專利名稱：Il－18抑制劑在治療和/或預(yù)防周圍血管疾病中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于血管疾病領(lǐng)域。更明確地說，它涉及IL-18抑制劑在治療和/或預(yù)防周圍血管疾病中的用途。本發(fā)明還涉及IL-18抑制劑在防止截肢中的用途。
背景技術(shù)：
細胞因子白細胞介素18(IL-18)最初被描述為γ干擾素(IFN-γ)的誘導(dǎo)因子(Nakamura等人，1989)。它是T淋巴細胞輔助細胞類型1(TH1)應(yīng)答的發(fā)展中的一個早期信號。IL-18與IL-12、IL-2、抗原、促分裂素以及可能的其他因子一起作用，從而誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生。IL-18還增強了GM-CSF和IL-2的生產(chǎn)，加強了由anti-CD3誘發(fā)的T細胞增殖，并且增加Fas介導(dǎo)的自然殺傷細胞的殺傷作用。
成熟的IL-18是通過IL-1β轉(zhuǎn)化酶(ICE，caspase-1)由它的前體產(chǎn)生。
IL-18受體至少由兩個在配體結(jié)合過程中共同起作用的組分(IL-18Rα和IL-18Rβ)構(gòu)成。在鼠IL-12刺激的T細胞中發(fā)現(xiàn)了IL-18的高親和力與低親和力的結(jié)合位點(Yoshimoto等人，1998)，這暗示了是一個多重的鏈受體復(fù)合物。迄今為止已被識別的兩個受體亞基，都屬于IL-1受體家族(Parnet等人，1996；Kim等人，2001)。IL-18的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及NF-κB的激活(DiDonato等人，1997)。IL-18的受體復(fù)合物由兩個受體鏈構(gòu)成一個配體結(jié)合鏈被命名為IL-18Rα鏈，而一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈被命名為IL-18Rβ鏈。IL-18Rα鏈最初作為結(jié)合于放射性標記的IL-18上的細胞表面蛋白質(zhì)而被分離的；該蛋白質(zhì)被純化，而它的氨基酸序列揭示與早先報告的一個名為IL-1R-相關(guān)蛋白(IL-1Rrp)的孤兒受體(Torigoe等人，1997)有相同性。
最近，一與IL-18有高親和性的可溶性蛋白質(zhì)已從人尿液中被分離出來，并且人和小鼠的cDNA與人類的基因已被克隆(Norvick等人，1999；WO99/09063)。該蛋白質(zhì)被稱為IL-18結(jié)合蛋白(IL-18BP)。
IL-18BP不是已知IL-18受體之一的胞外結(jié)構(gòu)域，而是一個分泌的、自然狀態(tài)下循環(huán)的蛋白。它屬于一個新的分泌蛋白家族，該家族還包括數(shù)個痘病毒編碼的蛋白質(zhì)(Norvick等人，1999)。來自尿的以及重組的IL-18BP都特異性地和高親和力地與IL-18結(jié)合，并且調(diào)節(jié)IL-18的生物親和力。
IL-18BP基因位于人染色體11q13，在一個8.3kb的基因組序列中沒找到編碼跨膜結(jié)構(gòu)域的外顯子。迄今為止，已經(jīng)在人體中發(fā)現(xiàn)了由不同mRNA剪接而產(chǎn)生的4種IL-18BP剪接變異體或同工型。它們被命名為IL-18BPa，b，c和d，都具有相同的N末端，但C末端有所不同(Norvick等人，1999)。這些同工型結(jié)合于IL-18的能力有差異。在這四種之中，已知hIL-18BP同工型a和c具有中和IL-18的能力。人IL-18BP同工型可結(jié)合于鼠IL-18。
周圍血管疾病(peripheral vascular disorder)可以是動脈的(閉塞性或功能性)，靜脈的，動靜脈的(比如，動靜脈瘺管)，或淋巴的疾病。閉塞性動脈疾病包括周圍動脈閉塞和伯格氏病(又稱血栓閉塞性血管炎)。功能性動脈疾病可以是血管痙攣(雷諾現(xiàn)象和疾病，肢端發(fā)紺癥)或血管舒張(紅斑性肢痛病)。它們可繼發(fā)于血管的局部病變或繼發(fā)于交感神經(jīng)系統(tǒng)活性的紊亂，或可伴有器質(zhì)性血管疾病。靜脈疾病包括靜脈血栓形成和靜脈曲張，復(fù)合性動靜脈疾病包括動靜脈瘺管，而淋巴疾病包括淋巴水腫和脂血癥(lipedema)。
周圍動脈閉塞指末端的血供應(yīng)受阻塞，通常是由動脈粥樣斑塊(動脈粥樣化)、血栓或栓塞引起。
周圍動脈閉塞可引起急性或慢性局部缺血。急性局部缺血是由破裂的近端動脈粥樣斑塊、由在先前的動脈硬化疾病基礎(chǔ)上發(fā)生的急性血栓癥、以及由心臟、大動脈或其他大血管的栓塞，或裂開的動脈瘤所引起的。慢性局部缺血由逐漸擴大的動脈粥樣斑塊引起。
血液高半胱氨酸的持續(xù)上升，通過破壞內(nèi)皮細胞，從而使大動脈及其分支動脈、末端動脈、腦動脈以及還有可能冠狀動脈易于提前發(fā)生動脈粥樣硬化。雖然高半胱氨酸的水平的提高通常與其他一些危險因素有關(guān)，但是它們可通過飲食和補充維生素B來改善。
動脈閉塞的臨床綜合病癥依賴于所涉及的血管、阻塞的范圍、閉塞發(fā)展的速度、以及側(cè)支流量是否足夠。
急性閉塞的病史包括突然發(fā)生四肢的劇烈疼痛、發(fā)冷、麻木、和蒼白。四肢冷且無力，閉塞處遠端的脈搏消失。急性閉塞會造成嚴重的缺血，表現(xiàn)為感覺和運動機能的缺失并且最后(6-8小時后)觸診可發(fā)現(xiàn)肌肉的觸痛和硬化。
在慢性閉塞中，癥狀與組織缺血的隱性發(fā)展有關(guān)。最初的癥狀為間歇性跛行綜合癥。跛行的癥狀為疼、痛、抽筋或在步行時感覺疲勞。這些癥狀在小腿上最常見但也可能發(fā)生在足部、腿、髖部或臀部。
最后，缺血性疼痛會在休息時發(fā)生，在肢的最遠端發(fā)生劇烈的、無休止的疼痛，這種疼痛可因海拔增加而加劇并且常常使人無法入睡。
動脈閉塞的程度和間歇性跛行綜合癥的位置緊密相連，比如，大動脈疾病經(jīng)常造成臀部、髖部和小腿的跛行，而股動脈的脈搏下降或消失。在股腘(femoropopliteal)疾病中，跛行一般發(fā)生在小腿上，并且股動脈以下的所有脈搏全都消失。在有小血管疾病的病人中(比如，血栓閉塞性血管炎，糖尿病)，股腘脈搏可能還在，但足脈搏消失了。腳抬起1至2分鐘后變蒼白(根據(jù)情況可出現(xiàn)皮膚變紅)，有助于確認動脈的供血不足。抬起后相關(guān)靜脈的血液充填時間超過了正常的15秒限度。如果跛行癥狀發(fā)生時遠端脈搏良好，就應(yīng)該在鑒別診斷中考慮椎管狹窄的可能性。
嚴重缺血的腳會又痛又冷，并時常麻木。在慢性的病例中，皮膚是干的且有鱗紋，指/趾甲和毛發(fā)生長得差。當局部缺血病情惡化，潰瘍可能出現(xiàn)(一般在腳趾或腳后跟上，偶爾會在腿上)，尤其是局部外傷后。水腫通常不會出現(xiàn)，除非病人把腿固定在能靠的位置來減輕痛苦，然而，嚴重的缺血腿有可能會萎縮。更廣泛的閉塞會危及組織活力，導(dǎo)致壞死或壞疽。缺血并伴有相關(guān)腳的皮膚發(fā)紅、疼痛和腫與蜂窩織炎或靜脈供血不足很相似。動脈的無創(chuàng)傷性測試能使診斷明朗化。
在所有周圍血管疾病中，伯格氏病(血栓閉塞性血管炎)是一種閉塞性疾病，表現(xiàn)為小型和中型的動脈和靜脈中的炎性變化。
伯格氏病發(fā)生在吸煙者中，絕大多數(shù)為20到40歲的男子。只有5％的病例發(fā)生在女性身上。近年來，其診斷頻率急劇下降，這是因為人們更好地理解了這種疾病與動脈硬化閉塞相比在臨床和血管造影上的特征。
雖然病因不明，沒有記錄過在非吸煙者中發(fā)現(xiàn)的伯格氏病，這暗示吸煙是主要的致病因素，可能是延發(fā)型的超敏性或中毒性脈管炎。血栓閉塞性血管炎可能是特定表型的人對煙草的反應(yīng)，因為有這種病的患者中有更高的HLA-A9和HLA-B5水平；或者是一種自身免疫疾病，其中對I和III型人膠原有細胞介導(dǎo)的敏感性(膠原是血管的組成成分)。
與動脈硬化癥不同，伯格氏病不涉及冠狀動脈。
該疾病涉及小型和中型的動脈，并且經(jīng)常以節(jié)段性模式涉及四肢的淺靜脈。偶爾，在嚴重的疾病中，身體其他部位的血管也受影響。病理表現(xiàn)是非化膿性全身動脈炎或全身靜脈炎，并有患病血管形成血栓。在急性損害中，發(fā)生內(nèi)皮細胞的增殖和淋巴細胞滲入內(nèi)膜層，但內(nèi)部彈性薄層是完整的。血栓變得有組織的并隨后不完全地再穿通。血管中層被很好地保持但可被成纖維細胞浸潤。原因是外膜通常更廣泛地被成纖維細胞所浸潤，較早的病區(qū)顯示出動脈外周的纖維化，這對相鄰的靜脈和神經(jīng)也有影響。
癥狀和跡象是動脈缺血和表淺性血栓靜脈炎。發(fā)作是漸進的，從上肢和下肢最遠端的血管開始，并且向近端發(fā)展，在遠端壞疽處達到頂峰。在疾病的客觀癥狀表現(xiàn)出來之前，病人會抱怨發(fā)冷、麻木、麻刺和灼痛。雷諾現(xiàn)象是常見的。間歇性跛行綜合癥在相應(yīng)的肢端發(fā)生(通常為足弓或腿，但很少為手，手臂或腿)。痛是持續(xù)的并伴隨著更嚴重的缺血(如在壞疽之前的階段)，而且伴有潰瘍和壞疽。通常地，交感神經(jīng)的活性過度表現(xiàn)為發(fā)冷、出汗過度以及相關(guān)肢端變得青紫，這可能是由劇烈、持續(xù)的疼痛所引起。
局部缺血性潰瘍和壞疽，通常有一個或多個的數(shù)字(digits)，會在疾病的早期發(fā)生但并不急性發(fā)作。無創(chuàng)傷性研究表明，在患病的腳趾、腳和手指上發(fā)生嚴重的血流量下降和血壓下降。該疾病向近端發(fā)展。
另一種周圍血管疾病是周圍動脈疾病，其中下肢患周圍動脈疾病(PAD)的病人會發(fā)展為嚴重的、威脅到四肢的局部缺血。缺血性休息痛、無法治愈的潰瘍和壞疽都是壞結(jié)果的預(yù)兆。這些病人失去四肢的風險很高。對嚴重四肢缺血的及時檢測、評估及隨后有效的血管再形成，對于挽救四肢和保持全身健康是必需的。
慢性的危重四肢局部缺血是動脈閉塞疾病的最后結(jié)果，最常見的是動脈硬化癥。除了與高血壓、高膽固醇癥、吸煙和糖尿病有關(guān)的動脈硬化癥之外，導(dǎo)致慢性的危重四肢局部缺血的頻率較低的病因包括伯格氏病、或血栓閉塞性血管炎以及某些形式的動脈炎。
慢性的危重局部缺血的發(fā)展通常需要多個位置的動脈閉塞，從而嚴重減少了流向組織的血流。危重組織缺血臨床表現(xiàn)為休息痛、不可治愈的傷口(由于治愈傷口有更高的代謝需求)或組織壞死(壞疽)。
缺血性休息痛經(jīng)典地被描述成在腳和腳趾的團塊中的灼痛，當病人在夜里臥床時，疼痛更為明顯。缺血性休息痛發(fā)生在足部，那里的組織離心臟最遠并且位于動脈閉塞處的遠端。不可治愈性傷口通常被發(fā)現(xiàn)在因穿鞋不合腳或受傷造成的足部創(chuàng)傷區(qū)域。通常如果一個傷口經(jīng)歷4-12周保守療法(比如定期換藥、避免創(chuàng)傷、治療感染和清除壞死組織)的嘗試之后，還沒有起色的話，它就被認為是不可治愈的。
壞疽通常被發(fā)現(xiàn)在腳趾。當血流供應(yīng)太低以致于在血液灌流最差的組織處自發(fā)地發(fā)生壞疽時，就會得壞疽。
雖然精心設(shè)計的保守療法可以使很多危重四肢缺血患者受益，但是他們患的這種病的嚴重性可導(dǎo)致考慮手術(shù)介入。外科介入包括血管再造術(shù)或截肢術(shù)。如果病人愿意進行血管再造術(shù)并且是可接受的手術(shù)候選人，常常進行動脈造影術(shù)，以便為血管再造術(shù)作進一步的評估和計劃。在一些醫(yī)學(xué)中心，核磁共振血管造影術(shù)被用來作為動脈造影術(shù)的替代或補充，以便降低暴露于染料的風險。用血管造影術(shù)來保留四肢是有成效的，可以讓大多數(shù)病人得到更好的生活質(zhì)量，并且手術(shù)后的發(fā)病率和死亡率比截肢術(shù)更低。保留四肢應(yīng)該是大多數(shù)慢性危重四肢局部缺血患者的目標。
血管再造術(shù)的可行性由動脈造影術(shù)發(fā)現(xiàn)的情況和旁路通道的可用性所決定。血管成形術(shù)或支架放置，或者兩者，對于短小的、近端的損傷(比如那些跛行病人的損傷)是最成功的，但不可能是危重四肢缺血情況下所需的唯一治療手段，因為動脈閉塞疾病有多級的特性。理想的旁路通道為大隱靜脈，但其他通道包括小隱靜脈、臂靜脈或人工通道(prosthetic conduit)。在大多數(shù)手術(shù)操作中，小腿動脈的三年分流術(shù)明顯率是從人工通道40％到隱靜脈通道的85％。作為比較，對保守療法的研究表明，其對不可治愈性傷口有25-49％的成功率，以及對缺血性休息痛有50-80％的改善率。
一些特定的病人可能需要初期的截肢術(shù)，例如那些患有不合適血管再造術(shù)的大面積組織壞死、威脅生命的感染或損傷的病人。決定是對病人癥狀進行緊密監(jiān)控并且施以保守治療，或是決定實施血管再造術(shù)或截肢術(shù)，都依賴于對手術(shù)與保守療法相比所帶來的風險和益處的仔細評估。
更為重要的是，它依賴于病人對可選方案的創(chuàng)傷性和適當性的理解。甚至一些因為他們的病情狀況而不能行走的病人，也認為截肢術(shù)是不合適的，而且并不是所有病人都有動力來進行截肢術(shù)后康復(fù)所需的工作。如果決定進行截肢術(shù)，截肢程度應(yīng)該使治愈的可能性最大同時讓病人有最大機會進行功能恢復(fù)。
對慢性危重四肢缺血的診斷包括休息時顯現(xiàn)的疼痛，不可治愈性傷口以及壞疽。缺血性休息痛通常被描述成在足弓或足部遠端的灼痛，該疼痛發(fā)生在病人橫臥時，但當病人回到足部下垂位置時疼痛緩解。支持診斷危重四肢缺血的客觀血液動力學(xué)參數(shù)包括踝臂指數(shù)≤0.4，踝收縮壓≤50mm Hg，或者腳趾收縮壓≤30mm Hg。干預(yù)療法可包括保守療法、血管再造術(shù)或截肢術(shù)。進行性壞疽、迅速擴大的傷口或持續(xù)的缺血性休息痛，預(yù)示著威脅四肢，并且暗示那些不存在禁止性手術(shù)風險的病人有必要實施血管再造術(shù)。通常需要旁路移植物，因為危重四肢缺血中狹窄的動脈具有多級和遠端的特性。糖尿病患者比其他病人更易患有不適合旁路移植治療的遠端疾病。與截肢術(shù)相比較，血管再造術(shù)更有成效，并且手術(shù)后的發(fā)病率和死亡率較低。保留四肢應(yīng)該是大多數(shù)危重四肢缺血患者的目標。
目前，周圍血管疾病的主要治療方法包括創(chuàng)傷療法，比如血管再造術(shù)或甚至截肢。鑒別出能刺激周圍新血管形成同時不使動脈粥樣硬化斑塊惡化的的藥物，在本醫(yī)藥領(lǐng)域有重大的治療重要性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于一個發(fā)現(xiàn)在試驗動物模型上誘發(fā)周圍缺血后，IL-18抑制劑可以刺激新血管形成。新血管形成的發(fā)生與VEGF/Akt信號的激活有關(guān)，并且伴隨著骨髓內(nèi)皮祖細胞的活動和分化的增多。
基于這些結(jié)果，提供了新的需要新血管形成或血管再造術(shù)的來治療或預(yù)防周圍血管疾病的治療方法。
因此，本發(fā)明涉及用IL-18抑制劑來治療和/或預(yù)防周圍血管疾病的方法，特別是周圍缺血癥。
本發(fā)明進一步涉及IL-18抑制劑在制造治療和/或預(yù)防跛行和壞疽的藥物中的用途。
此外，本發(fā)明涉及IL-18抑制劑在制造防止截斷(特別是截肢)的藥物中的用途。
為了治療或預(yù)防周圍血管疾病，使用包括IL-18抑制劑的編碼序列的表達載體，以及使用表達載體來誘導(dǎo)和/或增強細胞內(nèi)IL-18抑制劑的內(nèi)源產(chǎn)生，也包括在本發(fā)明內(nèi)。
本發(fā)明還涉及一種治療周圍血管疾病的方法，包括給予需要治療的宿主抑制有效量的IL-18抑制劑。
附圖簡述

圖1中的A)顯示了在小鼠股動脈閉塞3天和28天后，典型的微血管造影術(shù)下的右邊缺血性后肢和左邊非缺血性后肢。B)顯示了接受了pcDNA3-mIL18BP(IL-18BP)或空質(zhì)粒(對照)治療3或28天的小鼠的缺血性/非缺血性的血管造影術(shù)的評分。數(shù)值為平均值±SEM，每個組n＝7。**p＜0.01，與對照小鼠相比。
圖2顯示了A)在用pcDNA3-mIL18BP(IL-18BP)或空質(zhì)粒(對照)治療的小鼠體內(nèi)，用激光多普勒灌注成像法監(jiān)測到的缺血所誘導(dǎo)的后肢血流改變。在彩色編碼圖像中，正常灌注用紅色標出，后肢缺血造成的血流明顯減少用藍色標出。B)是血流量的定量評估，用缺血性四肢的血流量與非缺血性四肢的血流量之比來表示。數(shù)值為平均值±SEM，每組n＝7。**p＜0.01，與對照小鼠相比。
圖3顯示了A)為在股動脈閉塞28天后，在非缺血性和缺血性腿中VEGF蛋白質(zhì)含量的代表性Western印跡結(jié)果。B)為VEGF蛋白水平的定量評估，用在缺血性四肢中蛋白質(zhì)含量與非缺血性四肢中蛋白質(zhì)含量之比來表示。數(shù)值為平均值±SEM，每組n＝7。與非缺血的對照相比**p＜0.01，并且與缺血的對照相比p＜0.05。
圖4顯示了A)在股動脈閉塞28天后，在非缺血性和缺血性腿中磷酸-Akt蛋白質(zhì)(phospho-Akt protein)含量的代表性Western印跡結(jié)果。B)是磷酸-Akt蛋白水平的定量評估，用缺血性四肢中蛋白質(zhì)含量與非缺血性四肢中蛋白質(zhì)含量之比來表示。數(shù)值為平均值±SEM，每組n＝7。與非缺血的對照相比*p＜0.05，**p＜0.01；與缺血的對照相比p＜0.05。
圖5A)從沒有股動脈結(jié)扎的小鼠(假對照)和用pcDNA3-mIL18BP治療的小鼠(IL-18BP)或者用空質(zhì)粒治療的小鼠(對照)的骨髓中分離的EPC(內(nèi)皮祖細胞)的代表性圖像。EPC特征是粘附細胞，并且具有對AcLDL-Dil和von-Willebrand因子(vWF)的雙陽性染色結(jié)果。B)用pcDNA3-mIL18BP或空質(zhì)粒進行治療的小鼠中雙陽性細胞的定量。數(shù)值為平均值±SEM，每組n＝5。
與對照相比***p＜0.001，與沒有股動脈結(jié)扎的小鼠(假對照)相比p＜0.001。
發(fā)明詳述本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)IL-18抑制劑能在活體鼠科疾病模型中顯著增加四肢缺血后的缺血后血管再形成，并且不影響非缺血性四肢的血管密度。因此，本發(fā)明提供了一種新治療方法，用來治療或預(yù)防需要增強的組織灌注的周圍血管疾病。
因此，本發(fā)明涉及IL-18抑制劑在制造治療和/或預(yù)防周圍血管疾病的藥物中的用途。
本發(fā)明上下文中的術(shù)語“預(yù)防”不僅指對特定病情的全面防止，而且還包括對發(fā)病之前或疾病早期發(fā)作時病癥的任何部分的或?qū)嵸|(zhì)性的防止、減輕、減少、減緩或減弱。
本發(fā)明上下文中的術(shù)語“治療”意指任何對病情發(fā)展的改善效果，包括對疾病發(fā)作后病情發(fā)展的減輕、減少、減緩或減弱。
如本文所用，術(shù)語“周圍血管疾病”意指那些影響肢端的動脈、靜脈、淋巴管的疾病或失調(diào)。周圍血管疾病可以是動脈的(閉塞性或功能性)、靜脈的、動靜脈的(比如，動靜脈瘺管)、或淋巴的疾病。閉塞性動脈疾病包括周圍動脈閉塞和血栓閉塞性血管炎。功能性動脈疾病可以是血管痙攣(雷諾現(xiàn)象和疾病，肢端發(fā)紺癥)或血管舒張(紅斑性肢痛病)。它們可繼發(fā)于血管的局部病變或繼發(fā)于交感神經(jīng)系統(tǒng)活性的紊亂，或可伴有器質(zhì)性血管疾病。靜脈疾病包括靜脈血栓形成和靜脈曲張，復(fù)合性動靜脈疾病包括動靜脈瘺管，而淋巴疾病包括淋巴水腫和脂血癥。
術(shù)語周圍血管疾病包括上面“發(fā)明背景”中所述的所有醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥、疾病、紊亂或者癥狀。
在本發(fā)明上下文中的術(shù)語“IL-18抑制劑”，意指任何調(diào)節(jié)IL-18的產(chǎn)生和/或活性的分子，其調(diào)節(jié)使得IL-18的產(chǎn)生和/或活性被減緩、減少，或部分地、實質(zhì)性地或完全地被防止或阻斷。
產(chǎn)生抑制劑是能負面影響IL-18的合成、加工或成熟的任何分子。根據(jù)本發(fā)明所提到的抑制劑可以是，例如白細胞介素IL-18的基因表達的抑制物，減少或防止IL-18mRNA轉(zhuǎn)錄或者導(dǎo)致mRNA降解的反義mRNAs，妨礙正確折疊或者部分地或?qū)嵸|(zhì)性防止IL-18分泌的蛋白質(zhì)，降解IL-18的蛋白酶(一旦IL-18被合成)，切割pro-IL-18以產(chǎn)生成熟IL-18的蛋白酶的抑制劑(如比如天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1的抑制劑)等。
IL-18活性抑制劑可以是例如IL-18拮抗劑。拮抗劑以足夠的親和力和特異性結(jié)合于或鰲合(sequester)于IL-18分子本身，從而部分或基本上中和了IL-18或IL-18上的負責使IL-18結(jié)合于其配體(如結(jié)合于受體)的結(jié)合位點。拮抗劑也可以抑制IL-18信號路徑，該路徑在IL-18和其受體結(jié)合之后在細胞內(nèi)被激活。
IL-18活性抑制劑也可以是可溶性的IL-18受體或模仿受體的分子，或阻斷IL-18受體的物質(zhì)，或IL-18抗體(如多克隆或單克隆抗體)，或能防止IL-18結(jié)合于其靶目標從而減輕或防止IL-18介導(dǎo)的細胞內(nèi)或細胞外的反應(yīng)的任何其他物質(zhì)或分子。
在本發(fā)明的較佳實施例中，周圍血管疾病是周圍動脈疾病。
“周圍動脈疾病”是一種涉及從手臂到腿的主動脈和動脈的任何部位的動脈變窄的疾病。疾病的發(fā)作可以是突發(fā)的或漸進的，并且通常導(dǎo)致局部缺血(血管供血區(qū)域的供氧減少)。
較佳地，根據(jù)本發(fā)明，周圍動脈疾病涉及下肢。周圍動脈疾病或閉塞可以是慢性的或急性的。周圍動脈疾病通常與跛行有關(guān)。
因此，本發(fā)明進一步涉及用IL-18抑制劑來治療和/或預(yù)防跛行。跛行是腿部(尤其小腿)的疼痛，疼痛的不斷發(fā)作導(dǎo)致了跛行。通常跛行在走路時被感覺到，而在休息時平息。因此，它通常被稱為間歇性跛行。這種常見的跛行疼痛的間歇性特征是因為對腿部肌肉供氧的暫時不足。不足的氧供應(yīng)是給腿部供血的動脈變窄或閉塞所造成的。這樣限制了對腿部肌肉的供氧并且當這些肌肉的氧需求因鍛煉或行走而上升時特別容易被察覺。
在本發(fā)明的較佳實施例中，周圍血管疾病為血栓閉塞性血管炎(伯格氏病)。“伯格氏病”為一種閉塞性疾病，特征是在小型和中型的動脈和靜脈上的炎性改變，通常在吸煙者中發(fā)生，絕大多數(shù)是20到40歲的男性。
該疾病牽涉到小型和中型的動脈，并且經(jīng)常以節(jié)段性模式涉及四肢的淺靜脈。
在另一個較佳實施例中，周圍血管疾病為周圍性缺血，尤其是四肢缺血?！叭毖笔且环N血供應(yīng)不足，通常由血管的閉塞或損傷所致。“周圍性缺血”特別指在四肢(如手臂或腿)中的缺血，從而導(dǎo)致相應(yīng)四肢組織的供氧不足。
在本發(fā)明的另一較佳實施例中，這種四肢缺血是危重四肢缺血。“危重四肢缺血”是這樣一種狀態(tài)，即對四肢的血液供應(yīng)太少了，以致于威脅到其存活。休息痛、潰瘍或壞疽的出現(xiàn)就意味著危重四肢缺血。壞疽一詞被用于描述壞死的組織，并且它通常作為四肢缺血所致結(jié)果而出現(xiàn)，或者伴隨四肢缺血出現(xiàn)。缺血性潰瘍是血供應(yīng)不足所造成的。
危重四肢缺血(包括壞疽或潰瘍)，需要實施血管再造術(shù)來避免截肢。因此，本發(fā)明還涉及用IL-18抑制劑來治療和/或預(yù)防壞疽和潰瘍。
周圍血管疾病的最終后果(尤其是周圍缺血)，可導(dǎo)致受到影響的四肢被截斷，特別是患病的下肢或腳。血管再造術(shù)可以讓患病組織重新接受血液供應(yīng)，因而有助于治愈過程。
因此，本發(fā)明進一步涉及用IL-18抑制劑來制造用于預(yù)防截肢(尤其是下肢、腳或腳趾)的藥物。
在本發(fā)明的一個較佳實施例中，IL-18抑制劑選自天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)抑制劑(ICE)，針對IL-18的抗體，針對任何IL-18受體亞基的抗體，IL-18信號途徑的抑制劑，與IL-18競爭和阻斷IL-18受體的IL-18拮抗劑，和IL-18結(jié)合蛋白，或其抑制IL-18生物活性的同工型、突變蛋白、融合蛋白、功能衍生物、活性片段或者循環(huán)重排衍生物(circularly permutated derivatives)。
如本文所用，術(shù)語“IL-18結(jié)合蛋白”與“IL-18結(jié)合蛋白質(zhì)”或“IL18BP”的意義相同。它包括WO99/09063或Novick等人(1999)中所定義的IL-18結(jié)合蛋白，包括IL-18結(jié)合蛋白的剪接變異體和/或同工型(如Kim等人，2000所定義的那樣)，它們結(jié)合于IL-18。具體地，IL-18BP的人同工型a和c可用于本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明有用的蛋白質(zhì)可以是糖基化的或非糖基化的，它們可衍生自天然原料(如尿液)，或者較佳地是重組產(chǎn)生的。重組表達可以是在原核表達系統(tǒng)(如大腸桿菌)，或在真核表達系統(tǒng)中進行，并且較佳地在哺乳動物表達系統(tǒng)中進行。一種特別適合表達哺乳動物蛋白的細胞株為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系。
如本文所用，術(shù)語“突變蛋白”是指IL-18BP的類似物或者病毒性IL-18BP的類似物，其中天然IL-18BP或病毒性IL-18BP的一個或多個氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基所替代，或被缺失，或者一個或多個氨基酸殘基被插入IL-18BP或者病毒性IL-18BP的天然序列中，并且與野生型IL-18BP或病毒性IL-18BP相比，沒有顯著改變所形成的蛋白產(chǎn)物的活性。這些突變蛋白可用已知的合成方法和/或定點誘變技術(shù)或任何其他合適的已知技術(shù)制備。
本發(fā)明的突變蛋白包括由在嚴格條件下雜交于編碼IL-18BP或病毒性IL-18BP的DNA或RNA的核酸(如DNA或RNA)所編碼的蛋白質(zhì)，正如WO99/09063中所述的那樣。術(shù)語“嚴格條件”是指本領(lǐng)域一般技術(shù)人員常規(guī)地稱為“嚴格的”雜交條件以及隨后的洗滌條件。參照Ausubel等人，CurrentProtocol偶發(fā)Molecular Biology(分子生物學(xué)的目前方案)，同上，Interscience，N.Y.，§§6.3和6.4(1987，1992)，以及Sambrook等人(同上)。不起限制作用，嚴格條件的例子包括洗滌條件，在低于所研究的雜交體的Tm計算值12-20攝氏度下，如在2×SSC和0.5％SDS中洗滌5分鐘，在2×SSC和0.1％SDS中洗滌15分鐘；在0.1×SSC和0.5％SDS，于37攝氏度洗滌30-60分鐘并且在0.1×SSC和0.5％SDS，于68攝氏度洗滌30-60分鐘。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員知道，嚴格條件還依賴于DNA序列、寡核苷酸探針(如10-40堿基)或混合的寡核苷酸探針的長度。如果使用混合探針，優(yōu)選使用四甲基氯化銨(TMAC)來代替SSC。參考Ausubel(同上)。
任何這樣的突變蛋白優(yōu)選具有與IL-18BP高度相同的氨基酸序列，或者與病毒性IL-18BP高度相同的氨基酸序列，從而具有與IL-18BP相當?shù)幕钚?。IL-18BP的一種活性是其結(jié)合IL-18的能力。只要突變蛋白有對IL-18實質(zhì)性的結(jié)合活性，它就可用于純化IL-18(如通過親和層析)，因而就可被認為具有與IL-18BP實質(zhì)上相似的活性。因此，可通過常規(guī)實驗來確定任一給定的突變蛋白是否實質(zhì)上具有與IL-18BP相同的活性，該實驗包括對該突變蛋白進行簡單的夾心競爭測試，以測定它是否結(jié)合于適當標記的IL-18(如放射免疫測試或ELISA測試)。
在一個較佳實施例中，與IL-18BP或病毒編碼的IL-18BP類似物的序列相比，任何這類突變蛋白具有至少40％的相同性或同源性，如WO99/09063中所定義的那樣。更佳地，它具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或最佳地至少90％的相同性或同源性。
本發(fā)明可用的IL-18BP多肽的突變蛋白或者病毒性IL-18BP的突變蛋白，或相應(yīng)的編碼核酸，包括由基本一致的、作為置換肽或多核苷酸序列所構(gòu)成的有限集合，這些物質(zhì)可由本技術(shù)一般技術(shù)人員基于本文的教導(dǎo)和指導(dǎo)，在無過分試驗的情況下，通過常規(guī)方法制得。
根據(jù)本發(fā)明，突變蛋白的優(yōu)選改變是已知的“保守性”置換。IL-18BP的多肽或蛋白質(zhì)或病毒性IL-18BP的保守性氨基酸置換，可包括一組內(nèi)的近似氨基酸，這些近似氨基酸有足夠相似的物理化學(xué)特性以致于在組成員之間的置換將保持分子的生物功能(Grantham，1974)。很清楚，還可在上述氨基酸序列中插入或缺失氨基酸，而不改變它們功能，尤其是如果這些插入或缺失只涉及到少數(shù)氨基酸，比如少于30個，較佳地少于10個，并且不取消或置換那些對功能構(gòu)象至關(guān)重要的氨基酸，比如半胱氨酸殘基。由這些插入和/或缺失所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和突變蛋白屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
較佳地，相似氨基酸(synonymous amino acid)組為表1所定義的那些；更佳地，相似氨基酸組為表2所定義的那些；最佳地，相似氨基酸組為表3所定義的那些。
表1優(yōu)選的相似氨基酸組氨基酸 相似組Ser Ser，Thr，Gly，AsnArg Arg，Gln，Lys，Glu，HisLeu Ile，Phe，Tyr，Met，Val，LeuPro Gly，Ala，Thr，ProThr Pro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，ThrAla Gly，Thr，Pro，AlaVal Met，Tyr，Phe，Ile，Leu，ValGly Ala，Thr，Pro，Ser，GlyIle Met，Tyr，Phe，Val，Leu，IlePhe Trp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，PheTyr Trp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，TyrCys Ser，Thr，CysHis Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，HisGln Glu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，GlnAsn Gln，Asp，Ser，AsnLys Glu，Gln，His，Arg，Lys
AspGlu，Asn，AspGluAsp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，GluMetPhe，Ile，Val，Leu，MetTrpTrp表2更優(yōu)選的相似氨基酸組氨基酸相似組Ser SerArg His，Lys，ArgLeu Leu，Ile，Phe，MetPro Ala，ProThr ThrAla Pro，AlaVal Val，Met，IleGly GlyIle Ile，Met，Phe，Val，LeuPhe Met，Tyr，Ile，Leu，PheTyr Phe，TyrCys Cys，SerHis His，Gln，ArgGln Glu，Gln，HisAsn Asp，AsnLys Lys，ArgAsp Asp，AsnGlu Glu，GlnMet Met，Phe，Ile，Val，LeuTrp Trp表3最優(yōu)選的相似氨基酸組氨基酸 相似組Ser SerArg ArgLeu Leu，Ile，MetPro ProThr ThrAla AlaVal ValGly GlyIle Ile，Met，LeuPhe PheTyr TyrCys Cys，SerHis HisGln GlnAsn AsnLys LysAsp AspGlu GluMet Met，Ile，LeuTrp Met可通過在蛋白質(zhì)內(nèi)的產(chǎn)生氨基酸置換，得到用于本發(fā)明的IL-18BP多肽或蛋白的突變蛋白或者病毒性IL-18BP的突變蛋白，其例子包括任何已知的方法步驟，如在Mark等人的美國專利4959314，4588585，4737462；Koths etal.的美國專利5116943，Namen等人的美國專利4965195；Chong等人的美國專利4879111，和Lee等人的美國專利5017691中所述的方法；以及美國專利4904584(Shaw等人)中所述的賴氨酸置換蛋白質(zhì)。
術(shù)語“融合蛋白”是指一種多肽，其中包含IL-18BP或病毒性IL-18BP，或其突變蛋白或片段，并和其他蛋白質(zhì)(如在體液中有更長保留時間的蛋白)融合在一起。因而IL-18BP或病毒性IL-18BP可與其他蛋白質(zhì)、多肽等融合，如免疫球蛋白或其片段。
如本文所用，“功能衍生物”涵蓋IL-18BP或病毒性IL-18BP的衍生物，以及它們的突變蛋白和融合蛋白，這些物質(zhì)可用本領(lǐng)域已知的手段，從作為殘基側(cè)鏈或作為N末端或C末端基團存在的官能團制備而得，并且只要它們?nèi)匀皇轻t(yī)學(xué)上可接受的(即它們沒有破壞蛋白的與IL-18BP或病毒性IL-18BP的活性基本相似的活性，并且不會使含該物質(zhì)的組合物具有毒性)，那么它們就被包括在本發(fā)明中。
這些衍生物可以例如包括聚乙二醇支鏈，它可掩蓋抗原位點并且延長IL-18BP或病毒性IL-18BP在體液中的停留時間。其他的衍生物包括羧基的脂肪酯，羧基通過與氨或伯胺或仲胺反應(yīng)而形成的酰胺，氨基酸殘基的自由氨基與?；糠?如烷?；蛱辑h(huán)芳?；鶊F)形成的N-?；苌?，或自由羥基(如絲氨酰基或蘇氨?；鶜埢牧u基)與酰基部分形成的O-?；苌?。
作為IL-18BP和病毒性IL-18BP、突變蛋白和融合蛋白的“活性片段”，本發(fā)明包括了單獨的蛋白質(zhì)分子多肽鏈或其與相關(guān)分子或殘基相連(如糖或磷酸殘基)的多肽鏈的任何片段或前體，或蛋白質(zhì)分子或糖殘基自身的聚集體，只要所述片段具有與IL-18BP基本上相似的活性。
在本發(fā)明的另一較佳例中，IL-18抑制劑是針對IL-18或其受體(IL-18R)的抗體。針對任何IL-18R亞基(稱為IL-18Rα和β)的抗體，可根據(jù)本發(fā)明使用。
本發(fā)明的抗體可以是多克隆的或單克隆的、嵌合的、人源化的、或者甚至是全人的。重組抗體及其片段的特征為在體內(nèi)可高親和力地結(jié)合于IL-18或IL-18R并且毒性低?？稍诒景l(fā)明中使用的抗體的特征是，能夠治療病人一段足夠時間，從而良好直至優(yōu)異地減輕或緩和病癥，或與病癥有關(guān)的任何癥狀或癥候群，并且具有低毒性。
通過用IL-18或IL-18Rα或β進行免疫，可在動物(如兔子、山羊或小鼠)中容易產(chǎn)生中和抗體。免疫的小鼠特別適用于提供生產(chǎn)雜交瘤的B細胞源，雜交瘤依次培養(yǎng)以產(chǎn)生大量的抗IL-18單克隆抗體。
嵌合抗體是免疫球蛋白，其特征是有衍生自不同動物種類的兩個或多個的片段或部分。通常，嵌合抗體的可變化區(qū)衍生自非人哺乳動物的抗體，如鼠單克隆抗體，而免疫球蛋白的恒定區(qū)衍生自人免疫球蛋白分子。較佳地，兩個區(qū)域及其組合用常規(guī)方法測定(Elliot等人，1994)都具有低免疫原性。人源化抗體為用基因工程技術(shù)所產(chǎn)生的免疫球蛋白分子，其中鼠的恒定區(qū)被人的相應(yīng)區(qū)域所替代，同時保留鼠的抗原結(jié)合區(qū)域。形成的鼠-人嵌合抗體較佳地在人體中具有降低的免疫原性和改進的藥物動力特性(Knight等人，1993)。
因此，在另一較佳例中，抗IL-18或IL-18R的抗體是人源化抗體。人源化的抗-IL-18抗體的較佳例子在例如歐洲專利申請EP0974600中有描述。
在另一較佳實施例中，抗體是全人的。在例如WO00/76310，WO99/53049，US6162963或AU5336100中對產(chǎn)生人抗體的技術(shù)有詳盡的描述。
一種制備全人抗體的方法包括對小鼠體液免疫系統(tǒng)的“人源化”，即通過把人免疫球蛋白(Ig)的基因座引入到小鼠體內(nèi)(小鼠體內(nèi)的內(nèi)源性Ig基因已被失活)，產(chǎn)生可制造人Ig的小鼠品系(異小鼠(Xenomice))。Ig基因座在其物理結(jié)構(gòu)以及為了最終產(chǎn)生廣泛免疫應(yīng)答所需的基因重排和表達的過程兩方面都是復(fù)雜的。抗體多樣性主要是由Ig基因座中不同的V，D和J基因的組合重排所產(chǎn)生的。這些基因座還包含散布的調(diào)控元件，這些調(diào)控元件控制抗體表達、等位基因的排斥、類別轉(zhuǎn)換以及親和力成熟。將非重排的人Ig轉(zhuǎn)基因引入小鼠已表明，小鼠的重組機制與人類基因是相容的。此外，分泌抗原特異性的各種同種型hu-mAb的雜交瘤，可以通過用抗原免疫異小鼠而得到。
全人抗體及其產(chǎn)生方法是本領(lǐng)域中已知的(Mendez等人(1997)；Buggemann等人(1991)；Tomizuka等人，(2000)專利WO98/24893)。
在本發(fā)明高度優(yōu)選的實施例中，IL-18抑制劑為IL-18BP，或其同工型、突變蛋白、融合蛋白、功能衍生物、活性片段或循環(huán)重排衍生物。這些同工型、突變蛋白、融合蛋白或功能衍生物保留了IL-18BP的生物活性(尤其是結(jié)合于IL-18)，并且較佳地具有本質(zhì)上至少一種與IL-18BP相似的活性。理想地，與未經(jīng)修飾的IL-18BP相比，這些蛋白質(zhì)有增強的生物活性。較佳的活性片段具有比IL-18BP活性更好的活性，或具有其他優(yōu)勢，例如更好的穩(wěn)定性或更低的毒性或免疫原性，或者它們更容易大批量生產(chǎn)，或更容易純化。
IL-18BP及其剪接變異體/同工型的序列可從WO99/09063或Novick等人(1999)以及Kim等人(2000)的文獻中得到。
IL-18BP的功能衍生物可偶聯(lián)于聚合體以便改進蛋白質(zhì)的特性，比如穩(wěn)定性、半衰期、生物利用度、人體耐受性、或免疫原性。為了達到該目的，IL-18BP可連接于例如聚乙二醇(PEG)。PEG化可由已知的方法實施，例如WO92/13095所描述的方法。
因此，在本發(fā)明的較佳實施例中，IL-18抑制劑(特別是IL-18BP)是PEG化的。
在本發(fā)明另一較佳實施例中，IL-18抑制劑包括免疫球蛋白融合形式，即IL-18抑制劑是包括融合于全長或部分免疫球蛋白的全長或部分IL-18結(jié)合蛋白的融合蛋白。制造免疫球蛋白的融合蛋白的方法為本技術(shù)中熟知的，例如WO01/03737中所描述的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，本發(fā)明形成的融合蛋白保留了IL-18BP的生物活性，尤其是結(jié)合于IL-18的活性。融合可以是直接融合，或者通過短連接肽了解，連接肽的長度可以短至1-3個氨基酸殘基，或長達例如13-20氨基酸殘基。所述連接肽可以是引入的位于IL-18BP序列與免疫球蛋白序列之間的，例如序列為E-F-M(Glu-Phe-Met)的三肽，或含Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met的13聚氨基酸連接肽序列。形成的融合蛋白具有改進的特性，比如在體液中更長的保留時間(半衰期)、更高的特異活性、增加的表達水平，或者有助于融合蛋白的純化。
在一個較佳實施例中，IL-18BP被融合于Ig分子的恒定區(qū)。較佳地，它被融合于重鏈區(qū)域，比如人IgG1或IgG2的CH2和CH3區(qū)。包含IL-18BP和免疫球蛋白片段的特異性融合蛋白的生產(chǎn)方法，在例如WO99/09063的實施例11中有描述。Ig分子的其他同工型也適合用來生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白，比如同工型IgG2或IgG4，或其他Ig類型如IgM或IgA。融合蛋白可以是單體或多聚體，異多聚體或同多聚體。
在本發(fā)明的另一實例中，IL-18抑制劑和本發(fā)明臨床條件中一個或多個其他活性分子(如血管擴張劑、Ca阻滯劑、阿司匹林、β阻滯劑等)一起使用。例如，根據(jù)本發(fā)明，TNF拮抗劑也可與IL-18抑制劑聯(lián)用。TNF拮抗劑通過幾個途徑發(fā)揮其活性。首先，拮抗劑以足夠的親和力和特異性結(jié)合于或鰲合于TNF分子本身，從而部分或基本上中和了TNF表位或負責TNF受體結(jié)合的表位(以下稱為“鰲合拮抗劑”)。鰲合拮抗劑(sequestering antagonist)可以是例如針對TNF的抗體。
或者，TNF拮抗劑能抑制在TNF結(jié)合后由細胞表面受體所激活的TNF信號途徑(以下稱為“信號拮抗劑”)。這兩組拮抗劑在周圍血管疾病的治療或預(yù)防中都很有用，無論是單獨使用或一起使用，或者與IL-18抑制劑合用。
TNF拮抗劑能通過常規(guī)篩選候選物，根據(jù)體外其對天然TNF對易感細胞系(如人B細胞，TNF在該B細胞中導(dǎo)致增殖和免疫球蛋白的分泌)的活性的影響而輕易鑒別和評估。測試包括在不同稀釋度的候選拮抗劑下(例如為測試中TNF摩爾量的0.1到100倍)的TNF制劑，和沒有TNF或只有拮抗劑的對照(Tucci等人，1992)。
鰲合拮抗劑為優(yōu)選用于本發(fā)明的TNF拮抗劑。在鰲合拮抗劑中，那些高親和力地結(jié)合于TNF并且具有低免疫原性的多肽是優(yōu)選的?？扇躎NF受體分子和TNF的中和抗體是特別優(yōu)選的。例如，可溶的TNF-RI和TNF-RII可用于本發(fā)明。這些受體的截短形式，包括受體的胞外區(qū)域或其功能片段，是本發(fā)明更特別優(yōu)選的拮抗劑。例如，截短的可溶TNF I型和II型受體在EP914431中有描述。
TNF受體的截短形式是可溶的，并且已在尿液和血清中作為30kDa和40kDa TNF抑制性結(jié)合蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，該抑制性結(jié)合蛋白質(zhì)分別被稱為TBPI和TBPII(Engelmann等人，1990)。根據(jù)本發(fā)明，IL-18抑制劑和TNF拮抗劑的同時使用、依次使用、抑或分開使用都是優(yōu)選的。
在另一較佳實施例中，人的可溶TNF-RI(TBPI)是用于本發(fā)明的TNF拮抗劑。天然的和重組的可溶TNF受體分子及其生產(chǎn)方法，在歐洲專利EP308378，EP398327和EP433900中有描述。
受體分子的衍生物、片段、區(qū)域以及生物活性部分，在功能上類似于也可用于本發(fā)明的受體分子。這種受體分子的生物活性等同物或衍生物是指多肽的一部分，或編碼受體分子的序列的一部分，它們有足夠大小并且能夠以足夠高的親和性結(jié)合TNF，以致于與膜結(jié)合的TNF受體之間的相互作用被抑制或阻斷。
IL-18抑制劑可與TNF抑制劑同時使用，依次使用或分開使用。
在本發(fā)明的另一較佳實施例中，IL-18抑制劑的用量為約0.01-100mg/kg或1-10mg/kg或2-5mg/kg。
根據(jù)本發(fā)明，IL-18抑制劑較佳全身施用，并且較佳地為皮下或肌內(nèi)施用。它可每天或隔天施用。緩釋制劑可使施用更不頻繁，比如一周一次。
本發(fā)明還涉及含IL-18抑制劑編碼序列的表達載體的用途，它被用于制備預(yù)防和/或治療周圍血管疾病的藥物。因此，為了將IL-18抑制劑輸送至所需部位，可考慮基因療法。例如，為了治療和/或預(yù)防周圍血管疾病，包含IL-18抑制劑序列的基因治療載體可被例如直接注射入患病組織，從而避免基因治療載體的全身給藥的所涉及的問題，比如載體的稀釋，到達和定位于靶細胞或組織，以及副作用。
在通常不表達IL-18抑制劑或抑制劑表達數(shù)量不足的細胞中，使用載體來引起和/或增強內(nèi)源性產(chǎn)生IL-18抑制劑的方法，也在本發(fā)明構(gòu)思中。載體可包括在需要表達IL-18抑制劑的細胞中起作用的調(diào)控序列。例如，這種調(diào)控序列可以是例如啟動子或增強子。調(diào)控序列然后可以通過同源重組引入基因組的正確位置，這樣使調(diào)控序列與需要誘導(dǎo)或增強表達的基因可操作地連接。該技術(shù)通常被稱為“內(nèi)源基因激活”(EGA)，并且在例如WO91/09955中有描述。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，可用同樣技術(shù)直接關(guān)閉IL-18的表達，而不使用IL-18抑制劑。為此，負調(diào)控元件(如沉默元件)可引入IL-18基因座，從而導(dǎo)致下調(diào)或防止IL-18表達。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，這種使IL-18表達的下調(diào)或沉默與用IL-18抑制劑來預(yù)防和/或治療疾病有相同效果。
本發(fā)明還涉及已被基因修飾從而產(chǎn)生IL-18抑制劑的細胞的用途，它被用于生產(chǎn)治療和/或預(yù)防周圍血管疾病的藥物。
根據(jù)本發(fā)明中使用的IL-18抑制劑，優(yōu)選以藥物組合物形式施用，并且可任選地與治療有效量的TNF抑制劑或其他在治療或預(yù)防周圍血管疾病中有效的藥物聯(lián)用。
如上所述的IL-18BP以及它的同工型、突變蛋白、融合蛋白、功能衍生物、活性片段或循環(huán)重排衍生物是藥物組合物中較佳的活性成份。
“藥學(xué)上可接受”的定義包括任何載體，其并不干擾活性成份的生物活性的有效性，并且施用后對宿主沒有毒性。例如，對腸胃外給藥而言，活性蛋白質(zhì)可在諸如鹽、葡萄糖溶液、血清白蛋白和Ringer氏溶液等載體中，配制成用于注射的單位劑型。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中的活性成份可以通過幾種方法施用于人。給藥途徑包括皮內(nèi)、透皮(例如在緩釋劑型中)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、口服、顱內(nèi)、硬膜外、局部、和鼻內(nèi)的途徑。可以施用任何其他在治療上有效的給藥途徑，例如通過上皮或內(nèi)皮組織的吸收或通過基因療法(其中編碼活性成分的DNA分子被施用于病人(如通過載體)，這導(dǎo)致了該活性成分在體內(nèi)表達和分泌。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可與其他一些生物活性物質(zhì)成分(例如藥學(xué)上可接受的表面活性劑、賦形劑、載體、稀釋劑和運載體)一起施用。
對于腸胃外給藥(如靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi))來說，活性蛋白質(zhì)可以與藥學(xué)上可接受的腸胃外載體(例如水、鹽水、葡萄糖溶液)以及維持滲透壓(如甘露醇)或化學(xué)穩(wěn)定性(如防腐劑和緩沖劑)的添加劑一起配制成溶液、懸浮液、乳液或凍干粉末。制劑可用常用的技術(shù)進行滅菌。
本發(fā)明的活性蛋白質(zhì)的生物利用度也可通過延長分子在人體中半衰期的偶聯(lián)法加以改善，例如如PCT專利申請WO92/13095中所述的那樣，把分子連于聚乙二醇。
活性蛋白質(zhì)的治療有效量是一個有很多變量的函數(shù)，包括拮抗劑的類型，拮抗劑對IL-18的親和性，拮抗劑所體現(xiàn)的任何殘余細胞毒活性，給藥途徑，病人的臨床狀況(包括維持無毒水平的內(nèi)源IL-18活性的愿望)。
“治療有效量”是指施用時，IL-18抑制劑導(dǎo)致抑制IL-18的生物活性。施用于個體的劑量(作為單劑或多劑)可隨各種不同因素而變化，包括IL-18抑制劑的藥物動力學(xué)特性、給藥途徑、病人癥狀和特征(性別、年齡、體重、健康狀況、體格)、病癥的程度、并行的治療、治療的頻率和所需的效果。對已建立的劑量范圍進行調(diào)整和操作，以及用體外和體內(nèi)的方法來測定個體中IL-18受抑制，都在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能之內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明，IL-18抑制劑的用量為大約0.001-100mg/kg或大約0.01-10mg/kg體重，或大約0.1-5mg/kg或大約1-3mg/kg體重，或大約2mg/kg體重。
根據(jù)本發(fā)明較佳的給藥途徑是皮下途徑。根據(jù)本發(fā)明，肌內(nèi)給藥是更佳的。為了把IL-18抑制劑直接施用于起作用的位置，局部給藥也是較佳的。
在更佳實施例中，IL-18抑制劑是每天或隔天施用的。
每天的劑量通常分開幾次或通過持續(xù)釋放方式給予，以便有效地得到所需效果。第二次或隨后的給藥劑量可以與第一次或以前施用于個體的劑量相同、更小或更大。第二次或隨后的給藥可以在疾病發(fā)作之中或之前給予。
根據(jù)本發(fā)明，IL-18抑制劑可以預(yù)防性或治療性地以治療有效量施用于個體，在其他治療方案或藥物(如多藥物方案)之前，同時或之后給予，尤其是與TNF抑制劑和/或其他血管保護劑一起使用。和其他治療劑同時施用的活性劑可在相同或不同的組合物給予。
本發(fā)明還涉及一種制備藥物組合物的方法，它包括將有效量的IL-18抑制劑和/或TNF拮抗劑與藥學(xué)上可接受的載體混合。
本發(fā)明還涉及一種治療周圍血管疾病的方法，包括將藥物有效量的IL-18抑制劑(可任選地與藥物有效量的TNF拮抗劑一起)施用于需要治療的病人。
在現(xiàn)已充分描述了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍以及無需過分實驗的情況下，本發(fā)明可在大范圍的等價參數(shù)、濃度和條件下實施。
雖然本發(fā)明是通過一系列具體實施例來描述的，然而應(yīng)理解，本發(fā)明還可以有其他改進。本申請意在覆蓋總體上按照本發(fā)明原理的任何本發(fā)明的變化、用途或改進，并且包括脫離本公開內(nèi)容的變化形式，只要這些脫離形式在本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域是已知或常規(guī)的操作，并且適用于在隨附的權(quán)利要求書范圍內(nèi)中所列出必要技術(shù)特征。
所有在本文引用的文獻，包括期刊文章或摘要，公開或未公開的美國或外國的專利申請，授權(quán)的美國或外國的專利或任何其他文獻，通過在此引用而全部納入本文，包括所引用的文獻中所出現(xiàn)的所有的數(shù)據(jù)、表格、附圖和文本。此外，在本文所引用的文獻中所引用的全部文獻內(nèi)容，也通過在此引用而全部納入本文。
對已知方法步驟、常規(guī)方法步驟、已知方法或常規(guī)方法的引用，并非表示本發(fā)明的任何方面、描述或?qū)嵗言谙嚓P(guān)領(lǐng)域中被公開、教導(dǎo)或暗示。
前面對具體實例的描述對本發(fā)明的普遍本質(zhì)作了如此全面的披露，以致于其他人可以通過運用本領(lǐng)域技能內(nèi)的知識(包括本文所引用的參考文獻的內(nèi)容)，在沒有過分試驗的情況下，在不脫離本發(fā)明的總體概念的情況下，很容易地修改或變動這些具體實例以便用于各種應(yīng)用。因此，基于本文所給的教導(dǎo)和指導(dǎo)，這些變動和修改被認為被包括在所公開的實施例的等價范疇內(nèi)。應(yīng)理解，本文的措詞或術(shù)語是為了描述而非用于限制，所以本說明書的術(shù)語或措詞應(yīng)由熟練技術(shù)人員，根據(jù)本文所給的教導(dǎo)和指導(dǎo)并結(jié)合本技術(shù)領(lǐng)域一般技術(shù)人員的知識，作出解釋。
實施例實施例1抑制IL-18減少了周圍局部缺血方法
后肢缺血簡介對雄性C57BL/6J小鼠(Iffa Creddo，Lyon，法國)進行手術(shù)，以便誘導(dǎo)單側(cè)的后肢缺血。通過吸入異氟烷使動物麻醉。在右股動脈上進行結(jié)扎，離隱靜脈動脈和腘動脈的分叉近端0.5厘米。然后小鼠(每組7只)居住于特定的無菌室3天或28天。為了檢測IL-18BP在缺血引起的血管生成中的作用，用以前所述的方法(Mallat等人，2001)，在一組小鼠在脛骨和顱骨肌肉中都注射了60μg鼠IL-18BP表達質(zhì)粒pcDNA3-mIL18BP。對照小鼠注射了相同劑量的對照空質(zhì)粒。用PS-15電脈沖儀(Genetronics)，用兩根間隔4.2-5.5毫米的不銹鋼平板電極，在腿的每側(cè)傳送經(jīng)皮電脈沖(200V/cm，持續(xù)20毫秒，2赫茲的8方波電脈沖)。使用這個策略是因為以前的研究表明它可提升IL-18BP的血漿水平，減少血漿IL-18活性并且抑制動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展和惡化(Mallat等人，2001)。
血管生成的定量分析微血管造影術(shù)按以前所描述的方法(Silvestre等人，2000；Silvestre等人，2001)，在治療最后階段通過高精度微血管造影術(shù)來評價血管密度。簡言之，小鼠被麻醉(吸入異氟烷)，然后通過導(dǎo)入到腹腔大動脈的導(dǎo)管將造影劑(硫酸鋇，1g/ml)注入。通過數(shù)碼X射線傳感器得到的圖像(每個動物3張)被組合起來以得到后肢的完整圖像。血管密度由每個圖像的定量區(qū)域中血管占據(jù)的像素百分比來表達。對股動脈結(jié)扎處、膝蓋、股骨邊緣以及腿的外部界限劃定了定量區(qū)域。
毛細血管的密度按以前所述的方法(Silvestre等人，2000；Silvestre等人，2001)，通過對缺血性和非缺血性肌肉中毛細血管的密度的評估來完成微血管造影術(shù)分析。冷凍的組織切片(7μm)與針對CD31大鼠單克隆抗體(20μg/ml，Pharmingen)一起孵育以鑒別毛細血管。通過使用親和素-生物素辣根過氧化物酶系統(tǒng)(Vectastain ABC kit elite，Vector Laboratories)，使免疫印跡顯現(xiàn)。使用Histolab的軟件(Microvision)，在一定面積的隨機選定區(qū)域計算毛細血管密度。
激光多普勒灌注成像為了提供在血管形成中由缺血所引起的變化的功能證據(jù)，按以前所述的方法(Silvestre等人，2000；Silvestre等人，2001)，進行了激光多普勒灌注成像實驗。簡言之，多余的體毛在成像前用脫毛膏從四肢上脫掉，并且小鼠被放在37℃的加熱板上以減少溫度變化。然而，為了說明變數(shù)(包括環(huán)境光亮度與溫度)，經(jīng)過計算的灌注被表達為缺血性腿和非缺血性腿的比率。
統(tǒng)計分析結(jié)果被表達為平均值±SEM。變量ANOVA的單向分析法被用來比較每個參數(shù)。然后進行Post hoc Bonferonni氏t檢驗比較，以便鑒別出哪一個組的差異造成了顯著的整體ANOVA。p＜0.05的數(shù)值被認為在統(tǒng)計上是顯著的。
結(jié)果微血管造影術(shù)在第3天，每一組的缺血性/非缺血性腿的血管造影的評分比率未受到影響(圖1)。相反，在第28天，血管造影評分顯示，與對照相比，用IL-18BP治療的小鼠中增加了1.6倍(p＜0.01)。
毛細血管密度在CD31染色后，微血管造影術(shù)數(shù)據(jù)得到了毛細血管密度分析的確認。在第28天，對照小鼠的缺血性腿的毛細血管密度比非缺血性腿的毛細血管密度低(415±31對688±42根血管/平方毫米，p＜0.01)。然而，用IL-18BP治療的小鼠的缺血性腿的毛細血管密度比對照小鼠的缺血性腿的毛細血管密度要高出很多(增加了1.4倍)(分別為588±48對415±31根血管/平方毫米，p＝0.01)，并且與非缺血性腿中觀察到的水平?jīng)]有區(qū)別。
激光多普勒灌注成像微血管造影術(shù)和毛細血管密度的測量結(jié)果與血液灌注中的改變相關(guān)。后肢血流的恢復(fù)在接受治療和未接受治療的小鼠中都有發(fā)生。然而，在接受IL-18BP治療的小鼠中，在第28天所觀察到的血流量的增幅(腳部灌注)比對照動物更大(1.5倍，p＜0.01，圖2)。
實施例2VEGF，磷酸-Akt以及eNOS蛋白水平的調(diào)節(jié)方法按以前所述的方法(Silvestre等人，2000；Silvestre等人，2001)，通過Western印跡結(jié)果測定VEGF、磷酸-Akt和eNOS(內(nèi)皮氮氧合酶蛋白)在缺血性以及非缺血性腿中的表達。
結(jié)果VEGF。第3天，在任一組中，在缺血性和非缺血性腿上都沒有觀察到VEGF蛋白水平的變化。第28天，與非缺血性腿相比，在對照小鼠中VEGF蛋白質(zhì)含量趨于在缺血性腿中增加，但還不具有統(tǒng)計上的顯著性。相反，與對照相比，缺血性腿中的VEGF蛋白水平在IL-18BP治療的小鼠中顯著地上調(diào)了120％(p＜0.05)(圖3)。
磷酸-Akt。第3天，無論是否治療，在缺血性和非缺血性腿中的磷酸-Akt蛋白水平都無改變。第28天，在對照小鼠中，缺血性后肢中磷酸-Akt蛋白含量比非缺血性后肢中的含量增加了60％(p＜0.01)。在缺血性腿中磷酸-Akt蛋白含量的這種增長在接受IL-18BP治療的小鼠中增加了一倍(增加了110％，p＜0.05，與對照小鼠的缺血性腿中的增長相比)(圖4)。
ENOS。第3天，eNOS蛋白含量在對照和接受IL-18BP治療的動物的缺血性(107±8％對103±24％)和非缺血性腿(100±12％對94±21％)中都未受影響。第28天，在對照小鼠中，在缺血性腿中eNOS水平與非缺血性腿的相比提高了55％(分別為155±8％對100±11％，p＜0.05)。這種增長不受IL-18BP治療的影響(160±12％，與缺血性對照相比P＝0.61)。
實施例3IL-18BP對EPC(內(nèi)皮祖細胞)的影響方法流式細胞計量分析EPC細胞被認為是衍生自Sca-1-陽性的造血祖細胞(Takahashi等人，1999)。然后，用流式細胞分析來測定表達EPC標記蛋白質(zhì)Sca-1的單核細胞的百分比。缺血七天后，從接受空pcDNA3質(zhì)粒治療或接受pcDNA3-mI L18BP質(zhì)粒治療的小鼠(每組n＝5)的外周血(300μl)和骨髓中分離出單核細胞。骨髓細胞通過沖洗脛骨和股骨而得到。用Ficoll通過密度梯度離心法分離出低密度單核細胞。然后單核細胞與偶聯(lián)有熒光素異硫氰酸酯(FITC)的、抗Sca-1的單克隆抗體(D7，BD Pharmingen)一起被孵育。同種型-相同的(isotype-identical)抗體被用作對照。
EPC分化分析在分離之后，立刻將5×106個骨髓衍生的單核細胞也置于包被有小鼠血漿玻璃結(jié)合蛋白(vitronectin)(Sigma)和明膠(0.1％)的35mm細胞培養(yǎng)皿上，并且維持在內(nèi)皮基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(EBM2，Bio whittaker)。培養(yǎng)了四天后，非粘附細胞被去除，粘附細胞進行免疫化學(xué)分析。
為了檢測1，1’-雙十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚羰花青(1，1’-dioctadecyl-3，3，3’，3’-tetramethyl indocarbocyanine)標記的、乙酰化的低密度脂蛋白(AcLDL-Dil)的攝取情況，將細胞與AcLDL-Dil(Tebu)一起在37℃孵育1小時。然后用2％多聚甲醛固定細胞，與抗von-Willbrand因子(vWF)的兔子多克隆第一抗體(DAKO)一起孵育一小時，然后與FITC標記的抗兔子IgG(H+L)的單克隆抗體一起孵育30分鐘(Coulter)。對AcLDL-Dil和vWF都為陽性的雙染色細胞被判定為EPC，并且對每個孔中的這些細胞進行計數(shù)。三個獨立調(diào)查員通過對三個隨機選定的高倍區(qū)域進行記數(shù)，而評估每個孔中的EPC數(shù)量。然后，數(shù)據(jù)表示為以單核細胞總數(shù)的百分比。
結(jié)果EPC被認為是衍生自Sca-1陽性的單核細胞(Takahashi等人，1999)。與對照動物相比，接受IL-18BP治療的小鼠的周圍血管中Sca-1陽性的單核細胞的百分比保持不變(分別為31.5±13％對28.5±13％)。類似地，從骨髓中分離出的Sca-1陽性單核細胞總數(shù)，在IL-18BP治療小鼠和對照小鼠中沒有區(qū)別(分別為4.35±0.95％對5.87±0.22％)。此外，IL-18BP治療未對周圍血液或骨髓的單核細胞總數(shù)產(chǎn)生影響(數(shù)據(jù)未顯示)。
從骨髓的單核細胞中分離出EPC并培養(yǎng)，然后并以AcLDL-Dil和vWF陽性的雙染色細胞進行表征。具有雙陽性染色結(jié)果的細胞百分比，在非缺血性動物中幾乎無法檢測(＜5％，n＝4)。缺血誘導(dǎo)對AcLDL-Dil和vWF呈陽性的雙染色細胞的百分比顯著增加(48±3％，p＜0.001，相對于非缺血性動物)。這種效果通過IL-18BP治療進一步擴大(對照中的48±3％對IL-18BP治療小鼠中的85±2％，p＜0.001)(圖5)。因此，IL-18BP治療似乎刺激單核細胞分化成EPC，而不是增加了循環(huán)的祖細胞數(shù)量。
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權(quán)利要求
1.IL-18抑制劑在制備治療和/或預(yù)防周圍血管疾病的藥物中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述周圍血管疾病為周圍動脈疾病。
3.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述周圍血管疾病為下肢的周圍血管疾病。
4.IL-18抑制劑在制備治療和/或預(yù)防跛行的藥物中的用途。
5.如上述任一權(quán)利要求所述的用途，其特征在于，所述周圍血管疾病為伯格氏病(血栓閉塞性血管炎)。
6.如上述任一權(quán)利要求所述的用途，其特征在于，所述周圍血管疾病為周圍缺血病。
7.如權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述四肢缺血為危重四肢缺血。
8.IL-18抑制劑在制備治療和/或預(yù)防壞疽和/或潰瘍的藥物中的用途。
9.IL-18抑制劑在制備防止截肢的藥物中的用途。
10.如權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的用途，其特征在于，所述IL-18抑制劑選自天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1抑制劑(ICE)，抗IL-18的抗體，抗任何IL-18受體亞基的抗體，IL-18信號途徑抑制劑，與IL-18競爭和阻斷IL-18受體的IL-18拮抗劑，和IL-18結(jié)合蛋白，或其抑制IL-18生物活性的同工型、突變蛋白、融合蛋白、功能衍生物、活性片段或者循環(huán)重排衍生物。
11.如權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于，IL-18抑制劑是抗IL-18的抗體。
12.如權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于，IL-18抑制劑是抗IL-18受體α的抗體。
13.如權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于，IL-18抑制劑是抗IL-18受體β的抗體。
14.如權(quán)利要求10-13中任一權(quán)利要求所述的用途，其特征在于，所述的IL-18抗體是人源化抗體或人抗體。
15.如權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于，IL-18抑制劑是IL-18結(jié)合蛋白，或其抑制IL-18生物活性的同工型、突變蛋白、融合蛋白、功能衍生物、活性片段或者循環(huán)重排衍生物。
16.如上述任一權(quán)利要求所述的用途，其特征在于，所述IL-18抑制劑在一個或多個位點上是糖基化的。
17.如權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于，所述融合蛋白包括免疫球蛋白(Ig)融合蛋白。
18.如權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于，所述功能衍生物包括連于一個或多個官能團的至少一個部分，而所述官能團是氨基酸殘基的一個或多個側(cè)鏈。
19.如權(quán)利要求18所述的用途，其特征在于，所述部分是聚乙烯部分。
20.一種包括IL-18抑制劑的編碼序列的表達載體在制備治療和/或預(yù)防周圍血管疾病的藥物中的用途。
21.一種能誘導(dǎo)和/或增強IL-18抑制劑在細胞中內(nèi)源性產(chǎn)生的表達載體在制備治療和/或預(yù)防周圍血管疾病的藥物中的用途。
22.一種治療周圍血管疾病的方法，其特征在于，所述方法包括對有需要的宿主施用抑制有效量的IL-18抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及IL－18抑制劑在制備治療和/或預(yù)防周圍血管疾病的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及IL－18抑制劑在防止截肢中的用途。
文檔編號A61K39/395GK1655845SQ03811651
公開日2005年8月17日 申請日期2003年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月22日
發(fā)明者Y·奇韋提克, A·特奇, Z·馬勒特 申請人:應(yīng)用研究系統(tǒng)Ars股份公司, 國家健康及醫(yī)學(xué)研究院