專利名稱：護(hù)骨素在治療和／或預(yù)防纖維變性疾病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及纖維變性疾病及結(jié)締組織病領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及護(hù)骨素(osteoprotegerin)在治療和/或預(yù)防纖維變性疾病尤其是硬皮病中的應(yīng)用。護(hù)骨素與干擾素、TNF拮抗劑或其他抗纖維變性試劑如SARP-1的聯(lián)用也包括在本發(fā)明之內(nèi)。
背景技術(shù)：
纖維變性是在包括腎、心臟、肺、胃和關(guān)節(jié)等內(nèi)臟器官內(nèi)膠原蛋白過度產(chǎn)生的一種病征。
肺纖維變性是其中一種主要纖維變性疾病。特發(fā)性肺纖維變性(IPF)表現(xiàn)為肺泡壁病因不明地慢性發(fā)炎，逐漸纖維化。特發(fā)性間質(zhì)性肺病中50％至60％的病例是由IPF或者隱原性纖維性肺泡炎引致的。
普通間質(zhì)性肺炎(UIP)是間質(zhì)性肺炎的一種特殊組織病理模式，是IPF肺活檢中發(fā)現(xiàn)的典型模式。放大倍數(shù)較低時(shí)，組織呈不均質(zhì)，有正常肺部、間質(zhì)發(fā)炎、纖維變性和蜂窩樣等不同區(qū)域。間質(zhì)發(fā)炎在于淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞以及II型肺細(xì)胞增生相關(guān)的組織細(xì)胞的泡膜浸潤(rùn)。雖然增生成纖維細(xì)胞的分散病灶(成纖維細(xì)胞病灶)是早期病和活躍病的位點(diǎn)，通?？稍谛∨菸恢谜业?，但纖維變性區(qū)主要由致密非細(xì)胞膠原組成。蜂窩樣區(qū)域由囊性纖維化空隙組成，內(nèi)層通常為支氣管上皮并充滿粘液。嗜中性粒細(xì)胞可集中在粘液中。平滑肌增生常常發(fā)生在纖維變性和蜂窩樣區(qū)域。鑒定UIP最有用的特征是胸膜下和隔旁分布、斑狀特征以及時(shí)間異質(zhì)性。
間質(zhì)性發(fā)炎和纖維變性的相同模式是發(fā)生于膠原血管疾病(例如RA、SLE、進(jìn)行性全身性硬化癥、混合性結(jié)締組織病，糖尿病)、塵肺病(例如石棉沉滯癥)、放射性損傷、和某些藥物誘發(fā)的肺病(例如由呋喃妥因(nitrofurantoin)誘發(fā))內(nèi)。
IPF的臨床病程是漸進(jìn)的；診斷后存活期中值為4至6年。治療IPF通常使用強(qiáng)的松。對(duì)治療的反應(yīng)是可變化的，但在留下大量疤痕之前的細(xì)胞成分較多的階段，用皮質(zhì)類固醇或細(xì)胞毒素治療早期病患者似乎更有療效。支援姑息療法包括高濃度氧氣以減緩血氧不足，如果發(fā)生細(xì)胞感染，還包括抗生素。已經(jīng)有過末期肺病患者肺移植成功的例子。
肺纖維變性涉及肝臟內(nèi)結(jié)締組織積聚，這是由于胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和降解不平衡造成的，而先前存在的纖維萎陷和縮聚增強(qiáng)了纖維變性。
肝臟纖維變性是對(duì)肝細(xì)胞壞死或損傷的一種常見反應(yīng)，可經(jīng)由各種各樣試劑誘導(dǎo)發(fā)生，例如干擾肝臟動(dòng)態(tài)平衡的任何過程(尤其是發(fā)炎、中毒損傷、或肝血流改變)，以及肝感染(病毒、細(xì)胞、真菌和寄生蟲)。許多由先天性代謝性缺陷引起的貯積病通常與纖維變性有關(guān)，包括脂質(zhì)代謝紊亂(高歇氏病(Gaucher′s disease))、糖原貯積病(尤其是III、V、VI、IX和X型)；α1-抗胰蛋白酶缺乏；在鐵超負(fù)荷綜合征(血色沉著病)和銅貯積病(威爾遜氏病(Wilson′sdisease))中發(fā)現(xiàn)的外源物質(zhì)貯積；有毒代謝物積聚(如酪氨酸血病、果糖血癥和半乳糖血癥)；以及過氧化物酶體紊亂(澤爾韋格合征(Zellweger syndrome))。很多化學(xué)物質(zhì)和藥物可引致纖維變性，尤其是酒精、甲氨蝶呤、異煙肼、酚丁、甲多巴(methyldopa)、氯丙嗪、甲苯磺丁脲和胺碘酮。肝循環(huán)障礙(例如慢性心衰竭、巴-希二氏綜合征(Budd-Chiari syndrome)、靜脈阻塞性疾病、門靜脈栓塞)和慢性膽流阻塞都可導(dǎo)致纖維變性。最后，先天性肝纖維變性是一種常染色體隱性畸形。
正常肝臟由肝細(xì)胞和分布在由膠原蛋白(主要為I、III和IV型)和非膠原蛋白質(zhì)，包括糖蛋白(如纖連蛋白、層粘連蛋白)和多種蛋白聚糖(如硫酸肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、透明質(zhì)酸鹽)，組成的胞外基質(zhì)內(nèi)的竇狀隙構(gòu)成。正常情況下在匯管區(qū)(portal tracts)中找到的成纖維細(xì)胞可產(chǎn)生膠原、大分子糖蛋白和蛋白聚糖。
其他肝臟細(xì)胞(尤其是肝細(xì)胞和貯脂Kupffer細(xì)胞，以及內(nèi)皮細(xì)胞)也能夠產(chǎn)生胞外基質(zhì)成分。貯脂細(xì)胞位于狄氏腔(space of Disse)竇內(nèi)皮以下，是成纖維細(xì)胞的前體，能夠增殖和產(chǎn)生過量胞外基質(zhì)。肝臟細(xì)胞受損尤其是壞死以及炎癥細(xì)胞導(dǎo)致膠原主動(dòng)沉積形成纖維變性。從這些細(xì)胞釋放出來(lái)的確切因子尚未清楚，但可能是一或多個(gè)細(xì)胞因子或者脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物。Kupffer細(xì)胞和活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子。壞死肝臟細(xì)胞周圍形成新的成纖維細(xì)胞；膠原合成增加導(dǎo)致出現(xiàn)疤痕。纖維變性可源自纖維主動(dòng)生成和正常或改性膠原的不良降解。貯脂細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)于清除I型膠原、某些蛋白聚糖和變性膠原是重要的。這些細(xì)胞活性的改變可能使纖維變性程度發(fā)生變化。組織病理學(xué)家認(rèn)為，纖維變性組織在先前存在的纖維的被動(dòng)萎陷和縮聚中可變得更明顯。
所以，膠原的合成增加或降解減少都會(huì)引致過多結(jié)締組織主動(dòng)沉積，這影響到肝功能1)細(xì)胞外周纖維變性損害細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)并導(dǎo)致肝細(xì)胞萎縮；2)在狄氏腔內(nèi)，纖維變性組織在竇狀隙周圍積聚，阻塞血液中的物質(zhì)自由通過到達(dá)肝細(xì)胞；3)肝靜脈和匯管區(qū)周圍的纖維變性影響肝的血液流動(dòng)。從通過肝臟門靜脈分支至竇狀隙最后到達(dá)肝靜脈的靜脈阻力增大?？梢陨婕叭咳龡l途徑。
中心靜脈與匯管區(qū)連接的纖維變性帶也有利于吻合通道繞過正常肝細(xì)胞的動(dòng)脈血分流至輸出肝靜脈，這進(jìn)一步損害肝功能并能夠加重肝細(xì)胞壞死。這種過程存在的程度決定了肝功能異常的程度例如，在先天性肝纖維變性中，較大的纖維變性帶主要涉及門區(qū)(portal region)，但通常不傷害肝實(shí)質(zhì)。因此，先天性肝纖維變性表現(xiàn)為門脈高血壓，但保持肝細(xì)胞功能。
硬皮病是一種以皮膚和內(nèi)臟器官纖維變性為特征的結(jié)締組織疾病，導(dǎo)致器官衰竭和死亡(Black等人，1998；Clements和Furst，1996)。硬皮病有多種表現(xiàn)，在治療上有各種含義。它包括局限性硬皮病(localized scleroderma)、全身性硬化癥(systemic sclerosis)、硬皮病樣疾病及無(wú)硬皮病(Sinescleroderma)(Smith 2000)。局限性硬皮病是一種比較罕見的皮膚病，只限于皮膚的纖維變性和表現(xiàn)；全身性硬化癥是一種累及內(nèi)臟器官的多系統(tǒng)疾病，而且皮膚病的程度也是不同的。全身性硬化癥可以是彌漫型或局限型。局限型全身性硬化癥也稱CREST綜合癥(鈣質(zhì)沉積、雷諾現(xiàn)象、食道功能障礙、指端硬化、毛細(xì)血管擴(kuò)張)。據(jù)認(rèn)為，硬皮病樣疾病與暴露于工業(yè)環(huán)境有關(guān)。無(wú)硬皮病只涉及內(nèi)臟器官，而皮膚無(wú)改變。
硬皮病特別是全身性硬化癥的主要表現(xiàn)是不恰當(dāng)?shù)倪^度膠原合成和沉積、內(nèi)皮功能障礙、痙攣、由纖維變性引起的萎陷和閉塞。
硬皮病是一種比較罕見的疾病，每百萬(wàn)人中大約有19人發(fā)病。硬皮病的發(fā)病原因尚未清楚。然而，遺傳易感性是非常重要的。異常情況包括自身免疫與內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞功能的改變。事實(shí)上，全身性硬化癥可能是最嚴(yán)重的自身免疫疾病，診斷后5年內(nèi)死亡率為50％(Silman，1991)。
在診斷上，一個(gè)重要的臨床參數(shù)是近端掌指關(guān)節(jié)皮膚增厚。雷諾現(xiàn)象是硬皮病的常見癥狀，幾乎所有硬皮病患者均有雷諾現(xiàn)象。皮膚遇冷后會(huì)有色素變化，由此可作出診斷。雷諾疾病的癥狀是缺血和皮膚增厚。
疾病初期、加重和進(jìn)展都有一些基本的隱伏生物過程，包括血管功能障礙、內(nèi)皮細(xì)胞活化和損害、白細(xì)胞積聚、自身抗體的產(chǎn)生，以及嚴(yán)重時(shí)有失控的纖維變性反應(yīng)，可導(dǎo)致死亡(Clements和Furst，1996)。成纖維細(xì)胞在該疾病的發(fā)病機(jī)制中起決定性作用。從硬皮病患者身上抽取原代成纖維細(xì)胞，其具有體內(nèi)看到的許多疾病特性，主要為胞外基質(zhì)合成和沉積增加，特別是膠原和纖連蛋白(fibronectin)，以及改變生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如TGFβ和CTGF(Strehlow和Korn，1998；LeRoy，1974)。
目前尚未有效的方法治愈硬皮病。有人提出一種新穎但風(fēng)險(xiǎn)很高的療法自體干細(xì)胞移植(Martini等人，1999)。具體地說(shuō)，迄今為止還沒有一種硬皮病的治療方法是針對(duì)纖維變性過程(Wigley和Boling，2000)。
鑒定與疾病風(fēng)險(xiǎn)和硬皮病進(jìn)展相關(guān)的基因可能會(huì)研究出有效策略，在疾病的不同階段作出干預(yù)。
1997年，護(hù)骨素(OPG)首先被鑒定為一種由成纖維細(xì)胞分泌出來(lái)的新穎細(xì)胞因子(Simonet等人，1997)。人OPG是一個(gè)401個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，含有一個(gè)21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，將人OPG在22位谷氨酸之前切割，產(chǎn)生一個(gè)380個(gè)氨基酸的成熟蛋白質(zhì)。因此，OPG是一種可溶性蛋白。它是TNF受體家族的其中一個(gè)成員(Morinaga等人，1998，Yasuda等人，1998)，其N端部分含有四個(gè)富半胱氨酸的TNFR樣結(jié)構(gòu)域(Simonet等人，1997)。OPG已經(jīng)顯示在骨發(fā)育中起著作用，缺乏OPG基因的小鼠帶有骨質(zhì)疏松表型，而且全部骨胳為異常(Min等人，2000)。
護(hù)骨素由成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，缺少跨膜結(jié)構(gòu)域并作為不具有直接信號(hào)傳導(dǎo)能力的分泌性誘餌受體(decoy receptor)起作用。OPG通過與其天然配體護(hù)骨素配體(OPGL，也稱RANKL(NF-kappaB配體的受體激活劑))相結(jié)合起作用。OPG與OPGL之間的結(jié)合阻止OPGL激活它的同源受體RANK，其為一種破骨細(xì)胞受體，對(duì)破骨分化、活化和存活至關(guān)重要。
人OPG是TNFR家族成員，是一個(gè)單拷貝基因，由5個(gè)外顯子組成，長(zhǎng)29kb基因組(Simonet等人，1997)。重組OPG分別以表觀分子量為55kDa和110kDa的單體和二聚形式存在(Simonet等人，1997)。在N端結(jié)構(gòu)域切斷185位半胱氨酸，大概因?yàn)槠茐牧薚NFR樣結(jié)構(gòu)域的SSS3二硫鍵導(dǎo)致失活，而在蛋白質(zhì)C端部分切斷194位氨基酸則不會(huì)改變生物活性。所以，OPG的N端TNFR樣結(jié)構(gòu)域足以防止破骨細(xì)胞生成(Simonet等人，1997)。
轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)OPG過度表達(dá)在接近完全缺乏破骨細(xì)胞的情形下會(huì)導(dǎo)致深度骨胳石化癥。相反，切除OPG基因可引致小鼠發(fā)生嚴(yán)重骨胳石化癥。切除OPGL或RANK也會(huì)發(fā)生深度骨胳石化癥，表示這些蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)骨吸收方面有重要的生理作用。破骨細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分泌OPG和OPGL受許多激素和細(xì)胞因子通常以交互方式調(diào)節(jié)。OPG和OPGL產(chǎn)生的相對(duì)水平被認(rèn)為最終支配骨吸收程度。過量OPGL增加骨吸收，而過量OPG抑制骨吸收。事實(shí)上，重組OPG阻斷在體內(nèi)外刺激破骨細(xì)胞的全部因子的作用。OPG還抑制各種動(dòng)物疾病模型的骨吸收，包括卵巢切除誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥、惡性體液性高鈣血癥和實(shí)驗(yàn)性骨腫瘤轉(zhuǎn)移。所以，對(duì)于過度破骨細(xì)胞活性相關(guān)的疾病而言，OPG可能是一個(gè)有效治療選擇(Kostenuik and Shalhoub，2001)。
然而，仍未有人提示護(hù)骨素參與纖維變性疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)給予護(hù)骨素能顯著改善已建立的肺纖維變性動(dòng)物模型的病癥。肺纖維變性是硬皮病的其中一種表現(xiàn)。
因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于使用護(hù)骨素制備治療和/或預(yù)防纖維變性疾病尤其是硬皮病的藥物。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于使用表達(dá)護(hù)骨素的細(xì)胞或者含有護(hù)骨素編碼序列的表達(dá)載體制備治療和/或預(yù)防纖維變性疾病尤其是硬皮病的藥物。含有護(hù)骨素和其他抗纖維變性藥物如鹵夫酮(halofuginone)的藥物組合物，以及包括把護(hù)骨素給予人體的治療方法也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。


圖1所示為經(jīng)由基因過濾微陣列分析測(cè)定的6例硬皮病患者的正常(斜陰影線)和患病(水平陰影線)成纖維細(xì)胞中OPG mRNA的表達(dá)。平均表達(dá)水平見(a)部分，而表達(dá)水平的中值見(b)部分。
圖2所示為對(duì)9例硬皮病患者的OPG mRNA所作實(shí)時(shí)PCR分析。每例患者的結(jié)果表示為病變/非病變成纖維細(xì)胞內(nèi)OPG mRNA的表達(dá)之比。
圖3所示為經(jīng)由實(shí)時(shí)PCR測(cè)定的取自5例硬皮病患者病變和非病變皮膚的活檢中OPG mRNA的表達(dá)。橫線表示各組表達(dá)水平的中值。
圖4所示為病變和正常皮膚成纖維細(xì)胞中OPG表達(dá)的Western印跡分析。A1-A4為病變成纖維細(xì)胞，N1-N4為正常成纖維細(xì)胞。凝膠左手側(cè)的箭頭表示天然OPG(55kDa單體)及其二聚形式(110kDa)的位置。OPG Fc融合蛋白(購(gòu)自R&D systems)用作抗體的陽(yáng)性對(duì)照。
圖5所示為OPG對(duì)AG1518人成纖維細(xì)胞內(nèi)膠原合成的作用。AG1518細(xì)胞完全未經(jīng)處理或者以10、20或40ng/ml OPG預(yù)處理24小時(shí)，或者以40ng OPG+抗OPG中和單克隆抗體(1μg/ml)處理24小時(shí)，或者先單獨(dú)以抗OPG中和單克隆抗體然后以2ng/ml TGFβ1處理24小時(shí)。膠原合成通過ELISA測(cè)定。結(jié)果以三個(gè)測(cè)定值的平均值+S.E.M表示。
圖6所示為OPG轉(zhuǎn)染對(duì)人原代成纖維細(xì)胞(OBHC細(xì)胞)內(nèi)I型膠原α2合成的影響。參照方法部分中所述，使OBHC細(xì)胞與pcDNA3.1/OPG(OPG)或僅與pcDNA3.1(模擬試驗(yàn))轉(zhuǎn)染。以TGFβ1處理后24小時(shí)通過ELISA測(cè)量條件培養(yǎng)基內(nèi)的膠原。結(jié)果以三個(gè)測(cè)定值的平均值+S.E.M表示。
圖7A所示為OPG對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞內(nèi)I型膠原α2啟動(dòng)子活性的影響。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(πS3細(xì)胞)與含有連接于螢光素酶cDNA的3.5kb膠原1α2啟動(dòng)子的pGL3載體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基中，細(xì)胞或者未經(jīng)處理(對(duì)照)，或者僅以鹵夫酮(10-10M)處理12小時(shí)(HF)；以TGFβ1(5ng/ml)處理12小時(shí)(TGFβ1)；或者以TGFβ1(5ng/ml)+HF(10-8M)處理12小時(shí)(HF+TGFβ1)，伴隨護(hù)骨素濃度增大。結(jié)果以三個(gè)測(cè)定值的平均值表示。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。
圖7B所示為經(jīng)過僅與TGFβ培養(yǎng)或者與TGFβ并結(jié)合不同數(shù)量的OPG培養(yǎng)后在CTGF啟動(dòng)子存在下報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)的程度。
圖8所示為用鹵夫酮在體外處理硬皮病患者的病變和非病變成纖維細(xì)胞之后，對(duì)護(hù)骨素mRNA所作的逆轉(zhuǎn)錄酶PCR分析。以1％瓊脂糖-溴化乙錠染色的凝膠顯示病變成纖維細(xì)胞(詞尾A)和非病變成纖維細(xì)胞(詞尾N)中護(hù)骨素(上)和GAPDH(下)的RT PCR反應(yīng)產(chǎn)物。
圖9所示為體內(nèi)給予護(hù)骨素對(duì)用博來(lái)霉素處理過的小鼠肺纖維變性發(fā)展的影響。A小鼠體重隨護(hù)骨素的處理時(shí)間而變化。結(jié)果以氣管內(nèi)滴注博來(lái)霉素后每日測(cè)量的平均體重(克/組)表示。B給予博來(lái)霉素導(dǎo)致的死亡率。結(jié)果以每組10只動(dòng)物的死亡平均數(shù)表示。
圖10所示為體內(nèi)給予護(hù)骨素對(duì)用博來(lái)霉素處理過的小鼠肺纖維變性發(fā)展的影響。A給予博來(lái)霉素后12天測(cè)量的肺纖維變性程度。肺部用trichrome染色。結(jié)果以每只存活動(dòng)物受纖維變性影響的代表性肺葉的百分比表示。B給予博來(lái)霉素后12天測(cè)量的肺膠原沉積程度。測(cè)量每只存活動(dòng)物代表性肺葉的羥基脯氨酸含量。
具體實(shí)施例方式
根據(jù)本發(fā)明，使用DNA基因過濾微陣列技術(shù)(DNA gene filtermicroarraytechnology)來(lái)鑒定取自全身性硬化癥(硬皮病)患者中纖維變性病變的皮膚成纖維細(xì)胞與相同患者正常皮膚成纖維細(xì)胞相比的差異表達(dá)基因。在硬皮病成纖維細(xì)胞中持續(xù)下調(diào)的一個(gè)基因是護(hù)骨素(OPG)，也叫破骨細(xì)胞生成抑制因子。在9例測(cè)試患者中有7例的異常成纖維細(xì)胞與正常成纖維細(xì)胞相比表達(dá)極低水平OPG mRNA。這些結(jié)果得到實(shí)時(shí)PCR分析的證實(shí)。另外，對(duì)從硬皮病患者異常皮膚的整個(gè)活檢樣品分離出來(lái)的總RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)RP-PCR分析，結(jié)果顯示與臨床上正常、年齡、性別和解剖位置匹配的對(duì)照活檢相比，得到的總RNA的OPG mRNA水平較低。病變成纖維細(xì)胞的OPG蛋白也比相同患者分離出來(lái)的正常成纖維細(xì)胞的少。OPG在體外能夠使成纖維細(xì)胞與OPG cDNA轉(zhuǎn)染后，或者用重組蛋白處理后TGFβ介導(dǎo)的膠原合成減少。OPG的另一種體外活性是抑制TGFβ誘導(dǎo)的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)表達(dá)。CTGF正常情況下誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞內(nèi)胞外基質(zhì)成分的合成。
這些體外數(shù)據(jù)也得到從已有動(dòng)物模型取得的體內(nèi)數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持。給予護(hù)骨素能減少博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維變性模型的肺纖維變性并降低膠原沉積。從組織角度上看，用護(hù)骨素處理的動(dòng)物的肺與未經(jīng)處理的幼鼠的肺是類似的。
所以，本發(fā)明涉及一種物質(zhì)在制備治療和/或預(yù)防纖維變性疾病的藥物中的應(yīng)用，所述物質(zhì)選自以下組a)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的多肽；b)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的22到401氨基酸的多肽；c)含有1、2、3或4個(gè)護(hù)骨素富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的多肽；d)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的22到194氨基酸的多肽；e)(a)到(d)的任何一個(gè)突變蛋白，其中氨基酸序列與(a)到(d)中至少一個(gè)序列至少有40％或50％或60％或70％或80％或90％的同一性；f)(a)到(d)的任何一個(gè)突變蛋白，其中該突變蛋白是由在溫和嚴(yán)格條件或高度嚴(yán)格條件下能與編碼(a)到(d)任何一個(gè)突變蛋白的DNA序列的互補(bǔ)序列雜交的DNA序列編碼；g)(a)到(d)的任何一個(gè)突變蛋白，其中所述氨基酸序列的任何改變都是用保守性氨基酸取代(a)到(d)的氨基酸序列；h)(a)到(g)任何一個(gè)突變蛋白的鹽或同種型、融合蛋白、功能衍生物、活性片段或環(huán)形排列的衍生物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)懂得，根據(jù)本發(fā)明，刺激內(nèi)源護(hù)骨素釋放或加強(qiáng)其活性的物質(zhì)可同樣地用來(lái)治療和/或預(yù)防纖維變性疾病，尤其是硬皮病。所述物質(zhì)可以是成熟護(hù)骨素本身，或者是護(hù)骨素結(jié)合OPGL從而阻止OPGL與RANK結(jié)合以防治啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)通過RANK的任何片段。這樣一種物質(zhì)可以是例如針對(duì)OPGL的抗體。已經(jīng)知道OPG與OPGL結(jié)合，該相互作用阻止OPGL與其受體RANK結(jié)合。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)懂得，任何阻止OPGL與其受體RANK結(jié)合的物質(zhì)，或者任何阻斷RANK活性或信號(hào)傳導(dǎo)的其他試劑，都具有與護(hù)骨素預(yù)防和/或治療纖維變性疾病，尤其是硬皮病相同的活性。阻斷OPGL與RANK結(jié)合的試劑可以是例如針對(duì)OPGL的拮抗抗體。阻斷RANK活性的試劑還可以是例如針對(duì)RANK的拮抗抗體。其他阻斷OPGL/RANK相互作用的試劑可以是干擾這兩種蛋白質(zhì)相互結(jié)合的化合物，也可以是抑制信號(hào)傳導(dǎo)通過RANK受體的任何其他化學(xué)或生物抑制劑。
已經(jīng)克隆了人護(hù)骨素的全長(zhǎng)cDNA，如所附序列表的SEQ ID NO1所示，相應(yīng)的氨基酸序列如所附序列表的SEQ ID NO2所示。關(guān)于這些序列的描述可以在網(wǎng)址www.ncbi.nlm.nih.gov中查到，其編號(hào)為AB_008821，以及參見Morinaga等人(1998)等人所述。Simonet等人(1997)描述了護(hù)骨素的同種型或多態(tài)形式。Simonet等人(1997)的cDNA如所附序列表的SEQ ID NO3所示，而相應(yīng)的氨基酸序列如所附序列表的SEQ ID NO4所示。兩個(gè)序列都可在網(wǎng)址www.ncbi.nlm.nih.gov中查到，其編號(hào)為U94332。Morinaga等人和Simonet等人發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的差別僅在于氨基酸位置263，分別是天冬氨酸或丙氨酸。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“護(hù)骨素”指的是上述(a)到(h)考慮的任何一種物質(zhì)。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“預(yù)防和/或治療”包括對(duì)疾病的形成、發(fā)展、進(jìn)程或者疾病的任一個(gè)、某些或全部癥狀的形成、發(fā)展或進(jìn)程的任何減輕、減緩，或者部分的、實(shí)質(zhì)性的或完全的防止或阻斷。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“纖維變性疾病”指的是涉及纖維變性的疾病，可以是例如由慢性炎癥或組織修復(fù)和再生引起。纖維變性可涉及人體內(nèi)任何器官，例如皮膚、肺、胰、肝或腎。因此，本發(fā)明還涉及纖維變性疾病的治療和/或預(yù)防，例如肝硬化、肺間纖維變性、迪皮特朗攣縮(Dupuytren’s contracture)、瘢痕疙瘩和其它疤痕/傷口的不正常愈合、手術(shù)后縫合和反應(yīng)性纖維變性、以及慢性心衰竭，特別是心肌梗塞之后。其他可用護(hù)骨素治療的疾病包括傷口愈合疾病，尤其是肺部傷口愈合，包括慢性肺炎并最后導(dǎo)致肺表面纖維變性或疤痕。涉及肺炎的病癥包括例如特發(fā)性肺纖維變性、肉狀瘤病、支氣管肺發(fā)育不良、纖維增生性ARDS，以及肺部適應(yīng)癥或全身性疾病例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Krein等人，2001)。
纖維變性一般涉及結(jié)締組織的產(chǎn)生或增生，替換某一給定器官的功能專用組織。因此，在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，纖維變性疾病是結(jié)締組織病。
在一優(yōu)選實(shí)施例中，纖維變性疾病是硬皮病。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“硬皮病”指的是稱之全身性硬化癥或全身性硬皮病。這些術(shù)語(yǔ)在本專利申請(qǐng)中是同義的。全身性硬化癥是一種不明病因的慢性病，表現(xiàn)為皮膚、關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)和內(nèi)臟器官(尤其是食道、胃腸道、肺、心和腎)出現(xiàn)分散性纖維化、退化性改變和血管異常。它可以是局限性、混合性、全身性、彌漫型或局限型。
術(shù)語(yǔ)“硬皮病”較佳指的是局限性硬皮病、全身性硬皮病、彌漫型硬皮病或局限型硬皮病以及疊加綜合征。
局限性硬皮病主要影響皮膚，但也會(huì)影響下面的肌肉和骨胳。然而，它通常不會(huì)累及內(nèi)臟器官。局限性硬皮病是病情相對(duì)較輕的硬皮病，可與全身性硬皮病的表面癥狀相似，例如顯微鏡下皮膚活檢的表現(xiàn)。
全身性硬皮病包括多種癥狀和多組癥狀，如CREST綜合征、局限型與彌漫型。全身性硬皮病又叫進(jìn)行性全身性硬化癥或家族性進(jìn)行性全身性硬化癥。全身性硬皮病可以影響例如皮膚、血管和/或內(nèi)臟器官。當(dāng)它累及皮膚時(shí)，它可導(dǎo)致皮膚增厚，大多數(shù)常見于手和臉。當(dāng)它累及血管時(shí)，它可引起雷諾疾病。全身性硬化癥的最嚴(yán)重情況是累及內(nèi)臟器官，可導(dǎo)致殘廢甚至死亡。除此之外，全身性硬化癥包括硬皮病肺病、硬皮病腎危象、心臟表征、包括疲勞或局限型CREST在內(nèi)的肌肉無(wú)力、胃腸蠕動(dòng)異常和痙攣以及中樞、周邊和自主神經(jīng)系統(tǒng)異常。對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)異常，最常見的是先有腕管綜合征，繼而三叉神經(jīng)痛。
局限型硬皮病可以例如限于手指，雖然也可累及臉和頸。
彌漫型硬皮病包括皮膚繃緊，也可發(fā)生在手腕以上的位置(或肘)。彌漫型硬皮病有多種亞型，例如內(nèi)臟器官纖維變性但皮膚無(wú)繃緊的“硬皮病無(wú)硬皮病(scleroderma sine scleroderma)”和發(fā)生在家族中較少見的家族性進(jìn)展性全身性硬化癥。
疊加綜合癥指硬皮病患者還有其它自身免疫疾病(如狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等)，例如彌漫型硬皮病與狼瘡迭加。硬皮病癥狀也可以是混合型結(jié)締組織病(MCTD)或者未分化型結(jié)締組織病(UCTD)的一部分。
本文使用的術(shù)語(yǔ)“護(hù)骨素”指的是含有所附序列表的SEQ ID NO2或4(二者均為人)的全部或一部分序列的蛋白質(zhì)，及其鹽、同種型、突變蛋白、活性片段、功能衍生物和環(huán)形排列的衍生物。來(lái)自人以外的其他物種的OPG，例如小鼠或大鼠，也可用于本發(fā)明中，只要蛋白質(zhì)之間有足夠同一性，使該蛋白質(zhì)具有生物活性，而且在人體內(nèi)不會(huì)引起明顯的免疫反應(yīng)。
較佳的是，術(shù)語(yǔ)“護(hù)骨素”指缺少信號(hào)肽的成熟蛋白。該信號(hào)肽含有SEQID NO2或4所示的OPG的N端21個(gè)氨基酸，即含有SEQ ID NO2或4的22到401氨基酸的成熟蛋白。本文使用的術(shù)語(yǔ)“護(hù)骨素”還包括對(duì)硬皮病或其他纖維變性疾病表現(xiàn)所希望的活性的SEQ ID NO2或4的任何片段、部分、結(jié)構(gòu)域或亞結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)片段、同種型、差異性糖基化或唾液酸化形式、或者該蛋白質(zhì)的一或多個(gè)結(jié)構(gòu)域都可用在本發(fā)明中，只要它們對(duì)纖維變性疾病具有有益的效果，最好具有至少可比擬全長(zhǎng)蛋白的效果。有益的效果可在以下實(shí)施例描述的其中一個(gè)體內(nèi)或體外試驗(yàn)中，或者在任何其它充分證明對(duì)纖維變性疾病，尤其是硬皮病的效果的試驗(yàn)中測(cè)定。
例如，參照Simonet等人，1997所述，護(hù)骨素的N端部分包括一富含半胱氨酸的TNFR樣結(jié)構(gòu)域。含有該結(jié)構(gòu)域的片段在體外試驗(yàn)中保留了OPG的生物活性。因此，優(yōu)選的OPG片段含有OPG的TNFR樣結(jié)構(gòu)域，特別是含有SEQ ID NO2或4的22到194氨基酸的片段。
根據(jù)本發(fā)明，護(hù)骨素可以是天然存在的，即天然蛋白，或者是重組蛋白。重組生產(chǎn)可在諸如酵母菌細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞等真核細(xì)胞、HEK細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞)或人成纖維細(xì)胞或細(xì)胞系中進(jìn)行。它還可以在原核細(xì)胞中生產(chǎn)，如大腸桿菌。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，護(hù)骨素可以以單體或二聚體形式存在(Simonet等人，1997)。所以，本發(fā)明的OPG可以是單體、二聚體或多聚體。
護(hù)骨素的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)最好被糖基化。它也可以是非糖基化的，取決于特定的需要以及產(chǎn)生或分離蛋白質(zhì)的來(lái)源。
本文的術(shù)語(yǔ)“鹽”既指護(hù)骨素分子或其同類物的羧基鹽，又指氨基的酸加成鹽。羧基鹽可通過本領(lǐng)域已知的方法形成，包括無(wú)機(jī)鹽，如鈉、鈣、銨、鐵或鋅鹽等等，那些與有機(jī)堿，例如三乙醇胺、精氨酸或賴氨酸、哌啶、普魯卡因等胺形成的鹽。酸加成鹽包括例如與諸如鹽酸或硫酸等無(wú)機(jī)酸形成的鹽，以及與諸如乙酸或草酸等有機(jī)酸形成的鹽。當(dāng)然，任何這樣一些鹽必須保留與本發(fā)明有關(guān)的護(hù)骨素生物活性，即對(duì)纖維變性疾病尤其是硬皮病具有有益的效果。
護(hù)骨素的同種型或剪接變體也可用在本發(fā)明中，只要它們能夠抑制疾病的進(jìn)展和/或該疾病的癥狀。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“突變蛋白”指的是護(hù)骨素的類似物，其中天然護(hù)骨素的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基所替代，或被缺失，或者一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被插入護(hù)骨素的天然序列中，并且與野生型護(hù)骨素相比，其活性最好至少相同甚至更高。OPG的生物活性可通過例如測(cè)定OPG與其天然配體OPGL之結(jié)合來(lái)確定。評(píng)估蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的測(cè)定法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。這些測(cè)定法的例子是ELISA型結(jié)合測(cè)定法，免疫沉淀測(cè)定法，或者在任何其他合適的系統(tǒng)如BIAcore系統(tǒng)中進(jìn)行測(cè)定。這些突變蛋白可用已知的合成方法和/或定點(diǎn)誘變技術(shù)或任何其他合適的已知技術(shù)制備。
任何這樣一種蛋白質(zhì)最好具有一成熟護(hù)骨素充分復(fù)制的氨基酸序列，從而具有與護(hù)骨素基本上相似的活性。用以下實(shí)施例所解釋的測(cè)定法可測(cè)試護(hù)骨素突變蛋白的活性。例如，測(cè)量經(jīng)OPG處理的成纖維細(xì)胞中膠原合成量是評(píng)估護(hù)骨素突變蛋白的活性的一個(gè)恰當(dāng)試驗(yàn)。
本發(fā)明的突變蛋白包括由在嚴(yán)格條件下雜交于編碼護(hù)骨素的DNA或RNA的核酸(如DNA或RNA)所編碼的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格條件”是指本領(lǐng)域一般技術(shù)人員常規(guī)地稱為“嚴(yán)格的”雜交條件以及隨后的洗滌條件。參照Ausubel等人，Current Protocol in Molecular Biology(分子生物學(xué)的目前方案)，同上，Interscience，N.Y.，§§6.3和6.4(1987，1992)，以及Sambrook等人(Sambrook，J.C.，F(xiàn)ritsch，E.F.，and Maniatis，T.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY)。
不起限制作用，嚴(yán)格條件的例子包括洗滌條件，在低于所研究的雜交體的Tm計(jì)算值12-20攝氏度下，如在2×SSC和0.5％SDS中洗滌5分鐘，在2×SSC和0.1％SDS中洗滌15分鐘；在0.1×SSC和0.5％SDS，于37攝氏度洗滌30-60分鐘并且在0.1×SSC和0.5％SDS，于68攝氏度洗滌30-60分鐘。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員知道，嚴(yán)格條件還依賴于DNA序列、寡核苷酸探針(如10-40堿基)或混合的寡核苷酸探針的長(zhǎng)度。如果使用混合探針，優(yōu)選使用四甲基氯化銨(TMAC)來(lái)代替SSC。參考Ausubel(同上)。
任何這樣的突變蛋白優(yōu)選具有與護(hù)骨素充分復(fù)制的氨基酸序列，從而具有與護(hù)骨素基本上相似或者甚至更高的生物活性。
護(hù)骨素的一種易測(cè)活性是其降低膠原合成的能力。只要突變蛋白有降低膠原合成的活性，就可被認(rèn)為具有與護(hù)骨素實(shí)質(zhì)上相似的活性。因此，可通過對(duì)任一給定的突變蛋白進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定該突變蛋白是否實(shí)質(zhì)上具有與護(hù)骨素相同的活性。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，任何這類突變蛋白具有與成熟護(hù)骨素序列至少40％的同一性或同源性。更佳地，它具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或最佳地至少90％的同一性或同源性。
同一性反映兩個(gè)或多個(gè)多肽序列或者兩個(gè)或多個(gè)多核苷酸序列之間的關(guān)系，通過比較這些序列而確定。通常，同一性指兩個(gè)多核苷酸或兩個(gè)多肽序列在各自要比較的序列長(zhǎng)度中，它們的核苷酸與核苷酸或者氨基酸與氨基酸之間的對(duì)應(yīng)是完全一樣的。
對(duì)于其對(duì)應(yīng)不是完全一樣的序列，可以確定“序列百分比”。通常把待比較的兩個(gè)序列進(jìn)行序列對(duì)比，得出這兩個(gè)序列之間的最大相關(guān)性。這可包括在其中一個(gè)或兩個(gè)序列中插入“缺口(gap)”以增加對(duì)比度。比較每一個(gè)序列的整個(gè)長(zhǎng)度(所謂的全域性對(duì)比(global alignment))，或者比較它們的較短的限定長(zhǎng)度(所謂的區(qū)域性對(duì)比(local alignment))可確定序列百分比，前者特別適合長(zhǎng)度相等或長(zhǎng)度差不多的序列，后者更適合長(zhǎng)度不相等的序列。
兩個(gè)或多個(gè)序列同一性和同源性的比較方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。例如，Wisconsin序列分析軟件包9.1版(Devereux J等人，1984)所提供的程序，又例如程序BESTFIT和GAP均可用于確定兩個(gè)多核苷酸之間的同一性百分比與兩個(gè)多肽序列之間的同一性百分比及同源性百分比。BESTFIT采用Smith和Waterman的“區(qū)域性同源性”算法(1981)，找出兩個(gè)序列間最佳的一相似區(qū)域。其它確定兩個(gè)序列間同一性和/或相似性的程序也已為本領(lǐng)域所知，例如BLAST程序家族(Altschul S F等人，1990，Altschul S F等人，1997，登入NCBI主頁(yè)www.ncbi.nlm.nih.gov可查詢得到)與FASTA(Pearson WR，1990，Pearson 1988)。
本發(fā)明可用的護(hù)骨素突變蛋白，或其編碼核酸，包括由基本一致的、作為置換肽或多核苷酸序列所構(gòu)成的有限集合，這些物質(zhì)可由本領(lǐng)域一般技術(shù)人員基于本文的教導(dǎo)和指導(dǎo)，在無(wú)需過多試驗(yàn)的情況下，通過常規(guī)方法制得。
根據(jù)本發(fā)明，突變蛋白的優(yōu)選改變是已知的“保守性”置換。護(hù)骨素的多肽或蛋白質(zhì)的保守性氨基酸置換，可包括一組內(nèi)同義氨基酸，這些同義氨基酸有足夠相似的物理化學(xué)特性以致于在組成員之間的置換將保持分子的生物功能(Grantham，1974)。很清楚，還可在上述氨基酸序列中插入或缺失氨基酸，而不改變它們功能，尤其是如果這些插入或缺失只涉及到少數(shù)氨基酸，比如少于30個(gè)，較佳地少于10個(gè)，并且不取消或置換那些對(duì)功能構(gòu)象至關(guān)重要的氨基酸，比如半胱氨酸殘基。由這些插入和/或缺失所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和突變蛋白屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
較佳地，同義氨基酸(synonymous amino acid)組為表1所定義的那些；更佳地，同義氨基酸組為表2所定義的那些；最佳地，相似氨基酸組為表3所定義的那些。
表1 優(yōu)選同義氨基酸組氨基酸 同義組SerSer，Thr，Gly，AsnArgArg，Gln，Lys，Glu，HisLeuIle，Phe，Tyr，Met，Val，LeuProGly，Ala，Thr，ProThrPro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，ThrAlaGly，Thr，Pro，AlaValMet，Tyr，Phe，Ile，Leu，ValGlyAla，Thr，Pro，Ser，GlyIleMet，Tyr，Phe，Val，Leu，IlePheTrp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，PheTyrTrp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，TyrCysSer，Thr，CysHisGlu，Lys，Gln，Thr，Arg，HisGlnGlu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，GlnAsnGln，Asp，Ser，AsnLysGlu，Gln，His，Arg，LysAspGlu，Asn，AspGluAsp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，GluMetPhe，Ile，Val，Leu，MetTrpTrp表2 更好的同義氨基酸組氨基酸 同義組
SerSerArgHis，Lys，ArgLeuLeu，Ile，Phe，MetProAla，ProThrThrAlaPro，AlaValVal，Met，IleGlyGlyIleIle，Met，Phe，Val，LeuPheMet，Tyr，Ile，Leu，PheTyrPhe，TyrCysCys，SerHisHis，Gln，ArgGlnGlu，Gln，HisAsnAsp，AsnLysLys，ArgAspAsp，AsnGluGlu，GlnMetMet，Phe，Ile，Val，LeuTrpTrp表3 最好的同義氨基酸組氨基酸 同義組SerSerArgArgLeuLeu，Ile，MetProProThrThrAlaAlaValVal
GlyGlyIleIle，Met，LeuPhePheTyrTyrCysCys，SerHisHisGlnGlnAsnAsnLysLysAspAspGluGluMetMet，Ile，LeuTrpMet可通過在蛋白質(zhì)內(nèi)的產(chǎn)生氨基酸置換，得到用于本發(fā)明的護(hù)骨素多肽或蛋白的突變蛋白，其例子包括任何已知的方法步驟，如在Mark等人的美國(guó)專利4959314，4588585，4737462；Koths等人的美國(guó)專利5116943，Namen等人的美國(guó)專利4965195；Chong等人的美國(guó)專利4879111，和Lee等人的美國(guó)專利5017691中所述的方法；以及美國(guó)專利4904584(Shaw等人)中所述的賴氨酸置換蛋白質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“融合蛋白”指的是一種多肽，其中包含護(hù)骨素，或其突變蛋白，并和其他蛋白質(zhì)(如在體液中有更長(zhǎng)保留時(shí)間的蛋白)融合在一起。融合蛋白包含與能夠改善分子的生物活性例如在人體內(nèi)的半衰期的蛋白質(zhì)全部或功能部分融合的護(hù)骨素全部或功能部分。一優(yōu)選實(shí)施例中的融合蛋白包括免疫球蛋白(Ig)融合。包含與免疫球蛋白(Ig)全部或一部分融合的護(hù)骨素全部或一部分的融合蛋白是高度優(yōu)選的。它們可以是單體或多聚體，異源或同源多聚體。融合蛋白最好含有免疫球蛋白恒定區(qū)，特別是免疫球蛋白的Fc部分。免疫球蛋白是IgG1或IgG2同種型的實(shí)施例是本發(fā)明更優(yōu)選的。融合最好是Fc融合。
因此，護(hù)骨素可以與另一蛋白質(zhì)、多肽等融合，例如免疫球蛋白或其片段。融合可以是直接的，或者通過短連接肽，該連接肽的長(zhǎng)度可以短至1-3個(gè)氨基酸殘基，或長(zhǎng)達(dá)例如13-20氨基酸殘基。所述連接肽可以是引入的位于護(hù)骨素序列與免疫球蛋白序列之間的，例如序列為E-F-M(Glu-Phe-Met)的三肽，或含Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met的13聚氨基酸連接肽序列。
本文使用的“功能衍生物”涵蓋護(hù)骨素的衍生物，以及它們的突變蛋白和融合蛋白，這些物質(zhì)可用本領(lǐng)域已知的手段，從作為殘基側(cè)鏈或作為N末端或C末端基團(tuán)存在的官能團(tuán)制備而得，并且只要它們?nèi)匀皇轻t(yī)學(xué)上可接受的，即它們沒有破壞蛋白的與護(hù)骨素的活性基本相似的活性，并且不會(huì)使含該物質(zhì)的組合物具有毒性，那幺它們就被包括在本發(fā)明中。所以，一優(yōu)選實(shí)施例的功能性衍生物包括連于一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)的至少一個(gè)部分，而所述官能團(tuán)是氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈。
本發(fā)明高度優(yōu)選的部分是聚乙二醇(PEG)側(cè)鏈。PEG側(cè)鏈可掩蓋抗原位點(diǎn)并且延長(zhǎng)與它們連接的物質(zhì)在體液中的停留時(shí)間。其他的衍生物包括羧基的脂肪酯，羧基通過與氨或伯胺或仲胺反應(yīng)而形成的酰胺，氨基酸殘基的自由氨基與酰基部分(如烷?；蛱辑h(huán)芳酰基基團(tuán))形成的N-?；苌?，或自由羥基(如絲氨?；蛱K氨?；鶜埢牧u基)與酰基部分形成的O-?；苌铩?br> 護(hù)骨素、其突變蛋白和融合蛋白的“活性片段”涵蓋單獨(dú)的蛋白質(zhì)分子多肽鏈或其與相關(guān)分子或殘基相連(如糖或磷酸殘基)的多肽鏈的任何片段或前體，或蛋白質(zhì)分子或糖殘基自身的聚集體，只要所述片段具有與護(hù)骨素基本上相似的活性。
本發(fā)明還涉及核酸分子在制備治療和/或預(yù)防硬皮病的藥物中的應(yīng)用，其中該核酸分子含有的核酸序列編碼具有以下氨基酸序列之一的多肽a)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的多肽；b)含存SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的22到401氨基酸的多肽；c)含有1、2、3或4個(gè)護(hù)骨素富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的多肽；d)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的22到194氨基酸的多肽；e)(a)到(d)的任何一個(gè)突變蛋白，其中氨基酸序列與(a)到(d)中至少一個(gè)序列至少有40％或50％或60％或70％或80％或90％的同一性；f)(a)到(d)的任何一個(gè)突變蛋白，其中該突變蛋白是由在溫和嚴(yán)格條件或高度嚴(yán)格條件下能與編碼(a)到(d)任何一個(gè)突變蛋白的DNA序列的互補(bǔ)序列雜交的DNA序列編碼；g)(a)到(d)的任何一個(gè)突變蛋白，其中所述氨基酸序列的任何改變都是用保守性氨基酸取代(a)到(d)的氨基酸序列；h)(a)到(g)任何一個(gè)突變蛋白的同種型、融合蛋白或活性片段。
用于制備治療和/或預(yù)防纖維變性疾病的藥物。本發(fā)明還涉及所述核酸分子在治療和/或預(yù)防結(jié)締組織疾病，尤其是硬皮病中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明，護(hù)骨素也可以以含有所述核酸分子的載體形式給予人體。所以，本發(fā)明還涉及含有所述核酸分子的載體在制備治療和/或預(yù)防硬皮病或另一種纖維變性疾病的藥物中的應(yīng)用。載體最好是表達(dá)載體，含有操作性連接于護(hù)骨素編碼序列全部或一部分的啟動(dòng)子。另一優(yōu)選實(shí)施例的載體是基因治療載體?；蛑委熭d體為本領(lǐng)域所公知，大多數(shù)是病毒衍生而成的載體，例如腺病毒載體或慢病毒載體。
根據(jù)本發(fā)明，護(hù)骨素也可以以產(chǎn)生和/或分泌護(hù)骨素的細(xì)胞形式給予人體。所以，本發(fā)明還涉及表達(dá)護(hù)骨素的細(xì)胞在制備治療和/或預(yù)防硬皮病或另一種纖維變性疾病的藥物中的應(yīng)用，即涉及治療和/或預(yù)防硬皮病或另一種纖維變性疾病的細(xì)胞療法。此細(xì)胞可以是產(chǎn)生天然護(hù)骨素的細(xì)胞和/或產(chǎn)生重組護(hù)骨素的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。最好是表達(dá)和分泌高含量蛋白的細(xì)胞，例如過度表達(dá)的細(xì)胞，其攜帶高拷貝數(shù)目的表達(dá)載體，而該載體含有一編碼護(hù)骨素的核酸分子。
由于成纖維細(xì)胞表示纖維變性機(jī)制，所以它們是抗纖維變性和治療硬皮病的最合適的細(xì)胞。因此，本發(fā)明最好采用表達(dá)護(hù)骨素的成纖維細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及一種制備治療和/或預(yù)防纖維變性疾病尤其是硬皮病藥物的細(xì)胞，該細(xì)胞含有一包括編碼護(hù)骨素全部或一部分的核酸分子的載體。經(jīng)過基因改造產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的細(xì)胞也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在通常不表達(dá)護(hù)骨素抑制劑或抑制劑表達(dá)數(shù)量不足的細(xì)胞中，使用表達(dá)載體來(lái)誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)內(nèi)源性產(chǎn)生護(hù)骨素抑制劑的方法，也在本發(fā)明構(gòu)思中。所以本發(fā)明利用稱為內(nèi)源性基因激活(EGA)的技術(shù)產(chǎn)生所需要的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明優(yōu)選使用一些組合治療。故本發(fā)明的藥物最好還包括·干擾素，特別是干擾素β
·腫瘤壞死因子(TNF)拮抗劑，特別是可溶性TNFR，例如可溶性p55(TBPI)和/或可溶性p75(TBPII)·其他抗硬皮病試劑·選自以下組的的抗硬皮病試劑鹵夫酮、ACE抑制劑、鈣離子通道阻斷劑、質(zhì)子泵抑制劑、非類固醇抗炎藥(NSAIDs)、COX抑制劑、皮質(zhì)類固醇、四環(huán)素、己酮可可堿、布西拉明(bucillamine)、香葉基香葉基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(geranylgeranyl transferase inhibitor)、rotterlin、脯氨基-4-羥化酶抑制劑、c-蛋白酶抑制劑、賴氨基-氧化酶抑制劑、松弛素(relaxin)、鹵夫酮、前列腺素、前列環(huán)素、內(nèi)皮素-1、氧化氮、血管緊張素II抑制劑、抗氧化劑或SARP-1。
SARP-1是一種對(duì)纖維變性疾病如硬皮病具有有益效果的蛋白質(zhì)(WO02/46225)。根據(jù)本發(fā)明，如WO02/46225中描述的SARP-1的片段、同種型、活性部分、融合蛋白或功能衍生物可與護(hù)骨素聯(lián)用。
所有治療可以同時(shí)、先后或分開使用。
含有一或多種上述物質(zhì)以及護(hù)骨素的藥物組合物在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
雖然目前還沒有治愈硬皮病的方法，但現(xiàn)正使用一些試劑或療法來(lái)治療硬皮病癥狀?？捎米鞅景l(fā)明組合治療的這樣一些抗硬皮病藥物，可參見本文引用的參考文獻(xiàn)Leighton(2001)或Wigley和Sule(2001)。
干擾素主要因其對(duì)病毒復(fù)制和細(xì)胞增殖有抑制作用而為人所認(rèn)知。例如，干擾素-γ在促進(jìn)免疫和炎癥反應(yīng)中起重要作用。據(jù)說(shuō)干擾素β(IFN-β，I型干擾素)有抗炎作用。
在本發(fā)明另一實(shí)施例中，護(hù)骨素與TNF拮抗劑結(jié)合使用。TNF拮抗劑以幾種方式發(fā)揮其活性。首先，拮抗劑能以足夠的親和力和特異性結(jié)合或封蔽TNF分子本身，以致部分或基本上中和了TNF表位或負(fù)責(zé)與TNF受體結(jié)合的表位(下文稱為“遮蔽性拮抗劑”)。例如，一種遮蔽性拮抗劑可以是針對(duì)TNF的抗體。
另一方面，TNF拮抗劑可抑制TNF結(jié)合后由細(xì)胞表面受體激活的TNF信號(hào)通道(下文稱為“信號(hào)拮抗劑”)。TNF拮抗劑易于鑒定并通過常規(guī)方法篩選評(píng)價(jià)，即在體外敏感細(xì)胞系，如TNF能引起其增殖和分泌免疫球蛋白的人B細(xì)胞中用候選拮抗劑對(duì)天然TNF活性的影響來(lái)評(píng)價(jià)。該試驗(yàn)包含不同稀釋度，例如，試驗(yàn)所用TNF摩爾量的0.1倍至100倍，的候選拮抗劑的TNF制劑，以及無(wú)TNF或只有拮抗劑的對(duì)照(Tucci等人，1992)。
封蔽拮抗劑是本發(fā)明優(yōu)選使用的TNF拮抗劑。在封蔽拮抗劑中，優(yōu)選使用那些以高親和力結(jié)合TNF并具有低免疫原性的多肽。特別優(yōu)選使用可溶性TNF受體分子和抗TNF的中和抗體。例如，可溶性形式TNF-R I(p55)和TNF-R II(p75)可用于本發(fā)明。這些平截型受體是本發(fā)明更優(yōu)選的拮抗劑，其包括受體的胞外結(jié)構(gòu)域或其功能部分，例如，EP914431敘述了平截型可溶性TNF-I型和TNF-II型受體。
平截型TNF受體是可溶的，在尿和血清中檢測(cè)到30kDa或40kDa的TNF抑制性結(jié)合蛋白，這兩種TNF抑制性結(jié)合蛋白分別稱為TBPI和TBPII(Engelmann等人，1990)。根據(jù)本發(fā)明，護(hù)骨素與TNF拮抗劑和/或干擾素可同時(shí)、先后或分開使用。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選TNF拮抗劑是TBPI和TBPII，與護(hù)骨素聯(lián)用。該受體分子的衍生物、片段、區(qū)段和生物活性部分，按功能裝配成本發(fā)明用的受體分子。受體分子的這種生物活性等價(jià)物或衍生物，指的是多肽部分或編碼該受體分子的序列部分，其大小足夠并能以親和力結(jié)合TNF，以致抑制或阻斷與膜結(jié)合的TNF受體的相互作用。
本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施例中，可溶性人TNF-RI(TBPI)是本發(fā)明用的TNF拮抗劑。歐洲專利EP308378、EP398327和EP433900描述了天然和重組的可溶性TNF受體分子及其生產(chǎn)方法。
雖然在疾病早期可能有利于阻斷TNF-α，在晚期也作過討論，但TNF自身對(duì)硬皮病具有有益的效果(Abraham等人，2000)。所以，本發(fā)明還涉及護(hù)骨素和TNF-α結(jié)合使用來(lái)治療或預(yù)防硬皮病，特別是進(jìn)展期疾病。本發(fā)明也可使用TNF-α或TNF-β。
本發(fā)明還涉及用于治療和/或預(yù)防纖維變性疾病，尤其是硬皮病，的藥物組合物，其含有護(hù)骨素，可任選地?fù)接信c一或多種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。該藥物組合物也包括上述任何其它成分，特別是干擾素、TBP或COX抑制劑。
本發(fā)明的藥物組合物還包括含有本發(fā)明核酸分子的載體或表達(dá)護(hù)骨素的細(xì)胞。
藥物組合物的活性成分，即本發(fā)明的多肽、核酸或細(xì)胞、或其組合以及以上提到的物質(zhì)組合，可以以各種方式給予個(gè)體。給藥途徑包括皮內(nèi)、透皮(例如在緩釋劑型中)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、口服、硬膜外、局部、和鼻內(nèi)的途徑?？梢允褂萌魏纹渌谥委熒嫌行У慕o藥途徑，例如通過上皮或內(nèi)皮組織的吸收或通過基因療法(其中編碼活性成分的DNA分子被施用于病人(如通過載體)，這導(dǎo)致了該活性成分在體內(nèi)表達(dá)和分泌。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可與其他一些生物活性物質(zhì)成分(例如藥學(xué)上可接受的表面活性劑、賦形劑、載體、稀釋劑和運(yùn)載體)一起施用。
“藥學(xué)上可接受的”的定義包括任何載體，其并不干擾活性成份的生物活性的有效性，并且給予后對(duì)宿主無(wú)毒性。例如，對(duì)腸胃外給藥而言，活性蛋白質(zhì)可在諸如鹽水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和Ringer氏溶液等載體中，配制成用于注射的單位劑型。
對(duì)于腸胃外給藥(如靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi))來(lái)說(shuō)，活性蛋白質(zhì)可以與藥學(xué)上可接受的腸胃外載體(例如水、鹽水、葡萄糖溶液)以及維持滲透壓(如甘露醇)或化學(xué)穩(wěn)定性(如防腐劑和緩沖劑)的添加劑一起配制成溶液、懸浮液、乳液或凍干粉末。制劑可用常用的技術(shù)進(jìn)行滅菌。
本發(fā)明的活性蛋白質(zhì)的生物利用度也可通過延長(zhǎng)分子在人體中半衰期的偶聯(lián)法加以改善，例如如PCT專利申請(qǐng)WO92/13095中所述的那樣，把分子連于聚乙二醇。
活性蛋白質(zhì)的治療有效量是一個(gè)有很多變量的函數(shù)，包括受體類型、本發(fā)明的物質(zhì)與其受體的親和力、受體顯示的任何殘余細(xì)胞毒活性、給藥途徑、患者的臨床狀況。
“治療有效量”是指給予時(shí)，本發(fā)明的物質(zhì)在體內(nèi)導(dǎo)致對(duì)疾病的發(fā)展或進(jìn)程具有有益的效果。給予于個(gè)體的劑量(作為單劑或多劑)可隨各種不同因素而變化，包括OPG的藥物動(dòng)力學(xué)特性、給藥途徑、患者癥狀和特征(性別、年齡、體重、健康狀況、體格)、病癥的程度、并行的治療、治療的頻率和所需的效果。對(duì)已建立的劑量范圍進(jìn)行調(diào)整和操作在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能之內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明，多肽的劑量為大約0.0001-100mg/kg或大約0.01-10mg/kg體重，或大約0.1-5mg/kg或大約1-3mg/kg體重。如上所述，這取決于很多治療判斷。本發(fā)明的藥物可以每日一次、每隔一日一次、或每星期三次。
每天的劑量通常分開幾次或通過持續(xù)釋放方式給予，以便有效地得到所需效果。第二次或隨后的給藥劑量可以與第一次或以前給予于個(gè)體的劑量相同、更小或更大。第二次或隨后的給藥可以在疾病發(fā)作之中或之前給予。
本發(fā)明還涉及一種治療和/或預(yù)防纖維變性疾病，尤其是硬皮病的方法，其包括把有效量的本發(fā)明的物質(zhì)給予有需要的患者，可任選地與藥學(xué)上可接受的載體一起給予。另外，按照本發(fā)明也可給予產(chǎn)生本發(fā)明護(hù)骨素或核酸分子的細(xì)胞，其可任選地包含在一表達(dá)載體中。
表達(dá)載體可全身性給予。較佳地，表達(dá)載體通過肌內(nèi)注射給予。另一優(yōu)選給藥途徑是吸入途徑，特別當(dāng)疾病涉及肺纖維變性時(shí)。另一種優(yōu)選給藥途徑是局部給予含有OPG序列的表達(dá)載體，或本發(fā)明的OPG多肽，特別當(dāng)累及皮膚時(shí)。
本發(fā)明還涉及一種藥物組合物的制備方法，其包括使有效量的護(hù)骨素與藥學(xué)上可接受的載體混合，以及涉及一種關(guān)節(jié)炎的治療和/或預(yù)防方法，其包括把有效抑制量的護(hù)骨素給予有需要的宿主。
所有在本文引用的文獻(xiàn)，包括期刊文章或摘要，公開或未公開的美國(guó)或外國(guó)的專利申請(qǐng)，授權(quán)的美國(guó)或外國(guó)的專利或任何其他文獻(xiàn)，通過在此引用而全部納入本文，包括所引用的文獻(xiàn)中所出現(xiàn)的所有的數(shù)據(jù)、表格、附圖和文本。此外，在本文所引用的文獻(xiàn)中所引用的全部文獻(xiàn)內(nèi)容，也通過在此引用而全部納入本文。
對(duì)已知方法步驟、常規(guī)方法步驟、已知方法或常規(guī)方法的引用，并非表示本發(fā)明的任何方面、描述或?qū)嵗言谙嚓P(guān)領(lǐng)域中被公開、教導(dǎo)或暗示。
前面對(duì)具體實(shí)例的描述對(duì)本發(fā)明的普遍本質(zhì)作了如此全面的披露，以致于其他人可以通過運(yùn)用本領(lǐng)域技能內(nèi)的知識(shí)(包括本文所引用的參考文獻(xiàn)的內(nèi)容)，在沒有過分試驗(yàn)的情況下，在不脫離本發(fā)明的總體概念的情況下，很容易地修改或變動(dòng)這些具體實(shí)例以便用于各種應(yīng)用。因此，基于本文所給的教導(dǎo)和指導(dǎo)，這些變動(dòng)和修改被認(rèn)為被包括在所公開的實(shí)施例的等價(jià)范疇內(nèi)。應(yīng)理解，本文的措詞或術(shù)語(yǔ)是為了描述而非用于限制，所以本說(shuō)明書的術(shù)語(yǔ)或措詞應(yīng)由熟練技術(shù)人員，根據(jù)本文所給的教導(dǎo)和指導(dǎo)并結(jié)合本技術(shù)領(lǐng)域一般技術(shù)人員的知識(shí)，作出解釋。
以上為對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的敘述，參照以下提供的實(shí)施例將會(huì)更容易理解本發(fā)明的內(nèi)容，但以下實(shí)施例是用于闡述而不意味著對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例方法病人樣品從9例年齡和性別相當(dāng)?shù)膹浡推つw全身性硬化癥患者的病變或非病變皮膚(通常是前臂皮膚)鉆取2立方毫米，進(jìn)行活組織檢查。所有患者都符合美國(guó)風(fēng)濕學(xué)會(huì)關(guān)于全身性硬化癥診斷的標(biāo)準(zhǔn)。
成纖維細(xì)胞培養(yǎng)如前所述(Abraham等人，1991)，通過體外培養(yǎng)，自活檢獲得成纖維細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，將活檢組織切片，置于滅菌塑料皿或塑料瓶中。室溫干燥15分鐘后，活檢切片附在組織培養(yǎng)塑料上，再在由DMEM組成的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(FGM)中培養(yǎng)，所述DMEM含有10％胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉、100單位/ml盤尼西林、100μg/ml鏈霉素、50μg/ml艮他霉素和2.5μg/ml兩性霉素B。在濕空氣和5％二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)2-3星期后，經(jīng)胰蛋白酶簡(jiǎn)單處理使成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)暈(outgrowth)脫離出來(lái)，再在不含艮他霉素和兩性霉素B的FGM中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)采用第2和5代之間的成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞表型通過他們?cè)趩螌雍腿S膠原凝膠培養(yǎng)基中的一般形態(tài)而加以確認(rèn)。
RNA的分離按照制造商的方案，用Trizol(Life Technologies)從早期傳代成片的硬皮病成纖維細(xì)胞中提取總RNA。最終的RNA沉淀重懸于經(jīng)滅菌DEPC處理過的水中，濃度為1μg/μl，儲(chǔ)存于-80℃。
cDNA探針合成取2μg總RNA與1.3μl細(xì)胞因子特異性引物(R&D Systems，cat.no.GAC11)混合，70℃下在0.5毫升微量離心管(eppendorf tube)內(nèi)培育2分鐘。再把離心管冷卻至50℃，保持2分鐘，然后，加入反應(yīng)混合物，該混合物含有2μl 5X反應(yīng)緩沖液(250mM Tris-HCl pH8.3、375mM氯化鉀和15mM氯化鎂)、1μl 10X dNTP混合物(5mM dGTP、5mM dCTP和5mM dTTP)、3.5μlα32P-dATP(3000Ci/mmol，Amersham，cat.no.PB10204)、0.5μl DTT(100mM)和1μl Superscript II逆轉(zhuǎn)錄酶(Life Technologies)。反應(yīng)混合物用吸管頭(pipetting)混勻一下，50℃培養(yǎng)25分鐘。加入含1mg/ml糖原的1μl 0.1M EDTApH8.0終止反應(yīng)。再按照制造商的使用說(shuō)明，用Chromaspin-200 DEPC-H2O層析柱(Clontech)從無(wú)摻入的脫氧核苷酸純化標(biāo)記cDNA。通過Czerenkov計(jì)數(shù)鑒定含有cDNA的餾分。70℃下峰值餾分(通常為收集的全部6個(gè)餾分中第2個(gè)餾分)用含1mM EDTA的0.1倍體積1M氫氧化鈉處理20分鐘，使RNA水解，70℃下再以等體積含2.5μg人Col-1 DNA(Life Technologies)的1M磷酸二氫鈉中和20分鐘。加熱處理中和后的cDNA探針，再將其直接加入到雜交混合物中。
與基因過濾微陣列雜交將含0.5μg/ml鮭魚精DNA(Life Technologies)的5ml表達(dá)雜交液(ExpressHybridization solution)(Clontech)裝在轉(zhuǎn)動(dòng)瓶中，轉(zhuǎn)動(dòng)瓶置于Hybaid雜交烘箱(MWG Biotech)，68℃使基因過濾微陣列(人細(xì)胞因子表達(dá)陣列，R&DSystems，cat.no.GA001)在此表達(dá)雜交液中預(yù)雜交2小時(shí)。之后，預(yù)雜交液被新鮮雜交液所置換，所述新鮮雜交液含有比活性為0.25至1×106cpm/ml的cDNA探針制劑。68℃雜交16-20小時(shí)。雜交后，68℃過濾器用2X SSC/1％SDS洗4次，每次20分鐘，用0.1X SSC/0.5％SDS洗2次，每次15分鐘。然后，將過濾器密封在Saran wrapTM中，室溫暴露于K型成像磷感屏(Biorad)不同的時(shí)間(4小時(shí)到4天)。
影像分析成像磷感屏用Biorad的個(gè)人FX磷光影像分析儀掃描，分辨率為50μm。將所得的16位數(shù)字文件轉(zhuǎn)為可用Arrayvision軟件(Imaging Research Inc.)分析的TIF格式和影像。我們測(cè)量每個(gè)樣品滴在過濾器上兩斑點(diǎn)的384基因的像素密度。減去背景信號(hào)，得到陣列中每對(duì)斑點(diǎn)的平均像素密度(相等于表達(dá)水平)。
通過RT-PCR技術(shù)確認(rèn)選定基因的微陣列結(jié)果每個(gè)病人樣品各取1μg總RNA，用寡脫氧胸苷酸(oligo dT)引物(Promega)使總RNA在20μl反應(yīng)體積中逆轉(zhuǎn)錄，該反應(yīng)體積含5mM氯化鎂、10mMTris-HCl、50mM氯化鉀、0.1％Trition X-100、dATP、dGTP、dCTP和dTTP各1mM、0.5單位重組的RNasin核糖核酸酶抑制劑(Promega)及15單位AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)。反應(yīng)混合物在42℃培養(yǎng)60分鐘，95℃加熱5分鐘，再用無(wú)菌水稀釋至200μl。用特異性引物對(duì)使逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)稀釋液在Taqman(PEApplied Biosystem 7700)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR分析，所用的特異性引物對(duì)是根據(jù)基因過濾制造商提供的數(shù)據(jù)庫(kù)查詢號(hào)護(hù)骨素-112F 5’CTG CGC GCT CGTGTT TCT(SEQ ID NO5)和護(hù)骨素-185R 5’AAT GAA GGT ACT TTG GAGGAA ACG(SEQ ID NO6)，運(yùn)用Primer Express軟件(PE Applied Biosystems)針對(duì)護(hù)骨素而設(shè)計(jì)。將所得結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為每個(gè)樣品中管家基因甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的表達(dá)，并以折迭變化來(lái)表示，由異常病人樣品的表達(dá)值除以該患者相應(yīng)的正常樣品的表達(dá)值來(lái)確定。
人護(hù)骨素全cDNA編碼序列的克隆基于EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)已有的cDNA序列(查詢號(hào)U94332)，用下列引物通過逆轉(zhuǎn)錄酶PCR在含0.3mM dNTPs、1mM硫酸鎂、5μl正常人的真皮(包皮)成纖維細(xì)胞cDNA模板(用上述方法制備)、5μl 10X Pfx擴(kuò)增緩沖液(LifeTechnologies)和1μl鉑Pfx DNA聚合酶(Life Technologies)的50μl反應(yīng)混合物中克隆OPG的全長(zhǎng)cDNA編碼序列OPG F(正向)5’CGG GAT CCGCCACCA TGA ACA AGT TGC TGT GCT(SEQ ID NO7)和OPG R(反向)5’AAGCTC GAG TTA TAA GCA GCT TAT TTT各50pmole。94℃反應(yīng)混合物加熱2分鐘，再按下列條件進(jìn)行35次PCR94℃15秒，55℃30秒和68℃1分鐘。用1X TAE緩沖液中的1％瓊脂糖凝膠(Life Technologies)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物作分析。用Wizard PCR純化試劑盒(Promega)從凝膠中純化預(yù)測(cè)的分子量(1205bp)遷移的PCR產(chǎn)物。
取100ng凝膠純化的DNA，按照制造商的條件以限制酶BamHI和XhoI(Pharmacia)消化，按上述方法再次純化，并按照標(biāo)準(zhǔn)分子生物技術(shù)用T4 DNA連接酶(New England Biolabs)與用BamHI/XhoI消化的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)(Invitrogen)連接。用Biorad基因脈沖儀(Biorad Gene Pulser)通過電穿孔使連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)到大腸桿菌株TOP 10F’(Invitrogen)中。從所得克隆生長(zhǎng)而成的5ml培養(yǎng)基分離質(zhì)粒DNA，并用T7和pcDNA3.1AS引物(Invitrogen)在AppliedBiosystems 3700測(cè)序儀中進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序分析以確定OPG的序列。
檢測(cè)從病變和正常真皮成纖維細(xì)胞中分離的蛋白質(zhì)提取物中的護(hù)骨素按照上述方法培養(yǎng)硬皮病患者和對(duì)照受試者的低代細(xì)胞病變和正常成纖維細(xì)胞，通過含1mM EDTA的PBS在37℃處理細(xì)胞單層5分鐘，以收獲所述成纖維細(xì)胞。離心回收分離出來(lái)的細(xì)胞并重懸于50μl PBS中，用50μl樣品緩沖液(20％SDS、0.2％溴苯酚藍(lán)、50％甘油、1M Tris pH6.8)處理，-80℃冷凍，然后解凍。根據(jù)制造商的方案，用BCA試劑盒(Pierce)測(cè)定蛋白質(zhì)內(nèi)容物。取約10μg蛋白質(zhì)用0.1倍體積DTT(0.1M)處理，根據(jù)制造商的使用說(shuō)明在4-12％SDS聚丙烯酰胺凝膠(Novex)上運(yùn)行。再利用Novex wetblot裝置(30V，1小時(shí))將蛋白質(zhì)帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。4℃將纖維素膜在含5％脫脂奶粉的PBS中封閉過夜，再用PBST沖洗。這些膜與0.5μg/ml一級(jí)抗體(R&D systems，抗OPG單克隆抗體，cat no.MAB8051)在PBST/1％BSA中室溫?fù)u動(dòng)培養(yǎng)1小時(shí)。然后，先用PBST徹底沖洗膜，再與稀釋1/3000的二級(jí)抗體(抗小鼠辣根過氧化物酶，Sigma)在PBST/1％BSA中培養(yǎng)。最后，在研究和觀察之前，用ECL試劑和HyperfilmTM(Amersham)徹底沖洗膜。
用ELISA測(cè)定經(jīng)重組OPG處理的或經(jīng)過OPG/pcDNA3.1載體轉(zhuǎn)染后的成纖維細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的I型膠原參照Shi-wen等人(Shi-Wen等人，1997)所述，用捕獲ELISA系統(tǒng)在體外測(cè)定培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞中的膠原合成。簡(jiǎn)言之，使AG1518人真皮成纖維細(xì)胞(購(gòu)自ATCC)保持在含5％FCS和2mM谷氨酰胺的DMEM(LifeTechnologies)中。通過胰蛋白酶化作用收獲細(xì)胞，以70％鋪滿率接種在48孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Falcon)內(nèi)含5％血清的培養(yǎng)基中，8小時(shí)后轉(zhuǎn)移到不含血清的培養(yǎng)基中。經(jīng)過24小時(shí)后，除去培養(yǎng)基并換上含50μM L-抗壞血酸鹽(Wako PureChemical Industries)和濃度遞增的人重組護(hù)骨素(OPG-Fc，購(gòu)自R&D systems)且不含血清的新鮮培養(yǎng)基。16小時(shí)后，在培養(yǎng)基中加入TGFβ1(PeproTech)至終濃度為2ng/ml，再經(jīng)過24小時(shí)后，回收培養(yǎng)基，離心除去殘留細(xì)胞，稀釋，按下文所述的方法進(jìn)行ELISA試驗(yàn)測(cè)定I型膠原。
膠原合成的測(cè)定也可在與OPG cDNA(pcDNA3.1-OPG)轉(zhuǎn)染后的原代人成纖維細(xì)胞(OBHC細(xì)胞)中進(jìn)行或在以下的模擬轉(zhuǎn)染試驗(yàn)(僅有pcDNA3.1載體)中進(jìn)行通過胰蛋白酶化作用收獲OBHC細(xì)胞并以50％鋪滿率接種在48孔板內(nèi)的完全培養(yǎng)基中。按照制造商的使用說(shuō)明，用Fugene V轉(zhuǎn)染試劑(Roche)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到OBHC細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后5小時(shí)，用含有L抗壞血酸鹽且不含血清的新鮮培養(yǎng)基置換原有培養(yǎng)基，過夜，然后按以上所述的方法用TGFβ1(10ng/ml)處理24小時(shí)。
4℃，用在PBS(pH7.4)中的5μg/ml山羊抗人I型膠原(SouthernBiotechnology Associates.Inc.)包被MaxiSorp板(Nunc)，過夜。然后清除抗體溶液，板在室溫下用PBS-1％BSA封閉1小時(shí)，再用PBS/0.05％Tween 20(PBST)洗4次。取三份100μl條件培養(yǎng)基樣品進(jìn)行測(cè)試。此樣品室溫培養(yǎng)2小時(shí)，再用PBST洗4次。室溫下使樣品與稀釋1∶2000的生物素化山羊抗人I型膠原抗體(Southern Biotechnology Associates.Inc.)培養(yǎng)1小時(shí)，再用PBST洗4次。然后，在室溫下再使樣品與稀釋1∶4000的與HRP-鏈霉抗生物素偶合的抗體(Zymed)搖動(dòng)培養(yǎng)1小時(shí)。最后，樣品用PBST洗4次。加入OPD基質(zhì)(Sigma cat.no.P9187)，靜置10分鐘，出現(xiàn)顏色。加入20％H2SO4mix終止反應(yīng)，板在496nm處讀數(shù)(Victor2多標(biāo)記計(jì)數(shù)器(Victor2multilabel counter，Wallac)。運(yùn)用Molecular Probes的CyQuant細(xì)胞增殖分析試劑盒(C-7026)使得到的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化為細(xì)胞數(shù)。
CTGF-SEAP啟動(dòng)子分析以寡核苷酸5’-ATCTCGAGGGCCACTCGTCCCTTGTCC(SEQ ID NO9)和5’-ATAAGCTTGGAGTCGCACTGGCTGTCTCC(SEQ ID NO10)進(jìn)行PCR擴(kuò)增人CTGF(結(jié)締組織生長(zhǎng)因子)基因報(bào)導(dǎo)子區(qū)(788bp)，從而構(gòu)建CTGF-SEAP啟動(dòng)子-報(bào)導(dǎo)基因質(zhì)粒。將經(jīng)過凝膠純化的擴(kuò)增產(chǎn)物亞克隆到pSEAP2-基質(zhì)(basic)(Clontech)。
將NIH 3T3成纖維細(xì)胞(ATCC)接種在T-75燒瓶中，與5μg CTGF-SEAP和1μg pcDNA3.1(Invitrogen)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。就800μg/ml G418(Sigma)選擇細(xì)胞。
建立與CTGF-SEAP啟動(dòng)子-報(bào)導(dǎo)基因穩(wěn)定整合的克隆，并分析克隆，選擇最敏感的一個(gè)克隆作基于細(xì)胞的試驗(yàn)研究。
將此克隆的細(xì)胞(CTGF-SEAP)以每孔10,000個(gè)細(xì)胞接種在96孔板內(nèi)含0.5％FCS的DMEM中。第二日，加入新鮮培養(yǎng)基并且在不加入或加入不同濃度的TGFβ和OPG(護(hù)骨素)的情況下使細(xì)胞培養(yǎng)多72小時(shí)，然后收集上清液作SEAP試驗(yàn)。
按照制造商的方案(Clontech kit)測(cè)定SEAP表達(dá)。
體外研究第1日通過氣管內(nèi)給予在生理鹽水中的博來(lái)霉素(0.075IU)來(lái)誘導(dǎo)雄性小鼠肺纖維變性。將小鼠分為不同的3組，每組10只動(dòng)物。第1組每日接受皮下注射5mg/kg OPG(在生理鹽水中)。第2組每日接受皮下注射0.5mg/kgOPG。第3組每日接受皮下注射生理鹽水。第4組包括年齡和性別相當(dāng)?shù)奈唇?jīng)處理的幼鼠。每日測(cè)量體重，第12日處死全部小鼠。分離出各個(gè)肺葉測(cè)定羥基脯氨酸(Smith等人，1994)，或者肺葉經(jīng)福爾馬林固定，以石蠟包埋，用于組織學(xué)研究。肺解剖面的膠原染tri-chrome或苦天狼星紅(Bancroft andStevens)，為每個(gè)肺的纖維變性程度計(jì)分。
在體外經(jīng)鹵夫酮處理的硬皮病患者的成纖維細(xì)胞中OPG mRNA的半定量逆轉(zhuǎn)錄酶PCR分析按上述方法，使病變和非病變成纖維素細(xì)胞保持在培養(yǎng)基中。細(xì)胞單層(鋪滿70％)用鹵夫酮(10-8M)(Collgard Pharmaceuticals)處理12小時(shí)。過了處理期后，收獲細(xì)胞，運(yùn)用Trizol方法分離總RNA。取1μg總RNA，按上述方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶PCR，采用對(duì)護(hù)骨素特異的PCR引物(OPG 740 F 5’ACGCCT AAC TGG CTT AGT GT(SEQ ID NO11)和OPG 1280R 5’CTG ATTGGA CCT GGT TAC CT SEQ ID NO12)。經(jīng)過30次PCR之后，反應(yīng)產(chǎn)物在染有溴化乙錠的1％瓊脂糖凝膠上運(yùn)行，拍照，用Kodak 1D數(shù)字科學(xué)軟件分析。通過對(duì)凝膠提取的DNA作直接測(cè)序，證實(shí)以預(yù)測(cè)分子量遷移的PCR產(chǎn)物為護(hù)骨素。作為基因組DNA污染的對(duì)照，對(duì)含有合適的RNA但無(wú)逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR反應(yīng)。用對(duì)GAPDH特異的PCR引物擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)作為陽(yáng)性對(duì)照，分析初始反應(yīng)中輸入RNA的完整性和數(shù)量。
I型膠原α2啟動(dòng)子活性使小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(πS3細(xì)胞)保持在含2％FCS和2mM谷氨酰胺的DMEM-F12培養(yǎng)基中。通過胰蛋白酶化作用收獲細(xì)胞，以50％鋪滿率接種在48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。第2日，按照制造商的使用說(shuō)明，以Fugene V試劑(Roche)將細(xì)胞與含有連接于螢光素酶cDNA(英國(guó)倫敦Royal Free Hospital的Dr.David Abraham提供)的3.5kb膠原1α2啟動(dòng)子的pGL3載體(Promega)在不含血清的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染。經(jīng)過5小時(shí)轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含2％FCS的新鮮培養(yǎng)基中，并在0、1、10或100ng/ml重組人護(hù)骨素存在下單獨(dú)用鹵夫酮(HF)(10-10M)，單獨(dú)用TGFβ1(5ng/ml)或者HF(10-8M)+TGFβ1(5ng/ml)處理12小時(shí)。過了處理期后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有2％FCS和2mM谷氨酰胺的完全培養(yǎng)基中，48小時(shí)后，運(yùn)用購(gòu)自Promega的Bright-Glo檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定每孔螢光素酶的活性。得到的結(jié)果表示為相對(duì)發(fā)光單位并標(biāo)準(zhǔn)化用Cyquant試劑盒(Molecular Probes)在平行實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的每孔含有的細(xì)胞數(shù)。
實(shí)施例1病變成纖維細(xì)胞的護(hù)骨素mRNA相對(duì)于非病變成纖維細(xì)胞明顯下調(diào)對(duì)6例硬皮病患者的正常和異常成纖維細(xì)胞樣品進(jìn)行基因過濾微陣列分析。護(hù)骨素(OPG)的平均表達(dá)水平示于圖1a，每例患者的數(shù)值示于圖1b。
得到的微陣列結(jié)果通過對(duì)9例患者分離出的RNA樣品作實(shí)時(shí)PCR分析(使用對(duì)OGP特異的PCR引物)以進(jìn)一步確認(rèn)。結(jié)果示于圖2，表示為表達(dá)水平的折疊變化(病變除以非病變)。在測(cè)試的9例患者中有7例的病變成纖維細(xì)胞中OPG與同一患者的非病變成纖維細(xì)胞相比下調(diào)至少2倍。
同一例患者的非病變與病變成纖維細(xì)胞之間所看到的表達(dá)差異可能是兩組群體之間培養(yǎng)條件之差別引致，因?yàn)檎Ｈ苏嫫こ衫w維細(xì)胞的原代培養(yǎng)基的OPG mRNA表達(dá)不會(huì)顯著改變細(xì)胞傳代(數(shù)據(jù)未示出)。另外，對(duì)硬皮病患者異常皮膚的整個(gè)活檢樣品的總RNA作實(shí)時(shí)RT-PCR分析，結(jié)果顯示其護(hù)骨素mRNA相對(duì)于從同一患者臨床正常的解剖位置相匹配的皮膚低(圖3)。
實(shí)施例2 從蛋白質(zhì)水平上看硬皮病患者的病變成纖維細(xì)胞的護(hù)骨素相對(duì)于非病變成纖維細(xì)胞下調(diào)為了確定護(hù)骨素mRNA是否反映護(hù)骨素的改變，利用抗人護(hù)骨素單克隆抗體通過Western印跡分析測(cè)定了年齡和性別相當(dāng)?shù)氖茉囌咧薪馄饰恢孟嗥ヅ涞恼Ｆつw成纖維細(xì)胞與病變皮膚成纖維細(xì)胞的OPG含量。結(jié)果示于圖4。在3/4正常成纖維細(xì)胞中可清楚地檢測(cè)到護(hù)骨素單體和二聚體，只有一個(gè)正常樣品中顯示較弱表達(dá)。而對(duì)異常成纖維細(xì)胞，全部4個(gè)測(cè)試樣品都依稀看到一條單體帶。以重組表達(dá)的OPG-Fc融合蛋白作為染色的陽(yáng)性對(duì)照。
實(shí)施例3人OPG的克隆為了對(duì)OPG的體內(nèi)外活性作特性分析，通過逆轉(zhuǎn)錄酶PCR克隆全cDNA編碼序列，所用的引物基于已公開的OPG序列，其位于預(yù)測(cè)的啟動(dòng)密碼子和終止密碼子的側(cè)邊。對(duì)所得OPG cDNA克隆(在pcDNA3.1中)作序列分析，結(jié)果顯示與Morinaga等人，(Morianga等人，1998)公開的OPG核苷酸序列有100％同一性，但與Simonet等人(1997)公開的序列相差一個(gè)氨基酸(參見SEQ ID NO2和4)。
實(shí)施例4人真皮成纖維細(xì)胞系內(nèi)OPG I型膠原合成的影響在L-抗壞血酸鹽存在下培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞分泌膠原進(jìn)入培養(yǎng)基中，以致可運(yùn)用ELISA測(cè)定膠原。人成纖維細(xì)胞通過上調(diào)膠原合成來(lái)應(yīng)答促纖維變性細(xì)胞因子TGFβ1的刺激。因此，我們測(cè)試了重組護(hù)骨素(護(hù)骨素-Fc融合蛋白)對(duì)AG1518C成纖維細(xì)胞內(nèi)TGFβ1誘導(dǎo)的膠原合成的影響。開始TGFβ1處理之前在成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基中加入護(hù)骨素，其能夠以劑量依賴方式抑制TGFβ1介導(dǎo)的膠原合成的增加(圖5)。當(dāng)在中和抗OPG單克隆抗體存在下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)膠原合成無(wú)影響。類似地，在重組OPG不存在下僅給予抗OPG也不影響膠原合成，提示所看到的膠原合成的減少是OPG的特有作用。
在原代人成纖維細(xì)胞(OBHC)與含有OPG全長(zhǎng)編碼序列的質(zhì)粒(pcDNA3.1/OPG)轉(zhuǎn)染后也觀察到對(duì)膠原合成的類似作用。在與OPG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的OBHC中，無(wú)發(fā)現(xiàn)增加膠原合成來(lái)應(yīng)答TGFβ1刺激的現(xiàn)象，與模擬(pcDNA3.1空載體)轉(zhuǎn)染的OBHC相反(圖6)。
實(shí)施例5OPG處理使小鼠胚胎成纖維細(xì)胞內(nèi)I型膠原α2啟動(dòng)子的基礎(chǔ)活性和TGFβ1誘導(dǎo)的活性大大降低為了評(píng)估OPG使膠原合成減少是否是由于對(duì)膠原啟動(dòng)子活性的作用所引起的，我們?cè)贗型膠原α2啟動(dòng)子的3.5kb區(qū)調(diào)控下檢查了OPG處理對(duì)已經(jīng)與含有報(bào)導(dǎo)基因cDNA、螢光素酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的影響。膠原啟動(dòng)子對(duì)此構(gòu)造體的刺激導(dǎo)致螢光素酶基因的轉(zhuǎn)錄激活，而螢光素酶基因的活性可在其基質(zhì)螢火蟲螢光素存在下通過發(fā)光分析法測(cè)定。
用1ng/ml到100ng/ml OPG處理，能明顯降低膠原啟動(dòng)子活性的基礎(chǔ)水平(圖7A，對(duì)照)。受到TGFβ1刺激之后，膠原啟動(dòng)子活性至少增大2倍(圖7A，TGFβ1)。當(dāng)同時(shí)用100ng/ml OPG處理細(xì)胞，膠原啟動(dòng)子活性顯著下降(P＜0.05)。
據(jù)報(bào)導(dǎo)，植物生物堿鹵夫酮是I型膠原合成的特異性抑制劑(Granot等人，1993)。當(dāng)成纖維細(xì)胞用低濃度的鹵夫酮(10-10M)處理時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)膠原啟動(dòng)子活性隨著護(hù)骨素濃度增大(從1ng/ml到100ng/ml)而劑量依賴性地降低，測(cè)試的OPG劑量最高，這種降低非常明顯(100ng/ml，P＜0.01)(圖7A，HF)。鹵夫酮能夠抑制TGFβ1誘導(dǎo)的膠原啟動(dòng)子活性(McGaha等人2002)。OPG還能夠通過劑量依賴方式抑制TGFβ1誘導(dǎo)的膠原啟動(dòng)子活性增加來(lái)加強(qiáng)鹵夫酮的作用。這種作用在100ng/ml OPG時(shí)尤為明顯(P＜0.01)，該濃度下膠原啟動(dòng)子的活性幾乎恢復(fù)至基礎(chǔ)水平(圖7，HF+TGFβ1)。
實(shí)施例6TGFβ介導(dǎo)的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子反式激活為OPG所削弱結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)是一個(gè)38-kD富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，它刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生胞外基質(zhì)元件。據(jù)報(bào)，在很多纖維變性人組織中都發(fā)現(xiàn)CTGF過度表達(dá)，包括肺、皮膚、肝、腎和血管。TGFβ在體外激活人肺成纖維細(xì)胞的CTGF基因轉(zhuǎn)錄。用分泌型堿性磷酸酶(SEAP)構(gòu)建一個(gè)CTGF啟動(dòng)子-報(bào)導(dǎo)基因作為報(bào)導(dǎo)基因，其表達(dá)可在條件培養(yǎng)基而不是在細(xì)胞提取物中測(cè)定。
細(xì)胞表達(dá)使CTGF-SEAP報(bào)導(dǎo)基因與TGFβ和0.46、1.4或4.6μg/ml OPG一起培養(yǎng)。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖7B。與OPG一起培養(yǎng)抑制了TGFβ誘導(dǎo)的CTGF表達(dá)，這進(jìn)一步表示OPG的抗纖維變性活性。
實(shí)施例7經(jīng)鹵夫酮處理的硬皮病患者成纖維細(xì)胞中OPG mRNA的表達(dá)鹵夫酮能夠使成纖維細(xì)胞內(nèi)膠原合成下調(diào)的機(jī)制尚未有完整的闡述。因此，我們通過逆轉(zhuǎn)錄酶PCR檢查了鹵夫酮對(duì)成對(duì)硬皮病患者病變和非病變成纖維細(xì)胞中OPG mRNA的表達(dá)的影響。
在10-8M鹵夫酮處理后12小時(shí)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)全部測(cè)試樣品(3個(gè)正常，2個(gè)異常)的病變和非病變成纖維細(xì)胞的OPG mRNA表達(dá)都有上調(diào)(至少3倍)(圖8)。令人感興趣的是，在基因過濾微陣列分析實(shí)驗(yàn)中，OPG是用鹵夫酮處理成纖維細(xì)胞后上調(diào)最大的其中一個(gè)基因(數(shù)據(jù)未示出)。
實(shí)施例8體內(nèi)給予OPG防止博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維變性給予C57BL/6小鼠單次氣管內(nèi)注射博來(lái)霉素，結(jié)果在14日內(nèi)快速誘導(dǎo)肺纖維變性，表現(xiàn)為肺間質(zhì)內(nèi)膠原沉積增多(Hattori等人，2000)。為了測(cè)定給予OPG是否可能免于發(fā)展為纖維變性或確實(shí)能減緩疾病嚴(yán)重性，我們測(cè)試了每日注射OPG對(duì)博來(lái)霉素處理小鼠的影響。
給各有10只小鼠的3組動(dòng)物單次氣管內(nèi)滴注博來(lái)霉素。給予博來(lái)霉素后第一日開始皮下注射OPG。第一組接受高劑量(5mg/kg)，第二組接受低劑(0.5mg/kg)。對(duì)照小鼠接受每日皮下注射生理鹽水。作為比較，研究還包括第4組小鼠，它們完全未經(jīng)過處理且年齡和性別相匹配(幼鼠)。
用博來(lái)霉素處理后動(dòng)物立即生病。這引起體重快速下降并可導(dǎo)致死亡，此情形與未經(jīng)處理的動(dòng)物(它們的健康狀況保持良好，體重維持正常)相反(圖9A)。以低劑量OPG處理的小鼠體重下降的程度與對(duì)照小鼠相當(dāng)。此組動(dòng)物的死亡率似乎也較高(圖9B)。接受高劑量OPG處理的小鼠恢復(fù)情況則好得多，它們的體重只在治療最初5日下降。這也反映在此組動(dòng)物的死亡率較低(＜10％)。
在給予博來(lái)霉素后第12日，處死所有存活小鼠。肺的組織學(xué)分析揭示與對(duì)照動(dòng)物的纖維變性病變涵蓋約70％肺表面積相比，高劑量OPG處理的動(dòng)物受纖維變性影響的肺表面積大大減少(圖10A)。高劑量OPG處理的小鼠的肺相對(duì)于對(duì)照小鼠具有大大減少的羥基脯氨酸含量(P＜0.05)，與未經(jīng)博來(lái)霉素處理的小鼠相當(dāng)(幼鼠組，圖10B))。在低劑量OPG處理的小鼠中也觀察到羥基脯氨酸含量降低，雖然因?yàn)榇私M的存活小鼠數(shù)目太少未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。羥基脯氨酸含量是衡量膠原沉積的一個(gè)參數(shù)。此處結(jié)果表示OPG處理能有效地減少肺的膠原沉積。
參考文獻(xiàn)1.Abraham D.，Lupoli S.，McWhirter A.，Plater-Zyberk C.，Piela T.H.，Korn J.H.，OlsenI.and Black C.(1991)Expression and function of surface antigens on sclerodermafibroblasts.Arthritis Rheum.34，1164-1172.
2.Abraham DJ，Shiwen X，Black CM，Sa S，Xu Y，Leask A.J Biol Chem.2000 May19；275(20)15220-5.
3.Altschul S Fet al.，J Mol Biol，215，403-410，19904.Altschul S Fet al.，Nucleic Acids Res.，25389-3402，19975.Bancroft J.D.and Stevens A.Theory and Practice of Histological Techniques.Churchill Livingstone，England.
6.Black C.M and Denton C.P.(1998)Systemic sclerosis and related disorders.In“Oxford textbook of Rheumatology”(P.G.Maddison，D.A.Isenberg，P.Woo and D.N.Glass，Eds.)pp 771-789，Oxford Univ.Press，New York.
7.Clements P.J.and Furst D.E.(1996)“Systemic Sclerosis”Williama and Williams，Baltimore.
8.Devereux Jet al.，Nucleic Acids Res，12，387-395，1984.
9.Engelmann，H.，Novick，D.，and Wallach，D.，1990，J.Biol.Chem.265，1531-1536.
10.Granot I，Halevy O，Hurwitz S，Pines M.(1993)Halofuginonean inhibitor ofcollagen type I synthesis.Biochim Biophys Acta 1156，107-11211.Grantham(1974)，Science，185.862-864.
12.Hattori N.，Degen J.L.，Sisson T.H.，Liu H.，Moore B.B.，Pandrangi R.G.，Simon R.H.and Dfew A.F.(2000)Bleomycin induced pulmonary fibrosis in fibrinogen null mice.J.Clin.Invest.106，1341-13513.Kostenuik PJ，Shalhoub V.Curr Pharm Des 2001 May；7(8)613-3514.Krein，PM，Huang Y amd Winston BW(2001).Expert Opin.Ther.Patents 11(7)1065-1079.
15.Leighton，C.Drugs 2001 61(3)，419-427.
16.LeRoy E.C.(1974)Increased collagen synthesis by scleroderma skin fibroblasts invitro.J.Clin.Invest.54，880-889.
17.Martini，Maccario，Ravelliet al.，Arthritis Rheum.1999，42，807-811.
18.McGaha TL，Phelps RG，Spiera H，Bona C.(2002)Halofuginone，an Inhibitor ofType-I Collagen Synthesis and Skin Sclerosis，Blocks Transforming-Growth-Factor-beta-Mediated Smad3 Activation in Fibroblasts.J Invest Dermatol.118，461-70.
19.Min H.，Morony S.，Sarosi I.，Dunstan C.R.，Capparelli C.et al.(2000)Osteoprotegerin reverses osteoporosis by inhibiting endosteal osteoclasts andprevents vascular calcification by blocking a process resembling osteoclastogenesis.J.Exp.Med.192，463-474.
20.Morinaga T.，Nagakawa N.，Yasuda H.，Tsuda E.and Higashi K.(1998)Cloning andcharacterization of the gene encoding human osteoprotegerin/osteoclastogenesisinhibitory factor.Eur.J.Biochem.254，685-691.
21.Pearson W R，Methods in Enzymology，183，63-99，199022.Pearson W R and Lipman D J，Proc Nat Acad Sci USA，85，2444-2448，198823.Silman A.J.(1991)Moratlity from scleroderma in England and Wales 1968-1975.Ann.Rheu.Dis.50，95-96.
24.Simonet W.S.，Lacey D..，Dunstan C.R.，Kelley M.，et al.(1997)Osteoprotegerinanovel secreted protein involved in the regulation of bone densit y.Cell 89，309-319.
25.Shi-wen X.，Denton C.P.，McWhirter A.，Bou-Gharios G.，Abraham D.J.，du BoisR.M.and Black C.M.(1997)Scleroderma lung fibroblasts exhibit elevated anddysregulated collagen type I biosynthesis.Arthritis Rheum.40，1237-1244.
26.Shi-Wen X，Denton CP，McWhirter A，Bou-Gharios G，Abraham DJ，du Bois RM，Black CM.(1997)Scleroderma lung fibroblasts exhibit elevated and dvsregulatedtype I collagen biosynthesis.Arthritis Rheum.40，1237-124427.Smith and Waterman J Mol Biol，147，195-197，1981，Advances in AppliedMathematics，2，482-489，1981.
28.Smith R.E.，Strieter R.M.，Phan S.H.，Lukacs N.W.，Huffnagle G.B.，Wilke C.A.，Burdick M.D.，Lincoln P.，Evanoff H.and Kunkel S.L.(1994)Production andfunction of murine macrophage inflammatory protein-1αin bleomycin induced lunginjury.J.Immunol.153，4704.
29.Smith，Textbook of the Autoimmune Diseases，Edited by Lahita，Chiorazzi andReeves，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia 2000.
30.Strehlow D.and Korn J(1998)Biology of the scleroderma fibroblast.Curr Opin.Rheumatol.10，572-578.
31.Tucci，A.，James，H.，Chicheportiche，R.，Bonnefoy，J.Y.，Dayer，J.M.，and Zubler，R.H.，1992，J.Immunol.148，2778-2784.
32.Von Heijne G.(1986)Nucleic Acids Res.14，4683-4690.
33.Wigley F.M.and Sule S.D.(2001)Expert Opinions on Investigational Drugs 10(1)31-48.
34.Wigley F.M.and Boling C.L.(2000)The treatment of scleroderma.2，276-292.
35.Wilm M.，Shevchenko A.，Houthaeve T.，Breit S.，Schweigerer L.，F(xiàn)otsis T.andMann M.(1996)Femtomole sequencing of proteins from polyacrylamide gels bynano-electrospray mass spectrometry.Nature，379466-469.
36.Yasuda H.，Shima N.，Nagakawa N.，Mochizuki S.，Yano K.et al.(1998)Identity ofosteoclastogenesisis inhibitory factor(OCIF)and osteoprotegerin(OPG)amechanism by which OPG/OCIF inhibits osteoclastogenesis in vitro.Endocrinology139，1329-1337.
序列表<110>應(yīng)用研究系統(tǒng)ARS股份公司(APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V.)<120>護(hù)骨素在治療和/或預(yù)防纖維變性疾病中的應(yīng)用<130>WO 550<150>EP02100364.5<151>2002-04-10<160>12<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>1681<212>DNA<213>智人<400>1ctggagacat ataacttgaa cacttggccc tgatggggaa gcagctctgc agggactttt 60tcagccatct gtaaacaatt tcagtggcaa cccgcgaact gtaatccatg aatgggacca120cactttacaa gtcatcaagt ctaacttcta gaccagggaa ttaatggggg agacagcgaa180ccctagagca aagtgccaaa cttctgtcga tagcttgagg ctagtggaaa gacctcgagg240aggctactcc agaagttcag cgcgtaggaa gctccgatac caatagccct ttgatgatgg300tggggttggt gaagggaaca gtgctccgca aggttatccc tgccccaggc agtccaattt360tcactctgca gattctctct ggctctaact accccagata acaaggagtg aatgcagaat420agcacgggct ttagggccaa tcagacatta gttagaaaaa ttcctactac atggtttatg480taaacttgaa gatgaatgat tgcgaactcc ccgaaaaggg ctcagacaat gccatgcata540
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<210>8<211>27<212>DNA<213>智人<400>8aagctcgagt tataagcagc ttatttt27<210>9<211>27<212>DNA<213>智人<400>9atctcgaggg ccactcgtcc cttgtcc27<210>10<211>29<212>DNA<213>智人<400>10ataagcttgg agtcgcactg gctgtctcc 29<210>11<211>20<212>DNA<213>智人<400>11acgcctaact ggcttagtgt20
<210>12<211>20<212>DNA<213>智人<400>12ctgattggac ctggttacct20
權(quán)利要求
1.一種物質(zhì)在制備治療和/或預(yù)防纖維變性疾病的藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述物質(zhì)選自以下組內(nèi)a)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的多肽；b)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的22到401氨基酸的多肽；c)含有1、2、3或4個(gè)護(hù)骨素富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的多肽；d)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的22到194氨基酸的多肽；e)(a)到(d)的任何一個(gè)突變蛋白，其中氨基酸序列與(a)到(d)中至少一個(gè)序列至少有40％或50％或60％或70％或80％或90％的同一性；f)(a)到(d)的任何一個(gè)突變蛋白，其中該突變蛋白是由在溫和嚴(yán)格條件或高度嚴(yán)格條件下能與編碼(a)到(d)任何一個(gè)突變蛋白的DNA序列的互補(bǔ)序列雜交的DNA序列編碼；g)(a)到(d)的任何一個(gè)突變蛋白，其中所述氨基酸序列的任何改變都是用保守性氨基酸取代(a)到(d)的氨基酸序列；h)(a)到(g)任何一個(gè)突變蛋白的鹽或同種型、融合蛋白、功能衍生物、活性片段或環(huán)形排列的衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述纖維變性疾病是一種結(jié)締組織病。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于所述纖維變性疾病是硬皮病。
4.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述物質(zhì)是單體或二聚體。
5.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述物質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)被糖基化。
6.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述融合蛋白包括免疫球蛋白(Ig)融合。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述Ig融合是Fc融合。
8.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述功能衍生物包括連于一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)的至少一個(gè)部分，而所述官能團(tuán)以氨基酸殘基的一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈的形式存在。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述部分是聚乙二醇部分。
10.一種核酸分子在制備治療和/或預(yù)防纖維變性疾病的藥物中的應(yīng)用，其中該核酸分子含有的核酸序列編碼具有以下氨基酸序列之一的多肽a)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的多肽；b)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的22到401氨基酸的多肽；c)含有1、2、3或4個(gè)護(hù)骨素富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的多肽；d)含有SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的22到194氨基酸的多肽；e)(a)到(d)的任何一個(gè)突變蛋白，其中氨基酸序列與(a)到(d)中至少一個(gè)序列至少有40％或50％或60％或70％或80％或90％的同一性；f)(a)到(d)的任何一個(gè)突變蛋白，其中該突變蛋白是由在溫和嚴(yán)格條件或高度嚴(yán)格條件下能與編碼(a)到(d)任何一個(gè)突變蛋白的DNA序列的互補(bǔ)序列雜交的DNA序列編碼；g)(a)到(d)的任何一個(gè)突變蛋白，其中所述氨基酸序列的任何改變都是用保守性氨基酸取代(a)到(d)的氨基酸序列；h)(a)到(g)任何一個(gè)突變蛋白的同種型、融合蛋白、或活性片段。
11.如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于所述纖維變性疾病是結(jié)締組織病。
12.如權(quán)利要求10或11所述的應(yīng)用，其特征在于所述纖維變性疾病是硬皮病。
13.如權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述核酸分子包括表達(dá)載體序列。
14.如權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其特征在于所述載體序列是基因治療載體序列。
15.一種能在細(xì)胞中誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)內(nèi)源性產(chǎn)生權(quán)利要求1所述多肽的載體在制備治療和/或預(yù)防纖維變性疾病尤其是硬皮病的藥物中的應(yīng)用。
16.一種含有權(quán)利要求10至15中任一項(xiàng)所述核酸分子的細(xì)胞在制備治療和/或預(yù)防纖維變性疾病尤其是硬皮病的藥物中的應(yīng)用。
17.一種表達(dá)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述物質(zhì)的細(xì)胞在制備治療和/或預(yù)防纖維變性疾病尤其是硬皮病的藥物中的應(yīng)用。
18.一種經(jīng)過基因改造產(chǎn)生權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述多肽的細(xì)胞在制備治療和/或預(yù)防纖維變性疾病尤其是硬皮病的藥物中的應(yīng)用。
19.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物還包括干擾素，可同時(shí)、先后或分開使用。
20.如權(quán)利要求19所述的應(yīng)用，其特征在于所述干擾素是干擾素β。
21.如上述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物還包括腫瘤壞死因子(TNF)拮抗劑，可同時(shí)、先后或分開使用。
22.如權(quán)利要求21所述的應(yīng)用，其特征在于所述TNF拮抗劑是TBPI和/或TBPII。
23.如上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物還包括抗硬皮病試劑，可同時(shí)、先后或分開使用。
24.如權(quán)利要求23所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗硬皮病試劑選自以下組內(nèi)鹵夫酮、ACE抑制劑、鈣離子通道阻斷劑、質(zhì)子泵抑制劑、非類固醇抗炎藥、COX抑制劑、皮質(zhì)類固醇、四環(huán)素、己酮可可堿、布西拉明、香葉基香葉基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、rotterlin、脯氨基-4-羥化酶抑制劑、c-蛋白酶抑制劑、賴氨基-氧化酶抑制劑、松弛素、鹵夫酮、前列腺素、前列環(huán)素、內(nèi)皮素-1、氧化氮、血管緊張素II抑制劑、抗氧化劑或SARP-1。
25.一種纖維變性疾病尤其是硬皮病的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于所述方法包括把有效量的權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的物質(zhì)，任選地和藥學(xué)上可接受的載體給予有需要的患者。
全文摘要
本發(fā)明涉及護(hù)骨素(osteoprotegerin)在治療和/或預(yù)防纖維變性疾病尤其是硬皮病中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1658895SQ03813308
公開日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2003年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月10日
發(fā)明者C·鮑爾, C·普拉特爾－齊貝克 申請(qǐng)人:應(yīng)用研究系統(tǒng)Ars股份公司