專利名稱：用于病毒培養(yǎng)的棉鼠肺細胞的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及新的細胞系及其用途，包括用于生成生物體或病原體的方法，諸如病毒，諸如引起稱為豬生殖和呼吸綜合癥(PRRS)的豬疾病的病毒。
更一般的說，本發(fā)明涉及生物體或病原體(諸如病毒，如有毒力的或減毒的病毒)的繁殖，即使用棉鼠肺細胞或依照本發(fā)明的細胞或細胞系(如保藏細胞或細胞系或具有其鑒定特征的細胞或細胞系)來生產(chǎn)生物體或病原體諸如病毒，如有毒力的或減毒的病毒，諸如通常不以嚙齒類或大鼠或棉鼠或棉鼠肺細胞為天然宿主的生物體或病原體如病毒，或RNA病毒，例如正鏈單鏈RNA病毒，像Nidovirales目的病毒，例如arteviruses，或動脈炎病毒科(Arteriviridae)的病毒，如乳酸脫氫酶病毒(LDV)、馬動脈炎病毒(EAV)、猿出血熱病毒(SHFV)、和PRRS病毒(它的載體通常是節(jié)肢動物)；冠狀病毒科的病毒，如冠狀病毒，諸如傳染性支氣管炎病毒、犬冠狀病毒、貓冠狀病毒、人冠狀病毒229E、豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬呼吸道病毒、牛冠狀病毒、人冠狀病毒OC43、小鼠肝炎病毒、豬血凝腦脊髓炎病毒、大鼠冠狀病毒、涎淚腺炎病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、火雞冠狀病毒、兔冠狀病毒(也是載體通常為節(jié)肢動物的病毒)，以及Toroviruses，諸如馬torovirus、豬torovirus、人torovirus、牛torovirus。
使用棉鼠肺細胞或依照本發(fā)明的細胞或細胞系有利繁殖的病毒包括犬副流感病毒(CPI)，如2型CPI(CPI-2)，腺病毒，諸如犬腺病毒(CAV)，如2型犬腺病毒(CAV-2)，豬腺病毒(PAV)，如3型和5型豬腺病毒(PAV-3、PAV-5)，牛皰疹病毒，如1型牛皰疹病毒(傳染性牛鼻氣管炎(IBR)的原因)，馬皰疹病毒(EHV)，如1型(EHV-1)或4型(EHV-4)，牛輪狀病毒(BRV)，3型牛副流感病毒(PI-3)，腸道和呼吸道牛冠狀病毒(BCV)、豬生殖和呼吸綜合癥病毒(porcinereproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)。
更有利的是，病毒是PRRS病毒。
而且在相當有利的實施方案中，棉鼠肺細胞或細胞系指保藏于ATCC的PTA-3930、或者具有ATCC PTA-3930的所有鑒定特征的棉鼠肺細胞或細胞系、或者通過培養(yǎng)棉鼠肺細胞并建立細胞系而生成的棉鼠肺細胞或細胞系，其中培養(yǎng)棉鼠肺細胞長達至少10代，如長達至少21代或76代或100代，諸如10代或更多、或者21代或更多、或者76代或更多，如至少10代或21代或76代，而且有利的是長達且包括100代，其中建立細胞系使得棉鼠肺細胞基本上是上皮細胞，并在傳代中維持形態(tài)學特征。
本發(fā)明因此涉及這些細胞或細胞系及其用途。
使用棉鼠肺細胞或依照本發(fā)明的細胞或細胞系繁殖的病毒可用于制備針對由病毒諸如PRRSV引起的疾病的免疫原性組合物和疫苗。同樣，使用棉鼠肺細胞或依照本發(fā)明的細胞或細胞系繁殖的生物體或其它病原體可用于制備針對這些其它病原體或生物體的免疫原性和疫苗組合物。
本發(fā)明還涉及通過在依照本發(fā)明的細胞上傳代而生長的病毒的用途，例如提供減毒的、滅活的和亞單位免疫原性組合物和疫苗；由此，本發(fā)明涉及這些減毒的、滅活的或亞單位免疫原性組合物和疫苗。
背景技術：
1987年在美國北卡羅萊納州首次描述了豬生殖和呼吸綜合癥(PRRS)。這種豬疾病當時稱為“神秘的豬疾病”或MSD，稍后稱為“豬不育和呼吸道綜合癥”或SIRS。它下次出現(xiàn)于1990年的歐洲中部。在歐洲，該疾病最初稱為“豬流行性流產(chǎn)和呼吸道綜合癥”或PEARS，最后稱為“豬生殖和呼吸綜合癥”或PRRS，這成為全世界接受的命名。
PRRS病毒是有包膜的單鏈RNA病毒，首次在荷蘭分離，并命名為Lelystad病毒。它被分類歸入Arterivirdae科的成員。動脈炎病毒科的病毒屬于Nidovirales目。Nidovirales目的其它病毒有冠狀病毒科的病毒，諸如冠狀病毒和toroviruses。
PRRS已經(jīng)描述于WO92/21375。一份分離物保藏于法國巴黎的巴斯德研究院的國立微生物保藏中心(Collection Nationale de Culture deMicro-organismes，CNCM)，保藏編號I-1102。還分離了病毒的北美型(WO93/03760)，并保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American TypeCulture Collection，ATCC)，保藏編號VR-2332。
在母豬中，疾病PRRS的特征是生殖紊亂和呼吸癥狀。PRRS病毒的靶細胞是巨噬細胞。
阻礙獲得針對PRRS病毒的免疫學產(chǎn)品的問題之一是用于病毒復制的穩(wěn)定基質的可獲得性有限。
PRRS病毒只能在豬肺泡巨噬細胞(PAM)培養(yǎng)物中擴增(Wensvoort G.等人，The Vet.Quart.，13121-130，1991)。獲得這些巨噬細胞對使用某種年齡的無病豬的需要意味著幾項缺點。此外，不能保證回收的PAM對病毒感染的易感性，因為衍生自不同動物的細胞基質總是易變的。這造成了生成恒定且均一品質的大量抗原時的主要缺點，而且每一批都需要評估以測定其易感性。
研究了其它細胞基質。由此，在美國專利號5,476,778中，對由多種物種(如牛、犬、貓、人、豬、猿)和多種組織(如腎、肺、睪丸)獲得的15種細胞系測試了PRRS病毒培養(yǎng)。15種細胞系中只有一種容許PRRS病毒的生長。
將猴腎細胞系(例如VERO、MA-104、MARC-145，分別參閱美國專利號5,476,778和WO98/00165)用于PRRS病毒的培養(yǎng)和減毒。但是PRRS病毒在這些細胞上的滴度較低，因而生產(chǎn)成本較高。
盡管滅活的和減毒的PRRS疫苗現(xiàn)在已經(jīng)商品化，然而用于生產(chǎn)PRRS病毒的候選細胞基質將是極有價值的，如用于生產(chǎn)疫苗或免疫原性組合物。而且，更一般的說，用于生產(chǎn)病原體(諸如病毒，例如RNA病毒，例如正鏈單鏈RNA病毒，像Nidovirales目的病毒，諸如arteviruses或動脈炎病毒科的病毒和冠狀病毒科的病毒)的候選細胞基質將是極有價值的，如用于生產(chǎn)疫苗或免疫原性組合物。
此外，提供新的棉鼠肺細胞系將是有利的。
發(fā)明概述本發(fā)明基于下面的發(fā)現(xiàn)，即盡管嚙齒類不是PRRS病毒的天然宿主，然而來自棉鼠的肺細胞容許PRRS病毒生長或繁殖。還生成并保藏了由棉鼠肺組織衍生的新細胞系。
本發(fā)明還基于下面的發(fā)現(xiàn)，即來自棉鼠的肺細胞也容許其它病毒生長或繁殖，這些病毒不是嚙齒類的天然病原體。這些病毒包括2型犬副流感病毒(CPI-2)、2型犬腺病毒(CAV-2)、1型馬皰疹病毒(EHV-1)、4型馬皰疹病毒(EHV-4)、牛輪狀病毒(BRV)和牛冠狀病毒(BCV)。
更一般的說，本發(fā)明涉及棉鼠肺細胞或者依照本發(fā)明的細胞或細胞系用于繁殖生物體或病原體像病毒的用途，所述病毒如有毒力的或減毒的病毒，諸如通常不以嚙齒類或大鼠或棉鼠或棉鼠肺細胞作為天然宿主的病毒，或者是Nidovirales目的病毒，例如arteviruses，或動脈炎病毒科的病毒，如乳酸脫氫酶病毒(LDV)、馬動脈炎病毒(EAV)、猿出血熱病毒(SHFV)、和PRRS病毒(它的載體通常是節(jié)肢動物)；冠狀病毒科的病毒，如冠狀病毒，諸如傳染性支氣管炎病毒、犬冠狀病毒、貓冠狀病毒、人冠狀病毒229E、豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬呼吸道病毒、牛冠狀病毒、人冠狀病毒OC43、鼠肝炎病毒、豬血凝性腦脊髓炎病毒、大鼠冠狀病毒、涎淚腺炎病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、火雞冠狀病毒、兔冠狀病毒(也是載體通常為節(jié)肢動物的病毒)，以及Toroviruses，諸如馬torovirus、豬torovirus、人torovirus、牛torovirus。
使用棉鼠肺細胞或依照本發(fā)明的細胞或細胞系有利繁殖的病毒包括犬副流感病毒(CPI)，如2型CPI(CPI-2)，腺病毒，諸如犬腺病毒(CAV)，如2型犬腺病毒(CAV-2)，豬腺病毒(PAV)，如3型豬腺病毒(PAV-3)，牛皰疹病毒，如1型牛皰疹病毒(傳染性牛鼻氣管炎(IBR)的原因)，馬皰疹病毒(EHV)，如1型(EHV-1)或4型(EHV-4)，牛輪狀病毒(BRV)，3型牛副流感病毒(PI-3或bPI-3)，牛冠狀病毒(BCV)，和豬生殖和呼吸綜合癥病毒(PRRSV)。最有利的是，病毒是PRRS病毒。因此，本發(fā)明涉及這些病毒的繁殖或培養(yǎng)或生長。
有些病毒可以在來自棉鼠的肺細胞上生長，諸如1型牛皰疹病毒(BHV-1)(參閱Papp Z.等人，J.Gen.Virol.，1997，78，2933-2943，如第2935頁)、3型牛副流感病毒(bPI-3)(參閱Breker-Klassen M.M.等人，J.Virol.，1995，69(7)，4308-4315)、和3型豬腺病毒(PAV-3)(參閱PCT專利申請WO-A3-99/53047)。這些文件未描述或提議這些細胞及由其生成的病毒用于制備滅活的、減毒的或亞單位免疫原性組合物或疫苗的用途及其對動物的施用以及免疫或接種的方法。
本發(fā)明還涉及以PTA-3930保藏于ATCC的棉鼠肺細胞或細胞系、或者具有ATCC PTA-3930的所有鑒定特征的棉鼠肺細胞或細胞系、或者通過培養(yǎng)棉鼠肺細胞并建立細胞系而生成的棉鼠肺細胞或細胞系，其中培養(yǎng)棉鼠肺細胞長達至少10代或21代或76代，諸如10代或更多、或者21代或更多、或者76代或更多，如至少10代或21代或76代，而且有利的是長達且包括100代，并且其中建立細胞系使得棉鼠肺細胞基本上是上皮細胞，并在傳代中維持形態(tài)學特征。
本發(fā)明有利的涉及棉鼠肺細胞(CRL細胞)(如由這些細胞生成的細胞系)用于繁殖有毒力的或減毒的PRRS病毒的用途。
本發(fā)明還有利的涉及CRL細胞(如由這些細胞生成的細胞或細胞系，諸如本發(fā)明的細胞或細胞系，如保藏細胞系或具有其特征的細胞)用于繁殖生物體或病原體諸如病毒的用途，所述病毒例如有毒力的或減毒的病毒，諸如CPI-2、CAV-2、EHV-1、EHV-4、BRV、BCV。
由此，本發(fā)明包括用于培養(yǎng)或繁殖病毒的方法，所述病毒諸如PRRSV、CPI-2、CAV-2、PAV-5、EHV-1、EHV-4、BRV、BCV、LDV、EAV、SHFV、傳染性支氣管炎病毒、犬冠狀病毒、貓冠狀病毒、人冠狀病毒229E、豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬呼吸道病毒、牛冠狀病毒、人冠狀病毒OC43、小鼠肝炎病毒、豬血凝性腦脊髓炎病毒、大鼠冠狀病毒、涎淚腺炎病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、火雞冠狀病毒、兔冠狀病毒、馬torovirus、豬torovirus、人torovirus、牛torovirus，所述方法包括在適于培養(yǎng)或繁殖的條件下使棉鼠肺細胞接觸病毒。該方法還可包括收獲由此生成的病毒。對于制備免疫原性或免疫學或疫苗組合物，可以任選將病毒滅活和/或由其分離蛋白質或抗原或表位(對于滅活的或亞單位組合物而言)，并將病毒或亞單位與合適的載體或稀釋劑和/或佐劑，如獸醫(yī)學可接受的或制藥學可接受的載體或稀釋劑和/或佐劑混合。
術語“免疫原性組合物”和“免疫學組合物”和“免疫原性或免疫學組合物”覆蓋引發(fā)針對靶病原體的免疫應答的任何組合物；例如在施用或注射到動物(諸如豬)體內后引發(fā)針對靶病原體(如PRRS)的免疫應答。術語“疫苗組合物”和“疫苗”覆蓋誘導針對靶病原體的保護性免疫應答或提供針對病原體的有效保護的任何組合物；例如在施用或注射到動物(如豬)體內后引發(fā)針對靶病原體的保護性免疫應答或提供針對病原體(如PRRS)的有效保護。病原體如病毒的亞單位，由病原體如病毒分離的抗原或免疫原或表位；和亞單位組合物包含由病原體如病毒分離的一種或多種抗體、免疫原或表位或者基本由其組成。
本發(fā)明還提供了通過在棉鼠肺細胞或本發(fā)明的細胞或細胞系上培養(yǎng)或繁殖獲得的生物體或病原體如病毒的培養(yǎng)物，如滅活的、減毒的和亞單位培養(yǎng)物或制備物，所述病毒諸如通常不以嚙齒類或大鼠或棉鼠或棉鼠肺細胞作為天然宿主的病毒，例如PRRSV、LDV、EAV、SHFV、傳染性支氣管炎病毒、犬冠狀病毒、貓冠狀病毒、人冠狀病毒229E、豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬呼吸道病毒、牛冠狀病毒、人冠狀病毒OC43、小鼠肝炎病毒、豬血凝性腦脊髓炎病毒、大鼠冠狀病毒、涎淚腺炎病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、火雞冠狀病毒、兔冠狀病毒、馬torovirus、豬torovirus、人torovirus、牛torovirus、CPI-2、CAV-2、PAV-5、EHV-1、EHV-4、BRV或BCV，有利的是PRRS病毒、CPI-2、CAV-2、EHV-1、EHV-4、BRV或BCV。
這些培養(yǎng)物與以前的培養(yǎng)物不同，因為它們可不含在不同細胞上繁殖的培養(yǎng)物的污染物，而且可具有與在不同細胞上繁殖的培養(yǎng)物不同的滴度。例如，再次考慮在豬細胞中擴增的PRRS病毒；其培養(yǎng)物易于包含來自豬細胞的污染物，而在CRL細胞上培養(yǎng)的PRRSV很可能不含在豬細胞中發(fā)現(xiàn)的污染物。這種分析可以延伸至在用于繁殖PRRSV和其它病毒的其它細胞上培養(yǎng)的PRRSV和其它病毒培養(yǎng)物與本發(fā)明中在CRL細胞上培養(yǎng)的病毒培養(yǎng)物的比較，顯然本發(fā)明的培養(yǎng)物不同于以前的培養(yǎng)物。
本發(fā)明還包括針對PRRS疾病或PRRSV的免疫原性組合物和疫苗，它可以由依照本發(fā)明的PRRS病毒培養(yǎng)物獲得，有利的是活的減毒的免疫原性組合物和疫苗、滅活的免疫原性組合物和疫苗、以及亞單位免疫原性組合物和疫苗。
本發(fā)明還包括針對在CRL細胞或本發(fā)明的細胞系或細胞上培養(yǎng)或繁殖的其它病原體或生物體的免疫原性組合物和疫苗，如活的減毒的、滅活的、或亞單位組合物或疫苗。這些免疫原性組合物或疫苗可以針對在CRL細胞或本發(fā)明的細胞系或細胞上生長、培養(yǎng)、繁殖、諸如此類的任何生物體或病原體或病毒，例如針對任何本文提及的病毒或生物體或病原體，諸如CPI-2、CAV-2、BHV-1、EHV-1、EHV-4、BRV、bPI-3或BCV的免疫原性或疫苗組合物。
本發(fā)明包括包含細胞和要在其中培養(yǎng)的病毒或生物體或病原體的試劑盒，有利的是在分開的容器中；甚至更有利的是，分開的容器在相同的包裝中；任選的是，試劑盒包括對培養(yǎng)、生長、養(yǎng)育細胞和/或病毒的說明書，且說明書任選包括對收獲和/或滅活病毒和/或分離亞單位抗原或免疫原或表位的說明。
本發(fā)明還包括聯(lián)合組合物；例如包含一種或多種本發(fā)明疫苗或免疫原性組合物、或者本發(fā)明疫苗或免疫原性組合物聯(lián)合另一種疫苗或免疫原性組合物或活性成分(如滅活的或減毒的病毒或病原體或生物體或其亞單位抗原或免疫原或蛋白質或表位)的組合物。
由此，例如，本發(fā)明包括針對豬疾病的免疫原性組合物和疫苗，它包含依照本發(fā)明的PRRS和PAV-3病毒培養(yǎng)物的混合物，諸如活的減毒的免疫原性組合物和疫苗、滅活的免疫原性組合物和疫苗、或者亞單位免疫原性組合物和疫苗。PAV-3還可以是重組PAV-3，它包含編碼一種或多種外來或異源或外源免疫原、抗原或表位(對于該腺病毒而言是外來、異源或外源的)的一種或多種核酸序列并表達之?？捎糜趯嵺`本發(fā)明的重組豬腺病毒載體的實例參見WO99/53047、WO99/08706、WO01/83737和WO00/47756。
另一個實例是本發(fā)明包括針對犬疾病的免疫原性組合物和疫苗，它包含依照本發(fā)明的CPI-2和CAV-2病毒培養(yǎng)物的混合物，諸如活的減毒的免疫原性組合物和疫苗、滅活的免疫原性組合物和疫苗、或者亞單位免疫原性組合物和疫苗。CAV-2還可以是重組CAV-2，它包含編碼一種或多種外來或異源或外源免疫原、抗原或表位(對于該腺病毒而言是外來、異源或外源的)的一種或多種核酸序列并表達之?？捎糜趯嵺`本發(fā)明的重組犬腺病毒載體的實例參見美國專利號6,090,393。
又一個實例是本發(fā)明包括針對牛疾病的免疫原性組合物和疫苗，它包含依照本發(fā)明的至少兩種或至少三種或所有四種病毒培養(yǎng)物的混合物，包括BHV-1、BRV、bPI-3和/或BCV，如BHV-1+BRV、BHV-1+BRV+bPI-3、BHV-1+BRV+bPI-3+BCV、BRV+bPI-3、BRV+bPI-3+BCV、bPI-3+BCV、BHV+bPI-3、BHV+bPI-3+BCV、BHV-1+BCV、BRV+BCV，諸如活的減毒的免疫原性組合物和疫苗、滅活的免疫原性組合物和疫苗、或者亞單位免疫原性組合物和疫苗。被認為有利的是針對牛呼吸道疾病的免疫原性組合物和疫苗，它包含包括BHV-1和bPI-3的依照本發(fā)明的至少兩種病毒培養(yǎng)物的混合物，以及針對牛腸道疾病的免疫原性組合物和疫苗，它包含包括BCV和BRV的依照本發(fā)明的至少兩種病毒培養(yǎng)物的混合物。
依照本發(fā)明的聯(lián)合組合物的還有一個實例是針對馬疾病的免疫原性組合物和疫苗，它包含依照本發(fā)明的EHV-1和EHV-4病毒培養(yǎng)物的混合物，諸如活的減毒的免疫原性組合物和疫苗、滅活的免疫原性組合物和疫苗、或者亞單位免疫原性組合物和疫苗。
本發(fā)明包括制備這些聯(lián)合組合物；例如通過混合活性成分，有利是與載體或稀釋劑和/或佐劑一起。
本發(fā)明還包括用于制備本發(fā)明的聯(lián)合免疫原性或疫苗組合物的試劑盒；例如，在分開的容器中包含(a)生物體、病原體或病毒或其抗原或表位(有利的是本文提及的病毒)以及(b)與(a)不同的生物體、病原體或病毒或其免疫原、抗原或表位(有利的是病毒或其免疫原、抗原或表位，但是也包括本文提及的其它病原體)的試劑盒，任選在相同包裝中，且任選附有對混合和/或施用的說明。
本發(fā)明還包括通過以足以誘導免疫應答的量對宿主(諸如易于患上由在棉鼠肺細胞或細胞系如本發(fā)明的棉鼠肺細胞或細胞系上繁殖的病原體或生物體或病毒如本文提及的病毒引起的疾病的宿主)施用本發(fā)明的免疫原性或疫苗組合物(其包含這種滅活的或減毒的病原體或生物體或病毒或其抗原或免疫原或表位)來誘導免疫應答的方法。
由此，本發(fā)明提供了以足以引發(fā)適當免疫應答的量使用本發(fā)明的免疫原性組合物和/或疫苗(如對宿主(如豬)施用免疫原性或疫苗組合物)來針對PRRS疾病或病毒免疫或接種或誘導免疫應答的方法。本發(fā)明還提供了以足以引發(fā)適當免疫應答的量使用本發(fā)明的免疫原性組合物和/或疫苗(如對宿主(如病毒的天然宿主)施用免疫原性或疫苗組合物)來針對CPI-2、CAV-2、BHV-1、EHV-1、EHV-4、BRV、bPI-3或BCV疾病或病毒免疫或接種或誘導免疫應答的方法。
例如在采用混合或聯(lián)合組合物時，本發(fā)明涉及在宿主動物中針對兩種或多種不同抗原、表位或病原體或生物體或病毒免疫或接種或引發(fā)免疫應答的方法，諸如在豬中針對PRRS和PAV-3疾病，包括施用有效量的本發(fā)明的免疫原性組合物和/或疫苗以引發(fā)應答。(所述免疫原性組合物和疫苗可以是復數(shù)，因為還可以通過順序施用本發(fā)明的組合物或疫苗來實踐該方法。)同樣，作為另一個實例，本發(fā)明涉及使用或施用有效量的本發(fā)明的免疫原性組合物和/或疫苗來在犬中針對CPI-2和CAV-2疾病或病毒免疫或接種或引發(fā)免疫應答的方法。類似的，本發(fā)明提供了使用或施用有效量的本發(fā)明的免疫原性組合物和/或疫苗來在牛中針對至少兩種或至少三種或至少四種牛疾病或病毒免疫或接種或引發(fā)免疫應答的方法。另外，本發(fā)明涉及使用或施用本發(fā)明的免疫原性組合物和/或疫苗來在牛中針對BHV-1和bPI-3疾病或病毒免疫或接種或引發(fā)免疫應答的方法。本發(fā)明還涉及使用或施用本發(fā)明的免疫原性組合物和/或疫苗來在牛中針對BCV和BRV疾病和病毒免疫或接種或引發(fā)免疫應答的方法。而且，本發(fā)明涉及使用或施用本發(fā)明的免疫原性組合物和/或疫苗來在馬中針對EHV-1和EHV-4疾病或病毒免疫或接種或引發(fā)免疫應答的方法。
注意，在本公開書中，特別是在權利要求中，術語諸如“包含”、“包括”、“含有”等可以具有美國專利法中賦于它的含義；如它可以指“包括”；而且術語諸如“基本上由...組成”具有美國專利法中賦于它的含義，如它容許未明確敘述的成分，但排除在現(xiàn)有技術中找到的或影響本發(fā)明的基本的或新的特征的成分。
下文發(fā)明詳述公開或啟示和涵蓋了這些和其它實施方案。
發(fā)明詳述本發(fā)明人開發(fā)了使用棉鼠肺細胞生產(chǎn)或繁殖病毒的方法，和新的細胞系；以及生物體或病原體或病毒在這些細胞上的繁殖或生產(chǎn)或培養(yǎng)或生長。
由棉鼠收集肺，并進行酶促消化(如用胰蛋白酶和/或膠原酶)。收集含有解離細胞的上清液，并培養(yǎng)成例如單層或懸浮液。有利的是將細胞在補充胎牛血清(FBS)和/或乳白蛋白水解物(LAH)的極限必需培養(yǎng)基(MEM)中培養(yǎng)成單層。有利的是培養(yǎng)基可以含有抗生素，例如慶大霉素、鏈霉素和/或青霉素。
在這種肺細胞培養(yǎng)物上培養(yǎng)PRRS病毒。還在這種肺細胞培養(yǎng)物上培養(yǎng)PAV-3、CPI-2、CAV-2、BHV-1、EHV-1、EHV-4、BRV、bPI-3或BCV病毒。
有利的是細胞培養(yǎng)物可以來自這些細胞的幾代。有利的是這些細胞的傳代容許生成可用于例如繁殖PRRS病毒的細胞系。例如，可以將細胞進行至少10次傳代，如10-100次傳代。有利的是這些細胞系在胎牛血清(FBS)缺乏的情況下持久生長，盡管單層的建立需要一些FBS或另一種適當?shù)募毎L因子。
依照本發(fā)明的CRL細胞培養(yǎng)物的另一個優(yōu)點是細胞培養(yǎng)物作為健康單層或懸浮物可以持續(xù)至少一個月而無需更換耗盡的培養(yǎng)基或額外的營養(yǎng)補充。這種耐久性賦予了由相同細胞培養(yǎng)物多次收獲病毒而無需啟動時間(培養(yǎng)物建立)和細胞存量消耗的優(yōu)勢。由此有可能由相同細胞培養(yǎng)物多次收獲病毒。在一個實施方案中，培養(yǎng)過程包括兩次或多次收獲病毒，經(jīng)過或未經(jīng)再次接種病毒和/或添加新鮮培養(yǎng)基。有利的是在每次收獲后向細胞培養(yǎng)物中添加新鮮的培養(yǎng)基。
遵循該流程，已將棉鼠肺細胞培養(yǎng)了長達76代并建成細胞系。這些棉鼠肺細胞基本上是上皮細胞，并且在傳代中維持形態(tài)學特征。第21代于2001年12月18日在布達佩斯條約的條款下保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，10801 University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209)，保藏編號ATCC PTA-3930。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及棉鼠上皮肺細胞、由其衍生的上皮細胞系諸如細胞系PTA-3930或具有其鑒定特征的細胞系用于生產(chǎn)有毒力的或減毒的PRRS病毒的用途。在其它實施方案中，本發(fā)明涉及棉鼠上皮肺細胞、由其衍生的上皮細胞系諸如細胞系PTA-3930或具有其鑒定特征的細胞系用于生產(chǎn)有毒力的或減毒的CPI-2、CAV-2、EHV-1、EHV-4、BRV或BCV病毒的用途。在其它實施方案中，本發(fā)明涉及細胞系PTA-3930或具有其鑒定特征的細胞系用于生產(chǎn)有毒力的或減毒的BHV-1或bPI-3病毒的用途。所述細胞系或具有其鑒定特征的細胞系還可用于本文提及的其它病毒。
由此，本發(fā)明的另一個方面是生產(chǎn)PRRS病毒的方法，包括在包含上皮細胞的棉鼠肺細胞培養(yǎng)物上，有利的是在棉鼠肺細胞系上培養(yǎng)PRRS病毒。例如，在細胞系PTA-3930或具有其鑒定特征的細胞系上進行病毒生產(chǎn)。這種生產(chǎn)病毒的方法還可用于CPI-2、CAV-2、BHV-1、EHV-1、EHV-4、BRV、bPI-3和BCV病毒，以及本文提及的其它病毒。
病毒可以是有毒力的病毒或減毒的病毒。
病毒生產(chǎn)包括在細胞上接種和繁殖病毒的步驟。在接種前，可以在合適的培養(yǎng)基，例如補充FBS或另一種適當?shù)募毎L因子的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)依照本發(fā)明的細胞。有利的是在35-39℃之間的溫度進行細胞培養(yǎng)，有利的是37℃左右。有利的是細胞培養(yǎng)物是單層?；蛘呒毎囵B(yǎng)物是懸浮物。一般而言，在以單層培養(yǎng)的細胞匯合時接種病毒。胞外病毒可以由上清液直接回收。胞內病毒可以在適當破壞細胞后回收，例如通過凍融或超聲處理。在懸浮細胞培養(yǎng)物的情況中，可以在例如過濾濾液后回收病毒?？梢栽诮臃N后2-15天、諸如3-7天、更有利的是5-7天回收病毒。依照關于病毒生產(chǎn)領域熟練技術人員的一般知識進行病毒生產(chǎn)。此階段獲得病毒的粗培養(yǎng)物。
本發(fā)明中所使用的培養(yǎng)基可以補充抗生素。
如果需要，使病毒如PRRS病毒適應依照本發(fā)明的細胞上的生長。適應可以通過在依照本發(fā)明的細胞和猴腎細胞諸如MA-104上共培養(yǎng)來進行。眾所周知，適應就是通過在逐漸增加依照本發(fā)明細胞的量的共培養(yǎng)物上連續(xù)傳代來進行的。這種適應也可用于CPI-2、CAV-2、BHV-1、EHV-1、EHV-4、BRV、bPI-3或BCV病毒，以及本文提及的其它病毒。
粗培養(yǎng)物可以濃縮和/或純化。
濃縮可以通過本領域熟練技術人員知道的任何常規(guī)方法來進行，例如選擇性沉淀或超濾。純化可以通過本領域熟練技術人員知道的任何常規(guī)方法來進行，例如超速離心或層析方法，如凝膠過濾。此階段得到病毒的濃縮培養(yǎng)物、純化培養(yǎng)物或濃縮且純化的培養(yǎng)物。
在本發(fā)明的另一個方面，可以通過任何常規(guī)方法例如熱和/或化學方法來滅活依照本發(fā)明的病毒培養(yǎng)物(粗的、濃縮的、純化的、或濃縮且純化的)。有利的方法是化學滅活，例如使用β-丙酸內酯、福爾馬林、乙烯亞胺或其衍生物諸如二元乙烯亞胺(binary ethylenimine，BEI)以及這些滅活化合物的聯(lián)合。此階段得到滅活的PRRS病毒培養(yǎng)物。
在本發(fā)明的另一個方面，可以由依照本發(fā)明的病毒培養(yǎng)物(粗的、濃縮的、純化的、或濃縮且純化的，任選滅活的)中存在的病毒提取免疫原性部分像糖蛋白或蛋白質。病毒免疫原性部分的提取是依照本領域熟練技術人員的一般知識進行的。此階段得到亞單位病毒制備物。
由此本發(fā)明的其它方面是本文描述的病毒粗培養(yǎng)物、濃縮培養(yǎng)物、純化培養(yǎng)物、濃縮且純化的培養(yǎng)物、滅活培養(yǎng)物、亞單位制備物。
在本發(fā)明的一個有利實施方案中，可以通過在依照本發(fā)明的細胞上足夠次數(shù)的傳代將有毒力的病毒減毒。本領域熟練技術人員能夠通過常規(guī)實驗來確定足以使病毒減毒的傳代次數(shù)。得到減毒的病毒制備物。
本發(fā)明的另一個目標是提供用于預防病毒感染的免疫原性組合物和疫苗。這些免疫原性組合物或疫苗包含至少一種本文所述培養(yǎng)物或制備物。
術語“免疫原性組合物”在本文中覆蓋一旦施用于動物如豬則能夠引發(fā)針對病毒或抗原或免疫原或表位的免疫應答的任何組合物。術語“疫苗”在本文中覆蓋一旦施用于動物如豬則能夠誘導針對病毒的保護性免疫應答或給動物提供針對所述病毒的有效保護的任何組合物。
依照本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗可以包含病毒培養(yǎng)物或制備物或病毒的抗原或免疫原或表位，以及另一種病原體的至少一種免疫原、抗原或表位或另一種病原體(如滅活的或減毒的病原體)。這種免疫原、抗原或表位可以是例如細菌的、或寄生蟲或病毒來源的，或者是病原體的滅活或減毒形式。本發(fā)明還包括用于制備這些聯(lián)合組合物的試劑盒，以及用于生產(chǎn)這些聯(lián)合組合物的方法和這些聯(lián)合組合物的成分用于制備聯(lián)合組合物的用途。因此，本發(fā)明涉及用于制備本發(fā)明的聯(lián)合免疫原性或疫苗組合物的試劑盒；例如，在分開的容器中包含(a)生物體、病原體或病毒或其抗原或表位(有利的是本文提及的病毒)以及(b)與(a)不同的生物體、病原體或病毒或其免疫原、抗原或表位(有利的是病毒或其免疫原、抗原或表位，但是也包括本文提及的其它病原體)的試劑盒，任選在相同包裝中，且任選附有對混合和/或施用的說明。
依照本發(fā)明的免疫原性組合物和/或疫苗可以包含PRRS病毒培養(yǎng)物或制備物(如滅活的或減毒的PRRSV或其免疫原或抗原或表位)，以及另一種豬病原體的至少一種免疫原、抗原或表位(包括但不限于滅活或減毒形式的病原體)。這種病原體可以選自但不限于下組假狂犬病病毒、豬流感病毒、豬細小病毒、傳染性胃腸炎病毒(冠狀病毒)、豬環(huán)狀病毒諸如2型豬環(huán)狀病毒、輪狀病毒、3型豬輪狀病毒、大腸桿菌(Escherichia coli)、豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、支氣管敗血性博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、梭菌(Clostridiumspp.)、沙門氏菌(Salmonella spp.)、副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、豬鏈球菌(Streptococcus suis)、豬肺炎枝原體(Mycoplasma hyopneumoniae)和大葉性肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)。有利的是，依照本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗可以包含在依照本發(fā)明的細胞或細胞系如PTA-3930細胞系或具有其所有鑒定特征的細胞系上生長和繁殖的PRRS病毒培養(yǎng)物或制備物和PAV-3病毒。豬病原體的免疫原可以包括假狂犬病病毒gB、假狂犬病病毒gC、假狂犬病病毒gD、豬流感HA、豬流感NA、豬流感NP、豬生殖和呼吸綜合癥病毒的ORF4、豬生殖和呼吸綜合癥病毒的ORF7、PRRSV的ORF5、PRRSV ORF3、PRRSVORF6、PRRSV開放讀碼框5(ORF5)和6(ORF6)、PRRSV開放讀碼框5(ORF5)和3(ORF3)和6(ORF6)、豬瘟病毒E1、豬瘟病毒E2基因、細小病毒VP2、2型豬環(huán)狀病毒ORF1、或2型豬環(huán)狀病毒ORF2。關于豬病原體的免疫原及編碼它們的核酸分子和表達它們的構建物請參考美國專利號6,517,843、6,497,883、6,391,314、6,379,676、6,217,883、6,207,165和美國專利公開物2003003112和WO99/53047、WO99/08706、WO01/83737、和WO00/47756。由此，本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)這些組合物的方法以及試劑盒。
依照本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗可以包含CPI-2和/或CAV-2病毒培養(yǎng)物或制備物(如滅活的或減毒的CPI-2和/或CAV-2或其免疫原或抗原或表位)，以及另一種犬病原體的至少一種免疫原、抗原或表位(包括但不限于病原體的滅活或減毒形式)。這種病原體可以選自但不限于下組犬瘟病毒、犬細小病毒、犬冠狀病毒、犬皰疹病毒、萊姆病病原體、布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)和狂犬病病毒。有利的是，依照本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗包含依照本發(fā)明的CPI-2病毒培養(yǎng)物或制備物和/或CAV-2病毒培養(yǎng)物或制備物。CPI-2免疫原可以是CPI-2F和/或HN。關于犬病原體的免疫原及編碼它們的核酸分子和表達它們的構建物還可參閱美國專利號5,616,326、6,090,393、6,159,477、6,228,846。由此，本發(fā)明還涉及用于制備這些組合物的方法以及試劑盒。
依照本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗可以包含BHV-1、BRV、bPI-3和/或BCV病毒培養(yǎng)物或制備物(如滅活的或減毒的BHV-1、BRV、bPI-3和/或BCV或其免疫原或抗原或表位)，以及另一種牛病原體的至少一種免疫原、抗原或表位(包括但不限于病原體的滅活或減毒形式)。這種病原體可以選自但不限于下組牛呼吸道合胞病毒和牛病毒性腹瀉病毒。有利的是，依照本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗包含包括BHV-1、BRV、bPI-3或BCV的至少兩種依照本發(fā)明的病毒培養(yǎng)物或制備物。BRSV免疫原可以是BRSV F或G或N，諸如BRSV F和/或G或N和/或G。BHV-1免疫原可以是gB和/或gC和/或gD。BVDV免疫原可以是E0蛋白質(gp48)和/或E2蛋白質(gp53)。BVDV可以是1型和/或2型。bPI-3免疫原可以是bPI-3 F和/或HN。關于牛病原體的免疫原及編碼它們的核酸分子和表達它們的構建物還可參閱美國專利號6,451,770、6,376,473、6,224,878。由此，本發(fā)明還涉及用于制備這些組合物的方法以及試劑盒。
依照本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗可以包含EHV-1和/或EHV-4病毒培養(yǎng)物或制備物(如滅活的或減毒的EHV-1和/或EHV-4或其免疫原或抗原或表位)，以及另一種馬病原體的至少一種免疫原、抗原或表位(包括但不限于病原體的滅活或減毒形式)。這種病原體可以選自但不限于下組馬流感病毒、東部腦脊髓炎病毒(EEV)、西部腦脊髓炎病毒(WEV)、委內瑞拉腦脊髓炎病毒(VEV)、萊姆病病原體、布氏疏螺旋體、破傷風梭菌(Clostridium tetani)、馬動脈炎病毒(EAV)和狂犬病病毒。有利的是，依照本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗可以包含依照本發(fā)明的EHV-1病毒培養(yǎng)物或制備物和EHV-4病毒培養(yǎng)物或制備物。EHV糖蛋白可以是gB、gD、gB+gD、gC、和gE。關于馬病原體的免疫原及編碼它們的核酸分子和表達它們的構建物請參考美國專利號6,207,166和6,368,603。由此，本發(fā)明還涉及用于制備這些組合物的方法以及試劑盒。
還包含這種額外免疫原性成分(額外的免疫原、抗原或表位)的依照本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗具有同時誘導針對幾種傳染或疾病或其病原體的免疫應答或保護作用的優(yōu)點。這種額外免疫原性成分可以是減毒的或滅活的微生物、重組構建物或亞單位(如蛋白質、糖蛋白、多肽、或表位)。表位確定方法，諸如構建交疊肽庫(Hemmer B.等人，Immunology Today，1998，19(4)163-168)、Pepscan(Geysen H.M.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，1984，81(13)，3998-4002；GeysenH.M.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，1985，82(1)，178-182；Vander Zee R.等人，Eur.J.Immunol.，1989，19(1)，43-47；Geysen H.M.，Southeast Asian J.Trop.Med.Public Health，1990，21(4)，523-533；Multipin Peptide Synthesis Kits de Chiron)和算法(De Groot A.等人，Nature Biotechnology，1999，17，533-561)，可在本發(fā)明的實踐中用于無需過多實驗就確定免疫原、抗原、多肽、糖蛋白等的表位。根據(jù)該信息，可以構建編碼這種表位的核酸分子；而且根據(jù)該知識和本領域的知識，可以構建表達免疫原、表位或抗原的載體或構建物如重組病毒或載體或質粒；都無需過多實驗。
免疫原性組合物或疫苗組合物還包含制藥學或獸醫(yī)學可接受賦形劑、稀釋劑或載體，以及任選的穩(wěn)定劑和/或佐劑。合適制劑對于任何本領域熟練技術人員而言都是顯然的。可以為任何合適施用途徑開發(fā)制劑。
制藥學可接受載體可以是水或鹽水。
滅活的免疫原性組合物或滅活的疫苗有利包含至少一種佐劑。
可以將活的減毒的病毒凍干，有利的是與穩(wěn)定劑一起。凍干可以依照眾所周知的標準凍干流程進行。制藥學可接受穩(wěn)定劑可以是SPGA(蔗糖、磷酸鹽、谷氨酸鹽、清蛋白)(Bovarnik等人，J.Bacteriology，1950，59，509)、碳水化合物(如山梨醇、甘露醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖、右旋糖苷、海藻糖)、谷氨酸鈉(Tsvetkov T等人，Cryobiology，1983，20(3)，318-323；Israeli E等人，Cryobiology，1993，30(5)，519-523)、蛋白質諸如蛋白胨、清蛋白或酪蛋白、含蛋白質的物質諸如脫脂奶(Mills CK等人，Cryobiology，1988，25(2)，148-152；Wolff E等人，Cryobiology，1990，27(5)，569-575)、和緩沖劑(如磷酸鹽緩沖劑、堿金屬磷酸鹽緩沖劑)。
佐劑可用于使凍干制劑可溶。
佐劑的實例是基于礦物油和/或植物油和非離子表面活性劑諸如嵌段共聚物、Tween、Span的水包油、水包油包水乳化液。其它合適佐劑是例如維生素E、皂角苷、Carbopol、氫氧化鋁、磷酸鋁或氧化鋁(“Vaccine Design，The subunit and adjuvant approach”，Pharmaceutical Biotechnology(制藥學生物技術)，第6卷，Michael F.Powell和Mark J.Newman編，1995，Plenum出版社，紐約)。這里引用的文件同樣可用作佐劑以及賦形劑、稀釋劑、載體和媒介的參考文獻。
本發(fā)明的另一個方面是分別使用依照本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗組合物的免疫方法或接種方法。
該方法包括至少一次對動物施用有效量的依照本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗。動物可以是雄性、雌性、懷孕的雌性和新生的。這種施用特別可以是通過肌肉內(IM)、皮內(ID)或皮下(SC)注射或者通過鼻內或口服施用來進行的。可以通過注射器或無針裝置(像例如Pigjet或Biojector(Bioject，俄勒岡，美國))來施用依照本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗。
對于減毒組合物，在新細胞培養(yǎng)物上生產(chǎn)的病毒或生物體或病原體的劑量可以在大約103-大約107CCID50(中間細胞培養(yǎng)物感染劑量)之間，有利的是在大約104-大約106CCID50之間，更有利的是大約105CCID50。體積是0.2-2.0ml，有利的是大約2.0ml。可以進行一次或多次施用；如兩次注射，間隔2-4周，有利的是在首次注射后大約3周進行一次加強注射。
對于在新細胞培養(yǎng)物上生產(chǎn)的病毒或生物體或病原體的滅活組合物，可以在單劑劑量單位中對動物施用大約104-109當量CCID50(滅活前的滴度)，有利的是大約105-108當量CCID50。單劑劑量單位的體積可以是0.2-5.0ml，有利的是0.5-2.0ml，更有利的是大約2.0ml?？梢赃M行一次或多次施用；如兩次注射，間隔2-4周，有利的是在首次注射后大約3周進行一次加強注射。
對于亞單位組合物，如來自在新細胞培養(yǎng)物上生產(chǎn)的病毒或病原體或生物體，可以對動物施用大約5μg-500μg，有利的是20μg-50μg。體積是0.2-2.0ml，有利的是大約2.0ml?？梢赃M行一次或多次施用；如兩次注射，間隔2-4周，有利的是在首次注射后大約3周進行一次加強注射。
依照本發(fā)明的組合物還可以施用于其它哺乳動物，如小鼠或實驗室動物，例如用于生成多克隆抗體或用于制備雜交瘤(為了單克隆抗體)。
通過下面的非限制性實施例將進一步描述本發(fā)明。
實施例實施例1獲得棉鼠肺(CRL)細胞由無痛致死動物切下后，將肺置于含有極限必需培養(yǎng)基F-15(MEMF-15，Hyclone，目錄編號SH30024.02)和30μg/ml慶大霉素的細胞培養(yǎng)基中。該培養(yǎng)基補充了2％v/v濃度的商品化抗生素(青霉素和鏈霉素)和抗真菌素(兩性霉素(amphotercin)B)。將肺在裝有25ml含有30μg/ml慶大霉素的MEM F-15的50ml圓錐形離心管中于37℃進行消化，溶液中膠原酶(Sigma，目錄編號L-0130)和胰蛋白酶(Sigma，目錄編號T-8003)的濃度分別為1mg/ml和1X強度(對應于2.5mg/ml的濃度)。消化30分鐘后，添加胎牛血清(FBS)(Bio Whittaker)至終濃度10％v/v。使用移液管將細胞吹散并澄清后，收集含有解離細胞的上清液并涂布到裝有MEM F-15培養(yǎng)基的25cm2燒瓶中，其中含有30μg/ml慶大霉素并補充FBS至終濃度10％v/v的。
實施例2培養(yǎng)CRL細胞用胰蛋白酶溶液漂洗除去實施例1中得到的CRL細胞匯合(鋪滿)單層上殘余的FBS。將用0.1％(1X)豬胰蛋白酶與乙二胺四乙酸(EDTA)(JRH Biosciences，目錄編號62244-79P)的混合物(75cm2燒瓶用3ml，150cm2燒瓶用5ml)覆蓋的細胞置于37℃培養(yǎng)箱中，并密切監(jiān)視直至完成細胞脫離。使用移液管吹散細胞，并收集3ml細胞懸浮液。此時，用含有MEM F-15、濃度30μg/ml慶大霉素、濃度10％FBS v/v的新鮮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)1∶4的收集細胞。
讓CRL細胞在37℃、5％CO2分壓的培養(yǎng)箱中生長。1∶4分割的匯合單層在大約4天后匯合，而1∶8的分割在大約7天內生成匯合單層。這構成一次傳代。
然后將細胞繁殖2代-76代。
添加二甲亞砜(DMSO)防凍劑后，將直至76代的所有傳代的小型庫存冷凍。將庫存保存于液氮中。
CRL細胞的21代保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號ATCCPTA-3930。
實施例3在CRL細胞上繁殖PRRS病毒使用已知在猴腎細胞上繁殖的減毒PRRS病毒。
在裝有50ml培養(yǎng)基的75cm2燒瓶(T75燒瓶)中在CRL細胞的單層上進行PRRS病毒的繁殖，其中培養(yǎng)基含有MEM F-15，慶大霉素濃度30μg/ml且FBS v/v濃度10％。接種病毒前，將細胞于37℃保溫24小時，直至它們匯合。接種1ml PRRS病毒后，將接種后的細胞于37℃保溫5-7天。通過間接免疫熒光抗體測試(IFA)和上清液滴定來檢查病毒生長。凍融后，收獲上清液。這構成PRRS病毒的粗培養(yǎng)物。
間接免疫熒光抗體測試(IFA)為了IFA，將細胞進行胰蛋白酶消化、分散、收集和重懸于含有30μg/ml慶大霉素并補充FBS至濃度10％v/v的新鮮MEM F-15培養(yǎng)基中。以100μl/孔將細胞接種到96孔組織培養(yǎng)處理板中，并讓其生長過夜至匯合。制備PRRS病毒的4倍連續(xù)稀釋液。然后，將100μl或200μl稀釋病毒加到96孔板的某一排的每個孔中。將板在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中保溫7天。通過間接免疫熒光抗體測試(IFA)使用抗PRRS病毒單克隆抗體(SDOW 17，得自USDA；Magar R.等人，Can J vet Res，1995，59(3)，232-234)測定含有受感染CRL細胞的孔。
在CRL細胞上生長的PRRS病毒的表征在含有CRL細胞的96孔板中滴定PRRS病毒。使用Spearman-Karber的50％終點測定法計算滴度，并以每ml為基礎報告。結果表述成Log10(FAID50)/ml。以Log10(FAID50)/ml表示的滴定結果是4.3。
實施例4使PRRS病毒適應CRL上的生長和繁殖使NADC 8 PRRS病毒適應在CRL細胞上的生長。NADC 8得自國家動物疾病中心(National Animal Disease Center，USDA)。
在MA-104細胞數(shù)量逐漸減少的CRL細胞與MA-104細胞(非洲綠猴腎細胞，MARC-145的親本細胞系)的共培養(yǎng)物上連續(xù)繁殖病毒。首先于37℃在含乳白蛋白水解物(LAH，v/v濃度0.1％)、慶大霉素(濃度30μg/ml)和FBS(v/v濃度10％)的MEM F-15中以1∶9的比例接種CRL細胞與MA-104細胞(20,000個CRL細胞/ml∶180,000個MA-104細胞/ml)。當這些共培養(yǎng)物匯合后，接種PRRS病毒(每個T75燒瓶1ml)，無需補充任何培養(yǎng)基。通過間接免疫熒光抗體測試(IFA，如實施例3中所述)和上清液滴定來檢查病毒生長。將接種后的細胞于37℃保溫5-7天。傳代包括凍融、收獲上清液、及隨后連續(xù)共培養(yǎng)T75燒瓶接種1ml，即收獲的上清液的大約10％。通過將接種物在比例分別為2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、和9∶1的CRL∶MA-104共培養(yǎng)物上傳代來重復這一過程。
最后，在裝有含MEM F-15、慶大霉素(濃度為30μg/ml)和FBS(v/v濃度為10％)(不含LAH)的50ml培養(yǎng)基的T75燒瓶中使病毒在只由CRL細胞組成的單層上生長。將接種后的CRL細胞于37℃保溫5-7天。凍融后，收獲上清液。這構成PRRS病毒的粗培養(yǎng)物。
IFA顯示NADC 8感染了CRL細胞。
在CRL培養(yǎng)物上生長的PRRS病毒的鑒定在含有CRL細胞的96孔板中滴定PRRS病毒NADC 8株。如上所述進行培養(yǎng)。使用Spearman-Karber的50％終點測定法計算滴度，并以每ml為基礎報告。結果表述成Log10(FAID50)/ml。
以Log10(FAID50)/ml表示的滴定結果是4.12。
可以采用本文所述技術或本文關于PRRS所述的那些技術的類似技術使其它病毒適應在棉鼠肺細胞，有利的是本發(fā)明的棉鼠肺細胞或細胞系(如保藏的那些)上生長，病毒諸如Nidovirales目的其它病毒，例如arteviruses，或動脈炎病毒科的病毒，如乳酸脫氫酶病毒(LDV)、馬動脈炎病毒(EAV)、猿出血熱病毒(SHFV)，冠狀病毒科的病毒，如冠狀病毒諸如傳染性支氣管炎病毒、犬冠狀病毒、貓冠狀病毒、人冠狀病毒229E、豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬呼吸道病毒、牛冠狀病毒、人冠狀病毒OC43、鼠肝炎病毒、豬血凝性腦脊髓炎病毒、大鼠冠狀病毒、涎淚腺炎病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、火雞冠狀病毒、兔冠狀病毒，Toroviruses諸如馬torovirus、豬torovirus、人torovirus、牛torovirus、和通常不以嚙齒類或大鼠或棉鼠為宿主的其它病毒。
實施例5滅活方法收獲在CRL上繁殖的PRRS病毒(實施例3或4)。在大約5℃超聲處理病毒懸浮液。在大約5℃將病毒懸浮液濾過50-100μm孔徑的濾膜。
向病毒懸浮液中添加β-丙酸內酯至終濃度1/3000(v/v)。攪勻后，將懸浮液轉移到另一個無菌燒瓶中。
在大約5℃攪動24小時而進行滅活。添加1M NaOH，將pH調至大約7.2。
通過大約50次超濾來濃縮滅活的病毒懸浮液。將濃縮的病毒懸浮液保存于-40℃。
實施例6制備基于礦物油的乳狀液形式的滅活疫苗依照下面的配方，使用實施例5中獲得的滅活PRRS病毒(融化并稀釋后)制備疫苗-滅活PRRS病毒的懸浮液 167ml-油相 83ml油相7％質量體積(w/v)脫水甘露醇油酸酯、8％w/v乙氧基化油酸(11氧化乙烯)、和85％v/v輕液體石蠟油(依照歐洲藥典)。
分別將水相和油相過濾除菌。借助Silverson渦輪乳化器，通過將各種成分混合并勻漿來制備乳狀液。
一個疫苗劑量含有大約107.5CCID50(滅活前的滴度)。對于肌肉內途徑的施用，一個疫苗劑量的體積是2.0ml。
實施例7在CRL細胞上繁殖病毒使用CRL細胞滴定在測定中常規(guī)用作參照病毒且可獲得熒光抗體(FA)試劑的病毒儲液。因為這些參照病毒已經(jīng)使用標準細胞系進行了常規(guī)滴定，所以每一種都具有各種變化程度的已知滴度。使用標準滴定方法，將這些參照病毒的每一種病毒的10倍或4倍稀釋液用于接種96孔板中的CRL細胞。保溫7天后，將平板用丙酮固定，并用適當?shù)腇A試劑染色。將熒光陽性培養(yǎng)物的滴度與由標準細胞培養(yǎng)物獲得的滴度進行比較。結果如下
病毒滴度表示成每毫升細胞培養(yǎng)物感染劑量50的log10(log10CCID50/ml)。
盡管在每種情況中，通過基于CRL的測定法產(chǎn)生的滴度低于標準細胞系的滴度，然而必須強調的是這些病毒未經(jīng)過使用CRL細胞的細胞適應過程，而參照病毒在標準細胞系上進行過適應過程。這只是用于檢測任何病毒復制的測試。換言之，通過一定的努力，很有可能能夠將在CRL細胞上生長的活病毒濃度提高到等同或好于在適應的細胞系上生長的病毒濃度。適應CRL的PRRS(實施例4)證明了這一點，在使用CRL細胞和MARC-145細胞(MA-104細胞的敏感亞克隆)時，病毒相同連續(xù)稀釋度的滴度分別是5.22和5.34(log10CCID50/ml)。滴度的這種差異是可以忽略的。
下面的編號段落進一步描述了本發(fā)明1.產(chǎn)生PRRS病毒的方法，其中制備棉鼠肺細胞培養(yǎng)物，并在該細胞培養(yǎng)物上繁殖PRRS病毒。
2.依照第1段的方法，其中細胞培養(yǎng)物包括上皮細胞。
3.生產(chǎn)PRRS病毒的方法，包括由棉鼠肺細胞系制備細胞培養(yǎng)物，并在該培養(yǎng)物上繁殖PRRS病毒。
4.依照第3段的方法，其中培養(yǎng)物包括上皮細胞。
5.生產(chǎn)PRRS病毒的方法，包括制備棉鼠肺上皮細胞培養(yǎng)物，并在該細胞培養(yǎng)物上繁殖PRRS病毒。
6.生產(chǎn)PRRS病毒的方法，包括由棉鼠肺上皮細胞系制備細胞培養(yǎng)物，并在該細胞系上繁殖PRRS病毒。
7.依照第3或6段的方法，其中細胞系是以編號PTA-3930保藏于ATCC的細胞系，或者是具有以編號PTA-3930保藏于ATCC的細胞系的所有鑒定特征的棉鼠肺細胞系。
8.依照第7段的方法，其中細胞系是以編號PTA-3930保藏于ATCC的細胞系。
9.依照第1-8段之任一的方法，其中PRRS病毒是有毒力的PRRS病毒。
10.依照第1-8段之任一的方法，其中PRRS病毒是減毒的PRRS病毒。
11.依照第1-8段之任一的方法，其中在細胞上繁殖PRRS病毒，并回收PRRS病毒的粗培養(yǎng)物。
12.依照第1-8段之任一的方法，其中在細胞上繁殖PRRS病毒，回收PRRS病毒得到PRRS病毒的粗培養(yǎng)物，并由該粗培養(yǎng)物純化得到PRRS病毒的純化培養(yǎng)物。
13.依照第1-8段之任一的方法，其中在細胞上繁殖PRRS病毒，回收PRRS病毒得到PRRS病毒的粗培養(yǎng)物，并由該粗培養(yǎng)物濃縮得到PRRS病毒的濃縮培養(yǎng)物。
14.依照第1-8段之任一的方法，其中在細胞上繁殖PRRS病毒，回收PRRS病毒得到PRRS病毒的粗培養(yǎng)物，并由該粗培養(yǎng)物濃縮和純化得到PRRS病毒的濃縮且純化的培養(yǎng)物。
15.依照第11段的方法，包括滅活粗培養(yǎng)物。
16.依照第12段的方法，包括滅活純化培養(yǎng)物。
17.依照第13段的方法，包括滅活濃縮培養(yǎng)物。
19.依照第14段的方法，包括滅活濃縮且純化的培養(yǎng)物。
20.依照第15、16、17或18段的方法，包括用化學試劑滅活培養(yǎng)物。
21.依照第19段的方法，其中化學試劑選自β-丙酸內酯、福爾馬林、乙烯亞胺和二元乙烯亞胺。
22.依照第11、12、13、14、15、16、17、18、19或20的方法，其中處理培養(yǎng)物以回收PRRS亞單位。
23.依照第9段的方法，包括在細胞上繁殖PRRS病毒，并回收減毒的PRRS病毒。
24.在棉鼠肺細胞上繁殖PRRS病毒后得到的PRRS病毒或PRRS病毒的培養(yǎng)物。
25.在棉鼠肺細胞系上繁殖PRRS病毒后得到的PRRS病毒或PRRS病毒培養(yǎng)物。
26.依照第23或24段的PRRS病毒或PRRS病毒培養(yǎng)物，其中細胞是上皮細胞。
27.依照第23或24段的PRRS病毒或PRRS病毒培養(yǎng)物，其中細胞包括上皮細胞。
28.依照第25段的PRRS病毒或PRRS病毒培養(yǎng)物，其中細胞系是以編號PTA-3930保藏于ATCC的細胞系，或者是具有以編號PTA-3930保藏于ATCC的細胞系的所有鑒定特征的棉鼠肺細胞系。
29.依照第25段的PRRS病毒或PRRS病毒培養(yǎng)物，其中細胞系是以編號PTA-3930保藏于ATCC的細胞系。
30.通過執(zhí)行第1-20或22段之任一的方法而得到的PRRS病毒或PRRS病毒培養(yǎng)物。
31.依照第23-28段之任一的PRRS病毒或PRRS病毒培養(yǎng)物，其是滅活的。
32.依照第23-28段之任一的PRRS病毒或PRRS病毒培養(yǎng)物，其是減毒的。
33.通過執(zhí)行第21段的方法而得到的亞單位PRRS病毒制備物。
34.包含依照第23-31段之任一的PRRS病毒或PRRS病毒培養(yǎng)物以及獸醫(yī)學可接受賦形劑、稀釋劑或載體的免疫原性組合物。
35.包含依照第32段的亞單位PRRS病毒制備物以及獸醫(yī)學可接受賦形劑、稀釋劑或載體的免疫原性組合物。
36.第33段的免疫原性組合物，還包含穩(wěn)定劑。
37.第33或34或35段的免疫原性組合物，還包含佐劑。
38.包含通過依照第1段的方法得到的PRRS病毒培養(yǎng)物的免疫原性組合物。
39.包含通過依照第3段的方法得到的PRRS病毒培養(yǎng)物的免疫原性組合物。
40.包含通過依照第1-22段之任一的方法得到的PRRS病毒培養(yǎng)物的免疫原性組合物。
41.包含通過依照第1段的方法得到的PRRS病毒培養(yǎng)物的疫苗。
42.包含通過依照第3段的方法得到的PRRS病毒培養(yǎng)物的疫苗。
43.包含通過依照第1-22段之任一的方法得到的PRRS病毒培養(yǎng)物的疫苗。
44.包含依照第23-31段之任一的PRRS病毒或PRRS病毒培養(yǎng)物以及獸醫(yī)學可接受賦形劑、稀釋劑或載體的疫苗。
45.包含依照第32段的亞單位PRRS病毒制備物以及獸醫(yī)可接受賦形劑、稀釋劑或載體的疫苗。
46.第43段的疫苗，還包含穩(wěn)定劑。
47.第43或44或45段的疫苗，還包含佐劑。
48.給豬免疫的方法，包括對豬施用依照第33-39段之任一的免疫原性組合物。
49.給豬接種的方法，包括對豬施用依照第40-46段之任一的疫苗。
50.以編號PTA-3930保藏于ATCC的棉鼠肺細胞系或具有以編號PTA-3930保藏于ATCC的細胞系的所有鑒定特征的棉鼠肺細胞系。
51.以編號PTA-3930保藏于ATCC的棉鼠肺細胞系。
由此詳細描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案后，應當理解，由上述段落定義的本發(fā)明不限于上述說明書中所列出的具體細節(jié)，因為有可能對它們進行許多明顯的變化且不違背本發(fā)明的精神或范圍。
權利要求
1.棉鼠細胞系ATCC PTA-3930或具有其所有鑒定特征的細胞系。
2.權利要求1的細胞系，它是ATCC PTA-3930。
3.用于生產(chǎn)病原體、生物體或病毒的方法，包括在權利要求1或2的細胞系的細胞上繁殖病原體、生物體或病毒。
4.權利要求3的方法，其中所述病原體、生物體或病毒是病毒，其中病毒是乳酸脫氫酶病毒(LDV)、馬動脈炎病毒(EAV)、猿出血熱病毒(SHFV)、豬生殖和呼吸綜合癥病毒(PRRSV)、傳染性支氣管炎病毒、犬冠狀病毒、貓冠狀病毒、人冠狀病毒229E、豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬呼吸道病毒、牛冠狀病毒(BCV)、人冠狀病毒OC43、鼠肝炎病毒、豬血凝性腦脊髓炎病毒、大鼠冠狀病毒、涎淚腺炎病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、火雞冠狀病毒、兔冠狀病毒、馬torovirus、豬torovirus、人torovirus、牛torovirus、犬副流感病毒(CPI)、腺病毒、牛皰疹病毒(BHV)、馬皰疹病毒(EHV)、牛輪狀病毒(BRV)、或3型牛副流感病毒(bPI-3)。
5.權利要求4的方法，其中病毒是PRRSV、2型CPI、2型犬腺病毒、3型豬腺病毒、BHV-1、EHV-1、EHV-4、bPI-3、BRV或BCV。
6.權利要求5的方法，其中病毒是PRRSV。
7.包含權利要求5的病毒或其免疫原、抗原、表位的免疫原性或疫苗組合物。
8.權利要求7的免疫原性或疫苗組合物，其中病毒是滅活或減毒的。
9.權利要求8的免疫原性或疫苗組合物，其中病毒是滅活的。
10.權利要求9的免疫原性或疫苗組合物，其中病毒是PRRSV。
11.用于誘導針對病毒的免疫學或保護性應答的方法，包括對動物施用有效量的權利要求7的免疫原性或疫苗組合物以誘導應答。
12.權利要求11的方法，其中病毒是PRRSV且動物是豬。
13.權利要求7的免疫原性或疫苗組合物，其額外包含與所述病毒或其抗原、免疫原或表位不同的免疫原、抗原或表位。
14.用于制備權利要求13的免疫原性或疫苗組合物的方法，包括混合所述病毒或其抗原或表位以及所述與所述病毒或其抗原或表位不同的免疫原、抗原或表位。
15.用于制備權利要求13的免疫原性或疫苗組合物的試劑盒，其在分開的容器中包含(a)所述病毒或其抗原或表位和(b)所述與所述病毒或其抗原或表位不同的免疫原、抗原或表位，任選在相同包裝中，且任選附有對混合和/或施用的說明。
16.為了免疫原性或疫苗組合物而生產(chǎn)病原體、生物體或病毒或者為了免疫原性或疫苗組合物而提供抗原、免疫原或表位的方法，包括在棉鼠肺細胞上繁殖病原體、生物體或病毒。
17.權利要求16的方法，其中所述病原體、生物體或病毒是病毒，其中病毒是乳酸脫氫酶病毒(LDV)、馬動脈炎病毒(EAV)、猿出血熱病毒(SHFV)、豬生殖和呼吸綜合癥病毒(PRRSV)、傳染性支氣管炎病毒、犬冠狀病毒、貓冠狀病毒、人冠狀病毒229E、豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬呼吸道病毒、牛冠狀病毒(BCV)、人冠狀病毒OC43、鼠肝炎病毒、豬血凝性腦脊髓炎病毒、大鼠冠狀病毒、涎淚腺炎病毒、禽傳染性支氣管炎病毒、火雞冠狀病毒、兔冠狀病毒、馬torovirus、豬torovirus、人torovirus、牛torovirus、犬副流感病毒(CPI)、腺病毒、牛皰疹病毒(BHV)、馬皰疹病毒(EHV)、牛輪狀病毒(BRV)、或3型牛副流感病毒(bPI-3)。
18.權利要求17的方法，其中病毒是PRRSV、2型CPI、2型犬腺病毒、3型豬腺病毒、BHV-1、EHV-1、EHV-4、bPI-3、BRV或BCV。
19.權利要求18的方法，其中病毒是PRRSV。
20.包含權利要求18的病毒或其免疫原、抗原、表位的免疫原性或疫苗組合物。
21.權利要求20的免疫原性或疫苗組合物，其中病毒是滅活或減毒的。
22.權利要求21的免疫原性或疫苗組合物，其中病毒是滅活的。
23.權利要求22的免疫原性或疫苗組合物，其中病毒是PRRSV。
24.用于誘導針對病毒的免疫學或保護性應答的方法，包括對動物施用有效量的權利要求20的免疫原性或疫苗組合物以誘導應答。
25.權利要求24的方法，其中病毒是PRRSV且動物是豬。
26.權利要求20的免疫原性或疫苗組合物，其額外包含與所述病毒或其抗原、免疫原或表位不同的免疫原、抗原或表位。
27.用于制備權利要求26的免疫原性或疫苗組合物的方法，包括混合所述病毒或其抗原或表位以及所述與所述病毒或其抗原或表位不同的免疫原、抗原或表位。
28.用于制備權利要求26的免疫原性或疫苗組合物的試劑盒，其在分開的容器中包含(a)所述病毒或其抗原或表位以及(b)所述與所述病毒或其抗原或表位不同的免疫原、抗原或表位，任選在相同包裝中，且任選附有對混合和/或施用的說明。
全文摘要
本發(fā)明公開了棉鼠細胞系，棉鼠細胞用于生長、繁殖、或培養(yǎng)生物體、病原體或病毒諸如PRRSV的用途，以及由此產(chǎn)生的生物體、病原體或病毒的用途。
文檔編號A61K39/42GK1653172SQ03810530
公開日2005年8月10日 申請日期2003年3月19日 優(yōu)先權日2002年3月20日
發(fā)明者F·R·戴維, M·E·塔納, S·K·雷迪 申請人:梅瑞爾有限公司