在2至18小時(shí)，更常用的約4至16小時(shí)。使用適度的溫度，通常不超過(guò)40℃，優(yōu)選范圍在大約15℃到30℃。膠原蛋白與磷酸鈣礦質(zhì)的重量比通常約為20∶1-1∶1，典型地約為7∶3。
其它添加劑如，非膠原蛋白樣的蛋白質(zhì)，因子或藥物，如BMP′s、TGF-β、降鈣素、抗生素均可包含在基質(zhì)中，方法是在加入鈣和磷酸鹽之前或之后加到膠原蛋白漿中。這樣的添加劑的用量通常是基于用作基質(zhì)的生物聚合體(比如膠原蛋白)重量的約0.0001-2％。
礦化產(chǎn)物中膠原蛋白的量，以除去粘合劑的膠原蛋白纖維的重量計(jì)，通常約占95％-30％。
為形成具有形狀記憶功能的多孔三維固定的組織修復(fù)基質(zhì)，將礦化生物聚合體纖維與一種粘合劑混合。
優(yōu)選用精制的可溶膠原蛋白作為粘合劑，通過(guò)首先將可溶膠原蛋白與一種溶劑如異丙醇(IPA)混合，然后分離出膠原蛋白。將pH降至約3.0，當(dāng)膠原蛋白溶解后，升高pH至5.0，用溶劑洗兩次，再用去離子水沖洗、過(guò)篩并且凍干。
其它可被應(yīng)用的粘合劑包括，但是不限于明膠、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸和乙醇酸共聚物、聚己酸內(nèi)酯、羧甲基纖維素、纖維素酯(比如甲酯和乙酯)、醋酸纖維素、葡萄糖、葡聚糖、脫乙酰殼多糖、透明質(zhì)酸、ficol、硫酸軟骨素、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙二醇、聚乙二醇、水溶性的甲基丙烯酸酯或丙烯酸酯的聚合體。
為制備多孔基質(zhì)，將優(yōu)選的可溶膠原蛋白粘合劑加至一種礦化生物聚合體勻漿并混合。優(yōu)選地，不溶性膠原蛋白是生物聚合體，并使用可溶膠原蛋白對(duì)不溶性膠原蛋白為約10％(重量比)比例。根據(jù)需要，將pH調(diào)節(jié)至8.0±2.0。當(dāng)達(dá)到所需要的混合水平時(shí)，將此分散體在-20℃到-80℃下冷凍。
將此冷凍的勻漿凍干。此多孔基質(zhì)可以被交聯(lián)，以提高物理穩(wěn)定性，增加基質(zhì)的再吸收時(shí)間，并使終產(chǎn)物易于處理。所述凍干基質(zhì)交聯(lián)優(yōu)選在戊二醛溶液(典型的濃度為0.01％)或水蒸氣中進(jìn)行。如果用溶液，在除去過(guò)量試劑以后，將上述基質(zhì)冷凍干燥。
多孔基質(zhì)還可以通過(guò)過(guò)濾礦化膠原蛋白纖維和粘合劑的勻漿形成，形成網(wǎng)狀物。然后將經(jīng)干燥的網(wǎng)狀物交聯(lián)。
通過(guò)將生物聚合體膠原蛋白纖維、粘合劑和可濾去的微粒(可溶鹽，比如氯化鈉)和/或高蒸氣壓固體混合，也可以獲得多孔結(jié)構(gòu)，所述固體在后來(lái)可通過(guò)升華除去?？梢詫驖{干燥，然后可以除去可濾去的微?；蚩缮A的微粒，以形成多孔結(jié)構(gòu)。所述多孔基質(zhì)可以被交聯(lián)。
交聯(lián)基質(zhì)的其它優(yōu)點(diǎn)包括增加植入駐留時(shí)間和形狀保持性(不發(fā)生植入物的破碎)。所述基質(zhì)有一種形狀記憶功能，意味著它可從初始的大小、形狀和多孔性被壓縮，也可以從壓縮狀態(tài)回復(fù)到它初始的大小、形狀和多孔性。而且，上述過(guò)程中它的纖維或粘合劑不出現(xiàn)實(shí)質(zhì)性的損失。在植入后，就其物理性狀完整方面，所述基質(zhì)還將保持其多孔性超過(guò)約14天，尤其當(dāng)被用于骨生長(zhǎng)時(shí)。
可用其它交聯(lián)方法和交聯(lián)劑，如甲醛、鉻鹽、二異氰酸鹽、碳二亞胺、雙官能的?；?、雙官能的酐、雙官能的琥珀酰亞胺、二溴異丙醇、環(huán)氧氯丙烷、二環(huán)氧化物；交聯(lián)方法包括脫氫熱交聯(lián)、干燥時(shí)紫外輻射，或E-射線輻射，或在水溶液中進(jìn)行γ輻射。
最終產(chǎn)物可使用γ輻射、E-射線輻射、干熱或環(huán)氧乙烷方法滅菌。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是膠原蛋白纖維和被固定的磷酸鈣礦質(zhì)形成一種基質(zhì)，特別適于骨的置換或增加。在骨置換情形中，當(dāng)植入生理環(huán)境后，該基質(zhì)的物理性狀完整和它的多孔性可保持超過(guò)約14天。物理性狀完整意味著基質(zhì)也保持其多孔性，這對(duì)組織置換或增加的步驟是很重要的。如上所述，該基質(zhì)也有形狀記憶功能。這使得基質(zhì)可以壓縮為一種轉(zhuǎn)送載體，比如插管，此轉(zhuǎn)送載體可以引入到所需組織生長(zhǎng)的位置，通過(guò)在該位點(diǎn)從轉(zhuǎn)送載體釋放基質(zhì)，該基質(zhì)回復(fù)到它的初始的大小，形狀和多孔性，它的纖維和粘合劑沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的損失。這與組合物的情形相反，所述組合物在植入組合物后立即，或不久后就崩解為無(wú)定型的、無(wú)孔的物質(zhì)，并且丟失礦質(zhì)。
本發(fā)明的基質(zhì)將最終被生物降解或被再吸收，所以在有限的期間之后，不能保持物理性狀完整和多孔性。此過(guò)程通常平均歷時(shí)約2到12周，并且當(dāng)然取決于所植入基質(zhì)的大小。然而，只要在骨置換或增加過(guò)程之前沒(méi)出現(xiàn)基質(zhì)的全吸收或生物降解，此生物降解速度是足夠的。
本發(fā)明的一個(gè)方面，磷酸鈣礦質(zhì)(典型為羥基磷灰石)被固定在基質(zhì)上，但相反在基質(zhì)中又可自由移動(dòng)。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的磷酸鈣礦質(zhì)固定在基質(zhì)內(nèi)部。由于吞噬細(xì)胞比如巨細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在微粒物質(zhì)周?chē)鼮橥怀觯?jīng)常形成肉芽瘤，可以改變細(xì)胞反應(yīng)。當(dāng)微粒小到足以被吞噬，即大約3到5微米或更小時(shí)，可被吞噬細(xì)胞吞噬，這更進(jìn)一步促進(jìn)局部的組織反應(yīng)。例如觀察到，在骨醫(yī)治期間發(fā)現(xiàn)在相鄰組織的巨噬細(xì)胞中存在與人造關(guān)節(jié)有關(guān)的微粒磨損碎片，并且在一種劑量依賴(lài)方式的動(dòng)物模型中與增加的骨吸收有關(guān)。(″巨噬細(xì)胞/微粒的相互使用大小、組合物和表面區(qū)域的影響″，Shanbhag AS等，J.Biomed.Mater.Res.28(1)，81-90(1994))。因此本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是被固定的磷酸鈣礦質(zhì)始終以5微米或更小的微粒被釋放，這是吞噬細(xì)胞可吞噬的理想大小。本發(fā)明的另一優(yōu)點(diǎn)是任何磷酸鈣礦質(zhì)微粒的釋放均受到控制，這是由于礦質(zhì)固定在基質(zhì)內(nèi)部的結(jié)果。粒徑大小和固定的優(yōu)點(diǎn)見(jiàn)后面的實(shí)施例III。
本基質(zhì)材料可用于組織或軟骨修復(fù)，或在脊柱融合術(shù)、充填骨缺損、骨折修復(fù)和移植齒根膜的缺損中作為骨傳導(dǎo)骨移植材料。通過(guò)將此組合物與成骨性的材料結(jié)合，如自生的骨或自體抽出的骨髓，或骨傳導(dǎo)骨生長(zhǎng)因子BMP′s、降鈣素或其它生長(zhǎng)因子，可進(jìn)一步增加骨誘導(dǎo)和生長(zhǎng)。所述組合物還可以含有其它添加劑，比如藥物和特別的抗生素。此基質(zhì)也可以作為一種基材，粘結(jié)生長(zhǎng)因子，以使宿主產(chǎn)生的或外部引入的因子集中在此基質(zhì)中。所述組合物可在組織或軟骨修復(fù)、骨折修復(fù)、maxifacial重建、脊柱融合術(shù)、關(guān)節(jié)再建及其他整形外科的手術(shù)上得到應(yīng)用。
提供以下實(shí)施例用于說(shuō)明，但并不意味著以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例I植入骨將本發(fā)明的礦化膠原蛋白基質(zhì)植入8周齡頂骨缺損大鼠模型。在第14和第28天進(jìn)行組織學(xué)評(píng)定。在14天以后，觀察到骨從缺損處切割邊緣進(jìn)入膠原蛋白基質(zhì)生長(zhǎng)。圍繞著殘余的基質(zhì)塊和疏松結(jié)締組織區(qū)域重新形成編織骨，所述結(jié)締組織區(qū)域中血管形成明顯。至28天，出現(xiàn)了有意義的改變，遍及新骨呈現(xiàn)出骨細(xì)胞。由于骨繼續(xù)生長(zhǎng)，在第14天看到的結(jié)締組織空腔變小。
實(shí)施例II用骨髓或自體移植物植入骨將實(shí)施例I的磷酸鈣礦化膠原蛋白基質(zhì)添加骨髓后植入成年的雄性新西蘭白兔(3.7到4.1公斤)。在右前臂內(nèi)側(cè)面中軸部位做一個(gè)切口，以暴露橈骨。用一種風(fēng)鉆除去1.5厘米橈骨，造成嚴(yán)重缺損。在截骨術(shù)期間進(jìn)行沖洗，使過(guò)熱和對(duì)骨的破壞程度減到最小。用礦化膠原蛋白基質(zhì)與骨髓或自體移植物混合，將缺損處充滿。所述骨髓從同一動(dòng)物的脛骨中抽取。自體移植物是松質(zhì)骨，從髂嵴獲得，類(lèi)似于通用的骨增大或移植方法。
手術(shù)后每日觀察動(dòng)物，并且在前八周每?jī)芍芤淮?、以后每月一次進(jìn)行射線照相檢查被手術(shù)的橈骨，直到在第12周進(jìn)行尸體剖檢。此實(shí)驗(yàn)兔預(yù)定在術(shù)后存活12和24周。
在尸體剖檢時(shí)，除去左右兩橈骨，評(píng)價(jià)手術(shù)橈骨總的醫(yī)治情況(形成愈合組織和骨折愈合)。檢查包括指示愈合的骨的存在，或表明有軟骨、軟組織的存在，或指示一種可能不穩(wěn)定愈合的缺損內(nèi)部的裂縫。
然后將橈骨固定在10％中性緩沖的福爾馬林中，進(jìn)行組織學(xué)和形態(tài)測(cè)定的估價(jià)。
在0、2、4、6、8、12周所拍的射線照片表明，早在二周時(shí)就出現(xiàn)了明顯的愈合作用，缺損部位繼續(xù)改善，向重新組成正常的橈骨皮質(zhì)發(fā)展。在磷酸鈣膠原蛋白基質(zhì)處理組和自體移植物對(duì)照組之間出現(xiàn)了一致的漸進(jìn)性的愈合。從射線照相愈合來(lái)看，在上述兩個(gè)交聯(lián)組之間幾乎無(wú)差別。
在較早的研究中，已經(jīng)表明缺損留下的空洞或未經(jīng)治療的(陰性對(duì)照)含有極少新骨，或幾乎沒(méi)有新骨。在此研究中，自體移植物(陽(yáng)性對(duì)照)形成一種穩(wěn)定的骨愈合。含有骨髓的磷酸鈣膠原蛋白處理的缺損也顯示出穩(wěn)定的與新骨的連接，其效果與自體移植物相當(dāng)。
實(shí)施例III(比較實(shí)施例)制備一批不加膠原蛋白的磷酸鈣礦質(zhì)。獲得此礦質(zhì)，沖洗，并且凍干為干燥粉末。紅外光譜顯示與羥基磷灰石相符。
將不溶性纖絲狀膠原蛋白纖維與可溶膠原蛋白以9/1重量比混合，總固體為4％(重量)，制備成混合基質(zhì)。手工混合此勻漿，加入游離礦質(zhì)制成25％(重量)的總固體。將此勻漿傾入2平方英寸聚四氟乙烯模子，約5mm深，在-80℃冷凍至干。用戊二醛使干燥基質(zhì)交聯(lián)30分鐘，沖洗，然后再凍干。得到的基質(zhì)約4mm厚，用此基質(zhì)制成直徑為8mm的沖壓樣品用于植入。用于對(duì)比，新近制備的一批礦化膠原蛋白(固定礦質(zhì))，灰分含量為28％(重量)，用于制造8mm直徑的沖壓植入片。
在第3、7、14天的時(shí)間點(diǎn)將兩個(gè)同樣類(lèi)型材料的植入物經(jīng)皮下放置在四只大鼠胸廓筋膜。在尸體剖檢時(shí)，記錄植入物的組織反應(yīng)，并取組織進(jìn)行組織學(xué)檢查，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察各個(gè)動(dòng)物H&E染色的植入物和周?chē)M織的切片，以確定組織反應(yīng)和累積效應(yīng)。
尸體剖檢觀察結(jié)果混合配方組(非固定礦質(zhì)) 礦化膠原蛋白組3天 周?chē)M織清楚 周?chē)M織清楚植入物含糊不清 植入物柔軟7天 周?chē)M織清楚 周?chē)M織清楚植入物柔軟，但感覺(jué)變厚 植入物柔軟至堅(jiān)實(shí)14天 周?chē)M織發(fā)炎 周?chē)M織清楚植入物堅(jiān)實(shí)，但感覺(jué)變厚 植入物堅(jiān)實(shí)尸體剖檢的臨床觀察表明，與在大鼠皮下植入固定礦化膠原蛋白的模型相比較，混合配方組發(fā)生了嚴(yán)重許多的炎癥反應(yīng)和降解效應(yīng)。觀測(cè)結(jié)果描述了在第3天植入物含糊不清的情況。在第7和14天，組織學(xué)觀察到植入物變厚，可能是由于混合配方引起了嚴(yán)重的纖維囊反應(yīng)。在所有三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，相對(duì)比的帶有固定礦質(zhì)的配方表現(xiàn)出清楚的周?chē)M織的和正常的植入物外觀。
組織學(xué)檢查顯示，從晚期(14天)的PMN活性和早期(3天)的巨細(xì)胞活性看，混合配方組導(dǎo)致了嚴(yán)重的急性和慢性炎癥。上述巨細(xì)胞表明吞噬細(xì)胞的活性正被組織起來(lái)，這可能是為了應(yīng)對(duì)大量松散聯(lián)合的礦質(zhì)微粒。還觀察到成纖維細(xì)胞侵入，并且組織壞死不明顯。
相反，礦質(zhì)微粒固定在膠原蛋白纖維上的配方顯示出更有代表性的植入物組織反應(yīng)。在3天時(shí)，觀察到急性炎癥，其迅速地平息，在7天時(shí)成為更長(zhǎng)期性的植入物反應(yīng)，僅在成纖維細(xì)胞的侵入和在植入物周?chē)行卵苄纬善陂g發(fā)生中度炎癥。在第14日，可見(jiàn)到炎癥增加的跡象，也許這表示因?yàn)槟z原蛋白降解，膠原蛋白纖維釋放出額外的礦質(zhì)。
膠原蛋白和羥基磷灰石礦質(zhì)成分的混合配方表明，其在大鼠皮下植入時(shí)發(fā)生顯著的急性炎癥性反應(yīng)。在礦化膠原蛋白組合物中固定礦質(zhì)成分似乎可減少礦質(zhì)的生物利用度，減少炎癥的發(fā)生，而在愈傷期間繼續(xù)支撐組織整合。
實(shí)施例IV在軟組織部位植入將本發(fā)明的礦化膠原蛋白基質(zhì)植入5-6周齡的Sprague Dawley大鼠皮下組織，并在4周和8周時(shí)用組織學(xué)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。在4周以后，觀察到向內(nèi)生長(zhǎng)的纖維組織進(jìn)入嗜曙紅細(xì)胞插入物的卵形塊。同時(shí)也觀察到中度到明顯的慢性炎癥性反應(yīng)，并伴有淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)。外周存在致密纖維組織和多核巨細(xì)胞。在此時(shí)間點(diǎn)，仍有適量的礦化膠原蛋白植入物存留。在8周時(shí)，礦化膠原蛋白的植入物顯示出精細(xì)而致密的纖維組織和小的空隙空間。也觀察到中度的炎癥，主要是在外周，伴隨著慢性炎性細(xì)胞和分散的巨多核細(xì)胞的浸潤(rùn)。6個(gè)樣本中有3個(gè)顯示少量殘留植入物材料，而其余3個(gè)植入物部位僅含痕量的植入物。
實(shí)施例V植入的礦化膠原蛋白基質(zhì)的存留時(shí)間將本發(fā)明的礦化膠原蛋白基質(zhì)與自體骨髓結(jié)合，并植入新西蘭白兔的橈骨1.5cm部分的缺損處。在12周以后，對(duì)植入部位進(jìn)行組織學(xué)評(píng)價(jià)，顯示存留殘余礦化膠原蛋白基質(zhì)并緊密附著在骨基質(zhì)上。
實(shí)施例VI MP52的釋放將本發(fā)明的礦化膠原蛋白基質(zhì)與形態(tài)發(fā)生蛋白-52(MP52)水合，制成濃度為0.1mg MP52/cc基質(zhì)。將此含水基質(zhì)凍干。凍干基質(zhì)在37℃置于PBS，檢測(cè)基質(zhì)釋放的MP52。在下列時(shí)間點(diǎn)15分鐘、30分鐘、1小時(shí)和18小時(shí)，累積釋放分別為5％，、7％、9％和10％。18小時(shí)以后，從該基質(zhì)中回收到90％加入的MP52。
實(shí)施例VII抗生素的釋放將本發(fā)明的礦化膠原蛋白基質(zhì)與萬(wàn)古霉素水合，濃度是10mg萬(wàn)古霉素/cc基質(zhì)。將此含水基質(zhì)凍干。凍干基質(zhì)在37℃置于PBS，檢測(cè)基質(zhì)釋放萬(wàn)古霉素。在下列時(shí)間點(diǎn)6小時(shí)、24小時(shí)、51小時(shí)、73小時(shí)和97小時(shí)，累積釋放分別為40％、63％、72％、80％和83％。
實(shí)施例VIII形狀記憶將本發(fā)明的礦化膠原蛋白基質(zhì)放在液體中，基質(zhì)可以容易地水合。在水合以后基質(zhì)保持其完整性和形狀。含水基質(zhì)可以被壓縮并人工穿過(guò)一條窄通路，但是當(dāng)再水合時(shí)又回復(fù)到它的原始大小和形狀。在操作和壓縮期間基質(zhì)保持其完整性，纖維沒(méi)有任何實(shí)質(zhì)性的損失。
權(quán)利要求
1.一種可移植的、多孔、可生物降解、三維固定的具有形狀記憶功能的基質(zhì)，其包括不溶于水的礦化生物聚合體纖維構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、藥物和通過(guò)交聯(lián)可變?yōu)椴蝗苄缘乃苄哉澈蟿?br> 2.一種可移植的、多孔、可生物降解、三維固定、用于骨生長(zhǎng)、具有形狀記憶功能、并在植入骨生長(zhǎng)所需的生理環(huán)境后其多孔性保持超過(guò)約14天的基質(zhì)，其包括不溶性的礦化生物聚合體纖維、藥物和通過(guò)交聯(lián)可變?yōu)椴蝗苄缘乃苄哉澈蟿?br> 3.如權(quán)利要求1或2所述的基質(zhì)，其中所述基質(zhì)可從其初始大小、形狀和多孔性狀態(tài)下被壓縮，并可從壓縮狀態(tài)回復(fù)，而所述纖維或粘合劑無(wú)實(shí)質(zhì)性損失。
4.如權(quán)利要求1或2所述的基質(zhì)，其中所述藥物包括抗生素。
5.如權(quán)利要求1或2所述的基質(zhì)，其還含有生長(zhǎng)因子。
6.如權(quán)利要求1或2所述的基質(zhì)，其還含有骨髓。
7.如權(quán)利要求1或2所述的基質(zhì)，其中所述粘合劑選自可溶膠原蛋白、明膠、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸和乙醇酸共聚物、聚己酸內(nèi)酯、羧甲基纖維素、纖維素酯、葡萄糖、葡聚糖、脫乙酰殼多糖、透明質(zhì)酸、ficol、硫酸軟骨素、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙二醇、聚乙二醇、水溶性的聚丙烯酸酯和水溶性的聚甲基丙烯酸酯。
8.如權(quán)利要求1或2所述的基質(zhì)，其中所述生物聚合體包括纖絲狀膠原蛋白。
9.如權(quán)利要求1或2所述的基質(zhì)，其中所述礦質(zhì)包括羥基磷灰石。
10.如權(quán)利要求2所述的基質(zhì)，其中所述礦質(zhì)在骨置換期間，隨時(shí)間釋放進(jìn)入所述生理環(huán)境，并在所述時(shí)間內(nèi)保持所述多孔性。
11.如權(quán)利要求1或2所述的基質(zhì)，其中所述礦化生物聚合體纖維以含約30-95％重量膠原蛋白的礦化膠原蛋白的形式存在。
12.權(quán)利要求1或2所述的基質(zhì)，其還包括自體骨。
13.一種修復(fù)纖維組織或軟骨的方法，其包括以下步驟在修復(fù)的目標(biāo)部位引入一種組合物，所述組合物包括有效量的多孔、可生物降解、三維固定的具有形狀記憶功能的基質(zhì)，該基質(zhì)包括不溶性的礦化生物聚合體纖維和通過(guò)交聯(lián)可變?yōu)椴蝗苄缘乃苄哉澈蟿鼋M合物足以促使新的纖維組織或軟骨形成。
14.一種修復(fù)纖維組織、軟骨或骨骼的方法，其包括以下步驟(a)在修復(fù)的目標(biāo)部位引入運(yùn)送載體，所述載體含多孔、可生物降解、三維固定的具有形狀記憶功能的基質(zhì)，該基質(zhì)包括不溶性的礦化生物聚合體纖維和通過(guò)交聯(lián)可變?yōu)椴蝗苄缘乃苄哉澈蟿砸环N與所述基質(zhì)初始大小、形狀和多孔性相關(guān)的壓縮狀態(tài)存在；(b)從所述運(yùn)送載體中釋放所述基質(zhì)，由此所述基質(zhì)回復(fù)到所述初始大小、形狀和多孔性。
15.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述基質(zhì)回復(fù)為所述的初始大小、形狀和多孔性，而所述纖維和粘合劑的量不發(fā)生實(shí)質(zhì)性的損失。
16.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述基質(zhì)還包括添加劑。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述添加劑包括藥物。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述藥物包括抗生素。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述添加劑包括生長(zhǎng)因子。
20.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述基質(zhì)還包括骨髓。
21.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述粘合劑選自可溶膠原蛋白、明膠、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸和乙醇酸共聚物、聚己酸內(nèi)酯、羧甲基纖維素、纖維素酯、葡萄糖、葡聚糖、脫乙酰殼多糖、透明質(zhì)酸、ficol、硫酸軟骨素、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙二醇、聚乙二醇、水溶性的聚丙烯酸酯和水溶性的聚甲基丙烯酸酯。
22.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述生物聚合體包括纖絲狀膠原蛋白。
23.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述礦化生物聚合體纖維的礦質(zhì)包括羥基磷灰石。
24.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述基質(zhì)包括膠原蛋白和固定化的磷酸鈣，以含約30-95％重量膠原蛋白的礦化膠原蛋白的形式存在。
25.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述基質(zhì)還包括自體骨。
26.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述粘合劑包括可溶膠原蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可生物降解的多孔三維組織修復(fù)基質(zhì)。該基質(zhì)優(yōu)選由礦化膠原蛋白形成，所述礦質(zhì)包括固定在基質(zhì)中的磷酸鈣微粒。
文檔編號(hào)A61F2/28GK1646070SQ03808980
公開(kāi)日2005年7月27日 申請(qǐng)日期2003年2月21日 優(yōu)先權(quán)日1995年10月16日
發(fā)明者R·K·亞馬莫托, M·K·關(guān), S·D·佩斯蒂 申請(qǐng)人:德普伊斯派爾公司