專(zhuān)利名稱(chēng)：祖細(xì)胞在沒(méi)有細(xì)胞因子存在條件下的生長(zhǎng)和維持的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通常涉及造血細(xì)胞，更具體地涉及到造血祖細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
循環(huán)的血液細(xì)胞，比如紅血球、白血球、血小板以及淋巴細(xì)胞都是可辨別母體終末分化的產(chǎn)物。在正常的成人中，可辨別母體只在中軸骨骼的骨髓腔中發(fā)生末期分化，但有些分化延伸到了鄰近的腿節(jié)、肱骨及椎骨中。這些母體細(xì)胞是從被稱(chēng)為祖細(xì)胞的細(xì)胞衍生出來(lái)的，祖細(xì)胞是一種發(fā)育極不完全的細(xì)胞，祖細(xì)胞在諸如甲基纖維素這樣的半固體介質(zhì)中培養(yǎng)1-3星期后可發(fā)育到相鄰的成熟血液細(xì)胞集落中，通過(guò)這種方式可對(duì)祖細(xì)胞進(jìn)行分析測(cè)定。
人體骨髓細(xì)胞培養(yǎng)物最初被發(fā)現(xiàn)具有有限的造血能力，但產(chǎn)生的造血祖細(xì)胞數(shù)量和成熟血液細(xì)胞數(shù)量會(huì)越來(lái)越少，并在6～8星期后停止了細(xì)胞生成。而且隨后對(duì)原系統(tǒng)進(jìn)行的改動(dòng)也只取得了微小的改善。這在很大程度上是因?yàn)樵煅婕?xì)胞對(duì)環(huán)境的依賴(lài)性較大，比如對(duì)體內(nèi)存在的基本生成因子(造血生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子)的依賴(lài)性較大(見(jiàn)5,999,703、5,728,851和6,372,210號(hào)美國(guó)專(zhuān)利)。
在以前為促進(jìn)造血祖細(xì)胞體外增殖和分化所做的嘗試中，人們對(duì)細(xì)胞因子在各種基質(zhì)中的效果進(jìn)行了考察，包括對(duì)細(xì)胞因子在預(yù)先放入造血祖細(xì)胞的基質(zhì)和纖維結(jié)合蛋白中的效果進(jìn)行了考察。在培養(yǎng)環(huán)境加入外源性生成因子，特別是白細(xì)胞介素-3(IL-3)和粒細(xì)胞巨嗜細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)可導(dǎo)致造血祖細(xì)胞有選擇的向特定的分化方向擴(kuò)增。這些發(fā)現(xiàn)表明，在造血祖細(xì)胞培養(yǎng)物中加入外源性生長(zhǎng)因子可以導(dǎo)致原始造血祖細(xì)胞發(fā)生分化，并因此消除了未發(fā)育完全的造血祖細(xì)胞集落，從而對(duì)原始造血祖細(xì)胞造成了不利的影響。
其他的方法是使用經(jīng)過(guò)放射性物質(zhì)照射過(guò)的骨髓基質(zhì)來(lái)培養(yǎng)和維持造血祖細(xì)胞，這些其他方法可使這些祖細(xì)胞成為長(zhǎng)期培養(yǎng)的引發(fā)細(xì)胞(這些細(xì)胞是未發(fā)育完全的細(xì)胞)，并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體來(lái)增加造血祖細(xì)胞和長(zhǎng)期培養(yǎng)的引發(fā)細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。但是，在非自體骨髓移植的感染以及免疫反應(yīng)方面又出現(xiàn)了問(wèn)題。纖維結(jié)合蛋白是一種細(xì)胞基質(zhì)成分，這種蛋白可以降低感染的風(fēng)險(xiǎn)以及免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，同時(shí)還可增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄酶病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。然而，單獨(dú)靠纖維結(jié)合蛋白不足以在體外維持原始造血祖細(xì)胞。
骨髓移植后的造血祖細(xì)胞擴(kuò)增是人體骨髓細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)的一項(xiàng)潛在應(yīng)用。人類(lèi)自體骨髓移植和異體骨髓移植目前被用來(lái)治療白血病、淋巴瘤以及其他危及生命的疾病。然而，在這些疾病的治療過(guò)程中，為了取得足夠的植入細(xì)胞，必須要從捐獻(xiàn)者體中移取大量的骨髓細(xì)胞，即便如此，經(jīng)常也會(huì)得不到足夠數(shù)量的細(xì)胞。
一種可使造血祖細(xì)胞擴(kuò)增的方法降低了骨髓細(xì)胞捐獻(xiàn)量，這種方法可使少量捐獻(xiàn)的骨髓細(xì)胞在體外進(jìn)行祖細(xì)胞擴(kuò)增，然后再注入到骨髓接受者體中。人們還知道，少量的造血細(xì)胞會(huì)隨血液進(jìn)行循環(huán)。如果選取這些造血祖細(xì)胞并使其擴(kuò)增，則有可能從周邊血液中獲取移植所需的造血祖細(xì)胞，并由此消除了骨髓捐獻(xiàn)的必要性。
造血祖細(xì)胞的擴(kuò)增有助于患者在經(jīng)歷化療和放療后的身體恢復(fù)，造血祖細(xì)胞擴(kuò)增的另一項(xiàng)應(yīng)用是用于人類(lèi)骨髓細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)。大多數(shù)化療藥劑和放療手段是通過(guò)殺死正在經(jīng)歷細(xì)胞分裂的細(xì)胞而發(fā)揮療效的。骨髓是人體是多產(chǎn)的組織之一；因此，化療藥物和放療措施最先損害的器官通常是骨髓?；熀头暖煂?dǎo)致了人體生成的血液細(xì)胞在治療過(guò)程中遭到了迅速的破壞。這樣，在患者再次接受化療之前必須要終斷治療，從而使造血系統(tǒng)補(bǔ)充血液供應(yīng)。
一種使造血細(xì)胞成功擴(kuò)增的方法可大大地促進(jìn)非分化母體細(xì)胞大量生成，進(jìn)而促進(jìn)具有特定分化方向的分化母體細(xì)胞的大量生成，這種結(jié)果反過(guò)來(lái)又為包括輸血在內(nèi)的廣泛應(yīng)用提供了分化造血細(xì)胞。
目前存在一種需求，這種需求就是在體外培養(yǎng)條件下促進(jìn)造血祖細(xì)胞的成活率和多能性。
同時(shí)還需要產(chǎn)生大量的分化造血細(xì)胞。
本發(fā)明的目標(biāo)是提供造血干細(xì)胞擴(kuò)增和增殖的方法，同時(shí)使造血祖細(xì)胞保持自我更新的能力及多能性。
本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供一種方法，該方法對(duì)具有特定分化能力的祖細(xì)胞以及大量生成更高分化程度的造血細(xì)胞過(guò)程進(jìn)行控制。以下將對(duì)本發(fā)明的這些目標(biāo)及其他目標(biāo)進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。
發(fā)明概述本發(fā)明很重要的一部分涉及到培養(yǎng)造血祖細(xì)胞的方法，該方法可使造血祖細(xì)胞保持自我更新能力以及多能性。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是改善造血祖細(xì)胞培養(yǎng)物的保存狀況。本發(fā)明的另一方面是增加從造血祖細(xì)胞樣本所獲得的后代細(xì)胞數(shù)量。本發(fā)明的再一方面是增加從造血祖細(xì)胞樣本所獲得的分化后代細(xì)胞數(shù)量。
根據(jù)本發(fā)明，驚奇地發(fā)現(xiàn)的是，造血祖細(xì)胞可在不加入外源性生長(zhǎng)因子的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，這樣就避免了祖細(xì)胞在培養(yǎng)期間出現(xiàn)分化誘導(dǎo)和/或數(shù)量減少。因此，本發(fā)明可在不加入造血生長(zhǎng)因子、接種的基質(zhì)細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)介質(zhì)的條件下，對(duì)造血祖細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)。通過(guò)將造血祖細(xì)胞植入到只含有血清的培養(yǎng)液中即可實(shí)現(xiàn)這一培養(yǎng)過(guò)程。使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)(見(jiàn)5,677,139美國(guó)專(zhuān)利，該專(zhuān)利描述了靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物胸腺基質(zhì)單細(xì)胞層上的CD3+細(xì)胞的體外分化，見(jiàn)6,372,210號(hào)美國(guó)專(zhuān)利，該專(zhuān)利描述了支持CD34+細(xì)胞增殖和分化的無(wú)細(xì)胞因子培養(yǎng)液，但為了維持未成熟的顯型細(xì)胞，需要加入外源性因子)從未取得過(guò)這樣的結(jié)果。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種對(duì)造血祖細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)的方法。一定數(shù)量的造血祖細(xì)胞被植入到培養(yǎng)室中。造血祖細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境中不含有接種的基質(zhì)細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)介質(zhì)以及促進(jìn)分化的外源性造血生長(zhǎng)因子，但培養(yǎng)環(huán)境中含有血清。
造血祖細(xì)胞是由以下組織衍生出來(lái)的骨髓(包括全骨髓)、周邊血液(包括流動(dòng)的周邊血液)、臍帶血、胎盤(pán)血、胎兒肝臟、胚胎細(xì)胞(包括胚胎干細(xì)胞)、大動(dòng)脈—生殖腺—中腎衍生細(xì)胞以及淋巴軟組織。淋巴軟組織包括胸腺、脾、肝、淋巴結(jié)、皮膚、扁桃腺以及派伊爾氏淋巴集結(jié)(Peyer’s Patches)。
在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還包括收集造血細(xì)胞的步驟。在第一培養(yǎng)期后有第一次收集。至少在另一培養(yǎng)期后還至少有另一次收集過(guò)程，所收集到的細(xì)胞然后在至少含有一種外源性因子的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，外源性因子選自于由造血生長(zhǎng)因子、接種的基質(zhì)細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)介質(zhì)組成的一組物質(zhì)；其中造血生長(zhǎng)因子促進(jìn)造血細(xì)胞的維持、擴(kuò)增和/或分化，并影響細(xì)胞的定位。在某些實(shí)施方案中，促進(jìn)造血細(xì)胞維持、擴(kuò)增和/或分化，并影響細(xì)胞定位的造血生長(zhǎng)因子可包括白細(xì)胞間介素3、白細(xì)胞間介素6、白細(xì)胞間介素7、白細(xì)胞間介素11、白細(xì)胞間介素12、干細(xì)胞因子、FLK-2配位體/FLT-3配位體、Epo、Tpo、GMCSF、GCSF、制瘤素M和/或MCSF。
根據(jù)前面所述的本發(fā)明任何實(shí)施方案，本發(fā)明的方法在所述的第一培養(yǎng)步驟中包括在不含有諸如白細(xì)胞間介素3、白細(xì)胞間介素6、白細(xì)胞間介素7、白細(xì)胞間介素11、白細(xì)胞間介素12、干細(xì)胞因子、FLK-2配位體/FLT-3配位體、Epo、Tpo、GMCSF、GCSF、制瘤素M和/或MCSF這些造血祖細(xì)胞生存和增殖因子的環(huán)境中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。正如前面所述的，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)造血祖細(xì)胞可在不添加任何這些介質(zhì)的條件下生長(zhǎng)。在以往的技術(shù)中，為了避免造血祖細(xì)胞死亡和/或在培養(yǎng)期間發(fā)生分化，通常要加入這些介質(zhì)。對(duì)于引發(fā)細(xì)胞增殖從而提高干細(xì)胞的數(shù)量而言，這些介質(zhì)被認(rèn)為是必要的。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，第一培養(yǎng)步驟是在不含任何外源性造血祖細(xì)胞生長(zhǎng)因子(包括細(xì)胞因子)但含有血清的環(huán)境下進(jìn)行的。
正如將要理解的，現(xiàn)在根據(jù)本發(fā)明可以在不添加外源性生長(zhǎng)因子的條件下對(duì)造血祖細(xì)胞進(jìn)行7、8、9、10或多達(dá)14天的培養(yǎng)。
根據(jù)本發(fā)明，現(xiàn)在還可以在培養(yǎng)期間不出現(xiàn)誘導(dǎo)分化和/或沒(méi)有祖細(xì)胞損失的情況下對(duì)造血祖細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并在此期間收集細(xì)胞，然后在含有造血生長(zhǎng)因子的條件下對(duì)收集到的細(xì)胞進(jìn)行再培養(yǎng)，或者將收集到的細(xì)胞引入到患者體內(nèi)；其中的造血生長(zhǎng)因子促進(jìn)造血細(xì)胞的維持、擴(kuò)增和/或分化。在培養(yǎng)期內(nèi)的培養(yǎng)過(guò)程及收集過(guò)程是本發(fā)明的單獨(dú)一個(gè)方面。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供一種對(duì)造血祖細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并由此生成分化的造血源細(xì)胞的方法。在第一培養(yǎng)步驟中，第一數(shù)量的造血祖細(xì)胞在不含接種的基質(zhì)細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)介質(zhì)以及外源性造血生長(zhǎng)因子但含有血清的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，其中造血生成因子會(huì)促進(jìn)造血細(xì)胞的維持、擴(kuò)增和/或分化。在這些條件下經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，培養(yǎng)的造血祖細(xì)胞數(shù)量得到了增加，培養(yǎng)過(guò)程生成了第二數(shù)量的造血祖細(xì)胞。此后，在第二培養(yǎng)步驟中，在培養(yǎng)出來(lái)的第二數(shù)量造血祖細(xì)胞中，至少有一部分在含有至少一種促生介質(zhì)的環(huán)境中進(jìn)行再培養(yǎng)，從而產(chǎn)生出分化的造血源細(xì)胞；其中促生介質(zhì)選自于能促進(jìn)造血祖細(xì)胞維持、擴(kuò)增和/或分化的造血生長(zhǎng)因子、培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)介質(zhì)。在本發(fā)明的某一實(shí)施方案中，培養(yǎng)環(huán)境不含有諸如白細(xì)胞間介素的3、白細(xì)胞間介素6、白細(xì)胞間介素11、Tpo、干細(xì)胞因子以及FLK-2配位體/FLT-3配位體這些促進(jìn)造血祖細(xì)胞生存和增殖的造血生長(zhǎng)因子。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，第一培養(yǎng)步驟所處的環(huán)境中不含除血清之外的任何造血生長(zhǎng)因子。在本發(fā)明的這一方面，本發(fā)明的方法還包括多個(gè)第二培養(yǎng)步驟，每個(gè)第二培養(yǎng)步驟包括只對(duì)第二數(shù)量的造血祖細(xì)胞中的一部分進(jìn)行培養(yǎng)。該方法還包括在第一培養(yǎng)步驟和第二培養(yǎng)步驟之間進(jìn)行細(xì)胞的收集，其中收集步驟包括在對(duì)至少一部分第二數(shù)量的造血祖細(xì)胞進(jìn)行第二步驟培養(yǎng)前，至少將第二數(shù)量的造血祖細(xì)胞的一部分收集起來(lái)。收集步驟可分成多個(gè)步驟進(jìn)行，收集步驟之間有時(shí)間間隔。在這種情況下，第二培養(yǎng)步驟可分成多個(gè)培養(yǎng)步驟進(jìn)行，一個(gè)培養(yǎng)步驟對(duì)應(yīng)一個(gè)收集步驟。優(yōu)選的造血祖細(xì)胞來(lái)源以及培養(yǎng)條件如前面所述。
在前面的任何涉及使用造血生長(zhǎng)因子進(jìn)行造血細(xì)胞維持、擴(kuò)增和/或分化的實(shí)施方案中，所用的造血因子均選自于白細(xì)胞間介素3、白細(xì)胞間介素12、干細(xì)胞因子、FLK-2配位體/FLT-3配位體、Epo、Tpo、GMCSF、GCSF、制瘤素M以及MCSF。
下面將對(duì)本發(fā)明的這些方面及其他方面進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明。
圖示簡(jiǎn)介

圖1是在不含細(xì)胞因子的干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天時(shí)細(xì)胞平均總數(shù)的柱狀圖。
圖2是在不含細(xì)胞因子的干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天時(shí)細(xì)胞的平均成活率。
圖3是在不含細(xì)胞因子的干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天時(shí)CD34+細(xì)胞平均總數(shù)的柱狀圖。
圖4是在不含細(xì)胞因子的干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天時(shí)CD34+細(xì)胞的平均百分率。
應(yīng)該理解的是，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明并不一定需要這些附圖。
本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的某一方面涉及在不含接種的基質(zhì)細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)介質(zhì)以及外源性造血生長(zhǎng)因子但含有血清的環(huán)境中進(jìn)行造血祖細(xì)胞的培養(yǎng)，其中造血生長(zhǎng)因子促進(jìn)造血細(xì)胞的維持、擴(kuò)增和/或分化。
本發(fā)明的方法所培養(yǎng)的細(xì)胞是造血祖細(xì)胞。本文中所用的“造血祖細(xì)胞”是指未發(fā)育完全的血液細(xì)胞，這種細(xì)胞具有自我更新能力，并可分化成更成熟的血液細(xì)胞(在本文中也被稱(chēng)為“后代細(xì)胞”)。這些血液細(xì)胞包括粒性白細(xì)胞(例如成髓細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞)、紅血球(例如網(wǎng)狀細(xì)胞、紅血球細(xì)胞)、凝血細(xì)胞(例如成巨核細(xì)胞、生成血小板的成巨核細(xì)胞、血小板)、淋巴細(xì)胞(例如B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞)、含抗原細(xì)胞(例如樹(shù)狀細(xì)胞、Kupfer細(xì)胞、Langerhans細(xì)胞)以及單核細(xì)胞(例如循環(huán)單核細(xì)胞、組織巨噬細(xì)胞、格子細(xì)胞)。本領(lǐng)域已知，這些細(xì)胞可包括CD34+細(xì)胞，也可不包括CD34+細(xì)胞。CD34+是本文以下所述“血液制品”中存在的未成熟細(xì)胞，CD34+表達(dá)CD34細(xì)胞的表面標(biāo)志，CD34+被認(rèn)為含有細(xì)胞子集落，子集落中的細(xì)胞具有前面所述的“祖細(xì)胞”特性。在本發(fā)明中，優(yōu)選的細(xì)胞包括AC133抗原表達(dá)細(xì)胞(見(jiàn)5,843,633號(hào)美國(guó)專(zhuān)利)和/或CD34+細(xì)胞。造血祖細(xì)胞還包括以前被認(rèn)為不具造血能力的細(xì)胞，但最近的研究表明這些以往被認(rèn)為不具造血能力的細(xì)胞能夠形成血液細(xì)胞。最近已從腦部、肝臟、肌肉以及其他組織中分離出了這些細(xì)胞(見(jiàn)Bjornson CR.等人在《科學(xué)》上發(fā)表的文章，1999，283(5401)534-7，見(jiàn)Gritti A.等人在《生理學(xué)雜志》上發(fā)表的文章，2002，96(1-2)81-90，見(jiàn)Muench MO.等人在《免疫學(xué)雜志》上發(fā)表的文章，2001，167(9)4902-9，見(jiàn)Weissman IL.在《科學(xué)》上發(fā)表的文章，2000，287(5457)1442-6)。
造血祖細(xì)胞可從血液制品中獲取。本發(fā)明中所用的“血液制品”是指從含有造血源細(xì)胞的軀體器官或軀體中獲得的產(chǎn)品。這些血液制品源包括全骨髓、臍帶、周邊血液、肝臟、胸腺、淋巴以及脾臟(所有這些源是可被調(diào)用的)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將清楚地認(rèn)識(shí)到，通過(guò)多種方式可使前面提到的所有原生血液制品或未經(jīng)處理的血液制品含有更多的具有“造血祖細(xì)胞”特性的細(xì)胞。舉例而言，血液制品可與分化程度更高的后代細(xì)胞分離開(kāi)來(lái)，通過(guò)所表達(dá)的細(xì)胞表面分子可有選擇性地去除發(fā)育更完全、分化程度更高的細(xì)胞。另外，血液制品可進(jìn)行分級(jí)處理，從而選擇CD34+細(xì)胞和/或AC133+細(xì)胞。正如前面提到的，本技術(shù)領(lǐng)域認(rèn)為CD34+細(xì)胞包括具有自我更新能力及多能性的細(xì)胞子集落。可使用抗CD34磁珠和/或抗AC133磁珠實(shí)現(xiàn)對(duì)CD34+和AC133+細(xì)胞的選擇，這兩種磁珠可通過(guò)商業(yè)渠道購(gòu)買(mǎi)。未經(jīng)分級(jí)處理的血液制品可直接從捐獻(xiàn)者獲得，或取自細(xì)胞存儲(chǔ)庫(kù)，或從商業(yè)供應(yīng)商處購(gòu)買(mǎi)。
采用本文下面將要詳細(xì)說(shuō)明的培養(yǎng)條件可保存造血祖細(xì)胞，并刺激造血祖細(xì)胞數(shù)量發(fā)生擴(kuò)增和/或集落形成的能力。一旦造血祖細(xì)胞發(fā)生擴(kuò)增后，造血祖細(xì)胞可輸送回到人體中，從而補(bǔ)充患者的造血祖細(xì)胞數(shù)量。舉例而言，這對(duì)于經(jīng)歷化療的患者是十分適合的。在某些遺傳條件下，造血祖細(xì)胞的數(shù)量會(huì)減小，本發(fā)明的方法也可用于這類(lèi)情況。
還可以按照本發(fā)明的方法將增加的造血祖細(xì)胞取出，并使用造血生長(zhǎng)因子對(duì)造血祖細(xì)胞進(jìn)行刺激，其中造血生長(zhǎng)因子促進(jìn)造血細(xì)胞的維持、擴(kuò)增和/或分化，從而在體外產(chǎn)生更成熟的血液細(xì)胞。這些擴(kuò)增的血液細(xì)胞集落可按前面所述應(yīng)用于人體內(nèi)，或者按本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)為的進(jìn)行試驗(yàn)性使用。這些分化的細(xì)胞包括前面所述的那些細(xì)胞以及T細(xì)胞、血漿細(xì)胞、紅血球、成巨核細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞、分葉核白細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜曙紅細(xì)胞、血小板以及這些細(xì)胞各自的直接母體細(xì)胞。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，造血祖細(xì)胞可進(jìn)行連續(xù)的培養(yǎng)，并可對(duì)培養(yǎng)得到的細(xì)胞進(jìn)行收集。“收集造血細(xì)胞”被定義為從培養(yǎng)室中移出或分離出細(xì)胞。使用多種方法可完成細(xì)胞的分離過(guò)程，例如可采用酶促法、離心分離法、電子法進(jìn)行細(xì)胞分離，或者根據(jù)細(xì)胞的大小進(jìn)行細(xì)胞分離或者根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方法，即在細(xì)胞中加入細(xì)胞離散液(Bio Whittaker，Walkersville，MD)而對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離。這些細(xì)胞可進(jìn)行進(jìn)一步的收集和分離?！胺謺r(shí)收集步驟”或“間歇收集細(xì)胞”是指收集一部分細(xì)胞，留下另一部分細(xì)胞在已有的介質(zhì)中繼續(xù)培養(yǎng)，從而保障可連續(xù)的獲得原始細(xì)胞并保持原始細(xì)胞的各種特性。收集“至少某一部分”意味著收集細(xì)胞子集落或收集全部細(xì)胞。因?yàn)椋绫绢I(lǐng)域技術(shù)人員將要理解的，本發(fā)明可被用來(lái)擴(kuò)增造血祖細(xì)胞的數(shù)量，同時(shí)收集部分?jǐn)U增的細(xì)胞進(jìn)行處理，從而培育出更大集落的分化細(xì)胞。
本文中所述的“培養(yǎng)室”是指本領(lǐng)域所通用的塑料盤(pán)、轉(zhuǎn)動(dòng)容器以及塑料(如聚丙烯)袋。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，三維基質(zhì)特別地被排除在培養(yǎng)室范圍之外。
在本發(fā)明中的所有培養(yǎng)方法中，所用的培養(yǎng)介質(zhì)是常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)，例如是RPMI、DMEM、ISCOVES等介質(zhì)，在這些介質(zhì)中添加了有效劑量的脂肪酸、有效劑量的膽固醇、有效劑量的鐵傳遞蛋白(或有效劑量的離子鹽)以及0.25～2.5U/ml的胰島素(或起到生成因子作用的有效劑量胰島素)。含有這些添加物的培養(yǎng)介質(zhì)可通過(guò)商業(yè)渠道購(gòu)得(比如從Quality Biological公司購(gòu)買(mǎi)，這些培養(yǎng)介質(zhì)在6,372,210B2號(hào)美國(guó)專(zhuān)利中有所說(shuō)明)。本發(fā)明所用的優(yōu)選培養(yǎng)介質(zhì)是QBSF(Quality Biological公司生產(chǎn))。重要的一點(diǎn)是，本發(fā)明所用的培養(yǎng)介質(zhì)添加了人類(lèi)血清或動(dòng)物血清，如果造血祖細(xì)胞是人體原始細(xì)胞，則更適宜加入人體血清。雖然可以使用濃度更低(比如小于0.05％、小于0.1％、小于0.25％、小于0.5％、小于0.75％、小于1.0％、小于1.5％，以及位于本文明確指出的整數(shù)濃度范圍之間的濃度)或濃度更高的培養(yǎng)介質(zhì)，但適宜的血清濃度在2％-5％之間。當(dāng)在這些濃度下使用血清時(shí)，血清可含有少量天然存在于血清中的造血生長(zhǎng)因子。在優(yōu)選情況下，血清是自體的，但也可以從血清庫(kù)中取用。本文中所用的“自體的”是指從對(duì)象本身取得的物質(zhì)，培養(yǎng)介質(zhì)中的造血祖細(xì)胞源自于對(duì)象本身。培養(yǎng)介質(zhì)中還可含有血清白蛋白(人類(lèi)的或動(dòng)物的)。根據(jù)本發(fā)明，在本發(fā)明中的細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，可在培養(yǎng)介質(zhì)中添加(補(bǔ)充介質(zhì))或?qū)Σ糠峙囵B(yǎng)介質(zhì)進(jìn)行替換(比如進(jìn)行等量替換)，或保持培養(yǎng)介質(zhì)不變。
與本發(fā)明相關(guān)的特別生長(zhǎng)因子是造血生長(zhǎng)因子。造血生長(zhǎng)因子是指影響造血細(xì)胞生存、增殖或分化的因子。只影響造血細(xì)胞的生存及增殖，但對(duì)分化不具促進(jìn)作用的生長(zhǎng)因子包括白細(xì)胞間介素3、白細(xì)胞間介素6、白細(xì)胞間介質(zhì)11、干細(xì)胞因子以及FLK-2配位體/FLT配位體。促進(jìn)造血細(xì)胞分化的造血生長(zhǎng)因子包括集落刺激因子，比如GMCSF、GCSF、MCSF、Tpo、Epo、制瘤素M以及除白細(xì)胞間介質(zhì)3、6、11之外的其他白細(xì)胞間介素。前面這些生長(zhǎng)因子是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些生長(zhǎng)因子中的大多數(shù)可通過(guò)商業(yè)渠道購(gòu)得。這些生長(zhǎng)因子可通過(guò)提純、重組方法獲得，或通過(guò)衍生或合成而得到。
在本發(fā)明的某一方面，本發(fā)明中的細(xì)胞在不含外源性細(xì)胞因子的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)?！凹?xì)胞因子”是可溶性蛋白的專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)，其中的可溶性蛋白是由一個(gè)細(xì)胞子集落釋放出來(lái)的，在免疫響應(yīng)的生成和調(diào)節(jié)中，這種可溶性蛋白是細(xì)胞間的調(diào)節(jié)介質(zhì)。見(jiàn)《基礎(chǔ)及臨床研究手冊(cè)》中的人類(lèi)細(xì)胞因子章節(jié)(Aggrawal等人編輯，麻省波士頓Blackwell科學(xué)出版社1991年出版)(該手冊(cè)全文在此通過(guò)引證被并入本文)。細(xì)胞因子例如包括白細(xì)胞間介素IL-1至IL-5、腫瘤壞死因子α及β、干擾素α、β、γ、腫瘤生長(zhǎng)因子β、集落刺激因子以及粒性白細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子。通過(guò)與細(xì)胞表面受體的結(jié)合可以調(diào)節(jié)每種細(xì)胞因子對(duì)其靶細(xì)胞的作用。細(xì)胞因子具有許多荷爾蒙的性質(zhì)，但與經(jīng)典的荷爾蒙不同之處在于細(xì)胞因子在體內(nèi)一般只對(duì)組織內(nèi)局部附近的細(xì)胞發(fā)揮作用。
在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明中的細(xì)胞在一種除血清外不含培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)介質(zhì)以及外源性造血生長(zhǎng)因子的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，其中造血生長(zhǎng)因子促進(jìn)造血細(xì)胞的分化?！安缓信囵B(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞”是指細(xì)胞培養(yǎng)室中沒(méi)有作為促進(jìn)造血祖細(xì)胞生存、增殖或分化的培養(yǎng)液而單獨(dú)加入到培養(yǎng)室中的基質(zhì)細(xì)胞，但這類(lèi)基質(zhì)細(xì)胞不包括經(jīng)過(guò)分離后的血液制品中天然含有的基質(zhì)細(xì)胞以及加入分離的血液制品后在培養(yǎng)室中生存和增殖的基質(zhì)細(xì)胞。
本文中所用的“基質(zhì)細(xì)胞”包括纖維原細(xì)胞和間葉細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞可帶有其他細(xì)胞及元素，也可以不帶有其他細(xì)胞和元素，其中這些細(xì)胞和元素被用來(lái)建立有利于造血祖細(xì)胞附著及生長(zhǎng)的條件。纖維原細(xì)胞包括胎兒纖維原細(xì)胞，纖維原細(xì)胞通過(guò)組織或器官的活體解剖而獲得。這些纖維原細(xì)胞和間葉細(xì)胞可使用外源性DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其中DNA編碼上述造血生長(zhǎng)因子中的某一因子。
“基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)介質(zhì)”是指前面所述基質(zhì)細(xì)胞接種到其中的介質(zhì)。接種的時(shí)間足以使基質(zhì)細(xì)胞在這種介質(zhì)中分泌出因子。然后這些“基質(zhì)細(xì)胞”調(diào)節(jié)介質(zhì)被植入到造血祖細(xì)胞培養(yǎng)室中，從而促進(jìn)造血祖細(xì)胞的增殖和/或分化。
因此，當(dāng)細(xì)胞在不含前面所提到的因子的條件下培養(yǎng)時(shí)，意思是指細(xì)胞在不添加這些因子的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，但血清、普通營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)或分離的血液制品、分級(jí)的或未分級(jí)的血液制品中所存在的因子除外；其中血液制品中含有造血祖細(xì)胞。
在優(yōu)選情況下，造血細(xì)胞的培養(yǎng)條件可使造血細(xì)胞的數(shù)量得到增長(zhǎng)，和/或使造血細(xì)胞的集落形成能力得到加強(qiáng)。這里所用的條件是指本領(lǐng)域已知條件的組合(比如溫度、氧氣、二氧化碳濃度、營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)等)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地確定足以使細(xì)胞數(shù)量得到增長(zhǎng)所需要的時(shí)間，這一時(shí)間隨植入的原始細(xì)胞數(shù)量不同而變化。例如，介質(zhì)的變色可被用作融合的指標(biāo)。此外，更準(zhǔn)確的做法是在相同條件下對(duì)不同數(shù)量的血液制品進(jìn)行培養(yǎng)，并以固定的時(shí)間間隔對(duì)細(xì)胞進(jìn)行收集和計(jì)數(shù)，從而得到“控制曲線”。這些控制曲線被用來(lái)估算其后細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞的數(shù)量。根據(jù)本發(fā)明，造血細(xì)胞的優(yōu)選培養(yǎng)時(shí)間是7天。雖然這一時(shí)間可延長(zhǎng)幾天，但本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)到14天時(shí)，培養(yǎng)室的細(xì)胞總數(shù)及祖細(xì)胞的數(shù)量均少于在同等條件下培養(yǎng)期為7天時(shí)的數(shù)量。
決定集落形成能力的條件也用相似的方法進(jìn)行確定。集落形成能力是細(xì)胞形成后代細(xì)胞的能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員已熟知測(cè)定這一能力的方法，該方法包括在半固體培養(yǎng)介質(zhì)中植入細(xì)胞，使用生長(zhǎng)因子處理這些細(xì)胞，并對(duì)集落的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。
如本文所使用的，“對(duì)象”可以是人類(lèi)、非人類(lèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓或嚙齒動(dòng)物。人類(lèi)造血細(xì)胞和人類(lèi)對(duì)象是本發(fā)明實(shí)施方案中特別重要的內(nèi)容。根據(jù)本發(fā)明，一定數(shù)量的造血祖細(xì)胞被植入到體外的細(xì)胞培養(yǎng)室中，并在含有血清但不含培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)介質(zhì)以及外源性造血生長(zhǎng)因子的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)；其中造血生長(zhǎng)因子促進(jìn)造血細(xì)胞的維持、擴(kuò)增和/或分化。
結(jié)合以下的實(shí)施例將會(huì)更充分地理解本發(fā)明。但這些實(shí)施例的目的只在于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，這些實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。
實(shí)施例細(xì)胞分離和培養(yǎng)通過(guò)Ficoll分離和抗人體CD34+磁珠(Miltenyi Biotec.Auburn，CA)法從人體的流通周邊血液中分離出單核細(xì)胞，CD34+造血祖細(xì)胞由這些單核細(xì)胞衍生而得。
CD34+細(xì)胞還可從人類(lèi)的骨髓或臍帶衍生出來(lái)。這些造血祖細(xì)胞源可從Poietics公司(Geithersburg，MD)購(gòu)得。在某些情況下，磁珠分離步驟可在抗個(gè)體基因型抗體(Detachbead，Dynal)進(jìn)行分離過(guò)程之后進(jìn)行。
50萬(wàn)個(gè)CD34+細(xì)胞被植入到48孔標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)盤(pán)(BectonDickinson/Falco，Bedford，MA)的每個(gè)孔中。培養(yǎng)使用0.35毫升的QBSF-60液相培養(yǎng)介質(zhì)(Quality Biological，Gaithersburg，MD)，培養(yǎng)液中加入5％的人類(lèi)AB型血清。培養(yǎng)在37℃、5％二氧化碳的條件下進(jìn)行7-14天。
在培養(yǎng)期之后，從培養(yǎng)孔中收集所有非粘著細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并用表面抗原對(duì)細(xì)胞進(jìn)行沾染。使用錐蟲(chóng)藍(lán)排除法和Nuebauer血球計(jì)測(cè)定細(xì)胞的數(shù)量和成活率。
結(jié)果收集的細(xì)胞平均數(shù)量為136萬(wàn)個(gè)，這一數(shù)字是植入細(xì)胞量的2.6倍。收集細(xì)胞的成活率(89.1％)與植入細(xì)胞的成活率(92.3％)近似相同。這些結(jié)果在圖1和圖2中表明。
在測(cè)定CD34+集落時(shí)得到了相似的結(jié)果。收集的CD34+細(xì)胞平均數(shù)量為97.9萬(wàn)。這一數(shù)字是植入細(xì)胞量的2.1倍。植入細(xì)胞集落和收集細(xì)胞集落的CD34陽(yáng)性標(biāo)記百分率相近(92.0％對(duì)87.5％)。這些結(jié)果在圖3和圖4中表明。
表面顯型測(cè)定所用的抗體包括抗CD34(Qbend10，Beckman/Coulter，Brea，CA)、抗CD38和抗CD45(均來(lái)自BDImmunocytometry，San Diego，CA)，使用這些抗體來(lái)評(píng)估祖細(xì)胞的分布情況。使用多參數(shù)FACScan流動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析法進(jìn)行細(xì)胞的流動(dòng)計(jì)數(shù)分析，在分析中使用到了FACSCalibur儀器(BectonDickinson)。所包括的適應(yīng)對(duì)照物與同型抗體相配，從而建立陽(yáng)性和陰性象限，同時(shí)還與單色染色劑相配，從而建立補(bǔ)償。對(duì)于每個(gè)樣品而言，至少收集10,000個(gè)列表形式的事件。
從不含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中所收集的造血祖細(xì)胞的體外測(cè)定使用常規(guī)的甲基纖維素測(cè)定法可測(cè)定造血祖細(xì)胞(經(jīng)過(guò)上述的7-14天培養(yǎng)后)生成骨髓細(xì)胞集落和生成紅血球細(xì)胞集落的能力。下面將說(shuō)明一個(gè)甲基纖維素測(cè)定的實(shí)例，但在不出現(xiàn)不當(dāng)實(shí)驗(yàn)方法的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員有能力按照需要對(duì)這一測(cè)定方法進(jìn)行修改。
從前面所述的培養(yǎng)基中提取同樣數(shù)量的細(xì)胞，并在細(xì)胞密度為1.33×104個(gè)細(xì)胞/毫升的情況下向細(xì)胞中加入3.5ml甲基纖維素培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中含有細(xì)胞因子(濃度為20ng/ml的白細(xì)胞間介素3；30ng/ml的GM-CSF；3IU/ml的紅細(xì)胞生成素；50ng/ml的干細(xì)胞因子；所有這些細(xì)胞因子都是由加拿大溫哥華的干細(xì)胞技術(shù)公司生產(chǎn))，以及加入0.5ml的DMEM(2％的FCS，10IU/ml的青霉素，10ug/ml的鏈霉素，1mM的L谷氨酸鹽)。使用注射器和鈍頭針頭將1.5ml混合液注入到有劃痕的有蓋培養(yǎng)皿中，使用鈍針頭是為了避免產(chǎn)生氣泡。對(duì)每種條件進(jìn)行重復(fù)測(cè)定。兩個(gè)相同的有蓋培養(yǎng)皿在5％二氧化碳及37℃下在培育箱中放置10～21天。在10～21天后，通過(guò)手工計(jì)數(shù)方法測(cè)定集落的數(shù)量。對(duì)累積20個(gè)或以上細(xì)胞的陽(yáng)性集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。在培養(yǎng)14-21天后，根據(jù)黃褐色色素對(duì)屬于紅血球的集落進(jìn)行計(jì)數(shù)，黃褐色色素表明的是血紅蛋白，骨髓細(xì)胞集落是通過(guò)它們明顯的透明外觀進(jìn)行辨識(shí)的。計(jì)數(shù)工作應(yīng)進(jìn)行二次。
從不含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中所收集的造血祖細(xì)胞的體內(nèi)測(cè)定使用本領(lǐng)域已知的動(dòng)物模型可對(duì)培養(yǎng)出來(lái)的造血祖細(xì)胞(按前面所述的培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)行培養(yǎng))在體內(nèi)的分化及增殖能力進(jìn)行測(cè)定。體內(nèi)測(cè)定表明，造血祖細(xì)胞在宿主體內(nèi)具有生成多種類(lèi)型后代血液細(xì)胞的能力(多能性)，具有自我更新的能力，同時(shí)可以與宿主體內(nèi)的細(xì)胞相融合。這種動(dòng)物模型是經(jīng)過(guò)亞致死劑量輻射的、缺乏免疫的、患有非肥胖性糖尿病的重度復(fù)合免疫不全癥試驗(yàn)鼠。簡(jiǎn)單地講，根據(jù)前面所述本發(fā)明方法培養(yǎng)出的造血祖細(xì)胞通過(guò)靜脈注射而進(jìn)入到試驗(yàn)鼠體中，在植入造血祖細(xì)胞6-8星期后檢測(cè)受體體內(nèi)的骨髓細(xì)胞(使用極限稀釋分析法測(cè)定造血祖細(xì)胞生成CD34CD19+(B淋巴細(xì)胞)以及生成CD34+(骨髓細(xì)胞)后代集落細(xì)胞的頻率)。
等同物本領(lǐng)域中的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到或能夠發(fā)現(xiàn)，使用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法即可得到許多與本文所述的本發(fā)明具體實(shí)施方案等同的結(jié)果。這些等同情況在以下權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。本文所提到的所有參考文獻(xiàn)在此通過(guò)引證被并入本文。
權(quán)利要求
1.一種對(duì)造血祖細(xì)胞進(jìn)行體外培育的方法，該方法包括將一定數(shù)量的造血祖細(xì)胞植入到培養(yǎng)室中；并在不含接種的基質(zhì)細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)介質(zhì)以及外源性造血生長(zhǎng)因子但含有血清的環(huán)境中對(duì)所述的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；其中造血生長(zhǎng)因子促進(jìn)造血祖細(xì)胞的維持、擴(kuò)增和/或分化。
2.如權(quán)利要求1中的方法，其中培養(yǎng)環(huán)境不含有以下物質(zhì)白細(xì)胞間介素3、白細(xì)胞間介素6、白細(xì)胞間介素11、Tpo、干細(xì)胞因子以及FLT/FLK配位體生長(zhǎng)因子。
3.如權(quán)利要求1中的方法，其中培養(yǎng)環(huán)境不含有造血生長(zhǎng)因子。
4.權(quán)利要求1中的方法還包括在所述的植入步驟前，從血液制品中獲得所述的造血祖細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求4中的方法，其中所述的血液制品是流動(dòng)的周邊血液或流動(dòng)的臍帶血液。
6.如權(quán)利要求1中的方法，其中造血祖細(xì)胞在培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)時(shí)間足以使造血祖細(xì)胞的數(shù)量超過(guò)植入到所述培養(yǎng)室中的造血祖細(xì)胞數(shù)量。
7.權(quán)利要求1中的方法還包括在所述的培養(yǎng)步驟后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行收集。
8.權(quán)利要求7中的方法還包括在至少一種外源性添加物質(zhì)中對(duì)所述的收集細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；其中外源性添加物質(zhì)選自造血生長(zhǎng)因子、接種的基質(zhì)細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)介質(zhì)；造血生長(zhǎng)因子促進(jìn)造血細(xì)胞的維持、擴(kuò)增和/或分化。
9.權(quán)利要求8中的方法還包括在有外源性添加物質(zhì)存在的環(huán)境中對(duì)所述的第一次收集所取得的造血細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；在有外源性添加物質(zhì)存在的環(huán)境中對(duì)所述的至少另一次收集所取得的造血細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；其中所述的外源性添加物質(zhì)選自于造血生長(zhǎng)因子、培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)介質(zhì)；造血生長(zhǎng)因子促進(jìn)造血細(xì)胞的維持、擴(kuò)增和/或分化。
10.一種對(duì)造血祖細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，從而使造血原始細(xì)胞產(chǎn)生分化細(xì)胞的方法，該方法包括在第一培養(yǎng)步驟中，在含有血清但不含有接種的基質(zhì)細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)介質(zhì)以及外源性造血生長(zhǎng)因子的環(huán)境中對(duì)第一數(shù)量的造血祖細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；其中造血生長(zhǎng)因子促進(jìn)造血細(xì)胞的分化；在這種培養(yǎng)條件下，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的培養(yǎng)，造血祖細(xì)胞的數(shù)量和集落形成能力都較第一數(shù)量的造血祖細(xì)胞有所增加；然后在第二培養(yǎng)步驟中，在至少含有一種以下物質(zhì)的環(huán)境中對(duì)至少一部分第二數(shù)量的造血祖細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)造血生長(zhǎng)因子、接種的基質(zhì)細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)介質(zhì)；其中造血生長(zhǎng)因子促進(jìn)造血細(xì)胞的維持、擴(kuò)增和/或分化。這些培養(yǎng)步驟可產(chǎn)生造血原始細(xì)胞的分化細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求10中的方法，其中所述第一培養(yǎng)步驟的環(huán)境中不含白細(xì)胞間介素3、白細(xì)胞間介素6、白細(xì)胞間介素11、Tpo、干細(xì)胞因子以及FLT/FLK配位體生長(zhǎng)因子。
12.如權(quán)利要求10中的方法，其中培養(yǎng)環(huán)境中不含造血生長(zhǎng)因子。
13.如權(quán)利要求10中的方法，其中第二培養(yǎng)步驟含有多個(gè)第二培養(yǎng)步驟，每個(gè)培養(yǎng)步驟對(duì)一部分所述第二數(shù)量的造血祖細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
14.權(quán)利要求10中的方法還包括在所述的第一和第二培養(yǎng)步驟間進(jìn)行細(xì)胞收集，其中收集步驟包括在對(duì)至少一部分第二數(shù)量的造血祖細(xì)胞進(jìn)行第二培養(yǎng)步驟之前，至少收集一部分第二數(shù)量的造血祖細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求14中的方法，其中所述的收集步驟包括多個(gè)收集步驟，多個(gè)收集步驟之間有時(shí)間間隔，所述的第二培養(yǎng)步驟含有多個(gè)第二培養(yǎng)步驟，每個(gè)第二培養(yǎng)步驟都與一個(gè)所述的收集步驟相對(duì)應(yīng)。
16.如權(quán)利要求10中的方法，其中所述的造血祖細(xì)胞從血液制品獲得。
17.如權(quán)利要求16中的方法，其中所述的血液制品是流動(dòng)的周邊血液或流動(dòng)的臍帶血液。
18.一種對(duì)造血祖細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，從面生成造血原始細(xì)胞的分化細(xì)胞的方法，該方法包括在第一培養(yǎng)步驟中，在含有血清但不含有接種的基質(zhì)細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)介質(zhì)以及外源性造血生長(zhǎng)因子的環(huán)境中對(duì)第一數(shù)量的造血祖細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，從而產(chǎn)生培養(yǎng)的造血祖細(xì)胞；其中造血生長(zhǎng)因子促進(jìn)造血細(xì)胞的維持、擴(kuò)增和/或分化；間歇性地收集所述培養(yǎng)造血祖細(xì)胞的一部分，從而生成多組間歇收集的造血培養(yǎng)細(xì)胞；在多個(gè)第二培養(yǎng)步驟中，對(duì)多組間歇收集的造血細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，第二培養(yǎng)步驟的培養(yǎng)環(huán)境中至少含有一種以下物質(zhì)造血生長(zhǎng)因子、接種的基質(zhì)細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)介質(zhì)；其中造血生長(zhǎng)因子促進(jìn)造血細(xì)胞的維持、擴(kuò)增和/或分化；第二培養(yǎng)步驟可產(chǎn)生造血原始細(xì)胞的分化細(xì)胞。
19.如權(quán)利要求18中的方法，其中所述第一培養(yǎng)步驟的環(huán)境中不含白細(xì)胞間介素3、白細(xì)胞間介素6、白細(xì)胞間介素11、Tpo、干細(xì)胞因子以及FLT/FLK配位體生長(zhǎng)因子。
20.如權(quán)利要求18中的方法，其中的環(huán)境不含造血生長(zhǎng)因子。
全文摘要
本文涉及在缺乏外源性造血生長(zhǎng)因子的條件下，造血祖細(xì)胞體外培養(yǎng)所用的方法和裝置。造血祖細(xì)胞在缺乏外源性添加的造血生長(zhǎng)因子的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，但祖細(xì)胞的數(shù)量和/或功能不會(huì)降低，同時(shí)保持了祖細(xì)胞的多能性。
文檔編號(hào)A61L27/00GK1656214SQ03811772
公開(kāi)日2005年8月17日 申請(qǐng)日期2003年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月24日
發(fā)明者馬克·J·佩克特, 邁克·羅森茲維格, 托德·M·厄普頓 申請(qǐng)人:基質(zhì)細(xì)胞有限責(zé)任公司