專(zhuān)利名稱(chēng)：神經(jīng)保護(hù)性螺甾烯醇藥用組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由β-淀粉樣蛋白沉積所誘發(fā)的細(xì)胞毒性疾病的新的預(yù)防或治療方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及包含螺甾烯醇的藥用組合物；包括將這種藥用組合物給予有需要的患者的治療方法；制備這種組合物的方法；這種組合物治療疾病的用途；這種組合物與其它治療藥物的聯(lián)合療法；以及包含這種組合物的藥盒。
背景技術(shù)：
神經(jīng)細(xì)胞死亡(變性)可對(duì)個(gè)體造成潛在不可逆的破壞作用，例如由于中風(fēng)可導(dǎo)致心臟病發(fā)作或腦或脊髓的局部缺血或創(chuàng)傷的其它后果。另外，與神經(jīng)細(xì)胞死亡有關(guān)的神經(jīng)變性性疾病包括早老性癡呆(Alzheimer′s disease)、帕金森病(Parkinson′s disease)、亨廷頓舞蹈病(Huntington′s disease)、肌萎縮性側(cè)索硬化、唐氏綜合征(Down′sSyndrome)以及科爾薩科夫精神病(Korsakoff′s disease)。
早老性癡呆(AD)是進(jìn)行性神經(jīng)變性性疾病，臨床表現(xiàn)為智力功能進(jìn)行性喪失。AD影響約10％的65歲以上的群體。其在75-85歲的群體中的發(fā)生率為19％，在85歲以上群體中的發(fā)生率為45％。AD是成人死亡的第四大主要原因，排在心臟病、癌癥和中風(fēng)之后。AD約占老年性癡呆的75％。這種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病表現(xiàn)為多種癥狀，例如神經(jīng)元變性、淀粉樣蛋白斑發(fā)生、神經(jīng)纖維纏結(jié)、乙酰膽堿下降以及大腦皮層萎縮。AD患者起初喪失短時(shí)記憶，隨后認(rèn)知功能減退，最終喪失照顧自己的能力。包括診斷、護(hù)理、家庭護(hù)理以及工資損失在內(nèi)的照顧患者費(fèi)用估計(jì)每年約為$800億-$900億。
與AD相關(guān)的嚴(yán)重功能損害是由于在新皮質(zhì)和海馬區(qū)存在神經(jīng)炎性病斑并且喪失膽堿能神經(jīng)元突觸前標(biāo)記物所致。變性軸突和神經(jīng)末梢組成神經(jīng)炎性病斑，經(jīng)常環(huán)繞在淀粉樣蛋白核心周?chē)?，通常含有反?yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)元素。早老性癡呆的另一個(gè)病理特征是神經(jīng)纖維纏結(jié)，其為神經(jīng)元內(nèi)物質(zhì)，與異常磷酸化的τ蛋白聚合為被稱(chēng)作成對(duì)螺旋絲的原纖維結(jié)構(gòu)的蓄積相同。此外，神經(jīng)纖維纏結(jié)還含有高度磷酸化的神經(jīng)絲蛋白。
盡管在闡明該疾病的病理生理學(xué)機(jī)制方面已有顯著進(jìn)展，但發(fā)生AD的原因仍不十分清楚。有幾個(gè)可能的原因，例如遺傳素因(PS-1、PS-2、APP、apoE、CO1、CO2基因突變)、神經(jīng)遞質(zhì)缺損(乙酰膽堿缺乏)、炎癥、代謝降低、自由基應(yīng)激或興奮性氨基酸毒性。
根據(jù)當(dāng)前對(duì)其發(fā)病機(jī)制的了解，目前正在對(duì)幾種化合物進(jìn)行治療AD的臨床研究。在這些藥物中，乙酰膽堿酯酶(AchE)抑制劑較為明顯。最近，行政當(dāng)局已批準(zhǔn)兩種AchE抑制劑他克林及多奈哌齊用于治療AD。雖然他克林對(duì)認(rèn)知能力的減退提供中等有益作用，但是由于其引起血清肝臟酶升高，因而也帶來(lái)一些副作用。
因此，非常需要新的神經(jīng)保護(hù)性藥物，尤其是限制程度或治療例如可與中風(fēng)、心臟病發(fā)作或腦或脊髓創(chuàng)傷同時(shí)發(fā)生的神經(jīng)細(xì)胞死亡(變性)的藥物；或治療神經(jīng)變性性疾病如早老性癡呆、帕金森病、亨廷頓舞蹈病、肌萎縮性側(cè)索硬化、唐氏綜合征以及科爾薩科夫精神病的藥物。
早老性癡呆的特征為稱(chēng)為β-淀粉樣蛋白或Aβ的39-43氨基酸肽蓄積，呈原纖維形式，作為細(xì)胞外淀粉樣蛋白斑存在；作為淀粉樣蛋白在大腦血管壁存在。據(jù)信在早老性癡呆中的原纖維Aβ淀粉樣蛋白沉積對(duì)患者有害，并且最終導(dǎo)致毒性及神經(jīng)元細(xì)胞死亡，其為AD的典型特點(diǎn)。蓄積證據(jù)提示淀粉樣蛋白是AD發(fā)病機(jī)制的主要誘因。
多種其它人類(lèi)疾病也證明淀粉樣蛋白沉積，并且通常涉及全身器官(即中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外的器官或組織)，由于淀粉樣蛋白蓄積，導(dǎo)致器官功能障礙或衰竭。對(duì)AD和“系統(tǒng)性”淀粉樣蛋白疾病，目前尚無(wú)治愈或有效的治療方法，所以患者通常從開(kāi)始患病起3-10年內(nèi)死亡。
通過(guò)蛋白酶解β-淀粉樣蛋白前體蛋白生成的Aβ是老年斑和腦血管病的主要成分。遺傳學(xué)、生物化學(xué)以及組織學(xué)研究強(qiáng)有力地提示Aβ在AD的發(fā)病機(jī)制中，其臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知缺損及記憶缺失。Selkoe，D.J(1999)Nature399，A23-31；Yankner，B.A.(1996)Neuron16，921-932；Selkoe，D.J.(1989)Cell58，611-612；Kalaria，R.N.(1996)Pharmacol.Ther.72，193-214。
已做了很多有關(guān)AD的工作，但是對(duì)于治療方案中抑制淀粉樣蛋白形成、沉積、蓄積和/或持續(xù)發(fā)生在AD及其它淀粉樣蛋白病的化合物或藥物卻知之甚少。
因此，需要治療方案中抑制或逆轉(zhuǎn)AD及其它淀粉樣蛋白病發(fā)生的淀粉樣蛋白形成、沉積、蓄積和/或持續(xù)的新化合物或新藥。
因此，如果能在現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的化合物、合理修飾的化合物的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)新的療法和/或重新設(shè)計(jì)具有Aβ功能抑制劑活性的化合物，將會(huì)是非常有益的。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及治療、預(yù)防或減少患者發(fā)生與神經(jīng)毒性、特別是β-淀粉樣蛋白誘發(fā)的神經(jīng)毒性相關(guān)的障礙或疾病的危險(xiǎn)或與之相關(guān)的癥狀的方法、藥盒、聯(lián)合療法和組合物。本發(fā)明化合物是具有生物活性的22R-羥基膽甾醇衍生物，所述衍生物含有共同的螺甾-5-烯-3-醇結(jié)構(gòu)并且具有下文公開(kāi)的式(I)結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明涉及治療病癥或障礙的方法，所述病癥或障礙采用式(I)神經(jīng)毒性抑制劑進(jìn)行治療，所述方法包括將本發(fā)明的組合物給予有需要的患者。更具體地說(shuō)，本發(fā)明主題是提供一種抑制患者腦β-淀粉樣蛋白Aβ形成或持續(xù)沉積的神經(jīng)毒性作用的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的式(I)化合物。
在一方面，本發(fā)明提供一種促進(jìn)、維持或增強(qiáng)患者一種或多種選自以下與β-淀粉樣蛋白形成有關(guān)的智力或認(rèn)知質(zhì)量的方法記憶力、注意力集中和短時(shí)記憶力，所述方法包括給予所述患者治療有效量的式(I)化合物。
在另一方面，本發(fā)明提供減輕患者一種或多種與β-淀粉樣蛋白形成有關(guān)的選自以下的智力或認(rèn)知影響的方法認(rèn)知或記憶力減退和智力下降，所述方法包括給予所述患者治療有效量的式(I)化合物。
在又一方面，本發(fā)明提供治療患者與β-淀粉樣蛋白形成或持續(xù)有關(guān)的精神狀態(tài)的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的式(I)化合物。
在再一方面，本發(fā)明提供治療患有選自以下神經(jīng)疾病或障礙的患者的方法全腦和局部缺血性中風(fēng)和出血性中風(fēng)、頭部創(chuàng)傷、脊髓損傷、低氧誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞損傷、心博停止或新生兒窘迫誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞損傷、癲癇、焦慮、糖尿病、多發(fā)性硬化、幻肢痛、灼痛、神經(jīng)痛、帶狀皰疹、脊髓損害、痛覺(jué)過(guò)敏、異常性疼痛、AD、亨廷頓舞蹈病以及帕金森病，其中所述治療包括給予所述患者治療有效量的式(I)化合物。
在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供治療特征為β-淀粉樣蛋白沉積在患者心臟、脾臟、腎臟、腎上腺皮質(zhì)或肝臟的疾病的方法，所述方法包括給予所述患者治療有效量的式(I)化合物。
在再一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供鑒定具有與β-淀粉樣蛋白結(jié)合親和性的化合物的方法，所述方法包括根據(jù)與22R-羥基膽甾醇的結(jié)構(gòu)同源性篩選已知化合物的數(shù)據(jù)庫(kù)；將所述數(shù)據(jù)庫(kù)中的化合物根據(jù)與22R-羥基膽甾醇的同源程度進(jìn)行排列，從所述數(shù)據(jù)庫(kù)中提取與22R-羥基膽甾醇有最高結(jié)構(gòu)同源性的化合物；將所提取的化合物按與β-淀粉樣蛋白的體外結(jié)合進(jìn)行排列；選擇出具有最高體外親和性的化合物。
在再一方面，本發(fā)明提供一種設(shè)計(jì)與β-淀粉樣蛋白具有結(jié)合親和性的化合物的方法，所述方法包括將22R-羥基膽甾醇繪制成兩個(gè)或更多個(gè)獨(dú)立結(jié)構(gòu)單元；通過(guò)修飾22R-羥基膽甾醇的一個(gè)或多個(gè)單元設(shè)計(jì)新化合物，將所設(shè)計(jì)的化合物按與β-淀粉樣蛋白的體外結(jié)合進(jìn)行排列；選擇出具有最高體外結(jié)合親和性的化合物。
在一個(gè)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供一種設(shè)計(jì)與β-淀粉樣蛋白具有結(jié)合親和性的化合物的方法，所述方法包括繪制β-淀粉樣蛋白，在計(jì)算機(jī)屏幕上構(gòu)建與β-淀粉樣蛋白結(jié)構(gòu)或其片段互補(bǔ)的化合物；將所設(shè)計(jì)的化合物按與β-淀粉樣蛋白的體外結(jié)合進(jìn)行排列；選擇出具有最高體外結(jié)合親和性的化合物。
在又一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)并定量生物體液中Aβ的方法，所述方法包括獲取樣品液；將所述樣品液與標(biāo)記的式(I)化合物一起培養(yǎng)；任選在濃度遞增的未標(biāo)記化合物存在下；從培養(yǎng)液中分離樣品并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；將所述膜暴露于氚敏屏；用磷光成像法檢測(cè)Aβ的存在或定量測(cè)定生物體液中存在的Aβ含量，從而分析所述膜的內(nèi)容物。
在再一方面，本發(fā)明提供診斷患者AD的方法，所述方法包括從患者腦中獲取樣品液；將所述樣品液與標(biāo)記的式(I)化合物一起培養(yǎng)；任選在濃度遞增的未標(biāo)記化合物存在下；從培養(yǎng)液中分離樣品并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；將所述膜暴露于氚敏屏；用磷光成像法檢測(cè)Aβ的存在或定量測(cè)定生物體液中存在的Aβ含量，從而分析所述膜的內(nèi)容物。
因此，本發(fā)明的一個(gè)主要方面涉及治療患者的與β-淀粉樣蛋白誘發(fā)的神經(jīng)毒性有關(guān)的疾病或神經(jīng)變性性疾病的藥用組合物。該組合物包括有效量的式(I)化合物和藥學(xué)上可接受的載體。式(I)化合物在制備用于治療這類(lèi)疾病之一的藥物中的用途也在本發(fā)明范圍內(nèi)。通過(guò)給予患者治療有效量的本發(fā)明化合物或組合物，完成了對(duì)這些疾病的治療。
本發(fā)明一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的細(xì)節(jié)在下文所附說(shuō)明中有闡述。根據(jù)本發(fā)明說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)勢(shì)將會(huì)是顯而易見(jiàn)的。
附圖簡(jiǎn)述


了本發(fā)明的一些化合物、鑒定這些化合物的方法以及證明本發(fā)明說(shuō)明性化合物活性的體外和體內(nèi)生物學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果。
圖1說(shuō)明22R-羥基膽甾醇(SP222)和天然存在的衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)中的幾種結(jié)構(gòu)。
圖2是描述在AD和對(duì)照腦樣本中22R-羥基膽甾醇水平的圖。
圖3A是一幅曲線圖，描繪在濃度遞增的Aβ1-42不存在或存在下，濃度遞增的22R-羥基膽甾醇對(duì)大鼠PC12神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響。
圖3B是一幅曲線圖，描繪在濃度遞增的Aβ1-42不存在或存在下，濃度遞增的膽甾醇對(duì)大鼠PC12神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響。
圖3C是一幅曲線圖，描繪在濃度遞增的Aβ1-42不存在或存在下，濃度遞增的孕烯醇酮對(duì)大鼠PC12神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響。
圖3D是一幅曲線圖，描繪在濃度遞增的Aβ1-42不存在或存在下，濃度遞增的17α-羥基孕烯醇酮對(duì)大鼠PC12神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響。
圖3E是一幅曲線圖，描繪在濃度遞增的Aβ1-42不存在或存在下，濃度遞增的DHEA對(duì)大鼠PC12神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響。
圖3F是一幅曲線圖，描繪在濃度遞增的Aβ1-42不存在或存在下，濃度遞增的22S-羥基膽甾醇對(duì)大鼠PC12神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響。
圖4是一幅曲線圖，描繪在Aβ1-42不存在或存在下，待測(cè)22R-羥基膽甾醇對(duì)分化人NT2N神經(jīng)元活力的影響。
圖5A是一幅曲線圖，描繪22R-羥基膽甾醇和DHEA對(duì)受Aβ1-42誘發(fā)的毒性影響的大鼠PC12神經(jīng)元細(xì)胞的影響。
圖5B是一幅曲線圖，描繪22R-羥基膽甾醇和DHEA對(duì)受Aβ25-35誘發(fā)的毒性影響的大鼠PC12神經(jīng)元細(xì)胞的影響。
圖5C是一幅曲線圖，描繪22R-羥基膽甾醇和DHEA對(duì)受Aβ1-42誘發(fā)的毒性影響的人NT2細(xì)胞的影響。
圖5D是一幅曲線圖，描繪22R-羥基膽甾醇和DHEA對(duì)受Aβ25-35誘發(fā)的毒性影響的人NT2細(xì)胞的影響。
圖6A是描繪22R-羥基膽甾醇對(duì)Aβ聚集影響的考馬斯藍(lán)凝膠。
圖6B是圖6A的考馬斯藍(lán)染色凝膠的免疫印跡分析，描繪22R-羥基膽甾醇對(duì)Aβ聚集的影響。
圖7A是通過(guò)CPBBA鑒定Aβ1-42-22R-羥基膽甾醇結(jié)合和結(jié)合位點(diǎn)的免疫印跡分析。
圖7B是通過(guò)在圖7A所示印跡上的多克隆兔抗β-淀粉樣肽抗血清鑒定Aβ1-42的免疫印跡分析。
圖7C是鑒定22R-羥基膽甾醇在Aβ上的結(jié)合位點(diǎn)的免疫印跡分析。
圖7D是22R-羥基膽甾醇與Aβ1-42的計(jì)算對(duì)接模擬。
圖7E是22R-羥基膽甾醇與Aβ17-40的計(jì)算對(duì)接模擬。
圖7F是22R-羥基膽甾醇與Aβ17-40的計(jì)算對(duì)接模擬。
圖7G是22R-羥基膽甾醇與Aβ1-42的計(jì)算對(duì)接模擬。
圖7H是22R-羥基膽甾醇與Aβ17-40的計(jì)算對(duì)接模擬。
圖7I是定位于Aβ1-42的22R-羥基膽甾醇結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸序列。
圖8是一幅柱狀圖，說(shuō)明將PC12細(xì)胞在濃度遞增的Aβ中暴露3天，導(dǎo)致劑量依賴(lài)性細(xì)胞死亡。
圖9A-9P是一系列柱狀圖，說(shuō)明在0.1μM Aβ1-42不存在或存在下，濃度遞增的22R-羥基膽甾醇(SP222)及衍生物對(duì)大鼠PC12神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響。
圖10A-10P是一系列柱狀圖，說(shuō)明在1.0μM Aβ1-42不存在或存在下，濃度遞增的22R-羥基膽甾醇(SP222)及衍生物對(duì)大鼠PC12神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響。
圖11A-11P是一系列柱狀圖，說(shuō)明在10.0μM Aβ1-42不存在或存在下，濃度遞增的22R-羥基膽甾醇(SP222)及衍生物對(duì)大鼠PC12神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響。
圖12A是一幅柱狀圖，顯示Aβ暴露誘發(fā)膜電位評(píng)價(jià)發(fā)光(potential-assessing luminescence)的劑量相關(guān)性減少。
圖12B是一幅柱狀圖，顯示22R-羥基膽甾醇(SP222)及衍生物抵抗0.1μM Aβ誘發(fā)的神經(jīng)毒性的效果。
圖12C是一幅柱狀圖，顯示22R-羥基膽甾醇(SP222)及衍生物抵抗1.0μM Aβ誘發(fā)的神經(jīng)毒性的效果。
圖12D是一幅柱狀圖，顯示22R-羥基膽甾醇(SP222)及衍生物抵抗10.0μM Aβ誘發(fā)的神經(jīng)毒性的效果。
圖13A是一幅柱狀圖，顯示在0.1μM、1.0μM和10.0μM Aβ誘發(fā)的神經(jīng)毒性存在下，Aβ以劑量依賴(lài)性方式減少PC12細(xì)胞產(chǎn)生的ATP。
圖13B是一幅柱狀圖，顯示在0.1μM Aβ誘發(fā)的神經(jīng)毒性存在下，22R-羥基膽甾醇(SP222)及衍生物對(duì)ATP的影響。
圖13C是一幅柱狀圖，顯示在1.0μM Aβ誘發(fā)的神經(jīng)毒性存在下，22R-羥基膽甾醇(SP222)及衍生物對(duì)ATP的影響。
圖13D是一幅柱狀圖，顯示在10.0μM Aβ誘發(fā)的神經(jīng)毒性存在下，22R-羥基膽甾醇(SP222)及衍生物對(duì)ATP的影響。
圖14A是一幅曲線圖，顯示在單獨(dú)的Aβ存在下，在Aβ+SP233(30μM)存在下，在Aβ+SP233(50μM)存在下，細(xì)胞對(duì)錐蟲(chóng)藍(lán)的攝取。
圖14B是一幅曲線圖，顯示濃度遞增的SP233對(duì)受0.1μM、1.0μM和10.0μM Aβ誘發(fā)的神經(jīng)毒性影響的大鼠PC12神經(jīng)元細(xì)胞的影響。
圖15是一幅曲線圖，說(shuō)明SP233對(duì)MA-10間質(zhì)細(xì)胞類(lèi)固醇形成的影響。
圖16是通過(guò)CPBBA鑒定Aβ-SP結(jié)合和結(jié)合位點(diǎn)的柱狀圖。
圖17A-17Q是表1化合物與Aβ1-42的計(jì)算對(duì)接模擬。
圖18A是描繪22R-羥基膽甾醇(SP222)和SP233與Aβ1-42的結(jié)合能頻率的計(jì)算對(duì)接模擬。
圖18B是描繪22R-羥基膽甾醇(SP222)和SP233與Aβ1-42結(jié)合概率的計(jì)算對(duì)接模擬。
圖19是在神經(jīng)保護(hù)性SP化合物中存在的基本螺甾烯醇結(jié)構(gòu)的計(jì)算機(jī)模擬。
發(fā)明詳述雖然本發(fā)明可包括許多不同的形式，但在本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容僅作為本發(fā)明原理的范例前體下，討論本文的幾個(gè)具體實(shí)施方案，并不意味著所述實(shí)施方案構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
本文所用的縮寫(xiě)如下5-膽甾烯-3β，22R-二醇(22R-羥基膽甾醇)；5-膽甾烯-3β，22S-二醇(22S-羥基膽甾醇)；5-膽甾烯-3β-醇(膽甾醇)；5-雄烯-3β-醇-17-酮或脫氫表雄酮(DHEA)；5-孕烯-3β，17α-二醇-20-酮(17α-羥基孕烯醇酮)；5-孕烯-3β-醇-20-酮(孕烯醇酮)；Ntera2/D1畸胎瘤細(xì)胞(NT2)；分化人NT2神經(jīng)元(NT2N)；β-淀粉樣肽(Aβ)；早老性癡呆(AD)；膽甾醇-蛋白結(jié)合印跡測(cè)定(CPBBA)。
本發(fā)明基于意想不到的發(fā)現(xiàn)22R-羥基膽甾醇(膽甾醇形成孕烯醇酮途徑上的甾類(lèi)中間體)在AD海馬和額皮層組織樣本中的水平比相同年齡對(duì)照組低。正如以上討論那樣，淀粉樣蛋白β(Aβ)肽已證實(shí)具有神經(jīng)毒性，其在腦中的存在已與AD病理相關(guān)。
如下所述，本發(fā)明人意想不到地發(fā)現(xiàn)，22R-羥基膽甾醇具有以劑量依賴(lài)性方式防止Aβ誘發(fā)的大鼠交感神經(jīng)嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12)和分化人NT2N神經(jīng)元細(xì)胞死亡。發(fā)現(xiàn)22R-羥基膽甾醇的作用是立體特異性的，因?yàn)槠?2S-羥基膽甾醇對(duì)映體不能保護(hù)神經(jīng)元抵抗Aβ誘發(fā)的細(xì)胞死亡。這種大鼠模型通常適用于人。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及治療與神經(jīng)毒性有關(guān)的障礙、特別是AD的方法，所述方法包括給予有需要的患者下式(I)化合物 式(I)中，每個(gè)R1、R2、R4、R5、R6、R7、R11、R12、R15和R16獨(dú)立為氫、烷基、羥基、氨基、羧基、氧代、磺酸或任選被以下基團(tuán)取代的烷基-NH-、-N(烷基)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2-、-SO2-O-、-SO3-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NR′-或-NR′-CO-；R3為在表1和圖1中列出的化合物的R3情況下所公開(kāi)的取代基；每個(gè)R8、R9、R10、R13和R14獨(dú)立為氫、烷基、羥烷基、烷氧基或羥基；R17為在表1和圖1中列出的化合物的R17情況下所公開(kāi)的取代基。注意到，除非另有說(shuō)明，式(I)所示的碳原子與氫飽和。
每個(gè)術(shù)語(yǔ)“烷基”、前綴“烷(alk)”(如在烷氧基中)和后綴“-烷基”(如在羥烷基中)是指C1-8烴鏈，直鏈烷基(例如丁基)或支鏈烷基(例如異丁基)。亞烷基、亞烯基和亞炔基分別指二價(jià)的C1-8烷基(例如亞乙基)、烯基和炔基。
除非另有定義，本文所用的所有科技術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同。
下表1所示為幾個(gè)上述的式(I)化合物，其可用來(lái)實(shí)施本發(fā)明
表1.含22R-羥基膽甾醇先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的天然存在的化合物的化學(xué)名稱(chēng)、代號(hào)及來(lái)源。
其它22R-羥基膽甾醇衍生物可通過(guò)搜索基于結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)鑒定?？勺裱瓋煞N方法。一種方法基于22R-羥基膽甾醇的結(jié)構(gòu)。可將22R-羥基膽甾醇再分為幾個(gè)結(jié)構(gòu)單元，在該數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索包括22R-羥基膽甾醇的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元的化合物。可形成一種基于本發(fā)明的結(jié)果而改進(jìn)的搜索方法，以保留22R-羥基膽甾醇的22R羥基官能團(tuán)。從數(shù)據(jù)庫(kù)中提取具有類(lèi)似22R-羥基膽甾醇結(jié)構(gòu)的化合物，在體外測(cè)試其與Aβ的結(jié)合親和性。選出具有最高結(jié)合親和性的化合物進(jìn)行進(jìn)一步體內(nèi)研究。第二種方法是基于Aβ的結(jié)構(gòu)。簡(jiǎn)而言之，基于(受體)結(jié)構(gòu)的3D數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，通過(guò)NMR分析確定靶分子Aβ的3D結(jié)構(gòu)，然后在儲(chǔ)存有成千上萬(wàn)個(gè)結(jié)構(gòu)各異的合成化合物和天然產(chǎn)物3D結(jié)構(gòu)的大型化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過(guò)計(jì)算機(jī)化分子對(duì)接尋找并鑒定能與Aβ有效相互作用的小分子。
在形成Aβ的3D結(jié)構(gòu)模板中，按照開(kāi)始的構(gòu)象給Aβ骨架上的每個(gè)原子指定一個(gè)位置，根據(jù)每條側(cè)鏈的內(nèi)配位價(jià)的最小能量給側(cè)鏈上的原子指定位置。通過(guò)使模板的內(nèi)能最小化，精選由此而獲得的模板結(jié)構(gòu)?；诰x的Aβ結(jié)構(gòu)，通過(guò)在Aβ附近安排一個(gè)選自化合物數(shù)據(jù)庫(kù)的化合物形成主賓絡(luò)合物。在三維參考系中，主賓絡(luò)合物的結(jié)構(gòu)由該絡(luò)合物中每個(gè)原子所占據(jù)的位置確定。
選擇可安排在靶結(jié)合位點(diǎn)而不與Aβ的原子形成明顯不利重疊的化合物，形成幾何上合適的基團(tuán)。對(duì)于每一個(gè)在幾何上合適基團(tuán)上的化合物，通過(guò)使能量作用最小化描述所述化合物原子和Aβ原子之間的相互作用，確定預(yù)測(cè)的與Aβ受體位點(diǎn)的結(jié)合親和性。能量作用最小化是通過(guò)改變化合物的位置來(lái)實(shí)現(xiàn)，以便獲得對(duì)應(yīng)能量作用最小化的主賓絡(luò)合物結(jié)構(gòu)。為了任選的再處理，鑒定與結(jié)合位點(diǎn)上原子具有最佳能量相互作用的化合物，例如通過(guò)展示和目測(cè)化合物Aβ絡(luò)合物來(lái)鑒定最有希望的候選化合物。
通過(guò)目測(cè)展示的絡(luò)合物形成用于體外試驗(yàn)的候選化合物組。例如，為目測(cè)化合物與Aβ受體位點(diǎn)對(duì)接的質(zhì)量，檢查絡(luò)合物。目測(cè)為鑒定用于體外試驗(yàn)的化合物提供了有效的基礎(chǔ)。
當(dāng)鑒定出假定的結(jié)合化合物后，在體外和/或體內(nèi)證實(shí)這種化合物特異性結(jié)合Aβ的能力。
在另一方面，本發(fā)明提供經(jīng)合理設(shè)計(jì)的、抑制與Aβ結(jié)合的新化合物。新化合物的合理設(shè)計(jì)是以與Aβ結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)的信息為基礎(chǔ)。分析Aβ和先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)，以便確定可能具有與Aβ的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合活性的化合物結(jié)構(gòu)。
可將該先導(dǎo)化合物結(jié)構(gòu)劃分為設(shè)計(jì)單元，對(duì)其進(jìn)行修飾以了解對(duì)先導(dǎo)化合物與Aβ結(jié)合位點(diǎn)相互作用的影響。然后合成具有不同設(shè)計(jì)單元組合的化合物，并對(duì)其活性與所鑒定的機(jī)制的關(guān)系進(jìn)行試驗(yàn)。這種試驗(yàn)在體外和/或體內(nèi)按上述方式進(jìn)行。然后將從這種試驗(yàn)獲得信息結(jié)合到新一輪的合理藥物設(shè)計(jì)中。重復(fù)這種設(shè)計(jì)-合成-試驗(yàn)循環(huán)直至發(fā)現(xiàn)具有所需特性的先導(dǎo)化合物。然后將該先導(dǎo)化合物進(jìn)行臨床試驗(yàn)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療”是指任何治療患者的與神經(jīng)毒性或β-淀粉樣蛋白誘發(fā)的神經(jīng)毒性有關(guān)的疾病或障礙，并且包括但不限于預(yù)防可能易患所述障礙或疾病，但尚未診斷出已患所述障礙或疾病的患者已存在的障礙或疾??；抑制所述障礙或疾病，例如抑制患所述障礙或疾病的發(fā)展；緩解所述障礙或疾病，例如促使所述障礙或疾病消退；或緩解由所述障礙或疾病引起的病癥，例如使所述障礙或疾病的癥狀穩(wěn)定。本文所用的“神經(jīng)變性性疾病”意指包括所有上述疾病。
對(duì)患者神經(jīng)毒性或與β-淀粉樣蛋白誘發(fā)的神經(jīng)毒性相關(guān)的疾病或障礙而言，術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”，是指如果未曾發(fā)生的話，不會(huì)發(fā)生疾病或障礙；或如果已發(fā)生疾病或障礙的話，疾病或障礙不會(huì)進(jìn)一步發(fā)展。
在給藥前，可以將有效量的有效化合物與藥學(xué)上可接受的載體配制成藥用組合物，治療與神經(jīng)毒性有關(guān)的疾病。“有效量”或“藥理上的有效量”是指為治療患者提供治效所需的化合物劑量。Freireich等，Cancer Chemother.Rep.，1966，50，219描述了動(dòng)物和人的劑量相互關(guān)系(以每平方米體表面積毫克計(jì))。體表面積可按患者的身高和體重粗略確定。參見(jiàn)例如Scientific Tables，Geigy Pharmaceuticals，Ardley，New York，1970，537。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)的，有效劑量也會(huì)變化，取決于給藥途徑、賦形劑的用法和任選的與其它治療藥物聯(lián)合用藥。
活性成分的毒性和療效可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)方法確定。例如測(cè)定LD50(使群體的50％致死的劑量)和ED50(有效治療群體的50％的劑量)。毒性與療效的劑量比率為治療指數(shù)，其可表示為L(zhǎng)D50/ED50的比率。優(yōu)選具有大治療指數(shù)的化合物。雖然可以使用有毒副作用的化合物，但在設(shè)計(jì)遞藥系統(tǒng)時(shí)，應(yīng)該注意將這種化合物靶向受影響的組織部位，以便對(duì)未受感染細(xì)胞的潛在損害最小，因此降低副作用。
本發(fā)明的方法、藥盒、聯(lián)合療法以及藥用組合物包括所述化合物的晶型(例如多晶型)、異構(gòu)體和互變異構(gòu)體及其藥學(xué)上可接受的鹽。說(shuō)明性的藥學(xué)上可接受的鹽可用以下酸制備甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、羥基乙酸、葡萄糖酸、乳酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、葡糖醛酸、馬來(lái)酸、富馬酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、鄰氨基苯甲酸、甲磺酸、硬脂酸、水楊酸、對(duì)羥基苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸、雙羥萘酸(撲姆酸)、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、泛酸、甲苯磺酸、2-羥基乙磺酸、磺胺酸、環(huán)己基氨基磺酸、藻酸、b-羥基丁酸、半乳糖二酸以及半乳糖醛酸。
術(shù)語(yǔ)“前體藥物”是指通過(guò)體內(nèi)代謝過(guò)程轉(zhuǎn)化引發(fā)藥理作用的藥物或化合物(活性部分)。通常認(rèn)為前體藥物是在患者用藥和隨后攝取后，經(jīng)過(guò)某些過(guò)程(例如代謝過(guò)程)轉(zhuǎn)化為活性或活性更強(qiáng)的種類(lèi)。該轉(zhuǎn)化過(guò)程產(chǎn)生的其它產(chǎn)物易于被機(jī)體處理。前體藥物通常具有使其活性減弱；和/或?qū)⑷芙庑曰蛞恍┢渌再|(zhì)賦予藥物的化學(xué)基團(tuán)。一旦該化學(xué)基團(tuán)從前體藥物切下，就會(huì)產(chǎn)生活性更強(qiáng)的藥物。前體藥物可設(shè)計(jì)為可逆藥物衍生物，用其作為改性劑，促使藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至定位組織。目前，前體藥物的設(shè)計(jì)已增加了治療性化合物的有效水溶性，以便靶向至水為主要溶劑的區(qū)域。例如Fedorak等，Am.J.Physiol.269G210-218(1995)描述了地塞米松-β-D-葡萄糖醛酸苷。McLoed等，Gastroenterol.，106405-413(1994)描述了地塞米松-丁二酸酯-右旋糖苷。Hochhaus等，Biomed.Chrom.，6283-286(1992)描述了地塞米松-21-硫苯甲酸鈉和地塞米松-21-異煙酸酯。另外，J.Larsen和H.Bundgaard，Int.J.Pharmaceutics，37，87(1987)描述了對(duì)N-?；酋０纷鳛闈撛谇绑w藥物衍生物的評(píng)價(jià)。J.Larsen等，Int.J.Pharmaceutics.47，103(1988)描述了對(duì)N-甲基磺酰胺作為潛在前體藥物衍生物的評(píng)價(jià)。例如Sinkula等，J.Pharm.Sci.，64181-210(1975)也描述了前體藥物。
術(shù)語(yǔ)“衍生物”是指通過(guò)用另一個(gè)原子、分子或基團(tuán)置換取代類(lèi)似結(jié)構(gòu)化合物的一個(gè)原子、分子或基團(tuán)生成的化合物。例如一種化合物的氫原子可被烷基、?；被热〈?，生成該化合物的衍生物。
“血漿濃度”是指藥物在血漿或血清中的濃度。
“藥物攝取”或“攝取”是指藥物從給藥部位移動(dòng)到體循環(huán)的過(guò)程，例如進(jìn)入患者的血流。
“生物利用度”是指活性成分(藥物或代謝物)被攝取進(jìn)入大循環(huán)并在體內(nèi)的藥物作用部位可利用的程度?！按x”是指體內(nèi)藥物的化學(xué)轉(zhuǎn)化過(guò)程。
“藥效學(xué)”是指確定觀察到的、相對(duì)應(yīng)作用部位的藥物濃度的生物反應(yīng)的因素。
“藥物動(dòng)力學(xué)”是指確定達(dá)到并維持作用部位的合適藥物濃度的因素。
“血漿半衰期”是指血漿藥物濃度從最高濃度減少50％所需要的時(shí)間。
本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中所用的術(shù)語(yǔ)“約”的用途是指“近似”，作為說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“約”的用途表明在所述范圍外的劑量也可能是有效和安全的，并且這種劑量也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
術(shù)語(yǔ)“可測(cè)血清藥物濃度”指給藥后，治療藥物被攝取進(jìn)入血流的血清藥物濃度(通常以每ml、dl或l的血清所含mg、μg或ng治療藥物測(cè)量)。
本文所用的形容詞性術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”是指被修飾的名詞適合用于藥品。藥學(xué)上可接受的陽(yáng)離子包括金屬離子和有機(jī)離子。更優(yōu)選的金屬離子包括但不限于合適的堿金屬(Ia組)鹽、堿土金屬(IIa組)鹽和其它生理上可接受的金屬離子。示例性的離子包括正?；蟽r(jià)的鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉和鋅。優(yōu)選的有機(jī)離子包括質(zhì)子化叔胺和季銨陽(yáng)離子，部分包括三甲胺、二乙胺、N，N′-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普甲胺(N-甲基普糖胺)和普魯卡因。示例性的藥學(xué)上可接受的酸包括但不限于鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸、甲磺酸、乙酸、甲酸、酒石酸、馬來(lái)酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、異檸檬酸、琥珀酸、乳酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、丙酮酸丁酮二酸、富馬酸、丙酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸等。
本發(fā)明組合物通常以藥用組合物的形式給藥。這些藥用組合物可通過(guò)任何合適的途徑給藥，包括但不限于口服、鼻胃、直腸、經(jīng)皮、胃腸外(例如皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、髓內(nèi)和皮內(nèi)注射或輸注技術(shù)給藥)、鼻內(nèi)、經(jīng)粘膜、植入、陰道、局部、口腔和舌下。這種制劑按常規(guī)可含有緩沖劑、防腐劑、滲透促進(jìn)劑、配伍載體和其它治療或非治療性成分。
本發(fā)明還包括使用包含本發(fā)明的成分和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的藥用組合物的方法。本文所用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”或“藥學(xué)上可接受的賦形劑”包括任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣材料、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這種作為可攝取介質(zhì)和試劑的用途在本領(lǐng)域中眾所周知。除了與所述組合物不配伍的任何常規(guī)介質(zhì)或試劑之外，其用途是可設(shè)想的。還可將輔助活性成分摻入到所述組合物中。在制備本發(fā)明的組合物中，可以將組合物與藥學(xué)上可接受的賦形劑混合，用賦形劑稀釋或用這種載體包裹，其可呈膠囊劑、小藥囊劑或其它容器形式?？捎糜谥苽浔景l(fā)明組合物的載體材料為那些在藥劑學(xué)上常用的任何賦形劑，并且應(yīng)該在與活性藥物配伍以及需要的劑型的釋放分布特性的基礎(chǔ)上進(jìn)行選擇。
選擇以下藥用賦形劑作為說(shuō)明性實(shí)例(a)粘合劑，例如阿拉伯膠、海藻酸及其鹽、纖維素衍生物、甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、硅酸鎂鋁、聚乙二醇、樹(shù)膠、多糖酸、皂土、羥丙基甲基纖維素、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮/醋酸乙烯酯共聚物、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸酯、羥丙基甲基纖維素、羥丙基纖維素、淀粉、預(yù)膠化淀粉、乙基纖維素、黃芪膠、糊精、微晶纖維素、蔗糖或葡萄糖等。
(b)崩解劑，例如淀粉、預(yù)膠化玉米淀粉、預(yù)膠化淀粉、纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素、淀粉羥乙酸鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、藻酸鈣絡(luò)合物、藻酸鈉絡(luò)合物、粘土、藻酸鹽、樹(shù)膠或淀粉羥乙酸鈉以及任何在片劑制劑中使用的崩解劑。
(c)填充劑，例如乳糖、碳酸鈣、磷酸鈣、磷酸氫鈣、硫酸鈣、微晶纖維素、纖維素粉、右旋葡萄糖、葡萄糖結(jié)合劑、右旋糖苷、淀粉、預(yù)膠化淀粉、蔗糖、木糖醇、拉克替醇、甘露醇、山梨醇、氯化鈉、聚乙二醇等。
(d)表面活性劑，例如十二烷基硫酸鈉、司盤(pán)-80、吐溫-80、吐溫、polaxomers、膽鹽、單硬脂酸甘油酯、PluronicTM系列(BASF)等。
(e)增溶劑，例如檸檬酸、琥珀酸、富馬酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、馬來(lái)酸、戊二酸碳酸氫鈉和碳酸鈉等。
(f)也可使用穩(wěn)定劑例如抗氧化劑、緩沖劑或酸等。
(g)潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂、氫氧化鈣、滑石粉、硬酯酰富馬酸鈉、氫化植物油、硬脂酸、甘油二十二烷酸酯、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣和硬脂酸鈉、硬脂酸、滑石粉、蠟、Stearowet、硼酸、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉、DL-亮氨酸、聚乙二醇、油酸鈉或十二烷基硫酸鈉等。
(h)濕潤(rùn)劑，例如油酸、單硬脂酸甘油酯、司盤(pán)-80、司盤(pán)-20、三乙醇胺油酸脂、吐溫-80、吐溫-20、油酸鈉或十二烷基硫酸鈉等。
(i)稀釋劑，例如乳糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、右旋葡萄糖、微晶纖維素、磷酸氫鈣、蔗糖為主的稀釋劑、蔗糖玉米淀粉混合物、硫酸鈣一水合物、硫酸鈣二水合物、乳酸鈣三水合物、葡萄糖結(jié)合劑、肌醇、水解谷類(lèi)固體物、直鏈淀粉、粉狀纖維素、碳酸鈣、甘氨酸或皂土等。
(J)抗粘著劑或助流劑，例如滑石粉、玉米淀粉、DL-亮氨酸、十二烷基硫酸鈉以及硬脂酸鎂、硬脂酸鈣或硬脂酸鈉等。
(K)藥學(xué)上可配伍的載體包括阿拉伯膠、明膠、膠態(tài)二氧化硅、甘油磷酸鈣、乳酸鈣、麥芽糖糊精合劑、甘油、硅酸鎂、酪蛋白酸鈉、大豆卵磷脂、氯化鈉、磷酸鈣、磷酸氫二鉀、硬脂酰乳酸鈉、卡拉膠、單甘油酯、二甘油酯或預(yù)膠化淀粉等。
另外，在例如Remington′s The Science and Practice of Pharmacy(2000)中論述了藥物制劑。還可在Liberman，H.A.和Lachman，L.(編著)，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker，New York，N.Y.，1980中查閱藥物制劑論述。含本發(fā)明組合物的片劑或顆?？砂∧ひ禄蚰c溶衣。
除了用于治療人之外，本發(fā)明還可用于其它患者，包括寵物、爬行動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)、外來(lái)動(dòng)物和家畜；包括哺乳動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物等。哺乳動(dòng)物包括靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(例如猴或狐猴)、馬、犬、豬或貓。嚙齒動(dòng)物包括大鼠、小鼠、松鼠或豚鼠。
本發(fā)明藥用組合物可用于神經(jīng)毒性抑制劑的適應(yīng)癥。已發(fā)現(xiàn)這些組合物在治療老年性認(rèn)知損害和/或癡呆(例如AD)中尤其有效。
為治療神經(jīng)變性性疾病，可用本發(fā)明組合物提供足夠產(chǎn)生治療反應(yīng)的量的本發(fā)明化合物的劑量，例如為降低Aβ誘發(fā)的細(xì)胞毒性，提供例如約5ng至約1000mg、或約100ng至約600mg、或約1mg至約500mg、或約20mg至約400mg的量。通常，劑量有效量的范圍在約0.0001mg/kg體重至1500mg/kg體重、更優(yōu)選1-1000mg/kg體重，更優(yōu)選約1-150mg/kg體重，最優(yōu)選約50-100mg/kg體重。給藥劑量每天可為一個(gè)至約四個(gè)劑量，或?yàn)槊刻於鄠€(gè)劑量，以誘發(fā)治療效果。作為說(shuō)明，本發(fā)明組合物的劑量單位通常含有例如約5ng、50ng、100ng、500ng、1mg、10mg、20mg、40mg、80mg、100mg、125mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、700mg、800mg、900mg或1000mg的本發(fā)明化合物?？蛇x擇劑型以滿(mǎn)足需要的用于達(dá)到規(guī)定劑量的給藥頻率。給藥的組合物的單位劑型的量和治療病癥或障礙的給藥方案取決于多種因素，包括患者的年齡、體重、性別和醫(yī)學(xué)病癥、病癥或障礙的嚴(yán)重程度、給藥途徑和頻率，眾所周知，其變化范圍可以很大。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，給予患者治療有效量的組合物，也就是說(shuō)，給予患者組合物后，在一段時(shí)間內(nèi)，本發(fā)明化合物在患者血清中達(dá)到治療有效劑量而產(chǎn)生所需療效的量。作為說(shuō)明，在空腹成年人(通常至少空腹10小時(shí))中，給予受試者組合物后約5分鐘，組合物在受試者血清中達(dá)到本發(fā)明化合物的治療有效劑量。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，給予受試者組合物后約10分鐘，在受試者血清中達(dá)到本發(fā)明化合物的治療有效劑量。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，給予受試者組合物后約20分鐘，在受試者血清中達(dá)到本發(fā)明化合物的治療有效劑量。在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，給予受試者組合物后約30分鐘，在受試者血清中達(dá)到本發(fā)明化合物的治療有效劑量。在本發(fā)明的再一實(shí)施方案中，給予受試者組合物后約40分鐘，在受試者血清中達(dá)到本發(fā)明化合物的治療有效劑量。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，給予受試者組合物后約20分鐘至約12小時(shí)，在受試者血清中達(dá)到本發(fā)明化合物的治療有效劑量。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，給予受試者組合物后約20分鐘至約6小時(shí)，在受試者血清中達(dá)到本發(fā)明化合物的治療有效劑量。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，給予受試者組合物后約20分鐘至約2小時(shí)，在受試者血清中達(dá)到本發(fā)明化合物的治療有效劑量。在本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案中，給予受試者組合物后約40分鐘至約2小時(shí)，在受試者血清中達(dá)到本發(fā)明化合物的治療有效劑量。以及在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，給予受試者組合物后約40分鐘至約1小時(shí)，在受試者血清中達(dá)到本發(fā)明化合物的治療有效劑量。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物的給藥劑量適合提供具有本發(fā)明化合物半數(shù)最大劑量的血清藥物濃度。作為說(shuō)明，給予受試者本發(fā)明組合物后，在受試者體內(nèi)達(dá)到了約0.01nM至約1000nM、或約0.1nM至約750nM、或約1nM至約500nM、或約20nM至約1000nM、或約100nM至約500nM、或約200nM至約400nM的血清藥物濃度。
本發(fā)明設(shè)計(jì)的組合物在給藥后約5分鐘至約24小時(shí)的間隔內(nèi)，提供本發(fā)明藥物中化合物的療效，如果需要，允許一天一次或一天兩次給藥。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，給予受試者組合物后約10分鐘、20分鐘、30分鐘或40分鐘，給藥組合物的劑量適合提供具有以下本發(fā)明化合物的半數(shù)最大劑量的平均血清藥物濃度至少約1μg/ml；或至少約5μg/ml；或至少約10μg/ml；或至少約50μg/ml；或至少約100μg/ml；或至少約500μg/ml；或至少約1000μg/ml。
產(chǎn)生療效所需的治療藥物的量可根據(jù)例如藥物進(jìn)入血清的攝取速率、藥物的生物利用度和治療疾病的功效實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。但是，要理解，本發(fā)明治療藥物針對(duì)任何具體患者的準(zhǔn)確劑量水平取決于多種因素，包括使用的具體化合物的活性、患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食(包括例如患者是處于空腹還是飽腹?fàn)顟B(tài))、給藥時(shí)間、排泄速率、藥物組合、接受治療的具體疾病的嚴(yán)重程度和給藥形式。一般可滴定測(cè)定治療劑量以使安全性和功效最優(yōu)化。通常，在體外和/或體內(nèi)試驗(yàn)初步得到的量效關(guān)系對(duì)患者給藥的合適劑量可提供有用指導(dǎo)。在動(dòng)物模型上的研究通常可用于指導(dǎo)治療與本發(fā)明有關(guān)的胃腸道障礙或疾病的有效劑量。按照治療方案，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到給藥劑量取決于幾個(gè)因素，包括具體給藥的藥物、給藥途徑、具體患者的狀況等。一般而言，需要給予患者化合物的有效量為在一段時(shí)間內(nèi)，有效達(dá)到與在體外發(fā)現(xiàn)的有效濃度相對(duì)應(yīng)的血清藥物水平而產(chǎn)生療效的量。因此，例如治療與高β-淀粉樣蛋白誘發(fā)的神經(jīng)毒性有關(guān)的障礙，當(dāng)證實(shí)化合物在體外、在例如200nM濃度的半數(shù)最大有效量具有活性時(shí)，因而需要給予患者藥物的量為在一段時(shí)間內(nèi)，在患者體內(nèi)有效提供產(chǎn)生需要的療效的約200nM濃度的半數(shù)最大有效劑量，本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇其它適合測(cè)量的指標(biāo)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉這些參數(shù)的測(cè)定。這些需要考慮的事項(xiàng)在本領(lǐng)域眾所周知，而且在標(biāo)準(zhǔn)教科書(shū)中有描述。
為了測(cè)量并確定給予患者有效量的本發(fā)明化合物，本發(fā)明化合物的血清藥物濃度可用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定技術(shù)測(cè)量。
設(shè)計(jì)的本發(fā)明組合物在給予患者后約30分鐘至約24小時(shí)間隔內(nèi)提供療效。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物在約30分鐘內(nèi)提供這種療效。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物在約24小時(shí)內(nèi)提供療效，允許一天一次給藥，以改進(jìn)患者的順應(yīng)性。
本發(fā)明的方法、藥盒和組合物還可與其它治療或預(yù)防神經(jīng)變性性疾病的藥物聯(lián)合使用(“聯(lián)合療法”)，例如乙酰膽堿酯酶抑制劑(即加蘭他敏，鹽酸多奈哌齊(donezepil)。當(dāng)與本發(fā)明聯(lián)合使用即聯(lián)合療法時(shí)，可實(shí)現(xiàn)相加或協(xié)同作用，可以減少或消除(如果不是所有的)許多數(shù)不希望的副作用。這些減少副作用的藥物的表現(xiàn)，一般歸因于例如用聯(lián)合給藥必須達(dá)到療效的劑量減少。
術(shù)語(yǔ)“聯(lián)合療法”包括給予患者本本發(fā)明組合物和其它治療或預(yù)防神經(jīng)變性性疾病的藥物，作為具體治療方案的組成部分，從這些治療神經(jīng)變性性疾病藥物的協(xié)同作用中提供有益作用。聯(lián)合療法的有益作用包括但不限于由治療藥物組合產(chǎn)生的、藥物動(dòng)力學(xué)或藥效學(xué)的協(xié)同作用。這些治療藥物聯(lián)合用藥通常在確定的時(shí)間內(nèi)完成(通常基本上同時(shí)、分鐘、小時(shí)、天、周、月或年，取決于所選擇的聯(lián)合療法)?！奥?lián)合療法”通常不包括作為獨(dú)立的單一治療方案的組成部分給予這些治療藥物中的兩種或多種(偶然和任意產(chǎn)生本發(fā)明的聯(lián)合作用)?！奥?lián)合療法”包括這些治療藥物按序貫方式給藥，即每種治療藥物在不同時(shí)間使用；以及包括這些藥物或至少這些藥物的兩種以基本上同時(shí)的方式用藥。可實(shí)現(xiàn)基本上同時(shí)用藥，例如給予患者每種藥物具有固定比率的一片片劑或一粒膠囊劑，或含有每種治療藥物的多個(gè)、單個(gè)膠囊劑或片劑?？赏ㄟ^(guò)任何合適的途徑，實(shí)現(xiàn)每種治療藥物順序或基本上同時(shí)給藥。本發(fā)明組合物可口服或鼻胃給藥，盡管聯(lián)合療法中的其它治療藥物可通過(guò)任何對(duì)具體藥物合適的途徑給藥，包括但不限于口服途徑、經(jīng)皮途徑、靜脈內(nèi)途徑、肌內(nèi)途徑或通過(guò)粘膜組織直接攝取。例如將本發(fā)明組合物口服或鼻胃給藥，而且聯(lián)合療法中的治療藥物可口服或經(jīng)皮給藥。治療藥物給藥的順序不是非常重要?！奥?lián)合療法”還包括上述治療藥物再與其它生物活性成分(例如但不限于鎮(zhèn)痛藥)聯(lián)合給藥；例如與非藥物療法(例如但不限于外科手術(shù))聯(lián)合。
組成聯(lián)合療法的治療性化合物可以為復(fù)合劑型或獨(dú)立劑型，以便基本同時(shí)給藥。組成聯(lián)合療法的治療性化合物也可與通過(guò)需要兩步給藥方案給藥的任一治療性化合物序貫給藥。因此，可能需要治療性化合物與分開(kāi)給藥的單獨(dú)的活性藥物序貫給藥的方案。多步給藥的時(shí)間范圍可在例如幾分鐘至幾小時(shí)至幾天，取決于每種治療性化合物的特性例如效力、溶解度、生物利用度、血漿半衰期和治療性化合物動(dòng)力學(xué)曲線；以及取決于患者的攝食量、年齡和病癥。靶分子濃度的晝夜節(jié)律性變化也能決定最佳劑量間隔。無(wú)論同時(shí)、基本同時(shí)還是序貫給藥，聯(lián)合療法的治療性化合物可能涉及需要一種經(jīng)口服途徑給藥的治療性化合物和經(jīng)皮途徑、靜脈內(nèi)途徑、肌內(nèi)途徑或經(jīng)粘膜組織直接攝取的另一種治療性化合物一起給藥的方案，例如。無(wú)論聯(lián)合療法的治療性化合物是口服、通過(guò)吸入噴霧、直腸、局部、口腔、舌下、還是胃腸外(例如皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮內(nèi)注射)給藥；分別或一起給藥，每個(gè)這種治療性化合物會(huì)包含在藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或其它制劑成分的合適的藥用制劑中。
對(duì)于口服給藥，藥用組合物可含有需要量的式(I)化合物，并且可為以下劑型例如片劑、硬膠囊劑或軟膠囊劑、錠劑、扁囊劑、可調(diào)配的散劑、顆粒劑、混懸劑、酏劑、液體制劑或任何其它合理的適用于口服給藥的劑型。作為說(shuō)明，可將這種組合物制成含有預(yù)定量的活性化合物的分離的單位劑型，例如片劑或膠囊劑。這種口服劑型還可含有例如緩沖劑。另外，片劑、丸劑等可用腸溶衣制備。
適合口腔或舌下給藥的藥用組合物包括例如含活性化合物和矯味基質(zhì)(例如蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠)的錠劑；和含活性化合物和惰性基質(zhì)(例如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠)的軟錠劑。
口服給藥的液體劑型可包括藥學(xué)上可接受的含有本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑(例如水)的乳劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑和酏劑。這種組合物還可包括例如濕潤(rùn)劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、矯味劑和香精。
合適的液體劑型的實(shí)例包括但不限于含活性化合物和β-環(huán)糊精或以下β-環(huán)糊精的水溶性衍生物的水性溶液劑，例如磺丁基醚β-環(huán)糊精；七(2，6-二甲基)-β-環(huán)糊精；羥丙基-β-環(huán)糊精和二甲基-β-環(huán)糊精。
本發(fā)明的藥用組合物也可(靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下)注射給藥。這種注射用組合物可使用例如鹽水、葡萄糖或水作為合適的載體材料。如果需要，可用合適的酸、堿或緩沖劑調(diào)節(jié)組合物的pH值。合適的填充劑、分散劑、濕潤(rùn)劑或懸浮劑，包括甘露醇和聚乙二醇(例如PEG400)也可包括在組合物中。合適的胃腸外用組合物還包括在注射瓶中凍干的活性化合物。注射前，可加入水溶液溶解該組合物。
藥用組合物可以栓劑等的劑型給藥。這種直腸制劑優(yōu)選含有占總量例如約0.075w/w至約75％w/w、或約0.2w/w至約40％w/w、或約0.4w/w至約15％w/w的活性化合物。在這種組合物中可使用載體材料例如可可脂、可可油、其它種類(lèi)的油和聚乙二醇作為栓劑基質(zhì)。如果需要，也可使用其它載體材料例如包衣材料(例如羥丙基甲基纖維素薄膜包衣材料)和崩解劑(例如交聯(lián)羧甲基纖維素鈉和交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮)。
主題化合物可以是游離的，或包埋在微囊、膠體藥物遞藥系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、微乳和粗乳狀液)中。
這些藥用組合物可通過(guò)任何合適的藥劑學(xué)方法制備，包括將本發(fā)明活性化合物和一種或多種載體材料結(jié)合到一起的步驟。一般而言，組合物是將活性化合物與液體或微細(xì)固體載體、或二者均勻地混合在一起，然后如果需要，將該產(chǎn)物成形。例如通過(guò)壓制或模制所述化合物的粉末或顆粒和任選的一種或多種補(bǔ)充成分制備片劑?？梢詫⒆杂闪鲃?dòng)的化合物例如粉末或顆粒任選與粘合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑和/或表面活性劑/分散劑可在合適的機(jī)器中混合，壓縮，制備壓制片?？稍诤线m的機(jī)器上，通過(guò)將潤(rùn)濕的化合物粉末和惰性液體稀釋劑一起塑造制備模制片。
本發(fā)明化合物的片劑也可用常規(guī)的包衣材料例如白色OpadryTMYS-1-18027A(或其它顏色)包衣，包衣粉的重量組分可約為包衣片總重的3％。通過(guò)使用在本領(lǐng)域已知的方法，可配制本發(fā)明的組合物以便在患者用藥后提供快速釋放、或緩慢釋放或延遲釋放的組合物。
當(dāng)賦形劑作稀釋劑時(shí)，其可為固體、半固體或液體材料，其擔(dān)當(dāng)活性成分的載體或介質(zhì)。因此，組合物可以為片劑、咀嚼片劑、丸劑、錠劑、小藥囊、扁囊劑、酏劑、混懸劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑、氣霧劑(作為固體或在液體介質(zhì)中)、軟明膠膠囊劑和硬明膠膠囊劑以及無(wú)菌包裝的粉針劑。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，制備方法可使用包括以下一種或組合方法(1)干混；(2)直接壓片；(3)粉碎；(4)干法或非水制粒；(5)濕法制粒；或(6)熔融法。Lachman等，The Theory and Practice ofIndustrial Pharmacy(1986)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)將本發(fā)明的治療藥物與藥用賦形劑混合，形成含有治療藥物和賦形劑的均質(zhì)混合物的固體預(yù)制組合物，制備固體組合物例如片劑。當(dāng)將這些預(yù)制組合物稱(chēng)為均質(zhì)時(shí)，意指治療藥物在整個(gè)組合物中均勻分散，變得可以容易地將所述組合物再分為同等有效的單位劑型例如片劑、丸劑和膠囊劑。然后將該固體預(yù)制組合物再分到本文所述類(lèi)型的單位劑型中。
壓制片為通過(guò)壓縮含有活性成分和賦形劑的制劑制備的固體劑型，所選的賦形劑應(yīng)能幫助處理和改善成品的性能。術(shù)語(yǔ)“壓制片”通常是指口服攝入的普通未包衣片劑，其通過(guò)單純壓縮或通過(guò)預(yù)壓縮叩出(pre-compaction tapping)和最后壓縮制備。
可以給本發(fā)明片劑或丸劑進(jìn)行包衣或用其它方法配煉，以提供具有長(zhǎng)效優(yōu)點(diǎn)的劑型。例如片劑或丸劑可包含內(nèi)層劑量和外層劑量成分，后者是前者的保護(hù)層。包括許多高分子酸以及高分子酸與紫膠、鯨蠟醇、醋酸纖維素等材料的混合物的多種材料，可用作這種腸溶層或包衣。
長(zhǎng)期緩釋植入片的應(yīng)用可適用于治療需要連續(xù)給予神經(jīng)變性性疾病的患者本發(fā)明組合物。本文所用的“長(zhǎng)期”釋放是指構(gòu)造和安排所述植入片至少在30天，優(yōu)選在60天內(nèi)釋放的活性成分能達(dá)到治療水平。長(zhǎng)期緩釋植入片是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的，長(zhǎng)期緩釋植入片包括上述的一些釋放系統(tǒng)。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，治療神經(jīng)變性性疾病的化合物以盛有本發(fā)明的一種或多種治療性化合物的藥盒或包裝形式出現(xiàn)。本發(fā)明這些治療性化合物可包裝在某種形式的藥盒或包裝物中，在其中安排每小時(shí)、每天、每周或每月(或其它周期)的劑量，能夠適當(dāng)?shù)匦蜇灮蛲瑫r(shí)給藥。本發(fā)明還提供盛有多種劑量單位的藥盒或包裝，以適合連續(xù)每天給藥，每個(gè)劑量單位包含至少一種本發(fā)明的治療性化合物?？捎盟鲞f藥系統(tǒng)幫助本發(fā)明治療性化合物的各種實(shí)施方案的任何方案給藥。在一實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)包括每天或每周給藥的多種劑量。藥盒或包裝還可裝有用于聯(lián)合療法的藥物，以幫助所述劑型的適當(dāng)給藥。藥盒或包裝還可裝有一套為患者提供的說(shuō)明書(shū)。
相信本領(lǐng)域技術(shù)人員按本文提供的說(shuō)明書(shū)，能最大限度地利用本發(fā)明。因此，例舉以下的具體實(shí)施例僅為說(shuō)明目的，并不意味著以任何方式限制本公開(kāi)的其它部分。
實(shí)施例I材料Aβ1-42和Aβ肽片段購(gòu)自American Peptide Co.(Sunnyvale，CA)。多克隆兔抗β-淀粉樣蛋白肽(目錄號(hào)71-5800)得自Zymed Laboratories(San Francisco，CA)。[22-3H]R-羥基膽甾醇(sp.act.20Ci/mmol)由American Radiolabeled Chemical(St Louis，MO)合成。膽甾醇、22R-羥基膽甾醇、22S-羥基膽甾醇、孕烯醇酮、17α-羥基孕烯醇酮和DHEA購(gòu)自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。細(xì)胞培養(yǎng)用品購(gòu)自GIBCO(GrandIsland，NY)，細(xì)胞培養(yǎng)塑料制品購(gòu)自Corning(Corning，NY)。電泳試劑和材料由Bio-Rad(Richmond，CA)提供。其它所有使用的化學(xué)品均為分析純，得自各種商業(yè)。
組織樣品所有人組織樣品購(gòu)自Harvard Brain Tissue Resource Center(Belmont，MA)。將用于測(cè)定類(lèi)固醇的樣品在液氮中速凍或被動(dòng)(passively)冷凍。腦海馬和額皮層樣品取自19名患者，12名AD(6男6女)和7名同年齡對(duì)照組患者(4男3女)。AD患者按Harvard TissueResource Center分類(lèi)為患有“嚴(yán)重AD”。所有AD患者的平均年齡為74.6±7.2歲，對(duì)照組患者的平均年齡為73.4±10.5歲。AD患者的尸體解剖平均間隔時(shí)間為10.2小時(shí)，對(duì)照組為14.7小時(shí)。由Georgetown University Internal Review Board批準(zhǔn)人組織使用規(guī)程。
22R-羥基膽甾醇的純化與測(cè)定樣品按前述方法用反相HPLC提取和純化。Brown，R.C.，Cascio，C.& Papadopoulos，V.(2000)J.Neurochem.74，847-859。收集含22R-羥基膽甾醇的流分(22R-羥基膽甾醇的保留時(shí)間＝55分鐘)，用膽甾醇氧化酶測(cè)定法測(cè)定22R-羥基膽甾醇水平。Gamble，W.，Vaughan，M.，Kruth，H.S.& Avigan，J.(1978)J.Lipid Res.19，1068-1070。
細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞毒性和活力測(cè)定按前述方法培養(yǎng)大鼠PC12細(xì)胞。Yao，Z.，Drieu K.&Papadopoulos，V.(2001)Brain Res.889，181-190。人NT2前體(Ntera2/D1畸胎瘤)細(xì)胞得自Stratagene(La Jolla，CA)，并按供應(yīng)商的說(shuō)明培養(yǎng)。分化人NT2神經(jīng)元(NT2N)取自用視黃酸處理后的NT2前體細(xì)胞。Andrews，P.W.(1984)Dev.Biol.103，285-293。將Aβ溶于培養(yǎng)基中，以聚集體(在4℃下放置過(guò)夜)或可溶形式(含寡聚體例如二聚體和四聚體)使用，用前述電泳法檢查。Yao，Z.等，Brain Res.(2001)。按前述方法(同上)，用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)試驗(yàn)(Trevigen，Gaithersburg，MD)測(cè)定Aβ及Aβ片段的細(xì)胞毒性。細(xì)胞活力按前述方法(同上)用錐蟲(chóng)藍(lán)排除法測(cè)定。簡(jiǎn)單地說(shuō)，對(duì)于這些研究，在濃度遞增的Aβ存在或不存在下，細(xì)胞用類(lèi)固醇處理72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，細(xì)胞用PBS洗滌三次，與0.1％錐蟲(chóng)藍(lán)染色液在室溫下一起培養(yǎng)15分鐘。用PBS洗滌三次后，將0.1N NaOH加入到細(xì)胞中，用Victor定量檢測(cè)分光光度計(jì)(EGG-Wallac，Gaithersburg，MD)，在450nm處定量測(cè)定錐蟲(chóng)藍(lán)染色。在相同樣品中，按Bradford方法(Bradford，M.M.(1976)Anal.Biochem.72，248-254)，在590nm處測(cè)定考馬斯藍(lán)染色以測(cè)定細(xì)胞蛋白質(zhì)水平。
膽甾醇-蛋白結(jié)合印跡測(cè)定(CPBBA)將純化的Aβ1-42蛋白(50μM)或各種Aβ片段(50μM)和3H-22R-羥基膽甾醇單獨(dú)、或者在20μl體積的濃度遞增的未標(biāo)記22R-羥基膽甾醇存在下，于37℃培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，在10XSSC緩沖液中，用1.5％瓊脂糖(Type I-B)凝膠電泳分離樣品，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Schleicher & Schuell，Keene，NH)上。將膜暴露于氚敏屏，用CycloneStorage phosphor system(Packard BioScience，Meridien，CT)通過(guò)磷光成像分析膜，用OptiQuant軟件(Packard)進(jìn)行圖像光密度分析。該方法適用于分離、顯現(xiàn)和鑒定Aβ絡(luò)合物，其在非變性條件下?lián)饺肓朔派湫詷?biāo)記的膽甾醇(Yao，Z.& Papadopoulos，V.，提交的手稿)和22R-羥基膽甾醇。用電泳分離和排除低分子量的未摻入的22R-羥基膽甾醇。
Aβ聚集測(cè)定將純化的Aβ1-42蛋白(50mM)的細(xì)胞培養(yǎng)基單獨(dú)、或在濃度遞增的22R-羥基膽甾醇存在下，于37℃培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，在125V電壓下，在4％-20％梯度丙烯酰胺-雙丙烯酰胺凝膠上，用SDS-PAGE分離蛋白2小時(shí)。蛋白質(zhì)用考馬斯藍(lán)染色顯現(xiàn)。通過(guò)免疫印跡分析鑒定各種Aβ種。Yao，Z.等，Brain Res.(2001)。
免疫印跡分析然后用含有22R-羥基膽甾醇-Aβ肽絡(luò)合物的膜檢測(cè)Aβ水平。通過(guò)在5％牛奶中培養(yǎng)硝酸纖維素封閉所述膜，然后用ECL試劑處理以便進(jìn)行Aβ免疫檢測(cè)(Amersham-Pharmacia，Piscataway，NJ)。Li，H.，Yao，Z.，Degenhardt，B.，Teper，G.& Papadopoulos，V.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98，1267-1272?？笰β抗體和第二抗體分別按0.2μg/ml和1∶5000稀釋度使用。
肽建膜和22R-羥基膽甾醇對(duì)接用在Aβ1-40Met(O)(MMDB同上7993PDB同上1BA)(由CD和NMR光譜產(chǎn)生的數(shù)據(jù))的溶液結(jié)構(gòu)中生成的Aβ結(jié)構(gòu)，完成22R-羥基膽甾醇與Aβ17-40和Aβ25-35的計(jì)算機(jī)對(duì)接。Watson，A.A.，F(xiàn)airlie，D.P.，& Craik，D.J.(1998)Biochemistry37，12700。Met(O)SME35殘基被保留相鄰的骨架雙面夾角和提取的殘基17-40的配位價(jià)的Met置換。運(yùn)用Alchemy 2000程序(Tripos，St.Louis，MO)開(kāi)發(fā)出22R-羥基膽甾醇結(jié)構(gòu)。用Monte Carlo模擬退火(Li，H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2001))完成對(duì)接，并且按修訂版的Autogrid/Autodock.Morris，G.M.，Goodsell，D.S.，Halliday，R.S.，Huey，R.，Hart，W.E.，Belew，R.K.，&Olson，A.J.(1998)；J.Comput.Chem.19，1639-1662方法完善對(duì)接。在約109的構(gòu)象中評(píng)價(jià)最小能量的構(gòu)象。執(zhí)行5輪組成100次運(yùn)行，每輪在配體與靶標(biāo)的隨機(jī)初始相對(duì)位置和取向開(kāi)始。每次運(yùn)行由用約2×104改進(jìn)步驟的100個(gè)退火循環(huán)組成。用1.7GHz、1GB RAM個(gè)人電腦和改進(jìn)的程序計(jì)算，總的計(jì)算時(shí)間約為15分鐘。
統(tǒng)計(jì)用INSTAT 3.00程序包(GraphPad，San Diego，CA)，按照單向方差分析(ANOVA)和非配對(duì)學(xué)生氏t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
結(jié)果如圖2所示，人腦內(nèi)源性22R-羥基膽甾醇水平經(jīng)HPLC純化，用膽甾醇氧化酶測(cè)定法測(cè)定。報(bào)告的數(shù)據(jù)為兩次測(cè)定的12名AD和7名相同年齡對(duì)照組樣品的平均值±SEM。圖2顯示，AD患者腦海馬標(biāo)本中的22R-羥基膽甾醇水平與相同年齡組對(duì)照組相比減少60％(p＝0.04)。盡管沒(méi)有顯著意義，AD患者腦額皮層標(biāo)本中的22R-羥基膽甾醇水平與相同年齡組相比也減少50％。
在濃度遞增的22R-羥基膽甾醇(圖3A)、膽甾醇(圖3B)、孕烯醇酮(圖3C)或17α-羥基孕烯醇酮(圖3D)、DHEA(圖3E)或22S-羥基膽甾醇(圖3F)不存在或存在下，用指定濃度的Aβ1-42處理PC12細(xì)胞24小時(shí)。所示結(jié)果為平均值±SD(n＝6-12)。用線粒體黃遞酶測(cè)定MTT法測(cè)定22R-羥基膽甾醇拯救大鼠PC12神經(jīng)元細(xì)胞抵抗Aβ誘發(fā)的細(xì)胞毒性的能力。
分別在5.0μM和50μM Aβ存在下，Aβ1-42誘發(fā)的分別達(dá)到26％(p＜0.001)和40％(P＜0.001)細(xì)胞死亡的劑量依賴(lài)性神經(jīng)毒性(圖3A)。盡管在10μM和100μM的22R-羥基膽甾醇存在下出現(xiàn)非顯著性提高，但濃度遞增的22R-羥基膽甾醇不影響PC12細(xì)胞活力(圖3A)。22R-羥基膽甾醇能夠拯救所有細(xì)胞抵抗25μM Aβ誘發(fā)的細(xì)胞毒性(P＜0.001)；和在50μM Aβ存在下，拯救50％(p＜0.01)的即將死亡的細(xì)胞(圖3A)。有趣的是，22R-羥基膽甾醇只與Aβ同時(shí)存在時(shí)才有效。用22R-羥基膽甾醇預(yù)處理PC12細(xì)胞后，隨后用Aβ處理無(wú)法對(duì)細(xì)胞提供任何的保護(hù)(數(shù)據(jù)未顯示)。
用其前體膽甾醇(圖3B)或其代謝物孕烯醇酮(圖3C)重復(fù)不出22R-羥基膽甾醇的神經(jīng)保護(hù)性作用。相反，單獨(dú)的膽甾醇和孕烯醇酮都對(duì)細(xì)胞有毒性。而且，膽甾醇的存在加大低濃度Aβ的毒性作用。單獨(dú)的17α-羥基孕烯醇酮也對(duì)細(xì)胞有毒性(圖3D)。100μM DHEA對(duì)細(xì)胞活力有積極作用。相同濃度的DHEA防止5μM(p＜0.001)Aβ誘發(fā)的神經(jīng)毒性，但對(duì)50μM無(wú)效(圖3E)。22R-羥基膽甾醇的作用為立體專(zhuān)一性的，因?yàn)?2S-羥基膽甾醇不僅沒(méi)有防止Aβ誘發(fā)的神經(jīng)毒性，而且在100μM濃度下還有神經(jīng)毒性(圖3F)。
應(yīng)該注意，在例舉的這些研究中，使用的是聚集的Aβ(放置過(guò)夜，4℃)。在另外的試驗(yàn)中，將可溶性Aβ(含寡聚體)直接加入到PC12細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)其有毒性(數(shù)據(jù)未顯示)。22R-羥基膽甾醇還有防止Aβ寡聚體誘發(fā)的毒性(未顯示)。
22R-羥基膽甾醇的神經(jīng)保護(hù)性作用并不限于PC12細(xì)胞，而在分化人NT2N神經(jīng)元中也可以重現(xiàn)(圖4)。在22R-羥基膽甾醇存在或不存在下，用25μM Aβ1-42處理分化人NT2N神經(jīng)元72h。盡管1μM和10μM的22R-羥基膽甾醇分別保護(hù)50％(p＜0.01)和100％(p＜0.001)人神經(jīng)元抵抗Aβ誘發(fā)的毒性，但25μM Aβ抑制50％(p＜0.001)的人神經(jīng)元活力(圖4)。為評(píng)價(jià)22R-羥基膽甾醇是否拯救人NT2細(xì)胞抵抗其它毒性損害，在1-50μM 22R-羥基膽甾醇存在或不存在下，用5mM谷氨酸鹽處理NT2細(xì)胞3天。用MTT測(cè)定法測(cè)定，谷氨酸鹽引起細(xì)胞活力下降30％，而22R-羥基膽甾醇不能保護(hù)細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。
MTT測(cè)定獲得的結(jié)果用錐蟲(chóng)藍(lán)染料排除測(cè)定法進(jìn)一步證實(shí)。在100μM 22R-羥基膽甾醇或DHEA存在或不存在下，PC12細(xì)胞用濃度遞增的Aβ1-42(圖5A)或Aβ25-35(圖5B)處理72小時(shí)。在25μM 22R-羥基膽甾醇或DHEA存在或不存在下，NT2細(xì)胞用濃度遞增的Aβ1-42(圖5C)或Aβ25-35(圖5D)處理72小時(shí)?；盍λ接貌牧虾头椒ㄖ忻枋龅腻F蟲(chóng)藍(lán)測(cè)定法測(cè)定。結(jié)果以每總細(xì)胞蛋白的錐蟲(chóng)藍(lán)染色細(xì)胞相對(duì)于未處理對(duì)照細(xì)胞的倍數(shù)表示。所示結(jié)果為平均值±SD(n＝6-12)。圖5A和圖5C顯示22R-羥基膽甾醇既拯救大鼠PC12細(xì)胞(圖5A)又拯救人NT2細(xì)胞(圖5C)抵抗Aβ1-42誘發(fā)的細(xì)胞死亡。相反，DHEA只保護(hù)大鼠PC12細(xì)胞抵抗Aβ1-42誘發(fā)的細(xì)胞死亡，而不保護(hù)NT2細(xì)胞(圖5A和圖5C)。22R-羥基膽甾醇和DHEA都不能拯救PC12和NT2細(xì)胞抵抗Aβ25-35誘發(fā)的細(xì)胞死亡(圖5B和圖5D)。
還檢測(cè)了22R-羥基膽甾醇改變Aβ聚集的能力。將純化的Aβ1-42蛋白(50μM)在細(xì)胞培養(yǎng)基中單獨(dú)、或在濃度遞增的22R-羥基膽甾醇存在下，于37℃培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，用SDS-PAGE分離蛋白，并用考馬斯藍(lán)顯現(xiàn)(圖6A)。形成的各種Aβ用抗Aβ多克隆抗血清免疫印跡鑒定(圖6B)。在凝膠的頂部可觀察到Aβ聚集，在對(duì)照培養(yǎng)基泳道不存在聚集。圖6A和6B顯示22R-羥基膽甾醇不影響Aβ聚集，該聚集用考馬斯藍(lán)染色凝膠(圖6A)的免疫印跡分析(圖6B)鑒定。在包括在對(duì)照培養(yǎng)基中使用的所有樣品中，經(jīng)Aβ多克隆抗血清識(shí)別的100kDa條帶可能反映出抗血清的非特異結(jié)合。
然后檢測(cè)22R-羥基膽甾醇的作用機(jī)制。鑒于22R-羥基膽甾醇只在Aβ存在下有神經(jīng)保護(hù)性(作用)，用新方法(CPBBA法)探索了22R-羥基膽甾醇與Aβ的直接相互作用。將放射性標(biāo)記的22R-羥基膽甾醇與Aβ1-42在37℃下一起培養(yǎng)24小時(shí)，證明存在可被Aβ的特異性抗體(圖7B)所識(shí)別的高分子量放射性標(biāo)記條帶(圖7A)。用未標(biāo)記的22R-羥基膽甾醇進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)性研究證明，22R-羥基膽甾醇與放射性標(biāo)記的Aβ1-42的特異性(圖7A)。在這些研究中，50μM和200μM 22R-羥基膽甾醇分別抑制50％和90％的放射性標(biāo)記的22R-羥基膽甾醇與50μMAβ1-42的結(jié)合，如放射性標(biāo)記的Aβ1-42圖像分析所示(圖7A)。用放射性標(biāo)記的Aβ1-42免疫印跡分析，評(píng)價(jià)Aβ1-42在培養(yǎng)反應(yīng)和CPBBA中的等量加樣(圖7B)。應(yīng)該注意，盡管在50-200μM 22R-羥基膽甾醇存在下觀察到放射性標(biāo)記的Aβ1-42減少，但在各泳道存在的Aβ1-42的量沒(méi)有差異。這些數(shù)據(jù)表明，在非變性條件下，22R-羥基膽甾醇與Aβ結(jié)合。用CPBBA和各種Aβ合成肽，測(cè)得22R-羥基膽甾醇在Aβ結(jié)合位點(diǎn)是在Aβ的氨基酸17-40位(圖7C和圖7E)。有趣的是，在22R-羥基膽甾醇(圖7B和圖7D)存在下，保持其神經(jīng)毒性的肽Aβ25-35不結(jié)合22R-羥基膽甾醇(圖7C)。用計(jì)算對(duì)接模擬進(jìn)一步證實(shí)了這些數(shù)據(jù)。對(duì)接結(jié)果顯示Aβ17-40形成一個(gè)口袋，22R-羥基膽甾醇在該處可對(duì)接(圖7D)。通過(guò)氨基酸G29A30I31形成的該口袋捕獲到22R-羥基膽甾醇的C27-29原子。R與S的相對(duì)定位允許22R-羥基膽甾醇對(duì)接。用Aβ25-35進(jìn)行的類(lèi)似研究表明，盡管在19-36區(qū)域存在一些氨基酸，但Aβ25-35與22R-羥基膽甾醇的對(duì)接能(-6.0510kcal/mol)比Aβ17-40(-8.6939Kcal/mol)和Aβ1-42(-9.6960Kcal/mol)高，提示該類(lèi)固醇不與Aβ25-35結(jié)合，與CPBBA數(shù)據(jù)相符。
討論在腦中，神經(jīng)類(lèi)固醇(孕烯醇酮和DHEA)蓄積不依靠外周內(nèi)分泌器官供應(yīng)(Baulieu，E.E.& Robel，P.(1990)J.Steroid Biochem.Mol.Biol.37，395-403)，充當(dāng)神經(jīng)調(diào)節(jié)劑(Paul，M.P.& Purdy，R.H.(1992)FASEB J.6，2311-2322)，并且可作為各種神經(jīng)病理學(xué)的藥理學(xué)工具(Costa，E.，Cheney，D.L.，Grayson，D.R.，Korneyev，A.，Longone，P.，Pani，L.，Romeo，E.，Zivkovich，E.& Guidotti，A.(1994)Ann.N.Y.Acad.Sci.746，223-242)。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可將膽甾醇轉(zhuǎn)換為孕烯醇酮。體外研究表明，少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株和神經(jīng)膜細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞色素P450負(fù)責(zé)膽甾醇側(cè)鏈切割，因此形成孕烯醇酮。Jung-Testas，I.，Hu，Z.，Baulieu，E.E.& Robel，P.(1989)Endocrinology125，2083-2091；Papadopoulos，V.，Guarneri，P.，Krueger，K.E.，Guidotti，A.&Costa，E.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89，5113-5117；Akwa，Y.，Schumacher，M.，Jung-Testas，I.& Baulieu，E.E(1993)C.R.Acad.SciIII(France)316，410-414。P450側(cè)鏈切割酶也存在于嚙齒動(dòng)物腦中(Stromstedt，M.& Waterman，M.R.(1995)Mol.Brain Res.34，75-88)，并存在于AD和相同年齡對(duì)照組腦標(biāo)本中(Brown，R.C.，Han，J.Cascio，C.& Papadopoulos，V.(2002)Neurobiol.Aging，即將出版)。已有文章詳細(xì)記述了在該酶反應(yīng)中形成的三個(gè)羥基化中間體中的一個(gè)為22R-羥基膽甾醇。Dixon，R.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.(1970)；Hall，P.F.(1985)Vitamins & Hormones42，315-368。22R-羥基膽甾醇比膽甾醇極性更強(qiáng)，容易轉(zhuǎn)運(yùn)穿過(guò)細(xì)胞膜。在本研究中，發(fā)現(xiàn)在AD患者腦標(biāo)本中的22R-羥基膽甾醇的水平比相同年齡對(duì)照組低。22R-羥基膽甾醇的水平在海馬(對(duì)學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知功能至關(guān)重要的腦邊緣系統(tǒng)結(jié)構(gòu))中顯著降低，其在AD中受到影響。Aβ的生理功能是調(diào)節(jié)膽甾醇的轉(zhuǎn)運(yùn)(Yao，Z.& Papadopoulos，V.，F(xiàn)ASEB Journal，161677-1679)。根據(jù)這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)，22R-羥基膽甾醇的減少可能是因?yàn)锳β在AD患者腦中過(guò)量生成(Roher，A.E.，Lowenson，J.D.，Clark，S.，Wolkow，C.，Wang，R.，Cotter，R.J.，Reardon，I.M.，Zurcher-Neely，H.A.，Heinrikson，R.L.，Ball，M.J.& Greenberg，B.D.(1993)J.Biol.Chem.286，3072-3083；Younkin，S.G.(1998)J.Physiol.92，289-292)阻斷了細(xì)胞對(duì)膽甾醇的交換或減少了細(xì)胞對(duì)膽甾醇的攝取，因此影響神經(jīng)類(lèi)固醇形成對(duì)底物膽甾醇的利用率，導(dǎo)致AD患者腦中的22R-羥基膽甾醇合成減少。另外，將AD腦標(biāo)本的膽甾醇用于增加孕烯醇酮和DHEA的從頭合成，也會(huì)耗竭AD中可利用的22R-羥基膽甾醇中間體。在AD海馬中出現(xiàn)孕烯醇酮和DHEA水平增加(Brown，R.C.，Han，Z.，Cascio，C.& Papadopoulos，V.(2003)Neurobiology of Aging，2457-65))，是由Aβ誘發(fā)的(Brown，R.C.，Cascio，C.& Papadopoulos，V.(2000)J.Neurochem.74847-859)。Aβ誘發(fā)的膽甾醇交換減少和膽甾醇代謝增加，這兩個(gè)事件可能在AD中發(fā)生，導(dǎo)致22R-羥基膽甾醇水平降低也是可能的。
對(duì)于這些研究，均采用公認(rèn)的大鼠PC12神經(jīng)元細(xì)胞模型。然而，22R-羥基膽甾醇的神經(jīng)保護(hù)性作用并不限于嚙齒動(dòng)物神經(jīng)元，在人NT2和NT2N神經(jīng)元細(xì)胞也發(fā)現(xiàn)該作用。NT2細(xì)胞是人畸胎瘤細(xì)胞的克隆系，源自NT2細(xì)胞的NT2N是有絲分裂期后的、具有與中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元一致的細(xì)胞表面標(biāo)記的終末分化的神經(jīng)元。Andrews，P.W.，Dev.Biol.(1984)。發(fā)現(xiàn)22R-羥基膽甾醇以劑量依賴(lài)性方式保護(hù)大鼠和人神經(jīng)元抵抗Aβ誘發(fā)的毒性，其對(duì)PC12和NT2T細(xì)胞的IC50分別為10μM和3μM。用22R-羥基膽甾醇處理的細(xì)胞可給細(xì)胞提供完全保護(hù)25μM濃度的Aβ，提供50％的神經(jīng)防止50μM Aβ肽。
在B12大鼠神經(jīng)細(xì)胞中，用淀粉樣蛋白原纖維誘發(fā)的MTT甲胞吐測(cè)定法，對(duì)多種公認(rèn)的類(lèi)固醇抗Aβ的神經(jīng)保護(hù)特性進(jìn)行了測(cè)試。Liu Y.& Schubert，D.(1998)J.Neurochem.71，2322-2329。在這些研究中，Liu和Schubert認(rèn)為阻斷淀粉樣蛋白原纖維誘發(fā)的MTT甲胞吐的化合物(不影響對(duì)照細(xì)胞的胞吐作用)，應(yīng)該作用于上游靶，因而具有神經(jīng)保護(hù)性作用。同上。除22R-羥基膽甾醇作用外，還用檢測(cè)藍(lán)甲形成的MTT測(cè)定法，檢測(cè)參與膽甾醇代謝的各種類(lèi)固醇的神經(jīng)保護(hù)特性。在這些經(jīng)Aβ誘發(fā)的PC12神經(jīng)毒性測(cè)試的類(lèi)固醇中，除了22R-羥基膽甾醇和DHEA，其它所有都有毒性。DHEA對(duì)嚙齒動(dòng)物神經(jīng)元的神經(jīng)保護(hù)性作用與先前的研究一致。Kimonides，VG，Khatibi，NH，Svendsen，CN，Sofroniew，MV，& Hervert，J(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，1852-1857；Cardounel，A，Regelson，W，&Kalimi，M(2000)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，222，145-149。但是，與22R-羥基膽甾醇相反，DHEA對(duì)Aβ誘發(fā)的人NT2細(xì)胞死亡不起作用，提示22R-羥基膽甾醇的作用不是種特異性，可能因?yàn)樵擃?lèi)固醇與Aβ直接相互作用。發(fā)現(xiàn)膽甾醇(22R-羥基膽甾醇的前體)具有神經(jīng)毒性。但是，在碳22(R)位存在羥基不僅降低膽甾醇的毒性作用，而且防止Aβ誘發(fā)的神經(jīng)毒性。通過(guò)觀察，發(fā)現(xiàn)其對(duì)映體22S-羥基膽甾醇無(wú)活性，而且在高濃度時(shí)具有神經(jīng)毒性，進(jìn)一步證實(shí)22R-羥基膽甾醇作用的特異性。
用新的測(cè)定法(CPBBA)顯示22R-羥基膽甾醇與Aβ直接相互作用。在非變性條件下，該測(cè)定法適用于放射性標(biāo)記的類(lèi)固醇與Aβ、或Aβ肽片段直接互相作用的研究和顯現(xiàn)。放射性標(biāo)記的22R-羥基膽甾醇與Aβ結(jié)合，而未標(biāo)記的22R-羥基膽甾醇取代該結(jié)合的類(lèi)固醇。CPBBA表明22R-羥基膽甾醇結(jié)合Aβ1-42和Aβ17-40，但幾乎不與Aβ1-40相互作用。純化的淀粉樣蛋白斑質(zhì)譜分析表明，Aβ1-42是淀粉樣蛋白沉淀的主要成分，因此，據(jù)信Aβ1-42是AD發(fā)病機(jī)制的主要元兇。Roher，A.E.等，J.Biol.Chem.(1993)；Younkin，S.G.，J.Physiol.(1998)。據(jù)信40個(gè)氨基酸的較短型Aβ沒(méi)有病理作用(Brown，R.C.等，J.Neurochem.(2000))，并且在AD腦中較少(Roher，A.E.等，J.Biol.Chem.(1993)；Younkin，S.G.，J.Physiol.(1998))。根據(jù)報(bào)道的Aβ結(jié)構(gòu)的計(jì)算模型化模擬表明，當(dāng)羥基具有R定位時(shí)，氨基酸19-36捕獲捕獲22-R羥基膽甾醇的側(cè)鏈。有趣的是，已知具有毒性作用的肽Aβ25-35(Schubert，D.，Behl，C.，Lesley，R.，Brack，A.，Dargusch，R.，Sagara，Y.& Kimura H.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA92，1989-1993)即使在22R-羥基膽甾醇存在下，仍保留其神經(jīng)毒性特性。計(jì)算模型化模擬和CPBBA無(wú)法顯示22R-羥基膽甾醇和肽Aβ25-35的相互作用，提示是Aβ1-42和Aβ17-40的三維構(gòu)象而非一級(jí)氨基酸序列，提供氨基酸19-36與22R-羥基膽甾醇相互作用的能力。
22R-羥基膽甾醇與Aβ1-42的氨基酸17-40結(jié)合導(dǎo)致保護(hù)/拯救嚙齒動(dòng)物和人神經(jīng)元細(xì)胞抵抗Aβ1-42誘發(fā)的細(xì)胞毒性和細(xì)胞死亡。22R-羥基膽甾醇阻斷Aβ的神經(jīng)毒性作用的確切機(jī)制尚不得而知。但是，本文出具的數(shù)據(jù)表明其不影響Aβ的聚合。22R-羥基膽甾醇與Aβ1-42結(jié)合可能改變Aβ單體或多聚體的構(gòu)象，因此致使其無(wú)活性，或阻止Aβ與細(xì)胞相互作用或激活介導(dǎo)其毒性作用的胞內(nèi)機(jī)制。因此，除了在AD腦中Aβ1-42生成增加外，AD患者腦中22R-羥基膽甾醇水平比相同年齡對(duì)照組低，導(dǎo)致腦降低/失去抵抗A1-42誘發(fā)的神經(jīng)毒性的能力。這一點(diǎn)可能對(duì)與早老蛋白1樣家族性早老性癡呆(FAD)患者尤其正確，這類(lèi)患者的Aβ1-42水平最高。Borchelt，D.R.，Thinakaran，G.，Eckman，C.B.，Lee，M.K.，Davenport F.，Ratovitsky，T.，Prada，C-M.，Kim，G.，Seekins，S.，Yager，D.，Slunt，H.H.，Wang，R.，Seeger M.，LeveyA.I.，Gandy S.E.，Copeland N.G.，Jenkins N.A.，Price DL，Younkin S.G.& Sisodia S.S.(1996)，Neuron17，1005-1013。
實(shí)施例II材料Aβ1-42肽購(gòu)自American Peptide Co.(Sunnyvale，CA)。22R-羥基膽甾醇(SP222)購(gòu)自Sigma(St.Louis，MO)。[22-3H]R-羥基膽甾醇(sp.act.20Ci/mmol)由American Radiolabeled Chemical(St Louis，MO)合成。22R-羥基膽甾醇衍生物(SP223-238)購(gòu)自Interbioscreen(Moscow，Russia)。細(xì)胞培養(yǎng)用品購(gòu)自GIBCO(Grand Island，NY)，細(xì)胞培養(yǎng)塑料制品得自Corning(Corning，NY)和Packard BioSciences Co.(Meriden，CT)。
22R-羥基膽甾醇衍生物的計(jì)算機(jī)篩選運(yùn)用ISIS軟件(Information Systems，Inc.，San Leandro，CA)，在天然存在的實(shí)體的Interbioscreen數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選含22R-羥基膽甾醇結(jié)構(gòu)的化合物。選擇和測(cè)試的22R-羥基膽甾醇(SP222)及衍生物(SP223-238)的結(jié)構(gòu)示于圖1，而每個(gè)化合物的代號(hào)、化學(xué)名稱(chēng)和來(lái)源示于表1。細(xì)胞培養(yǎng)和處理在37℃和5％CO2下，將得自ATCC(Manassas，VA)的PC12細(xì)胞(大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤神經(jīng)元)在不含谷氨酰胺、補(bǔ)充10％胎牛血清和5％馬血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。Yao Z，Drieu K和Papadopoulos V.，The Gingko biloba extract EGb 761 rescues PC12neuronal cells from β-amyloid-induced cell death by inhibiting theformation of β-amyloid-derived diffusible neurotoxic ligands(通過(guò)抑制β-淀粉樣蛋白衍生的彌散性神經(jīng)毒性配體形成，銀杏葉提取物EGb761拯救PC12神經(jīng)元細(xì)胞抵抗β-淀粉樣蛋白誘發(fā)的細(xì)胞死亡)，BrainRes2001，889181-190。將細(xì)胞接種到96孔板(8×104細(xì)胞/孔)上。經(jīng)一夜培養(yǎng)后，在指定濃度的待測(cè)SP化合物存在或不存在下，將濃度遞增的聚集Aβ(0.1μM、1μM和10μM)加入到所述細(xì)胞中。經(jīng)過(guò)72小時(shí)培養(yǎng)后，檢測(cè)各種參數(shù)和細(xì)胞活力的標(biāo)記物。將小鼠MA-10腫瘤間質(zhì)細(xì)胞在補(bǔ)充熱滅活的5％胎牛血清和2.5％馬血清的DMEM/Ham’s F12(Biofluids，Rockville，MD)培養(yǎng)基中，在5％CO2下，于37℃進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞按2.5×104細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板上過(guò)夜。在0.2ml/孔的無(wú)血清培養(yǎng)基中，細(xì)胞用指定濃度的各種SP化合物刺激2小時(shí)。收集培養(yǎng)基，通過(guò)放射免疫測(cè)定法測(cè)定其對(duì)孕酮生成的影響。
MTT細(xì)胞毒性測(cè)定用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)測(cè)定法(Trevigen，Gaithersburg，MD)評(píng)價(jià)Aβ的細(xì)胞毒性。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將10μl的MTT溶液加入到在100μl培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞。經(jīng)過(guò)4小時(shí)培養(yǎng)后，加入100μl去垢劑，將細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)過(guò)夜。用Victor定量檢測(cè)分光光度計(jì)(EGG-Wallac，Gaithersburg，MD)，在600nm和690nm處定量檢測(cè)甲藍(lán)形成，結(jié)果以(DO600-DO690)表示。盡管MTT測(cè)定法廣泛用于評(píng)價(jià)用Aβ處理的神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞毒性，但已提示，在各種類(lèi)固醇存在下得到的結(jié)果可反映出Aβ依賴(lài)的小泡再循環(huán)，導(dǎo)致MTT甲胞吐增加和損失。Liu Y和Schubert D，Steroid hormonesblock amyloid fibril-induced 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)formazan exocytosisrelationship toneurotoxicity(類(lèi)固醇激素阻斷淀粉樣蛋白原纖維誘發(fā)的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)甲胞吐與神經(jīng)毒性的關(guān)系)，JNeurochem 1998，191639-1662。為此，使用其它的細(xì)胞毒性和細(xì)胞活力的測(cè)定法。
錐蟲(chóng)藍(lán)細(xì)胞活力測(cè)定用前述的錐蟲(chóng)藍(lán)排除法測(cè)定細(xì)胞活力。Yao Z，Drieu K和Papadopoulos V，The Gingko biloba extract EGb 761 rescues PC12neuronal cells from β-amyloid-induced cell death by inhibiting theformation of β-amyloid-derived diffusible neurotoxic ligands(通過(guò)抑制β-淀粉樣蛋白衍生的彌散性神經(jīng)毒性配體形成，銀杏葉提取物EGb761拯救PC12神經(jīng)元細(xì)胞抵抗β-淀粉樣蛋白誘發(fā)的細(xì)胞死亡)，BrainRes 2001，889181-190。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在濃度遞增的Aβ存在或不存在下，用SP化合物處理細(xì)胞72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，細(xì)胞用PBS洗滌三次，然后用0.1％錐蟲(chóng)藍(lán)染色液在室溫下培養(yǎng)15分鐘。用PBS洗滌三次后，將0.1N NaOH加入到細(xì)胞，然后在450nm處，用Victor定量檢測(cè)分光光度計(jì)定量檢測(cè)錐蟲(chóng)藍(lán)。
膜電位的測(cè)定還用發(fā)光試劑盒CytoLiteTM(Packard BioScience Co.)，按照生產(chǎn)商的建議，評(píng)價(jià)細(xì)胞活力。簡(jiǎn)單地說(shuō)，培養(yǎng)細(xì)胞，然后在96孔板中處理細(xì)胞，經(jīng)過(guò)72小時(shí)培養(yǎng)后，將25μl激活劑溶液加入細(xì)胞中，隨后加入150μl Amplifier溶液。計(jì)數(shù)前待機(jī)5分鐘，然后用TopCountNXTTM計(jì)數(shù)器(Packard BioSciences Co.)檢測(cè)發(fā)光。
細(xì)胞ATP水平測(cè)定用ATPLite-MTM發(fā)光測(cè)定法(Packard BioSciences Co.)測(cè)定細(xì)胞ATP濃度。對(duì)于這種測(cè)定法，在黑色96孔ViewPlateTM上培養(yǎng)細(xì)胞，按照生產(chǎn)商的建議，用TopCount NXTTM計(jì)數(shù)器(Packard BiosciencesCo.)測(cè)定ATP濃度。
放射免疫測(cè)定法用抗孕酮抗血清(ICN，Costa Mesa，CA)，按照生產(chǎn)商推薦的條件，通過(guò)放射免疫測(cè)定法測(cè)定MA-10細(xì)胞產(chǎn)生的孕酮。調(diào)整各孔中的蛋白量使孕酮的產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)化。運(yùn)用MultiCalc軟件(EG&G Wallac，Gaithersburg，MD)，分析放射免疫測(cè)定數(shù)據(jù)。
22R-羥基膽甾醇-蛋白結(jié)合印跡測(cè)定(CPBBA)將純化的Aβ(50μM)和3H-22R-羥基膽甾醇單獨(dú)、或者在100μM的未標(biāo)記22R-羥基膽甾醇(SP-222)、或在各種20μl體積的22R-羥基膽甾醇衍生物存在下，于37℃培養(yǎng)8小時(shí)或24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，在非變性條件下，在10XSSC緩沖液中用1.5％瓊脂糖(Type I-B)凝膠電泳分離樣品，然后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Schleicher & Schuell，Keene，NH)。將所述膜暴露于氚敏屏，并用Cyclone Storage phosphorsystem(Packard BioScience，Meridien，CT)通過(guò)磷光成像進(jìn)行分析，用OptiQuant軟件(Packard BioScience)進(jìn)行圖像光密度分析。所述方法適用于Aβ絡(luò)合物的分離、顯色和鑒定，其已在非變性條件下?lián)饺敕派湫詷?biāo)記的膽甾醇(Yao Z.和Papadopoulos V.，F(xiàn)unction of β-amyloidin cholesterol transporta lead to neurotoxicity(β-淀粉樣蛋白在膽甾醇轉(zhuǎn)運(yùn)中的功能神經(jīng)毒性的先導(dǎo))，F(xiàn)ASEB J2002，161677-1679)和22R-羥基膽甾醇(Yao Z.X.等，J Neurochem2002，831110-1119)或22R-羥基膽甾醇衍生物。在電泳期間，分離并排除低分子量未結(jié)合的22R-羥基膽甾醇及衍生物。
肽建模與對(duì)接模擬用在Aβ1-40Met(O)(MMDB同上7993PDB同上1BA)(由CD和NMR光譜測(cè)得的數(shù)據(jù))溶液結(jié)構(gòu)初始化的Aβ結(jié)構(gòu)，完成22R-羥基膽甾醇及其16種衍生物與Aβ1-42的計(jì)算機(jī)對(duì)接。Watson，A.A.，F(xiàn)airlie，D.P.和Craik，D.J.Solution structure of methionine-oxidized amyloidbeta-peptid(1-40)(甲硫氨酸氧化的淀粉樣β-肽溶液結(jié)構(gòu)(1-40))。Doesoxidation affect conformational switching？(氧化影響構(gòu)象轉(zhuǎn)換嗎？)，Biochem.(1998)，37，12700-12706。Met(O)SME 35殘基被保留相鄰骨架雙面夾角和附帶的I41和A42殘基的Met置換。然后用Alchemy 2000程序(Tripos，St.Louis，MO)使該結(jié)構(gòu)的能量最小化。22R-羥基膽甾醇衍生物結(jié)構(gòu)也用Alchemy 2000生成。用前述Monte Carlo模擬退火完成分子對(duì)接。Li，H.，Yao Z.，Degenhardt B.，Teper G.和PapadopoulosV.，Cholesterol binding at the cholesterol recognition/interaction aminoacid consensus(CRAC)of the peripheral-type benzodiazepine receptorand inhibition of steroidogenesis by an HIV TAT-CRAC peptide(在外周型苯并二氮雜受體的膽甾醇-氨基酸識(shí)別/相互作用的共同區(qū)域結(jié)合的膽甾醇，和HIV TAT-CRAC肽抑制類(lèi)固醇生成)，Proc Natl Acad SciUSA2001，981267-1272，按修訂版的Autogrid/Autodock實(shí)施。MorrisG.M.，Goodsell D.S.，Halliday R.S.，Huey R.，Hart W.E.，Belew R.K.和Olson A.J.，Distributed automated docking of flexible ligands toproteinsparallel applications of AutoDock 2.4(柔性配體與蛋白指定的自動(dòng)對(duì)接AutoDock 2.4的平行應(yīng)用)，J Comput Chem1998，191639-1662。對(duì)于每一對(duì)化合物/Aβ，約需評(píng)價(jià)108個(gè)構(gòu)象以選擇一種最小能量。執(zhí)行3輪組成的100次運(yùn)行，每輪在配體相對(duì)于靶標(biāo)的隨機(jī)初始位置和定位開(kāi)始。每次運(yùn)行由使用約2×104改進(jìn)步驟的100個(gè)退火循環(huán)組成。用1.7GHz、1GB RAM個(gè)人電腦，每對(duì)配體/靶標(biāo)的平均計(jì)算時(shí)間約為2小時(shí)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用INSTAT 3.00(GraphPad，San Diego，CA)，按照單向方差分析(ANOVA)和非配對(duì)學(xué)生氏t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
結(jié)果將PC12細(xì)胞在濃度遞增的Aβ中暴露3天，產(chǎn)生劑量依賴(lài)性細(xì)胞死亡(圖8)，達(dá)到最大細(xì)胞濃度的50％，與本文先前的數(shù)據(jù)相符。Yao Z.X.等，J Neurochem2002，831110-1119；和Yao Z.，Drieu K.和Papadopoulos V.，The Gingko biloba extract EGb 761 rescues PC12neuronal cells from β-amyloid-induced cell death by inhibiting theformation of β-amyloid-derived diffusible neurotoxic ligands(通過(guò)抑制β-淀粉樣蛋白衍生的彌散性神經(jīng)毒性配體形成，銀杏葉提取物EGb761拯救PC12神經(jīng)元細(xì)胞抵抗β-淀粉樣蛋白誘發(fā)的細(xì)胞死亡)，BrainRes 2001，889181-190。為與AD腦中Aβ濃度相近，使用0.1-10μM Aβ濃度。在濃度30μM和50μM(圖9-15)，測(cè)試試驗(yàn)化合物的神經(jīng)保護(hù)特性。
圖9-11顯示用MTT測(cè)定即測(cè)定NADPH黃遞酶活性，先導(dǎo)化合物22R-羥基膽甾醇(SP222)和含22R-羥基膽甾醇結(jié)構(gòu)的化合物(SP223-238)對(duì)Aβ誘發(fā)的神經(jīng)毒性的影響。圖9-11顯示這些化合物分別對(duì)0.1μM、1.0μM和10.0μM Aβ誘發(fā)的神經(jīng)毒性的作用，用NADPH黃遞酶活性的抑制百分率表示。100％抑制水平對(duì)應(yīng)于單獨(dú)給予Aβ所誘發(fā)的藍(lán)甲形成減少。
SP222保護(hù)PC12細(xì)胞抵抗0.1μM和1μM Aβ，但在10μM Aβ下，只提供有限的神經(jīng)保護(hù)。應(yīng)該注意到，根據(jù)所用細(xì)胞的傳代數(shù)，觀察到SP-222對(duì)高濃度的Aβ作用的差異很大。SP228、SP229、SP233、SP235、SP236、SP237和SP238顯示有抵抗0.1μM Aβ的神經(jīng)保護(hù)性活性，但只有SP233、SP235、SP236和SP238明顯比SP222有更強(qiáng)的顯著性作用(圖9A-9P)。SP233、SP236和SP238保持其抵抗1μM Aβ誘發(fā)的毒性的神經(jīng)保護(hù)特性(圖10A-10P)，但只有SP233和SP238在10μM Aβ存在下仍保持這種特性(圖11A-11P)。
用評(píng)價(jià)膜電位的Cytolite測(cè)定法測(cè)定SP222、SP233、SP235、SP236和SP238，結(jié)果證實(shí)了用MTT測(cè)定獲得的結(jié)果。圖12A顯示Aβ暴露誘發(fā)劑量相關(guān)的評(píng)價(jià)膜電位的發(fā)光減少。盡管SP222抵抗0.1μMAβ(圖12B)，但其未能抵抗兩個(gè)最高濃度的Aβ(圖12C和圖12D)。如測(cè)得的發(fā)光增強(qiáng)所示，使用的各種SP化合物證實(shí)明顯比SP222的神經(jīng)保護(hù)性作用強(qiáng)。通過(guò)在相同條件下(圖12D)提高信號(hào)，可重復(fù)在MTT測(cè)定(圖11)中觀察到的SP233和SP238對(duì)10μM Aβ的神經(jīng)保護(hù)性作用。
在SP222-SP238化合物(圖13A-13D)存在或不存在下，測(cè)定用濃度遞增的Aβ處理的PC12細(xì)胞ATP水平(一種線粒體功能的指數(shù))。Aβ以劑量依賴(lài)性方式減少PC12細(xì)胞產(chǎn)生ATP；在0.1μM、1.0μM和10μM Aβ存在下，測(cè)得ATP水平分別下降18％、22％和25％(p＜0.001，ANOVA法；圖13A)。在測(cè)試的化合物中，只有SP233和SP236能夠逆轉(zhuǎn)0.1μM和1.0μM Aβ誘發(fā)的ATP水平降低(圖13B和圖13C)。在10μM Aβ存在下，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)SP化合物對(duì)ATP合成的有益作用。
細(xì)胞攝取錐蟲(chóng)藍(lán)是第四個(gè)試驗(yàn)，用于評(píng)價(jià)有希望的SP233化合物對(duì)Aβ誘發(fā)的毒性的影響(圖14A)。正如所料，0.1μM、1μM和10μMAβ誘發(fā)的劑量依賴(lài)性(分別為33％、36％和97％；p＜0.001，ANOVA法)增加PC12細(xì)胞攝取錐蟲(chóng)藍(lán)。30μM和50μM SP233抑制Aβ誘發(fā)的細(xì)胞死亡(p＜0.001 ANOVA法)。圖14B顯示盡管在高、超病理生理Aβ濃度存在下其功效下降，SP233的神經(jīng)保護(hù)性作用為劑量依賴(lài)性，并且在所有這三個(gè)Aβ濃度存在下保持其原有特性。
鑒定22R-羥基膽甾醇衍生物的一個(gè)原因是需要生物活性(神經(jīng)保護(hù)性)化合物，所述化合物不能被P450scc代謝為孕烯醇酮，然后代謝為組織特異性的最終類(lèi)固醇產(chǎn)物。為評(píng)價(jià)類(lèi)固醇生成細(xì)胞對(duì)這些化合物的代謝，本發(fā)明人檢測(cè)了這些化合物在MA-10小鼠腫瘤間質(zhì)細(xì)胞形成類(lèi)固醇的能力，所述細(xì)胞為一種充分表征的類(lèi)固醇生成細(xì)胞模型，其中22R-羥基膽甾醇為良好的P450scc底物，并且能夠產(chǎn)生大量的類(lèi)固醇。Li H.，Yao Z.，Degenhardt B.，Teper G.和Papadopoulos V.，Cholesterol binding at the cholesterolrecognition/interaction acid consensus(CRAC)of the peripheral-typebenzodiazepine receptor and inhibition of steroidogenesis by an HIVTAT-CRAC peptide(在外周型苯并二氮雜受體的膽甾醇-氨基酸識(shí)別/相互作用的共同區(qū)域結(jié)合的膽甾醇，和HIV TAT-CRAC肽抑制類(lèi)固醇生成)，Proc Natl Acad Sci USA2001，981267-1272。圖15顯示與SP222相反，SP233不能被代謝為最終類(lèi)固醇產(chǎn)物。
鑒于先前對(duì)基于22R-羥基膽甾醇(SP222)神經(jīng)保護(hù)性作用機(jī)制的研究，其中用實(shí)施例1的CPBBA方法顯示了22R-羥基膽甾醇和Aβ的直接相互作用，進(jìn)行類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)以了解22R-羥基膽甾醇衍生物是否與Aβ結(jié)合。這些化合物與Aβ的直接相互作用在抗放射性標(biāo)記的22R-羥基膽甾醇/Aβ絡(luò)合物(圖16)的替代研究中出現(xiàn)。將放射性標(biāo)記的22R-羥基膽甾醇與Aβ在37℃一起培養(yǎng)24小時(shí)，證明存在高分子量的放射性標(biāo)記條帶(圖16)，其可被Aβ的特異性抗體所識(shí)別(Yao等，2002，數(shù)據(jù)未顯示)。通過(guò)用未標(biāo)記的22R-羥基膽甾醇(圖16)進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)性研究證實(shí)，22R-羥基膽甾醇對(duì)放射性標(biāo)記的Aβ的特異性，其中100μM SP222置換了80％放射性標(biāo)記的與Aβ結(jié)合的SP222化合物。在測(cè)試的SP化合物中，SP237、SP238、SP226、SP227和SP233分別置換了與Aβ結(jié)合的46％、44％、65％、38％和35％的放射性標(biāo)記的22R-羥基膽甾醇(圖16)。
用與Aβ計(jì)算對(duì)接模擬進(jìn)一步證實(shí)了這些數(shù)據(jù)。對(duì)接結(jié)果表明，Aβ1-42在19-36氨基酸區(qū)域形成一個(gè)與22R-羥基膽甾醇結(jié)合的口袋(圖17)，與本文先前的數(shù)據(jù)一致。Yao Z.X.等J Neurochem2002，831110-1119。各種被測(cè)化合物的對(duì)接能按與Aβ結(jié)合所需的最小能量的次序排列(-10.34kcal/mol)SP229＜SP232＜SP224＜SP237＜SP222＜SP233＜SP228＜SP223＜SP230＜SP234＜SP225＜SP238＜SP236＜SP226＜SP235＜SP231＜SP227(-8.35kcal/mol)。圖18A和18B比較了SP222、SP233的結(jié)合特性。這是每個(gè)化合物運(yùn)行100次的對(duì)接分析。數(shù)據(jù)顯示在約23％的時(shí)間內(nèi)，SP233對(duì)接能為-7.0至-7.5Kcal/mol；而SP222在約25％時(shí)間內(nèi)，對(duì)接能只為5.5-6.0kcal/mol。SP233具有更高對(duì)接能的概率(負(fù)數(shù)更大)明顯比SP222大。在幾乎100％的時(shí)間內(nèi)，SP233的結(jié)合能小于-6.0kcal/mol，而在相同時(shí)間內(nèi)SP222的結(jié)合能只約為-4.0kcal/mol。對(duì)結(jié)合能頻率分布的分析表明，雙峰分布提示在Aβ中存在兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)于SP233，峰可能出現(xiàn)在-7至-7.5以及-8至-8.5kcal/mol；而對(duì)于SP222，峰位于-5.5至-6.0以及-4.0至-4.5kcal/mol。
討論本專(zhuān)利申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)與相同年齡對(duì)照組標(biāo)本相比，AD腦海馬和額皮層中的22R-羥基膽甾醇在下降，促使對(duì)該類(lèi)固醇在腦中的功能進(jìn)行研究，導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)22R-羥基膽甾醇保護(hù)大鼠PC12和人分化NT2N細(xì)胞抵抗Aβ毒性。
本申請(qǐng)人最初使用的是MTT測(cè)定法(一種廣泛使用的細(xì)胞活力和細(xì)胞毒性的標(biāo)記物)。即使當(dāng)PC12細(xì)胞暴露在高達(dá)10μM的Aβ濃度下，使用這種測(cè)定法，一些稱(chēng)為SP233、SP235、SP236和SP238的被測(cè)化合物還顯示出神經(jīng)保護(hù)性活性。有趣的是，這些化合物比22R-羥基膽甾醇(SP222)參比分子更有效。
Aβ作用機(jī)制的一個(gè)最新事件是，直接或間接的破壞線粒體呼吸鏈，導(dǎo)致ATP生成減少，僅此即可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。SP222、SP235和SP238化合物能夠拯救PC12細(xì)胞抵抗Aβ誘發(fā)的毒性，但不能阻斷Aβ誘發(fā)的ATP合成的改變。盡管這種明顯的矛盾有待于解釋?zhuān)玀TT測(cè)定法(線粒體黃遞酶活性)和ATP合成不反映呼吸鏈相同部分的狀況是可能的。相反，SP233和SP236部分阻斷Aβ誘發(fā)的ATP生成減少。SP233保存ATP儲(chǔ)存的能力只能解釋該化合物有效的神經(jīng)保護(hù)性作用，其被錐蟲(chóng)藍(lán)攝取細(xì)胞活力測(cè)定法進(jìn)一步證實(shí)。應(yīng)該注意到，發(fā)現(xiàn)SP233不僅在所有的測(cè)定中是最靈驗(yàn)的，而且是效力最強(qiáng)的，在體外提供神經(jīng)保護(hù)，以抵抗低至10μM濃度Aβ。
用0.1μM、1.0μM和10μM Aβ1-42進(jìn)行本文報(bào)道的研究。這些濃度都是超病理生理的，因?yàn)樵贏D患者腦脊髓液中存在這些Aβ1-42濃度，對(duì)照組范圍為500 1000ng/l(0.1-0.2nM)。即使Aβ1-42可能在AD腦中的濃度高10倍，估計(jì)Aβ1-42的病理生理濃度在1-2nM，其比本申請(qǐng)人實(shí)驗(yàn)的濃度低100-10,000倍。將這些因素都考慮在內(nèi)，很明顯SP233提供75％的抵抗0.1μM Aβ的保護(hù)作用是有重大藥理學(xué)意義的。
用公認(rèn)的MA-10小鼠間質(zhì)細(xì)胞模型，本申請(qǐng)人證實(shí)與22R-羥基膽甾醇不同，其生物活性衍生物SP233不能誘發(fā)類(lèi)固醇形成。
SP化合物的神經(jīng)保護(hù)特性似乎遵從結(jié)構(gòu)/活性關(guān)系(SAR)。SP231和SP235是薯蕷皂甙元的立體異構(gòu)體(圖1)，但只有SP235是抗Aβ誘發(fā)的神經(jīng)毒性的保護(hù)劑。SP235的立體化學(xué)為C3R、C10R、C13S、C20S、C22S、C25S，SP233和SP236也具有這種基序(圖1和圖19)。顯示高神經(jīng)保護(hù)性活性并且在高濃度Aβ的存在下具有活性的SP化合物C3位成酯，優(yōu)選與脂肪酸或脂肪酸類(lèi)結(jié)構(gòu)成酯。事實(shí)上，在C3位上具有未取代羥基的SP235提供有限的神經(jīng)保護(hù)性作用，只抵抗0.1μM Aβ。相反，SP236是SP235的C3位的琥珀酸酯，其具有抗更高Aβ濃度的活性，而SP233是效力最強(qiáng)的化合物，其為SP235的C3位的己酸酯。發(fā)現(xiàn)盡管SP238對(duì)維持ATP水平?jīng)]有影響，但其能保護(hù)PC12細(xì)胞抵抗Aβ誘發(fā)的毒性，進(jìn)一步支持這個(gè)假設(shè)，因?yàn)槠湓贑3位沒(méi)有任何側(cè)鏈的衍生物(SP226)不提供神經(jīng)保護(hù)性作用。苯甲酸取代的SP232對(duì)于神經(jīng)保護(hù)無(wú)效的發(fā)現(xiàn)，提示在該水平上存在的脂族鏈比芳族結(jié)構(gòu)更有意義。盡管這些數(shù)據(jù)是SAR的說(shuō)明，并突出了在C3存在脂肪酸鏈的重要性，但需要進(jìn)行進(jìn)一步的建模和SAR研究以?xún)?yōu)化神經(jīng)保護(hù)性的SP233結(jié)構(gòu)。
Yao等最近證實(shí)，22R-羥基膽甾醇的神經(jīng)保護(hù)性作用在于與Aβ1-42結(jié)合和使Aβ1-42失活的能力?；谶@個(gè)觀察，本申請(qǐng)人檢測(cè)了SP222衍生物通過(guò)相同作用方式提供神經(jīng)保護(hù)的能力。本申請(qǐng)人的發(fā)現(xiàn)表明，顯示抗Aβ誘發(fā)的細(xì)胞死亡的神經(jīng)保護(hù)特性的SP化合物置換了與淀粉樣肽結(jié)合的放射性標(biāo)記的22R-羥基膽甾醇。
用計(jì)算對(duì)接模擬進(jìn)一步表征SP-Aβ的相互作用。研究表明在Aβ上可能存在與生物活性SP化合物結(jié)合的兩個(gè)位點(diǎn)。一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)似乎對(duì)22R-羥基膽甾醇(SP222)更專(zhuān)一，而第二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)顯示對(duì)化合物如SP233和SP236有更強(qiáng)的親和性。盡管SP226顯示也與第二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，但該化合物計(jì)算的結(jié)合能比神經(jīng)保護(hù)性SP分子顯示的能量低得多。其后的計(jì)算對(duì)接模擬研究表明SP222和SP233的結(jié)合能遵循雙峰分布，該發(fā)現(xiàn)強(qiáng)有力地支持在Aβ上存在兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步的結(jié)合能計(jì)算表明SP222對(duì)第二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的親和性小于SP233，提示酯鏈的存在可能是造成SP233與Aβ上這兩個(gè)位點(diǎn)結(jié)合的原因?；谶@些觀察，本申請(qǐng)人假設(shè)使淀粉樣肽持續(xù)失活可能需要占據(jù)Aβ的第二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。本申請(qǐng)人現(xiàn)正對(duì)該假設(shè)進(jìn)行體外和計(jì)算機(jī)試驗(yàn)。
與Aβ直接失活無(wú)關(guān)的其它機(jī)制也與SP233的神經(jīng)保護(hù)活性有關(guān)。盡管對(duì)螺甾烯醇與核受體的結(jié)合知之甚少，但不排除對(duì)類(lèi)固醇受體家族可能的調(diào)節(jié)。已證實(shí)，Aβ抑制含GLUT3小泡的融合，導(dǎo)致破壞線粒體穩(wěn)態(tài)并導(dǎo)致因此神經(jīng)元死亡。另一方面，從黃精(Polygonatirhizome)提取的螺甾烯醇衍生物提高了正常小鼠和鏈脲佐菌素誘發(fā)的糖尿病小鼠的葡萄糖攝取。合起來(lái)看，這些結(jié)果提示，細(xì)胞內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的恢復(fù)可能是螺甾烯醇SP233在本文所述模型中激活保護(hù)機(jī)制。還已證實(shí)，天然和合成的薯蕷皂甙元衍生物減少細(xì)胞攝取膽甾醇，并通過(guò)抑制關(guān)鍵酶3-羥基-3-甲基戊二酰基輔酶A還原酶減少膽甾醇的合成。增加細(xì)胞膽甾醇濃度誘發(fā)激活β-和γ-分泌酶，導(dǎo)致產(chǎn)生Aβ也是眾所周知的。此外，還證實(shí)薯蕷皂甙元衍生物通過(guò)抑制膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白修飾細(xì)胞內(nèi)膽甾醇庫(kù)，膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白據(jù)報(bào)道為一種正調(diào)節(jié)Aβ生成的酶。盡管這些保護(hù)性機(jī)制不可能在本申請(qǐng)人的模型中發(fā)生，因?yàn)樗鼈冊(cè)谂囵B(yǎng)基中加入Aβ，但它們?cè)隗w外可對(duì)SP233產(chǎn)生部分應(yīng)答。
盡管在過(guò)去幾年中作出了極大努力，以期發(fā)現(xiàn)新的治療模式用于治愈和/或減緩AD的進(jìn)程，但自從引入乙酰膽堿酯酶抑制劑以來(lái)尚未取得較大的臨床進(jìn)展，所述抑制劑能夠減緩10-15％患者的疾病進(jìn)程，但維持的時(shí)間有限。盡管許多化合物實(shí)際上已進(jìn)入試圖治療AD的臨床試驗(yàn)，對(duì)其中的大多數(shù)而言，AD病理學(xué)是僅次于其主要作用的目標(biāo)。這類(lèi)藥物包括抗氧化劑、COX-1和COX-2抑制劑、抑制素和腦血管擴(kuò)張藥。本申請(qǐng)人的結(jié)果表明，天然存在的螺甾烯醇化合物能保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞抵抗Aβ。
已描述了本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案。然而，不用說(shuō)，在不偏離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前體下，可以進(jìn)行各種修改。因此，其它實(shí)施方案在所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)；并且在不偏離本發(fā)明范圍的前體下，可以對(duì)上述組合物、制劑、聯(lián)合療法和方法進(jìn)行變化，這意味著包括在上面說(shuō)明書(shū)中所包括的所有內(nèi)容都可認(rèn)為是說(shuō)明性的而不是限制性的。本文列舉的所有專(zhuān)利文獻(xiàn)和參考文獻(xiàn)全都通過(guò)引用結(jié)合到本文中。
權(quán)利要求
1.一種治療有需要的患者的神經(jīng)變性性疾病的方法，所述方法包括給予所述患者下式(I)化合物 其中每個(gè)R1、R2、R4、R5、R6、R7、R11、R12、R15和R16獨(dú)立為氫、烷基、羥基、氨基、羧基、氧代、磺酸或任選被以下基團(tuán)取代的烷基-NH-、-N(烷基)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2-、-SO2-O-、-SO3-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NR′-或-NR′-CO-；R3為在表1和圖1中列出的化合物的R3情況下所公開(kāi)的取代基；每個(gè)R8、R9、R10、R13和R14獨(dú)立為氫、烷基、羥烷基、烷氧基或羥基；R17為在表1和圖1中列出的化合物的R17情況下所公開(kāi)的取代基。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物選自表1中列出的化合物。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物是在包含治療有效量的所述化合物的劑型之中。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述劑型選自片劑、軟明膠膠囊劑、硬明膠膠囊劑、混懸型片劑、泡騰片劑、散劑、泡騰散劑、咀嚼片劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、乳膏劑、凝膠劑、貼劑和栓劑。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述劑型還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述藥學(xué)上可接受的賦形劑包括粘合劑、崩解劑、填充劑、表面活性劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、稀釋劑、抗粘著劑、助流劑或藥學(xué)上可配伍的載體。
7.權(quán)利要求1的方法，所述方法還包括給予至少一種乙酰膽堿酯酶抑制劑。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述神經(jīng)變性性疾病選自全腦和局部缺血性中風(fēng)和出血性中風(fēng)、頭部創(chuàng)傷、脊髓損傷、低氧誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞損傷、心博停止或新生兒窘迫誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞損傷、癲癇、焦慮、糖尿病、多發(fā)性硬化、幻肢痛、灼痛、神經(jīng)痛、帶狀皰疹、脊髓損害、痛覺(jué)過(guò)敏、異常性疼痛、早老性癡呆、亨廷頓舞蹈病和帕金森病。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述神經(jīng)變性性疾病是早老性癡呆。
10.一種藥用組合物，所述組合物包含治療有效量的下式(I)化合物和藥學(xué)上可接受的賦形劑， 其中每個(gè)R1、R2、R4、R5、R6、R7、R11、R12、R15和R16獨(dú)立為氫、烷基、羥基、氨基、羧基、氧代、磺酸或任選被以下基團(tuán)取代的烷基-NH-、-N(烷基)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2-、-SO2-O-、-SO3-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NR′-或-NR′-CO-；R3為在表1和圖1中列出的化合物的R3情況下所公開(kāi)的取代基；每個(gè)R8、R9、R10、R13和R14獨(dú)立為氫、烷基、羥烷基、烷氧基或羥基；R17為在表1和圖1中列出的化合物的R17情況下所公開(kāi)的取代基。
11.權(quán)利要求10的藥用組合物，其中所述化合物選自表1中列出的化合物。
12.權(quán)利要求10的藥用組合物，其中所述藥用組合物是在選自以下的劑型之中片劑、軟明膠膠囊劑、硬明膠膠囊劑、混懸型片劑、泡騰片劑、散劑、泡騰散劑、咀嚼片劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、乳膏劑、凝膠劑、貼劑和栓劑。
13.權(quán)利要求10的藥用組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的賦形劑包括粘合劑、崩解劑、填充劑、表面活性劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)滑劑、濕潤(rùn)劑、稀釋劑、抗粘著劑、助流劑或藥學(xué)上可配伍的載體。
14.權(quán)利要求10的藥用組合物，所述組合物還包含至少一種乙酰膽堿酯酶抑制劑。
15.一種鑒定與β-淀粉樣蛋白具有結(jié)合親和性的化合物的方法，所述方法包括根據(jù)與22R-羥基膽甾醇的結(jié)構(gòu)同源性，篩選已知化合物的數(shù)據(jù)庫(kù)；將所述數(shù)據(jù)庫(kù)中的化合物根據(jù)與22R-羥基膽甾醇的同源程度進(jìn)行排列；從所述數(shù)據(jù)庫(kù)中提取與22R-羥基膽甾醇有最高結(jié)構(gòu)同源性的化合物；將所提取的化合物按與β-淀粉樣蛋白的體外結(jié)合進(jìn)行排列；和選擇出具有最高體外親和性的化合物。
16.一種設(shè)計(jì)與β-淀粉樣蛋白具有結(jié)合親和性的化合物的方法，所述方法包括將22R-羥基膽甾醇繪制成兩個(gè)或更多個(gè)獨(dú)立結(jié)構(gòu)單元；通過(guò)修飾22R-羥基膽甾醇的一個(gè)或多個(gè)單元，設(shè)計(jì)新化合物；將所設(shè)計(jì)的化合物按與β-淀粉樣蛋白的體外結(jié)合進(jìn)行排列；和選擇出具有最高體外結(jié)合親和性的化合物。
17.一種設(shè)計(jì)與β-淀粉樣蛋白具有結(jié)合親和性的化合物的方法，所述方法包括繪制β-淀粉樣蛋白；在計(jì)算機(jī)屏幕上構(gòu)建與β-淀粉樣蛋白結(jié)構(gòu)或其片段互補(bǔ)的化合物；將所構(gòu)建的化合物按與β-淀粉樣蛋白的體外結(jié)合進(jìn)行排列；和選擇出具有最高體外結(jié)合親和性的化合物。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述片段由β-淀粉樣蛋白的氨基酸17-40組成。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述片段由β-淀粉樣蛋白的氨基酸15-40組成。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述片段由β-淀粉樣蛋白的氨基酸17-38組成。
21.權(quán)利要求17的方法，其中所述片段由β-淀粉樣蛋白的氨基酸16-39組成。
22.一種檢測(cè)并定量生物體液中Aβ的方法，所述方法包括獲取樣品液；將所述樣品液與標(biāo)記的下式(I)化合物一起培養(yǎng) 其中每個(gè)R1、R2、R4、R5、R6、R7、R11、R12、R15和R16獨(dú)立為氫、烷基、羥基、氨基、羧基、氧代、磺酸或任選被以下基團(tuán)取代的烷基-NH-、-N(烷基)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2-、-SO2-O-、-SO3-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NR′-或-NR′-CO-；R3為在表1和圖1中列出的化合物的R3情況下所公開(kāi)的取代基；每個(gè)R8、R9、R10、R13和R14獨(dú)立為氫、烷基、羥烷基、烷氧基或羥基；R17為在表1和圖1中列出的化合物的R17情況下所公開(kāi)的取代基；從所述培養(yǎng)液中分離出樣品并將所述樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；將所述膜暴露于氚敏屏；和分析所述膜的內(nèi)容物。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述樣品液與標(biāo)記的式(I)化合物一起培養(yǎng)是在濃度遞增的未標(biāo)記式(I)化合物存在下進(jìn)行。
24.權(quán)利要求22的方法，其中分析所述膜內(nèi)容物的步驟包括用至少一種磷光成像檢測(cè)Aβ的存在并定量測(cè)定生物體液中存在的Aβ含量，從而分析所述膜的內(nèi)容物。
25.一種診斷患者的早老性癡呆的方法，所述方法包括從患者腦中獲取樣品液；將所述樣品液與下式(I)標(biāo)記化合物一起培養(yǎng) 其中每個(gè)R1、R2、R4、R5、R6、R7、R11、R12、R15和R16獨(dú)立為氫、烷基、羥基、氨基、羧基、氧代、磺酸或任選被以下基團(tuán)取代的烷基-NH-、-N(烷基)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2-、-SO2-O-、-SO3-O-、-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-NR′-或-NR′-CO-；R3為在表1和圖1中列出的化合物的R3情況下所公開(kāi)的取代基；每個(gè)R8、R9、R10、R13和R14獨(dú)立為氫、烷基、羥烷基、烷氧基或羥基；R17為在表1和圖1中列出的化合物的R17情況下所公開(kāi)的取代基；從所述培養(yǎng)液中分離出樣品并將所述樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；將所述膜暴露于氚敏屏；和分析所述膜的內(nèi)容物。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述樣品液與標(biāo)記的式(I)化合物一起培養(yǎng)是在濃度遞增的未標(biāo)記式(I)化合物存在下進(jìn)行。
27.權(quán)利要求25的方法，其中分析膜內(nèi)容物的步驟包括用至少一種磷光成像檢測(cè)Aβ的存在并定量測(cè)定生物體液中存在的Aβ含量，從而分析所述膜的內(nèi)容物。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療、預(yù)防或緩解患者發(fā)生與神經(jīng)毒性相關(guān)的、特別是與β－淀粉樣蛋白誘發(fā)的神經(jīng)毒性和早老性癡呆相關(guān)的障礙或疾病危險(xiǎn)、或與之相關(guān)的癥狀的方法、藥盒、聯(lián)合療法和組合物。本發(fā)明化合物為含螺甾－5－烯－3－醇通用結(jié)構(gòu)的生物活性22R－羥基膽甾醇衍生物。本發(fā)明還提供通過(guò)給予患者治療有效量的22R－羥基膽甾醇或其治療活性類(lèi)似物，治療患有諸如以下神經(jīng)疾病或障礙的患者的方法全腦和局部缺血性中風(fēng)和出血性中風(fēng)、頭部創(chuàng)傷、脊髓損傷、低氧誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞損傷、心搏停止或新生兒窘迫誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞損傷、癲癇、焦慮、糖尿病、多發(fā)性硬化、幻肢痛、灼痛、神經(jīng)痛、帶狀皰疹、脊髓損害、痛覺(jué)過(guò)敏、異常性疼痛、亨廷頓舞蹈病和帕金森病。
文檔編號(hào)A61K31/56GK1652794SQ03810488
公開(kāi)日2005年8月10日 申請(qǐng)日期2003年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月15日
發(fā)明者Z·-X·姚, L·萊卡努, G·L·特佩爾, J·格里森, V·帕帕多普洛斯 申請(qǐng)人:薩馬里坦藥品公司, 喬治敦大學(xué)