專利名稱：連續(xù)使用抑制硫酸酯酶的孕激素的避孕給藥方案的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于月經期間的女性連續(xù)的孕激素避孕給藥方案。更具體地說，本發(fā)明涉及連續(xù)的孕激素避孕給藥方案，其應用了有效的抑制硫酸酯酶的孕激素如炔諾肟酯(NGM)或諾孕曲明(NGMN)和雌激素。
背景技術：
人乳腺癌的顯著發(fā)生百分率是激素依賴性的。動物研究和臨床試驗已經表明雌激素尤其是雌二醇是支持激素依賴性的乳房腫瘤生長的最重要的激素(參見參考文獻#1的第493頁，#2的第967頁，#7的第1589頁，#8的第525頁，#9的第135頁，#10的第225頁，#11的第625頁和#12的第1497頁)。
絕經后的婦女體內的雌酮和雌二醇血漿濃度非常低(參見參考文獻#1的493頁和#11的第626頁)。還有，雌酮和雌二醇的乳房腫瘤組織濃度比血漿濃度高一個數量級(參見參考文獻#1的第493頁、#2的第967頁和#13的第641頁)。

圖1顯示了雌激素在人乳腺癌細胞局部形成因而能支持乳腺癌細胞生長的酶催化過程(參見參考文獻#10的第229頁)。參見圖1，研究表明在雌激素的形成中顯然硫酸酯酶比芳香酶至少重要10倍(參見參考文獻#1的第493頁，#2的第967頁，#4的第17頁，#5的第931頁，#7的第1589頁，#8的第525頁，#9的第135頁，#10的第228頁，#11的第626和628頁和#13的第641頁)。因此，硫酸酯酶途徑是促進人乳腺癌細胞內雌激素局部形成的主要途徑。
既然雌二醇是支持激素依賴性乳房腫瘤生長的主要因素之一，而硫酸酯酶途徑又是乳房內雌二醇形成的主要途徑，因此通過抑制硫酸酯酶途來減少雌二醇的形成將對乳腺癌的治療具有潛在的治療作用(參見參考文獻#1的第493頁，#3的第55頁，#4的第17頁，#5的第931頁，#6的第123頁，#11的第631頁)。抑制硫酸酯酶途徑將具有保護乳房的作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一是提供一種連續(xù)抑制人乳腺癌細胞內硫酸酯酶的活性的連續(xù)的孕激素避孕給藥方案。
本發(fā)明還有一目的是提供一種異常抑制人乳腺癌細胞內硫酸酯酶的活性的連續(xù)的孕激素避孕給藥方案。
本發(fā)明還有一目的是提供一種連續(xù)抑制人乳腺癌細胞內雌激素的形成的連續(xù)的孕激素避孕給藥方案。
本發(fā)明還有一目的是提供一種異常抑制人乳腺癌細胞內雌激素的形成的連續(xù)的孕激素避孕給藥方案。
本發(fā)明還有一目的是提供一種連續(xù)的孕激素避孕給藥方案，該方案能將乳房與局部形成的雌激素的接觸減少到最小程度。
本發(fā)明還有一目的是提供一種連續(xù)的孕激素避孕給藥方案，與其它同等劑量的雌激素避孕給藥方案相比，該方案能減少乳房與雌激素的接觸。
本發(fā)明還有一目的是提供一種連續(xù)的孕激素避孕給藥方案，與其它同等劑量的雌激素避孕給藥方案相比，該方案中乳房與雌激素的接觸為最低水平。
本發(fā)明還有另一目的是提供一種連續(xù)的孕激素避孕給藥方案，該方案幾乎能限制乳房與該給藥方案中給藥的雌激素或體內乳房外產生的雌激素三者水平的接觸。
本發(fā)明還有另一目的是提供一種連續(xù)的孕激素避孕給藥方案，該方案能提供異常的和連續(xù)的乳房保護作用。
本發(fā)明還有另一目的是提供一種能將乳腺癌的危險因素減少到最低程度的連續(xù)的孕激素避孕給藥方案。
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發(fā)明概述本發(fā)明提供一種避孕方法，該方法包括給月經期間的女性一個周期的避孕治療的步驟，所述的治療周期包括用雌激素和孕激素以有效避孕的日劑量聯(lián)合給藥至多連續(xù)35天，其中所述的孕激素為有效的抑制硫酸酯酶的孕激素，所述的治療周期包括在上述的至多連續(xù)的35天后不用雌激素只用所述孕激素的4-8天。
本發(fā)明還提供一種用于月經期間女性給藥的避孕的治療單元，該治療單元包括一個周期的分開的劑量單位，所述劑量單位周期包括至多35個適于連續(xù)每天口服給藥的劑量單位，其中所述的劑量單位含與藥學上可接受的載體混合的有效避孕日劑量的雌激素和孕激素的聯(lián)合，其中所述的孕激素為有效的抑制硫酸酯酶的孕激素，且所述劑量單位周期包括適于連續(xù)每天口服給藥的含所述孕激素而不含雌激素的4-8個劑量單位。
本發(fā)明還提供一種用于月經期間女性給藥的避孕的治療單元，該治療單元包括一個周期的經皮貼劑，其中所述經皮貼劑周期包括適于連續(xù)給藥以提供至多連續(xù)35天治療的足夠數目的貼劑，其中所述的經皮貼劑在合適的基質中含以有效避孕的日劑量釋放的雌激素和孕激素的聯(lián)合，其中所述的孕激素為有效的抑制硫酸酯酶的孕激素，且所述經皮貼劑周期包括用于連續(xù)4-8天治療的含所述的孕激素而不含雌激素的貼劑。
本發(fā)明還提供一種用于月經期間女性給藥的避孕的治療單元，該治療單元包括一個周期的陰道環(huán)，其中所述陰道環(huán)周期包括適于連續(xù)給藥以提供至多連續(xù)35天治療的足夠數量的環(huán)，其中所述的陰道環(huán)在合適的基質中含以有效避孕的日劑量釋放的雌激素和孕激素的聯(lián)合，其中所述的孕激素為有效的抑制硫酸酯酶的孕激素，且所述陰道環(huán)周期包括用于連續(xù)4-8天治療的含所述的孕激素而不含雌激素的環(huán)。
申請人出乎意料地發(fā)現(xiàn)與其它用同等劑量的雌激素避孕的給藥方案相比，這種連續(xù)的孕激素給藥方案有望減少乳房內雌激素的水平。
附圖簡述附圖1-顯示了有關人乳腺癌的雌激素形成和轉化的酶催化過程。
發(fā)明詳述本發(fā)明的避孕給藥方案是給月經期間的女性一個周期接一個周期地用藥以取得長期的避孕效果。月經期間的女性是指到了育兒年齡的能生育的女性。給藥的方法可以是經皮給藥、陰道給藥或口服給藥。經皮給藥時，連續(xù)戴上合適的貼劑，并按要求更換。陰道給藥時，連續(xù)地插入合適的陰道裝置如環(huán)，并按要求更換。口服給藥時，服用每日的口服劑量單位。
許多常規(guī)的避孕給藥方案為28天一個周期，它包括21天的雌激素和孕激素的聯(lián)合用藥，緊接著是不使用這些激素的7天間歇期。在間歇期不用激素以便來月經。本文中所用到短語“連續(xù)的孕激素避孕給藥方案”是指35天或更短時間的雌激素和孕激素的聯(lián)合給藥，緊接著是不用雌激素只用孕激素以便月經的間歇期的避孕給藥方案。因此，最長周期所包括的期間為用藥的35天加上不用雌激素只用孕激素的4-8天的間歇期。優(yōu)選的周期是21天雌激素和孕激素的聯(lián)合給藥緊接著是用孕激素而不用雌激素的4-8天最優(yōu)選7天的間歇期。
在間歇期間停止雌激素的用藥通常會導致月經。本發(fā)明的一個關鍵方面是在間歇期間繼續(xù)用有效的抑制硫酸酯酶的孕激素以繼續(xù)獲得其乳房保護作用。因此，需要在整個間歇期繼續(xù)用孕激素，用藥達到的程度應為獲得乳房保護作用且又不干擾月經。可以全劑量或減少的劑量用孕激素。全劑量是指在間歇期孕激素繼續(xù)按周期中活性期間的給藥劑量或下文所述的適合于周期中活性期間給藥的孕激素的劑量用藥。減少的或最低的劑量可以是以片劑的形式釋放至口服等效于30或60mcg炔諾肟酯的劑量，或以裝置的形式釋放至體循環(huán)中等效于18或30mcg炔諾肟酯的劑量。優(yōu)選的不用雌激素以進行月經的間歇期為7天。
本發(fā)明中的連續(xù)的孕激素給藥方案可包括按固定的模式所給的活性成分劑量每天至每天或每周至每周都變化的給藥方案。在這種情況下，包括劑量變化的給藥方案一個周期接一個周期地重復。連續(xù)的孕激素給藥方案也可以是所給的活性成分的劑量沒有變化的給藥方案。無論是哪種情況，利用本發(fā)明避孕給藥方案的連續(xù)的孕激素避孕產品都是以周期的單位開方、銷售和給藥。基于一個周期的避孕產品可以是2-6個陰道環(huán)，按照其設計這些陰道環(huán)插入后每隔7、14或21天進行更換。基于一個周期的避孕產品可以是2-6個經皮貼劑，按照其設計這些帖劑粘上后每隔7、10或14天進行更換?；谝粋€周期的避孕產品可以是28、35或42個片劑，這些片劑在一個周期21/7，28/7或35/7內每日口服。
雌激素與孕激素聯(lián)合以足以提供避孕效果的量給藥。此外，在本文中描述的避孕給藥法中雌激素的劑量與控制周期中的出血和起斑緊密聯(lián)系在一起。在月經期之間應將出血和起斑減少至最小的程度。因此，可用足量的17α-乙炔雌二醇控制或最小化或消除周期中月經期之間的出血和起斑。
本文中的“雌激素”是指雌激素受體調節(jié)劑，它對雌激素受體要么具有激動作用要么具有拮抗作用，但優(yōu)選具有激動作用。任何常規(guī)的雌激素都可作為一種合適的成分應用于本發(fā)明的避孕給藥方案中。應選擇和應用的具體雌激素在避孕效果上等同于每天劑量約0.005-0.050mg的17α-乙炔雌二醇。所用的雌激素的優(yōu)選劑量等效于每天劑量約0.010-0.035mg的17α-乙炔雌二醇。
除了通常應用的17β-雌二醇外，還可能應用17α-乙炔雌二醇、17α-乙炔雌二醇的酯和醚如17α-乙炔雌二醇3-二甲氨基丙酸酯、17α-乙炔雌二醇3-環(huán)戊基醚(quienestrol)和17α-乙炔雌二醇3-甲基醚(炔雌醇甲醚)作為雌激素成分。也可以應用天然的雌激素如雌酮、雌酮硫酸酯、硫酸雌酮哌嗪鹽、雌二醇和雌三醇以及它們的酯。已知的用于這方面的激素有綴合的馬雌激素(CEE)或綴合的雌激素(CE)。用于本發(fā)明的合適的合成雌激素或合成的雌激素調節(jié)劑包括他莫昔芬、托瑞米芬、奧美昔芬、modrefen、呋維司曲(fulvestrant)、拉索昔芬、bazedoxifene (TSE-424)，阿佐昔芬、替米利芬、米潑昔芬、EM-652(Sch-57068)、3339(Aventis)、Ospemifene(Fc 1271A)、ERA-923、GTx-006、HM-101、DPC-974、A-007、SP-8490、WAY-140424、替勃龍、levodoxiphen、雷洛昔芬。
在日口服片劑的情況下，17α-乙炔雌二醇(或避孕等效量的合適的雌激素)優(yōu)選的給藥劑量為約0.005mg至約0.050mg，更優(yōu)選約0.010mg至約0.035mg。具體的日口服片劑可含0.015、0.020、0.025或0.035mg17α-乙炔雌二醇。在陰道環(huán)的情況下，優(yōu)選的環(huán)釋放17α-乙炔雌二醇(或避孕等效量的合適的雌激素)到體循環(huán)中的日劑量為約0.003mg至約0.030mg，更優(yōu)選約0.006mg至約0.020mg。具體的陰道環(huán)可插入一周，在此期間內釋放到體循環(huán)中的17α-乙炔雌二醇的平均日劑量為0.009、0.012、0.015或0.020mg。在經皮貼劑的情況下，優(yōu)選的帖劑釋放17α-乙炔雌二醇(或避孕等效量的合適的雌激素)到體循環(huán)中的日劑量為約0.003mg至約0.030mg，更優(yōu)選約0.006mg至約0.020mg。具體的貼劑可戴上一周，在此期間內釋放至皮膚表面的17α-乙炔雌二醇的平均日劑量為0.009、0.012、0.015或0.020mg。不管是上述的哪種情況，本發(fā)明均使用雌激素的常規(guī)劑量，因為雌激素的成分不是本發(fā)明的關鍵。本領域的技術人員很容易理解在避孕給藥方案中所需雌激素需要的劑量。
本文中有效抑制硫酸酯酶的孕激素定義為這樣一種孕激素，該孕激素(或與其基本代謝物一起的孕激素)在MCF-7或T-47D乳腺癌細胞系中將E1S轉化為E2的IC50與諾孕曲明相應的IC50大約相等或比它低。有效抑制硫酸酯酶的孕激素也可以是這樣一種孕激素，該孕激素(或與其基本代謝物一起的孕激素)在MCF-7或T-47D乳腺癌細胞系中將E1S轉化為E2的IC50基本上低于醋酸甲羥孕酮相應的IC50，例如約為醋酸甲羥孕酮IC50的1/3、1/2或1/5倍。有效抑制硫酸酯酶的孕激素也可以定義為這樣一種孕激素，該孕激素(或與其基本代謝物一起的孕激素)在MCF-7或T-47D乳腺癌細胞系中將E1S轉化為E2的IC50為醋酸甲羥孕酮(MPA)相應的IC50的最多約1/10，或優(yōu)選地約為1/100。有效抑制硫酸酯酶的孕激素也可定義為這樣一種孕激素，該孕激素(或與其基本代謝物一起的孕激素)在試驗中以50×10- 6mol/l的濃度應用時對MCF-7或T-47D乳腺癌細胞系中E1S轉化為E2的抑制為至少約70％，優(yōu)選至少約90％。
炔諾肟酯(NGM)或諾孕曲明(NGMN)為本發(fā)明使用的優(yōu)選的孕激素，均屬于避孕治療領域已知的孕激素。事實上，現(xiàn)在許多市售的避孕產品中都使用了炔諾肟酯。最優(yōu)選的孕激素為諾孕曲明(17-d-炔諾肟酯)。諾孕曲明是人體內炔諾肟酯的主要代謝產物，80％或更高的炔諾肟酯在體內轉化為諾孕曲明。因此，對硫酸酯酶活性的抑制顯示的是諾孕曲明的作用，據推斷是炔諾肟酯的作用。當然，與任何劑量的諾孕曲明比較，為獲得對硫酸酯酶活性(但不是孕激素效應)同等的抑制，必須應用比諾孕曲明略大劑量的炔諾肟酯。
將雌激素與足量的孕激素聯(lián)合給藥，其量足以產生避孕效果。孕激素還將對抗雌激素對子宮內膜的作用。已經發(fā)現(xiàn)長期應用雌激素而不應用孕激素對抗其作用，會導致子宮內膜癌發(fā)生率的顯著增加。因此，在避孕的給藥方案中還要求應用孕激素，其量為有效地保護子宮內膜的量。
按照本發(fā)明，額外地要求孕激素以有效保護乳房的量應用。更具體地說，在有效保護乳房的或其它適量的孕激素的第一種特征中，所選擇和應用的足量的抑制硫酸酯酶的孕激素在避孕和乳房保護作用方面至少等效于約0.030mg至約0.500mg口服的炔諾肟酯。優(yōu)選地，所選擇和應用的足量的抑制硫酸酯酶的孕激素在避孕和乳房保護作用方面至少等效于約0.050mg至約0.300mg口服的炔諾肟酯。在乳房保護量的孕激素或假定的有效避孕量的另一種特征中，所應用的足量的活性化合物在每天的基本時間期間基本抑制硫酸酯酶的活性，例如抑制50％或更高，優(yōu)選67％或更高以及最優(yōu)選75％或更高的活性。一天的基本時間是指至少4小時的期間，但在本發(fā)明中也可能指至少8小時或12小時甚至24小時的期間。在日口服片劑的情況下，所應用的炔諾肟酯或諾孕曲明(或等效避孕量的合適的孕激素)的優(yōu)選劑量為約30mcg至約500mcg，更優(yōu)選約50mcg至約300mcg。具體的日口服片可含125、180、215、250或300mcg炔諾肟酯或諾孕曲明。在陰道環(huán)的情況下，優(yōu)選的環(huán)釋放炔諾肟酯或諾孕曲明(或等效避孕量的合適的孕激素)到體循環(huán)中的日劑量為約18mcg至約300mcg，更優(yōu)選30mcg至約175mcg。具體的陰道環(huán)可插入一周，且在此期間內釋放炔諾肟酯或諾孕曲明到體循環(huán)中的平均日劑量為70、100、125、140或175mcg。在經皮貼劑的情況下，優(yōu)選的貼劑釋放炔諾肟酯或諾孕曲明(或等效避孕量的合適的孕激素)到體循環(huán)中的日劑量為約18mcg至約300mcg，更優(yōu)選約30mcg至約175mcg。具體的貼劑可戴一周，且在此期間內釋放炔諾肟酯或諾孕曲明到體循環(huán)中的平均日劑量為70、100、125、140或175mcg。
表1中公開了本發(fā)明優(yōu)選的每天口服的連續(xù)的孕激素避孕給藥方案，其中所用的藥物含炔諾肟酯(NGM)或諾孕曲明(NGMN)和17α-乙炔雌二醇(EE)。在間歇期用不含激素的安慰劑，在活性期用含報告中含激素的單一的片劑。
表1



表2中公開了本發(fā)明優(yōu)選的避孕經皮給藥方案或陰道環(huán)給藥方案，該給藥方案使用含炔諾肟酯(NGM)或諾孕曲明(NGMN)和17α-乙炔雌二醇(EE)的周貼劑或環(huán)。周貼劑或環(huán)將報告中平均日劑量的NGM或NGMN或EE釋放至體循環(huán)中。
表2



雌激素和孕激素成分優(yōu)選以含藥學上可接受的無毒載體的片劑形式一起口服給藥，但也可分開給藥。合適的載體包括碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石粉、乳糖、糖、peptin、糊精、淀粉、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉等。片劑也可含一種或多種起稀釋劑、調味劑、增溶劑、潤滑劑、懸浮劑、粘合劑或片劑崩解劑及囊化材料作用的物質。一般活性成分與常用的添加劑、載體和/或常用于蓋倫制劑中的調味劑按普遍接受的藥學操作一起加工。含激素的片劑也可含營養(yǎng)添加劑如鐵添加劑、葉酸、鈣、維生素B6、維生素B12等。在典型的片劑制造中，活性成分與噴霧干燥的乳糖、潤滑劑和著色劑一起制粒和壓縮。
口服的片劑優(yōu)選以藥物試劑盒或包裝的形式包裝，其中每日劑量按適當的給藥順序排列。因此，本發(fā)明還涉及一種含有同步、固定順序的給藥方案的片劑的藥物單元，其中劑量單位的順序或排列與每日給藥方案相對應。
雌激素和孕激素成分也可用貼劑經皮給藥，優(yōu)選一起給藥。概括地說，貼劑是這樣一種裝置，它至少含容納藥物和定量供應存儲的藥物或釋放藥物至皮膚的貯藥基質、背襯層和將裝置粘于患者身上的粘附層。該裝置可含其它層如調節(jié)釋放速率的藥物釋放速率控制層等。該裝置可含透皮增強劑以增加藥物穿透皮膚的速率。貼劑為本領域技術人員已知和了解。目前，用于某些孕激素和雌激素給藥的市售的產品中應用了貼劑。本文中描述的具體的貼劑及類固醇的這類應用在美國專利5474783；5656286；5958446；6024976；5252334；5006342；和4906463中有描述。
雌激素和孕激素成分也可用環(huán)陰道內給藥，優(yōu)選一起給藥。概括地說，環(huán)是具有彈性部分或體的裝置，其中活性的類固醇分散于彈性部分或體中，彈性部分或體起儲庫的作用并定量將活性成分分散到陰道內表面。環(huán)可完全由含均勻分散其間的類固醇的彈性體構成，如美國專利3545397中所述。環(huán)可具有的惰性內芯，該內芯被含活性成分的彈性層包圍，如美國專利4012496中所述。環(huán)可具有彈性的含活性成分的內芯，該內芯被一層初始不含活性成分的薄彈性體層包圍。該環(huán)可具有惰性芯，該惰性芯被含活性成分的彈性層包圍并進一步被初始不含活性成分的各種厚度的彈性外層包圍，如美國專利4292965所述。彈性體、環(huán)的層狀設計、其表面積、活性成分的濃度、活性成分的特性等都結合起來決定活性成分的釋放速率。環(huán)為本領域技術人員已知和理解。目前，在用于某些類固醇給藥的市售產品中應用了環(huán)。更具體的環(huán)及本文中描述的類固醇的這類應用在美國專利4871543和5188835有描述。
具體實施例方式
生物實驗方法化學藥品[6，7-3H(N)]-雌甾酮硫酸酯(3H-E1S)、銨鹽(sp.act.53Ci/mmol)和[4-14C]-雌二醇(14C-E2)(sp.act.57mCi/mmol)購自New England NuclearDivision(DuPont de Nemours，Les Ulls，F(xiàn)rance)。使用前用薄層層析(TLC)在合適的系統(tǒng)中對放射性同位素進行評估。E1S、銨鹽、未標記的E1和E2(分析純)購自Sigma-Aldrich Chimle，(St Quentin Fallavier，F(xiàn)rance)。17-去乙?；谆仓Z酮(NGMN；13-乙基-17-羥基-18，19-雙去甲基-17α-孕甾-4-烯-20-炔-3-酮肟)由R.W.Johnson PharmaceuticalResearch Institute，Medicinal Chemistry Department，(Raritan，NJ，USA)贈送；醋酸甲羥孕酮(MPA，17α-乙酰氧基-6α-甲基孕甾酮)購自Sigma-Aldrich Chimie。其它所有的化學藥品級別均為市售的最高級別。
細胞培養(yǎng)讓激素依賴性MCF-7和T-47D人乳腺癌細胞系在以10mmol/lHEPES(pH 7.6)緩沖的Eagle′s Minimal Essential Medium(MEM)中生長，培養(yǎng)基中補充2mmol/l L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素-鏈霉素和胎牛血清(FCS)(A.T.G.C.，Marne-la-Vallée，F(xiàn)rance)，對于T-47D胎牛血清的濃度為5％，對于MCF-7細胞胎牛血清的濃度為10％，并在37℃下含5％CO2的潮濕空氣中孵化。培養(yǎng)基一周更換兩次。細胞每10-12天傳代一次，將其重新平鋪在75cm2的燒瓶(A.T.G.C.)中，每個燒瓶3×106個細胞。試驗前4天，將細胞轉移至含5％除去類固醇的處理的FCS的MEM中。將FCS用右旋糖苷包被的活性碳(DCC)(0.1-1％w/v，DCC-FCS)在4℃處理一整夜。本發(fā)明中使用的MCF-7和T-47D細胞系按照布達佩斯條約的規(guī)定以MCF7_JJPRD和T47D_JJPRD的流水號于2002年5月17日存儲在The Belgian Co-ordinatedCollections of Microorganisms(BCCM)，Laboratorium voorMoleculaire Biologie，Universiteit Gent，K.L.Ledeganckstraat 35，B-9000 Gent，Belgium，并能為公眾獲得，它們的保藏號分別為LMBP5862CB和LMBP 5863CB。
用[3H]-E1S孵化的人乳腺癌細胞產生的[3H]-雌二醇的分離與定量測試將預匯流的細胞在MEM-DCC-FCS中于37℃孵化4小時，孵化時基質中只加入5×10-9mol/l的[3H]-E1S(對照細胞)，或還加入溶解在乙醇中濃度為5×10-5-5×109mol/l的不同的化合物NGMN或MPA(最終濃度＜0.2％)。對照細胞只能以乙醇為媒介物。24小時后，除去培養(yǎng)基用冰水冷卻的Hank′s緩沖鹽溶液(HBSS，游離的鈣-鎂)(A.T.G.C.)洗滌細胞兩次，刮下并收集。離心過濾后，用80％乙醇處理平鋪板并在-20℃下提取的放射性物質至少24小時。測定乙醇上清液內細胞的放射性攝取量，并按照Burton.Biochem Journal 62315-323，1956描述的方法計算殘留在平鋪板上的DNA含量。加入[14C]-E2(5,000dpm)以監(jiān)測分析過程中的損失，并加入未標記的E1和E2(50μg)作為載體和對照指示劑。通過薄層層析(TLC)在硅膠60F254(Merck，Darmstadt，Germany)上以氯仿-乙酸乙酯(4∶1，v/v)溶劑系統(tǒng)展開分離整個乙醇提取物中的E2。當雌激素在254nm的紫外光下清晰可見時，切下其中適當的區(qū)域成小塊，置于裝有乙醇(0.5ml)的液體閃爍小瓶中并提取30mn。加入3ml of Opti-fluor(Packard，Rungis，F(xiàn)rance)并通過外標法以猝滅校正分析小瓶的3H和14C的含量。E2的定量計算是以占細胞總放射性的百分數計算的，并以由E1S形成的E2的fmol/mgDNA表示。
統(tǒng)計分析數據以平均值±平均值的標準偏差(SEM)的值表示。用斯徒登t-檢驗來評價平均值之間是否存在顯著性的差異；認為p值≤0.05時有顯著性的差異。
結果表3顯示了NGMN和醋酸甲羥孕酮(MPA)的濃度對激素依賴性的人乳腺癌細胞系T-47D內E1S轉化為E2的影響。數據為3次獨立試驗重復測定的平均值±SEM。加*表示與對照值(未處理的細胞)比較p≤0.05；加**表示與對照值(未處理的細胞)比較p≤0.005。
表3T-47D

表4顯示了NGMN和醋酸甲羥孕酮(MPA)的濃度對激素依賴性的人乳腺癌細胞系MCF-7內E1S轉化為E2的影響。數據為3次獨立試驗重復測定的平均值±SEM。加*表示與對照值(未處理的細胞)比較p≤0.05；加**表示與對照值(未處理的細胞)比較p≤0.005。
表4MCF-7

表5顯示了在激素依賴性的人乳腺癌細胞系MCF-7和T-47D內E1S轉化為E2的NGMN和醋酸甲羥孕酮(MPA)的IC50值。IC50值相當于對E1S轉化為E2產生50％抑制時的值，用非線性回歸分析法測定。
表5

以上詳細地描述了本發(fā)明并舉例說明了可實施的方式，對本領域的技術人員來說在不背離本發(fā)明的精神或范圍的情況下可對其基本原理進行無數變化、應用、改變和擴展是顯而易見的。應理解以上的描述僅僅是示例，本發(fā)明不限于本文中描述和說明部分的具體形式或方案。
權利要求
1.一種避孕的方法，包括給月經期間的女性一個周期的避孕治療的步驟，所述的治療周期包括用雌激素和孕激素以有效避孕的日劑量聯(lián)合給藥至多連續(xù)35天，其中所述的孕激素為有效的抑制硫酸酯酶的孕激素，所述的治療周期包括在上述的至多連續(xù)的35天后不用雌激素只用所述孕激素的4-8天。
2.一種用于月經期間女性給藥的避孕的治療單元，包括一個周期的分開的劑量單位，所述劑量單位的周期包括至多35個適于連續(xù)每天口服給藥的劑量單位，其中所述的劑量單位含與藥學上可接受的載體混合的有效避孕日劑量的雌激素和孕激素的聯(lián)合，其中所述的孕激素為有效的抑制硫酸酯酶的孕激素，且所述劑量單位的周期包括適于連續(xù)每天口服給藥的含所述的孕激素而不含雌激素的4-8個劑量單位。
3.本發(fā)明還提供一種用于月經期間女性給藥的避孕治療單元，其包括一個周期的經皮貼劑，其中所述經皮貼劑周期包括適于連續(xù)給藥以提供至多連續(xù)35天治療的足夠數目的貼劑，其中所述的經皮貼劑在合適的基質中含以有效避孕的日劑量釋放的雌激素和孕激素的聯(lián)合，其中所述的孕激素為有效的抑制硫酸酯酶的孕激素，且所述經皮貼劑周期包括用于連續(xù)4-8天治療的含所述的孕激素而不含雌激素的貼劑。
4.本發(fā)明還提供一種用于月經期間女性給藥的避孕治療單元，其包括一個周期的陰道環(huán)，其中所述陰道環(huán)周期包括適于連續(xù)給藥以提供至多連續(xù)35天治療的足夠數量的環(huán)，其中所述的陰道環(huán)在合適的基質中含以有效避孕的日劑量釋放的雌激素和孕激素的聯(lián)合，其中所述的孕激素為有效的抑制硫酸酯酶的孕激素，且所述陰道環(huán)周期包括用于連續(xù)4-8天治療的含所述的孕激素而不含雌激素的環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種避孕方法，它包括給月經期間的女性一個周期的避孕治療的步驟，所述的治療周期包括用雌激素和孕激素以有效避孕的日劑量聯(lián)合給藥至多連續(xù)35天，其中所述的孕激素為有效的抑制硫酸酯酶的孕激素，所述的治療周期包括在上述的至多連續(xù)的35天后不用雌激素只用所述孕激素的4－8天。
文檔編號A61K31/56GK1652797SQ03810716
公開日2005年8月10日 申請日期2003年3月11日 優(yōu)先權日2002年3月11日
發(fā)明者P·M·科貝爾, A·J·弗里德曼 申請人:詹森藥業(yè)有限公司