專利名稱：使用抑制素和其它免疫調(diào)節(jié)劑治療自身免疫病的制作方法
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發(fā)明的背景免疫系統(tǒng)的復(fù)雜性是了解免疫系統(tǒng)功能紊亂的一個(gè)令人膽怯的障礙。近年來，分子生物技術(shù)可洞察構(gòu)成免疫的機(jī)制和組成。免疫的故事很大程度上是淋巴細(xì)胞的故事。淋巴細(xì)胞具有非常復(fù)雜和精細(xì)的系統(tǒng)，用于彼此、與抗原呈遞細(xì)胞、外來抗原和細(xì)胞相互作用。自身免疫病的例子包括多發(fā)性硬化、類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胰島素依賴性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎和原發(fā)性膽汁性肝硬變。
多發(fā)性硬化(MS)是最普遍的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)脫髓鞘病，在北美影響350,000個(gè)(0.1％)人且全球影響110萬人。一般，認(rèn)為MS是部分由促炎CD4 T(Th1)細(xì)胞介導(dǎo)的自身免病，此細(xì)胞識(shí)別與抗原(Ag)呈遞細(xì)胞(APC)上表達(dá)的MHC II類分子相關(guān)的特異髓鞘蛋白。與其它自身免疫病相似，MS易感性與MHC HLA-D區(qū)(HLA DR2(DRβ*1501，DQβ*0602)遺傳相關(guān)。
MS是多階段的。神經(jīng)損傷發(fā)作在早期發(fā)生，其組織學(xué)特征是炎性損傷包含顯著的CD4 T細(xì)胞、B細(xì)胞、MHC II類陽性巨噬細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是居留CNS抗原呈遞細(xì)胞(APC)。多次急性發(fā)作后，通常接著產(chǎn)生慢性“繼發(fā)性進(jìn)行性”階段，伴隨持續(xù)神經(jīng)損傷。此“不可逆”階段的特征是神經(jīng)元損失和萎縮。
在美國，2種IFN-β藥物avonex(IFN-β1a)和betaseron(IFN-β1b)以及copaxone(乙酸格拉太咪爾)批準(zhǔn)用于治療早期炎性“復(fù)發(fā)性-緩解性”階段。IFNβ以非抗原特異方式發(fā)揮一些作用，而copaxone似乎優(yōu)選影響地CNS自身抗原特異的T細(xì)胞。諾凡特龍是干擾DNA修復(fù)的癌癥化療劑，已批準(zhǔn)用于治療繼發(fā)性進(jìn)行性MS。除了它們的副作用和潛在毒性，這些藥物僅部分有效，更需要開發(fā)新的免疫調(diào)節(jié)MS療法。
稱為“抑制素”的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑由于其在防止動(dòng)脈粥樣化形成中降低膽固醇效果被批準(zhǔn)，有證據(jù)表明它們可能有益于治療炎性疾病。在1995年，報(bào)導(dǎo)普代他汀治療心臟移植病人與血液動(dòng)力學(xué)上顯著排斥發(fā)作減少和存活增加相關(guān)，不取決于其降低膽固醇效果。已知HMG-CoA還原酶產(chǎn)物甲羥戊酸鹽的代謝物參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的特異蛋白的翻譯后修飾(異戊二烯化)和細(xì)胞分化。然而，當(dāng)證明洛伐他汀抑制小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞生成氧化氮合酶(iNOS)和促炎細(xì)胞因子(TNFα、IL-1β和IL-6)時(shí)，更加理解了開發(fā)抑制素的潛在免疫調(diào)節(jié)效果，星形膠質(zhì)細(xì)胞是另一種CNS APC。觀察到抑制素抑制iNOS分泌，提示它們也可能有神經(jīng)保護(hù)作用。
抑制素通過抑制II類表達(dá)的主調(diào)節(jié)物MHC II型反式激活蛋白(CIITA)在IFN-γ-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(p)pIV的轉(zhuǎn)錄來防止非消化性APC上的IFN-γ-誘導(dǎo)型II類表達(dá)，但不改變使用pl的樹突細(xì)胞或使用plll的B細(xì)胞中的組成型表達(dá)。因此，抑制素可通過非消化性居留CNS APC抑制抗原呈遞。
抑制素抑制淋巴細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)，此酶參與基膜降解和跨內(nèi)皮屏障遷移，內(nèi)皮屏障包括血腦屏障。抑制素結(jié)合淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)并防止與其配基ICAM-1相互作用和T細(xì)胞活化，這不取決于HMG-CoA還原酶抑制，LFA-1是β2-整聯(lián)蛋白。這些發(fā)現(xiàn)提示抑制素可能在MS的病原級(jí)聯(lián)的多個(gè)步驟中具有益的效果。與當(dāng)前腸胃外施用的MS治療相反，抑制素口服給予且耐受好。由于抑制素的活性似乎與目前批準(zhǔn)的MS治療不同，除了認(rèn)為是單藥治療的候選的，它們也能用于聯(lián)合治療。
自身免疫病的其它例子包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胰島素依賴性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎和原發(fā)性膽汁性肝硬變。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是慢性自身免疫炎性滑膜炎，影響0.8％的全球人口。其特征是導(dǎo)致侵蝕性關(guān)節(jié)破壞的慢性炎性滑膜炎。RA由T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)。
人I型或胰島素依賴性糖尿病(IDDM)的特征是自身免疫性破壞郎格漢斯胰島的β細(xì)胞。耗竭β細(xì)胞導(dǎo)致不能調(diào)節(jié)血液中的葡萄糖水平。在人類中，糖尿病發(fā)作前有一段長的癥狀前階段。在此階段期間，胰腺β細(xì)胞功能逐漸喪失。糖尿病發(fā)展包括存在自身抗體抗胰島素、谷氨酸脫羧酶和酪氨酸磷酸酶IA2(IA2)，它們各自是根據(jù)本發(fā)明的自身-蛋白、-多肽或-肽的例子。
自身免疫性葡萄膜炎是眼部的自身免疫病，估計(jì)影響400,000個(gè)人，在美國的發(fā)病率為每年43,000個(gè)新病例。自身免疫性葡萄膜炎目前用類固醇、免疫抑制劑如甲氨蝶呤和環(huán)孢菌素、靜脈內(nèi)免疫球蛋白和TNFα-拮抗物治療。
原發(fā)性膽汁性肝硬變(PBC)是器官特異性自身免疫病，主要影響40-60歲間的女性。此群體中報(bào)導(dǎo)的流行率接近每1,000人1個(gè)。PBC的特征是進(jìn)行性破壞肝內(nèi)膽上皮細(xì)胞(IBEC)，IBEC襯入小肝內(nèi)膽管。這導(dǎo)致妨礙和干擾膽汁分泌，最終引起硬化。已報(bào)導(dǎo)與其它的免疫病相關(guān)的特征是上皮襯(lining)/分泌系統(tǒng)損害，包括舍格倫綜合征、肢端硬皮綜合征、自身免疫性甲狀腺病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
發(fā)明概述本發(fā)明提供治療自身免疫病的方法，通過共施用有效量的抑制素和第2種免疫調(diào)節(jié)劑給罹患疾病的病人?？筛鶕?jù)本文所提供方法治療的自身免疫病包括例如多發(fā)性硬化、胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或自身免疫性葡萄膜炎。自身免疫病可以是多階段的，例如脫髓鞘自身免疫病(如多發(fā)性硬化)。
在一些實(shí)施方案中，抑制素在自身免疫病開始發(fā)作后施用。例如，抑制素能在疾病緩解階段或主動(dòng)發(fā)作期間施用。抑制素可以是例如羅蘇伐他汀、美伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、昔伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀或西伐他汀。
在發(fā)明的一些實(shí)施方案中，第2種免疫調(diào)節(jié)劑抗原特異。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑是自身載體，包括編碼自身免疫病相關(guān)的自身多肽的多核苷酸。多核苷酸編碼的自身多肽可以是例如蛋白或肽。在一些實(shí)施方案中，包含多核苷酸的自身載體編碼一種自身多肽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑是多肽。多肽可以是例如蛋白或肽。此外，多肽可包括疾病相關(guān)的自身多肽或能包括對(duì)應(yīng)于疾病相關(guān)的自身多肽的自身抗原表位的氨基酸。在多肽包括對(duì)應(yīng)于自身抗原表位的氨基酸的實(shí)施方案中，氨基酸可隨機(jī)形成隨機(jī)共聚物或有序從而多肽包括有序的氨基酸基序。在自身免疫病是脫髓鞘自身免疫病的實(shí)施方案中，有序的氨基酸基序是[1E2Y3Y4K]n，其中n從2到6。
在治療脫髓鞘自身免疫病(如多發(fā)性硬化)的實(shí)施方案中，多核苷酸編碼的多肽可以是例如髓鞘堿性蛋白(MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)、髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)、環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(CNPase)、髓鞘相關(guān)少突膠質(zhì)細(xì)胞堿性蛋白(MBOP)、髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞蛋白(MOG)或α-B晶體。脫髓鞘病可以是例如多發(fā)性硬化。
在治療胰島素依賴性糖尿病的實(shí)施方案中，多核苷酸編碼的自身多肽可以是例如胰島素、胰島素B鏈、前胰島素原、胰島素原、谷氨酸脫羧酶(65kDa或67kDa形式)、酪氨酸磷酸酶IA2或IA-2b、羧肽酶H、熱激蛋白、glima38、島細(xì)胞抗原的69kDa形式、p52或島細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子(GLUT2)。在一些實(shí)施方案中，含多核苷酸的自身載體編碼一種自身多肽例如前胰島素原或胰島素B鏈9-23。
在其它實(shí)施方案中，自身免疫病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。當(dāng)治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎時(shí)，多核苷酸編碼的多肽可以是例如II型膠原；hnRNP A2/RA33；Sa；聚絲蛋白；角蛋白；包含gp39的軟骨蛋白；I、III、IV、V、IX、XI型膠原；HSP-65/60；RNA聚合酶；hnRNP-B1；hnRNP-D；或醛縮酶A。
在治療自身免疫性葡萄膜炎的實(shí)施方案中，多核苷酸編碼的多肽可以是例如S抗原、光受體間類視黃醇結(jié)合蛋白(IRBP)、視紫質(zhì)或恢復(fù)蛋白。
在其它實(shí)施方案中，第2種免疫調(diào)節(jié)劑是非抗原特異的。在一個(gè)實(shí)施方案中，非抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑是骨橋蛋白或自身載體，自身載體包括編碼骨橋蛋白的多核苷酸。在另外的實(shí)施方案中，非抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑是免疫調(diào)節(jié)序列。免疫調(diào)節(jié)序列可以是例如5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’或5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶3’，其中X和Y是任何天然產(chǎn)生或合成的核苷酸，除了X和Y不能是胞嘧啶-鳥嘌呤。
附圖簡述

圖1.通過口服阿托伐他汀防止和治療EAE。在C57B1/6小鼠中MOG p35-55-誘導(dǎo)的EAE發(fā)作時(shí)治療防止臨床惡化(A，每組7只小鼠)，而發(fā)作后治療改善EAE(B，每組14只小鼠)。在SJL/J小鼠中PLP p139-151-誘導(dǎo)的EAE發(fā)作時(shí)治療防止復(fù)發(fā)(C，每組10只小鼠)，而急性EAE開始后治療逆轉(zhuǎn)EAE復(fù)發(fā)(D，每組10只小鼠)，防止MBP Ac1-11 Tg小鼠中MBP Ac1-11誘導(dǎo)的急性EAE(E，每組6只小鼠)。各圖下的水平柱表示阿托伐他汀治療階段。平均EAE分?jǐn)?shù)根據(jù)EAE誘導(dǎo)后的天數(shù)作圖。
圖2.阿托伐他汀治療腦中單核浸潤的減少。
圖3.阿托伐他汀體內(nèi)下調(diào)CNS中的不同CIITA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。治療3組SJL小鼠1mg/kg或10mg/kg阿托伐他汀或僅PBS12天。治療開始后2天，EAE用PLP139-151/CFA在這些小鼠中誘導(dǎo)。在治療第12天(相當(dāng)于EAE的第10天)，殺死每組的2只小鼠和2只原首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠?？俁NA提取自腦且總CIITA表達(dá)和特異性CIITA表達(dá)用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)分析。(A)顯示所有CIITA mRNA轉(zhuǎn)錄物的總表達(dá)(如內(nèi)部轉(zhuǎn)錄物所證明)，(B)顯示形式I或設(shè)計(jì)啟動(dòng)子I(PI，對(duì)樹突細(xì)胞特異)的特異性表達(dá)，(C)顯示形式III或設(shè)計(jì)啟動(dòng)子III(PIII，對(duì)B細(xì)胞特異)的特異性表達(dá)和(D)顯示形式IV或設(shè)計(jì)啟動(dòng)子IV(PIV，IFN-γ誘導(dǎo)形式且對(duì)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異)的特異性表達(dá)。平均轉(zhuǎn)錄物拷貝根據(jù)治療組作圖。星號(hào)表示各情況中阿托伐他汀治療或原初組相比PBS治療組沒有統(tǒng)計(jì)上顯著的差異(p0.05，單向ANOVA測試)。
圖4.阿托伐他汀抑制增殖并促進(jìn)Th2細(xì)胞因子偏性。(A)來自阿托伐他汀治療和載體治療PLP p139-151免疫小鼠的PLP p139-151-刺激脾細(xì)胞的增殖反應(yīng)。阿托伐他汀治療與IL-2(B)和IFN-γ(C)分泌減少、IL-4(D)和IL-10(10mg/kg阿托伐他汀)(E)生成增加相關(guān)。增殖通過3H-胸苷結(jié)合測量，細(xì)胞因子通過ELISA測量。
圖5.(A)進(jìn)行抗磷STAT6-特異Western以確定小鼠中的STAT6活化程度，小鼠用PBS(1泳道)、1mg/kg阿托伐他汀(2泳道)、10mg/kg阿托伐他汀(3泳道)或mrIL-4(10ng/ml)處理淋巴細(xì)胞(4泳道)治療。樣品獲得自不同組小鼠排出淋巴結(jié)細(xì)胞的蛋白裂解物。如正對(duì)照(4泳道)所見，IL-4治療和阿托伐他汀治療活化淋巴結(jié)細(xì)胞中預(yù)期的105kDa STAT6異構(gòu)體(B和C)。剝下相同的印跡并用抗Stat6(B)或小鼠CD3(C)的抗體作為對(duì)照再探測以確保各泳道上樣相等。所示數(shù)據(jù)代表2個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行的2次不同Western印跡。分子量以千道爾頓表示。
圖6A.編碼來自自身蛋白蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)的肽的DNA減少T細(xì)胞增殖反應(yīng)。淋巴結(jié)細(xì)胞(LNC)對(duì)于PLP139-151的增殖反應(yīng)在DNA接種小鼠中降低。從疾病急性階段恢復(fù)后，殺死注射編碼PLP139-151(A)或?qū)φ蛰d體pTarget(B)的DNA的動(dòng)物，分離排出的LNC。通過不同濃度的肽PLP139-151(正方形)或?qū)φ针腜LP178-191(三角形)刺激來體外測試細(xì)胞。來自5只動(dòng)物組的集合的LNC增殖反應(yīng)表示為一式三份孔的平均CPM±SD。伴刀豆球蛋白A(0.001mg/ml)刺激LNC的CPM對(duì)于組A是102401，對(duì)于組B是76702。
圖6B.在ELISA分析基礎(chǔ)上，細(xì)胞因子水平在來自DNA免疫動(dòng)物的LNC中減少。EAE急性期后，來自5只動(dòng)物組的LNC體外用免疫肽PLP139-151刺激，動(dòng)物用編碼PLP139-151的質(zhì)粒DNA或單用載體(pTarget)接種。γ-干擾素(條紋柱)或IL-2(虛線柱)的水平通過ELISA在上清中測試并與已知標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照比較。結(jié)果以ng/ml表示。
圖6C.在RNA酶保護(hù)測定基礎(chǔ)上，細(xì)胞因子水平在來自DNA免疫動(dòng)物的LNC中減少。對(duì)于細(xì)胞因子mRNA檢測，來自實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦的RNA樣品用多探針RNA酶保護(hù)測定測試且反應(yīng)用5％聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。在走電泳結(jié)束時(shí)干燥凝膠并對(duì)X光膠片曝光。
圖7.有抑制IMS的多核苷酸治療抑制PLP139-151介導(dǎo)的EAE。在第0天，7周齡雌性SJL/J小鼠用PBS中的100μg PLP139-151皮下免疫，PLP139-151在CFA中乳化，由IFA和0.5mg熱殺傷結(jié)核分支桿菌組成。在第7天開始每天給動(dòng)物臨床打分。在第12天，小鼠用PBS中的總共0.1ml 0.25％鹽酸布比卡因注射兩個(gè)四頭肌。2天后，所選小鼠肌肉內(nèi)注射兩個(gè)四頭肌，注射用0.2ml TE總體積中各單獨(dú)pTARGET質(zhì)粒(各25μg)上編碼全長鼠PLP、MAG、MOG和MBP的DNA多核苷酸加50μg編碼全長鼠IL-4的pTARGET質(zhì)粒。DNA注射以每周間隔給予6周。與初始DNA治療同時(shí)，200μlPBS體積中50μgIMS單獨(dú)腹膜內(nèi)施用或結(jié)合DNA多核苷酸治療。IMS每隔一周給予，連續(xù)6周。
圖8是描述有序肽治療大鼠中防止EAE的圖。圖例有序肽{SEQ ID NO4}EYYKEYYKEYYK防止劉易斯大鼠中EAE的發(fā)展。動(dòng)物用完全弗氏佐劑中0.1mgMBPp85-99乳劑注射，用于誘導(dǎo)EAE。10天后，當(dāng)疾病的臨床癥狀明顯時(shí)，施用腹膜內(nèi)單劑量肽{SEQ ID NO4}EYYKEYYKEYYK(正方形)、{SEQ ID NO5}KYYKYYKYYKYY(三角形)或PBS(圓形)。結(jié)果表示為6只動(dòng)物組的平均疾病分?jǐn)?shù)。
圖9A.1mg/kg阿托伐他汀結(jié)合編碼自身蛋白蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)的DNA減少EAE嚴(yán)重性。在第0天，7周齡雌性SJL/J小鼠用PBS中的100μgPLP139-151皮下免疫，PLP139-151在CFA中乳化，由IFA和0.5mg熱殺傷結(jié)核分支桿菌組成。在第7天開始每天給動(dòng)物臨床打分。在第15天，小鼠用PSB中總共0.1ml0.25％鹽酸布比卡因注射兩個(gè)四頭肌。2天后，小鼠隨機(jī)分成治療組并用0.2ml TE總體積中的DNA多核苷酸肌肉內(nèi)注射兩個(gè)四頭肌，DNA多核苷酸編碼全長鼠PLP(50μg每小鼠)。實(shí)驗(yàn)中，DNA注射以每周間隔給予。與初始DNA治療同時(shí)，阿托伐他汀以lmg/kg劑量在0.5ml體積中口服施用。阿托伐他汀在實(shí)驗(yàn)中每天施用。對(duì)照小鼠在每日基礎(chǔ)上口服給予0.5ml PBS。每日監(jiān)控小鼠的EAE疾病并指示治療組的平均分?jǐn)?shù)。
圖9B.10mg/kg阿托伐他汀結(jié)合編碼自身蛋白蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)的DNA減少EAE嚴(yán)重性。實(shí)驗(yàn)如圖1A進(jìn)行，除了阿托伐他汀以10mg/kg施用。
圖9C.DNA治療在1mg/kg和10mg/kg阿托伐他汀劑量提供的益處相等。直接比較圖1A和1b中的數(shù)據(jù)以證明DNA效果在2個(gè)測試的阿托伐他汀劑量上相等。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明的方法提供治療自身免疫病的聯(lián)合療法，包括多階段的自身免疫病如自身免疫性脫髓鞘病(例如多發(fā)性硬化)，使用甲羥戊酸途徑抑制劑如抑制素。FDA批準(zhǔn)長期使用β-干擾素和乙酸格拉太咪爾(glatiramer)，它是髓鞘堿性蛋白(MBP)的合成形式，副作用少于干擾素。其它治療包括施用編碼自身抗原的核酸、肽和其它免疫抑制方案。其它試劑的聯(lián)合使用甲羥戊酸鹽途徑抑制劑如抑制素能具有優(yōu)勢，單獨(dú)藥物的所需劑量較低且不同藥物效果互補(bǔ)。
治療自身免疫病的聯(lián)合療法包括共施用有效劑量的甲羥戊酸鹽途徑抑制劑和有效劑量的第2種免疫調(diào)節(jié)劑給罹患疾病的病人。在較佳實(shí)施方案中，甲羥戊酸鹽途徑抑制劑是抑制素。顯示抑制素使免疫反應(yīng)轉(zhuǎn)換成調(diào)節(jié)Th2反應(yīng)，這主要通過生成IL-4和IL-10細(xì)胞因子，當(dāng)治療開始于首次發(fā)作后時(shí)能成功逆轉(zhuǎn)復(fù)發(fā)性脫髓鞘病中的癱瘓。
在一些實(shí)施方案中，第2種免疫調(diào)節(jié)劑是抗原特異的。優(yōu)選的抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑包括自身載體，其中自身載體包括編碼與疾病相關(guān)的自身多肽的多核苷酸。在其它較佳實(shí)施方案中，治療的自身免疫病是脫髓鞘病且抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑是有序肽，包括重復(fù)基序(SEQ ID NO1)[1E2Y3Y4K]n，其中n從2到6。
在發(fā)明的其它實(shí)施方案中，第2種免疫調(diào)節(jié)劑是非抗原特異的。在較佳實(shí)施方案中，非抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑是免疫調(diào)節(jié)寡核苷酸。
活性劑(甲羥戊酸鹽途徑抑制劑或免疫調(diào)節(jié)劑)可在疾病發(fā)作前、期間或之后施用。盡管受試者方法用于預(yù)防或治療目的，特定興趣是在疾病發(fā)作后共施用甲羥戊酸鹽途徑抑制劑和抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑，例如在緩解期間；疾病復(fù)發(fā)期間等。顯示當(dāng)治療起始于首次發(fā)作后時(shí)，甲羥戊酸鹽途徑抑制劑結(jié)合抗原特異性治療劑能成功逆轉(zhuǎn)復(fù)發(fā)性脫髓鞘病導(dǎo)致的癱瘓。
在更詳細(xì)陳述發(fā)明前，闡明下文所用一些術(shù)語的定義有助于進(jìn)一步理解。
定義除非另有定義，本文所用全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的意義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同。盡管任何類似于本文所述的方法和材料能用于實(shí)踐或測試本發(fā)明，僅描述示范方法和材料。為了本發(fā)明目的，下列術(shù)語定義于下。
如本文所用，術(shù)語“一”、“該”是非限制性且包括復(fù)數(shù)所指的對(duì)象，除非上下文另有明確說明。因此，例如提到“一個(gè)復(fù)合體”包括多種這種復(fù)合體，提到“制劑”包括一種或多種制劑和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等價(jià)物等。
如本文所用，術(shù)語“治療”用于指防止疾病和治療先存在的疾病。
術(shù)語“自身免疫病”指具有發(fā)病機(jī)制特征至少部分是適應(yīng)性免疫的任何病癥，免疫誤導(dǎo)向健康細(xì)胞和/或身體組織。自身免疫病的特征是異常靶自身分子(如自身多肽)的T和/或B淋巴細(xì)胞，引起體內(nèi)器官、組織或細(xì)胞類型(如胰腺、腦、甲狀腺或胃腸道)損傷和/或功能失常。自身免疫病包括影響特定組織以及多種組織的紊亂。此外，如本文所用，術(shù)語“自身免疫病”可包括疾病的急性、慢性和/或復(fù)發(fā)-緩解形式。自身免疫病的例子包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、移植物抗宿主病(GvHD)、炎性腸病(IBD)、胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、多發(fā)性硬化、原發(fā)性膽汁性肝硬變、系統(tǒng)性硬化、牛皮癬、自身免疫性甲狀腺炎和自身免疫性血小板減少性紫癜。
“受試者”或“病人”指任何動(dòng)物，例如人、非人的靈長類動(dòng)物、馬、牛、狗、貓、小鼠、大鼠、豚鼠或兔。
如本文所用，術(shù)語“分子”、“化合物”和“試劑”同義且廣泛用于指潛在能經(jīng)非共價(jià)相互作用與蛋白在結(jié)構(gòu)上相互作用的分子，例如經(jīng)氫鍵、離子鍵、范德華引力或疏水相互作用。例如，試劑通常包括與蛋白在結(jié)構(gòu)上相互作用必需的官能團(tuán)，特定是參與氫鍵的基團(tuán)。試劑可包括例如小分子藥物；肽，包括變體類似物、同系物、修飾肽或肽類似物質(zhì)如肽模擬物或類肽；或蛋白、其片段。試劑可以是非天然產(chǎn)生，由體外方法生成，或可以是天然產(chǎn)生，例如細(xì)胞中內(nèi)源表達(dá)的蛋白或其片段或者來自cDNA文庫。
術(shù)語“多肽”指氨基酸和其等價(jià)物的聚合物且不指特定長度的產(chǎn)物；因此，肽、寡肽和蛋白包括在多肽定義內(nèi)。“片段”指多肽部分通常有至少10個(gè)毗連氨基酸，更常有至少20個(gè)，更加常有至少50個(gè)多肽的毗連氨基酸。衍生物是與另外序列相比，有保守或非保守氨基酸取代的多肽。衍生物進(jìn)一步包括例如糖基化、乙?；?、磷酸化等?！岸嚯摹倍x內(nèi)進(jìn)一步包括例如一種或多種氨基酸類似物(如非天然或“非經(jīng)典”氨基酸等)、有取代鍵以及本領(lǐng)域已知其它修飾的多肽，它們天然和非天然產(chǎn)生。因此，“多肽”可包括藥學(xué)上可接受多肽的鹽。
如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受鹽”指無機(jī)酸加成鹽如氫氯化物、硫酸鹽和磷酸鹽，或有機(jī)酸加成鹽如乙酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、酒石酸鹽和檸檬酸鹽。藥學(xué)上可接受金屬鹽的例子是堿性金屬鹽如鈉鹽和鉀鹽，堿土金屬鹽如鎂鹽和鈣鹽、鋁鹽和鋅鹽。藥學(xué)上可接受銨鹽的例子是銨鹽和四甲基銨鹽。藥學(xué)上可接受有機(jī)胺加成鹽的例子是有嗎啉和哌啶的鹽。藥學(xué)上可接受氨基酸加成鹽的例子是有賴氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸的鹽。
如本文所用，術(shù)語“自身多肽”指動(dòng)物基因組內(nèi)編碼的任何多肽或其片段或衍生物，它在動(dòng)物中表達(dá)，可在動(dòng)物生命中的某一時(shí)間翻譯后修飾并作為自體抗原(即自身抗原)與自身免疫病相關(guān)。自身多肽的翻譯后修飾的例子是糖基化，加入脂基、通過磷酸酶去磷酸化、加入二甲基精氨酸殘基、通過肽基精氨酸脫亞氨酶(PAD)聚絲蛋白和纖維蛋白的瓜氨酸化(citrullination)；αB晶體磷酸化；MBP的瓜氨酸化；通過半胱天冬酶和粒酶的SLE自身抗原蛋白水解?！翱乖敝改鼙幻庖叻磻?yīng)的組分如淋巴細(xì)胞或抗體特異識(shí)別的任何分子。自身多肽不包括免疫蛋白，免疫蛋白是由免疫系統(tǒng)的細(xì)胞特異和專一表達(dá)的分子，用于調(diào)節(jié)免疫功能。一些包括于自身多肽定義的免疫蛋白是MHC I類膜糖蛋白、MHC II類糖蛋白和骨橋蛋白。
“自身載體”指載體包括編碼自身多肽的多核苷酸，是DNA或RNA。如本文所用，多核苷酸是一系列包括DNA的脫氧核糖核酸或包括RNA的核糖核酸及它們的衍生物。自身多肽編碼序列插入適當(dāng)質(zhì)粒表達(dá)自身盒。一旦編碼自身多肽的多核苷酸插入表達(dá)自身盒，它稱為“自身載體”。在待施用的多核苷酸編碼超過一種自身多肽的情況中，單個(gè)自身載體可編碼多種不同自身多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼一些自身多肽的DNA在單個(gè)自身質(zhì)粒中連續(xù)編碼，使用內(nèi)部核糖體再進(jìn)入序列(IRES)或其它方法以從單個(gè)DNA分子表達(dá)多種蛋白。制備編碼自身多肽的DNA表達(dá)自身載體并用分離質(zhì)粒DNA的常用技術(shù)分離，如商業(yè)購買自Qiagen公司的技術(shù)。純化DNA無細(xì)菌內(nèi)毒素，用于作為治療劑傳遞給人。另外，各自身多肽在單獨(dú)DNA表達(dá)載體上編碼。本發(fā)明涵蓋的自身載體進(jìn)一步定義于WO053019。
“質(zhì)?！焙汀拜d體”由小寫字母p和之后的字母和/或數(shù)字命名。起始質(zhì)?？缮虡I(yè)購買，可無限制地公開獲得，或能從符合發(fā)表過程的可用質(zhì)粒構(gòu)建。此外，與所述質(zhì)粒相當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒在本領(lǐng)域已知且對(duì)于普通技術(shù)人員是顯而易見的?！拜d體”或“質(zhì)?！敝溉魏芜z傳元件，它們存在于宿主細(xì)胞時(shí)能通過包括適當(dāng)控制和調(diào)節(jié)元件來復(fù)制。為了本發(fā)明目的，載體或質(zhì)粒的例子包括但不限于質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、病毒等。
“轉(zhuǎn)染”指將DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞從而表達(dá)DNA，無論是功能性表達(dá)或其它；DNA也可作為染色體外元件或通過染色體整合來復(fù)制。除非另有說明，本文所用轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法是磷酸鈣共沉淀方法，Graham和van der Eb(1973)Virology52，456-457。另外的轉(zhuǎn)染方法是電穿孔、DEAE-葡聚糖方法、脂轉(zhuǎn)染和生物導(dǎo)彈術(shù)(Kriegler(1990)《基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)實(shí)驗(yàn)室手冊》(Gene Transfer and ExpressionALaboratory Manual)，Stockton Press)。
如本文所用，關(guān)于試劑的“抗原特異”指試劑能與抗原識(shí)別分子(如T細(xì)胞受體、B細(xì)胞上的表面IgM)特異地相互作用，以區(qū)分同類但有不同抗原特異性的抗原識(shí)別分子。由于抗原識(shí)別分子通常無性地分布于B或T淋巴細(xì)胞，活性抗原特異性試劑能對(duì)特定淋巴細(xì)胞亞群產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)作用，此亞群表達(dá)與試劑相互作用的特定抗原識(shí)別分子。試劑與抗原識(shí)別分子的相互作用可以是例如在其它分子相互作用中，如肽抗原結(jié)合T細(xì)胞受體作為肽MHC復(fù)合體。
如本文所用，“調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)”指體外或體內(nèi)現(xiàn)有或潛在免疫反應(yīng)的任何改變。在自身免疫病中，這種改變是抗自身分子的免疫反應(yīng)的改變。調(diào)節(jié)可包括任何免疫細(xì)胞(如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞等)中存在或功能的任何改變，這些細(xì)胞參與或有參與免疫反應(yīng)的潛力。調(diào)節(jié)包括例如免疫細(xì)胞中作為免疫反應(yīng)部分的基因、蛋白和/或其它分子表達(dá)和/或功能的改變；去除、缺失或鰲合免疫細(xì)胞；誘導(dǎo)或產(chǎn)生能調(diào)節(jié)其它細(xì)胞功能的免疫細(xì)胞，例如自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞(APCs)或炎性細(xì)胞；在免疫細(xì)胞中誘導(dǎo)無反應(yīng)狀態(tài)(如無反應(yīng)性)；或者增加、減少或改變免疫細(xì)胞的活性或功能。免疫細(xì)胞表達(dá)蛋白的模式改變可包括例如某些分子種類生成和/或分泌的改變，如細(xì)胞因子(例如IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4)、趨化因子、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子(例如NF-κB)、激酶(例如Lock、Lyn)、磷酸酶(例如(PTP-1C、PTP-1D)、共刺激分子(例如B7.1/B7.2、CTLA-4、CD40、ICAM、LFA-1)或其它細(xì)胞表面受體。
如本文所用，“免疫調(diào)節(jié)序列(IMSs)”指試劑由脫氧核苷酸、核糖核苷酸或其類似物組成，它們調(diào)節(jié)自身免疫或炎性疾病。IMSs可以是寡核苷酸或摻入載體的核苷酸序列。根據(jù)本文提供方法使用的IMSs進(jìn)一步描述于美國專利申請(qǐng)?zhí)?0/302098，全部納入本文供參考。
如本文所用，“免疫調(diào)節(jié)劑”指能調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)的分子。免疫調(diào)節(jié)劑可以是例如核酸(如DNA)或多肽(如蛋白、糖蛋白、肽等)。另外，免疫調(diào)節(jié)劑可抗原特異(如多肽包括自身抗原表位或與自身抗原表位免疫交叉反應(yīng))或非抗原特異(如細(xì)胞因子、白介素、干擾素或免疫調(diào)節(jié)序列)。免疫調(diào)節(jié)多肽可包括多肽的重組或合成形式。免疫調(diào)節(jié)多肽可包括例如包含與尋求治療疾病相關(guān)的自身抗原的多肽，或另外與自身抗原免疫交叉反應(yīng)的多肽。此外，免疫調(diào)節(jié)多肽可包括例如細(xì)胞因子(或其功能片段)如白介素、干擾素或集落刺激因子。免疫調(diào)節(jié)多肽可包括例如趨化因子或共刺激分子或其功能片段。天然蛋白是膜結(jié)合分子(例如受體如細(xì)胞因子受體(如TNF-αR、IL-2R)或共刺激分子例如CD40、CTLA-4或B7分子)時(shí)，本文所述方法中使用的免疫調(diào)節(jié)多肽可以是蛋白的可溶形式，例如Ig融合蛋白。制備可溶性Ig融合重組形式受體的方法在本領(lǐng)域已知(參見例如美國專利號(hào)5,750,375)。
術(shù)語“活性劑”指能調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的任何試劑。
如本文所用，術(shù)語“有效量”和“有效劑量”同義。施用試劑(抑制素、自身載體或有序肽)中的“有效劑量”指分子量足以調(diào)節(jié)受試者中的自身免疫反應(yīng)，從而抑制受試者中靶自身免疫反應(yīng)發(fā)生或改善一種或多種癥狀。因此，試劑的有效劑量是當(dāng)施用適當(dāng)時(shí)間段時(shí)自身免疫病的嚴(yán)重性明顯減少的劑量。自身免疫病的嚴(yán)重性明顯減少的適當(dāng)施用時(shí)間段通常至少約1周，可以是約2周或更多，直至約4周的時(shí)間段。本領(lǐng)域技術(shù)人員要理解的是，初始劑量可施用于這些時(shí)間段，接著是維持劑量，在一些病例中維持劑量是減少的劑量。
此外，有效量的抑制素、自身載體或有序肽根據(jù)本發(fā)明方法以“有效方案”施用。術(shù)語“有效方案”指試劑量與劑量頻率的組合足以完成治療或防止自身免疫病。
另外，聯(lián)合療法(如抑制素加自身載體或抑制素加有序肽)中有效量的特定試劑指當(dāng)特定試劑量與第2種活性劑共施用適當(dāng)時(shí)間段時(shí)，自身免疫病的嚴(yán)重性相比單用第2種活性劑觀察到的明顯減少。在一些實(shí)施方案中，試劑組合產(chǎn)生協(xié)同療效。如本文所用，“協(xié)同”指大于添加。在發(fā)明的其它實(shí)施方案中，施用有效量的第2種活性劑能降低第一種試劑量，此量需使自身免疫病的嚴(yán)重性相比單用第一種試劑觀察到的明顯減少。第2種活性劑存在時(shí)這種試劑“有效量”減少在本文稱為“節(jié)省”，即施用第2種試劑用不首施用第一種試劑。
自身免疫病本發(fā)明提供治療或防止自身免疫病的方法。疾病進(jìn)展可通過監(jiān)控臨床或診斷癥狀來測量，使用已知方法例如下文所述方法。
可根據(jù)本文提供的方法治療的一些自身免疫病的例子描述于下。
特別感興趣的發(fā)明方法用于治療脫髓鞘病，包括多發(fā)性硬化、EAE、視神經(jīng)炎、急性橫貫性脊髓炎和急性播散性腦炎。
多發(fā)性硬化.多發(fā)性硬化的疾病進(jìn)程高度變化、不可預(yù)測，在大部分病人中是間歇性的。MS的病理標(biāo)志是多中心、多階段CNS炎癥和脫髓鞘。緩解幾個(gè)月或幾年可單獨(dú)發(fā)作，特別在疾病早期。約70％的復(fù)發(fā)-緩解(RR)類型病人的特征是急性加劇，充分或部分緩解。剩余存在慢性進(jìn)行性MS的病人再進(jìn)一步分成(a)原發(fā)性-進(jìn)行性(PP)，(b)復(fù)發(fā)-進(jìn)行性(RP)，此模式結(jié)合RR和RP的特征且臨床嚴(yán)重性處于中間，(c)繼發(fā)性-進(jìn)行性(SP)，許多患RR的病人隨著時(shí)間發(fā)展。
MS的臨床癥狀包括感覺喪失(感覺異常)、運(yùn)動(dòng)(痙攣狀態(tài)繼發(fā)的肌肉痛性痙攣)和自主(膀胱、腸、性功能障礙)的脊髓癥狀；小腦癥狀(如查科三聯(lián)征構(gòu)音障礙、共濟(jì)失調(diào)、震顫；疲勞和頭暈；神經(jīng)心理學(xué)測試中的信息加工損傷；眼部癥狀，包括側(cè)視中的復(fù)視；三叉神經(jīng)痛和視神經(jīng)炎。
MS中的自身抗原最可能是一些髓鞘蛋白(如蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)；髓鞘少突細(xì)胞糖蛋白(MOG)；髓鞘堿性蛋白(MBP)；髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)；髓鞘相關(guān)少突細(xì)胞堿性蛋白(MBOP)；瓜氨酸修飾的MBP(MBP的C8同種型，其中6個(gè)精氨酸脫亞氨成瓜氨酸)、環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(CNPase)、α-B晶體等)之一。整合膜蛋白PLP是髓鞘的顯性自身抗原。小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞共同作為抗原呈遞細(xì)胞，導(dǎo)致活化細(xì)胞因子、補(bǔ)體和炎癥過程的其它調(diào)節(jié)物，靶向特異性少突細(xì)胞和其膜髓鞘。具有分泌IFN-γ能力的髓鞘-自身反應(yīng)性T細(xì)胞的定量增加與MS和EAE的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，提示MS病人的外周血中自身免疫誘導(dǎo)物/輔助T淋巴細(xì)胞可起始和/或調(diào)節(jié)MS病人的脫髓鞘過程。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎.類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是慢性自身免疫性炎性滑膜炎，影響0.8％的全球人口。其特征是導(dǎo)致侵蝕性關(guān)節(jié)破壞的慢性炎性滑膜炎。RA由T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)。
T細(xì)胞在RA中發(fā)揮關(guān)鍵作用的證據(jù)包括(1)浸潤滑膜的CD4+T細(xì)胞占主導(dǎo)，(2)臨床改善與用藥物如環(huán)孢菌素抑制T細(xì)胞功能相關(guān)，(3)RA與一些HLA-DR等位基因相關(guān)。與RA相關(guān)的HLA-DR等位基因包含β鏈的第3個(gè)高變區(qū)67-74位氨基酸的類似序列，它們參與肽結(jié)合和呈遞給T細(xì)胞。RA由自身反應(yīng)性T細(xì)胞介導(dǎo)，這些T細(xì)胞識(shí)別滑膜關(guān)節(jié)中存在的自身蛋白或修飾的自身蛋白。本發(fā)明的自身多肽也稱為自身抗原，在RA中靶向且包括來自II型膠原的抗原表位；hnRNP；A2/RA33；Sa；聚絲蛋白；角蛋白；瓜氨酸；包括gp39的軟骨蛋白；I、III、IV、V、IX、XI型膠原；HSP-65/60；IgM(類風(fēng)濕因子)；RNA聚合酶；hnRNP-B1；hnRNP-D；心磷脂；醛縮酶A；瓜氨酸修飾的聚絲蛋白和纖維蛋白。在高比例RA病人的血清中鑒定了自身抗體，這些自身抗體識(shí)別含修飾的精氨酸殘基(脫亞氨以形成瓜氨酸)的聚絲蛋白肽。自身反應(yīng)性T和B細(xì)胞反應(yīng)在一些病人中都針對(duì)相同的免疫顯性II型膠原(CII)肽257-270。
胰島素依賴性糖尿病.人I型或胰島素依賴性糖尿病(IDDM)的特征是自身免疫性破壞郎格漢斯胰島中的β細(xì)胞。耗竭β細(xì)胞導(dǎo)致不能調(diào)節(jié)血液中的葡萄糖水平。當(dāng)血液中的葡萄糖水平高于特定水平時(shí)，通常約250mg/dl，產(chǎn)生明顯的糖尿病。在人類中，糖尿病發(fā)作前有一段長的癥狀前階段。在此階段中，逐步喪失胰β細(xì)胞功能。糖尿病的發(fā)展包括存在抗胰島素的自身抗體、谷氨酸脫羧酶和酪氨酸磷酸酶IA2(IA2)，它們各自是根據(jù)本發(fā)明的自身-蛋白、-多肽或-肽的例子。
可在癥狀前階段期間評(píng)估的標(biāo)記是胰中胰島炎的存在、島細(xì)胞抗體的水平和頻率、島細(xì)胞表面抗體、胰β細(xì)胞上MHC II類分子的異常表達(dá)、血中葡萄糖濃度和血漿胰島素濃度。胰中T淋巴細(xì)胞、島細(xì)胞抗體和血液葡萄糖的數(shù)量增加是疾病的征兆，胰島素濃度減少也如此。
非-肥胖糖尿病(NOD)小鼠是動(dòng)物模型，許多臨床、免疫和組織學(xué)特征與人IDDM相同。NOD小鼠自發(fā)地發(fā)展島的炎癥和β細(xì)胞的破壞，導(dǎo)致高血糖癥和明顯的糖尿病。CD4+和CD8+T細(xì)胞都需要用于發(fā)展糖尿病，盡管各自的作用仍不清楚。已顯示在NOD小鼠耐受情況下施用胰島素或GAD作為蛋白，防止疾病并下調(diào)對(duì)其它自身抗原的反應(yīng)。
血清中具不同特異性的自身抗體組合的存在是高度敏感的且對(duì)人I型糖尿病特異。例如，抗GAD和/或IA-2的自身抗體的存在約98％敏感且99％特異于來自對(duì)照血清的鑒定I型糖尿病特異。在I型糖尿病患者的非糖尿病一級(jí)親屬中，存在對(duì)3種自身抗原中的2種自身抗體特異對(duì)于5年內(nèi)發(fā)展I型DM為＞90％的正預(yù)測值，自身抗原包括GAD、胰島素和IA-2。
人胰島素依賴性糖尿病中靶向的自身抗原可包括自身多肽酪氨酸磷酸酶IA-2；IA-2β；谷氨酸脫羧酶(GAD)，65kDa和67kDa形式；羧肽酶H；胰島素；胰島素原；熱激蛋白(HSP)；glima38；島細(xì)胞抗原69kDa(ICA69)；p52；2種神經(jīng)節(jié)苷脂抗原(GT3和GM2-1)；島細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子(GLUT2)。
目前治療人IDDM是通過監(jiān)控血液葡萄糖水平以指導(dǎo)注射或以泵為基礎(chǔ)傳遞重組胰島素。飲食和鍛煉方案有助于達(dá)到適當(dāng)血液葡萄糖控制。
自身免疫性葡萄膜炎.自身免疫性葡萄膜炎是眼部的自身免疫病，估計(jì)影響400,000個(gè)人，在美國的發(fā)病率為每年43,000個(gè)新病例。自身免疫性葡萄膜炎目前用類固醇、免疫抑制劑如甲氨蝶呤和環(huán)孢菌素、靜脈內(nèi)免疫球蛋白和TNFα-拮抗物治療。
實(shí)驗(yàn)自身免疫性葡萄膜炎(EAU)是T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病，靶向神經(jīng)視網(wǎng)膜、葡萄膜和眼中相關(guān)組織。EAU與人自身免疫性葡萄膜炎共享許多臨床和免疫學(xué)特征，且通過外周施用葡萄膜產(chǎn)生的(uveitogenic)肽來誘導(dǎo)，此肽在完全弗氏佐劑(CFA)中乳化。
人自身免疫性葡萄膜炎中由自身免疫反應(yīng)靶向的自身蛋白可包括S-抗原、光受體間類視黃醇結(jié)合蛋白(IRBP)、視紫質(zhì)和恢復(fù)蛋白。
原發(fā)性膽汁性肝硬變.原發(fā)性膽汁性肝硬變(PBC)是器官特異性自身免疫病，主要影響40-60歲間的女性。此群體中報(bào)導(dǎo)的流行率接近每1,000人1個(gè)。PBC的特征是進(jìn)行性破壞肝內(nèi)膽上皮細(xì)胞(IBEC)，IBEC襯入小肝內(nèi)膽管。這導(dǎo)致妨礙和干擾膽汁分泌，最終引起硬化。已報(bào)導(dǎo)PBC與其它自身免疫病相關(guān)的特征是上皮襯(lining)/分泌系統(tǒng)損害，包括舍格倫綜合征、肢端硬皮綜合征、自身免疫性甲狀腺病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。關(guān)于驅(qū)動(dòng)抗原的注意力集中于線粒體超過50年，從而發(fā)現(xiàn)抗線粒體抗體(AMA)(Gershwin等，Immunol Rev 174210-225，2000)；(Mackay等，mmunol Rev 174226-237，2000)。AMA很快成為實(shí)驗(yàn)室診斷PBC的基礎(chǔ)，它在臨床癥狀出現(xiàn)前很久就存在于90-95％病人的血清中。線粒體中的自身抗原反應(yīng)性命名為M1和M2。M2反應(yīng)性針對(duì)48-74kDa組成的家族。M2代表2-氧酸(oxoacid)脫氫酶復(fù)合體(2-OADC)的酶的多個(gè)自身抗原性亞基且是本發(fā)明自身多肽的另一個(gè)例子。鑒定丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDC)抗原在PBC發(fā)病機(jī)制中作用的研究支持PDC在疾病誘導(dǎo)中發(fā)揮重要作用的觀念(Gershwin等，Immunol Rev 174210-225，2000)；(Mackay等，Immunol Rev 174226-237，2000)。95％PBC病例中最頻繁的反應(yīng)性是E2 74kDa亞基，它屬于PDC-E2。存在相關(guān)但不同的復(fù)合體，包括2-氧戊二酸脫氫酶復(fù)合體(OGDC)和分支鏈(BC)2-OADC。3種組成酶(E1，2，3)有助于催化功能，使2-氧酸底物轉(zhuǎn)化成酰基輔酶A(CoA)，伴隨著NAD+還原成NADH。哺乳動(dòng)物PDC包含另外的組分，名為蛋白X或E-3結(jié)合蛋白(E3BP)。在PBC病人中，主要的抗原反應(yīng)針對(duì)PDC-E2和E3BP。E2多肽包含2個(gè)串聯(lián)重復(fù)的硫辛酰結(jié)構(gòu)域，而E3BP有單個(gè)硫辛酰結(jié)構(gòu)域。硫辛酰結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)于一些PBC的自身抗原靶并在本文稱為“PBC硫辛酰結(jié)構(gòu)域”。PBC用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑治療，免疫抑制劑包括甲氨蝶呤和環(huán)孢菌素A。
實(shí)驗(yàn)自身免疫性膽管炎(EAC)的鼠模型使用腹膜內(nèi)(i.p.)用哺乳動(dòng)物PDC在雌性SJL/J小鼠中致敏，誘導(dǎo)非化膿性破壞性膽管炎(NSDC)和生成AMA(Jones，J ClinPathol 53813-21，2000)。
其它自身免疫病和相關(guān)的自身多肽.用于重癥肌無力的自身抗原可包括乙酰膽堿受體內(nèi)的抗原表位。尋常性天皰瘡中靶向的自身抗原可包括橋粒芯蛋白-3。舍格倫綜合征抗原可包括SSA(Ro)；SSB(La)和胞影蛋白。用于尋常性天皰瘡的顯性自身抗原可包括橋粒芯蛋白-3。用于肌炎的組可包括tRNA合成酶(如蘇氨酰、組氨酰、丙氨酰、異亮氨酰和甘氨酰)；Ku；Scl；SSA；U1 Sn核糖核蛋白；Mi-1；Mi-1；Jo-1；Ku和SRP。用于硬皮病的組包括Scl-70；著絲粒；U1核糖核蛋白和核仁纖維蛋白。用于惡性貧血的組包括內(nèi)因子和胃H/K ATP酶的糖蛋白β亞基。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的抗原表位抗原可包括DNA；磷脂；核抗原；Ro；La；U1核糖核蛋白；Ro60(SS-A)；Ro52(SS-A)；La(SS-B)；鈣網(wǎng)蛋白；Grp78；Scl-70；組蛋白；Sm蛋白和染色質(zhì)等。對(duì)于格雷夫斯病，抗原表位可包括Na+/-同向轉(zhuǎn)運(yùn)子；促甲狀腺素受體；Tg和TPO。
甲羥戊酸鹽途徑抑制劑根據(jù)本發(fā)明治療自身免疫病的方法包括使用是甲羥戊酸鹽合成或效應(yīng)途徑抑制劑的試劑。甲羥戊酸鹽代謝物參與G蛋白的修飾，如Ras。甲羥戊酸鹽途徑抑制劑用于抑制Ras蛋白的異戊二烯化和Raf/MAP激酶級(jí)聯(lián)(Kikuchi等，J.Biol.Chem.，26920054-20059(1994))。HMG-CoA還原酶和甲羥戊酸鹽焦磷酸脫羧酶是抑制甲羥戊酸鹽途徑的2個(gè)有用靶。
抑制素.在一個(gè)較佳實(shí)施方案中，甲羥戊酸鹽途徑抑制劑是抑制素。抑制素指一類已知的HMG-CoA還原酶抑制劑。這些試劑詳細(xì)描述于例如美國專利號(hào)3,983,140所示類伐他汀和相關(guān)化合物、美國專利號(hào)4,231,938所示洛伐他汀(美維諾林)和相關(guān)化合物、美國專利號(hào)4,346,227所示普伐他汀和相關(guān)化合物、美國專利號(hào)4,448,784和4,450,171所示昔伐他汀和相關(guān)化合物；美國專利號(hào)5,354,772所示氟伐他汀和相關(guān)化合物；美國專利號(hào)4,681,893、5,273,995和5,969,156所示阿托伐他汀和相關(guān)化合物；美國專利號(hào)5,006,530和5,177,080所示西伐他汀和相關(guān)化合物。另外的化合物揭示于美國專利號(hào)5,208,258、5,130,306、5,116,870、5,049,696、RE 36,481和RE 36,520。近來，“超級(jí)抑制素”羅蘇伐他汀已商業(yè)化。一些抑制素的親脂性使它們特別適用于皮下傳遞。
本文提供的數(shù)據(jù)證明抑制素通過差異地改變特異性STAT(信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和轉(zhuǎn)錄的激活物)蛋白活化來促進(jìn)Th2調(diào)節(jié)T細(xì)胞的發(fā)育。STATs是轉(zhuǎn)錄因子的家族，經(jīng)酪氨酸激酶的Janus激酶(JAK)家族的磷酸化來活化。STAT6對(duì)于Th2分化是關(guān)鍵的，而STAT4在Th1分化上有非常重要的作用。抑制素通過磷酸化差異地促進(jìn)STAT6的活化。抑制素也抑制治療的腦中不同CIITA啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)，影響非消化性CNS APC上受抑制的CIITA定向的II類上調(diào)，從而防止抗原呈遞給Th1細(xì)胞。
抑制素的制劑和施用是熟知的，一般遵循常規(guī)用法。治療自身免疫病所需劑量可不同于控制膽固醇所用的水平，在一些情況中劑量較高，約超過常規(guī)劑量5倍(其中常規(guī)劑量用于指控制膽固醇的批準(zhǔn)劑量)；約超過常規(guī)劑量10倍，可多至20倍或更高。
抑制素能摻入多種制劑用于治療施用。更具體地，本發(fā)明化合物能通過組合適當(dāng)藥學(xué)上可接受載體或稀釋劑來配制成藥物組合物，并可配制成固體、半固體、液體或氣體形式的制品，如片劑、膠囊、粉末、顆粒、軟膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球和氣霧劑。這樣，化合物能以多種方法施用，包括口服、含服、直腸、腸胃外、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、經(jīng)皮、鞘內(nèi)等施用。施用后，活性劑可以是全身性或局部性，通過使用區(qū)域施用、壁內(nèi)施用或使用在移植位置維持活性劑量的植入物。
抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑在發(fā)明的一些實(shí)施方案中，抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑與甲羥戊酸鹽途徑抑制劑(如抑制素)共施用。抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑可以是例如核酸(如DNA或RNA)，如編碼與疾病相關(guān)的自身抗原性自身多肽的多核苷酸。另外，抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑可以是例如多肽。例如，抗原特異性試劑可以是多肽，包括與疾病相關(guān)的自身抗原性抗原表位。這種多肽可以是例如蛋白自身抗原或包括其片段的多肽(如肽片段)、有自身抗原性抗原表位的多肽片段。同樣，例如，多肽試劑可包括的氨基酸與構(gòu)成自身抗原性抗原表位的氨基酸不相同，但與抗原表位免疫交叉反應(yīng)。此外，多肽可包括例如對(duì)應(yīng)于自身抗原性抗原表位的氨基酸，如隨機(jī)排列(隨機(jī)共聚物，例如乙酸格拉太咪爾)或排列為有序基序?？乖禺愋悦庖哒{(diào)節(jié)多肽至少約6個(gè)氨基酸長度，通常從約6個(gè)到約100個(gè)氨基酸，更常從約8個(gè)到約50個(gè)氨基酸，最常從約8個(gè)到約25個(gè)氨基酸。在其它實(shí)施方案中，抗原特異性免疫調(diào)節(jié)多肽可以是衍生的多肽。與另外序列相比，衍生物是有保守或非保守氨基酸取代的多肽。衍生物進(jìn)一步包括例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。這種衍生物的例子包括改變的肽配基，如U6669033、6322949所述。
編碼自身多肽的多核苷酸.在發(fā)明的一些實(shí)施方案中，抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑是包含多核苷酸的自身載體，其中多核苷酸編碼與疾病相關(guān)的自身抗原性自身多肽。自身載體是表達(dá)“自身盒”，設(shè)計(jì)用于在轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞時(shí)表達(dá)編碼的自身多肽。
構(gòu)建本發(fā)明載體使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)連接和限制技術(shù)(參見Ausuel等，(1987)《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，Wiley-Interscience或Maniatis等，(1992)《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular CloningALaboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.)。分離的質(zhì)粒、DNA序列或合成的寡核苷酸被切割、剪接并歸入所需形式。所有摻入合成DNA的所有DNA構(gòu)建物的序列通過DNA序列分析確認(rèn)(Sanger等(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.74，5463-5467)。
表達(dá)自身盒使用在宿主細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子。一般，含啟動(dòng)子和控制序列的載體用于特定宿主細(xì)胞，啟動(dòng)子和控制序列獲得自與宿主細(xì)胞相容的種類。適用于原核宿主的啟動(dòng)子包括β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)和雜合啟動(dòng)子如tac啟動(dòng)子。然而，其它功能性細(xì)菌啟動(dòng)子也適合。除了原核生物，也可使用真核微生物如酵母培養(yǎng)物。釀酒酵母或普通面包酵母是最常用的真核微生物，盡管一些其它菌株通?？捎谩２溉閯?dòng)物宿主細(xì)胞中來自載體的啟動(dòng)子控制轉(zhuǎn)錄可獲得自多種來源，例如病毒基因組如多形瘤病毒、猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒和優(yōu)選的巨細(xì)胞病毒，或者來自異源哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子如β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子可作為SV40限制片段方便地獲得，此片段也包含SV40病毒的復(fù)制起點(diǎn)。人巨細(xì)胞病毒的中間早期啟動(dòng)子作為HindIII限制片段方便地獲得。當(dāng)然，來自宿主細(xì)胞或相關(guān)屬的啟動(dòng)子也用于本文。
本文所用載體可包含選擇基因，也稱為可選擇標(biāo)記。選擇基因編碼蛋白，是用載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的存活或生長所必需的。用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的合適的可選擇標(biāo)記的例子包括二氫葉酸還原酶基因(DHFR)、鳥氨酸脫羧酶基因、多藥物抗性基因(mdr)、腺苷脫氨酶基因和谷氨酰胺合酶基因。當(dāng)這種可選擇標(biāo)記成功地轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞時(shí)，如果置于選擇性壓力下轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞能存活。有2類廣泛使用的不同選擇方案。第1類以細(xì)胞代謝為基礎(chǔ)并使用突變細(xì)胞系，此細(xì)胞系缺乏不依賴補(bǔ)充培養(yǎng)基生長的能力。第2類稱為顯性選擇，指用于任何細(xì)胞類型的選擇方案且不需要使用突變細(xì)胞系。這些方案通常使用抑制宿主細(xì)胞生長的藥物。有新基因的細(xì)胞表達(dá)賦予藥物抗性的蛋白且在選擇中存活。這種顯性選擇的例子使用藥物新霉素(Southern和Berg(1982)J.Molec.Appl.Genet.1，327)、霉酚酸(Mulligan和Berg(1980)Science 209，1422)或潮霉素(Sugden等(1985)Mol.Cell.Biol.5，410-413)。上述3個(gè)例子使用真核控制下的細(xì)菌基因以分別賦予對(duì)適當(dāng)藥物新霉素(G418或慶大霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。
本發(fā)明的自身載體能制成多核苷酸鹽，用作藥物。多核苷酸鹽可用非毒性無機(jī)或有機(jī)堿基制備。無機(jī)堿鹽包括鈉、鉀、鋅、鈣、鋁、鎂等。有機(jī)非毒性堿基包括伯、仲、叔胺等的鹽。這種自身DNA多核苷酸鹽能制成凍干形式用于在傳遞前重建，如無菌水或鹽溶液。另外，自身DNA多核苷酸鹽能制成溶液、懸浮液或乳劑，包括以水或油為基礎(chǔ)的載體用于傳遞。在一個(gè)較佳實(shí)施方案中，DNA在有生理水平的鈣(0.9mM)的磷酸緩沖鹽水中凍干，隨后施用前用無菌水重建。另外，DNA在含較高量Ca++的溶液中配制，量在1mM和2M間。DNA也能在缺乏特定離子種類時(shí)配制。
如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，有多種方法傳遞多核苷酸給受試者，如本文所定義。編碼自身多肽的多核苷酸能用陽離子聚合物制成，包括陽離子脂質(zhì)體。其它脂質(zhì)體也代表配制和傳遞自身多核苷酸的有效方法。另外，自身DNA可摻入病毒載體、病毒粒子或細(xì)菌用于藥理學(xué)傳遞。病毒載體可以是感染感受態(tài)、減毒(有減少誘導(dǎo)疾病能力的突變)或復(fù)制缺陷。使用自身DNA防止致病的自身蛋白的沉積、積聚或活性的方法可用病毒載體或其它傳遞系統(tǒng)增強(qiáng)，這些系統(tǒng)增加抗編碼自身蛋白的體液反應(yīng)。在其它實(shí)施方案中，DNA能綴合固體支持物，包括金粒、以多糖多基礎(chǔ)的支持物，或者其它能注射、吸入或由粒子轟擊(彈道傳遞)傳遞的顆?；蛑椤?br> 傳遞核酸制品的方法在本領(lǐng)域已知。參見例如美國專利號(hào)5,399,346、5,580,859、5,589,466。開發(fā)了一些以病毒為基礎(chǔ)的系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。例如，描述了逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)(美國專利號(hào)5,219,740；Miller等，Biotechniques 7980-990，1989；Miller，A.D.，Human Gene Therapy 15-14，1990；Scarpa等，Virology 180849-852，1991；Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908033-8037，1993；Boris-Lawrie和Temin，Cur.Opin.Genet.Develop.3102-109，1993)。也描述了一些腺病毒載體，參見例如(Haj-Ahmad等，J.Virol.57267-274，1986；Bett等，J.Virol.675911-5921，1993；Mittereder等，Human Gene Therapy 5717-729，1994；Seth等，J.Virol.68933-940，1994；Barr等，GeneTherapy 151-58，1994；Berkner，K.L.，BioTechniques 6616-629，1988；Rich等，HumanGene Therapy 4461-476，1993)。也開發(fā)了腺伴隨病毒(AAV)載體系統(tǒng)用于核酸傳遞。AAV載體能用本領(lǐng)域熟知技術(shù)方便地構(gòu)建。參見例如美國專利號(hào)5,173,414和5,139,941；國際出版號(hào)WO 92/01070和WO 93/03769；Lebkowski等，Molec.Cell.Biol.83988-3996，1988；Vincent等，Vaccines 90(Cold Spring Harbor Laboratory Press)1990；Carter，B.J.，《生物技術(shù)的當(dāng)前觀點(diǎn)》(Current Opinion in Biotechnology)3533-539，1992；Muzyczka，N.，《微生物和免疫的當(dāng)前主題》(Current Topics in Microbiol.And Immunol.)15897-129，1992；Kotin，R.M.，Human Gene Therapy 5793-801，1994；Shelling等，Gene Therapy 1165-169，1994；Zhou等，J.Exp.Med.1791867-1875，1994)。
本發(fā)明的多核苷酸也能沒有病毒載體傳遞。例如，分子可包裝于脂質(zhì)體，然后傳遞給受試者。脂質(zhì)膠囊化一般用脂質(zhì)體完成，脂質(zhì)體能穩(wěn)定結(jié)合或截留和保持核酸。對(duì)于使用脂質(zhì)體作為傳遞核酸的載體的綜述，參見(Hug等，Biochim.Biophys.Acta.10971-17，1991；Straubinger等，《酶學(xué)方法》(Methods of Enzymology)，101卷，512-527頁，1983)。
“治療有效量”的自身載體根據(jù)本發(fā)明的講授施用并足以治療或防止疾病，例如通改善或去除癥狀和/或疾病的原因，自身載體含編碼自身多肽的多核苷酸。例如，治療有效量在廣泛范圍內(nèi)且經(jīng)臨床試驗(yàn)確定，對(duì)于特定病人，在普通熟練臨床醫(yī)生已知因素基礎(chǔ)上確定，包括疾病嚴(yán)重性、病人重量、年齡和其它因素。治療有效量的自身載體在約0.001微克到約1克的范圍內(nèi)。優(yōu)選治療量的自身載體在約10微克到約5毫克的范圍內(nèi)。最優(yōu)選的治療量的自身載體在約0.025mg到約5mg的范圍內(nèi)。多核苷酸治療每月傳遞，連續(xù)6-12個(gè)月，隨后每3-12個(gè)月傳遞作為維持劑量。可制定另外的治療方案且范圍可從每日到每周、到每隔一月、到每年、到一次施用，這取決于疾病嚴(yán)重性、病人年齡、施用的自身多肽和其它因素如普通治療醫(yī)師會(huì)考慮的因素。
在一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸通過肌肉內(nèi)注射傳遞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸是鼻內(nèi)、口、皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、粘膜傳遞，經(jīng)皮膚傳遞或附于金粒傳遞給皮膚或通過皮膚(參見例如WO 97/46253)。另外，核酸能傳遞入皮膚細(xì)胞，通過有或沒有脂質(zhì)體或帶電脂類的局部應(yīng)用(參見例如美國專利號(hào)6,087,341)。另一種選擇是傳遞核酸作為吸入劑。多核苷酸在有生理水平的鈣(0.9mM)的磷酸緩沖鹽水中制成。另外，多核苷酸在含較高量Ca++的溶液中制成，量在1mM和2M間。多核苷酸可用其它陽離子制成，如鋅、鋁和其它?；蛘呋虼送?，多核苷酸可用陽離子聚合物、陽離子脂質(zhì)體-形成的化合物制成，或在非陽離子脂質(zhì)體中制成。用于DNA傳遞的陽離子脂質(zhì)體的例子包括用1，2-二(油?；趸?-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)和其它這類分子產(chǎn)生的脂質(zhì)體。
在傳遞多核苷酸前，傳遞位置能通過bupivicane、心臟毒素或另一種提高隨后多核苷酸治療的傳遞的試劑治療進(jìn)行預(yù)處理。這種預(yù)處理方案一般傳遞12到96小時(shí)，然后傳遞治療多核苷酸，更常在傳遞治療DNA前傳遞24到48小時(shí)。另外，DNA治療前沒有給予預(yù)處理。
除了編碼自身多肽的自身載體外，可共施用調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的佐劑以增強(qiáng)免疫反應(yīng)，佐劑由CpG寡核苷酸組成。CpG寡核苷酸顯示增強(qiáng)DNA接種的抗體反應(yīng)(Krieg等，Nature 374546-9，1995)。CpG寡核苷酸由純化的主鏈寡核苷酸組成，即抗體內(nèi)降解如硫代磷酸主鏈。包含于寡核苷酸內(nèi)的特定序列是嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶或嘌呤-嘧啶-C-G-嘧啶-嘧啶。所有這些構(gòu)建物的施用方式產(chǎn)生抗編碼自身多肽的免疫反應(yīng)。免疫反應(yīng)通常是抗體反應(yīng)，影響非生理作用或與自身多肽相關(guān)的過程。
選擇用于本發(fā)明的核苷酸可獲得自已知來源，例如用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從含所需基因或核苷酸序列的細(xì)胞中分離核酸。類似地，核苷酸序列能用本領(lǐng)域熟知的多核苷酸合成的標(biāo)準(zhǔn)方式合成產(chǎn)生。參見例如(Edge等，Nature 292756 1981)；(Nambair等，Science 2231299 1984)；(Jay等，J.Biol.Chem.2596311-1984)。一般，能制備合成寡核苷酸，通過(Edge等，同上)和(Duckworth等，Nucleic Acids Res.91691 1981)所述磷酸三酯方法或(Beaucage等，Tet.Letts.221859 1981)和(Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.1033185 1981)所述亞磷酰胺方法。合成寡核苷酸也能用可商業(yè)購買的自動(dòng)寡核苷酸合成儀制備。因此，對(duì)于特定氨基酸序列，核苷酸序列能用適當(dāng)密碼子命名。一般，可選擇在預(yù)期宿主中表達(dá)的優(yōu)選密碼子。完整序列集合自重疊寡核苷酸，它們用標(biāo)準(zhǔn)方法制備并集合到完整編碼序列中。參見例如Edge等(同上)；Nambair等(同上)和Jay等(同上)。
獲得本文所用核酸序列的另一種方法是重組方法。因此，所需核苷酸序列可切自攜帶核酸的質(zhì)粒，使用標(biāo)準(zhǔn)限制性酶和步驟。位點(diǎn)特異性DNA切割通過合適的限制性酶和步驟處理來進(jìn)行。位點(diǎn)特異性DNA切割通過合適的限制性酶(或幾種酶)在本領(lǐng)域一般理解的條件下處理來進(jìn)行，細(xì)節(jié)由商業(yè)購買限制性酶的廠商指定。如果需要，大小分離切割片段可通過聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。
分離特定核酸分子的另一種方便方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。(Mullis等，Methods Enzymol.155335-350，1987)。
有序肽.在發(fā)明的一些實(shí)施方案中，抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑是具有有序的氨基酸基序的肽，其中氨基酸對(duì)應(yīng)于抗原表位中的氨基酸。
在一個(gè)治療脫髓鞘自身免疫病的較佳實(shí)施方案中，有序肽包括有序的氨基酸基序{SEQ ID NO1}[1E2Y3Y4K]n，其中n從2到6。有序基序可開始于所示殘基1，或可開始于不同位置，如{SEQ ID NO6}YYKEYYKEYYKE；{SEQ ID NO7}KEYYKEYYKEYY等。有序肽序列的總長度通常至少為約8個(gè)氨基酸長度且不超過約24個(gè)氨基酸長度，通常至少約10個(gè)且不超過約20個(gè)。感興趣的特定肽包括序列{SEQ ID NO4}EYYKEYYKEYYK。肽僅由有序重復(fù)組成，或通過加入其它氨基酸殘基在任一末端延伸。
可對(duì)有序肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾和變化并仍獲得有所需抑制脫髓鞘自身免疫病特征的分子。所需性質(zhì)可在體外測定中至少部分確定，其中結(jié)合MHC抗原HLA-DR，特別是HLA-DR2，相關(guān)生物活性的征兆。
例如，一些氨基酸可取代蛋白結(jié)構(gòu)中的其它氨基酸而沒有顯著喪失功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解可對(duì)有序肽的序列進(jìn)行多種改變(如關(guān)于蛋白穩(wěn)定性或效率)而沒有顯著喪失其生物效用或活性，特別是另外的末端氨基酸。只要變化維持結(jié)合性質(zhì)和免疫學(xué)活性，認(rèn)為所得蛋白是用于發(fā)明目的的生物功能等價(jià)物。
肽能以多種方式提供，連接非野生型側(cè)翼區(qū)域作為融合蛋白，通過連接基團(tuán)連接或者經(jīng)半胱氨酸(二硫化物)或肽鍵直接共價(jià)連接。肽可連接N-或C-末端或氨基酸鏈的單個(gè)氨基酸。融合肽可延伸以提供方便的連接位置例如半胱氨酸或賴氨酸、提高穩(wěn)定性、結(jié)合特定受體、提供位點(diǎn)定向作用、提供純化方便、改變物理特征(如穩(wěn)定性、電荷等)、穩(wěn)定構(gòu)象等。肽可以是N-末端、C-末端或與這些加入序列有關(guān)的內(nèi)部。
肽可經(jīng)多種雙功能試劑連接，如馬來酰亞胺苯甲酸、甲基二硫代乙酸(methyldfhioacetic acid)、巰基苯甲酸、S-吡啶基二硫代丙酸鹽等。寡肽能連接蛋白以提供位點(diǎn)定向作用。寡肽能連接抗體用于位點(diǎn)定向作用，特別是通過細(xì)胞內(nèi)可切割的鍵。對(duì)于綴合技術(shù)，參見例如美國專利號(hào)3,817,837；3,853,914；3,850,752；3,905,654；4,156,081；4,069,105和4,043,989，納入本文供參考。寡肽也可通過摻入小泡的腔如脂質(zhì)體來修飾，可依次結(jié)合配基或受體用于指導(dǎo)特定細(xì)胞或組織。
對(duì)于治療，肽能局部或腸胃外施用，例如通過在特定位置注射，包括皮下、腹膜內(nèi)、血管內(nèi)等或經(jīng)皮，如通過電轉(zhuǎn)運(yùn)。在較佳實(shí)施方案中，皮下注射用于傳遞肽。寡肽也可在持續(xù)釋放制劑或滲透泵中施用，用于提供活性肽的貯存以在延伸段緩慢釋放。這種傳遞可降低所需藥物劑量，也減少獲得療效所需的治療數(shù)量。
本發(fā)明的寡肽能根據(jù)常規(guī)技術(shù)制備，如合成、重組技術(shù)等。例如，固相肽合成包括連續(xù)加入氨基酸以產(chǎn)生線性肽鏈(參見Merrifield(1963)J.Am.Chem.Soc.852149-2154)。也通過重組DNA技術(shù)生成肽。首先合成或另外產(chǎn)生編碼所需肽的核酸序列。此編碼序列可操作連接用于表達(dá)的合適控制元件，如本領(lǐng)域已知的啟動(dòng)子、終止子、ATG起始密碼子等。此表達(dá)構(gòu)建的導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞，分離生成的重組蛋白。另外，編碼序列導(dǎo)入長期療法治療的宿主，例如通過插入表達(dá)構(gòu)建物到肌肉或長命的造血細(xì)胞用于治療。表達(dá)載體可以是質(zhì)粒、病毒載體，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒等，且可通過轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA接種等導(dǎo)入。
藥學(xué)上可接受的肽鹽也在本文所示肽的范圍內(nèi)。
可使用多種施用方法。制劑能口服、吸入給予，或可注射，如血管內(nèi)、腫瘤內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)等。治療制劑的劑量可廣泛變化，這取決于疾病性質(zhì)、施用頻率、施用方式、從宿主中清除試劑等。初始劑量可較大，接著是較小的維持劑量。施用劑量可少至每周或雙周一次，或分成較小劑量和每日、一周兩次施用等，用于維持有效劑量水平。在許多病例中，口服施用需要的劑量高于靜脈內(nèi)施用。
發(fā)明的肽能摻入多種制劑用于治療施用。更具體地，復(fù)合體能通過組合適當(dāng)藥學(xué)上可接受載體或稀釋劑來配制成藥物組合物，并可配制成固體、半固體、液體或氣體形式的制品，如片劑、膠囊、粉末、顆粒、軟膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球和氣霧劑。這樣，肽能以多種方法施用，包括口服、含服、直腸、腸胃外、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、經(jīng)皮、鞘內(nèi)等施用。施用后，肽可以是全身性或局部性，通過使用在移植位置維持活性劑量的植入物。
以藥物劑量形式，肽能以其藥學(xué)上可接受鹽的形式施用，或它們也能單獨(dú)使用或適當(dāng)聯(lián)合以及結(jié)合其它藥物活性化合物。下列方法和賦形劑僅作為示范且決不限制。
對(duì)于口服制品，肽能單獨(dú)使用或結(jié)合適當(dāng)添加劑以制備片劑、粉末、顆?；蚰z囊，例如用常規(guī)添加劑如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉；用粘合劑如結(jié)晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯樹膠、玉米淀粉或明膠；用崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或羧甲基纖維素鈉；用潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂；如果需要，用稀釋劑、緩沖劑、濕潤劑、防腐劑和調(diào)味劑。
肽能制成用于注射的制品，這是通過使它們?nèi)芙?、懸浮或乳化于水或非水溶劑，如植物油或其它類似油、合成脂肪酸甘油酯、較高脂肪酸的酯或丙二醇；如果需要，用常規(guī)添加劑如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。
肽能在氣霧劑制劑中使用，氣霧劑制劑通過吸入施用。本發(fā)明的化合物可制成加壓的可接受推進(jìn)劑，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。
此外，肽能制成栓劑，這是通過混合多種堿基如乳化堿基或水溶性堿基。本發(fā)明的肽可經(jīng)栓劑直腸施用。栓劑可包括載體，如可可油、碳蠟和聚乙二醇，它們在體溫融化而在室溫固化。
可提供口服或直腸施用的單位劑量形式如糖漿、酏劑和懸浮液，其中各劑量單位如一茶匙、一湯匙、片劑或栓劑，包含預(yù)定量的組合物，組合物含一種或多種本發(fā)明化合物。類似地，用于注射或靜脈內(nèi)施用的單位劑量形式可包括組合物中的本發(fā)明化合物，如無菌水、正常鹽水或另外藥學(xué)上可接受載體中的溶液。
用于持續(xù)釋放制劑的植入物在本領(lǐng)域熟知。植入物制成微球；厚片等，用可生物降解或非生物降解的聚合物。例如，乳酸和/或乙醇酸的聚合物形成宿主良好耐受的易蝕聚合物。含肽的植入物置于作用位置附近，從而活性劑的局部濃度相對(duì)于身體的其它部分增加。
如本文所用，術(shù)語“單位劑量形式”指物理上離散單位，適合作為單元?jiǎng)┝坑糜谌撕蛣?dòng)物受試者，各單位含預(yù)定量的本發(fā)明肽，量計(jì)算足以產(chǎn)生與藥學(xué)上可接受稀釋劑、運(yùn)載體或載體相關(guān)的所需效果。本發(fā)明新單位劑量形式的規(guī)格取決于所用特定復(fù)合體和待獲得的效果以及與宿主中各復(fù)合體相關(guān)的藥效學(xué)。
藥學(xué)上可接受賦形劑如載體、佐劑、運(yùn)載體或稀釋劑是公開獲得。此外，藥學(xué)上可接受輔助物質(zhì)如pH調(diào)節(jié)和緩沖劑、滲透性調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑等易公開獲得。
取決于病人和治療情況及施用途徑，肽一般以0.01mg到500mg V/kg體重每天施用，例如對(duì)于普通人約20mg/天。范圍廣，因?yàn)閷?duì)不同哺乳動(dòng)物療效的功效一般隨著劑量廣泛變化，人中通常20、30或甚至40倍(每單位體重)小于大鼠。類似地，施用模式可對(duì)劑量有大的作用。因此，例如大鼠中的口服劑量可10倍于注射劑量。典型的劑量可以是每日一次注射。
技術(shù)人員員理解劑量水平可隨特定化合物、癥狀嚴(yán)重性和受試者對(duì)副作用易感性而變。一些特定肽比其它更有效。用于特定復(fù)合體的優(yōu)選劑量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過多種方法容易確定。優(yōu)選方法是測量特定化合物的生理效價(jià)。
非抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑在發(fā)明的一些實(shí)施方案中，非抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑與甲羥戊酸鹽途徑抑制劑(如抑制素)共施用。非抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑可以是例如核酸(如DNA或RNA)，如編碼免疫調(diào)節(jié)多肽的免疫調(diào)節(jié)寡核苷酸或多核苷酸載體。同樣非抗原特異性試劑可以是例如有免疫抑制性質(zhì)的小有機(jī)分子。在其它實(shí)施方案中，非抗原特異性試劑可以是例如多肽。免疫調(diào)節(jié)多肽能包括例如細(xì)胞因子、趨化因子、白介素、干擾素(如IFN-β)或共刺激分子(如CTLA-4)。在免疫調(diào)節(jié)多肽的天然形式作為膜結(jié)合蛋白存在的情況中，多肽可修飾成可溶形式(如與多肽的胞外結(jié)構(gòu)域Ig-融合)。通常，非抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑不是甲羥戊酸鹽途徑抑制劑。例如，甲羥戊酸鹽途徑抑制劑是抑制素時(shí)，非抗原特異性試劑是非抑制素分子。
在發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施方案中，非抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑是骨橋蛋白或自身載體，載體包括編碼骨橋蛋白的多核苷酸。骨橋蛋白是多效分子，近來被鑒定在自身免疫病中發(fā)揮致病作用。用自身蛋白骨橋蛋白或編碼骨橋蛋白的DNA治療誘導(dǎo)宿主中抗骨橋蛋白的免疫球蛋白反應(yīng)，抑制骨橋蛋白在持續(xù)疾病中的有害影響。
免疫調(diào)節(jié)序列.在一個(gè)較佳實(shí)施方案中，非抗原特異性免疫調(diào)節(jié)蛋白是含免疫調(diào)節(jié)序列的寡核苷酸。
一方面，發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)序列是合成寡核苷酸，包括下列一級(jí)結(jié)構(gòu)5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’或5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶3’；
其中X和Y是任何天然產(chǎn)生或合成的核苷酸，除了X和Y不能是胞嘧啶-鳥嘌呤。
IMSs的核心六聚體可以通過任何組成或數(shù)量的核苷酸或核苷位于5’和/或3’的側(cè)翼。IMSs范圍優(yōu)選在6和100個(gè)堿基對(duì)長度間，最優(yōu)選6-15個(gè)堿基對(duì)長度。IMSs也能作為較大DNA片段的部分傳遞，范圍從100到100,000個(gè)堿基對(duì)。IMSs能摻入或已存在于DNA質(zhì)粒、病毒載體和基因組DNA。IMSs范圍也最優(yōu)選從6(無側(cè)翼序列)到10,000個(gè)堿基對(duì)大小，或更大。能構(gòu)建存在于六聚體核心側(cè)翼的序列以與任何已知免疫抑制序列(IIS)中存在的側(cè)翼序列充分匹配。例如，側(cè)翼序列TGACTGTG-Pu-Pu-X-Y-Pyr-Pyr-AGAGATGA，其中TGACTGTG(SEQ ID NO76)和AGAGATGA(SEQ ID NO77)是側(cè)翼序列。另外的優(yōu)選側(cè)翼序列摻入一系列嘧啶(C、T和U)，作為重復(fù)2次或多次的單獨(dú)嘧啶，或者有2種或多種長度不同的嘧啶的混合物。不同側(cè)翼序列用于測試抑制調(diào)節(jié)序列。用于抑制寡核苷酸的側(cè)翼序列的更多例子包含于下列參考文獻(xiàn)美國專利號(hào)6,225,292和6,339,068，Zeuner等，《關(guān)節(jié)炎和風(fēng)濕病》(Arthritis and Rheumatism)，462219-24，2002。
發(fā)明的特定IMSs包括寡核苷酸，含下列六聚體序列1.5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMSs，IMSs含GG二核苷酸核心GTGGTT(SEQ ID NO12)、ATGGTT(SEQ ID NO13)、GCGGTT(SEQ ID NO14)、ACGGTT(SEQ ID NO15)、GTGGCT(SEQ ID NO16)、ATGGCT(SEQ ID NO17)、GCGGCT(SEQ ID NO18)、ACGGCT(SEQ ID NO19)、GTGGTC(SEQ ID NO20)、ATGGTC(SEQ ID NO21)、GCGGTC(SEQ ID NO22)、ACGGTC(SEQ ID NO23)等。
2.5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMSs，IMSs含GC二核苷酸核心GTGCTT(SEQ ID NO24)、ATGCTT(SEQ ID NO25)、GCGCTT(SEQ ID NO26)、ACGCTT(SEQ ID NO27)、GTGCCT(SEQ ID NO28)、ATGCCT(SEQ ID NO29)、GCGCCT(SEQ ID NO30)、ACGCCT(SEQ ID NO31)、GTGCTC(SEQ ID NO32)、ATGCTC(SEQ ID NO33)、GCGCTC(SEQ ID NO34)、ACGCTC(SEQ ID NO35)等。
3.鳥嘌呤和肌苷取代腺嘌呤和/或尿苷取代胞嘧啶或胸腺嘧啶，這些取代可在以上指南基礎(chǔ)上進(jìn)行。
如前所示，免疫抑制序列或IIS顯示抑制免疫刺激序列(ISS)活性，ISS含核心二核苷酸CpG，美國專利號(hào)6,225,292。在缺乏ISS的情況下此IIS，首次由本發(fā)明顯示能防止和治療自身免疫病，單獨(dú)或聯(lián)合DNA多核苷酸療法。此IIS包含核心六聚體AAGGTT(SEQ ID NO36)。此序列在本文稱為免疫調(diào)節(jié)序列或IMS。在本發(fā)明IMSs內(nèi)包括的具有類似基序的其它相關(guān)IISs是1.5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMSs，IMSs含GG二核苷酸核心GGGGTT(SEQ ID NO37)、AGGGTT(SEQ ID NO38)、GAGGTT(SEQ ID NO39)、AAGGTT(SEQ ID NO40)、GGGGCT(SEQ ID NO41)、AGGGCT(SEQ ID NO42)、GAGGCT(SEQ ID NO43)、AAGGCT(SEQ ID NO44)、GGGGTC(SEQ ID NO45)、AGGGTC(SEQ ID NO46)、GAGGTC(SEQ ID NO47)、AAGGTC(SEQ ID NO48)等。
2.5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’IMSs，IMSs含GC二核苷酸核心GGGCTT(SEQ ID NO48)、AGGCTT(SEQ ID NO49)、GAGCTT(SEQ ID NO50)、AAGCTT(SEQ ID NO51)、GGGCCT(SEQ ID NO52)、AGGCCT(SEQ ID NO53)、GAGCCT(SEQ ID NO54)、AAGCCT(SEQ ID NO55)、GGGCTC(SEQ ID NO56)、AGGCTC(SEQ ID NO57)、GAGCTC(SEQ ID NO58)、AAGCTC(SEQ ID NO59)等。
3.鳥嘌呤和肌苷取代腺嘌呤和/或尿苷取代胞嘧啶或胸腺嘧啶，這些取代可在以上指南基礎(chǔ)上進(jìn)行。
寡核苷酸可獲得自現(xiàn)有核酸來源，包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、病毒DNA和cDNA，但優(yōu)選由寡核苷酸合成產(chǎn)生的合成寡核苷酸。IMS可以是部分單鏈或雙聯(lián)DNA、RNA和/或寡核苷酸。
IMSs優(yōu)選是含未甲基化GpG寡核苷酸的寡核苷酸。另外的實(shí)施方案包括IMSs，其中一個(gè)或多個(gè)腺嘌呤或胞嘧啶殘基被甲基化。在真核細(xì)胞中，通常胞嘧啶和腺嘌呤殘基能被甲基化。
IMSs可以是穩(wěn)定和/或不穩(wěn)定寡核苷酸。穩(wěn)定寡核苷酸指相對(duì)抗核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶和其它降解途徑體內(nèi)降解的寡核苷酸。優(yōu)選的穩(wěn)定寡核苷酸有修飾的磷酸主鏈，最優(yōu)選的寡核苷酸有硫代磷酸修飾的磷酸主鏈，其中至少1個(gè)磷酸酯氧被硫取代。主鏈磷酸基團(tuán)修飾包括甲基膦酸酯、硫代磷酸、氨基磷酸鹽和二硫代磷酸酯核苷酸間鍵合，能提供IMSs的抗微生物性質(zhì)。IMSs優(yōu)選是穩(wěn)定寡核苷酸，優(yōu)選使用硫代磷酸酯穩(wěn)定寡核苷酸。
另外的穩(wěn)定寡核苷酸包括烷基磷酸三酯和磷酸二酯，其中帶電氧被烷基化；芳基膦酸鹽和烷基膦酸鹽，它們是非離子DNA類似物，其中帶電膦酸酯氧被芳基或烷基取代；或/和在任一或兩個(gè)末端含六乙二醇或四乙二醇或另外二醇的寡核苷酸。另外的空間構(gòu)象能用于使糖部分附于IMSs中的核苷堿基。
在調(diào)節(jié)二核苷酸側(cè)翼的IMS的核苷酸堿基可以是已知的天然產(chǎn)生堿基或合成的非天然堿基。寡核苷能用常規(guī)技術(shù)摻入IMS-ON的內(nèi)部區(qū)和/或末端用作附著點(diǎn)，即作為附著或連接其它分子的方法用于其它化合物，包括自身脂類、自身多肽、自身糖蛋白、自身糖脂、自身碳水化合物和翻譯后修飾的自身多肽或自身糖蛋白，或者作為另外免疫調(diào)劑治療劑的附著點(diǎn)。IMS-ON的堿基、糖部分、磷酸基團(tuán)和末端也可以本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何方式修飾用于構(gòu)建具有所需性質(zhì)的IMS-ON，除了IMS-ON的調(diào)節(jié)活性外。例如，糖部分可以在任何空間構(gòu)象中附于IMS-ON的核苷酸堿基。
對(duì)寡核苷酸進(jìn)行這些磷酸基團(tuán)修飾的技術(shù)在本領(lǐng)域已知且不需要詳細(xì)解釋。為回顧一個(gè)這種有用技術(shù)，制備用于靶寡核苷酸產(chǎn)物的中間磷酸三酯并氧化成天然產(chǎn)生的磷酸三酯，用含水碘或其它試劑如無水胺。所得寡核苷酸氨基磷酸酯能用硫處理以產(chǎn)生硫代磷酸?？蓱?yīng)用相同的一般技術(shù)(除了硫處理步驟)從甲基膦酸酯產(chǎn)生甲基氨基亞磷酰胺(phosphoamidites)。關(guān)于磷酸基團(tuán)修飾技術(shù)的更多細(xì)節(jié)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可參考美國專利號(hào)4,425,732；4,458,066；5,218,103和5,453,496以及Tetrahedron Lett.214149 25(1995)、75575(1986)、251437(1984)和Journal Am.ChemSoc.，936657(1987)，其內(nèi)容納入本文供參考以闡明關(guān)于IMSs組成和制備領(lǐng)域的知識(shí)水平。
尤其有用的磷酸基團(tuán)修飾是轉(zhuǎn)變成IMS-ON寡核苷酸的硫代磷酸或二硫代磷酸形式。硫代磷酸和二硫代磷酸酯對(duì)體內(nèi)降解的抗性大于其未修飾的寡核苷酸對(duì)應(yīng)物，使發(fā)明的IMS-ON更可為宿主所用。
IMS-ON能用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)和核酸合成高備來合成。關(guān)于此方面，參見例如Ausubel等，《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)摜》(Current Protocols in Molecular Biology)，第2和4章(Wiley Interscience，1989)；Maniatis等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(ColdSpring Harbor Lab.，New York，1982)；美國專利號(hào)4,458,066和美國專利號(hào)4,650,675。這些參考文獻(xiàn)納入本文供參考以證明關(guān)于生成合成寡核苷酸領(lǐng)域的知識(shí)水平。
另外，能通過突變分離的微生物ISS-ODN獲得IMS-ON以使競爭的二核苷酸取代天然產(chǎn)生的CpG基序和側(cè)翼核苷酸。篩選過程取決于核酸雜交，能從任何生物體分離任何多核苷酸序列，只要存在適當(dāng)探針或抗體。寡核苷酸探針對(duì)應(yīng)于編碼上述蛋白序列的一部分，能化學(xué)合成。這需要氨基酸序列的短、寡肽延伸必須已知。編碼蛋白的DNA序列也可推斷自遺傳密碼子，然而，必須考慮密碼子簡并性。
例如，能篩選被認(rèn)為包括含ISS的多核苷酸的cDNA文庫，通過將獲得自cDNAs的不同mRNA注射入卵母細(xì)胞，有足夠時(shí)間表達(dá)cDNA基因產(chǎn)物，測試所需cDNA表達(dá)產(chǎn)物的存在，例如通過使用對(duì)由感興趣多核苷酸編碼的肽特異的抗體或使用探針用于重復(fù)基序和組織表達(dá)模式，這些是感興趣多核苷酸編碼的肽的特征。另外，能間接篩選cDNA文庫表達(dá)感興趣肽，肽有至少1個(gè)抗原表位，使用對(duì)肽特異的抗體。這種抗體可以是多克隆或單克隆獲得并用于檢測指示感興趣cDNA存在的表達(dá)產(chǎn)物。
一旦獲得含ISS的多核苷酸，它能縮短至所需長度，例如通過用常規(guī)技術(shù)酶消化。ISS-ODN寡核苷酸產(chǎn)物中的CpG基序隨后突變以使“抑制”二核苷酸-用本發(fā)明方法鑒定-取代CpG基序。在有已知序列的DNA中特定位置進(jìn)行取代突變的技術(shù)熟知，例如通過PCR的M13引物誘變。因?yàn)镮MS是非編碼的，在取代突變中沒有涉及維持可讀框。然而，對(duì)于體內(nèi)使用，多核苷酸起始物質(zhì)ISS-ODN寡核苷酸中間物或IMS突變產(chǎn)物應(yīng)充分純(即盡可能無天然產(chǎn)生的污染物和LPS，使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知和選擇的技術(shù))。
發(fā)明的IMS可單獨(dú)使用或者順式或反式摻入重組自身載體(質(zhì)粒、粘粒、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒)，依次編碼重組表達(dá)載體可傳遞的任何自身多肽。為了方便起見，IMSs優(yōu)選沒有摻入表達(dá)載體施用。然而，如果需要摻入表達(dá)載體，這種摻入可用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知技術(shù)完成。對(duì)于綜述，普通技術(shù)人員可參考Ausubel等，《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》，同上。
簡要地，構(gòu)建重組表達(dá)載體使用標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)。為分析確認(rèn)構(gòu)建載體中的正確序列，連接混合物可用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞且適當(dāng)時(shí)通過抗生素抗性選擇成功的轉(zhuǎn)化子。制備來自轉(zhuǎn)化子的載體，限制性分析和/或測序分析，例如通過Messing等，(Nucleic Acids Res.，9309，1981)的方法、Maxam等，(Methods in Enzymology，65499，1980)的方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它合適方法。大小分離切割的片段用常規(guī)凝膠電泳進(jìn)行，如Maniatis等，(分子克隆，133-134頁，1982)所述。
宿主細(xì)胞可用本發(fā)明表達(dá)載體轉(zhuǎn)化并培養(yǎng)于常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基修改適合用于誘導(dǎo)啟動(dòng)子，選擇轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增基因。培養(yǎng)條件如溫度、pH等是以前用于選擇表達(dá)的宿主細(xì)胞，對(duì)于普通技術(shù)人員是顯而易見的。
如果重組表達(dá)載體用作發(fā)明IMS-ON的載體，質(zhì)粒和粘粒由于缺乏致病性而優(yōu)選。然而，質(zhì)粒和粘粒受到的體內(nèi)降解比病毒更快，因此不傳遞適當(dāng)劑量的IMS-ON以防止或治療炎癥或自身免疫病。
大部分用于構(gòu)建載體、轉(zhuǎn)染和感染細(xì)胞的技術(shù)在本領(lǐng)域廣泛實(shí)踐，大部分實(shí)踐者熟悉描述特定條件和過程的標(biāo)準(zhǔn)資源材料。
共施用試劑用于治療自身免疫病如上所示，本發(fā)明試劑(甲羥戊酸鹽抑制劑和第2種免疫調(diào)節(jié)劑)共施用給受試者以治療自身免疫病。共施用指試劑各以有效劑量施用給受試者，從而試劑同時(shí)在受試者中存在和具有活性。因而，共施用指施用給相同受試者且不一定到相同位置或通過相同施用途徑。在一些實(shí)施方案中，試劑同時(shí)施用。在其它實(shí)施方案中，試劑協(xié)同施用，這樣第一種試劑在第2種試劑施用前在受試者中存在并具有活性，施用第2種試劑后2種試劑都存在和具有活性。試劑通常作為單獨(dú)制劑協(xié)同共施用。此外，試劑能通過相同施用途徑或不同途徑施用。不同施用途徑可包括例如相同治療方案中試劑的全身或局部途徑。例如，聯(lián)合療法包括共施用抑制素和編碼自身多肽的自身載體時(shí)，抑制素能口服傳遞而自身載體能肌肉內(nèi)施用。
在本文所述發(fā)明的各實(shí)施方案中，試劑的傳遞方式與常規(guī)方法一致，這些方法與尋求治療或防止自身免疫病的控制相關(guān)。根據(jù)本文說明，有效量的試劑施用給需要這種治療的受試者，施用時(shí)間和條件足以治療自身免疫反應(yīng)。
根據(jù)發(fā)明的聯(lián)合療法受試者包括有高風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展自身免疫病的病人以及存在自身免疫病的病人。通常，已診斷的受試者有尋求治療的自身免疫病。此外，可監(jiān)控受試者在治療過程中響應(yīng)治療的自身免疫病癥狀中的任何變化。
為鑒定受試病人用于根據(jù)發(fā)明方法的治療，使用公認(rèn)的篩選方法以確定與特定自身免疫病相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素或確定受試者中鑒定的現(xiàn)有疾病狀態(tài)。這種方法可包括例如確定個(gè)體是否有親屬診斷患自身免疫病。篩選方法可包括例如常規(guī)方法以確定已知有遺傳成分的特定自身免疫或炎性疾病的家庭狀況。為了此目的，核苷酸探針能常規(guī)用于鑒定攜帶與感興趣特定自身免疫病相關(guān)的遺傳標(biāo)記的個(gè)體。另外，多種免疫學(xué)方法在本領(lǐng)域已知，用于鑒定特定自身免疫病的標(biāo)記。例如，有各種ELISA免疫測定方法并在本領(lǐng)域熟知，它們使用單克隆抗體探針以檢測與自身免疫病的特定生理標(biāo)記相關(guān)的自身抗體。可進(jìn)行這種篩選，如已知病人癥狀學(xué)、年齡因素、相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素等所示。這些方法使臨床醫(yī)生能常規(guī)選擇需要本文所述方法的病人以治療自身免疫病。根據(jù)這些方法，聯(lián)合療法可作為單獨(dú)防止或治療程序進(jìn)行或作為其它治療的跟蹤、輔助或協(xié)同治療方案。
對(duì)治療進(jìn)行中的疾病特別感興趣，其中治療穩(wěn)定或減少病人不理想的臨床癥狀。這種治療最好在受影響組織完全喪失功能前進(jìn)行。受試者治療最好在疾病癥狀階段中施用，在一些病例中在疾病癥狀階段后施用，其中疾病有復(fù)發(fā)癥狀(即是多階段的)。癥狀前或臨床前階段定義為T細(xì)胞在疾病位置參與的階段，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)等，但功能喪失未嚴(yán)重到足以產(chǎn)生指示明顯疾病的臨床癥狀。T細(xì)胞參與可由疾病位置上的T細(xì)胞數(shù)量增加、存在對(duì)自身抗原特異的T細(xì)胞、在疾病位置上釋放穿孔素和粒酶、響應(yīng)免疫抑制治療等證明。
技術(shù)人員易理解劑量水平可隨特定化合物、癥狀嚴(yán)重性和受試者對(duì)副作用易感性而變。一些特定化合物比其它更有效。用于給定化合物的優(yōu)選劑量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過多種方法容易確定。優(yōu)選方法是測量給定化合物的生理效價(jià)。
確定方案的有效性可用涉及確定T細(xì)胞反應(yīng)的測定。測定能確定反應(yīng)性的水平，如在樣品中發(fā)現(xiàn)的反應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量的基礎(chǔ)上，與來自原初宿主的負(fù)對(duì)照相比，或根據(jù)獲得自一個(gè)或多個(gè)病人的數(shù)據(jù)曲線標(biāo)準(zhǔn)化。除了檢測自身抗原反應(yīng)性T細(xì)胞的定性和定量存在外，T細(xì)胞可測定為細(xì)胞因子的表達(dá)類型，已知增加或抑制炎癥反應(yīng)。也需要測定反應(yīng)性T細(xì)胞的抗原表位特異性類型。
T細(xì)胞可分離自病人外周血液、淋巴結(jié)，或優(yōu)選來自位置炎癥。反應(yīng)性測定可在初級(jí)T細(xì)胞上進(jìn)行，或在融合產(chǎn)生雜交瘤的細(xì)胞上進(jìn)行。這種反應(yīng)性T細(xì)胞也能用于進(jìn)一步分析疾病進(jìn)程，通過監(jiān)控其原位位置、T細(xì)胞受體利用等。監(jiān)控T細(xì)胞響應(yīng)的測定在本領(lǐng)域已知，包括增殖測定和細(xì)胞因子釋放測定。
增殖測定測量響應(yīng)特異性抗原的T細(xì)胞增殖水平，廣泛用于本領(lǐng)域。在一個(gè)示范測定中，獲得病人淋巴結(jié)、血液或脾細(xì)胞。制備并洗滌從約104到107個(gè)細(xì)胞的懸浮液，通常從約105到106個(gè)細(xì)胞，隨后在對(duì)照抗原和測試抗原存在時(shí)培養(yǎng)。測試抗原可以是懷疑誘導(dǎo)炎性T細(xì)胞反應(yīng)的任何自身抗原的肽。通常培養(yǎng)細(xì)胞幾天?？乖T導(dǎo)的增殖通過監(jiān)控培養(yǎng)物的DNA合成來評(píng)估，例如在最后18小時(shí)培養(yǎng)中摻入的3H-胸苷。
酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)用于確定反應(yīng)性T細(xì)胞的細(xì)胞因子分布，可用于監(jiān)控細(xì)胞因子的表達(dá)，如IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、γ-IFN等。捕獲抗體可以是對(duì)感興趣細(xì)胞因子特異的任何抗體，其中上述來自T細(xì)胞增殖測定的上清方便地用作抗原的來源。封閉和洗滌后，加入標(biāo)記的檢測抗體，存在的蛋白濃度確定為結(jié)合標(biāo)記的函數(shù)。
可用本發(fā)明方法治療的哺乳動(dòng)物種類包括犬和貓；馬；牛；羊等和靈長類動(dòng)物，特別是人。動(dòng)物模型特別是小哺乳動(dòng)物如鼠、兔形目動(dòng)物等，可用于實(shí)驗(yàn)調(diào)研。其它用途包括的調(diào)研中需要研究缺乏T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥時(shí)的特定效果。
要理解本發(fā)明不限于所述特定方法、操作、制劑和試劑，這些當(dāng)然可以變化。也要理解本文所用術(shù)語僅用于描述特定實(shí)施方案，不想限制本發(fā)明的范圍，范圍僅由附加權(quán)利要求限制。
本文所述所有出版物全部納入供參考，用于各種目的，包括描述和揭示例如出版物中所述方法和方法學(xué)，它們可結(jié)合發(fā)明所述使用。上面和全文中討論的出版物僅提供它們在本申請(qǐng)?zhí)峤蝗涨暗膬?nèi)容。本文沒有一處解釋為允許發(fā)明者沒有權(quán)利根據(jù)先發(fā)明使這種披露提前發(fā)生。
提出下列例子以提供本領(lǐng)域普通技術(shù)人員關(guān)于如何完成和使用發(fā)明的完整披露和描述，且不想限制發(fā)明范圍。努力確保關(guān)于所用數(shù)字(如量、溫度、濃度等)的精確性，但應(yīng)允許一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏差。除非另有說明，重量、分子量的部分是平均分子量，壓力是大氣壓或接近大氣壓。
實(shí)施例1用于治療多發(fā)性硬化動(dòng)物模型的阿托伐他汀檢測阿托伐他汀(Lipitor)是否能抑制實(shí)驗(yàn)自身免疫腦脊髓炎(EAE)中的促炎反應(yīng)，EAE是Th1介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)脫髓鞘病，作為多發(fā)性硬化(MS)的模型。在C57BL/6小鼠中MOG p35-55-誘導(dǎo)慢性EAE的發(fā)作時(shí)開始每日口服施用阿托伐他汀逆轉(zhuǎn)癱瘓。當(dāng)在PLP p139-151-誘導(dǎo)的復(fù)發(fā)緩解EAE急性發(fā)作后給予時(shí)，阿托伐他汀也改善SJL/L小鼠中的復(fù)發(fā)。急性EAE也在MBPAc1-11治療的Tg小鼠中防止。組織學(xué)評(píng)估取自阿托伐他汀-治療小鼠的腦和脊髓，顯示血管周損傷的數(shù)量以及這些損傷中的浸潤程度都顯著減少。CNS MHC II類反式激活蛋白(CIITA)表達(dá)，包括單獨(dú)啟動(dòng)子(p)I、pIII和pIV轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，在阿托伐他汀-治療小鼠中降低。阿托伐他汀治療與CNS自身抗原特異增殖性T細(xì)胞反應(yīng)減少、這些T細(xì)胞的IFN-γ和IL-2分泌降低以及IL-4和IL-10分泌增加相關(guān)。因此，阿托伐他汀治療促進(jìn)Tha偏性。這些結(jié)果證明阿托伐他汀是治療脫髓鞘病的有效免疫調(diào)節(jié)劑。
方法實(shí)驗(yàn)過程動(dòng)物.雌性SJL/J、B10.PL和C57BL/6小鼠(8到12周齡)購自JacksonLaboratory(Bar Harbor，ME)。MBP Ac1-11轉(zhuǎn)基因(tg)TCR小鼠與B10.PL小鼠回交以獲得對(duì)EAE的敏感性。所有動(dòng)物操作由Stanford的比較醫(yī)學(xué)部門批準(zhǔn)并根據(jù)國立衛(wèi)生研究院指南。
肽.肽在肽合成儀(9050型；MilliGen，Burlington，MA)上通過標(biāo)準(zhǔn)9-芴甲氧羰基化學(xué)合成。肽由HPLC純化。結(jié)構(gòu)通過氨基酸分析和質(zhì)譜確定。用于這些實(shí)驗(yàn)的肽是小鼠MBP Ac1-11 1(Ac-ASQKRPSQRHG)(SEQ ID NO60)、MOG35-55(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)(SEQ ID NO61)、PLP139-151(HCLGKWLGHPDKF)(SEQ ID NO62)和HSVP16(DMTPADALDDRDLEM)(SEQID NO63)-病毒肽用作增殖和細(xì)胞因子測定中的負(fù)對(duì)照。
藥物治療.阿托伐他汀(Lipitor)片劑商業(yè)獲得并溶于PBS。小鼠每日一次口服施用0.5ML阿托伐他汀溶液(1或10mg/kg)或僅PBS，使用18mm飼針。阿托伐他汀治療階段示于結(jié)果部分。
EAE誘導(dǎo).在SJL/J小鼠中用100μg PLP139-151肽誘導(dǎo)復(fù)發(fā)緩解EAE，在C57BL/6或MBP Ac1-11 TCR Tg小鼠中分別用100μg MOG35-55肽或100μgMBP Ac1-11肽誘導(dǎo)慢性進(jìn)行性EAE。所有肽以2mg/ml溶于PBS并用等體積CFA乳化，CFA由補(bǔ)充4mg/ml熱殺傷結(jié)核分支桿菌H37Ra(Difco Laboratories，Detroit，MI)的不完全弗氏佐劑組成。小鼠皮下注射0.1ml肽乳劑。在肽免疫當(dāng)天和48小時(shí)后，僅C57BL/6小鼠和MBP Ac1-11 TCR Tg小鼠也靜脈內(nèi)注射0.1ml PBS中的1μg/ml百日咳鮑特桿菌(Bordetella pertussis)毒素。小鼠臨床打分如下0，無癱瘓；1，尾部虛弱或癱瘓；2，后肢虛弱或癱瘓；3，后肢癱瘓且前肢虛弱；4，后肢和前肢癱瘓；5，瀕死或死亡。
抗原特異活體外T細(xì)胞增殖測定.在所有不同品系中誘導(dǎo)EAE前2天開始1mg/kg或10mg/kg阿托伐他汀或者PBS每日治療。EAE誘導(dǎo)10天后(即阿托伐他汀治療后12天)，從對(duì)照、1mg/kg或10mg/kg阿托伐他汀治療的SJL/J、C57BL/6和MBP Ac1-11轉(zhuǎn)基因小鼠中取出排出的淋巴結(jié)和脾。淋巴結(jié)細(xì)胞(LNCs)或脾細(xì)胞體外培養(yǎng)用于對(duì)特定腦產(chǎn)生的肽(分別為PLP139-151、MOG35-55或MBP Ac1-11)的特異增殖性反應(yīng)。LNCs在0.2ml/孔體積的96孔微量滴定板中制備，濃度為5×106個(gè)細(xì)胞/ml。培養(yǎng)基由富集RPMI(RPMI1640，補(bǔ)充L-谷氨酰胺[2mM]、丙酮酸鈉[1mM]、非必需氨基酸
、青霉素[100U/ml]、鏈霉素
、2-ME[5×10-5M])組成，補(bǔ)充加入不同肽濃度的1％自身新鮮正常小鼠血清。培養(yǎng)物在含5％CO2的濕潤空氣中37℃培養(yǎng)。取自SJL/J或C57BL/6小鼠的培養(yǎng)物培養(yǎng)72小時(shí)，而來自MBP Ac-1-11 Tg小鼠的培養(yǎng)物培養(yǎng)48小時(shí)且隨后用1μCi/孔[3H]胸苷脈沖18小時(shí)。然后收集細(xì)胞并在β計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。
細(xì)胞因子分布測定.來自EAE供體的淋巴結(jié)細(xì)胞和脾細(xì)胞在24孔板中體外刺激(2.5×106個(gè)細(xì)胞/ml)，有或沒有腦產(chǎn)生的肽或用CoA作為正對(duì)照。細(xì)胞培養(yǎng)上清在不同時(shí)間點(diǎn)收集用于測量細(xì)胞因子水平對(duì)于IL-2是48小時(shí)，對(duì)于IFN-γ和TNFα是72小時(shí)，對(duì)于IL-4和IL-10是120小時(shí)。用相應(yīng)的細(xì)胞因子的特定ELISA試劑盒根據(jù)廠商操作(PharMingen，San Diego，CA，USA)確定細(xì)胞因子的水平。
總RNA分離.殺死小鼠并用20ml冷的無菌PBS灌注。立即分離腦且總RNA用Trizol試劑(Invitrogen)分離，如廠商操作所建議?？俁NA量隨后在260nm測量。
通過實(shí)時(shí)(動(dòng)力學(xué))RT-PCR評(píng)估CIITA啟動(dòng)子特異mRNA表達(dá).一步驟RT-PCR如Baranzini等(2000)J.Immunol 1656576所述進(jìn)行。制備主混合物用400μM dUTP和200μM各dATP、dCTP和dGTP；0.2μM各寡核苷酸引物，DMSO(1％終濃度)中的0.2X SYBR綠；2.5％甘油；1U尿嘧啶N-糖苷酶；4mM Mn(OAc)2和5U rTth聚合酶。RT-PCR參數(shù)45℃用活化尿嘧啶N-糖苷酶起始孵育10分鐘，接著60℃室溫30分鐘；95℃ 50個(gè)循環(huán)15秒和57℃ 30秒。β-肌動(dòng)蛋白從所有樣品中作為管家基因擴(kuò)增以使表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。各套引物包括無模板的對(duì)照。為定量，10倍稀釋的CIITA失控轉(zhuǎn)錄物(107到102初始CIITA拷貝)系列包括于各反應(yīng)板。數(shù)據(jù)用軟件“序列檢測系統(tǒng)程序”分析并轉(zhuǎn)至MS Excel表格程序用于分析。產(chǎn)生校準(zhǔn)曲線，這是通過各10倍稀釋的CIITA(失控轉(zhuǎn)錄物)相對(duì)各產(chǎn)物超過預(yù)定閾(Ct)所需的循環(huán)數(shù)作圖。Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線上所得值相比。用于普通CIITA(核苷酸2374-2458)的引物5’-GCCCACGAGACACAGCAA(SEQ ID NO64)和5’-TGAGCCGGGTGCCCAGGAA(SEQ ID NO65)。5’(正向)啟動(dòng)子特異引物pI CIITA(pl核苷酸259)5’-CCTGACCCTGCTGGAGAA(SEQ ID NO66)；pIII CIITA(pIII核苷酸112)5’-GCATCACTCTGCTCTCTAA(SEQ ID NO67)；pIV CIITA(pIV核苷酸43)5’-TGCAGGCAGCACTCAGM(SEQ ID NO68)。用于啟動(dòng)子特異轉(zhuǎn)錄物的CIITA(核苷酸265)反向引物5’-GGGGTCGGCACTGTTAA(SEQ ID NO69)。β-肌動(dòng)蛋白(301-538)5’-CGACCTGGGGATCTTCTA(SEQ ID NO70)和5’-TCGTGCCCTCAGCTTCCAA(SEQ ID NO71)。
用于STAT-6和STAT-4磷酸化的蛋白質(zhì)印跡分析.蛋白質(zhì)印跡分析如Garren等(2001)Immunity 1515所述進(jìn)行，有小修改。來自對(duì)照和阿托伐他汀治療小鼠的淋巴結(jié)在T-PER蛋白提取緩沖液(Pierce)中攪勻，緩沖液中有20μg/ml抑肽酶、20μg/ml亮抑酶肽、1.6mM Pefablock SC(Roche)、10mM NaF、1mM Na3VO4和1mMNa4P2O7(Sigma，St.Louis，MO)。所有過程在冰上操作。作為正對(duì)照，分離來自首次用于實(shí)驗(yàn)的鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞，用小鼠重組IL-4(10ng/ml)或IFN-γ(100單位/ml)培養(yǎng)1小時(shí)，分別用于STAT-6和STAT-4表達(dá)。蛋白濃度通過BCA蛋白測定(Pierce)確定。裂解物加入有40mM DTT的3x SDS加樣緩沖液(Cell Signaling Technology)。產(chǎn)物在4-15％SDS-PAGE梯度凝膠(BioRad)上電泳分離。預(yù)染色標(biāo)記(Invitrogen)用于確定分子量。凝膠以100V在125mM Tris、192mM甘氨酸和20％(v/v)甲醇中印跡到PVDF膜，隨后用含0.1％吐溫-20和5％脫脂奶粉的Tris-緩沖鹽水(TBS)室溫封閉1小時(shí)。TBS和0.1％吐溫20洗滌后，膜用抗磷酸STAT6抗體或抗磷酸STAT4抗體(Zymed，South San Francisco，CA)4℃過夜雜交，抗體在TBS、0.1％吐溫20和5％BSA中1∶1000稀釋，膜隨后用ECL加prebetween操作(Amersham Life Sciences)處理以通過化學(xué)發(fā)光檢驗(yàn)帶。膜在100mM 2-巰基乙醇、2％(w/v)SDS和62.5mMTris(pH7.4)中60℃剝離30分鐘，然后用抗CD3ζ(Pharmingen，San Diego，CA)或者抗Stat6或抗Stat4(均獲得自Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)作為對(duì)照探測以確認(rèn)加樣量相等。
組織病理學(xué).殺死小鼠并用20ml冷PBS灌注，接著用20ml冷的4％低聚甲醛。分離腦和脊髓并進(jìn)行石蠟包埋程序；隨后切片進(jìn)行蘇木精和曙紅染色。對(duì)各小鼠的10個(gè)切片進(jìn)行組織學(xué)檢測，各切片在組織學(xué)分?jǐn)?shù)上評(píng)估而不知道動(dòng)物的治療狀態(tài)。
統(tǒng)計(jì)分析.數(shù)據(jù)表示為平均值±SE。2組間的顯著差異用斯圖頓特檢驗(yàn)檢測。p＜0.05的值認(rèn)為是顯著的。也進(jìn)行具有p＜0.05顯著水平的單向多范圍ANOVA檢驗(yàn)用于多重加壓(multiple compression)。
結(jié)果阿托伐他汀在小鼠中逆轉(zhuǎn)和防止進(jìn)行中的慢性復(fù)發(fā)EAE或慢性進(jìn)行性EAE。開始，測試阿托伐他汀防止C57B1/6雌性小鼠中的慢性EAE，EAE通過用髓鞘少突細(xì)胞糖蛋白(MOG)免疫顯性決定簇p35-55免疫來誘導(dǎo)。如圖1A所示，EAE發(fā)作時(shí)開始用1mg/kg(大致相當(dāng)于批準(zhǔn)的成人最高劑量80mg)或10mg/kg阿托伐他汀每日口服治療，抑制EAE誘導(dǎo)。發(fā)作后治療也改善EAE(圖1B)。阿托伐他汀治療在SJL/L小鼠的慢性復(fù)發(fā)EAE中測試，EAE通過致腦炎蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)肽p139-151免疫來誘導(dǎo)。阿托伐他汀不僅有效防止EAE復(fù)發(fā)(圖1C)，當(dāng)治療在從急性EAE恢復(fù)后開始時(shí)也逆轉(zhuǎn)進(jìn)行中的復(fù)發(fā)EAE(圖1D)。阿托伐他汀成功地防止MBP Ad-11 Tg小鼠中的急性EAE進(jìn)展，EAE通過致腦炎髓鞘堿性蛋白(MBP)肽pAd-li免疫來誘導(dǎo)(圖1E)。
殺死來自所有5次實(shí)驗(yàn)各組的小鼠且取腦和脊髓用于CNS組織學(xué)評(píng)估。圖2顯示取自實(shí)驗(yàn)A的腦的代表性H和E染色(見圖1A)，這是在阿托伐他汀治療開始后11天，從而是C57BL/6小鼠的EAE誘導(dǎo)后22天。H&E矢狀腦切片取自PBS處理的C57BL/6小鼠(a)、1mg/kg治療(b)、10mg/kg治療(c)和作為負(fù)對(duì)照的首次用于實(shí)驗(yàn)的C57BL/6(d)。切片是來自各組2只小鼠的代表性切片。
蘇木精和曙紅染色顯示阿托伐他汀治療小鼠中CNS浸潤的數(shù)量和大小(如圖2B和2C所示)，與PBS處理的小鼠和首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠相比(分別為圖2A和2D)。因此，通過阿托伐他汀口服治療抑制和防止疾病體現(xiàn)在炎癥位置(CNS)被確認(rèn)和組織學(xué)證明。對(duì)來自其它4個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的代表性成員的脊髓和腦進(jìn)行相同分析，獲得類似結(jié)果。
阿托伐他汀在EAE期間下調(diào)炎癥位置(CNS)上的CIITA表達(dá)。在正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中，MHC II型的表達(dá)最小，盡管發(fā)現(xiàn)它在小鼠中誘導(dǎo)的EAE中的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上高度上調(diào)。此表達(dá)由因子II類反式激活蛋白(CIITA)調(diào)節(jié)，CIITA需要用于活化MHC II類基因，特別是調(diào)節(jié)小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(CNS中的主要抗原呈遞細(xì)胞)中表達(dá)的CIITA pVI。還報(bào)導(dǎo)阿托伐他汀能通過對(duì)CIITA pIV基因的作用來抑制MHC II的表達(dá)。由于組織學(xué)結(jié)果指出阿托伐他汀治療小鼠的腦浸潤相比對(duì)照EAE小鼠減少，研究阿托伐他汀是否體內(nèi)抑制炎癥位置中的CIITA表達(dá)。3組SJL/J小鼠用1mg/kg阿托伐他汀、10mg/kg或僅PBS(對(duì)照)口服治療。加入第4組首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠作為CIITA表達(dá)的負(fù)對(duì)照。3個(gè)治療組在EAE誘導(dǎo)前2天開始每日治療。誘導(dǎo)后10天(不同治療的12天)，殺死所有4組的小鼠并用20ml冷PBS灌注。分離腦并進(jìn)行總RNA制備，如方法部分所述。RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR(PT-PCR)以測量阿托伐他汀治療和載體處理的EAE體內(nèi)對(duì)炎癥位置(CNS)上的啟動(dòng)子特異CIITA轉(zhuǎn)錄物的效果。結(jié)果示于圖3。
阿托伐他汀治療以劑量響應(yīng)方式抑制CIITA轉(zhuǎn)錄物的總表達(dá)(圖3A)。特定CIITA分析顯示阿托伐他汀治療抑制所有3種特定CIITA的同種型(圖3B、3C和3D)。有趣的是，阿托伐他汀顯示劑量依賴性抑制CIITA Ply轉(zhuǎn)錄物(已知對(duì)調(diào)節(jié)ONS中小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上的MHC II表達(dá)特異)，但也意外地抑制PI和PIII轉(zhuǎn)錄物，PI和PIII轉(zhuǎn)錄物已知分別對(duì)樹突細(xì)胞和B細(xì)胞特異。Pl和Pill轉(zhuǎn)錄物顯示體外受阿托伐他汀影響。
這些結(jié)果證明用阿托伐他汀治療直接抑制腦中的CIITA同種型，這可能是抑制CNS中MHC II表達(dá)的主要因素并因而防止單核細(xì)胞大量浸潤到CNS中和逆轉(zhuǎn)EAE。
阿托伐他汀促進(jìn)Th2偏性的發(fā)展.SJL/L雌性小鼠用PLP p139-151免疫用于EAE誘導(dǎo)并用阿托伐他汀或載體(對(duì)照)治療，分離自此小鼠脾和淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞在治療10天后分離且檢測增殖和細(xì)胞因子生成。如圖4A所示，PLP p139-151特異的增殖性反應(yīng)以劑量相關(guān)方式抑制。Th1細(xì)胞因子IL-2生成減少，盡管在10mg/kg治療小鼠中的程度大許多(圖4B)。標(biāo)志性Th1細(xì)胞因子IFN-γ的分泌在2種治療劑量都顯著減少(圖4C)。關(guān)鍵的抗炎癥細(xì)胞因子IL-4在2種治療劑量都誘導(dǎo)(圖4D)，而在此實(shí)驗(yàn)中，另一種抗炎癥Th2細(xì)胞因子IL-10的分泌在較高治療劑量觀察到(圖4E)。因此，阿托伐他汀抑制Th1細(xì)胞因子生成且促進(jìn)Th2細(xì)胞因子。這些實(shí)驗(yàn)在C57BL/6和MBP Ac1-11特異轉(zhuǎn)基因小鼠中重復(fù)。獲得類似數(shù)據(jù)。如上面SJL/L小鼠所述，阿托伐他汀在這些小鼠中促進(jìn)幾乎相同的Th2偏性。在這些體外實(shí)驗(yàn)中，我們沒有觀察到細(xì)胞死亡增加。
阿托伐他汀導(dǎo)致Stat6的活化。為證明阿托伐他汀中的IL-4生成導(dǎo)致從Th1偏向Th2，我們想探索功能性IL-4細(xì)胞因子是否確實(shí)在阿托伐他汀治療期間表達(dá)。已知IL-4經(jīng)IL-4受體作用以特異地活化STAT6，STAT6是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和轉(zhuǎn)錄家族活物的成員，因此預(yù)期它在IL-4依賴的Th2偏性發(fā)生時(shí)被磷酸化。SJL/L小鼠通過口服施用阿托伐他汀(1mg/kg和10mg/kg)或僅PBS每日治療，在抑制素治療開始后2天通過施用PLP/CFA誘導(dǎo)EAE。
EAE誘導(dǎo)后10天，殺死所有組并解剖排出的淋巴結(jié)。蛋白裂解物分離自淋巴結(jié)細(xì)胞并通過蛋白質(zhì)印跡探測活性STAT6的存在，使用對(duì)STAT6的磷酸化形式特異的多克隆抗體。對(duì)于正對(duì)照，淋巴結(jié)細(xì)胞分離自首次用于實(shí)驗(yàn)的小鼠并用小鼠重組IL-4(10ng/ml)孵育1小時(shí)。蛋白裂解物以類似方式提取。如圖5所示，磷酸化STAT6發(fā)現(xiàn)于阿托伐他汀治療的小鼠淋巴結(jié)(泳道2和3)和正對(duì)照(泳道4)，而PBS治療的小鼠沒有顯示可檢測的磷酸化STAT6(泳道1)。鑒定的磷酸化STAT6根據(jù)預(yù)染色標(biāo)記以約100kDa走電泳。
實(shí)施例2多核苷酸治療包括施用編碼自身蛋白PLP的DNA以防止多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型PLP自身載體.構(gòu)建編碼PLP自身蛋白的抗原表位的多核苷酸，這是通過退火有16聚體重疊互補(bǔ)序列(下劃線)的2個(gè)寡核苷酸，用DNA聚合酶和dNTPs延伸PLP(139-151)5’-CTCGAGACCATGCATTGTTTGGGAAAATGGCTAGGACATCCCGACAAGTTTTCTAGATAGCTA-3’(SEQ ID NO72)；PLP(139-151)L144/R1475’-CTCGAGACCATGCATTGTTTGGGAAAACTACTAGGACGCCCCGACAAGTTTTCTAGATAGCTA-3’(SEQ ID NO73)。
這些寡核苷酸雙鏈體設(shè)計(jì)用于摻入XhoI和XbaI限制性位點(diǎn)。產(chǎn)物克隆入pTARGET載體(Promega，Madison，WI)的多克隆區(qū)，此載體是CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。陽性克隆通過顏色篩選鑒定且插入物的正確方向通過DNA自動(dòng)測序確認(rèn)。質(zhì)粒DNA的純化用Wizard plus Maxipreps(Promega)根據(jù)廠商說明書完成，在相同肌肉中注射0.05ml質(zhì)粒DNA(PBS中1mg/ml)。
多核苷酸治療操作.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的左四頭肌注射PBS中的0.1ml 0.25％鹽酸布比卡因(Sigma，St.Louis，MO)。2和10天后，小鼠的相同肌肉注射0.05ml質(zhì)粒DNA(PBS中1mg/ml)。
EAE誘導(dǎo).PLP139-151肽溶于PBS至2mg/ml的濃度并用等體積的不完全弗氏佐劑乳化，佐劑補(bǔ)充4mg/ml熱殺傷結(jié)核分支桿菌H37Ra(DifcoLaboratories，Detroit，MI)。小鼠皮下注射0.1ml肽乳劑，在當(dāng)天和48小時(shí)后，靜脈內(nèi)注射PBS中的0.1ml 4□g/ml百日咳鮑特桿菌毒素。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物打分如下0＝無臨床疾病；1＝尾部虛弱或癱瘓；2＝后肢虛弱；3＝后肢癱瘓；4＝前肢虛弱或癱瘓；5＝動(dòng)物瀕死或死亡。
為確定注射編碼PLP序列的DNA是否有效保護(hù)小鼠不受EAE誘導(dǎo)，以一周間隔2次肌肉內(nèi)注射PLP139-151。最后1次注射后10天，小鼠用CFA中乳化的PLP139-151肽攻擊。與對(duì)照質(zhì)粒組相比，在PLP139-151自身載體治療動(dòng)物中觀察到急性臨床疾病的改善。疾病發(fā)作相比對(duì)照質(zhì)粒組延遲(11.5±0.5天，p＜0.008)，平均最高疾病嚴(yán)重性減少(p＜.005)，平均疾病分?jǐn)?shù)降低(p＜0.0005)。此外，其它組注射a)自身載體，載體含編碼改變肽配基PLP p139-151(W144＞L，H147＞R)的多核苷酸，b)自身載體，載體含編碼PLP抗原表位p178-191的多核苷酸。用編碼改變自身肽配基(W144，H147)的自身載體，疾病發(fā)作延遲(11.6±0.5天，p＜0.009)且平均最高疾病分?jǐn)?shù)減少(p＜.02)。同樣，用含編碼PLP自身肽p178-191的多核苷酸的自身載體，疾病發(fā)作延遲(11.5±0.4天，p＜0.003)，平均最高疾病嚴(yán)重性減少(p＜.007)且平均疾病分?jǐn)?shù)降低(p＜0.0001)。
小鼠注射DNA并進(jìn)一步用致腦炎肽PLP139-151攻擊，在臨床疾病的急性階段消退后殺死小鼠。排出的LNC體外用PLP139-151自身肽再刺激并測試它們的增殖性反應(yīng)和細(xì)胞因子生成。圖6A顯示來自注射編碼PLP139-151自身肽的DNA的小鼠的LNC的增殖性反應(yīng)低于來自對(duì)照動(dòng)物的LNC(p＜0.01)。圖6(B)顯示用PLP139-151刺激時(shí)，來自自身載體治療小鼠的LNC分泌的IL-2和□-干擾素水平低于對(duì)照組，載體包含編碼PLP139-151自身肽的DNA。對(duì)分離自腦組織的mRNA的核糖核酸酶保護(hù)測定用于評(píng)估發(fā)炎腦中的細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄物的水平。圖6(C)顯示自身載體治療小鼠中□-干擾素和IL-15的mRNA水平下降，載體包含編碼PLP139-151自身肽的DNA。因此，臨床疾病的低發(fā)病率、細(xì)胞反應(yīng)減少與低水平IL-2、IL-15和□-干擾素間的相關(guān)性在PLP139-151 DNA治療小鼠中明顯。圖6(C)中所示細(xì)胞因子mRNA帶的相對(duì)表達(dá)水平通過光密度測定法測量。為糾正加樣差異，值根據(jù)各樣品內(nèi)管家基因GAPDH的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化。光密度測定分析確認(rèn)與pTargeT和含編碼PLP139-151(L/R)自身肽的DNA的自身載體相比，用含編碼PLP139-151自身肽的DNA的自身載體治療的小鼠腦中測試細(xì)胞因子的表達(dá)水平減少。
實(shí)施例3用IMS結(jié)合編碼多種自身蛋白的DNA治療多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型DNA多核苷酸治療由全長cDNAs編碼4種主要髓鞘成分MBP、MAG、MOG和PLP組成，當(dāng)它們在疾病開始發(fā)作后給予時(shí)治療EAE動(dòng)物模型中的復(fù)發(fā)疾病。此外，加入編碼IL-4的DNA到髓鞘DNA多核苷酸治療，治療功效進(jìn)一步提高，復(fù)發(fā)率減少。然而，盡管復(fù)發(fā)降低，總體疾病嚴(yán)重性仍可與對(duì)照組相比。在一系列單獨(dú)研究中，SJL/L小鼠皮下免疫用于疾病誘導(dǎo)，誘導(dǎo)用完全弗氏佐劑(CFA)中的PLP139-151肽，同時(shí)以單一注射腹膜內(nèi)施用重懸浮于磷酸緩沖鹽水的IMS。用單一注射抑制IMS的治療小鼠與PBS-治療和刺激性CpG-ODN治療小鼠相比，表現(xiàn)出總體疾病嚴(yán)重性減少(圖7)。
實(shí)施例4有序肽用于以MHC TCR結(jié)合基序?yàn)榛A(chǔ)的免疫調(diào)節(jié)髓鞘堿性蛋白(MBP)的氨基酸85到99間的區(qū)域包含用于T細(xì)胞的免疫顯性抗原表位和MS腦損傷中的自身抗體。T細(xì)胞和自身抗體識(shí)別的主要MBP區(qū)發(fā)現(xiàn)于MS腦，是核心基序{SEQ ID NO8}HFFK，來自HLA-DRB1*1501 DQB1*0602(HLA DR2)的病人中的MBPp87-99。
我們以前比較了識(shí)別自身抗體的結(jié)構(gòu)要求和對(duì)MBP p87-99反應(yīng)的T細(xì)胞克隆?？筂BP抗體親和純化自12個(gè)研究的死后病例的CNS損傷。MBP p87-99肽在所有病例中免疫顯性，它抑制超過90％的自身抗體結(jié)合MBP。有助于自身抗體結(jié)合的殘基位于10-氨基酸區(qū)段p86-95({SEQ ID NO9}VVHFFKNIVT)，此區(qū)段也包含MHC T-細(xì)胞受體接觸殘基，在DRB1*1501和DQB1*0602中用于T細(xì)胞識(shí)別MBP。在抗原表位中心，相同殘基{SEQ ID NO10}VHFFK對(duì)于T細(xì)胞結(jié)合和MHC識(shí)別是重要的。近來，具有MBP p87-99的HLA-DR2的晶體結(jié)構(gòu)被解決，確認(rèn)K91是主要TCR接觸殘基的預(yù)測，而F90是進(jìn)入MHC分子的疏水P4袋的主要錨。
合成的肽含3個(gè)氨基酸的重復(fù)序列，氨基酸有序排列以結(jié)合MS相關(guān)MHC分子中存在的袋并因此干擾致病T細(xì)胞的活化。這些預(yù)測序列之一({SEQ ID NO4}EYYKEYYKEYYK)有效防止和治療劉易斯大鼠中的實(shí)驗(yàn)自身免疫腦脊髓炎，劉易斯大鼠是多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型。
材料和方法動(dòng)物.雌性劉易斯大鼠(6-8周齡)，購自Harlan Sprague Dawley(Indianapolis，IN)。
肽.為免疫和疾病逆轉(zhuǎn)，肽在肽合成儀(9050型；MilliGen，Burlington，MA)上通過標(biāo)準(zhǔn)9-芴甲氧羰基化學(xué)合成。肽由HPLC純化。結(jié)構(gòu)通過氨基酸分析和質(zhì)譜確定。用于這些實(shí)驗(yàn)的肽是{SEQ ID NO11}ENPVVHFFKNIVTPR(MBPp85 99)、{SEQ ID NO4}EYYKEYYKEYYK、{SEQ ID NO5}KYYKYYKYYKYY。
EAE誘導(dǎo).合成肽MBPp85 99溶于PBS至2mg/ml的濃度并用等體積的不完全弗氏佐劑(IFA)乳化，佐劑補(bǔ)充4mg/ml熱殺傷結(jié)核分支桿菌H37Ra(DifcoLaboratories，Detroit，MI)。大鼠皮下注射0.1ml肽乳劑。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物打分如下0，無臨床疾?。?，尾部虛弱或癱瘓；2，后肢虛弱；3，后肢癱瘓；4，前肢虛弱或癱瘓；5，動(dòng)物瀕死或死亡。
EAE治療.大鼠以前用MBPp85 99免疫以誘導(dǎo)EAE，大鼠在肽注射后8天打分。在平均疾病發(fā)作日，動(dòng)物腹膜內(nèi)注射PBS中的0.5mg肽溶液(1劑量為0.25ml)。
結(jié)果注射含TCR-MHC結(jié)合基序的有序肽逆轉(zhuǎn)EAE的發(fā)展。為測試預(yù)測序列逆轉(zhuǎn)進(jìn)行中的EAE發(fā)展的潛力，我們傳遞單一劑量的PBS溶液，0.25ml溶液中含0.5mg肽。如圖8所見，當(dāng)與對(duì)照組相比時(shí)，此劑量足以治療進(jìn)行中的疾病。
實(shí)施例5結(jié)合阿托伐他汀和多核苷酸療法用于治療多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型PLP自身載體.編碼PLP自身蛋白的多核苷酸用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建。簡要地，小鼠全長PLP基因克隆自小鼠cDNA文庫并克隆入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pVAXl(Invtirogen，Carlsbad，CA)的多克隆位點(diǎn)。大規(guī)模生成和純化質(zhì)粒DNA通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用商業(yè)質(zhì)粒純化操作(Elim Biopharmaceuticals，Hayward，CA)進(jìn)行。
多核苷酸治療操作.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的四頭肌各注射PBS中的0.05ml 0.25％鹽酸布比卡因(Sigma，St.Louis，MO)。2到3天后，小鼠肌肉內(nèi)注射0.05mg質(zhì)粒DNA(PBS中0.25mg/ml)。
阿托伐他汀施用.阿托伐他汀(Pfizer Inc.，Groton，CT)(處方制劑)置于PBS中的懸浮液。阿托伐他汀每日一次以0.5ml(0.04mg/ml用于1mg/kg劑量或0.4mg/ml用于10mg/kg劑量)口服施用，使用20mm飼針(Popper and Sons Inc，New HydePark，NY)。施用PBS作為對(duì)照。
EAE誘導(dǎo).PLP139-151肽溶于PBS至2mg/ml的濃度并用等體積的不完全弗氏佐劑乳化，佐劑補(bǔ)充4mg/ml熱殺傷結(jié)核分支桿菌H37Ra(Difco Laboratories，Detroit，MI)。小鼠皮下注射0.1ml肽乳劑。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物打分如下0＝無臨床疾病；1＝尾部虛弱或癱瘓；2＝后肢虛弱；3＝后肢癱瘓；4＝前肢虛弱或癱瘓；5＝動(dòng)物瀕死或死亡。用此方法誘導(dǎo)EAE的小鼠發(fā)展疾病的方式是一些小鼠產(chǎn)生復(fù)發(fā)-緩解EAE，而另外的小鼠產(chǎn)生慢性進(jìn)行性疾病。
為確定編碼PLP序列的DNA結(jié)合阿托伐他汀注射是否有效治療進(jìn)行中的EAE，小鼠如上誘導(dǎo)EAE并允許達(dá)到最大急性疾病。在EAE誘導(dǎo)后約17天，小鼠隨機(jī)分成不同治療組。僅接受阿托伐他汀的小鼠每天口服施用1mg/kg或10mg/kg阿托伐他汀來治療。接受阿托伐他汀或DNA組合的小鼠每日口服施用1mg/kg或10mg/kg阿托伐他汀，以及編碼PLP的DNA每周一次肌肉內(nèi)施用，劑量為0.05mg每小鼠。對(duì)照小鼠每日口服施用PBS。隨后從EAE誘導(dǎo)開始總共跟蹤約45天的EAE臨床疾病。
與施用PBS的對(duì)照小鼠以及僅施用阿托伐他汀的小鼠相比，平均最高疾病嚴(yán)重性在接受阿托伐他汀和PLP的DNA的小鼠中顯著減少(圖9)。甚至更顯著的是，DNA在1和10mg/kg阿托伐他汀劑量時(shí)提供相等益處。這提示DNA甚至能在更低、更耐受的阿托伐他汀劑量時(shí)提供益處。此外，這些結(jié)果提示此聯(lián)合療法可用于治療復(fù)發(fā)-緩解以及慢性進(jìn)行性疾病。
實(shí)施例6抑制素和多核苷酸聯(lián)合療法用于治療復(fù)發(fā)-緩解及慢性進(jìn)行性人多發(fā)性硬化治療人多發(fā)性硬化的多核苷酸療法如下完成。構(gòu)建自身載體，載體包括巨細(xì)胞病毒或另一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；來源于SV40大T抗原的聚腺苷酸化信號(hào)、牛生長激素或普通技術(shù)人員已知的另一種有效的聚腺苷酸化信號(hào)序列；卡那霉素或其它FDA-接受的抗性基因，它使質(zhì)粒有效生長。
編碼一種或多種人髓鞘自身蛋白的DNA序列克隆入DNA自身載體。編碼這些髓鞘自身蛋白的DNA在MS病人中被自身免疫反應(yīng)靶向，包括髓鞘堿性蛋白(MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)、髓鞘相關(guān)少突細(xì)胞堿性蛋白(MOBP)，DNA克隆入自身載體。選擇特定自身抗原包括在多核苷酸治療中是以多種因素為基礎(chǔ)，使用本發(fā)明的講授，包括因素如受試者中致病自身抗體的存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，各髓鞘自身蛋白在單獨(dú)或不同自身質(zhì)粒中編碼。在另一個(gè)實(shí)施方案中，編碼一些髓鞘自身蛋白的DNA在單個(gè)自身質(zhì)粒中連續(xù)編碼，使用內(nèi)部核糖體再進(jìn)入序列(IRESs)或其它方法以從單個(gè)質(zhì)粒DNA中表達(dá)多種蛋白。制備編碼髓鞘蛋白的DNA表達(dá)自身質(zhì)粒并用分離質(zhì)粒DNA的常用技術(shù)分離，如商業(yè)購買自Qiagen公司的技術(shù)。純化DNA無細(xì)菌內(nèi)毒素，用于作為治療劑傳遞給人。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用僅編碼MBP的自身載體DNA治療患多發(fā)性硬化的病人。在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用編碼2種或多種髓鞘自身-蛋白、-多肽或-肽的多個(gè)自身質(zhì)粒。根據(jù)本發(fā)明講授，施用治療有效量的自身載體，載體包括編碼一種或多種自身多肽的多核苷酸。例如，治療有效量的自身載體在約0.001微克到約1克的范圍內(nèi)。優(yōu)選的治療量的自身載體在約10微克到約5毫克的范圍內(nèi)。最優(yōu)選的治療量的自身載體在約0.025mg到5mg的范圍內(nèi)。多核苷酸治療每月傳遞，連續(xù)6-12個(gè)月，隨后每3-12個(gè)月傳遞作為維持劑量?？芍贫硗獾闹委煼桨盖曳秶蓮拿咳盏矫恐?、到每隔一月、到每年、到一次施用，這取決于疾病嚴(yán)重性、病人年齡、施用的自身多肽和其它因素如普通治療醫(yī)師會(huì)考慮的因素。
在一個(gè)實(shí)施方案中，DNA通過肌肉內(nèi)注射傳遞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，DNA作為吸入劑鼻內(nèi)、口服、皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)傳遞，經(jīng)皮膚施加，或附于顆?；蛑閭鬟f給皮膚或通過皮膚。這種顆?；蛑榭梢允墙稹⑵渌饘?、聚苯乙烯或其它顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，DNA在有生理水平的鈣(0.9mM)的磷酸緩沖鹽水中制成。另外，DNA在含較高量的Ca++溶液中制成，量在1mM和2M間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，DNA用其它陽離子制成，如鋅、鋁和其它。DNA也可用陽離子聚合物、陽離子脂質(zhì)體制成，或在脂質(zhì)體中制成。DNA也能編碼于病毒載體、病毒顆?；蚣?xì)菌來傳遞。
結(jié)合上述多核苷酸治療，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑或“抑制素”以目前批準(zhǔn)用于高膽固醇血癥的劑量口服施用。例如，病人以10到80mg的劑量范圍每日一次施用阿托伐他汀，以每日一次40mg的優(yōu)選劑量作為維持劑量。
用所示抑制素和多核苷酸療法聯(lián)合治療的人MS病人在總無力分?jǐn)?shù)、臨床復(fù)發(fā)數(shù)和MRI監(jiān)控基礎(chǔ)上監(jiān)控疾病活動(dòng)性，MRI監(jiān)控新的釓增強(qiáng)損傷數(shù)量和增強(qiáng)損傷體積。此聯(lián)合療法用于治療復(fù)發(fā)-緩解以及慢性進(jìn)行性MS。
實(shí)施例7抑制素和多核苷酸治療的聯(lián)合包括施用編碼胰島素β鏈的自身肽的DNA用于防止胰島素依賴性糖尿病NOD小鼠發(fā)展自發(fā)性自身免疫糖尿病，與人IDDM共享許多臨床、免疫學(xué)和組織病理學(xué)特征。多核苷酸治療用自身載體進(jìn)行，載體包括的DNA編碼胰島素β鏈的氨基酸9-23的自身肽，胰島素免疫顯性抗原表位施用給NOD小鼠。對(duì)照是含編碼胰島素A鏈的相應(yīng)肽的DNA的載體。編碼自身肽的重疊寡核苷酸引物插入表達(dá)自身盒PcDNA。用編碼自身肽胰島素B(9-23)(insB-PcDNA)的自身載體治療預(yù)計(jì)有效保護(hù)動(dòng)物不產(chǎn)生糖尿病。胰島素A(+)鏈的核苷酸序列是5’-CCGGAATTCGCCATGTGCACGTCAATCTGTTCACTGTACCAGCTAGAGAACTACTGCAACTAGTCTAQGAGC-3’(SEQ ID NO74)；胰島素B(+)鏈的序列是5’-CCGGAATTCGCCATGAGCCACCTAGTAGAAGCACTATACCTCGTATGCGGCGAACGAGGTTAGTCTAGAGC-3’(SEQ ID NO75)。設(shè)計(jì)這些多核苷酸摻入EcoRI和XbaI限制性位點(diǎn)用于克隆。產(chǎn)物克隆入適當(dāng)表達(dá)載體的多克隆區(qū)，如PcDNA3.1+(Invitrogen，Carlsbad，CA)。純化自身質(zhì)粒DNA用Qiagen Endo-free Mega-prep試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)完成。
3到4周齡雌性NOD小鼠購自Taconic Farms(Germantown，NY)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在3到4周齡時(shí)用PBS中的0.1ml 0.25％鹽酸布比卡因(Sigma，St.Louis，MO)注射四頭肌(0.05ml每四頭肌)。2天后，小鼠的四頭肌各注射0.05ml的1.0mg/ml質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA以10天間隔注射2次或多次。
結(jié)合上述多核苷酸治療，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑或“抑制素”以1mg/kg或10mg/kg口服施用，如實(shí)施例5所述。
小鼠每周用Chemstrip(Boehringer Mannheim Co.，Indianapolis，IN)測試糖尿，用One Touch II儀(Johnson&Johnson，Milpitas，Ca)通過血漿葡萄糖測量確認(rèn)糖尿病。血漿葡萄糖水平重復(fù)大于250mg/dl的動(dòng)物認(rèn)為患糖尿病。從實(shí)驗(yàn)和對(duì)照動(dòng)物中取出胰，10％甲醛固定，石蠟包埋。薄切片有分開50□m的3個(gè)水平面，切割用于蘇木精和曙紅染色。浸潤的嚴(yán)重性通過光學(xué)顯微鏡評(píng)估。此外，胰淋巴結(jié)中的抗原特異反應(yīng)由用于細(xì)胞因子如IL-4、IL-10、IFN-γ和TGF-β的ELISA和RT-PCR檢測。
實(shí)施例8抑制素和多核苷酸治療的聯(lián)合包括施用編碼自身多肽胰島素和自身蛋白谷氨酸脫羧酶和酪氨酸磷酸酶的DNA用于治療胰島素依賴性糖尿病NOD小鼠用多核苷酸療法治療，包括編碼完整胰島素原多肽的DNA以及編碼谷氨酸脫羧酶(GAD)65kDa或島酪氨酸磷酸酶IA-2的DNA。分離編碼胰島素原、GAD 65和IA-2的cDNAs并克隆入表達(dá)自身盒pTARGET載體。DNA用QiagenEndo-free Mega-prep試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)純化。
NOD小鼠在3到4周齡時(shí)用PBS中的0.1ml 0.25％鹽酸布比卡因(Sigma，St.Louis，MO)注射四頭肌(0.05ml每四頭肌)。2天后，小鼠的四頭肌各注射磷酸緩沖鹽水中的0.05ml的1.0mg/ml各自身質(zhì)粒DNA，磷酸緩沖鹽水有0.9mM鈣。質(zhì)粒DNA以10天間隔注射2次或多次。
結(jié)合上述多核苷酸治療，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑或“抑制素”以1mg/kg或10mg/kg口服施用，如實(shí)施例5所述。
小鼠每周用Chemstrip(Boehringer Mannheim Co.，Indianapolis，IN)測試糖尿，用One Touch II儀表(Johnson&Johnson，Milpitas，Ca)通過血漿葡萄糖測量確認(rèn)糖尿病。血漿葡萄糖水平重復(fù)大于250mg/dl的動(dòng)物認(rèn)為患糖尿病。
實(shí)施例9抑制素和多核苷酸治療的聯(lián)合包括施用編碼自身多肽胰島素和/或自身蛋白谷氨酸脫羧酶和酪氨酸磷酸酶的DNA用于在確定的胰島素依賴性糖尿病中治療和逆轉(zhuǎn)明顯的高血糖癥NOD小鼠在糖尿檢測基礎(chǔ)上鑒定有明顯的臨床糖尿病，檢測使用Chemstrip(Boehringer Mannheim Co.，Indianapolis，IN)分析尿，用One Touch II儀(Johnson&Johnson，Milpitas，Ca)通過血漿葡萄糖測量確認(rèn)糖尿病。有明顯臨床糖尿病的NOD小鼠用多核苷酸療法治療，包括編碼自身肽胰島素B(9-23)(insB-PcDNA)的DNA或編碼完整胰島素原多肽的DNA以及編碼谷氨酸脫羧酶(GAD)65kDa或島酪氨酸磷酸酶IA-2的DNA，如實(shí)施例7和8。
結(jié)合上述多核苷酸治療，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑或“抑制素”以1mg/kg或10mg/kg口服施用，如實(shí)施例5所述。
小鼠每周用Chemstrip(Boehringer Mannheim Co.，Indianapolis，IN)測試糖尿，用One Touch II儀(Johnson&Johnson，Milpitas，Ca)通過血漿葡萄糖測量確認(rèn)糖尿病。血漿葡萄糖水平重復(fù)大于300mg/dl的動(dòng)物認(rèn)為患糖尿病。
實(shí)施例10抑制素和多核苷酸聯(lián)合療法用于治療人胰島素依賴性糖尿病構(gòu)建自身載體，載體包括的DNA編碼人島細(xì)胞自身蛋白如酪氨酸磷酸酶IA-2、谷氨酸脫羧酶(GAD)(65kDa或67kDa形式)、前胰島素原或島細(xì)胞抗原69KDa(ICA69)。DNA用PCR分離并克隆入表達(dá)自身盒，如上所述。治療有效量的自身載體根據(jù)本發(fā)明講授施用，載體包括編碼一種或多種自身多肽的多核苷酸。例如，治療有效量的自身載體在約0.001微克到約1克的范圍內(nèi)。優(yōu)選治療量的自身載體在約10微克到約5毫克的范圍內(nèi)。最優(yōu)選的治療量的自身載體在約0.025mg到約5mg的范圍內(nèi)。DNA治療每月傳遞，連續(xù)6-12個(gè)月，隨后每3-12個(gè)月傳遞作為維持劑量?？芍贫硗獾闹委煼桨盖曳秶蓮拿咳盏矫恐?、到每隔一月、到每年、到一次施用，這取決于疾病嚴(yán)重性、病人年齡、施用的自身多肽和其它因素如普通治療醫(yī)師會(huì)考慮的因素。在一個(gè)較佳實(shí)施方案中，DNA通過肌肉內(nèi)注射傳遞。另外，DNA自身載體作為吸入劑鼻內(nèi)、口、皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)傳遞，經(jīng)皮膚施加，在治療IDDM的病例中附于金粒，經(jīng)基因槍傳遞給上膚或通過皮膚。DNA在有生理水平的鈣(0.9mM)的磷酸緩沖鹽水中制成。另外，DNA在含較高量的Ca++溶液中制成，量在1mM和2M間。DNA用其它陽離子制成，如鋅、鋁和其它。
結(jié)合上述多核苷酸治療，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑或“抑制素”以目前批準(zhǔn)用于高膽固醇血癥的劑量口服施用。例如，病人以10到80mg的劑量范圍每日一次施用阿托伐他汀，以每日一次40mg的優(yōu)選劑量作為維持劑量。
人糖尿病患者用所示抑制素和多核苷酸治療的聯(lián)合治療，在對(duì)外源胰島素需求減少、血清自身抗體分布改變、糖尿降低、糖尿病并發(fā)癥減少的基礎(chǔ)上監(jiān)控患者的疾病活的性，糖尿病并發(fā)癥如白內(nèi)障、血管性功能不全、關(guān)節(jié)病和神經(jīng)病。
實(shí)施例11抑制素和多核苷酸聯(lián)合治療合包括施用編碼自身蛋白II型膠原的DNA用于防止自身免疫性滑膜炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)RA產(chǎn)生致病T細(xì)胞，致病T細(xì)胞回避促進(jìn)自身耐受的機(jī)制。小鼠中膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)是T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫的模型，與RA共享許多特征，包括與RA中組織學(xué)類似的滑膜炎和骨侵蝕。CIA的復(fù)發(fā)模型有炎癥糜爛性滑膜炎的臨床復(fù)發(fā)和緩解，方式類似于RA病人中觀察到的(Malfait等，Proc Natl Acad Sci USA，979561-6，2000)。CIA通過用完全弗氏佐劑中的II型膠原(CII)注射遺易感性小鼠品系來誘導(dǎo)。
用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分離編碼鼠II型膠原的cDNA。另外的滑膜自身蛋白如IV和IX型膠原以及熱激蛋白65可包括于多核苷酸治療。編碼所述肽的DNA用寡核苷酸引物獲得以通過PCR從鼠CII cDNA擴(kuò)增相關(guān)DNA的片段?？騼?nèi)甲硫氨酸起始翻譯位點(diǎn)以及XhoI和XbaI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)摻入寡核苷酸引物內(nèi)。PCR產(chǎn)生的DNA片段克隆入表達(dá)自身盒的XhoI和XbaI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，如pTARGET載體(Promega，Madison，WI)，此載體是由CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。測序分離的克隆以確定生成的所需DNA序列。
實(shí)驗(yàn)開始時(shí)使用6-9周齡雄性DBA/1LacJ(H-2q)小鼠。100μg各純化的自身質(zhì)粒以每周間隔三次肌肉內(nèi)注入前脛肌肉，然后誘導(dǎo)疾病用于防止CIA試驗(yàn)，或者在治療復(fù)發(fā)CIA實(shí)驗(yàn)中在臨床CIA發(fā)作后注射，自身質(zhì)粒包括編碼滑膜關(guān)節(jié)自身蛋白的DNA。這種DNA治療在施用位置注射后開始，施用bupivicane、心臟毒素或另一種預(yù)處理劑或者沒有這種試劑。
結(jié)合上述多核苷酸治療，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑或“抑制素”以1mg/kg或10mg/kg口服施用，如實(shí)施例5所述。
聯(lián)合治療后，小鼠的尾底部用完全弗氏佐劑(CFA)中的100μg純化的異源CII蛋白皮內(nèi)攻擊以誘導(dǎo)急性CIA，或用CFA中的同源CII以誘導(dǎo)復(fù)發(fā)性CIA(Malfait等，Proc Natl Acad Sci USA，979561-66)。在目測記分系統(tǒng)(Coligan等，John Wiley andSons，Inc 15.5.1-15.5.24，1994)基礎(chǔ)上每日跟蹤小鼠的臨床CIA表現(xiàn)，跟蹤12周0，無紅斑和腫脹跡象；1，紅斑和輕微腫脹，限于足中部(跗骨)或踝關(guān)節(jié)；2，紅斑和輕微腫脹，從踝延伸到足中部；3，紅斑和中等腫脹，從踝延伸到跖骨關(guān)節(jié)；4，紅斑和嚴(yán)重腫脹，涵蓋踝、足和趾。各動(dòng)物的臨床分?jǐn)?shù)是其四爪目測分?jǐn)?shù)的總和。產(chǎn)生臨床關(guān)切炎的小鼠的關(guān)節(jié)上進(jìn)行組織學(xué)分析。肢的第1個(gè)爪目測分?jǐn)?shù)最高，它被脫鈣、切片、用蘇木精和曙紅染色，如前所述(Williams等，Proc Natl Acad SciUSA 912762-2766，1994)。檢測染色切片的淋巴細(xì)胞糜爛、滑膜增生和侵蝕，如前所述(Williams等，Proc Natl Acad Sci USA 912762-2766，1994)。
實(shí)施例2抑制素和多核苷酸聯(lián)合治療包括施用編碼自身蛋白II型膠原的DNA用于治療確定的自身免疫性滑膜炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患確定進(jìn)行中CIA的動(dòng)物用自身載體DNA治療以逆轉(zhuǎn)確定的進(jìn)行中CIA，DNA編碼CII、BiP和/或GP-39。在目測記分系統(tǒng)(Coligan等，John Wiley and Sons，Inc15.5.1-15.5.24，1994)基礎(chǔ)上每日跟蹤小鼠的臨床CIA表現(xiàn)，跟蹤12周0，無紅斑和腫脹跡象；1，紅斑和輕微腫脹，限于足中部(跗骨)或踝關(guān)節(jié)；2，紅斑和輕微腫脹，從踝延伸到足中部；3，紅斑和中等腫脹，從踝延伸到跖骨關(guān)節(jié)；4，紅斑和嚴(yán)重腫脹，涵蓋踝、足和趾。各動(dòng)物的臨床分?jǐn)?shù)是其四爪目測分?jǐn)?shù)的總和。對(duì)產(chǎn)生臨床關(guān)節(jié)炎的小鼠的關(guān)節(jié)進(jìn)行組織學(xué)分析。肢的第1個(gè)爪目測分?jǐn)?shù)最高，它被脫鈣、切片、用蘇木精和曙紅染色，如前所述(Williams等，Proc Natl Acad Sci USA912762-2766，1994)。檢測染色切片的淋巴細(xì)胞浸潤、滑膜增生和糜爛，如前所述(Williams等，Proc Natl Acad Sci USA 912762-2766，1994)。用抑制素和自身DNA的聯(lián)合治療會(huì)減少滑膜炎的臨床復(fù)發(fā)數(shù)并降低目測記分系統(tǒng)基礎(chǔ)上的關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重性，自身DNA編碼CII、Bip、GP-39和/或滑膜關(guān)節(jié)中存在的另外蛋白。
實(shí)施例13結(jié)合抑制素和多核苷酸聯(lián)合療法用于防止或治療人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其它靶向關(guān)節(jié)的自身免疫病構(gòu)建自身質(zhì)粒，質(zhì)粒包括的DNA編碼人自身蛋白如滑膜關(guān)節(jié)中表達(dá)的蛋白，包括II型膠原、Bip、gp39、IV型膠原、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶和/或纖維蛋白。DNA用PCR分離并克隆入表達(dá)自身盒，如上所述。100μg質(zhì)粒DNA在有鈣的磷酸緩沖鹽水中每月肌肉內(nèi)施用。也能施用不同劑量方案、不同緩沖液中制成的DNA，或經(jīng)不同施用途徑，如以上實(shí)施例中所討論。
結(jié)合上述多核苷酸治療，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑或“抑制素”以目前批準(zhǔn)用于高膽固醇血癥的劑量口服施用。例如，病人以10到80mg的劑量范圍每日一次施用阿托伐他汀，以每日一次40mg的優(yōu)選劑量作為維持劑量。
有新發(fā)作或進(jìn)行中RA的人用自身多核苷酸聯(lián)合抑制素治療，自身多核苷酸編碼II型膠原、Bip、gp39、IV型膠原、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶和/或纖維蛋白，RA在美國風(fēng)濕病標(biāo)準(zhǔn)學(xué)會(huì)的基礎(chǔ)上診斷(診斷需要4/7標(biāo)準(zhǔn)(i)對(duì)稱多關(guān)節(jié)炎，(ii)包含MCPs、PIPs或腕，(iii)包含大于3個(gè)不同的關(guān)節(jié)區(qū)，(iv)手或足的X光上有關(guān)節(jié)侵蝕，(v)陽性類風(fēng)濕癥因子測試，(vi)早晨僵硬超過1小時(shí)和(vii)伸肌表面上的小結(jié)。用于RA的聯(lián)合療法的功效在部分病人的基礎(chǔ)上監(jiān)控，他們的脆弱和腫脹關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)的減少大于20％(美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)的20％反應(yīng)，ACR20)、50％(ACR50)和70％(ACR70)。另外的人RA測量包括類固醇使用中炎癥標(biāo)記(包括ESR和CRP)減少、射線照相進(jìn)程中的減少(包括侵蝕和關(guān)節(jié)空間變窄)和無力狀態(tài)分?jǐn)?shù)(如健康評(píng)估調(diào)查表-HAQ)改善。也監(jiān)控自身抗體效價(jià)和分布的變化。相同的方法用于相關(guān)關(guān)節(jié)炎如牛皮癬關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、賴特爾綜合征、脊柱炎和風(fēng)濕性多肌痛。
近來的研究提示一些對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有高特異性的自身抗體(如BiP、抗瓜氨酸抗體、抗聚絲蛋白抗體)可能先于臨床診斷幾個(gè)月或甚至幾年。這提出一種可能性，能在疾病發(fā)作前鑒定病人并用預(yù)防性多核苷酸療法有效治療。篩選健康、無癥狀病人的診斷抗體的存在，包括但不限于上述一種血清學(xué)測試。測試陽性的病人用上述抑制素和多核苷酸療法的聯(lián)合治療，在其它例子中嘗試防止疾病發(fā)作和嚴(yán)重性。隨后用上面的標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)控診斷和反應(yīng)。
實(shí)施例14抑制素和多核苷酸聯(lián)合療法用于治療人自身免疫性葡萄膜炎人S-抗原、光受體間類視黃醇結(jié)合蛋白(IRBP)、視紫質(zhì)和恢復(fù)蛋白用PCR分離并克隆入DNA表達(dá)自身盒，如實(shí)施例5所述。構(gòu)建自身質(zhì)粒，質(zhì)粒包括編碼多核苷酸的DNA，多核苷酸編碼的一種或多種自身多肽選自人S-抗原、光受體間類視黃醇結(jié)合蛋白、視紫質(zhì)和恢復(fù)蛋白。治療有效量的自身載體根據(jù)本發(fā)明講授施用，載體包括編碼一種或多種自身多肽的多核苷酸。例如，治療有效量的自身載體在約0.001微克到約1克的范圍內(nèi)。優(yōu)選治療量的自身載體在約10微克到約5毫克的范圍內(nèi)。最優(yōu)選的治療量的自身載體在約0.025mg到約5mg的范圍內(nèi)。DNA治療每月傳遞，連續(xù)6-12個(gè)月，隨后每3-12個(gè)月傳遞作為維持劑量。可制定另外的治療方案且范圍可從每日到每周、到每隔一月、到每年、到一次施用，這取決于疾病嚴(yán)重性、病人年齡、施用的自身多肽和其它因素如普通治療醫(yī)師會(huì)考慮的因素。
在一個(gè)較佳實(shí)施方案中，DNA通過肌肉內(nèi)注射傳遞。另外，DNA自身載體作為吸入劑鼻內(nèi)、口、皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)傳遞，經(jīng)皮膚施加，在治療自身免疫性葡萄膜炎的病例中附于金粒，經(jīng)基因槍傳遞給皮膚或通過皮膚。在另一個(gè)實(shí)施方案中，DNA在有生理水平的鈣(0.9mM)的磷酸緩沖鹽水中制成。另外，DNA在含較高量的Ca++溶液中制成，量在1mM和2M間。DNA能用其它陽離子制成，如鋅、鋁和其它。
結(jié)合上述多核苷酸治療，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑或“抑制素”以目前批準(zhǔn)用于高膽固醇血癥的劑量口服施用。例如，病人以10到80mg的劑量范圍每日一次施用阿托伐他汀，以每日一次40mg的優(yōu)選劑量作為維持劑量。
實(shí)施例15抑制素和多核苷酸聯(lián)合療法用于防止原發(fā)性膽汁性肝硬變并治療確定的原發(fā)性膽汁性肝硬變編碼人PDC-E2和-E3的DNA用PCR分離并克隆入合適的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的表達(dá)自身盒，在大腸桿菌中擴(kuò)增，用無內(nèi)毒素的質(zhì)粒純化方法純化。多核苷酸治療施用給患確定PBC的人，多核苷酸包括編碼自身蛋白PDC-E2和-E3的DNA。載體可與自身載體一起施用，此載體包括編碼細(xì)胞因子如IL-4的DNA。
結(jié)合上述多核苷酸治療，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑或“抑制素”以目前批準(zhǔn)用于高膽固醇血癥的劑量口服施用。例如，病人以10到80mg的劑量范圍每日一次施用阿托伐他汀，以每日一次40mg的優(yōu)選劑量作為維持劑量。
患PBC或有發(fā)展PBC風(fēng)險(xiǎn)的病人能通過鑒定血清自身抗體有效診斷，自身抗體針對(duì)線粒體蛋白如丙酮酸脫氫酶復(fù)合體。無癥狀的人類病人用現(xiàn)有的血清學(xué)試驗(yàn)測試，如ELISA、蛋白質(zhì)印跡或蛋白質(zhì)陣列用于診斷自身抗體的存在。血清學(xué)測試陽性的病人用上述多核苷酸療法預(yù)防性治療以防止疾病發(fā)作。用于PBCs的聯(lián)合療法在人中的功效通過測量連續(xù)肝功能試驗(yàn)以及肝功能衰竭進(jìn)程的時(shí)間延遲來確定，肝功能試驗(yàn)包括膽紅素、堿性磷酸酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)。經(jīng)皮肝活組織檢查后，肝組織學(xué)通過蘇木精和曙紅染色和高碘酸希夫染色來評(píng)估。也檢測膽管異常、門道(portal tract)中的壞死-炎癥性變化和肉芽腫性浸潤作為疾病活動(dòng)性的證據(jù)。也分析血清自身抗體分布。
實(shí)施例16用抑制素和編碼骨橋蛋白的DNA聯(lián)合治療多發(fā)性硬化和其它自身免疫病的方法骨橋蛋白是多效分子，近來被鑒定在多發(fā)性硬化和其動(dòng)物模型EAE中發(fā)揮致病作用。骨橋蛋白也可在炎性關(guān)節(jié)炎和其它人自身免疫病中發(fā)揮重要作用。用編碼自身蛋白骨橋蛋白的DNA治療治療小鼠誘導(dǎo)宿主中抗骨橋蛋白的免疫球蛋白反應(yīng)，抑制骨橋蛋白在持續(xù)疾病中的有害影響。
在患多發(fā)性硬化的人中，骨橋蛋白-自身載體治療在診斷后開始。結(jié)合此多核苷酸治療，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑或“抑制素”以目前批準(zhǔn)用于高膽固醇血癥的劑量口服施用。例如，病人以10到80mg的劑量范圍每日一次施用阿托伐他汀，以每日一次40mg的優(yōu)選劑量作為維持劑量。功效在誘導(dǎo)多發(fā)性硬化病人中抗骨橋蛋白抗體的基礎(chǔ)上監(jiān)控，如通過ELISA分析測量。在腦MRI掃描中損傷數(shù)和大小的減少、疾病復(fù)發(fā)數(shù)的降低(臨床癱瘓的發(fā)作)和到無力的進(jìn)展變慢的基礎(chǔ)上進(jìn)一步證明功效。
實(shí)施例17抑制素和多核苷酸聯(lián)合治療包括施用編碼自身免疫反應(yīng)靶向器官或組織中表達(dá)自身蛋白文庫的DNA另一種治療自身免疫的策略是施用DNA，DNA編碼免疫攻擊下組織或器官內(nèi)存在的許多或所有自身蛋白。cDNA表達(dá)文庫包含的cDNA編碼特定組織、器官或細(xì)胞類型中表達(dá)的許多或絕大部分自身蛋白。這種cDNA表達(dá)文庫在自身載體中產(chǎn)生以能在施用給宿主時(shí)表達(dá)它們編碼的多肽。患確定多發(fā)性硬化的動(dòng)物和人用自身載體治療，載體編碼腦中少突細(xì)胞表達(dá)的cDNA文庫?；碱愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物和人用自身載體治療，載體編碼滑膜關(guān)節(jié)中表達(dá)的cDNA文庫，滑膜關(guān)節(jié)是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中自身免疫反應(yīng)的靶。患自身免疫性糖尿病的動(dòng)物和人用自身載體治療，載體編碼胰β細(xì)胞中表達(dá)的cDNA文庫。編碼胰β細(xì)胞中表達(dá)cDNA文庫的自身載體也能用于防止個(gè)體中產(chǎn)生臨床糖尿病，個(gè)體被鑒定有高風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展自身免疫性糖尿病。另外，自身載體中編碼的在亞群的cDNA表達(dá)文庫能用于治療自身免疫，而不是使用完整cDNA文庫。
結(jié)合上述多核苷酸治療，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑或“抑制素”以目前批準(zhǔn)用于高膽固醇血癥的劑量口服施用。例如，病人以10到80mg的劑量范圍每日一次施用阿托伐他汀，以每日一次40mg的優(yōu)選劑量作為維持劑量。
實(shí)施例18抑制素和有序肽用于聯(lián)合治療多發(fā)性硬化以前顯示一些含3個(gè)氨基酸重復(fù)序列的有序肽能減少M(fèi)S動(dòng)物模型中的疾病嚴(yán)重性，氨基酸有序排列以結(jié)合MS相關(guān)MHC分子中存在的口袋。例如，證明MBP p87-99序列基礎(chǔ)上的特定氨基酸序列(EYYKEYYKEYYK)能有效防止和治療劉易斯大鼠中的EAE，發(fā)現(xiàn)此序列在MS病人中免疫顯性。
在本發(fā)明的聯(lián)合療法中，有序肽如EYYKEYYKEYYK每日、一周兩次、每周、每月二次、每月皮下施用給MS病人，或者偶爾聯(lián)合抑制素施用，如實(shí)施例6所述。
用所示抑制素和有序肽聯(lián)合治療的人MS病人在臨床復(fù)發(fā)數(shù)和MRI監(jiān)控基礎(chǔ)上監(jiān)控疾病活動(dòng)性，MRI監(jiān)控新的釓增強(qiáng)損傷的數(shù)量和增強(qiáng)損傷的體積。
實(shí)施例19抑制素和免疫調(diào)節(jié)序列(IMS)用于聯(lián)合治療多發(fā)性硬化以前顯示一些有稱為IMS’s的硫代磷酸主鏈的單鏈寡核苷酸能減少M(fèi)S動(dòng)物模型中的疾病嚴(yán)重性，IMS優(yōu)選包含六聚體基序5’-嘌呤-嘌呤-G-G-嘧啶-嘧啶-3’或5’-嘌呤-嘧啶-G-G-嘧啶-嘧啶3’。
在本發(fā)明的聯(lián)合療法中，IMS寡肽每日、一周兩次、每周、每月二次、每月皮下施用給MS病人，或者偶爾聯(lián)合抑制素施用，如實(shí)施例6所述。
用所示抑制素和IMS聯(lián)合治療的人MS病人在臨床復(fù)發(fā)數(shù)和MRI監(jiān)控基礎(chǔ)上監(jiān)控疾病活動(dòng)性，MRI監(jiān)控新的釓增強(qiáng)損傷的數(shù)量和增強(qiáng)損傷的體積。
權(quán)利要求
1.一種治療自身免疫病的方法，其特征在于，所述方法包括共施用有效量的抑制素和有效量的抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑給罹患自身免疫病的病人。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑是包含多核苷酸的自身載體，多核苷酸編碼與自身免疫病相關(guān)的自身多肽。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，自身多肽是自身蛋白或自身肽。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑是多肽。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，多肽是蛋白或肽。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，多肽是衍生多肽。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，多肽包含與疾病相關(guān)的自身多肽。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，多肽包含的氨基酸對(duì)應(yīng)于疾病相關(guān)的自身多肽的自身抗原表位。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，對(duì)應(yīng)于自身抗原表位的氨基酸隨機(jī)化形成隨機(jī)共聚物。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，隨機(jī)共聚物是肽。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，對(duì)應(yīng)于自身抗原表位的氨基酸是有序的，從而多肽包含有序的氨基酸基序。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，自身免疫病是脫髓鞘自身免疫病，有序的氨基酸基序是[1E2Y3Y4K]n，其中n從2到6。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，自身免疫病選自多發(fā)性硬化、胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和自身免疫性葡萄膜炎。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，自身免疫病是多發(fā)性硬化。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，抑制素選自羅蘇伐他汀、美伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、昔伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀和西伐他汀。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，抑制素是阿托伐他汀。
17.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，多核苷酸編碼的多肽選自髓鞘堿性蛋白(MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白(PLP)、髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)、環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(CNPase)、髓鞘相關(guān)少突細(xì)胞堿性蛋白(MBOP)、髓鞘少突細(xì)胞蛋白(MOG)和α-B晶體。
18.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，自身免疫病是胰島素依賴性糖尿病(IDDM)。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，多核苷酸編碼的多肽選自胰島素、胰島素B鏈、前胰島素原、胰島素原、谷氨酸脫羧酶的65kDa形式、谷氨酸脫羧酶的67kDa形式、酪氨酸磷酸酶IA2或IA-2b、羧肽酶H、熱激蛋白、glima38、島細(xì)胞抗原的69kDa形式、p52和島細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子(GLUT 2)。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，自身載體包含編碼一種自身多肽的多核苷酸。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，自身多肽是前胰島素原。
22.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，自身多肽是胰島素B鏈9-23。
23.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，自身免疫病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，多核苷酸編碼的多肽選自II型膠原；hnRNP A2/RA33；Sa；聚絲蛋白；角蛋白；包括gp39的軟骨蛋白；I、III、IV、V、IX、XI型膠原；HSP-65/60；RNA聚合酶；hnRNP-B1；hnRNP-D；和醛縮酶A。
25.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，自身免疫病是自身免疫性葡萄膜炎。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，多核苷酸編碼的多肽選自S抗原、光受體間類視黃醇結(jié)合蛋白(IRBP)、視紫質(zhì)和恢復(fù)蛋白。
27.一種治療自身免疫病的方法，其特征在于，所述方法包括共施用有效量的抑制素和有效量的非抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑給罹患自身免疫病的病人。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，非抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑是免疫調(diào)節(jié)序列。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，免疫調(diào)節(jié)序列選自(a)5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’和(b)5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶3’，其中X和Y是任何天然產(chǎn)生或合成的核苷酸，除了X和Y不能是胞嘧啶-鳥嘌呤。
30.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，非抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑是骨橋蛋白。
31.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，非抗原特異性免疫調(diào)節(jié)劑是自身載體，載體包含編碼骨橋蛋白的多核苷酸。
32.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，自身免疫病選自多發(fā)性硬化、胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和自身免疫性葡萄膜炎。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，自身免疫病是多發(fā)性硬化。
34.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，抑制素選自羅蘇伐他汀、美伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、昔伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀和西伐他汀。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，抑制素是阿托伐他汀。
全文摘要
提供治療自身免疫病的方法，這是通過共施用抑制素和第2種免疫調(diào)節(jié)劑。第2種免疫調(diào)節(jié)劑可以是抗原特異或非抗原特異。
文檔編號(hào)A61P25/00GK1652770SQ03810847
公開日2005年8月10日 申請(qǐng)日期2003年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月29日
發(fā)明者H·蓋倫, L·斯坦曼 申請(qǐng)人:利蘭·斯坦福青年大學(xué)托管委員會(huì), 貝希爾治療學(xué)股份有限公司