專利名稱：喜樹堿－紫杉烷類共軛物作為抗有絲分裂和抗腫瘤劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及喜樹堿及其類似物和紫杉烷類基的共軛物，含有它們的藥物制劑，使用它們作為抗有絲分裂和抗腫瘤劑，尤其用于治療諸如乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌的癌癥的方法。
背景技術(shù)：
如圖1所示的紫杉醇(1)和也在圖1中所示的喜樹堿(2)都是取自植物的目前臨床應(yīng)用的抗腫瘤劑(M.C.Wani et al.，Taxusbrevifolia，1971，93，2325-2327和M.E.Wall et al.，j.Am.Chem.Soc.，1966，88，3888-3890)。1992年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)紫杉醇用于治療晚期卵巢癌，1994年又批準(zhǔn)紫杉醇用于治療乳腺癌。
紫杉醇抗腫瘤作用的機(jī)理就在于抗有絲分裂，特別是促進(jìn)微管蛋白進(jìn)入微管的不可逆的組合(P.B.Schiff et al.，Nature，1979，277，665-667)。喜樹堿也因抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I(DNA topo I)而具有顯著的抗腫瘤活性。(Y.H.Hsiang et al.，J.Biol.Chem.，1985，260，14873-14878和J.C.Wang，Biochim.Biophys.Acta.，1987，909，1-9)。為了開發(fā)出更有用的化學(xué)治療劑這些化合物都經(jīng)過了不斷的結(jié)構(gòu)修飾。然而，盡管紫杉醇和喜樹堿都有有效的抗腫瘤活性，最近的研究顯示用這些藥物治療經(jīng)常導(dǎo)致許多不希望有的副作用和多種藥物的抗藥性(multi-drug resistance)。因此，開發(fā)具有更少副作用和提高的抗各種腫瘤的活性的抗癌劑依然是必要的。
先前我們曾經(jīng)報道過兩種4′-O-脫甲基表鬼臼脂素-喜樹堿共軛物(如圖1所示3和4)作為哺乳動物DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II抑制劑的合成和評價(K.F.Bastow et al.，Bioorg.Med.Chem.，1997，5，1481-1488)。最有活性的共軛物抑制細(xì)胞生長類似于topoI和II抑制組分。在幾種癌癥細(xì)胞株中，包括HOP-62白血病，SW-620結(jié)腸癌，MCF/ADR抗阿霉素乳腺癌和A-498腎癌，這些共軛物的細(xì)胞毒性強于表鬼臼脂素。在用裸鼠所做的實驗中，一種共軛物抗人KB(鼻咽)和DU-145(前列腺)腫瘤細(xì)胞生長的活性強于足葉乙甙或(2)。目前，許多報道描述了紫杉醇和柔紅霉素或苯丁酸氮芥之間的共軛物(A.K.Kar et al.，Bioorg.Med.Chem.Let.，2000，10，261-264和M.D.Wittman et al.，Bioorg.Med.Chem.Let.，2001，11，811-814)。但是，尚未有對DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑-紫杉醇雜化物(hybrid)進(jìn)行研究。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的實施方案，本發(fā)明涉及式I的化合物C’-L-T (I)其中C’為式II的喜樹堿基(II) 其中R1選自H、烷基、醛、羰基、烷氧基、烷芳基、羥基烷基、鹵代烷基、氨基烷基、二烷基氨基、二烷基氨基烷基、環(huán)氨基烷基、芳基、芳氧基、C-烯糖、硝基、氰基和O-糖基；R2、R3、R4和R5為各自獨立選自H、氨基、羥基、烷基、烷氧基、烷硫醇基、烷基氨基、氨基烷基、二(烷基)氨基、環(huán)氨基烷基、氨基烷氧基、芳基、芳氧基、C-烯糖、氰基、亞甲基二氧基、甲?；?、硝基、鹵素、疊氮基、酰胺基、肼基，通過氨基氮原子與A環(huán)鍵連的二十種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸之任一種、SR8、NR8R8或O-糖基；或R3和R4一起形成5或6元芳香環(huán)或二氧戊環(huán)；且其中R2和R3，R3和R4，或R4和R5連接；條件是R1，R2，R3，R4，和R5之一是與L連接的共價鍵；R6為H、鹵素、烷基、烷氧基、烷芳基、羥基烷基、或鹵代烷基；R7為烷基、烷芳基、羥基烷基、或芳基；R8為獨立地選自H、烷基、烷芳基、羥基烷基、氨基烷基、?；?、或芳基；L是連接部分；T為下式III的紫杉烷類基 其中R11選自H、烷基、烷氧基、氨基烷基和?；籖12和R13為各自獨立地選自H、烷基、芳基、烷氧基、烷芳基、羥基烷基、鹵代烷基、氨基烷基、二烷基氨基、二烷基氨基烷基、環(huán)氨基烷基、芳氧基、硝基、氰基，和鹵素；或其藥學(xué)上可接受的鹽。
根據(jù)本發(fā)明的其他實施方案，本發(fā)明涉及包含在藥學(xué)上可接受的載體中的上述式I化合物的藥物制劑。
根據(jù)本發(fā)明的其他實施方案，本發(fā)明涉及一種治療癌癥的方法，包括對需要它的主體施用治療有效量的上述的式I的化合物。可治療的癌癥的例子包括，但是不限于，小細(xì)胞肺癌、睪丸癌、淋巴瘤、白血病、食道癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、肝癌和前列腺癌。
根據(jù)本發(fā)明的另一些實施方案，本發(fā)明涉及一種誘發(fā)細(xì)胞分化的方法，該方法包括用分化有效量的上述式I化合物接觸癌細(xì)胞(體內(nèi)或體外)。
根據(jù)本發(fā)明的其他實施方案，本發(fā)明涉及抑制細(xì)胞有絲分裂的方法，該方法包括用抑制有絲分裂有效量的上述式I化合物接觸細(xì)胞(體內(nèi)或體外)。


圖1所示為本發(fā)明涉及的各種前體化合物的結(jié)構(gòu)；圖2所示為制備本發(fā)明化合物的一個合成路線的實施方式；圖3所示為化合物抗MCF-7(圖A)和HCT-8細(xì)胞復(fù)制(圖B)的活性的圖；和圖4所示為顯示本發(fā)明化合物作為人DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑的含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠。
發(fā)明詳述在后文將參考附圖更充分的描述本發(fā)明。然而本發(fā)明可以有不同的形式的實施方式，不受這里所提及的實施方式的限制。但是，這些實施方案可以使公開更加充分，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員更充分的表述本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明說明書中所用的術(shù)語僅用于描述特定的實施方案，其目的并不用于限定本發(fā)明。在本發(fā)明說明書和所附的權(quán)利要求書中，單數(shù)形式的“一種”和“這種”也包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文清楚的顯示不是如此。
除非另有說明，此處的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。這里所述的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)都全文引入作為參考。
這里使用的術(shù)語“烷基”或“低級烷基”是指C1到C4、C6或C8烷基，其可以是直鏈或支鏈且飽和或不飽和的。
“環(huán)烷基”此處定義同其本身，典型的為C3，C4或C5到C6或C8環(huán)烷基。
這里使用的“烯基”或“低級烯基”同樣的是指C1到C4烯基、和這里使用的烷氧基或低級烷氧基同樣的是指C1到C4烷氧基。
這里使用的“烷氧基”是指直鏈或支鏈，飽和或不飽和氧代烴鏈，包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基，和叔丁氧基。
這里使用的術(shù)語“芳基”指C3到C10環(huán)芳香基如苯基、萘基等，并且包括取代的芳基如甲苯基。
這里所使用的“鹵素”指任何鹵素原子，如氯、氟、溴或碘。
這里使用的術(shù)語“羥基烷基”指C1到C4直鏈或支鏈羥基取代的烷基，如-CH2OH，-(CH2)OH等。
這里使用的術(shù)語“氨基烷基”指C1到C4直鏈或支鏈氨基取代的烷基，其中術(shù)語“氨基”指基團(tuán)NR’R”，其中R’和R”獨立地選自H或如上定義的低級烷基，如-NH2，-NHCH3，-N(CH3)2等。
這里使用的術(shù)語“氧烷基”指C1到C4氧取代的烷基，如-OCH3，和這里使用的“氧芳基”指C3到C10氧取代的環(huán)芳基。
這里使用的“治療”指任何形式的治療，其對受病癥折磨的患者有利，包括患者病情的改善(例如，一個或多個癥狀)，延緩疾病的進(jìn)展，阻礙或延遲疾病的發(fā)作，等等。
這里使用的“藥學(xué)上可接受的”意思是指化合物或組合物適于給予主體以達(dá)到這里描述的治療作用，而從疾病的嚴(yán)重性和治療的必要性來講無不適當(dāng)?shù)挠泻Φ母弊饔谩?br> 本發(fā)明主要涉及對人類主體的治療，但是也可用于獸醫(yī)對其他動物主體(如，哺乳動物、鳥類)的治療。優(yōu)選哺乳動物，尤其優(yōu)選人類。
一般的，本發(fā)明的活性化合物具有式I的結(jié)構(gòu)C’-L-T (I)其中C’為喜樹堿基包括喜樹堿和其類似物，T為紫杉烷基，L為共價連接基。這里所使用的活性化合物包括它們的藥學(xué)可接受的鹽。本發(fā)明包括分別為右旋或左旋的純制劑，也包括其混合物(外消旋的或富對映異構(gòu)混合物)?？梢杂脕砼c上面式I結(jié)合的各種基團(tuán)，將在下面詳細(xì)討論。
A.喜樹堿任何喜樹堿或喜樹堿類似物都可以用于進(jìn)行本發(fā)明。喜樹堿是已知的，并可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)制備。見Merck Index，Monograph No.1783(12thed.1996)。
可以用于進(jìn)行本發(fā)明的喜樹堿的類似物的例子包括，但是不限于下述的記載
授予Wall等的美國專利US4 894 456；授予Miyasaka等的美國專利US4 399 282；授予Miyasaka等的美國專利US4 399 276和授予Vishnuvajjala等的美國專利4 943 579；歐洲專利申請0 321 122A2；授予Miyasaka等的美國專利US4 473 692；歐洲專利申請0 325247 A2；歐洲專利申請0 556 585 A2，由Takeda Chemical Industries遞交；授予Wall等的美國專利US4 981 968；授予Wall等的美國專利5 049 668；授予Comins等的美國專利US5 162 532；授予Wall等的美國專利US5 180 722；授予Comins等的美國專利US5 200 524；授予Comins等的美國專利US5 459 269；授予Fang等的美國專利US5 162 532；和授予Angelucci等的美國專利US6 328 953。
(所有這些引用的發(fā)明公開作為參考文獻(xiàn)全文引入)。這些化合物一般具有式II的結(jié)構(gòu) 其中R1選自H、烷基、醛、羰基、烷氧基、烷芳基、羥基烷基、鹵代烷基、氨基烷基、二烷基氨基、二烷基氨基烷基、環(huán)氨基烷基、芳基、芳氧基、C-烯糖、硝基、氰基和O-糖基；R2、R3、R4和R5為獨立選自H、氨基、羥基、烷基、烷氧基、烷硫醇基、烷基氨基、氨基烷基、二(烷基)氨基、環(huán)氨基烷基、氨基烷氧基、芳基、芳氧基、C-烯糖、氰基、亞甲基二氧基、甲酰基、硝基、鹵素、疊氮基、酰胺基、肼基，通過氨基氮原子與A環(huán)鍵連的二十種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的任一種、SR8、NR8R8或O-糖基；或R3和R4一起形成5或6元芳香環(huán)或二氧戊環(huán)；且其中R2和R3，R3和R4，或R4和R5連接。
條件是R1，R2，R3，R4，R5之一是與L連接的共價鍵；
R6為H、鹵素、烷基、烷氧基、烷芳基、羥基烷基、或鹵代烷基；R7為烷基、烷芳基、羥基烷基、或芳基；R8為獨立地選自H、烷基、烷芳基、羥基烷基、氨基烷基、酰基、或芳基；B.紫杉烷類基任何紫杉烷類基都可以用于進(jìn)行本發(fā)明。紫杉烷類基是已知的并可以根據(jù)已知的技術(shù)制備。見Merck Index，Monograph No.1783(12thed.1996)。
優(yōu)選的紫杉烷為具有現(xiàn)有技術(shù)中已知的能增強微管形成的成分，如紫杉醇和多西紫杉醇(docetaxel)的物質(zhì)?，F(xiàn)有技術(shù)中紫杉醇和多西紫杉醇的結(jié)構(gòu)是已知的?？梢杂糜谶M(jìn)行本發(fā)明的紫杉烷類基的例子包括，但是不限于授予Kingston等的美國專利US5614645；授予Chattopadhyay等的美國專利US6028206；授予Kingston等的美國專利US5411984；和授予Magnus的美國專利US5508447(所有這些引用的發(fā)明公開作為參考文獻(xiàn)全文引入)。能用于進(jìn)行本發(fā)明的紫杉烷類基用式III代表 其中R11為選自H、烷基、烷氧基、氨基烷基和?；?；R12和R13為各自獨立地選自H、烷基、芳基、烷氧基、烷芳基、羥基烷基、鹵代烷基、氨基烷基、二烷基氨基、二烷基氨基烷基、環(huán)氨基烷基、芳氧基、硝基、氰基，和鹵素；或其藥學(xué)上可接受的鹽。
C.連接部分可以用于形成兩個功能部分的共價共軛物的連接基是現(xiàn)有技術(shù)中已知的。所用的特定的連接基依賴于特定的共價共軛物的合成方法，它是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所能理解的。適當(dāng)?shù)倪B接基應(yīng)當(dāng)允許將喜樹堿(C’)和紫杉烷類(T)基相連提供代謝穩(wěn)定的共軛物(如，共軛物的空間位阻不能影響C’和T基的結(jié)合)。
一般的，該連接部分包括脂肪族、芳香族、或脂肪族和芳香族的混和基團(tuán)(如，烷基、芳基、烷芳基，等)和含有一個或多個氨基酸或如N，O，S等雜原子。如，連接基L可以是式-La-Lb-的化合物，其中Lb可有可無并且La和Lb各自獨立地選自下述基團(tuán)-(CH2)n-，
和 其中n為0到6，a為0到3和b為0到3；且R25選自烯烴、鏈烯基和亞芳基(aryleny1)。
連接基也可以包括一個在紫杉烷類基的7位上和下式IV的喜樹堿基的R1的連接部分-X-R21-A- (IV)其中X為吸電子基；和R21選自烯烴和芳基烯烴；A選自氨基和亞胺。
連接基也可以包括含有式V的連接部分
其中R21選自烯烴和芳基烯烴；R22選自H和烷基。
D.具體化合物在本發(fā)明范圍的具體化合物包括，但不限于

E.化合物的合成本發(fā)明的化合物的合成取決于使用的特定的連接化學(xué)。下述的一般合成方法的變更對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是顯而易見的，它們也均屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。一般的，式I的共軛物可以通過在苯中回流紫杉烷類化合物和喜樹堿制備。
作為具體例子，上述的共軛物16到20可以通過溶解7-甲酰基喜樹堿和紫杉烷類于無水苯中制得。然后該溶液在4A分子篩上回流過夜。過濾混合物并真空蒸發(fā)得到紫杉醇-喜樹堿共軛物粗品。以CHCl3-MeOH(1∶1)為洗脫劑，用Sephadex LH-20柱色譜純化產(chǎn)物。
F.藥學(xué)可接受的鹽此處使用的術(shù)語“活性劑”包括該化合物藥學(xué)可接受的鹽。藥學(xué)可接受的鹽為保留了母體化合物想要的生物活性又沒有不希望有的毒理學(xué)副作用的鹽。這樣的鹽的例子為(a)無機(jī)酸形成的酸加成鹽，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等；和有機(jī)酸形成的鹽如醋酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡萄糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、鞣酸、棕櫚酸、褐藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等；和(b)元素陰離子如氯、溴和碘形成的鹽。
用于制備本發(fā)明的組合物的活性劑也可以以活性劑的藥學(xué)可接受的游離堿的形式存在。因為該化合物的游離堿比鹽難溶、使用游離堿可以使活性劑更持續(xù)釋放到靶區(qū)域。在靶區(qū)域存在的沒有進(jìn)入溶液中的活性劑不會引起生理學(xué)響應(yīng)，但是可作為一個能逐漸的進(jìn)入到溶液中的生物可利用藥物的倉庫。
G.藥物制劑本發(fā)明的式I的喜樹堿和紫杉烷類化合物可用作藥學(xué)活性劑，能以大批形式使用。但是，更優(yōu)選的，這些化合物被配制成藥物制劑給藥。任一合適的藥物制劑都可以用作本發(fā)明的化合物給藥的載體。
式I的化合物可以制備成治療多種病癥的藥劑。在制作根據(jù)本發(fā)明的藥劑時，式I的化合物及其藥學(xué)可接受的鹽、或二者的酸衍生物(此后稱之為“活性化合物”)典型的和尤其是可接受的載體混和在一起。當(dāng)然載體必須與制劑中的其他成分可配伍，且不能對患者有害。載體可以是固體或液體，或均是，且優(yōu)選與化合物配制為單位劑量的制劑，如，片劑、其含有0.5％到95％重量的活性化合物。本發(fā)明的制劑可以包括一個或多個這樣的活性化合物，其可以用藥學(xué)公知技術(shù)，主要包括組分的混和，任選的包括一或多種附加成分，來進(jìn)行制備。
本發(fā)明的制劑包括適于經(jīng)口、直腸、局部、口腔(buccal)(如舌下)、腸胃道外(例如，皮下、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、或靜脈內(nèi))和經(jīng)皮給藥，但是在任何給定情形中，大多數(shù)適當(dāng)給藥途徑有賴于待治療病癥的特點和嚴(yán)重程度以及所使用的特定活性化合物的特性。
適于口服的制劑可以以含有事先確定量的活性化合物的獨立單元存在，如膠囊、藥包、錠劑、或片劑；如粉末或顆粒；如水或非水液體的溶液或懸濁液；或水包油或油包水型乳劑。這樣的制劑可通過適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)的手段制得，包括將活性化合物和適當(dāng)載體(其可以含有一種或多種上述的附加成分)進(jìn)行混合的步驟。
一般的，本發(fā)明的制劑可以通過將活性化合物和液態(tài)或細(xì)分的固態(tài)載體、或二者均有時進(jìn)行均一和緊密的混和，然后，如果必要，將最終混合物成型。例如，片劑可以通過將含有活性化合物、任選一種或多種附加成分的粉末或顆粒進(jìn)行擠壓或成型來制得。被擠壓的片劑可以通過將自由流動狀態(tài)的化合物，如粉末或顆粒任選與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑，和/或表面活性劑/分散劑混合，在適當(dāng)?shù)臋C(jī)器中擠壓而制得。成型片劑可以在適當(dāng)?shù)臋C(jī)器中模壓成型，粉末化合物用惰性液態(tài)粘合劑潤濕。
適于口腔(舌下)給藥的制劑包括錠劑，其中含有處于調(diào)味基中的活性化合物，所述調(diào)味基通常為蔗糖和阿拉伯樹膠或黃蓍膠；和軟錠劑，其中含有處于惰性基質(zhì)如凝膠和甘油或蔗糖和阿拉伯樹膠的化合物。
適于非腸道給藥的本發(fā)明的制劑通常含有活性化合物的無菌含水制劑，該制劑優(yōu)選與預(yù)定的使用者的血液等壓。這些制劑可以通過皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、或皮膚內(nèi)注射方式給藥。這些制劑通?？梢酝ㄟ^將化合物與水或甘氨酸緩沖溶液混和對得到的溶液滅菌并使之與血液等壓而制得。
適于直腸給藥的制劑優(yōu)選單元劑量的栓劑。它們可以通過將活性化合物與一種或多種慣用的固體載體，如可可油混和，然后使得到的混合物成型而得。
適于皮膚局部用藥的制劑優(yōu)選為藥膏、乳劑、洗液、糊膏、凝膠、噴霧劑、氣霧劑、或油的形式。所使用的載體可以包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇類、透皮增強劑，和它們兩種或以上的結(jié)合。
適于經(jīng)皮給藥的制劑可以以獨立的貼劑形式存在，適合于保持與受者表皮長時間的緊密接觸。適于經(jīng)皮給藥的制劑也能以離子電滲療法給藥(見，例如，Pharmaceutical Research 3(6)318(1986))，且典型的以活性化合物的任選緩沖水溶液的形式。適合的制劑包括檸檬酸鹽或二\三緩沖溶液(pH6)或乙醇/水和含0.01到0.2M活性成分。
H.使用方法除式I化合物之外，本發(fā)明還提供有用的治療方法。例如，本發(fā)明提供一種引起抗腫瘤活性的方法。更具體的，本發(fā)明提供一種抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I的方法。該方法包括將拓?fù)洚悩?gòu)酶在體內(nèi)或體外與抑制活性有效量的式I化合物接觸。對拓?fù)洚悩?gòu)酶I的抑制是抑制腫瘤或癌細(xì)胞生長的有用手段。
本發(fā)明還提供引起細(xì)胞分化的方法。該方法包括將癌細(xì)胞與分化有效量的式I化合物接觸?？梢员环只陌┘?xì)胞包括小細(xì)胞肺癌、睪丸癌、淋巴癌、白血病、食道癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、肝癌和前列腺癌的細(xì)胞。
本發(fā)明還提供一種對受癌癥折磨的主體進(jìn)行癌癥治療的方法。該方法包括對主體施用治療癌癥有效量的式I化合物。該方法可用于治療多種癌細(xì)胞，包括但是不限于小細(xì)胞肺癌、睪丸癌、淋巴癌、白血病、食道癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、肝癌和前列腺癌。
使用本發(fā)明的方法的受治主體典型的為人類主體，盡管本發(fā)明的方法可以根據(jù)獸醫(yī)目的而用于其他主體，特別是哺乳動物主體，包括但是不限于馬、牛、狗、兔子、家禽、羊等。如上所述，本發(fā)明提供包括在藥學(xué)可接受的載體內(nèi)含有式I化合物或其藥學(xué)可接受的鹽的藥物制劑，其可以任何適當(dāng)形式給藥，包括但是不限于口、直腸、局部、口腔、腸胃道外、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)和經(jīng)皮給藥。
任何具體化合物的治療有效劑量因化合物、患者的不同稍有不同，有賴于患者的病癥和給藥途徑。作為一般的提議，從約0.1到約50mg/kg的劑量具有治療效果，對于口服和/或氣霧劑給藥還潛在的可以有更高的劑量。高劑量的毒性將靜脈劑量限制在較低水平如約10mg/kg，所有的重量均以活性基質(zhì)的重量計算，包括使用鹽的情況。對于靜脈內(nèi)和肌肉內(nèi)給藥，典型的劑量為從約0.5mg/kg到約5mg/kg。對于口服給藥，劑量為從約10mg/kg到約50mg/kg。
本發(fā)明用下列的非限定性實施例進(jìn)一步解釋。
實施例A.材料和方法紫杉醇(1)從臺灣Yung Shin Pharmaceutical Ind.Co.，Ltd.購得。如Bastow等(1997)Bioorg.Med.Chem.51481所報道從(2)制備7-甲?；矘鋲A(5)(如圖1所示)。所有劑和溶劑均為劑級或在使用前通過標(biāo)準(zhǔn)方法純化。以TMS作為內(nèi)標(biāo)，在Varian Gemini-300光譜儀上得到1HNMR譜。化學(xué)位移(δ值)和偶合常數(shù)(J值)分別以ppm和Hz為單位。用JASCO DIP-1000數(shù)字旋光儀測量旋光度。在硅膠60(Merck 230-400目)上進(jìn)行柱色譜，使用預(yù)涂硅膠的鋁板(Aldrich，Inc.)進(jìn)行薄層色譜(TLC)，用Atlantic Microlab Inc.，Norcross，GA.進(jìn)行元素分析。使用如Berger et al.(1954)J.Am.Chem soc.765552所述的標(biāo)準(zhǔn)方法使用氯甲酸芐酯從適當(dāng)?shù)陌被嶂苽銷-Cbz-氨基酸，N-Cbz-β-丙氨酸(Sigma)除外。如Guy et al.(1996)Chem.Biol.31021所述來合成2’-O-Cbz-紫杉醇。
2’-O-Cbz-紫杉醇的7-O-?；耐ㄓ梅椒?。在氮氣保護(hù)下，2’-O-Cbz-紫杉醇和4-(N，N-二甲基氨基)吡啶(1.0當(dāng)量)溶于無水二氯甲烷中(5ml)，用適當(dāng)?shù)腘-Cbz-氨基酸(5.0當(dāng)量)和二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC，5.0當(dāng)量)在室溫處理過夜?；旌衔镉枚燃淄?5ml)稀釋并過濾除去尿素沉淀。真空蒸發(fā)溶劑，得到的殘余物用硅膠柱色譜純化，使用正己烷-乙酸乙酯溶劑體系(2∶1到1∶1)，得到所要的單一產(chǎn)物2’-O-Cbz-7-O-酰基紫杉醇。
2’-O-Cbz-7-(N-Cbz-β-丙氨酰基)-紫杉醇(6)。
2’-O-Cbz-7-(N-Cbz-β-丙氨?；?-紫杉醇(6).產(chǎn)率90.5％(以59.3mg的2’-O-Cbz-紫杉醇為原料)；白色粉末，[α]D-44.7°(c 0.76，CHCl3)；1HNMR(CDCl3)δ1.16(3H，s)，1.22(3H，s)，1.81(3H，s)，2.00(3H，s)，2.06(3H，s)，2.46(3H，s)，3.46(2H，m)，3.96(1H，d.J＝7.0Hz)，4.20(1H，d，J＝8.5Hz)，4.33(1H，d，J＝8.5Hz)，4.95(1H，d，J＝8.5Hz)，5.11(2H，m)，5.17(2H，m)，5.46(1H，d.J＝2.5Hz)，5.64(1H，dd，J＝7.2，9.8Hz)，5.70(1H.d.J＝7.0Hz)，5.77(1H，t，J＝5.1Hz)，5.98(1H，d，J＝9.0Hz)，6.26(1H，t，J＝9.3Hz)，6.29(1H，s)，6.94(1H，d，J＝9.0Hz)，7.30-7.42(band，17H)，7.44-7.54(3H，m)，7.62(1H，m)，7.74(2H，d，J＝8.5Hz)，8.13(2H，d，J＝8.5Hz)；FAB-MS m/z 1193[M+1]+.所有數(shù)據(jù)都與文獻(xiàn)報道值相符。
2’-O-Cbz-7-(N-Cbz-4-氨基丁酰基)-紫杉醇(7).產(chǎn)率97.2％(以69.1mg的2’-O-Cbz-紫杉醇為原料)；白色粉末，[α]D-31.5°(c 0.46，CHCl3)；1H NMR(CDCl3)δ1.16(3H，s)，1.21(3H，s)，1.81(3H，s)，1.99(3H，s)，2.09(3H，s)，2.45(3H，s)，3.19-3.40(2H，m)，3.94(1H，d.J＝6.9Hz)，4.20(1H，d，J＝8.5Hz)，4.33(1H，d，J＝8.5Hz)，4.95(1H，d，J＝8.5Hz)，5.08(2H，s)，5.17(2H，m)，5.45(1H，d.J＝2.4Hz)，5.57(1H，dd，J＝6.9，10.2Hz)，5.71(1H.d，J＝6.9Hz)，5.73(1H，t，J＝5.1Hz)，5.98(1H，dd，J＝2.4，9.0Hz)，6.24(1H，s)，6.26(1H，t，J＝9.3Hz)，6.92(1H，d，J＝9.0Hz)，7.27-7.46(band，16H)，7.48-7.54(3H，m)，7.62(1H，m)，7.73(2H，d，J＝8.5Hz)，8.13(2H，d，J＝8.5Hz)；ESI-MS m/z 1230[M+Na]+.
2’-O-Cbz-7-(N-Cbz-6-氨基己?；?-紫杉醇(8).產(chǎn)率94.7％(以78.3mg的2’-O-Cbz-紫杉醇為原料)；白色粉末，[α]D-44.0°(c 1.04，CHCl3)；1H NMR(CDCl3)δ1.16(3H，s)，1.21(3H，s)，1.81(3H，s)，2.00(3H，s)，2.13(3H，s)，2.45(3H，s)，3.19(2H，dd，J＝6.3，12.9Hz)，3.96(1H，d.J＝6.6Hz)，4.19(1H，d，J＝8.5Hz)，4.32(1H，d，J＝8.5Hz)，4.96(1H，d，J＝8.7Hz)，5.08(2H，s)，5.16(2H，m)，5.45(1H，d.J＝2.4Hz)，5.60(1H，dd，J＝7.2，10.5Hz)，5.71(1H.d，J＝6.9Hz)，5.98(1H，dd，J＝3.0，9.5Hz)，6.26(1H，t，J＝9.0Hz)，6.28(1H，s)，6.95(1H，d，J＝9.3Hz)，7.26-7.43(band，16H)，7.46-7.53(3H，m)，7.61(1H，m)，7.73(2H，d，J＝8.5Hz)，8.13(2H，d，J＝8.5Hz)；FAB-MS m/z 1236[M+1]+.
2’-O-Cbz-7-(N-Cbz-4-甲基氨基芐酰基)-紫杉醇(9).產(chǎn)率89.1％(以70.4mg的2’-O-Cbz-紫杉醇為原料)；白色粉末，[α]D-28.2°(c 0.99，CHCl3)；1H NMR(CDCl3)δ1.19(3H，s)，1.21(3H，s)，1.95(3H，s)，1.97(3H，s)，2.04(3H，s)，2.48(3H，s)，4.05(1H，d.J＝6.9Hz)，4.24(1H，d，J＝8.5Hz)，4.37(1H，d，J＝8.5Hz)，4.42(1H，d，J＝6.0Hz)，5.01(1H，d，J＝8.4Hz)，5.10-5.22(6H，m)，5.48(1H，d.J＝2.7Hz)，5.74-5.81(2Hm)，5.99(1H，dd，J＝2.7，9.2Hz)，6.27(1H，t，J＝9.0Hz)，6.41(1H，s)，6.97(1H，d，J＝9.3Hz)，7.29-7.42(band，19H)，7.46-7.54(3H，m)，7.62(1H，m)，7.74(2H，d，J＝8.5Hz)，7.89(2H，d，J＝8.4Hz).8.15(2H，d，J＝8.5Hz)；ESI-MS m/z 1277[M+Na]+.
2’-O-Cbz-7-(N-Cbz-4-(4-氨基苯基)-丁?；?-紫杉醇(10).產(chǎn)率83.8％(以66.8mg的2’-O-Cbz-紫杉醇為原料)；白色粉末，[α]D-46.5°(c0.40，CHCl3)；1H NMR(CDCl3)δ1.17(3H，s)，1.21(3H，s)，1.81(3H，s)，2.01(3H，s)，2.13(3H，s)，2.45(3H，s)，3.96(1H，d.J＝6.9Hz)，4.19(1H，d，J＝8.5Hz)，4.33(1H，d，J＝8.5Hz)，4.96(1H，d，J＝8.1Hz)，5.12-5.21(4H，m)，5.46(1H，d.J＝2.7Hz)，5.60(1H，dd，J＝7.2，10.5Hz)，5.70(1H.d，J＝7.2Hz)，5.98(1H，dd，J＝2.7，9.2Hz)，6.26(1H，t，J＝9.0Hz)，6.29(1H，s)，6.66(1H，s)，6.94(1H，d，J＝9.3Hz)，7.12(2H，d，J＝8.7Hz)，7.26-7.42(band，19H)，7.46-7.53(3H，m)，7.61(1H，m)，7.73(2H，d，J＝8.5Hz)，8.13(2H，d，J＝8.5Hz)；FAB-MS m/z 1306[M+Na]+.
除去芐氧基羰基(Cbz)保護(hù)基的通用方法。在氮氣保護(hù)下，用50wt％的5％鈀炭(Degussa type E101 NO/W)處理紫杉醇的溶液(如圖2所示6-10)的甲醇溶液，然后置于氫氣中(40psi)。在Parr儀器中振蕩混合物7h，然后過濾內(nèi)容物除去催化劑，真空蒸發(fā)干燥得到所要的脫保護(hù)的化合物11-15(如圖2所示)。
7-O-β-丙氨酰基紫杉醇(11).產(chǎn)率81.2％(以47.2mg的6為原料)；白色薄膜，[α]D-39.1°(c 0.34，MeOH)；1H NMR(CD3OD)δ1.10(3H，s)，1.16(3H，s)，1.78(3H，s)，1.88(3H，s)，2.16(3H，s)，2.37(3H，s)，3.12-3.22(2H，m)，3.90(1H，d，J＝7.0Hz)，4.20(2H，dd，J＝7.0，14.0Hz)，4.73(1H，d，J＝6.0Hz)，5.00(1H，m)，5.64(3H，m)，6.15(1H，br t，J＝6.2Hz)，6.23(1H，s)，7.28-7.68(band，11H)，7.85(2H，d，J＝8.5Hz)，8.10(2H，d，J＝8.5Hz)；FAB-MS m/z 925[M+1]+.所有數(shù)據(jù)都與文獻(xiàn)報道值相符。
7-O-(4-氨基丁?；?紫杉醇(12).產(chǎn)率92.7％(以59.1mg的7為原料)；白色薄膜，[α]D-29.7°(c 0.37，MeOH)；1H NMR(CD3OD)δ1.11(3H，s)，1.16(3H，s)，1.78(3H，s)，1.87(3H，s)，2.16(3H，s)，2.37(3H，s)，3.01(2H，t，J＝7.5Hz)，3.90(1H，d，J＝6.9Hz)，4.20(2H，br t，J＝8.7Hz)，4.75(1H，d，J＝5.4Hz)，5.00(1H，d，J＝9.3Hz)，5.59-5.66(3H，m)，6.15(1H，br t，J＝6.2Hz)，6.21(1H，s)，7.26-7.69(band，11H)，7.85(2H，d，J＝8.5Hz)，8.10(2H，d，J＝8.5Hz)；ESI-MS m/z939[M+1]+.
7-O-(6-氨基己酰基)紫杉醇(13).產(chǎn)率81.1％(以67.1mg的8為原料)；白色薄膜，[α]D-26.0°(c 0.53，MeOH)；1H NMR(CD3OD)δ1.11(3H，s)，1.16(3H，s)，1.77(3H，s)，1.88(3H，s)，2.14(3H，s)，2.37(3H，s)，2.92(2H，m)，3.90(1H，d，J＝6.9Hz)，4.20(2H，m)，4.75(1H，d，J＝5.4Hz)，4.99(1H，d，J＝9.0Hz)，5.58(1H，dd，J＝7.8，10.5Hz)，5.60-5.70(2H，m)，6.15(1H，br t，J＝6.2Hz)，6.24(1H，s)，7.26-7.72(band，11H)，7.85(2H，d，J＝8.5Hz)，8.10(2H，d，J＝8.5Hz)；FAB-MS m/z 968[M+1]+.
7-O-(4-甲基氨基苯甲?；?紫杉醇(14).產(chǎn)率96.7％(以58.1mg的9為原料)；白色薄膜，[α]D-12.9°(c 0.38，MeOH)；1H NMR(CD3OD)δ1.13(3H，s)，1.15(3H，s)，1.91(9H，s)，2.40(3H，s)，3.90(1H，d，J＝6.9Hz)，4.18-4.30(4H，m)，4.76(1H，d，J＝5.7Hz)，5.05(1H，m)，5.65(1H，d，J＝5.1Hz)，5.70(1H，d，J＝7.2Hz)，5.76(1H，dd，J＝7.2，10.5Hz)，6.16(1H，br t，J＝6.2Hz)，6.35(1H，s)，7.28-7.71(band，13H)，7.85(2H，d，J＝8.5Hz)，7.94(2H，d，J＝8.5Hz)，8.12(2H，d，J＝8.5Hz)；ESI-MS m/z 1009[M+Na]+.
7-O-(4-(4-氨基苯基)丁酰基)紫杉醇(15).產(chǎn)率81.3％(以67.1mg的10為原料)；白色薄膜，[α]D-45.3°(c 0.15，MeOH)；1H NMR(CD3OD)δ1.11(3H，s)，1.14(3H，s)，1.77(3H，s)，1.89(3H，s)，2.09(3H，s)，2.36(3H，s)，2.46(2H，t，J＝5.7Hz)，3.89(1H，d，J＝6.9Hz)，4.19(2H，brs)，4.75(1H，d，J＝5.4Hz)，4.97(1H，d，J＝9.6Hz)，5.56(1H，dd，J＝7.8，10.5Hz)，5.63-5.66(2H，m)，6.15(1H，br t，J＝6.2Hz)，6.26(1H，s)，6.67(2H，d，J＝8.4Hz)，6.93(2H，d，J＝8.4Hz)，7.28(1H，m)，7.38-7.68(band，10H)，7.84(2H，d，J＝8.5Hz)，8.10(2H，d，J＝8.5Hz)；FAB-MS m/z 1038[M+Na]+.
合成紫杉醇-喜樹堿共軛物(16-20)的通用方法(16-20)。紫杉烷類(11-15)和7-甲?；矘鋲A(1.2當(dāng)量)溶于無水苯(10ml)中形成的溶液在4A分子篩上回流過夜。過濾混合物并真空蒸發(fā)得到紫杉醇-喜樹堿共軛物粗品(如圖2所示16-20)。產(chǎn)物用以CHCl3-MeOH(1∶1)為洗脫液的Sephadex LH-20柱色譜純化。共軛物16-20的元素分析數(shù)據(jù)見下表1。
共軛物16產(chǎn)率85.4％[以14.2mg(0.015mmol)的11為原料]；淺黃色無定形固體，[α]D-33.9°(c 0.18，CHCl3)，1H NMR(CDCl3)δ1.02(3H，t，J＝7.5Hz)，1.18(3H，s)，1.25(3H，s)，1.80(3H，s)，1.85(3H，s)，2.19(3H，s)，2.37(3H，s)，3.92(1H，d，J＝6.6Hz)，4.14和4.29(each 1H，d，J＝8.4Hz)，4.80(1H，brs)，4.90(1H，d，J＝9.3Hz)，5.21(1H，d，J＝16.5Hz)，5.40(2H，s)，5.58-5.70(3H，m)，5.80(1H，dd，J＝8.9，2.1Hz)，6.19(1H，t，J＝9.0Hz)，6.24(1H，s)，7.27-7.86(16H，m)，8.09(2H，d，J＝7.2Hz)，8.27(1H，d，J＝8.4Hz)，8.45(1H，d，J＝8.4Hz)，9.32(1H，s)；FAB-MS m/z(rel.int.)1284[M+1]+(35)，1224(15)，940(51)，449(77)，289(98)，240(100)。分析值(C71H72N4O18)理論值C，67.18；H，5.72.測定值C，67.12；H，5.69.
共軛物17產(chǎn)率60.7％[以27.0mg(0.029mmol)的12為原料]；淺黃色無定形固體，[α]D-17.2°(c 0.47，CHCl3)，1H NMR(CDCl3)δ1.04(3H，t，J＝7.5Hz)，1.16(3H，s)，120(3H，s)，1.81(3H，s)，1.83(3H，s)，2.04(3H，s)，2.38(3H，s)，3.81-3.93(4H，m)，4.18和4.31(each 1H，d，J＝8.4Hz)，4.81(1H，dd，J＝6.2，2.7Hz)，4.93(1H，d，J＝8.7Hz)，5.30(1H，d，J＝16.5Hz)，5.50(2H，s)，5.58(1H，dd，J＝10.2，6.9Hz)，5.67(1H，d，J＝6.9Hz)，5.74(1H，d，J＝16.5Hz)，5.80(1H，dd，J＝8.9，2.4Hz)，6.17(1H，t，J＝9.0Hz)，6.23(1H，s)，7.14(1H，d，J＝9.3Hz)，7.30-7.87(15H，m)，8.10(2H，d，J＝7.2Hz)，8.28(1H，d，J＝8.4Hz)，8.50(1H，d，J＝8.4Hz)，9.32(1H，s)；ESI-MS m/z1320[M+Na]+.分析值(C72H74N4O18)理論值C，67.38；H，5.81.測定值C，67.30；H，5.79.
共軛物18產(chǎn)率69.3％[以27.8mg(0.029mmol)的13為原料]；淺黃色無定形固體，[α]D-41.3°(c 0.15，CHCl3)，1H NMR(CDCl3)δ1.03(3H，t，J＝7.5Hz)，1.15(3H，s)，1.25(3H，s)，1.57(3H，s)，1.76(3H，s)，2.10(3H，s)，2.28(3H，s)，3.80(1H，d，J＝6.6Hz)，4.13和4.27(each 1H，d，J＝8.4Hz)，4.79(1H，d，J＝2.7Hz)，4.85(1H，d，J＝8.1Hz)，5.31(1H，d，J＝16.5Hz)，5.46(1H，dd，J＝10.2，7.2Hz)，5.55(2H，s)，5.61(1H，d，J＝6.9Hz)，5.74(2H，m)，6.07(1H，t，J＝9.0Hz)，6.12(1H，s)，7.18(1H，d，J＝9.3Hz)，7.32-7.88(15H，m)，8.08(2H，d，J＝7.2Hz)，8.30(1H，d，J＝8.4Hz)，8.52(1H，d，J＝8.4Hz)，9.30(1H，s)；ESI-MS m/z1348[M+Na]+.分析值(C74H78N4O18)理論值C，67.77；H，5.99.測定值C，67.69；H，5.98.
共軛物19產(chǎn)率64.3％[以28.2mg(0.029mmol)的14為原料]；淺黃色無定形固體，[α]D-8.0°(c 0.40，CHCl3)，1H NMR(CDCl3)δ1.02(3H，t，J＝7.5Hz)，1.19(3H，s)，1.25(3H，s)，1.95(3H，s)，2.17(3H，s)，2.40(3H，s)，2.63(3H，s)，4.00(1H，d，J＝6.3Hz)，4.23和4.33(each 1H，d，J＝8.1Hz)，4.82(1H，d，J＝2.7Hz)，4.98(1H，d，J＝8.7Hz)，5.14(2H，brs)，5.28(1H，d，J＝16.2Hz)，5.52(2H，s)，5.67-5.76(2H，m)，5.81(1H，dd，J＝8.7，2.1Hz)，6.19(1H，t，J＝9.0Hz)，6.37(1H，s)，7.21-7.96(20H，m)，8.12(2H，d，J＝7.2Hz)，8.27(1H，d，J＝8.4Hz)，8.42(1H，d，J＝8.4Hz)，9.39(1H，s)；ESI-MS m/z 1396[M+Na]+.分析值(C76H74N4O18)理論值C，68.56；H，5.60.測定值C，68.40；H，5.56.
共軛物20產(chǎn)率55.1％[以23.3mg(0.023mmol)的15為原料]；淺黃色無定形固體，[α]D-11.5°(c 0.27，CHCl3)，1H NMR(CDCl3)δ1.06(3H，t，J＝7.5Hz)，1.18(3H，s)，1.25(3H，s)，1.84(3H，s)，1.85(3H，s)，2.17(3H，s)，2.39(3H，s)，3.94(1H，d，J＝6.6Hz)，4.20和4.33(each 1H，d，J＝8.4Hz)，4.81(1H，brs)，4.96(1H，d，J＝9.3Hz)，5.33(1H，d，J＝16.5Hz)，5.58(1H，m)，5.70(1H，d，J＝5.7Hz)，5.73(2H，s)，5.81(1H，d，J＝5.7Hz)，6.19(1H，t，J＝9.0Hz)，6.26(1H，s)，7.08(1H，d，J＝9.3Hz)，7.27-7.80(18H，m)，7.88(1H，t，J＝7.2Hz)，8.12(2H，d，J＝7.2Hz)，8.33(1H，d，J＝8.4Hz)，8.56(1H，d，J＝8.4Hz)，9.55(1H，s)；ESI-MS m/z1368[M+Na]+.分析值(C78H78N4O18)理論值C，68.91；H，5.78.測定值C，68.86；H，5.77.
表1.共軛物16-20的元素分析數(shù)據(jù)

人體腫瘤細(xì)胞復(fù)制試驗。化合物被用作細(xì)胞生長抑制劑進(jìn)行測試，所針對的實體腫瘤系的limited panel包括KB(表皮樣癌，CL17)和名為KB-CPT的抗喜樹堿次系；HCT-8(回盲腸腺癌(ileocecaladenocarcinoma)，CCL244)；MCF-7(乳腺癌，HTB22)；PC-3(前列腺癌，CRL1435)；1A9(卵巢癌)和具有變異的β-微管蛋白的名為PTX10的抗紫杉醇次系?？顾幖?xì)胞系由Dr.Y.C.Cheng(Yale University，New Haven，CT)和Dr.P.Giannakakou(NIH，Bethesda，MD)饋贈。使細(xì)胞系適應(yīng)在補充25mM的Hepes，2％的NaHCO3，10％(v/v)的小牛胎血清和100μg/ml的卡那霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中生長。培養(yǎng)物在37℃保持在5％的CO2氣氛中。使用Rubinstein et al.(1990)J.Natl.Cancer Inst.821113所記載的硫代羅丹明B微滴定板試驗，對化合物作為細(xì)胞復(fù)制抑制劑進(jìn)行評價。ED50值，相對于對照組持續(xù)暴露三天后50％抑制細(xì)胞系復(fù)制的化合物的濃度，從應(yīng)用Prizrn(GraphPad軟件，SanDiego，CA)得到的數(shù)據(jù)的量效圖中得出。
DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I活性測試。作為酶催化的質(zhì)粒DNA松弛(relaxation)的抑制劑，對化合物進(jìn)行了測試。反應(yīng)物包括0.5μg的pBR322DNA和0.5U人類DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I(TopoGen，Columbus，OH)，50μM的化合物和Krishnan et al.(2000)Anticancer Drug Design15255所描述的緩沖液組分。在37℃保持15分鐘后，通過添加蛋白酶K(0.1mg/ml)和1％(w/v)SDS終止反應(yīng)。在50℃保持1小時后，DNA溶入含有0.5mg/ml溴化乙錠的標(biāo)準(zhǔn)TBE緩沖溶液的1％(w/v)瓊脂糖凝膠中，使用偏振片667膠片在UV光下成像。
B.結(jié)果與討論這項工作的目標(biāo)在于研究通過制備紫杉醇(1)和喜樹堿(2)衍生物間的共軛物，能否制得顯示多種抗腫瘤活性或提高針對抗藥細(xì)胞的活性的抗腫瘤劑，和其抗腫瘤活性如何受共軛作用的影響。此處我們報道了紫杉醇-喜樹堿共軛物作為細(xì)胞毒性劑和DNA topo I抑制劑的合成和評價。
連接位置的選擇是基于紫杉烷核中C-7酯基的公知的耐受性(Nicolaou et al.(1994) Angew.Chem.Intl.Ed.Engl.10615，Guy et al.(1996)Chem.Biol.31021)和近期7-取代的喜樹堿類似物的SAR研究(Wang et al.(1994)Bioorg.Med.Chem.21397，Wang et al.(1990)J.Med.Chem.332660)。但是，紫杉醇側(cè)鏈的C’-2羥基通常是最有反應(yīng)活性的，僅當(dāng)C-2’被保護(hù)時才能選擇?；疌-7。使用Nicolaou et al.(1994)Angew.Chem.Intl.Ed.Engl.10615的方法制備C-7氨基官能化的紫杉醇(11-15)。這樣，在CH2Cl2中的DCC和DMAP存在下，用N-Cbz-氨基酸處理2’-羧芐基(Cbz)-紫杉醇得到高產(chǎn)量的6-10。然后氫化還原除去兩個Cbz基團(tuán)得到想要的C-7氨基-官能化的紫杉醇(11-15)。如略圖1所示，在苯中通過11-15與7-甲?；?喜樹堿(5)共軛得到五種紫杉醇-喜樹堿共軛物(16-20)?；衔?6-20在硅膠上不穩(wěn)定(母體化合物是再生的)，但是可以用Sephadex LH-20柱色譜純化。所有共軛物(16-20)都在1HNMR譜中顯示出亞胺基質(zhì)子在δ9.30-.55的特征峰。
對上述五種共軛物(16-20)進(jìn)行了針對包括如Rubinstein et al.(1990)J.Natl.Cancer Inst.821113所述的抗紫杉醇和抗喜樹堿衍生物的人類腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞毒性測試。結(jié)果顯示于表2中，并給出紫杉醇(1)和喜樹堿(2)的值作為對比。
表2.紫杉醇-喜樹堿共軛物16-20作為癌細(xì)胞復(fù)制a抑制劑的活性化合物 細(xì)胞系/ED50KB KB-IA9 IA9-HCT8 MCF-7 PC-3平均CPT PTX10 ED50b紫杉醇-12.1-12.2 -12.2-11.7 -7.1 -13.9 -10.3 -11.1喜樹堿-10.8-7.5 -10.2-9.4-9.3 -7.1-7.1-8.916＜-11.0 -11.1 ＜-11.0 -10.9 -10.6 -7.1-7.0＜-9.3(67)(76)17-10.4-9.7 -10.2-10.5 -10.0 -7.1-7.1-9.018-9.3 -8.1 -10.0-10.5 -10.6 -7.5-7.5-9.019-8.5 -8.9 -8.1 -8.4-8.1 -6.0-7.5-7.620-10.8-8.1 -8.3 -7.1-7.4 ＞-4.0 ＞-5.0 ＞-7.1(48)(45)a使用如Krishnan et al.(2000)Anticancer Drug Design 15255所述的標(biāo)準(zhǔn)方法確定對腫瘤細(xì)胞系復(fù)制的效果。細(xì)胞系/ED50以log10M表示(不超過5％的平行測定)。如果在最高測試濃度抑制＜50％或在最低時＞50％，觀察到的抑制百分比為括號內(nèi)的值。b平均值來自于HTCL數(shù)據(jù)不包括抗藥變體的值。
共軛物對MCF-7(乳腺癌)和HCT-8(結(jié)腸腺癌)的活性見圖3，分別見圖A和圖B。所有這些共軛物都是相對于2(喜樹堿)具有更強活性的強效的腫瘤細(xì)胞復(fù)制抑制劑。對于抗喜樹堿的KB-CPT細(xì)胞也顯示了比2更強的活性。如圖3所示明顯的是，16-18對于HCT-8細(xì)胞復(fù)制具有比1(紫杉醇)和2更強的活性?？紤]到紫杉醇和喜樹堿部分的連接部分的構(gòu)效關(guān)系(SAR)，表明紫杉醇和喜樹堿通過脂肪族氨基酸連接的16-18相比于紫杉醇和喜樹堿通過芳香族氨基酸連接的19和20，具有更好的細(xì)胞毒活性。
以Krishnan et al.(2000)Anticancer Drug Desigen 15255所述的方式，在體外對作為人類DNA topo I活性抑制劑的共軛物16-20也進(jìn)行了測試。測試中所有這些共軛物顯著不如2有效。共軛物16，18和19僅在50M顯示了很小的活性，而17和20則沒有活性。沒有共軛物能抑制DNA松弛(relaxation)。
基于針對抗藥細(xì)胞系復(fù)制的活性，人們可以得出結(jié)論，即共軛物僅簡單以“弱紫杉烷”作用，但是活性譜，尤其是針對MCF-7和HCT-8(圖3)的活性，與此結(jié)論相矛盾。后者結(jié)論顯示，相比于1和2，16-18的細(xì)胞毒性曲線非常與眾不同。另外，由于從DNA topo I抑制試驗的結(jié)果顯示共軛物，不同于2，在體外并不是DNA topo I抑制劑，這很可能是通過共軛形成了新的作用機(jī)理。
前述的是用于說明本發(fā)明，但是不解釋為對其的限制。本發(fā)明通過下述權(quán)利要求，且包括權(quán)利要求的等價方案來限定。
權(quán)利要求
1.式I的化合物C’-L-T (I)其中C’為式II的喜樹堿基 其中R1選自H、烷基、醛、羰基、烷氧基、烷芳基、羥基烷基、鹵代烷基、氨基烷基、二烷基氨基、二烷基氨基烷基、環(huán)氨基烷基、芳基、芳氧基、C-烯糖、硝基、氰基和O-糖基；R2、R3、R4和R5各自獨立選自H、氨基、羥基、烷基、烷氧基、烷硫醇基、烷基氨基、氨基烷基、二(烷基)氨基、環(huán)氨基烷基、氨基烷氧基、芳基、芳氧基、C-烯糖、氰基、亞甲基二氧基、甲?；?、硝基、鹵素、疊氮基、酰胺基、肼基，通過氨基氮原子與A環(huán)鍵連的二十種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸之任一種、SR8、NR8R8或O-糖基；或R3和R4一起形成5或6元芳香環(huán)或二氧戊環(huán)；且其中R2和R3，R3和R4，或R4和R5連接；條件是R1，R2，R3，R4，和R5之一是與L連接的共價鍵；R6為H、鹵素、烷基、烷氧基、烷芳基、羥基烷基、或鹵代烷基；R7為烷基、烷芳基、羥基烷基、或芳基；R8為獨立地選自H、烷基、烷芳基、羥基烷基、氨基烷基、?；?、或芳基；L是連接部分；T為下式III的紫杉烷類基； 其中R11選自H、烷基、烷氧基、氨基烷基和?；籖12和R13各自獨立地選自H、烷基、芳基、烷氧基、烷芳基、羥基烷基、鹵代烷基、氨基烷基、二烷基氨基、二烷基氨基烷基、環(huán)氨基烷基、芳氧基、硝基、氰基，和鹵素；或其藥學(xué)上可接受的鹽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R1為甲?；?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R6為鹵素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R11為?；?，和R12和R13分別獨立地為苯基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R11為H，和R12為叔丁氧基和R13為苯基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中L為在所述的紫杉烷類基的7位和在所述下式IV的喜樹堿基的R1的連接部分-X-R21-A-(IV)其中X為吸電子基；和R21選自烯烴和芳基烯烴；和A選自氨基和亞胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中所述的連接部分包括酯和亞胺連接。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中所述的連接部分包括式V 其中R21選自烯烴和芳基烯烴；和R22選自H和烷基。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中所述的連接部分包括脂肪族氨基酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中所述的連接部分包括芳香族氨基酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中L是式-La-Lb-的連接部分，其中Lb可有可無并且La和Lb各自獨立地選自下述基團(tuán)-(CH2)n-， 和 其中n為0到6，a為0到3和b為0到3；且R25選自烯烴、烯基和亞芳基。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其具有下述結(jié)構(gòu) 和
13.藥物制劑，其中包括在藥學(xué)可接受載體中的根據(jù)權(quán)利要求1的化合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物制劑，其中所述載體為含水載體。
15.一種治療癌癥的方法，包括對需要的主體給以治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的化合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述的癌癥選自小細(xì)胞肺癌、睪丸癌、淋巴瘤、白血病、食道癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、肝癌和前列腺癌。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述的癌癥為乳腺癌。
18.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述的癌癥為卵巢癌。
19.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述的癌癥為前列腺癌。
20.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述的癌癥抗喜樹堿。
21.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述的癌癥抗紫杉醇。
22.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述的癌癥同時抗喜樹堿和紫杉醇。
23.一種引起細(xì)胞分化的方法，所述的方法包括將癌細(xì)胞與分化有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的化合物接觸。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述接觸步驟在體內(nèi)進(jìn)行。
25.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述接觸步驟在體外進(jìn)行。
26.一種抑制細(xì)胞有絲分裂的方法，包括將細(xì)胞與有絲分裂抑制有效量的根據(jù)權(quán)利要求1的化合物接觸。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述的接觸步驟在體內(nèi)進(jìn)行。
28.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中所述的接觸步驟在體外進(jìn)行。
全文摘要
式(I)的化合物C’－L－T(I)，其中C’為喜樹堿基；L為連接部分；T為紫杉醇類基；和其藥學(xué)可接受的鹽。該化合物在其他物質(zhì)中，可以用于對需要它的主體進(jìn)行癌癥治療，包括細(xì)胞分化和抑制細(xì)胞有絲分裂。
文檔編號A61K31/4375GK1649873SQ03809950
公開日2005年8月3日 申請日期2003年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月2日
發(fā)明者K·-H·李, H·奧特蘇, K·F·巴斯托和, F·－Y·李, Y·納卡尼斯 申請人:北卡羅來納查佩爾山大學(xué)