專利名稱：隱形脂質(zhì)納米膠囊,其制備方法,及其作為活性成分載體的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的目的涉及如下的納米膠囊，其作為活性成分的載體能夠用于實(shí)體癌性腫瘤或循環(huán)系統(tǒng)癌性腫瘤的治療，顯示出與溶液中游離藥物相比較減少的毒性，顯示出對(duì)其施加的宿主的免疫系統(tǒng)的隱形性質(zhì)，而且不僅有進(jìn)行外滲進(jìn)入腫瘤的能力，還有在其中釋放內(nèi)含物的能力。有利地，根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)新穎載體是脂質(zhì)納米膠囊的可注射膠質(zhì)懸浮體形式，該膠囊的表面上帶有結(jié)合了聚乙二醇分子的磷脂分子。
本發(fā)明還涉及合成這些隱形脂質(zhì)納米膠囊的方法，尤其是將載有聚乙二醇基團(tuán)的所述分子插入到預(yù)先形成的納米膠囊的脂質(zhì)膜的方法。最后，本發(fā)明同時(shí)涉及由所述載體能夠得到的應(yīng)用，該載體是用于通過血液傳輸活性成分，尤其是用于治療人類實(shí)體或循環(huán)系統(tǒng)腫瘤，還用于炎癥或其他任何觀察到的血管滲透性增加的病理情況(炎癥區(qū)域、傳染區(qū)域)的治療。
本發(fā)明還涉及多種含有根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊的藥物組合物。
首先，術(shù)語“載體”用于表示，例如，在其投藥的機(jī)體中，可以使分子，尤其是如藥品的活性成分運(yùn)輸和傳送的任何化學(xué)實(shí)體。
此外，術(shù)語“膠質(zhì)”用于表示液相中元素分子小于1微米的固體元素的任何穩(wěn)定分散體。
術(shù)語“隱形”用來描述根據(jù)本發(fā)明的載體來表示納米膠囊的能力，該能力為不會(huì)被其投藥的宿主的免疫系統(tǒng)發(fā)覺及隨后的螯合和/或降解，或幾乎不被察覺及隨后的螯合和/或降解，和/或被察覺及隨后稍晚的螯合和/或降解。
術(shù)語“外滲”用來表示物體從血液區(qū)室出來的出口。這個(gè)出口通過切向?qū)ο蛎?xì)血管軸的孔或“穿孔”出現(xiàn)的。這個(gè)現(xiàn)象只能從特定器官，例如腎或肝的有孔的毛細(xì)管，尤其是腦外的實(shí)體腫瘤和其血管顯示增長(zhǎng)的滲透性的發(fā)炎或傳染組織中觀察出來。
術(shù)語“納米膠囊”用于描述直徑小于300nm的小球，其包括在室溫下在一定程度上剛性的環(huán)壁以及中心組分或核，在本發(fā)明中，所述核包含脂肪物質(zhì)。
術(shù)語“兩親”用來描述帶有對(duì)本質(zhì)上為疏水性的物質(zhì)有親和力的基團(tuán)且對(duì)本質(zhì)上為親水性的物質(zhì)有親和力的基團(tuán)的分子。
最后“mol％”表示摩爾百分比，術(shù)語“活性成分”表示藥物活性成分。
本發(fā)明目的的隱形脂質(zhì)納米膠囊主要由脂質(zhì)核和外脂質(zhì)膜組成，其中脂質(zhì)核在室溫為液態(tài)或半液態(tài)，脂質(zhì)膜包括至少一種實(shí)質(zhì)上為脂質(zhì)的親水性表面活性劑、至少一種實(shí)質(zhì)上為脂質(zhì)的親脂性表面活性劑和至少一種聚乙二醇的兩親衍生物，其中的聚乙二醇組分摩爾質(zhì)量大于或等于1000g/mol，優(yōu)選為大于或等于2000g/mol。
“聚乙二醇化(pegylated)”兩親衍生物有助于給納米膠囊?guī)黼[形性質(zhì)。有利地，納米膠囊的核可以使多數(shù)分子，尤為特別的是實(shí)質(zhì)上為親脂性的活性成分，如以溶解或分散狀態(tài)傳送的抗癌藥物結(jié)合和傳輸。從而，根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊具有在一段持續(xù)的時(shí)間周期，在血液系統(tǒng)，尤為特別的是在間質(zhì)性介質(zhì)緣的腫瘤中攜帶抗癌藥物的能力。此外，根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊有足夠長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間，以使其與循環(huán)系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行反應(yīng)，以及在實(shí)體腫瘤中進(jìn)行更多外滲。
“實(shí)體”腫瘤由被血液循環(huán)灌流的實(shí)體塊或組織中組織起來的腫瘤細(xì)胞構(gòu)成。帶孔毛細(xì)管的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)灌流許多腫瘤。因而這些毛細(xì)管有多種類型的孔，依據(jù)孔的大小，可以使實(shí)體元素通過血液區(qū)室。在腫瘤脈管基膜的皮下細(xì)胞之間的穿孔大小是從一個(gè)到另一個(gè)腫瘤變化的。但是，尺寸小于300nm的膠質(zhì)粒子能夠在許多腫瘤中進(jìn)行外滲。此外，由于腫瘤的差的淋巴引流，膠體粒子到腫瘤的間質(zhì)性介質(zhì)的滲透滲透作用與增強(qiáng)的停滯效應(yīng)結(jié)合。這個(gè)叫作EPR(增強(qiáng)滲透性和停滯效應(yīng))的雙重現(xiàn)象可能實(shí)現(xiàn)以膠質(zhì)載體系統(tǒng)為基礎(chǔ)的抗腫瘤治療的發(fā)展。尤其是，相對(duì)于從健康組織中觀察到的，EPR可以使腫瘤周圍的膠質(zhì)粒子和微分子有較長(zhǎng)的持續(xù)累積。
因此，為了形成想要傳輸活性成分的膠質(zhì)載體來開發(fā)了EPR現(xiàn)象。然而，為了使其真實(shí)活性，這樣的載體在被宿主免疫系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)及摧毀前，必須在血液區(qū)室中循環(huán)足夠長(zhǎng)的時(shí)間。因此，免疫系統(tǒng)的特定效應(yīng)物，尤其是巨噬細(xì)胞會(huì)快速發(fā)現(xiàn)非隱形的膠質(zhì)物體，使其不能以足夠的活性量到達(dá)腫瘤。
事實(shí)上，巨噬細(xì)胞是構(gòu)成免疫系統(tǒng)最重要成分之一，并且在從血液循環(huán)中去除包括脂質(zhì)體和其他膠質(zhì)粒子的外來粒子中起主導(dǎo)作用。
公認(rèn)為用于表示此組循環(huán)和沉積的單核細(xì)胞，其構(gòu)成涉及捕獲納米粒子的非特異性預(yù)防系統(tǒng)的表述為“單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)”(MPS)是為了。
在分子層面，注射后粒子的清除分兩步在粒子表面，血清蛋白(或“調(diào)理素”)沉積的調(diào)理素作用，其后是由巨噬細(xì)胞識(shí)別和捕獲調(diào)理后的粒子。
帶有親水性和彈性聚合物，通常是聚乙二醇類的納米粒子表面的修改使其得到空間保護(hù)來阻止調(diào)理素到達(dá)粒子表面，并且通過MPS細(xì)胞使其消除作用產(chǎn)生。依據(jù)鏈的長(zhǎng)度及其密度給予隱形性質(zhì)的高分子鏈的活性性。因此，莫里等人(FEBS Lett.，284263，1991)進(jìn)行了磷脂的對(duì)比研究，該磷脂含有在200nm脂質(zhì)體表面存在的PEG750，2000和5000g/mol的鏈。在相同的摩爾百分比下，證明PEG750在體外在給予對(duì)抗調(diào)理素作用的空間保護(hù)方面完全無效。另一方面，最長(zhǎng)的PEG鏈顯示出對(duì)抗調(diào)理素作用的活性性，該性質(zhì)與其鏈長(zhǎng)有關(guān)。這個(gè)體外的行為是與在對(duì)大鼠進(jìn)行靜脈內(nèi)注射之后的脂質(zhì)體的半衰期有關(guān)聯(lián)的，其是PEG750，PEG2000和PEG3000分別為小于30分鐘，大約2個(gè)小時(shí)和大于3個(gè)小時(shí)。
其他的研究(Allen等人，BBA，106629，1991)說明在1000g/mol以下，即使在納米粒子表面，聚乙二醇鏈?zhǔn)秋柡蜐舛龋膊豢梢允蛊渚哂凶銐虻目臻g保護(hù)，及因此的隱形性質(zhì)。
想要傳輸抗癌活性成分的隱形載體的設(shè)計(jì)不僅可能增加其治療效果，從而還能確定在調(diào)理素作用現(xiàn)象和免疫系統(tǒng)方面的特定不可見性。此外，其血液半衰期的該增長(zhǎng)(隱形效果的結(jié)果)還可以用來減少攜帶的活性成分的毒性，該活性成分將主要在腫瘤的間質(zhì)組織中釋放，在健康組織中的擴(kuò)散非常有限。
事實(shí)上，通?？拱┗钚猿煞质浅叽缧∏矣葹槊黠@的在分裂細(xì)胞上顯示高細(xì)胞毒性的分子。此外，其活性治療濃度有時(shí)與血漿濃度區(qū)別不大，在該濃度下，變?yōu)閷?duì)活性進(jìn)行投藥的機(jī)體有毒的。這種狹窄濃度界(narrow concentration window)需要使用載體以進(jìn)行所述化合物的投藥。隱形載體的使用可以使其在腫瘤間質(zhì)組織里累積，并且在其中釋放其活性物。由于累積作用，活性成分的腫瘤內(nèi)濃度非常高，比使用常規(guī)載體和單獨(dú)使用活性成分的濃度高很多(Allen，Trends，Pharm.Sci.，15215，1994)。因此，隱形膠質(zhì)系統(tǒng)有可能使用更多劑量的抗癌藥物，比起那些由于其高毒性而有可能單獨(dú)使用活性成分投藥的要好得多。
納米粒子在腫瘤中的累積及其導(dǎo)致的治療效果取決于其從血液循環(huán)消除的半衰期。因此，常規(guī)類型或顯示持續(xù)循環(huán)的調(diào)理素的不同配方通過其血液消除圖和其在大鼠內(nèi)腫瘤的累積的主要成分來進(jìn)行比較(Gabizon A.and Papahadjopoulos D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，856949，1988)。從而24小時(shí)后，半衰期為大約8小時(shí)的隱形配方在腫瘤內(nèi)顯示高于注射劑量10％的累積物。半衰期為稍微小于1小時(shí)的對(duì)比配方在腫瘤內(nèi)顯示的累積物比從隱形配方中觀察到的要低得多。具體來說，24小時(shí)時(shí)，對(duì)比配方的腫瘤內(nèi)濃度僅顯示為隱形配方的腫瘤中測(cè)定的數(shù)量的4-16％。這些結(jié)果說明半衰期為1小時(shí)或少于1小時(shí)的配方在腫瘤中的累積很差。
如脂質(zhì)體或納米粒子，即由在懸浮液中直徑在25nm到1μm之間的粒子構(gòu)成的膠質(zhì)系統(tǒng)，導(dǎo)致各種膠質(zhì)藥物形式的發(fā)展和商品化。
因此，專利US5,811,119描述了脂質(zhì)體用于從類胡蘿卜素衍生出來的抗癌藥物產(chǎn)品的使用。所述脂質(zhì)體配方尤其可能減少活性成分的體內(nèi)毒性。其中將要用于治療腫瘤的類胡蘿卜素與脂質(zhì)體中可以使其加載的夾層促進(jìn)劑結(jié)合。由于如甘油三酸酯的兩親化合物的存在，親脂性活性成分在其核實(shí)質(zhì)上是疏水性的脂質(zhì)體中的傳輸是可能的。這些“夾層促進(jìn)劑”有可能在10mol甘油三酸酯1mol類胡蘿卜素的比例下傳輸類胡蘿卜素。
這樣的載體有可能實(shí)現(xiàn)在減少其細(xì)胞毒性的同時(shí)傳輸抗癌藥物，但是卻有低的密封率，并且此外，其對(duì)腫瘤既沒有精確的靶向性，在血液區(qū)室中又沒有增長(zhǎng)的載體半衰期。尤其地，特別由于循環(huán)系統(tǒng)酶會(huì)對(duì)其快速降解，脂質(zhì)體系統(tǒng)的主要缺點(diǎn)是在血液循環(huán)中比較差的穩(wěn)定性。
文獻(xiàn)US5,527,528描述了修改后的脂質(zhì)體對(duì)攜帶和使用抗癌藥品的使用。所述脂質(zhì)體大小在50到120nm之間，包含如阿糖胞苷的抗腫瘤化合物和在其表面有足夠濃度的聚乙二醇分子鏈，該鏈較大地增加其投藥到的宿主的血液區(qū)室里的循環(huán)時(shí)間。此外，這些脂質(zhì)體還可以在其表面攜帶對(duì)某一腫瘤抗原特定的抗體來促使對(duì)抗腫瘤的脂質(zhì)體的活性靶向性。
這些文獻(xiàn)公開了提供血液循環(huán)中活性成分的持續(xù)傳輸和抵抗指向其的腫瘤類型的特定靶向性的載體。
但是，這類載體有一個(gè)主要缺點(diǎn)。具體來說，其尤其有利于實(shí)質(zhì)上是親水性的抗癌藥物，如阿糖胞苷或慶大霉素。而且，親脂性活性成分，例如，尤其是如道諾霉素的抗癌藥物的傳輸受到限制。這些化合物通過結(jié)合傳送到脂質(zhì)體的雙磷脂層。因此，由于大量脂質(zhì)體核不能用于傳送，所以其保持低的結(jié)合量。由于水區(qū)室體積和親脂性區(qū)室體積的差的比率，這個(gè)系統(tǒng)的主要缺點(diǎn)顯示在對(duì)親脂性藥品有限的結(jié)合能力方面。
另外，活性成分的膜結(jié)合將取決于它們?cè)诹字p層的脂質(zhì)環(huán)境里的溶解程度。在給定的雙層內(nèi)，其成分，在這里也就是磷脂的選擇決定的親脂性是很難調(diào)整的。因此，關(guān)于活性成分的溶脂性方面，這類載體不能調(diào)節(jié)傳輸介質(zhì)的HLB*(親水親脂平衡)，其中活性成分易于和根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊核一起傳輸，以向核組分的選擇提供更多易變性。所以結(jié)合量取決于活性成分在脂質(zhì)體膜內(nèi)的溶解程度。因而，對(duì)于所有由脂質(zhì)雙層組合物(Lasic，Trends Biotechnol.16307，1998)制成的脂質(zhì)，通常脂質(zhì)體不能將大于5mol％(絕大多數(shù)通常為1-2％)的疏水性活性成分結(jié)合到其膜上。
*HLB指數(shù)，或親水/親脂平衡如C.Larpent在出版物“Technique deI’ingenieur”的論文K.342中所定義。
以Doxil出售且希望傳輸阿霉素的脂質(zhì)體還有在血液區(qū)室里顯示出特定隱形性質(zhì)的目的。在這些脂質(zhì)體的表面，脂質(zhì)體擁有插入到磷脂雙層的PEG分子，因此提供了對(duì)腫瘤的被動(dòng)靶向性。
通過來自當(dāng)阿霉素分散到水質(zhì)核心中產(chǎn)生的絡(luò)合作用的“活性加載”機(jī)理，活性成分“加載”到脂質(zhì)體上。pH梯度使得阿霉素進(jìn)入到脂質(zhì)體中，在其中活性成分將轉(zhuǎn)換成膠質(zhì)形式。這個(gè)填充機(jī)理可以獲得高的活性成分加載量。
但是，這個(gè)機(jī)理只能用于特定的活性成分，該活性成分是實(shí)質(zhì)上兩親和可電離的，能夠易于穿過脂質(zhì)雙層(因而是小分子)分散，并且有沉淀或絡(luò)合性能，例如阿霉素或米托蒽醌，以及該機(jī)理不適用于大多數(shù)的抗癌藥物。不能受益于該機(jī)理的活性成分顯示出低的加載量，并且需要隨后的柱分離和活性成分循環(huán)的步驟。
另外，作為活性成分載體的脂質(zhì)體的使用有其他的缺點(diǎn)。尤其是，因?yàn)榭捎稍撃さ竭_(dá)的曲率半徑極限值，磷脂雙層的存在在物理上限制了獲得的脂質(zhì)體的大小，使其很難接近50nm。
因此，脂質(zhì)體載體的使用暗示了必然的主要缺點(diǎn)，尤其是，不僅是在其傳輸?shù)膸追N抗癌藥物質(zhì)的能力方面，還有關(guān)于其使用和儲(chǔ)存的容易程度。
具體來說，當(dāng)膠質(zhì)溶液重新形成時(shí)，在不失去其結(jié)構(gòu)性質(zhì)和傳輸能力的情況下，這樣的脂質(zhì)體載體不可能易于進(jìn)行凍干。結(jié)果是，脂質(zhì)體懸浮液可能顯示出非常不好的穩(wěn)定性和相對(duì)短的保存時(shí)間。
為了想要克服這些限制這類載體有效性的缺點(diǎn)，開始研發(fā)非脂質(zhì)體膠質(zhì)載體。事實(shí)上，在親脂性活性成分，尤其是抗癌藥物的傳輸方面，以高分子為基礎(chǔ)的微膠粒對(duì)于脂質(zhì)體提供了一個(gè)很好的選擇。
因此，文獻(xiàn)No.WO02/00194描述了以高分子為基礎(chǔ)的微膠粒形式的膠質(zhì)載體。該載體尤其可以對(duì)如類胡蘿卜素或甲氨喋呤的活性成分進(jìn)行傳送和運(yùn)輸。所述載體包含疏水性中心成分，和實(shí)質(zhì)上為親水性的外“殼”，其中的中心成分可以進(jìn)入到能被插入的親脂性抗癌藥物。事實(shí)上，這些微膠粒對(duì)應(yīng)于雙嵌段聚合物的集合，該聚合物包含一半以聚乙烯吡咯烷三酮為基礎(chǔ)的親水部分和一半由聚乳酸構(gòu)成的疏水性部分。疏水性中心成分對(duì)應(yīng)于組成這些微膠粒的聚合物分子的疏水性中心成分的整合。除了傳輸疏水性分子的能力之外，這些載體還有可能提供非常小尺寸的粒子，尤其是尺寸小于100nm的脂質(zhì)體的情況下很難得到的粒子。
為了達(dá)到在持續(xù)時(shí)間里，在血液中運(yùn)送活性成分(Stolnik等人.，J.Drug Target.，9361，2001)的目的，其他類型的聚合物微膠粒還在研發(fā)中。這類載體也有雙嵌段聚合物類的結(jié)構(gòu)，其疏水成分是由聚乳酸(PLA)構(gòu)成以及其親水成分是以PEG存在的。依賴于每段的長(zhǎng)度，獲得的PLA-PEG微膠粒有不同的尺寸，比較普遍的是75nm的。通過對(duì)大鼠進(jìn)行這些微膠粒的靜脈注射顯示出消除半衰期在1到2小時(shí)之間的隱形性質(zhì)；在3小時(shí)之后仍有25％的注射劑留在血液中。
另一方面，微膠?；A(chǔ)的載體有在機(jī)體內(nèi)不穩(wěn)定，以及一旦稀釋就快速游離的缺點(diǎn)。事實(shí)上，微膠粒的穩(wěn)定性取決于臨界微膠粒濃度(CMC)，低于該濃度時(shí)，形成的聚合物分子進(jìn)行分解。這個(gè)相對(duì)穩(wěn)定性使微膠粒用于抗癌藥物質(zhì)的治療傳輸方面的工業(yè)使用性不夠好。
因此，為了克服存在的膠質(zhì)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和/或傳輸實(shí)質(zhì)上為親脂性的分子的差的有效性，仍在研發(fā)除脂質(zhì)體以外的以其他納米粒子為基礎(chǔ)的載體。
從而，專利WO01/64328描述了含有剛性脂質(zhì)表面和液態(tài)或半液態(tài)的核的脂質(zhì)納米膠囊，其核是由脂肪酸或甘油三酸脂的酯組成的。這些納米膠囊的剛性表面的一部分是由對(duì)應(yīng)幾種卵磷脂混合物的LipoidS 75-3和SolutolHS15組成的。這類載體有可能實(shí)現(xiàn)疏水活性成分，尤其是抗癌藥物的傳輸。在這樣的納米粒子中，親脂活性成分以溶解形式存在于核里，作為選擇的活性成分的脂溶性的函數(shù)，其組合物可以通過修改來調(diào)節(jié)HLB。根據(jù)專利WO01/64328的脂質(zhì)納米膠囊具有對(duì)體內(nèi)血液中的性能評(píng)估的目的，該評(píng)估是在通過靜脈內(nèi)注射到大鼠體內(nèi)之后進(jìn)行的(Cahouet等人.，Int.J.Pharm.242367 2002)。構(gòu)成這些納米粒子表面的SolutolHS15為疏水組分和660g/mol，突出在外表的聚乙二醇短鏈組成的分子。如上所述，甚至在高密度下仍然很短的PEG鏈不能足夠有效的為納米粒子提供抵抗調(diào)理素作用的空間保護(hù)，以及由此產(chǎn)生的隱形性質(zhì)。因此，這些脂質(zhì)納米膠囊的半衰期很短，只有大約45分鐘。但是，這些脂質(zhì)納米膠囊比起如單獨(dú)的放射性標(biāo)記的小分子能循環(huán)更長(zhǎng)的時(shí)間。因而根據(jù)專利WO01/64328的脂質(zhì)納米膠囊的半衰期不足以使其循環(huán)所需的持續(xù)的時(shí)間段，如先前所述的，該時(shí)間段是為了能夠在(除肝和脾以外的機(jī)體內(nèi)的)腫瘤內(nèi)累積。
這次，其他類型的脂質(zhì)納米膠囊在Mosqueira等人(Pharm.Res.，181411，2001)中產(chǎn)生并描述，該類型能夠在大鼠體內(nèi)顯示出特定的長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間且希望傳輸活性成分。這樣的脂質(zhì)納米膠囊具有核和高分子的剛性外層，其核是由可以溶解并傳輸親脂活性成分，尤其是抗癌藥物的脂肪物質(zhì)組成，其外層上接合PEG鏈且提供給他們一些對(duì)免疫系統(tǒng)的隱形性質(zhì)。
這些直徑大約為200nm的納米膠囊顯示出比缺少所述表面分子的相同納米粒子長(zhǎng)很多的血液循環(huán)時(shí)間。但是，這樣的結(jié)果是從小鼠體內(nèi)獲得的，其免疫系統(tǒng)有調(diào)節(jié)素作用的能力，但該調(diào)解素作用小于如在大鼠或人體內(nèi)觀察到的。所以，在調(diào)節(jié)素作用能力方面，對(duì)大鼠或人類的免疫系統(tǒng)，不可能由逃避小鼠免疫系統(tǒng)的相對(duì)的有效性推斷出更有力的結(jié)果(Liu D.等人.，BBA，1240277，1995)。
另外，其相對(duì)大的直徑不會(huì)使其在大多數(shù)的實(shí)體腫瘤中易于進(jìn)行外滲。因此，即使在血液區(qū)室里的滯留時(shí)間增長(zhǎng)，腫瘤的靶向性還是很低，其限制了所有更好的治療活性性。
由制作PLA-PEG的雙嵌段結(jié)構(gòu)聚合物構(gòu)成的，在大鼠體內(nèi)顯示出隱形性質(zhì)，并且半衰期為6小時(shí)的納米球還在進(jìn)行發(fā)展(Verrecchia等人.，J.Control.Rel.3649，1995)。高分子疏水成分是由30000g/mol的PLA構(gòu)成，親水鏈?zhǔn)怯?000g/mol的PEG組成的。這些納米粒子有相對(duì)不利于補(bǔ)體激活的表面，其結(jié)果是降低了調(diào)理素作用現(xiàn)象和由MPS細(xì)胞導(dǎo)致的噬菌作用。
但是，這類以PLA類型的實(shí)體聚合物為基礎(chǔ)的納米粒子的主要缺點(diǎn)是一旦在腫瘤細(xì)胞的凝塊的周圍面積中，其快速釋放活性成分的能力很差。特別地，這些納米粒子的剛性外層是由PLA組成的，而且由于水解引起的降解相對(duì)很慢。弱的生物侵蝕暗示包含在這些納米膠囊里的活性成分釋放很慢。目前，這樣的抗癌載體的治療活性性首先來自其躲避免疫系統(tǒng)的能力，其次來自快速釋放的能力，即24小時(shí)內(nèi)，在腫瘤周圍面積里的含量。此刻，由Mosqueira或Verrecchia描述的納米粒子在生物體內(nèi)滯留24小時(shí)之后，實(shí)際上不再降解，其不可能實(shí)現(xiàn)實(shí)體腫瘤的最佳治療。
因此，本發(fā)明提供一種用于活性成分的新穎載體，其可能避免從脂質(zhì)體載體中觀察出來的大多數(shù)缺點(diǎn)，并且與存在的非脂質(zhì)體膠質(zhì)載體相比較，能夠改善將活性成分靶向性和釋放的有效性。
本發(fā)明的目的還在于提供了一種用于活性成分的新穎類型隱形載體，通過增加其治療指數(shù)，提供給癌癥，尤其是實(shí)體或循環(huán)系統(tǒng)腫瘤更有效的治療。
治療指數(shù)是產(chǎn)生不希望效果的藥物劑量與導(dǎo)致希望效果的劑量的比率。
鑒于由于藥品是形成膠囊而不是在溶液中而減少的毒性、長(zhǎng)的循環(huán)性質(zhì)和腫瘤靶向性能力，根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊提供了具有改善的治療指數(shù)的藥品。事實(shí)上，將活性成分封裝在膠質(zhì)藥物載體里來減少其體內(nèi)分布容積。這個(gè)藥物動(dòng)力學(xué)描述上的轉(zhuǎn)變帶來增長(zhǎng)的效力和/或減少的毒性，并且提供比較多的藥物使用量。
具體來說，由于根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊的大小和隱形性質(zhì)使得這些納米膠囊可以通過外滲現(xiàn)象接近和滲透這些腫瘤，作為用于活性成分載體的根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊可能用于實(shí)體腫瘤的治療。本試驗(yàn)中，也就是腫瘤的被動(dòng)靶向性。因此，對(duì)申請(qǐng)人有利的是，能夠設(shè)計(jì)出由隱形脂質(zhì)納米粒子組成的載體，該粒子可以對(duì)要瞄準(zhǔn)的腫瘤進(jìn)行被動(dòng)靶向。
另外，作為用于活性成分載體的根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊可以通過主動(dòng)靶向現(xiàn)象用于循環(huán)系統(tǒng)腫瘤的治療。這種主動(dòng)靶向是通過向所述納米膠囊、分子或特定用于某種循環(huán)系統(tǒng)腫瘤表面分子的“配體”進(jìn)行附著產(chǎn)生的。有利地，這種表面分子的附著是在通過其后描述的后插入合成納米膠囊方法中完成的。通常，作為用于活性成分載體的根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊可以通過有能夠被配體識(shí)別的接受器的主動(dòng)靶向或被動(dòng)靶向(沒有接受器的加入)用于實(shí)質(zhì)上為實(shí)體或循環(huán)系統(tǒng)腫瘤的治療。
作為用于活性成分載體的根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊還顯示活性成分在腫瘤鄰近環(huán)境中快速地，并且因而更有效地釋放。所述納米膠囊組分的快速生物吸收提供這樣快速地釋放，尤其是由于在機(jī)體內(nèi)存在的酶的作用。
尤其是通過酶消化的生物降解的特征是本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，其可能改善通過這個(gè)方法投藥的活性成分的治療有效性。根據(jù)本發(fā)明的載體還顯示有利的對(duì)免疫系統(tǒng)的隱形性質(zhì)和結(jié)合了完全沒有毒性的完整的生物降解能力。事實(shí)上，根據(jù)本發(fā)明的載體的所有組分為可生物降解且能夠在機(jī)體內(nèi)快速吸收，是用于腸道外使用的證明的目的，而且是在沒有任何有機(jī)溶劑的情況下配制的。因此，納米膠囊的這個(gè)“內(nèi)在”毒性是非常低或根本不存在的。
另外，根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊能夠攜帶相對(duì)高含量的潛在有毒的活性成分(例如抗癌藥物)通過機(jī)體，該過程與溶液中游離的藥物相比較，顯示出減少的毒性。
本發(fā)明的這個(gè)方面在說明書的F)部分，實(shí)施例10，和圖7(三次多烯紫杉醇靜脈注射后，小鼠相對(duì)平均體重的發(fā)展)和圖8(給小鼠使用不同配方的多烯紫杉醇，體重下降15％的平均天數(shù))中顯示出來。
因此，與攜帶潛在有毒物質(zhì)時(shí)其減少的毒性相結(jié)合，其非常低的內(nèi)在毒性可以使根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊成為哺乳動(dòng)物體內(nèi)非常安全的抗癌藥物的載體。
根據(jù)本發(fā)明的新穎隱形膠質(zhì)載體還有的優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)其以懸浮液的形式重新合成時(shí)，在不會(huì)失去其性質(zhì)的情況下，易于凍干和消除。
這個(gè)載體還有可能通過血管線路給藥實(shí)現(xiàn)組織炎癥的治療。
有利地，根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)納米膠囊的直徑在50到150nm之間，優(yōu)選在80到120nm之間。
所述納米膠囊的大小對(duì)腫瘤抗癌藥物的被動(dòng)靶向性起作用。具體來說，在腫瘤中觀察到的EPR效果可以使通道進(jìn)入到并保持在血液中存在的實(shí)體腫瘤分子周圍的間隙介質(zhì)內(nèi)，實(shí)體腫瘤分子的直徑要足夠小來實(shí)現(xiàn)這個(gè)外滲。根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊是通過使用有利地可能調(diào)節(jié)其分子大小的方法制備的。另外，納米膠囊顯示出長(zhǎng)的循環(huán)性質(zhì)，該循環(huán)能夠提供給納米膠囊在血液區(qū)室里長(zhǎng)于2小時(shí)的半衰期。有利地，通過增加由腫瘤毛細(xì)管孔的附近里的納米膠囊產(chǎn)生的通道數(shù)量，這兩個(gè)特征有可能促進(jìn)外滲現(xiàn)象。
該外滲現(xiàn)象顯示在G部分的實(shí)施例11(還可以參看圖9和10)，其中在腫瘤里的納米膠囊加載放射性同位素示蹤的多烯紫杉醇的累積對(duì)于隱形納米膠囊(S-LN)顯示出比對(duì)于非聚乙二醇化納米腫瘤(LN)更為重要。
根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊的隱形性質(zhì)還有促進(jìn)與血液循環(huán)中存在的惡性腫瘤細(xì)胞，尤其是循環(huán)系統(tǒng)腫瘤接觸的能力。
外滲對(duì)應(yīng)于切向過濾現(xiàn)象，其意思是孔直徑為200nm的腫瘤將可以使相同直徑的循環(huán)物通過，雖然很難。另外，根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊的大小可以使其避免由肝細(xì)胞層外滲引起的捕獲。事實(shí)上，肝的竇狀隙毛細(xì)管孔可使大約50nm的粒子的外滲。最后，所述納米膠囊的大小必須小于200nm以避免由于粒子大小超過這個(gè)尺寸而在脾里觀察到的過濾現(xiàn)象。因此，限定尺寸的納米膠囊既是造成由EPR促進(jìn)的被動(dòng)靶向性現(xiàn)象的原因，也是所述納米膠囊存留在血液循環(huán)里以使其能夠避免過濾和肝外滲現(xiàn)象的時(shí)間增長(zhǎng)的原因。
納米膠囊的直徑可以作為要治療的腫瘤類型的函數(shù)來進(jìn)行調(diào)整，并且可以適當(dāng)?shù)厣晕⑿∮诨虼笥谏鲜龇秶?br> 事實(shí)上，納米膠囊的大小必須調(diào)整到將要摧毀的腫瘤的孔的大小，這個(gè)大小有可能根據(jù)相同腫瘤空間里腫瘤的熟化度而隨著時(shí)間變化。結(jié)果是，如果根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊的大小能夠精確調(diào)整，那么根據(jù)本發(fā)明的載體的被動(dòng)靶向性能最適合在治療標(biāo)準(zhǔn)中實(shí)現(xiàn)。目前，有利地，申請(qǐng)人研發(fā)出精確合成可變化和可控制的隱形納米膠囊的方法。因此，現(xiàn)有載體具有適于腫瘤環(huán)境的能力以使其更有效。
根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊的外脂質(zhì)膜包括實(shí)質(zhì)上為脂質(zhì)的親脂性表面活性劑。有利地，該表面活性劑是卵磷脂的形式，其磷脂酰膽堿的比例至少等于95％，優(yōu)選高于99％。
申請(qǐng)人注意到在大鼠體內(nèi)含有高于95％的磷脂酰膽堿含量的納米膠囊的成分有可能較大地增長(zhǎng)血液循環(huán)中的循環(huán)時(shí)間。因此，例如其他磷脂，如磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂或游離脂肪酸的雜質(zhì)可以促進(jìn)增加這些納米膠囊的調(diào)理素作用現(xiàn)象。另外，申請(qǐng)人還注意到當(dāng)親脂性表面活性劑顯示最初卵磷脂含量高于95％時(shí)，偶聯(lián)PEG分子的脂質(zhì)分子的插入量更好。
因此，觀察到的根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊的長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間可能是因?yàn)檫@些納米膠囊的外表面含有以卵磷脂為基礎(chǔ)的實(shí)際上純的磷脂，其能夠限制調(diào)理素作用。根據(jù)卵磷脂的純度級(jí)對(duì)避免調(diào)理素作用的機(jī)理起作用。
有利地，實(shí)質(zhì)上為脂質(zhì)的親脂性表面活性劑顯示制作上述外脂質(zhì)膜的脂質(zhì)分子的5到30mol％的摩爾百分比。
優(yōu)選地，這個(gè)表面活性劑有高于25℃，優(yōu)選高于37℃的從凝膠轉(zhuǎn)化到液相的轉(zhuǎn)化溫度；意思是在室溫下，所述表面活性劑是凝膠形式，并且只能在高于25℃，優(yōu)選高于37℃的溫度下轉(zhuǎn)化為液體形式。凝膠/液體轉(zhuǎn)化溫度對(duì)所述納米膠囊的外脂質(zhì)膜的剛性起作用。無論納米膠囊是以懸浮液在水溶液中，還是投藥到血液區(qū)室中，外膜的剛性在水性介質(zhì)里提供給根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊相當(dāng)重要的物理化學(xué)穩(wěn)定性。事實(shí)上，所述外膜的剛性給予納米膠囊內(nèi)聚力使其可以抵抗如pH值變化或注射期間發(fā)生的滲透壓的環(huán)境改變。
有利地，親脂性表面活性劑是帶有飽和碳基鏈的磷脂，優(yōu)選雙鏈，每一個(gè)鏈包括至少16碳原子。作為其結(jié)果，磷脂優(yōu)選自C16-C18DSPC(二硬脂酰磷脂酰膽堿)和C16-C18DPPC(二棕櫚酰磷脂酰膽堿)。優(yōu)選地，HSPC可以作為高于99％純度級(jí)來使用以致于獲得更好的剛性和更好的隱形性質(zhì)。后一化合物是以Doxil來出售的可注射脂質(zhì)體配方的組合物的一部分。
另外，所述外脂質(zhì)膜含有優(yōu)選證明用于腸道外注射的實(shí)質(zhì)上為脂質(zhì)的親水性表面活性劑。有利地，該親水性表面活性劑選自聚乙二醇甲酯和聚乙二醇甲醚，及其混合物。
該親水性表面活性劑優(yōu)選為占構(gòu)成外脂質(zhì)膜的脂質(zhì)分子的60到90mol％之間。使用該表面活性劑的優(yōu)選摩爾比例大約為構(gòu)成外脂質(zhì)膜的脂質(zhì)分子的80mol％。
和親脂性表面活性劑一起的親水性表面活性劑用于形成需要制備根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊的油/水乳液。事實(shí)上，其保證了在合成所述納米膠囊的方法中由甘油三酸酯混合物形成的脂肪粒的穩(wěn)定性。另外，該表面活性劑還確保了所述外脂質(zhì)膜的內(nèi)聚力。在所述納米膠囊膜中，相對(duì)高比例的親水性表面活性劑有可能得到低的界面間張力的情況下，有可能制備納米膠囊，其中親水性表面活性劑的比例越高，直徑越小。
優(yōu)選地，將使用以下名稱出售的非離子表面活性劑SolutolHS15(BASF)，Brij(Uniquema)或Mapeg(BASF)。優(yōu)選使用SolutolHS15，其對(duì)應(yīng)于聚乙二醇-660 12-羥基硬脂酸類，其包含對(duì)應(yīng)于660g/mol分子重量的15個(gè)單元的乙二醇短鏈。該表面活性劑被證明有利地用于腸道外使用，并且更特別地用于靜脈給藥；另外，在內(nèi)聚力方面也得到很好的結(jié)果。
最后，所述外脂質(zhì)膜包含為所述納米膠囊有效提供長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間的PEG的兩親衍生物。特別地，PEG的兩親衍生物有可能同時(shí)減少納米膠囊的調(diào)理素作用現(xiàn)象，改善膠質(zhì)溶液的穩(wěn)定性和延長(zhǎng)這些納米膠囊在血液循環(huán)中的滯留時(shí)間。
有利地，PEG的兩親衍生物包含可以使其在所述外脂質(zhì)膜中粘附的疏水性成分和朝向所述脂質(zhì)納米膠囊的外部并在其表面提供親水性能的PEG類型成分。
PEG的兩親衍生物通過其疏水端插入到所述納米膠囊的外膜中。其后，PEG成分朝向所述納米膠囊的外部，并且在每一個(gè)納米膠囊的周圍形成保護(hù)性的親水殼。疏水端可以粘附在外膜表面。該粘附由較低能量鍵能提供，該鍵是將聚乙二醇化脂質(zhì)的疏水性成分連接到所述脂質(zhì)膜表面上存在的那些表面活性劑的鍵。具體來說，根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊的外脂質(zhì)膜的內(nèi)聚力來自施加在疏水性基團(tuán)之間，特別是構(gòu)成該膜的鏈上甲基之間的范德華力。當(dāng)納米膠囊進(jìn)入血液區(qū)室內(nèi)，這些低能量鍵有可能同時(shí)在膜組分之間保持足夠內(nèi)聚力來避免根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊的快速降解，而是給予它們足夠的脆性確?？焖俚厣锝到?，和因而的由傳輸?shù)幕钚猿煞轴尫诺闹委熡行浴?br> 事實(shí)上，不同于如Mosqueira描述的由PLA(聚乳酸)或PLAGA(聚乳—共—乙二醇酸)類的高分子鏈組成納米膠囊表面，且其中所述高分子鏈在生理情況下的任何溫度中為固體形式，構(gòu)成根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊膜的脂肪鏈不會(huì)以共價(jià)鍵彼此相連，因此，更容易分解。具體地，生物侵蝕是其表面現(xiàn)象，該現(xiàn)象是結(jié)合了局部的pH情況和水的存在下的酶破壞或自然生物降解(或生物回吸)的結(jié)果。該侵蝕是造成磷脂損失的原因，該磷脂在納米膠囊表面來促使活性成分的引出。
基于PLA或PLAGA的納米膠囊的高分子鏈很長(zhǎng)(由Mosqueira描述的納米膠囊為45000g/mol)，且構(gòu)成剛性且光滑的厚表面。所以其生物降解減慢。因此，對(duì)于完成基于PLA或PLAGA的納米膠囊生物降解，多于24小時(shí)(或甚至幾個(gè)星期)的時(shí)間是必要的。根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊的表面上存在的磷脂是不同的實(shí)體，并且有利地可以進(jìn)行表面萃取和快速生物降解，其對(duì)傳輸?shù)幕钚猿煞值闹委熡行缘尼尫乓彩潜匾摹?br> 最后，納米膠囊外膜的成分不僅可生物降解，且證明對(duì)于腸道外使用和靜脈內(nèi)注射，還能夠被機(jī)體吸收。特別地，例如卵磷脂或磷脂酰乙醇胺的成分通常存在于食品中，并且能自然地被機(jī)體吸收。
因此，覆蓋納米膠囊表面的鏈的大小及其性質(zhì)和保持其組合的化學(xué)鍵性質(zhì)既提供給形成根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊在血液區(qū)室里多于1小時(shí)的穩(wěn)定能力，又能夠被循環(huán)酶或存在于間質(zhì)液里的酶吸收。
有利地，用于根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊的根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊的半衰期長(zhǎng)于2小時(shí)。理想地，根據(jù)本發(fā)明地膠囊希望要獲得3到10小時(shí)之間的血漿半衰期。有利地，這個(gè)特征可以使根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊在腫瘤中累積，并且在其中在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間里釋放含量的大多數(shù)。從而作為結(jié)果，抗癌藥物的有效性增加。目前，抗腫瘤物的快速釋放是作為考慮消除實(shí)體腫瘤，提供高增長(zhǎng)率的基本因素。
本發(fā)明中使用的PEG的兩親衍生物優(yōu)選具有作為疏水性基團(tuán)的磷脂酰乙醇胺。因而其是聚乙二醇化磷脂。因此，使用可生物降解的磷脂，尤其是選自DPPE-PEGx(二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺)、DSPE-PEGx(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)、DOPE-PEGx(二油?；字Ｒ掖及?，和POPE-PEGx(棕櫚酰磷脂酰乙醇胺)，其中x以g/mol表示PEG分子大小，以及它們的混合物構(gòu)成。
優(yōu)選地，作為偶聯(lián)至PEG分子的磷脂，DSPE-PEGx將由于其穩(wěn)定性而在根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊的外膜中使用。
有利地，將使用DSPE-PEG2000、DSPE-PEG3000和DSPE-PEG5000。
另外，根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊的隱形性質(zhì)還可以從甾醇核-PEG的聚乙二醇化脂質(zhì)、神經(jīng)酰胺-PEG或PEG2000四油酸失水山梨醇類、或更普遍地有至少一個(gè)烷基鏈的烷基-PEG中獲得，該烷基鏈粘附外膜中至少一個(gè)PEG分子來提供疏水性。
接合上述磷脂的PEG高分子的分子大小也是很重要的。具體地，其將要決定在所述納米膠囊表面上的空間障礙、從而對(duì)表面的可到達(dá)性以及這些納米膠囊躲避MPS的能力。
本發(fā)明中使用的PEG的兩親衍生物的分子優(yōu)選具有大于或等于1000g/mol的摩爾質(zhì)量。如上所述，小于1000g/mol的PEG鏈的存在不能給予足夠抵抗調(diào)理素作用的保護(hù)。所以，上述親水性表面活性劑分子中存在的660g/mol的PEG短鏈不能給予足夠抵抗調(diào)理素作用的表面保護(hù)，也就是持續(xù)循環(huán)。能夠用于本發(fā)明的PEG分子式(O-CH2-CH2)屬于包括含有113PEG單元的PEG5000，含有68PEG單元的PEG3000，和含有45PEG單元的PEG2000的基團(tuán)。這些長(zhǎng)聚乙二醇鏈在脂質(zhì)納米膠囊表面投藥親水性。
使PEG的兩親衍生物并入所述納米膠囊膜的摩爾比例優(yōu)選為構(gòu)成外脂質(zhì)膜的脂質(zhì)分子的0.5到12mol％之間，優(yōu)選在1到10mol％之間。優(yōu)選地，DSPE-PEG分子的用量為膜的全部脂質(zhì)的1到10mol％之間的摩爾比例。
在優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，將使用DSPE-PEG5000的分子，由于其大小(大約兩倍于DSPE-PEG2000分子)，對(duì)相同數(shù)量分子來說，有可能在體內(nèi)通過空間影響和更顯著的隱形性質(zhì)獲得更強(qiáng)的斥力。具體地，在脂質(zhì)膜表面，PEG鏈保持持續(xù)的移動(dòng)，因此，其鏈越長(zhǎng)，其在脂質(zhì)納米膠囊周圍掃描的空間越大，以增加空間障礙和減少所有有可能到達(dá)這些納米膠囊表面的蛋白質(zhì)。因此，躲避調(diào)理素作用現(xiàn)象的能力也由于DSPE-PEG5000的存在而更強(qiáng)。
根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊的核是由脂肪酸酯和/或甘油三酸酯和/或作為脂肪物質(zhì)的油和/或其混合物組成的基本上脂質(zhì)的核。有利地，甘油三酸酯選自帶有6到14碳原子的中鏈甘油三酸酯和/或辛酸或癸酸甘油三酸酯和其混合物。更優(yōu)選地，作為構(gòu)成根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊核的脂肪物質(zhì)混合物將使用Labrafaccc，Miglyol812N或Miglyol810N，其與下列藥品名稱相對(duì)應(yīng)中鏈甘油三酸酯混合物，分餾的椰子油或辛酸或癸酸甘油三酸酯。甘油三酸酯可以由純的甘油基三辛酸酯(烷基鏈上有8個(gè)碳原子)構(gòu)成，例如三辛酸甘油酯。為了最大化地將藥物溶于核中，甘油三酸酯可以單獨(dú)使用或作為結(jié)合其他的還被證明用于腸道外使用的藥物油或脂肪酸酯的混合物來使用。
有利地，構(gòu)成所述基本上脂質(zhì)的核的脂肪酸酯選自帶有8到18碳原子的中鏈脂肪酸，例如棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、豆蔻酸異丙酯或辛基月桂醇肉豆蔻酸酯及其混合物。
當(dāng)然，作為混合物所需的親脂親水平衡(或HLB)的函數(shù)，這些組分的每一種組成和比例能夠進(jìn)行調(diào)整和調(diào)節(jié)。事實(shí)上，由于膜的內(nèi)表面實(shí)質(zhì)上是親脂性的，所以在膜性質(zhì)和核的含量之間是沒有不相容性的。
根據(jù)由甘油三酸酯和油組成的所述核攜帶的碳基鏈飽和度的大小和程度，這些脂質(zhì)在室溫下是液態(tài)或半液態(tài)形式。根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊核里的存在的脂肪物質(zhì)不僅用于作為傳輸抗癌藥物的溶劑，還構(gòu)成了為了在外部環(huán)境里保持納米膠囊及其相對(duì)的穩(wěn)定性的固體物質(zhì)，無論是在水質(zhì)的溶液或在凍干步驟末端的干燥狀態(tài)中。不像脂質(zhì)體或其他有脂質(zhì)膜和水質(zhì)內(nèi)部的膠質(zhì)載體，脂肪物質(zhì)含量的存在因而為根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊提供了一定的穩(wěn)定性(在粒子強(qiáng)度或滲透壓中變化)。
有利地，本發(fā)明目的的隱形脂質(zhì)納米膠囊的外脂質(zhì)膜的外表面實(shí)質(zhì)上是親水性，且基本上為脂質(zhì)的核實(shí)質(zhì)上是親脂性的。
因此，構(gòu)成核和膜的可生物降解的能夠消除的脂質(zhì)有可能實(shí)現(xiàn)傳輸?shù)幕钚猿煞挚焖籴尫?，還提供給納米膠囊物理穩(wěn)定性，該穩(wěn)定性可以使其凍干，甚至將其經(jīng)過0.45到0.22μm的過濾器消除。因此，根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊可以消除，并且隨意地以干燥形式儲(chǔ)存較長(zhǎng)時(shí)間。所以，根據(jù)本發(fā)明的新穎載體提供了確定的應(yīng)用，該應(yīng)用使其成為工廠易于開發(fā)的藥品。
有利地，本發(fā)明目的的隱形脂質(zhì)納米膠囊的基本上為脂質(zhì)的核占相對(duì)于所述納米膠囊總重量的20到60重量％之間，優(yōu)選為相對(duì)于所述納米膠囊總重量的25到50重量％之間。
有利地，可以在其中制備根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊(或分散相)的水相或分散相最初含有一定濃度的鹽，有利地為NaCl。所述濃度在4到8％之間，優(yōu)選地在4.4到5.2％之間。在合成方法的最后，向水相中加入滲透劑、冷凍防護(hù)劑或可溶防護(hù)劑和隨意地防腐劑。
事實(shí)上，申請(qǐng)人注意到該濃度的鹽有可能立刻獲得比沒有鹽時(shí)更低的相轉(zhuǎn)換溫度(或TIP)，可以在常規(guī)制備方法中(如下所述)使更多磷脂分子的塊狀結(jié)合偶聯(lián)到PEG，并且最后較大地降低得到的納米膠囊的大小。
組成所述脂質(zhì)核的脂肪物質(zhì)有可能實(shí)現(xiàn)攜帶從弱到強(qiáng)的親脂性活性成分，尤為突出是抗癌藥物質(zhì)。具體地，依據(jù)每一種活性成分的脂溶度，調(diào)節(jié)HLB來使活性成分完全溶解。本發(fā)明甚至可以使不同溶解度的活性成分的混合物傳輸，為此將要使用中間HLB，來確保每一種抗癌藥物至少部分的溶解度。
有利地，本發(fā)明目的的隱性脂質(zhì)納米膠囊含有一種或多種活性成分，特別是實(shí)質(zhì)上為親脂性的成分。
活性成分可以在納米膠囊的脂質(zhì)核里溶解或分散。
因此，可以單獨(dú)或作為混合物使用下列實(shí)質(zhì)上主要是親脂性的的抗癌活性成分紫杉醇及其例如多烯紫杉醇的衍生物、喜樹堿及其例如羥基喜樹堿、拓樸替康、魯比替康、白消安的衍生物、苯丁酸氮芥、酞菁素、類胡蘿卜素、尤其是紅必霉素。
另外，根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊還可以傳輸實(shí)質(zhì)上是兩親的抗癌活性成分，例如阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、氨甲葉酸、如5-氟二氧嘧啶或5-氟尿嘧啶核苷的氟代衍生物、尤其是阿霉素。將活性成分預(yù)先溶解在脂肪酸酯或甘油三酸脂或藥物油和可注射的脂肪物質(zhì)中。為了溶解藥物油中溶解性很差的活性成分，可以使用已被證明可用于腸道外應(yīng)用的有機(jī)輔助溶劑；然后，獲得的溶液可以混合到這些油中。由此制備的活性成分溶液可以直接在方法中使用或在甘油三酸酯混合物中在該混合物使用前作為繼發(fā)稀釋液。
最后，完全有可能實(shí)現(xiàn)任何類型活性成分，尤其是治療組織中的炎癥和感染部位的藥物的傳輸。因此，根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊尤為適合為發(fā)炎組織攜帶和傳送藥物，該膠囊具有隱形性質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)和能調(diào)整分子大小的事實(shí)。具體地，在發(fā)炎期間，例如，如觀察到的關(guān)節(jié)炎的形成，毛細(xì)管的穿孔不斷灌流發(fā)炎部位使其變大，以致于使得血液中存在的特定元素，尤其是蛋白質(zhì)的傳輸增加。對(duì)組織里的傳染部位也是一樣的。作為結(jié)果，即使在這些地方的累積的標(biāo)識(shí)少于腫瘤里的，也有可能實(shí)現(xiàn)在接近發(fā)炎或傳染位置，通過根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊釋放的合適的活性成分減少這些病理狀況的結(jié)果。因此，完全有可能通過本發(fā)明的納米膠囊實(shí)現(xiàn)抗發(fā)炎物質(zhì)的傳輸，所述抗發(fā)炎物質(zhì)為例如前列腺素E1，如布洛芬的非類固醇抗發(fā)炎物、酮丙酸、茚甲新或如氟美松的腎上腺皮質(zhì)類脂醇和抗生素，鎮(zhèn)痛劑和如兩性霉素B或酮康唑的抗傳染藥。
因此，根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊的核由脂肪相組成，其可變化的組成有可能調(diào)節(jié)納米膠囊溶解給定抗癌藥物的能力。
有利地，本發(fā)明目的的隱形脂質(zhì)納米膠囊能夠減少攜帶的活性成分的毒性(和反作用的剛度)，可以使用更多的藥物劑量，并且從而改善有效的但是高毒性的治療指數(shù)。另外，與常規(guī)抗癌藥物溶液相比較，憑借其長(zhǎng)的循環(huán)性質(zhì)和大小，根據(jù)本發(fā)明的隱形脂質(zhì)納米膠囊能夠累積，并因此增加脂肪組織中的藥物劑量。由于使用更多藥量(得益于對(duì)健康組織減少的毒性)和傳輸給脂肪組織更多藥量(得益于在腫瘤部位上特定的外滲)，預(yù)計(jì)腫瘤治療的功效有相當(dāng)大地提高。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是本發(fā)明的納米膠囊在制備藥品方面的使用，其中活性成分對(duì)健康組織的毒性減少。
本發(fā)明的一個(gè)目的是含有根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊的藥物組合物，其中包括一種或多種活性成分。有利地，這些藥物組合物是含有所述納米膠囊的膠質(zhì)水性懸浮液形式。
這樣的載體可能通過腸道外，尤其是靜脈內(nèi)或動(dòng)脈中、腹膜內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)和肌內(nèi)使用，但是也有可能實(shí)現(xiàn)通過皮下注射。事實(shí)上，皮下注射有可能到達(dá)淋巴腺內(nèi)的淋巴管，其可能確保根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊在淋巴結(jié)內(nèi)的累積。因此，這個(gè)進(jìn)入的路線對(duì)淋巴腺疾病，更特別地淋巴腺腫瘤的治療尤為重要。
1)實(shí)體和循環(huán)系統(tǒng)腫瘤的治療首先，本發(fā)明能夠用于通過血液的抗癌治療。
根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊可以用于治療人類的實(shí)體腫瘤。
另外，其可以用于治療白血病或淋巴瘤類型的循環(huán)系統(tǒng)腫瘤。事實(shí)上，如上所述，在肝或循環(huán)MPS細(xì)胞的任何捕獲之前，只有膠質(zhì)系統(tǒng)的粒子有足以促使與腫瘤細(xì)胞相遇的循環(huán)時(shí)間，從而能夠獲得循環(huán)系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞的靶向性。
依據(jù)偶聯(lián)的配體，這些納米膠囊還可以具備主動(dòng)靶向性的能力，其配體具有對(duì)位于癌細(xì)胞表面的受體類型分子的特定親和力。
有利地，本發(fā)明目的的隱形脂質(zhì)納米膠囊在其表面帶有特定配體，該配體給予納米膠囊主動(dòng)靶向細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞的能力，該細(xì)胞有對(duì)這些配體的受體。
優(yōu)選地，將選擇配體以致不會(huì)出現(xiàn)激發(fā)，或輕微激發(fā)粒子的清除現(xiàn)象。
有利地，所述配體是糖類或低聚糖類型或維生素類型，或作為另一選擇的寡肽，抗體片段或單克隆抗體類型。
有利地，糖類或低聚糖類型或維生素類型(葉酸鹽，維生素B2)，以及甚至寡肽，抗體片段或單克隆抗體類型的配體可以應(yīng)用。因此，所述配體將要預(yù)先偶聯(lián)到激活的聚乙二醇磷脂類或任何其他脂類的分子反應(yīng)端，該脂類可以包含能夠在納米膠囊表面粘附的疏水成分、PEG類的親水鏈以及在這個(gè)親水鏈的基端有活性的化學(xué)官能團(tuán)。這些配體一旦接觸到這些鏈的基端，將優(yōu)先利用如下所述的后插入技術(shù)被引入。事實(shí)上，后插入方法有可能引入特殊類型的配體或性質(zhì)不同的配體，性質(zhì)不同就是具有可以給予本發(fā)明的載體一系列特殊性質(zhì)的各種特征。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步目的是本發(fā)明的脂質(zhì)納米膠囊在藥物的制備方面的使用，所述藥物用于通過靜脈給藥對(duì)癌癥，尤其是實(shí)體或循環(huán)系統(tǒng)腫瘤進(jìn)行治療，或用于通過主動(dòng)靶向治療循環(huán)系統(tǒng)或?qū)嶓w腫瘤，或用于通過被動(dòng)靶向及其后所述經(jīng)過腫瘤毛細(xì)管的納米膠囊的外滲治療腫瘤。
2)發(fā)炎組織(尤其是關(guān)節(jié)炎)和感染組織的治療根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊的使用還可以看作治療組織傳染和/或炎癥，尤其是人類的。具體地，如上所述，在組織發(fā)炎和傳染期間，灌流區(qū)域的毛細(xì)管使發(fā)炎有增加的滲透性。與在治療實(shí)體腫瘤時(shí)的方法相同，也能使用這個(gè)暫時(shí)的滲透性，利用外滲現(xiàn)象將生物活性物質(zhì)，例如抗炎癥藥物，鎮(zhèn)痛劑或抗生素引入發(fā)炎組織，該生物活性物質(zhì)具有降低或消除病源和/或炎癥的后果能力的。因此，尤其有可能實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊活性成分的傳輸以削弱炎癥，例如傳輸抗炎藥、止痛劑或抗生素。例如關(guān)節(jié)炎的情況，也就是某一個(gè)關(guān)節(jié)發(fā)炎，優(yōu)先使用根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊的內(nèi)關(guān)節(jié)注射。這是因?yàn)檩d體對(duì)其位置的靶向性由此得到促進(jìn)，此外限制了納米膠囊的稀釋在整個(gè)血液循環(huán)里的損失。而且根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊的隱形性質(zhì)應(yīng)該可以使其不會(huì)被發(fā)炎位置上MPS的大量細(xì)胞和免疫系統(tǒng)識(shí)別和消除。
因此，本發(fā)明的進(jìn)一步目的是根據(jù)本發(fā)明的脂質(zhì)納米膠囊在用于治療炎癥和/或傳染組織的藥物制備方面的使用。
3)解毒作用有利地，本發(fā)明目的的脂質(zhì)納米膠囊可以用來在中毒情況之后，吸收存在于血液循環(huán)中的疏水性分子。
在實(shí)質(zhì)上為疏水性的活性成分的急性中毒情況之后，未加載活性成分的隱形脂質(zhì)納米膠囊可以通過靜脈內(nèi)給藥。因此，由于其長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間和疏水性脂質(zhì)核的優(yōu)點(diǎn)，根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊可以吸收存在于血液循環(huán)中的活性成分，從而減少其游離濃度，并且因而減少其毒性。因此，這些活性成分在有毒的游離濃度之下的濃度中隨著載體的降解逐步釋放。
因此，本發(fā)明的進(jìn)一步目的是本發(fā)明納米膠囊的使用可用于在中毒情況之后，吸收存在于血液循環(huán)中的疏水性分子的藥物的制備。
4)消除過濾最后，根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊的優(yōu)點(diǎn)是其能夠通過直徑為0.45μm，甚至是0.22μm的過濾器的消除過濾過程來進(jìn)行消除，在以下描述的方法中的最后冷卻步驟之后，可能發(fā)生這個(gè)步驟。事實(shí)上，申請(qǐng)人注意到根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊在懸浮液中是足以使其通過這類過濾器的固體，而不需要進(jìn)行任何主要的修改，尤其是不會(huì)失去其隱形性質(zhì)和生物降解能力。這個(gè)特征可以使所述納米膠囊易于并安全用于腸道外使用，來使其成為例如醫(yī)院和工業(yè)大量使用的載體。
5)在干燥/過濾形式里的使用根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊可以有利地進(jìn)行凍干，其后重新形成膠質(zhì)懸浮液的形式。因此，其在可以在持續(xù)時(shí)間段里易于轉(zhuǎn)化。事實(shí)上，根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊懸浮液可以在使用之前臨時(shí)重新組建形成干燥形式。這樣的凍干過程可以在上述的消除過濾步驟之后直接發(fā)生。
所述納米膠囊的凍干過程包括通過升華現(xiàn)象從制備中除去水分。然后，可以在納米膠囊懸浮液中加入例如冷凍防護(hù)劑或如甘露醇或海藻糖的溶解防護(hù)劑來進(jìn)行凍干。在這些化合物完全溶解之后，選擇的懸浮液進(jìn)行快速冷凍到大約-50℃的第一步。然后這些懸浮液通過直接經(jīng)過減壓降低溫度以水蒸氣形式的水來進(jìn)行凍干。而后，在使用前，干燥形式的納米膠囊可以以無菌形式儲(chǔ)存較長(zhǎng)時(shí)間。
6)其他應(yīng)用有可能實(shí)現(xiàn)使用根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊作為活性成分的載體來治療除腫瘤或炎癥以外類型的病癥。具體地，這個(gè)膠質(zhì)載體的性質(zhì)之一是其躲避宿主免疫系統(tǒng)，和特別是如巨噬細(xì)胞的MPS細(xì)胞的能力。因此，有可能實(shí)現(xiàn)將本發(fā)明的隱形納米膠囊用于不適合在常規(guī)載體內(nèi)應(yīng)用的機(jī)體區(qū)域內(nèi)。這樣的巨噬細(xì)胞豐富區(qū)域存在于例如肺泡和淋巴腺里。因此，有可能實(shí)現(xiàn)通過該途徑使用所述載體，為此噬菌作用和/或調(diào)理素作用構(gòu)成對(duì)藥物形式的有效性的限制。
制備納米膠囊的方法構(gòu)成根據(jù)本發(fā)明的隱形膠質(zhì)載體的納米膠囊可以有利地使用兩種方法合成。第一種方法是“常規(guī)的”，由于其經(jīng)常用于合成脂質(zhì)納米膠囊。第二種方法是申請(qǐng)人研發(fā)的，并且適合于根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊。尤其是有可能獲得多于使用常規(guī)法得到的“聚乙二醇”磷脂的結(jié)合層，并且還有可能為提供主動(dòng)靶向性而引入偶聯(lián)至配體的磷脂。這兩個(gè)方法在以下成功說明。
1)合成納米膠囊的常規(guī)方法有利的是，合成本發(fā)明的隱形膠質(zhì)載體的方法無需任何有機(jī)溶劑。而且，該方法簡(jiǎn)單、快捷，無需任何特別的材料。另外，本方法只使用允許用于注射的可生物降解的化合物，該化合物通過特別是“生物吸收”的現(xiàn)象能被生物體自然吸收。最后，按照本發(fā)明的方法有可能合成由使用者在40-200nm直徑范圍內(nèi)選擇的確定直徑的納米膠囊。調(diào)節(jié)合成的納米膠囊的尺寸使其能夠適合用于不同類型的待處理腫瘤的載體。
首先，按照本發(fā)明，油/水乳液由水、鹽、親水性表面活性劑、親脂性表面活性劑、組成所述納米膠囊的核所需的脂肪物質(zhì)、耦合到PEG分子的脂質(zhì)分子和要被納米膠囊傳送的活性成分。按照本發(fā)明，活性成分預(yù)先溶解在組成納米膠囊的核的油狀脂肪態(tài)中。
因此第一步包括稱重所有的組分，并將其在溫和攪拌例如磁性攪拌下加熱到比親脂性表面活性劑的熔化溫度更高的溫度，直至獲得均相的油/水乳液。因此當(dāng)親脂性表面活性劑為HSPC時(shí)，將該混合物首先加熱到65℃。
將該油/水乳液進(jìn)行相轉(zhuǎn)化，使之轉(zhuǎn)變成水/油乳液。為實(shí)現(xiàn)該轉(zhuǎn)化，將混合物的溫度提高到比所形成的混合物的相轉(zhuǎn)化溫度(TIP)更高的溫度T2。然后將該混合物的溫度降到溫度T1。
當(dāng)形成水/油乳液后，可選擇的，相轉(zhuǎn)化后配方的導(dǎo)電性可能會(huì)消失，但如下所述一般肉眼可見。T1為在其下所測(cè)導(dǎo)電率至少為20℃時(shí)所測(cè)量導(dǎo)電率的90-95％的溫度。T2是導(dǎo)電率消失時(shí)的溫度。
在相轉(zhuǎn)化區(qū)附近進(jìn)行至少一次介于T1和T2之間的溫度校正來重復(fù)該操作直至出現(xiàn)半透明溶液。特別地，納米膠囊形式的系統(tǒng)組織視覺反映為初始系統(tǒng)外觀上的變化，從不透明白轉(zhuǎn)變成半透明白。當(dāng)溫度降低到相轉(zhuǎn)化溫度(TIP)以下時(shí)發(fā)生該轉(zhuǎn)變。該溫度一般比TIP低6-15℃。
用于乳液的循環(huán)次數(shù)取決于形成納米膠囊所需的能量。當(dāng)溫度升高時(shí)，在油/水乳液和水/油乳液之間的相轉(zhuǎn)化導(dǎo)致導(dǎo)電率的降低，直至消失。相轉(zhuǎn)化區(qū)的平均溫度對(duì)應(yīng)于相轉(zhuǎn)化溫度(TIP)。
然后將油/水乳液驟冷以獲得穩(wěn)定的納米膠囊。該操作為在磁性攪拌下，將溫度為2℃+/-1℃的去離子水快速投到精細(xì)乳液中將乳液稀釋3-10倍。該驟冷步驟有可能將納米膠囊從乳液態(tài)提取到懸浮態(tài)，在乳液態(tài)時(shí)，形成納米膠囊的脂質(zhì)是流體，而在懸浮態(tài)時(shí)，脂質(zhì)處于更穩(wěn)定的狀態(tài)，因此結(jié)構(gòu)上更穩(wěn)定。將所獲得的顆粒攪拌5分鐘。在工業(yè)應(yīng)用中，可以通過例如使其在熱交換器系統(tǒng)上循環(huán)來進(jìn)行急劇冷卻。在該特例中，避免了制備液的稀釋。
有利的是，脂肪相為L(zhǎng)abrafaccc，親脂性表面活性劑為HSPC(加氫的大豆卵磷脂)，親水性表面活性劑為SolutolHS15。PEG的兩親衍生物為聚乙二醇化的磷脂DSPE PEG2000或-PEG5000。在該條件下，T1＝60℃，T2＝85℃，循環(huán)次數(shù)為3。
按照納米膠囊膜的組分，實(shí)質(zhì)為脂質(zhì)的親脂性表面活性劑的摩爾百分比為5-30mol％。實(shí)質(zhì)為親水性的表面活性劑的摩爾比為60-90mol％，聚乙二醇化的磷脂的摩爾比為0.5-5mol％。
所述納米膠囊的外脂質(zhì)膜的不同的組分的摩爾百分比的一個(gè)優(yōu)選例如下所示●HSPC15.46mol％●SolutolHS1581.2mol％●DSPE-PEG20003.34mol％在該例中，初始乳液的鹽的濃度為4.4％(m/m)，組成脂質(zhì)納米膠囊的核的Labrafaccc的質(zhì)量為制備液中存在的基本為脂質(zhì)的或表面活性劑的所有組分的44％(m/m)。該組組分隨后稱之為脂質(zhì)總量(除了水和氯化鈉以外的其他組分)；特別的，該術(shù)語包括聚乙二醇化的磷脂。外脂質(zhì)表面(如上述)的組分對(duì)脂質(zhì)總量的比因此為56％。
通常，組成所述納米膠囊外膜的脂質(zhì)對(duì)組成納米膠囊的脂質(zhì)總量的質(zhì)量比越高，納米膠囊越小。因此，按照本發(fā)明，在其合成時(shí)可以很容易的通過選擇合適的膜脂質(zhì)對(duì)脂質(zhì)總量的質(zhì)量比來調(diào)整納米膠囊的尺寸。
相反的，當(dāng)組成核的脂質(zhì)的比例提高時(shí)顆粒的尺寸增大。
而且，當(dāng)親水性表面活性劑的比例增大和當(dāng)(親水性和親脂性)表面活性劑的比例增大時(shí)，顆粒的尺寸下降。表面活性劑降低了界面張力因此使系統(tǒng)穩(wěn)定，促進(jìn)了小顆粒的生長(zhǎng)。特別的，界面張力越小，脂質(zhì)納米膠囊在水溶液中的懸浮液越穩(wěn)定。對(duì)固定數(shù)量的親水性和親脂性表面活性劑和脂肪酸酯，增加加入的聚乙二醇化的脂質(zhì)提高了顆粒的尺寸。可以通過選擇給定數(shù)量的SolutolHS15和DSPE-PEG(參見實(shí)施例4的

圖1)，來獲得不同的尺寸范圍和不同的聚乙二醇化的磷脂含量。
按照優(yōu)選的實(shí)施例，脂肪相為L(zhǎng)abrafaccc，實(shí)質(zhì)為脂質(zhì)的親脂性表面活性劑為HSPC(Northern Lipids)，非離子親水性表面活性劑為SolutolHS15，耦合到PEG分子的脂質(zhì)為DSPE-PEG2000。上述化合物具有下列特點(diǎn)-Labrafaccc(Gattefosse，Saint-Priest，F(xiàn)rance)。該化合物為由辛酸/癸酸中鏈甘油三酸酯(C8和C10)組成的油。其密度在20℃時(shí)為0.930-0.960。HLB指數(shù)約為1。其成分與Miglyol812N(Sasol，Germany)相同。Labrafaccc包含在用于制備注射營(yíng)養(yǎng)品的成分中。
-SolutolHS15(BASF，Ludwigshafen，Germany)。該化合物為聚(乙二醇)-660 12-羥基硬脂酸酯。因此其在配方中起親水性表面活性劑的作用?？勺⑸涫褂?對(duì)小鼠為IV LD 50＞3.16g/kg，對(duì)大鼠為1.0＜LD50＜1.47g/kg)。
-DSPE-PEG2000(Northern Lipids Inc.Vancouver，Canada)。該化合物為正-(氨基甲酰甲氧基聚(乙二醇)2000)-1，2-二硬脂酰-sn-3-磷酸乙醇胺的鈉鹽。該物質(zhì)賦予脂質(zhì)納米膠囊隱形性質(zhì)。聚(乙二醇)的長(zhǎng)鏈有可能通過其空間效應(yīng)阻止血液循環(huán)中的蛋白質(zhì)在納米膠囊的表面沉積(調(diào)理素作用)從而保護(hù)了納米膠囊的表面。其可以注射使用，并包含在脂質(zhì)體制備Doxil(Alza，Mountain View，USA)中。
初始油/水乳液的水相還可能含有4-8％的鹽，例如氯化鈉。修改鹽濃度會(huì)導(dǎo)致相轉(zhuǎn)化區(qū)的移動(dòng)。鹽濃度越高，相轉(zhuǎn)化溫度越低。該現(xiàn)象對(duì)封裝疏水熱敏性活性成分有利。該結(jié)合可在較低溫度下發(fā)生。
納米膠囊的直徑可通過調(diào)節(jié)該合成方法中起始混合物中鹽和親水性表面活性劑的比例、親脂性表面活性劑的純度來進(jìn)行有利的調(diào)節(jié)。
2)通過后插入合成隱形納米膠囊的方法有利的，作為本發(fā)明主題的隱形脂質(zhì)納米膠囊可用后插入的方法制備。
該方法包括一個(gè)預(yù)先形成缺少聚乙二醇的兩親衍生物的納米膠囊的步驟和隨后的將所述聚乙二醇的兩親性衍生物后插入到該納米膠囊表面的步驟。
根據(jù)本發(fā)明，有利的，所述預(yù)先形成步驟包括合成缺少PEG兩親性衍生物的納米膠囊，如上述的常規(guī)方法中按照數(shù)個(gè)溫度升降循環(huán)形成的油/水乳液的相轉(zhuǎn)化。
申請(qǐng)人開發(fā)的方法也無需使用任何有機(jī)溶劑，而且按照本發(fā)明，可以獲得更好的在納米膠囊表面結(jié)合“聚乙二醇化”的磷脂的產(chǎn)率。
例如，有可能獲得DSPE-PEG對(duì)膜脂質(zhì)的摩爾比大于5mol％、優(yōu)選大于10mol％的納米膠囊。該比例賦予本發(fā)明的納米膠囊良好的隱形性質(zhì)?，F(xiàn)在，按照上述常規(guī)方法很難獲得該比例。而且，通過預(yù)先形成不含PEG的納米膠囊和隨后的通過插入結(jié)合DSPE-PEG的合成方法可以很精確的調(diào)節(jié)納米膠囊的尺寸，因此通過調(diào)節(jié)兩親性衍生物的親水性鏈的比例和長(zhǎng)度使其適合待治療的腫瘤類型。除了插入較大比例的DSPE-PEG分子外，還可以設(shè)想利用該后插入技術(shù)來結(jié)合在其聚乙二醇化鏈末端含有配體的磷脂衍生物。該配體可以賦予本發(fā)明的納米膠囊主動(dòng)和特定的靶向感興趣的細(xì)胞(實(shí)體腫瘤和循環(huán)系統(tǒng)腫瘤)的性質(zhì)。因?yàn)樵诓怀^60℃的溫度下進(jìn)行，該后插入方法特別適用于熱敏性分子。
例如，基于HSPC、但缺少DSPE-PEG的納米膠囊，可以按照上述方法預(yù)先制備。
有利的，所述后插入步驟包括在聚乙二醇的兩親性衍生物存在下共培育預(yù)先形成的納米膠囊的第一步，和“驟冷”的第二步，在該步中，將所獲得的聚乙二醇的兩親性衍生物/預(yù)先形成的納米膠囊混合物急劇冷卻，以達(dá)到介于0-5℃的溫度。
例如，將水加入如上所述的含有缺少DSPE-PEG的納米膠囊的制備液中，以在容量瓶中具有精確的體積。因此，可以獲知脂質(zhì)以mg/ml計(jì)的精確濃度，基于該濃度可以計(jì)算按順序加入的DSPE-PEG2000或-PEG5000的數(shù)量，使其相對(duì)于形成本發(fā)明的脂質(zhì)納米膠囊的外膜的所有脂質(zhì)(包括DSPE-PEG)的濃度達(dá)到例如6mol％。有利的，隨后將納米膠囊的制備液和DSPE-PEG的膠束溶液分別置于并維持在60℃下15分鐘。
為避免由于相轉(zhuǎn)化現(xiàn)象造成的系統(tǒng)解體，聚乙二醇的兩親性衍生物/預(yù)先形成的納米膠囊的混合物的共培育步驟在比所述實(shí)質(zhì)為脂質(zhì)的親脂性表面活性劑的凝膠/液相轉(zhuǎn)換溫度略高、但比聚乙二醇的兩親性衍生物/預(yù)先形成的納米膠囊的混合物的相轉(zhuǎn)化溫度低的溫度下進(jìn)行。參考上述例子，注意到60℃下脂質(zhì)納米膠囊的表面流動(dòng)性更強(qiáng)，允許插入其他磷脂。將所需體積的DSPE-PEG的膠束溶液引入納米膠囊的制備液中。在60℃下培育1.5小時(shí)，每隔一刻鐘劇烈攪拌。在培育期結(jié)束時(shí)，將制備液浸入冰浴中1分鐘，以突然形成納米膠囊的膜并在該處俘獲所插入的DSPE-PEG分子。
該后插入方法獲得本發(fā)明的納米膠囊成為可能，該納米膠囊的DSPE-PEG含量高于按照常規(guī)方法有可能獲得的含量。實(shí)際上，與按照常規(guī)方法制備的納米膠囊有可能獲得的隱形性質(zhì)相比，所制備的納米膠囊在體內(nèi)顯示出更強(qiáng)的隱形性質(zhì)。
還可以在更低的溫度(37-50℃)下進(jìn)行DSPE-PEG的后插入，但需更長(zhǎng)的培育時(shí)間。因此，低溫插入方法適用于結(jié)合在其PEG鏈的末端含有例如寡肽和蛋白質(zhì)的熱敏性基團(tuán)的聚乙二醇化的磷脂的衍生物。該后一化合物可以用作制備本發(fā)明的納米膠囊的指向基團(tuán)，但允許主動(dòng)靶向腫瘤細(xì)胞。
另外，所述后插入方法還有可能引入除了DSPE-PEG分子外的PDP-PEG2000-DSPE(吡啶二硫代丙酰胺-PEG2000-DSPE)或MPB-PEG2000-DSPE(對(duì)馬來酰亞胺苯基丁芳?；?PEG2000-DSPE)類的活化磷脂(Northern Lipids，Inc.，Vancouver，Canada)，所述分子在其聚乙二醇化鏈末端含有反應(yīng)性基團(tuán)。一旦獲得本發(fā)明的納米膠囊，該反應(yīng)性基團(tuán)允許實(shí)質(zhì)為肽的和含有硫醇基團(tuán)的例如寡肽或抗體類蛋白質(zhì)的化合物進(jìn)行耦合，以賦予其主動(dòng)靶向性質(zhì)。
附圖在如下所述的實(shí)施例中，參照如下附圖圖1用HSPC制備的納米膠囊尺寸的變化，是DSPE-PEG2000的摩爾百分比的函數(shù)。
圖2用HSPC制備的缺少DSPE-PEG的納米膠囊尺寸的變化，是表面脂質(zhì)/脂質(zhì)總量的比率的函數(shù)。
圖3用后插入方法獲得的不同配方的納米膠囊尺寸的變化。
圖4用DSPE-PEG2000或DSPE-PEG5000制備的納米膠囊的配方的隱形性質(zhì)比較(血液中消失動(dòng)力學(xué))。
圖5用DSPE-PEG2000或DSPE-PEG5000、或按照現(xiàn)有技術(shù)制備的納米膠囊的不同配方的隱形性質(zhì)比較(血液中消失動(dòng)力學(xué))。
圖6用常規(guī)方法或后插入方法制備的納米膠囊的不同配方的隱形性質(zhì)比較(血液中消失動(dòng)力學(xué))。
圖7靜脈注射多烯紫杉醇(箭頭)三次后小鼠的相對(duì)平均體重的變化。數(shù)值代表平均相對(duì)體重，每組7只小鼠。
圖8投藥給小鼠(n＝7)使其體重減少15％的多烯紫杉醇的不同配方的平均天數(shù)。
圖9小鼠(n＝5)靜脈注射多烯紫杉醇加載的脂質(zhì)納米膠囊(表示為％注射的[3H]，即載體)后在C26腫瘤中脂質(zhì)納米膠囊在不同時(shí)間的累積。
圖10小鼠(n＝5)靜脈注射后在C26腫瘤中多烯紫杉醇(ng)在不同時(shí)間的累積。
A)根據(jù)常規(guī)方法的隱形納米膠囊的制備實(shí)施例在下列實(shí)施例中質(zhì)量％＝相對(duì)于制備液的總重量的質(zhì)量百分比％w/w＝相對(duì)于納米膠囊的總重量的質(zhì)量百分比mol％＝相對(duì)于納米膠囊外膜的摩爾百分比m％/env.＝相對(duì)于納米膠囊外膜的重量的質(zhì)量百分比實(shí)施例1含有DSPE-PEG2000的制備液按照常規(guī)方法，制備含有2.86mol％的DSPE-PEG2000、脂質(zhì)總量約為1克的的制備液。
將合成本發(fā)明的納米膠囊所需的成分加入20ml的閃爍管中，加入量如表1所述。
表1 通常，稱重時(shí)允許的最大變化范圍(相對(duì)于目標(biāo)值)為卵磷脂和DSPE-PEG±1.5％；親水性表面活性劑(SolutolHS15)和甘油三酸酯±0.2-0.5％；鹽±3％。加入的水的量至少與給定值相同，最多比給定值大2％。實(shí)際上，如上所述，獲得的納米膠囊的尺寸主要取決于組成顆粒的膜的脂質(zhì)的量對(duì)脂質(zhì)總質(zhì)量的比值(膜/總量)。
稱重后，將溫度逐漸升高到60℃，攪拌幾分鐘確保卵磷脂或DSPE-PEG的粒料已被分解。然后將溫度升高到80-85℃。隨后，將反應(yīng)瓶轉(zhuǎn)移到未加熱的板上，攪拌使溫度下降到60℃。可以進(jìn)行3次將溫度升高到80℃和降低到60℃的操作。在第二次升溫中，有可能觀察到相轉(zhuǎn)化現(xiàn)象(低于相轉(zhuǎn)化溫度(PIT)時(shí)，該溶液是半透明的，高于PIT時(shí)，該溶液不透明，呈乳脂狀)。
在第三個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)，當(dāng)溫度降到比在第二和第三次升溫時(shí)所觀察到的外觀發(fā)生變化的溫度低10℃時(shí)，加入一定量的1℃的冷水(12.5ml)進(jìn)行驟冷。冷卻后，攪拌5分鐘。在所引用的實(shí)施例中，外觀發(fā)生變化的溫度為75℃，制備液的最高溫度為82℃，驟冷時(shí)的溫度為62℃。
隨后，用空隙率為0.2μm的過濾器過濾制備液后可以用動(dòng)態(tài)表面光散射來分析尺寸的分布情況。作為例子所引用的制備液有可能獲得尺寸為87.5±14nm的本發(fā)明的納米膠囊。相對(duì)于表面的所有組分，DSPE-PEG2000的含量為2.86mol％。其他比例在上述表1中列出。
用該常規(guī)制備方法獲得的可能的DSPE-PEG2000的最大比例為3.34mol％。加入更多量的聚乙二醇化的磷脂會(huì)使得最后驟冷后獲得的制備液不穩(wěn)定。
實(shí)施例2含有DSPE-PEG5000的制備液按照常規(guī)方法，制備含有1.41mol％的DSPE-PEG5000、脂質(zhì)總量約為0.6克的的制備液。
除了表2中列出的使用量，其過程與上述實(shí)施例中描述的一致。
表2 在該制備中，外觀上不透明/半透明的變化在約72℃時(shí)發(fā)生，循環(huán)過程中達(dá)到的最高溫度為81℃，在低于65℃時(shí)用6ml的冰水進(jìn)行急劇冷卻。
用空隙率為0.2μm的過濾器過濾制備液后，用動(dòng)態(tài)表面光散射分析，獲得的納米膠囊的平均尺寸為63.2±9.83nm。
用該常規(guī)制備方法獲得的可能的DSPE-PEG5000的最大比例為1.49mol％。
因此，因?yàn)槠浞肿雍休^長(zhǎng)的PEG鏈，用該常規(guī)方法結(jié)合的磷脂的量將更加受到限制。
B)用后插入法制備本發(fā)明的納米膠囊的實(shí)施例實(shí)施例3按照將DSPE-PEG插入預(yù)先形成的納米膠囊的方法來制備納米膠囊表3給出了不同組分的含量的例子，使用將DSPE-PEG插入預(yù)先形成的納米膠囊的技術(shù)，有可能獲得直徑約為80nm的脂質(zhì)納米膠囊的配方。
按照常規(guī)方法制備預(yù)先形成的沒有DSPE-PEG的納米膠囊的母液。所用的量列于表3。驟冷后，將制備液轉(zhuǎn)移到容量瓶中，用蒸餾水將體積加到25ml。
表3 稱量75mg“聚乙二醇化”的磷脂，加入足量的蒸餾水形成溶液，全部溶解后，將體積精確的增加到5ml，來制備DSPE-PEG2000和DSPE-PEG5000的膠束溶液。
然后將2ml的母液分散到置于60℃水浴中的帶塞的溶血(haemolysis)試管中。將膠束溶液也置于水浴中。將脂質(zhì)納米膠囊的制備液和膠束溶液分別在60℃下預(yù)先培育15分鐘。然后，加入所需的體積以獲得理論百分比為6mol％的磷脂，該磷脂與納米膠囊的膜上的PEG分子相聯(lián)。因此，在上述給定的膠束溶液的體積和濃度下，加入532μl的DSPE-PEG2000或1108μl的DSPE-PEG5000。通過加入800μl的熱水來制備對(duì)照組。
加入上述量后，將溶液留在60℃下1.5小時(shí)，每隔一刻鐘使之渦旋。培育期后，將制備液投入冰浴中。
獲得的脂質(zhì)納米膠囊的尺寸如表4所示。
表4
在同樣條件下培育的對(duì)照制備液的顆粒尺寸接近于沒有在60℃下培育的母液中的尺寸。在DSPE-PEG存在下培育的制備液顯著提高了顆粒的平均直徑，表明已在納米膠囊的表面插入了“聚乙二醇化”的磷脂。
C)不同參數(shù)對(duì)本發(fā)明的納米膠囊尺寸的影響實(shí)施例4按照常規(guī)方法制備的納米膠囊尺寸的控制按照實(shí)施例1中所述的常規(guī)方法制造該制備液。制造該制備液使之含有約1克脂質(zhì)。圖1為親水性表面活性劑SolutolHS15的量分別為414mg(413.5±0.50)、446mg(445.85±0.01)或504mg(504.4±0.27)時(shí)，作為加入的DSPE-PEG2000的百分比的函數(shù)的納米膠囊的尺寸的變化。HSPC，Labrafaccc和NaCl的量在所有的制備液中維持恒定，分別為76mg、504.5mg和220mg。
通常，SolutolHS15的量降低時(shí)尺寸增大。在同一系列中，對(duì)于給定的SolutolHS15的量，尺寸隨著加入的DSPE-PEG百分比的提高而增加。
實(shí)施例5按照后插入方法制備的納米膠囊的尺寸的控制當(dāng)為了獲得特別長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間或要引入配體時(shí)，需要使用如實(shí)施例3所描述的后插入方法。因此，預(yù)先制備納米膠囊，該納米膠囊不含有DSPE-PEG，并且可以通過改變組成顆粒表面的所有脂質(zhì)和表面活性劑對(duì)組成制備液(表面和核)的所有的脂質(zhì)和表面活性劑的質(zhì)量比率來調(diào)節(jié)尺寸。表面脂質(zhì)/脂質(zhì)總量的比與適用于后插入方法獲得的納米膠囊尺寸的關(guān)系如圖2所示。
制備圖2所示的配方使之含有約1克脂質(zhì)。HSPC，Labrafaccc和NaCl的量恒定，與實(shí)施例4中的一致。使用的SolutolHS15的量和相應(yīng)的表面脂質(zhì)/脂質(zhì)總量的比(S/T比)如表5所示。
表5
隨后，有可能將聚乙二醇化的磷脂DSPE-PEG用后插入的方法引入，以獲得本發(fā)明的隱形納米膠囊。后插入方法按照實(shí)施例3中進(jìn)行，使得DSPE-PEG 2000或5000的最后的總的百分比為6mol％。
分別含有504、446和401mg SolutolHS15、不含DSPE-PEG的母配方(SM系列)，和為用所述后插入方法引入DSPE-PEG 2000和5000的主體的本發(fā)明的子配方的尺寸如圖3所示。
因此，插入DSPE-PEG2000使直徑平均提高7.2nm。DSPE-PEG5000對(duì)尺寸的提高更明顯，使粒子的直徑平均提高了9.1nm。
直徑的提高反映了在脂質(zhì)納米膠囊的表面已有效地插入了聚乙二醇化的磷脂，在此基礎(chǔ)上，并且已知不含PEG的納米膠囊的尺寸的變化是表面/總的脂質(zhì)的量比率的函數(shù)(圖2)，按照本發(fā)明，有可能調(diào)節(jié)納米膠囊的尺寸，以促進(jìn)通過存在于特殊腫瘤毛細(xì)管的內(nèi)皮上的穿孔的外滲。
D)在活體中用本發(fā)明的隱形納米膠囊進(jìn)行的清除實(shí)驗(yàn)的結(jié)果實(shí)施例6載體的消失動(dòng)力學(xué)(PEG2000/PEG5000的對(duì)比數(shù)據(jù))用在3.34mol％的DSPE-PEG2000(“2k-3.34”曲線)和1.41mol％的DSPE-PEG5000(“5k-1.41”)之間的對(duì)比研究來評(píng)價(jià)本發(fā)明的納米膠囊的血液清除。該配方用實(shí)施例1和2中所述的常規(guī)方法制備。
為此，將本發(fā)明的納米膠囊的溶液靜脈注射到雄性大鼠(Sprague-Dawley，325g)中，比例為每一配方物4只大鼠。選擇脂質(zhì)的注射劑量，使之約小于可能會(huì)開始發(fā)生“飽和MPS”現(xiàn)象的劑量的10倍(由于清除超限的能力，這可能會(huì)造成持續(xù)的循環(huán)時(shí)間)。因此，將含有脂質(zhì)總量為2mg、體積為400μl的納米膠囊的溶液注入每只大鼠中。
用氚示蹤的放射性示蹤劑[3H]-膽固醇十六碳烷基酯預(yù)先標(biāo)記本發(fā)明的納米膠囊，該示蹤劑為不可交換的標(biāo)記物。放射性標(biāo)記的劑量為每只大鼠3微居里(μCi)。注射納米膠囊后，在5、15和30分鐘、以及1、2、4、8、12和24小時(shí)取9個(gè)連續(xù)的血液樣本。
將血液樣本在Soluene 350(Canberra Packard，Mississauga，Canada)存在下在50℃消化1個(gè)小時(shí)。消化后，血液樣本用30％的過氧化氫水溶液去色。加入閃爍流體Hionic Fluor(Canberra)，將樣本留置過夜。用閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)算的放射性來分析血液中存在的標(biāo)記的納米膠囊在不同時(shí)間的量。分析對(duì)照可以確定相對(duì)于100％劑量的dpm(每分鐘的分解量)。大鼠中的血液總量為75ml/kg。因此，可以將結(jié)果表示為全部注射的劑量的百分比。本實(shí)驗(yàn)中獲得的血液圖概括在圖4中。
表6列出了用常規(guī)方法引入到所述脂質(zhì)納米膠囊的外膜的DSPE-PEG的名稱、平均尺寸和摩爾百分比。
所使用的命名表達(dá)了PEG組分的摩爾質(zhì)量(對(duì)2000或5000為2k，5k)和DSPE-PEG相對(duì)于所有表面脂質(zhì)的摩爾百分比。
表6使用的配方的描述
結(jié)果表明本發(fā)明的納米膠囊的原生質(zhì)半衰期對(duì)基于3.34mol％的DSPE-PEG2000和基于1.41mol％的DSPE-PEG5000的膠囊均在2-3小時(shí)之間。但重要的是，DSPE-PEG5000鏈提供了更強(qiáng)的隱形效果。特別的，由于納米膠囊表面的比DSPE-PEG2000的摩爾數(shù)小兩倍多的摩爾數(shù)，與質(zhì)量為2000g/mol的鏈所賦予的相比，較長(zhǎng)的PEG鏈實(shí)際上提供了更好的保護(hù)效果。
實(shí)施例7本發(fā)明的納米膠囊與現(xiàn)有技術(shù)中的納米膠囊的對(duì)比研究進(jìn)行了與實(shí)施例6類似、目的在于比較本發(fā)明的脂質(zhì)納米膠囊和現(xiàn)有技術(shù)中專利No.WO01/64328中的脂質(zhì)納米膠囊在血液中的消失速度的研究。配方1-4獲得的結(jié)果是在與圖4所給出的相同的條件下獲得的。下邊簡(jiǎn)述該配方，所獲得的數(shù)據(jù)如圖5所示。該圖為了對(duì)比，也包括了由Stolnik等(僅在血液動(dòng)力學(xué)3小時(shí)時(shí)獲得)和Cahouet等獲得的數(shù)據(jù)。
配方1在專利No.WO01/64328中描述的常規(guī)納米膠囊親脂性表面活性劑為L(zhǎng)ipoidS75-3，其不是純的卵磷脂(70％的磷脂酰膽堿)，顆粒中缺少PEG；配方2基于LipoidS75-3的納米膠囊，但含有按照常規(guī)方法引入的DSPE-PEG2000(1.65mol％)；配方3基于HSPC(＞99％的磷脂酰膽堿)和DSPE-PEG5000(1.41mol％)的納米膠囊，基于按照常規(guī)方法引入PEG5000的本發(fā)明的納米膠囊；配方4納米膠囊-DSPE-PEG2000(3.34mol％)，基于PEG2000的本發(fā)明的納米膠囊，按照常規(guī)方法能引入的HSPC的最大量；FSStolnik配方比例為13∶5(PEG組分的摩爾質(zhì)量為2000g/mol)的PLA-PEG膠束，其直徑為75nm。最佳配方的數(shù)值從已公開的文章中獲得(Stolnik等人.，J.Drug Target，9361，2001)。該數(shù)據(jù)也可以通過將一定量的、不會(huì)飽和MPS的納米膠囊靜脈注射到大鼠中獲得。
NL A.A.現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)的納米膠囊的配方。該數(shù)據(jù)從由Cahouet等人.(Int.J.Pharm.242367 2002)的研究中獲得。該數(shù)據(jù)也可以通過將由上述作者制備的按照專利No.WO01/64328記述的基于LipoidS75-3的配方的脂質(zhì)納米膠囊靜脈注射(未知?jiǎng)┝?到大鼠中獲得。
配方1和2分別代表了常規(guī)納米膠囊的配方，該納米膠囊的表面含有LipoidS75-3(含有雜質(zhì)的卵磷脂)，該納米膠囊的表面還含有1.65mol％的DSPE-PEG2000。該水平接近能引入到按照常規(guī)方法制備的含有LipoidS75-3的納米膠囊的最大含量。配方4的DSPE-PEG2000的含量也為按照傳統(tǒng)方法的最大值。沒有雜質(zhì)和均一的磷脂酰膽堿HSPC有可能將該含量的DSPE-PEG引入按照本發(fā)明的納米膠囊中(實(shí)踐上為L(zhǎng)ipoidS75-3的兩倍)。
結(jié)果表明與現(xiàn)有技術(shù)中從血液區(qū)室中被快速清除的脂質(zhì)納米膠囊(配方1，如專利No.WO01/64328中所述)相比，本發(fā)明的納米膠囊(配方3和4)顯示了明顯較低的清除。因此，對(duì)配方1，一小時(shí)后只有10％的注入劑量仍存在于血液中?，F(xiàn)有技術(shù)中的納米膠囊因此顯示出沒有隱形性質(zhì)。而且，將DSPE-PEG2000引入現(xiàn)有技術(shù)中的納米膠囊(配方2)只是略微提高了其在血液循環(huán)中的存留其半衰期時(shí)間也小于一小時(shí)。實(shí)際上，相對(duì)于配方1的AUCs(在5分鐘和20小時(shí)之間的曲線下面積)的提高(AUC配方X/AUC配方1)分別為配方21.09配方32.31配方42.68而且，如現(xiàn)有技術(shù)中所述，按照專利No.WO01/64328的納米膠囊曾經(jīng)是由Cahouet等人.進(jìn)行的大鼠體內(nèi)研究的主體。從血液中清除該納米膠囊的動(dòng)力學(xué)顯示的圖(配方NL A.A.，圖5)，稍好于配方1所獲得的，與配方2的相類似，可能是由于注射劑量的不同(NL A.A.未知?jiǎng)┝?。Cahouet等人.(NL A.A.)的納米膠囊的半衰期小于一小時(shí)(準(zhǔn)確的為45分鐘)。申請(qǐng)人從配方1中獲得的圖因此與現(xiàn)有技術(shù)的研究中所給出的相對(duì)類似。該兩組對(duì)照配方不含有大于1000g/mol的任何PEG鏈，顯示短PEG鏈在賦予保護(hù)免于從血液循環(huán)中快速清除方面SolutoHS15(660g/摩爾)的無效性。因此，該兩組配方?jīng)]有顯示出任何的隱形性質(zhì)或持續(xù)的循環(huán)(第2小時(shí)時(shí)10％的注入劑量)，在評(píng)價(jià)載體的組成的修改時(shí)(使用具有高磷脂酰膽堿的卵磷脂)，尤其是加入長(zhǎng)PEG碳，可以認(rèn)為沒有隱形性。
圖5也為由Stolnik等人.(Legend FS)的出版物給出的現(xiàn)有技術(shù)中的數(shù)據(jù)。他們的PLA-PEG膠束的配方顯示了隱形性質(zhì)，兩小時(shí)后血液中仍存在略小于40％的注入劑量。但是，該膠質(zhì)制備液的隱形性質(zhì)小于本發(fā)明的納米膠囊，后者的配方3(DSPE-PEG5000)和配方4(DSPE-PEG2000)第2小時(shí)后有超過50％和超過60％的注入劑量?？梢钥闯霰景l(fā)明(配方3和4)的納米膠囊在注射后前4個(gè)小時(shí)內(nèi)在血液循環(huán)中存在的比例明顯高于現(xiàn)有技術(shù)中的隱形納米顆粒(配方FS)，將會(huì)有利地提高容易到達(dá)實(shí)體和/或循環(huán)系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞的載體數(shù)量，因此提高了治療成功的機(jī)會(huì)。
實(shí)施例8后插入方法提供的隱形性質(zhì)的增強(qiáng)用4個(gè)不同的配方在與前述研究中相同的條件下進(jìn)行體內(nèi)研究。因此，為評(píng)價(jià)后插入方法的優(yōu)點(diǎn)，申請(qǐng)人將按照所述后插入方法制備的三個(gè)配方的隱形性質(zhì)與按照常規(guī)方法制備的最佳配方的隱形性質(zhì)相比較。該體內(nèi)研究的主題的4個(gè)配方如下配方2k-3.34納米膠囊-HSPC-PEG2000(3.34mol％)，基于PEG2000的本發(fā)明的納米膠囊，按照常規(guī)方法的能被引入到HSPC的最大量。該配方相當(dāng)于實(shí)施例7中的配方4，將其注入一組新的4只大鼠中；配方2k-6％基于HSPC的納米膠囊，該納米膠囊為按照后插入方法將相當(dāng)于本發(fā)明的納米膠囊表面脂質(zhì)總量的6mol％的DSPE-PEG2000引入的主題，如實(shí)施例3中詳述；配方5k-6％基于含有HSPC的同樣的母配方的納米膠囊，采用制備配方為2k-6％的納米膠囊的方法制備，但其目的為用后插入方法引入DSPE-PEG5000；配方2k-10％基于含有HSPC的同樣的母配方的納米膠囊，采用制備配方為2k-6％的納米膠囊的方法制備根據(jù)本發(fā)明的納米膠囊，但其目的為使用后插入方法引入10mol％的DSPE-PEG5000。
上述三個(gè)配方從血液中清除所獲得的結(jié)果如圖6所示。
圖6中的數(shù)據(jù)顯示出后插入方法的優(yōu)點(diǎn)。具體來說，所述后插入方法有可能獲得本發(fā)明的納米膠囊，其隱形性質(zhì)明顯高于按照傳統(tǒng)方法制備的本發(fā)明的納米膠囊。而且，該研究也顯示出本發(fā)明的納米膠囊的隱形性質(zhì)隨著時(shí)間變化的穩(wěn)定性和守恒性。配方2k-3.34在3個(gè)月前制備，并于本研究中再次注入。獲得的圖是可比較的(在第4小時(shí)末發(fā)現(xiàn)略高于注入劑量的22％，如圖4)。圖6中的配方顯示出顯著的隱形性質(zhì)。對(duì)照納米膠囊(沒有DSPE-PEG)或(前述實(shí)施例中和現(xiàn)有技術(shù)研究中的配方1)的配方在兩小時(shí)后顯示出小于10％的殘留劑量。
后插入方法有可能引入的DSPE-PEG的量大于按照常規(guī)方法引入的量，如圖6的血液圖所示，這可以提高制備液的循環(huán)時(shí)間，并將其用于在注射后前12小時(shí)內(nèi)需要血液中有較大納米膠囊比例的應(yīng)用中。因此，按照所述后插入方法制備的配方都顯示出在第4小時(shí)末約為60％的注入劑量。8小時(shí)后，配方2k-6％的納米膠囊的殘留劑量超過18％。比例相同但含有較長(zhǎng)PEG鏈(DSPE-PEG5000)的6mol％DSPE-PEG有可能在第8小時(shí)獲得高于40％的注入劑量。當(dāng)引入更多的DSPE-PEG2000直至10mol％時(shí)，有可能獲得略高于配方5k-6％的圖，在第8小時(shí)時(shí)有50％的注入劑量。按照后插入方法制備的本發(fā)明的納米膠囊的配方的隱形性質(zhì)因此很明顯的高于文獻(xiàn)中記述的“隱形”固體納米顆粒所觀察到的隱形性質(zhì)。
E)加載了抗癌藥物的隱形納米膠囊的制備實(shí)施例實(shí)施例9紫杉醇和多烯紫杉醇隱形脂質(zhì)納米膠囊的制備可以將紫杉醇和多烯紫杉醇按照常規(guī)方法引入脂質(zhì)納米膠囊中，獲得的藥物加載的納米膠囊可以通過后插入方法進(jìn)行聚乙二醇化以提供隱形性質(zhì)。
將藥物在75C下溶解在甘油三酸酯中以制備用于形成脂質(zhì)納米膠囊的內(nèi)核的紫杉醇或多烯紫杉醇的甘油三酸酯溶液。調(diào)節(jié)藥物的量，使得獲得的溶液在冷卻到室溫時(shí)不會(huì)再結(jié)晶。對(duì)于紫杉醇和多烯紫杉醇，具有短烷基鏈的甘油三酸酯比具有長(zhǎng)烷基鏈(C＞8)的甘油三酸酯顯示出更好的溶解性。其C8酯成分不同的紫杉醇和多烯紫杉醇的甘油三酸酯溶液列于表7中。
表7紫杉醇和多烯紫杉醇的甘油三酸酯溶液
*獲得的甘油三酸酯溶液中藥物的重量百分比表7表明具有較高C8酯含量的甘油三酸酯(即甘油基三辛酸酯＝三辛酸甘油酯)溶解了更多的紫杉醇或多烯紫杉醇。三辛酸甘油酯為純粹的C8化合物，是該兩種藥物的最佳溶劑。6％或更小的紫杉醇的三辛酸甘油酯溶液和7％或更小的多烯紫杉醇的三辛酸甘油酯溶液在室溫下可以保存很長(zhǎng)時(shí)間。
例如，6％的多烯紫杉醇的三辛酸甘油酯溶液的組成如下-三辛酸甘油酯 552.0mg-多烯紫杉醇 35.3mg6％的多烯紫杉醇的三辛酸甘油酯溶液在25℃下能穩(wěn)定數(shù)月。
不含有DSPE-PEG的藥物加載的脂質(zhì)納米膠囊，可以用常規(guī)方法從紫杉醇或多烯紫杉醇的三辛酸甘油酯溶液中制備。當(dāng)用6％的紫杉醇的三辛酸甘油酯溶液或7％的多烯紫杉醇的三辛酸甘油酯溶液來制備脂質(zhì)納米膠囊時(shí)，分別在10天或118天出現(xiàn)藥物晶體。這種不穩(wěn)定的現(xiàn)象是由于該三辛酸甘油酯的溶液已接近飽和。降低三辛酸甘油酯中藥物的量可以提高藥物加載的脂質(zhì)納米膠囊制備液的穩(wěn)定性。在25℃或5℃時(shí)用5％的紫杉醇的三辛酸甘油酯溶液制備的脂質(zhì)納米膠囊能穩(wěn)定32天，用6％的多烯紫杉醇的三辛酸甘油酯溶液制備的脂質(zhì)納米膠囊能穩(wěn)定至少7個(gè)月。
用5％的紫杉醇或6％的多烯紫杉醇的“三辛酸甘油酯溶液”制備的紫杉醇或多烯紫杉醇加載的脂質(zhì)納米膠囊可以具有下列組成-HSPC 75mg
-SolutolHS 15400mg-“三辛酸甘油酯溶液”504mg-NaCl 220mg-水qs ad 5000mg藥物加載的納米膠囊具有下列特點(diǎn)(表8)。
表8藥物加載的脂質(zhì)納米膠囊的特點(diǎn)
優(yōu)選多烯紫杉醇，因?yàn)槠浔茸仙即季哂懈玫乃幬锛虞d性和增強(qiáng)的穩(wěn)定性。但是，2％w/w紫杉醇脂質(zhì)納米膠囊能穩(wěn)定數(shù)月。3.09％w/w(“3％”)的多烯紫杉醇脂質(zhì)納米膠囊的穩(wěn)定性在25℃時(shí)大于7個(gè)月。
然后，用原藥加載的脂質(zhì)納米膠囊的制備液按照實(shí)施例3中所述的后插入方法制備藥物加載的隱形脂質(zhì)納米膠囊。簡(jiǎn)要的說，獲得的藥物加載的脂質(zhì)納米膠囊的制備液最多為25mL。其中的2mL用于與DSPE-PEG膠束溶液(見表9)培育(預(yù)培育15分鐘，然后在60℃下培育90分鐘)；在后插入時(shí)間結(jié)束時(shí)將制備液在冰浴中冷卻。作為本發(fā)明目的的在DSPE-PEG后插入后獲得的藥物加載的脂質(zhì)納米膠囊能穩(wěn)定幾個(gè)月(沒有觀察到引入的藥物的再結(jié)晶或者尺寸的明顯變化)。幾個(gè)DSPE-PEG后插入的用3.5％多烯紫杉醇加載的脂質(zhì)納米膠囊如表9所示。
表93.5％多烯紫杉醇(w/w)隱形脂質(zhì)納米膠囊的特定
*含有3.5％多烯紫杉醇的脂質(zhì)納米膠囊(LN)，在沒有后插入的同樣的條件下培育在任一制備中都沒有發(fā)生多烯紫杉醇的再結(jié)晶。與對(duì)照制備液相比直徑的顯著提高反映了DSPE-PEG在多烯紫杉醇加載的脂質(zhì)納米膠囊表面的有效插入。
F)加載抗癌藥物的本發(fā)明的隱形納米膠囊在體內(nèi)進(jìn)行的毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例10多烯紫杉醇加載的納米膠囊對(duì)Taxotere在健康小鼠中的毒性評(píng)價(jià)用不同的配方來評(píng)價(jià)不同劑量的多烯紫杉醇在小鼠中的毒性?？梢酝ㄟ^測(cè)量小鼠在靜脈注射配方后體重的減輕來評(píng)價(jià)抗癌藥物的毒性。多烯紫杉醇用商業(yè)可得的溶液Taxotere(Aventis)*、或配方的非聚乙二醇化的脂質(zhì)納米膠囊(LN)和隱形脂質(zhì)納米膠囊(S-LN)注射。
*Taxotere為多烯紫杉醇在聚山梨醇酯80、乙醇和水中的溶液。
按照實(shí)施例9中所述的方法制備脂質(zhì)納米膠囊和隱形脂質(zhì)納米膠囊，已獲得3％w/w的多烯紫杉醇的加載量。該制備液在25℃下能穩(wěn)定7個(gè)多月，具有下列特點(diǎn)(表10)。
表103％w/w多烯紫杉醇加載的LN或S-LN的特點(diǎn)
*使用6％w/w的多烯紫杉醇的三辛酸甘油酯溶液將多烯紫杉醇的配方(Taxotere，非聚乙二醇化的3％w/w的多烯紫杉醇加載的納米膠囊和3％w/w的多烯紫杉醇加載的DSPE-PEG2000-6mol％的納米膠囊)用生理鹽水稀釋，并以20、40和60mg/kg多烯紫杉醇注射。由于可注射的多烯紫杉醇溶液的高毒性，Taxotere沒有研究60mg/kg的劑量。將該多烯紫杉醇的配方施于8組小鼠，加入另外一個(gè)注入生理鹽水的對(duì)照組(表11)。
表11用于毒性研究的配方和劑量
在體重為17-20克的健康雌性BALB/c小鼠上進(jìn)行毒性研究(每配方7只小鼠，8個(gè)配方和1個(gè)對(duì)照)。給小鼠施予250μl的給定配方(或?qū)τ趯?duì)照組，為生理鹽水的溶液)作為單個(gè)靜脈劑量。首次注射(D0)之前的小鼠體重定義為參考體重。在0天(D0)、5天(D5)和10天(D10)對(duì)小鼠投藥3劑。每天稱重和檢查小鼠的明顯的有害反應(yīng)，達(dá)到D28和在D30、D33和D40。
圖7顯示了9組小鼠的相對(duì)體重(D/D0)的變化(沒有繪出誤差線；所有的RSD＜2.4％)。所有的多烯紫杉醇配方都引起了體重減輕，并且體重減輕隨著劑量的增加而增加。對(duì)照組(Ctrl)顯示出體重的增加。TXT-40組在D10第三次注射前中斷，因?yàn)橛?只動(dòng)物的后腿出現(xiàn)萎縮和癱瘓。TXT-40組的動(dòng)物在第10天死亡，因?yàn)樗麄兊捏w重已經(jīng)減輕了15％，因此不能再忍受第3次注射。
加載到LN或S-LN的20mg/kg的多烯紫杉醇比多烯紫杉醇的Taxotere溶液(P＜0.05，學(xué)生測(cè)試)在最低點(diǎn)(D23)引起了更低的體重減輕(b.w.l.)。而且，40mg/kg劑的多烯紫杉醇的Taxotere(TXT-40)顯示出高毒性，在9.7天b.w.l.達(dá)到1 5％；該b.w.l.高于LN-40和S-LN-40的相應(yīng)劑量，甚至高于60mg/kg的劑量(LN-60和S-LN-60)。為比較配方的毒性效果，觀察了b.w.l.為10％和15％的天數(shù)，分別在表12和圖8中所示。
表12小鼠(n＝7)體重減輕10％對(duì)應(yīng)的平均天數(shù)和接受的多烯紫杉醇的累積劑量
表12和圖8顯示出在相同劑量時(shí)，Taxotere配方比納米膠囊配方能更快的引起體重減輕。TXT-40組發(fā)生15％b.w.l.都明顯快于任何LN-40和S-LN-40或LN-60和S-LN-60配方(t檢驗(yàn)P＜0.05)。
總之，與同樣劑量、靜脈給藥的商業(yè)溶液Taxotere相比，在脂質(zhì)納米膠囊或隱形脂質(zhì)納米膠囊中封入多烯紫杉醇能有效地減小該抗癌劑的毒性。而且，發(fā)現(xiàn)給藥累積劑量為80mg/kg的Taxotere(2×40)具有高毒性和嚴(yán)重的副作用，卻有可能施加更高劑量的在LN或S-LN中的多烯紫杉醇，即180mg/kg(3×60)，其在最低點(diǎn)時(shí)b.w.l.小于20％，而且在最后一劑的幾個(gè)星期后體重增加。因此，當(dāng)將藥物配制在脂質(zhì)納米膠囊或隱形脂質(zhì)納米膠囊中，有可能施予更高劑量的多烯紫杉醇，或觀察到較輕的毒性。
G)用抗癌藥物加載的本發(fā)明的隱形納米膠囊在荷瘤小鼠進(jìn)行的體內(nèi)分解研究的結(jié)果實(shí)施例11在荷C26瘤的小鼠進(jìn)行的多烯紫杉醇加載的納米膠囊對(duì)Taxotere的腫瘤累積使用由3％w/w多烯紫杉醇加載的DSPE-PEG2000-6mol％隱形脂質(zhì)納米膠囊(S-LN)的配方、非聚乙二醇化的3％w/w脂質(zhì)納米膠囊(LN)的配方和商業(yè)的多烯紫杉醇溶液Taxotere(TXT)之間的對(duì)比研究來評(píng)價(jià)抗癌藥物加載的本發(fā)明的隱形脂質(zhì)納米膠囊的腫瘤累積。
配方的制備用實(shí)施例10(表10)中所述的相同的組分和相同的相對(duì)比例根據(jù)常規(guī)方法和后插入方法來制備多烯紫杉醇加載的LN和S-LN。所有的納米膠囊配方都用[3H]-膽固醇十六碳烷基醚(來跟蹤納米膠囊)和[14C]-多系紫杉醇(來跟蹤藥物)放射性標(biāo)記。三個(gè)配方LN、S-LN和TXT都用生理鹽水稀釋，以多烯紫杉醇為1mg/kg的劑量(150μl)注射。納米膠囊組接受了0.7μCi的[3H]和0.μuCi的[14C]，Taxotere小鼠被注入了0.35uCi的[14C]。
荷C26瘤的小鼠在荷大腸癌26(C26)瘤的雌性BALB/c(17-20克)小鼠上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在移入腫瘤前，將小鼠背部的毛刮掉并化學(xué)去毛。通過皮下注射懸浮在50μl生長(zhǎng)介質(zhì)中的2×106細(xì)胞，在每一個(gè)小鼠的背部移入三個(gè)C26腫瘤。細(xì)胞接種后10天腫瘤直徑平均達(dá)到8mm(5-10mm)時(shí)，對(duì)小鼠進(jìn)行測(cè)試。將荷瘤小鼠匯集成3組(LN，S-LN和TXT)，并皮下注射相當(dāng)于1mg/kg多烯紫杉醇劑量的150μl的配方。注射后動(dòng)物(n＝5)在2、6和12小時(shí)后死亡。
治療前稱量腫瘤。在Soluene350存在下消化腫瘤，用30％過氧化氫漂白，如實(shí)施例6中所述將閃爍液體加入獲得的溶液中。分別通過用閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)算[3H]和[14C]的放射性來評(píng)價(jià)腫瘤中納米膠囊和多烯紫杉醇的量。
評(píng)價(jià)不同時(shí)間的腫瘤累積圖9顯示了腫瘤中脂質(zhì)納米膠囊(LN)和隱形脂質(zhì)納米膠囊(S-LN)在不同時(shí)間時(shí)的累積。由于較長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間和隱形性質(zhì)，3％w/w多烯紫杉醇加載的DSPE-PEG2000-6mol％的本發(fā)明的脂質(zhì)納米膠囊，與3％w/w多烯紫杉醇加載的常規(guī)脂質(zhì)納米膠囊相比，隨時(shí)都顯示出較高的腫瘤累積(P＜0.05，學(xué)生測(cè)試)。給藥后12小時(shí)腫瘤中S-LN的量比常規(guī)LN中的高至少3倍。
圖10表示脂質(zhì)納米膠囊(LN)、隱形脂質(zhì)納米膠囊(L-SN)和參考的商業(yè)配方Taxotere(TXT)在腫瘤中累積的多烯紫杉醇的量。用單因子方差分析來計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(給定時(shí)間的配方之間和給定配方的不同時(shí)間之間)。當(dāng)認(rèn)為P值較大時(shí)(P＜0.05)，用事后Scheffe測(cè)試來比較多對(duì)的平均值。靜脈給藥2個(gè)小時(shí)后，三個(gè)配方的在腫瘤中累積的多烯紫杉醇的量沒有明顯差異(P＝0.954)。給藥6個(gè)小時(shí)后，S-LN配方的在腫瘤中累積的多烯紫杉醇的量明顯高于TXT的。給藥12個(gè)小時(shí)后，可以注意到更大的差別盡管TXT和LN的多烯紫杉醇的量沒有明顯區(qū)別，S-LN比LN或TXT使得更多的多烯紫杉醇釋放到腫瘤中(但TXT和LN在腫瘤中的多烯紫杉醇的量并沒有令人滿意的區(qū)別)。每個(gè)配方的數(shù)據(jù)分析表明作為TXT配方給藥的多烯紫杉醇的量不隨時(shí)間變化(P＝0.995)。常規(guī)LN給藥的多烯紫杉醇在腫瘤中的量隨時(shí)間略有提高，但沒有統(tǒng)計(jì)顯著性(P＝0.069)。但是，對(duì)于加載多烯紫杉醇的本發(fā)明的S-LN，腫瘤中多烯紫杉醇的量隨時(shí)間顯著提高。
總之，當(dāng)施予相同劑量時(shí)，加載多烯紫杉醇的本發(fā)明的脂質(zhì)納米膠囊比商業(yè)的多烯紫杉醇的溶液(Taxotere)在腫瘤中累積更多。而且，申請(qǐng)人注意到藥物加載的本發(fā)明的隱形脂質(zhì)納米膠囊，由于其長(zhǎng)循環(huán)性質(zhì)，在靶向腫瘤位置的抗癌劑的量的方面比常規(guī)的脂質(zhì)納米膠囊更有效。
權(quán)利要求
1.主要由脂質(zhì)核和外脂質(zhì)膜構(gòu)成的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中脂質(zhì)核在室溫為液態(tài)或半液態(tài)，而且脂質(zhì)膜包括至少一種實(shí)質(zhì)上為脂質(zhì)的親水性表面活性劑、至少一種實(shí)質(zhì)上為脂質(zhì)的親脂性表面活性劑和至少一種聚乙二醇的兩親衍生物，其中的聚乙二醇組分摩爾質(zhì)量大于或等于1000g/mol。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中的聚乙二醇組分摩爾質(zhì)量大于或等于2000g/mol。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中所述的親脂性表面活性劑是卵磷脂，其磷脂酰膽堿比例至少等于95％，優(yōu)選高于99％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中所述的親脂性表面活性劑具有至少等于25℃的凝膠/液態(tài)轉(zhuǎn)換溫度，優(yōu)選高于37℃。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中所述的親脂性表面活性劑為含有至少16個(gè)碳原子的酰基鏈的磷脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中所述的親脂性表面活性劑選自HSPC(氫化大豆磷脂酰膽堿)、DSPC(二硬脂酰磷脂酰膽堿)和DPPC(二棕櫚酰磷脂酰膽堿)、及其混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中所述的親脂性表面活性劑占構(gòu)成所述外脂質(zhì)膜的分子的5-30mol％之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中所述的親水性表面活性劑選自聚乙二醇烷基酯和聚乙二醇烷基醚，及其混合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中所述的親水性表面活性劑是含有15個(gè)聚乙二醇單元鏈的聚乙二醇-660 12-羥基硬脂酸類非離子表面活性劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9任一所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中所述的親水性表面活性劑在所述外脂質(zhì)膜中占分子的60至90mol％之間，優(yōu)選80mol％。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10任一所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中所述的聚乙二醇的兩親衍生物包括可以粘附在所述外脂質(zhì)膜里的疏水性成分和朝向所述外脂質(zhì)膜，且在其表面提供親水性質(zhì)的聚乙二醇類的親水性成分。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11任一所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中所述的聚乙二醇的兩親衍生物選自可生物降解的磷脂質(zhì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中所述可生物降解的磷脂質(zhì)選自DPPE-PEGx(二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺)、DSPE-PEGx(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)、DOPE-PEGx(二油?；字Ｒ掖及?，和POPE-PEGx(棕櫚酰磷脂酰乙醇胺)，其中x大于或等于1000g/mol，及其混合物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中所述可生物降解的磷脂質(zhì)選自DSPE-PEG2000、DSPE-PEG3000和DSPE-PEG5000，及其混合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14任一所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中所述的聚乙二醇的兩親衍生物占構(gòu)成所述外脂質(zhì)膜的分子的0.5至12mol％之間，優(yōu)選1至10mol％之間。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15任一所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中所述主要的脂質(zhì)核占所述納米膠囊總重量的20至60重量％之間，優(yōu)選為所述納米膠囊總重量的25至50重量％之間。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16任一所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中所述主要的脂質(zhì)核由脂肪酸酯和/或甘油三酸酯和/或油類，和/或其混合物組成。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中構(gòu)成所述主要的脂質(zhì)核的甘油三酸酯選自帶有6至14個(gè)碳原子的中鏈甘油三酸酯、辛酸/癸酸甘油三酯、及其混合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中構(gòu)成所述主要的脂質(zhì)核的脂肪酸酯選自具有8至18個(gè)碳原子的中鏈脂肪酸酯。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中構(gòu)成所述主要的脂質(zhì)核的脂肪酸脂選自乙基棕櫚酸酯、乙基油酸酯、乙基肉豆蔻酸酯、異丙基肉豆蔻酸酯、辛基月桂酰肉豆蔻酸酯、及其混合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至20任一所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其直徑在50至150nm之間，優(yōu)選在80至120nm之間。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至21任一所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中所述外脂質(zhì)膜的外表面是實(shí)質(zhì)上親水性的，主要的脂質(zhì)核是實(shí)質(zhì)上親脂性的。
23.根據(jù)權(quán)利要求1至22任一所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，在其表面上帶有特定配體，該配體為其提供主動(dòng)靶向帶有接收這些配體的受體的細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞的能力。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中所述配體選自糖類、低聚糖、維生素、低聚肽、抗體片段和單克隆抗體類型。
25.根據(jù)權(quán)利要求1至24中任一所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，在其投藥到的宿主的血液區(qū)室中有至少2個(gè)小時(shí)的半衰期。
26.根據(jù)權(quán)利要求1至25中任一所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，能夠通過生物降解，尤其是通過酶消化快速釋放其大多數(shù)內(nèi)含物。
27.根據(jù)權(quán)利要求1至26中任一所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，包含一種或多個(gè)活性成分。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，包含一種或多種實(shí)質(zhì)上主要是親脂性的抗癌活性成分。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中所述抗癌活性成分選自紫杉醇及其例如多烯紫杉醇的衍生物、喜樹堿及其例如羥基喜樹堿、拓樸替康、魯比替康、白消安的衍生物、苯丁酸氮芥、酞菁素、類胡蘿卜素和紅必霉素。
30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，包含一種或多種實(shí)質(zhì)上是兩親的抗癌活性成分。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中所述抗癌活性成分選自阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺、氨甲葉酸、如5-氟二氧嘧啶或5-氟尿嘧啶核苷的氟代衍生物和阿霉素。
32.根據(jù)權(quán)利要求27所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，包含一種或多種選自抗炎藥、腎上腺皮質(zhì)類脂醇、抗生素、鎮(zhèn)痛劑和抗感染劑的活性成分。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的隱形脂質(zhì)納米膠囊，包含氟美松、茚甲新、布洛芬、酮丙酸、酮康唑、前列腺素E1或兩性霉素B。
34.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1至33任一所述的納米膠囊的方法，包括預(yù)先形成缺少聚乙二醇的兩親衍生物的納米膠囊，隨后向這些納米膠囊的表面后插入所述聚乙二醇的兩親衍生物。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述預(yù)先形成的步驟包括根據(jù)溫度升降的幾個(gè)周期使油/水乳液相轉(zhuǎn)換發(fā)生，合成缺少聚乙二醇的兩親性衍生物的納米膠囊。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述后插入步驟包括第一步是在有聚乙二醇的兩親衍生物存在的情況下，預(yù)先形成納米膠囊的培養(yǎng)，其后第二步是獲得的聚乙二醇的兩親性衍生物/預(yù)先形成的納米膠囊混合物急冷直至溫度達(dá)0至5℃之間的“驟冷”步驟。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述聚乙二醇的兩親衍生物/預(yù)先形成的納米膠囊混合物的培養(yǎng)步驟是在高于實(shí)質(zhì)上是脂質(zhì)的所述親脂性表面活性劑的凝膠/液態(tài)相轉(zhuǎn)換溫度，但低于聚乙二醇的兩親衍生物/預(yù)先形成的納米膠囊混合物的相轉(zhuǎn)換溫度的溫度下進(jìn)行的。
38.根據(jù)權(quán)利要求34至37任一所述的方法，其中所述納米膠囊的直徑通過調(diào)節(jié)引入到后插入步驟中兩親衍生物的親水鏈比例和長(zhǎng)度來進(jìn)行調(diào)節(jié)。
39.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1至33任一所述的納米膠囊的方法，其中納米膠囊的直徑通過調(diào)節(jié)常規(guī)合成方法中初始混合物的親水性表面活性劑和鹽的比例，以及親脂性表面活性劑的純度來進(jìn)行調(diào)節(jié)的。
40.根據(jù)權(quán)利要求34至39任一所述的方法，其無需使用任何有機(jī)溶液，并且只能使用可生物降解的已被證明可用于腸道外應(yīng)用的化合物。
41.根據(jù)權(quán)利要求34至40任一所述的方法，其中所述納米膠囊通過直徑為0.45μm至0.22μm的過濾器的消除過濾過程進(jìn)行消除。
42.根據(jù)權(quán)利要求34至41任一所述的方法，其中所述納米膠囊經(jīng)過干凍，然后臨時(shí)重組來形成膠質(zhì)懸浮體。
43.包含根據(jù)權(quán)利要求1至33任一所述的脂質(zhì)納米膠囊的藥物組合物。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的藥物組合物，是以包含所述脂質(zhì)納米膠囊的膠質(zhì)水懸浮體形式存在的。
45.根據(jù)權(quán)利要求27至31任一所述的脂質(zhì)納米膠囊的應(yīng)用，其用于制備治療癌癥，尤其是通過靜脈給藥治療實(shí)體或循環(huán)系統(tǒng)腫瘤的藥物。
46.根據(jù)權(quán)利要求45的應(yīng)用，其用于制備通過主動(dòng)靶向來治療循環(huán)系統(tǒng)或?qū)嶓w腫瘤的藥物。
47.根據(jù)權(quán)利要求45的應(yīng)用，其用于制備由經(jīng)過腫瘤毛細(xì)管時(shí)，所述納米膠囊外滲之后的被動(dòng)靶向來治療實(shí)體腫瘤的藥物。
48.根據(jù)權(quán)利要求32或33所述的脂質(zhì)納米膠囊的應(yīng)用，其用于制備治療組織炎癥和/或傳染的藥物。
49.根據(jù)權(quán)利要求45至48任一所述的應(yīng)用，其中藥品要通過腸道外給藥，或通過血管內(nèi)、尤其是靜脈內(nèi)或動(dòng)脈中、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或關(guān)節(jié)內(nèi)注射到患者的血液循環(huán)中。
50.根據(jù)權(quán)利要求1至26任一的所述脂質(zhì)納米膠囊的應(yīng)用，其用于制備在中毒之后，吸收血液循環(huán)中疏水性分子的藥物。
51.根據(jù)權(quán)利要求45至50任一所述的應(yīng)用，其特征在于減小了活性成分對(duì)健康組織的毒性。
全文摘要
本發(fā)明涉及主要由脂質(zhì)核和外脂質(zhì)膜構(gòu)成的隱形脂質(zhì)納米膠囊，其中所述脂質(zhì)核在室溫為液態(tài)或半液態(tài)，而所述脂質(zhì)膜包括至少一種實(shí)質(zhì)上為脂質(zhì)的親水性表面活性劑、至少一種實(shí)質(zhì)上為脂質(zhì)的親脂性表面活性劑和至少一種聚乙二醇的兩親衍生物，其中聚乙二醇組分的摩爾質(zhì)量大于或等于100g/mol，優(yōu)選為大于或等于2000g/mol，本發(fā)明還涉及所述膠囊的制備方法，及其作為活性成分載體的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K9/00GK1658845SQ03813743
公開日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2003年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月11日
發(fā)明者D·瓦羅, P·戴爾馬, J－C·勒魯 申請(qǐng)人:愛的發(fā)制藥集團(tuán)