專利名稱：通過誘導(dǎo)新血管形成使內(nèi)生性心肌組織再生的制作方法
本申請要求于2002年4月23日提出的美國序列號10/128,738的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容由此通過參考結(jié)合于此。
貫穿本申請，將眾多出版物用阿拉伯?dāng)?shù)字引用于括號中。這些參考文獻(xiàn)的完整引文列于本說明書結(jié)尾緊靠權(quán)利要求書之前。因此這些公開出版物中公開內(nèi)容全部結(jié)合于本申請作為參考，以更完全地描述與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)。
背景作為對梗死組織損失的響應(yīng)，梗死周邊區(qū)域有活力的肌細(xì)胞需要經(jīng)歷代償性肥大以增加泵功能，這使心肌梗死的治療變得復(fù)雜(1，2)。這引發(fā)了一個稱為心肌重塑的過程，其特征在于肥大肌細(xì)胞的凋亡損失，初始梗死區(qū)域的擴(kuò)大，進(jìn)行性膠原置換和心力衰竭(3-6)。我們最近提出一個假設(shè)，肥大的心肌細(xì)胞會經(jīng)歷細(xì)胞凋亡，因?yàn)閮?nèi)生性毛細(xì)血管網(wǎng)不能夠提供細(xì)胞存活所需灌流的代償性增加(7)。
血管網(wǎng)的形成是起始于出生前的一個復(fù)雜過程的最終結(jié)果，在此過程中，由人腹部主動脈成血管細(xì)胞誘導(dǎo)的血管發(fā)生作用引起內(nèi)皮組織和造血成分的同時增加(8-11)?？煞只蓛?nèi)皮成分的細(xì)胞同樣存在于成人的骨髓中(12-14)并能夠誘導(dǎo)局部缺血組織的血管發(fā)生(15-17)。在成人體內(nèi)，新血管形成可通過已存在的成熟內(nèi)皮組織引起的血管發(fā)生作用或由骨髓衍生性內(nèi)皮前體所介導(dǎo)的血管發(fā)生作用而實(shí)現(xiàn)。最近，我們鑒定了一個成人骨髓衍生性內(nèi)皮祖細(xì)胞(progenitor cell)(成血管細(xì)胞)特殊種群，該種群具有胚胎成血管細(xì)胞的表型和功能特征(7)。我們表明靜脈施用這些細(xì)胞導(dǎo)致其選擇性尋靶缺血心肌層，誘導(dǎo)梗死層血管發(fā)生，防止梗死區(qū)周邊心肌細(xì)胞凋亡，并顯著促進(jìn)心肌功能。
我們最近發(fā)現(xiàn)含ELR基序的CXC趨化因子可調(diào)節(jié)人骨髓衍生性內(nèi)皮祖細(xì)胞向組織局部缺血位點(diǎn)的遷移。此外，由于選擇性骨髓尋靶和造血祖細(xì)胞的移入都依賴于CXCR4與骨髓中組成型表達(dá)的SDF-1的結(jié)合(28-30)，我們證明了阻斷CXCR4/SDF-1相互作用能夠使人骨髓衍生性內(nèi)皮祖細(xì)胞更改方向而向組織局部缺血位點(diǎn)運(yùn)輸，從而促進(jìn)了治療性血管發(fā)生。我們的結(jié)果顯示CXC趨化因子，包括IL-8，Gro-α和SDF-1在調(diào)節(jié)成人骨髓依賴性血管發(fā)生中起重要作用。
最近的觀察顯示了活性心肌細(xì)胞的另一種代償性反應(yīng)，即損傷后增殖和再生(18，19)。前面我們曾指出內(nèi)皮祖細(xì)胞等血管生成素原因子可在最小濃度誘導(dǎo)血管發(fā)生。此處我們揭示令人驚奇的結(jié)果，小心劑量給藥內(nèi)皮祖細(xì)胞/其它血管生成素原(pro-angiogenic)試劑還能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖，并且通過控制CXCR4/基質(zhì)衍生因子-1之間的相互作用可使這種增殖作用增強(qiáng)。此外，我們的結(jié)果顯示這種增強(qiáng)的增殖其機(jī)理是通過調(diào)節(jié)許多與心肌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期有關(guān)的應(yīng)激誘導(dǎo)基因的mRNA來實(shí)現(xiàn)的。
概述本發(fā)明提供了一種治療受試者涉及心肌細(xì)胞損失的心臟疾病的方法，該方法包括向受試者施用適量可有效使心肌細(xì)胞在受試者心臟內(nèi)增殖的試劑，以便由此治療疾病。
本發(fā)明另外提供了其中所述試劑為人內(nèi)皮祖細(xì)胞的該方法。
本發(fā)明另外提供了該方法，其包括施用有效量的第二種試劑，該試劑增加由人內(nèi)皮祖細(xì)胞導(dǎo)致的心肌細(xì)胞增殖。
本發(fā)明還提供了一種測定受試者心肌細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的敏感性的方法，包括(a)定量心肌細(xì)胞中peroxiredoxin的表達(dá)；(b)定量心肌細(xì)胞中維生素D3正調(diào)節(jié)蛋白-1的表達(dá)；(c)定量peroxiredoxin的表達(dá)與維生素D3正調(diào)節(jié)蛋白-1的表達(dá)的比率，其中低比率顯示心肌細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的高敏感性而高比率顯示心肌細(xì)胞對患者體內(nèi)的細(xì)胞凋亡的低敏感性。
附圖簡述

圖1A-1DIL-8/Gro-αCXC趨化因子調(diào)節(jié)人內(nèi)皮祖細(xì)胞(成血管細(xì)胞)向體內(nèi)心肌組織的遷移以及隨后血管形成作用的發(fā)展。
(A)靜脈注射入裸大鼠的DiI-標(biāo)記人內(nèi)皮祖細(xì)胞(血管生成細(xì)胞)(＞98％ CD34+純)在冠狀動脈結(jié)扎及梗死后而不是在假手術(shù)后的48小時，浸潤到大鼠的心肌中。
(B)人內(nèi)皮祖細(xì)胞(成血管細(xì)胞)向大鼠缺血心肌組織的遷移受抗大鼠IL-8或IL-8/Gro-α趨化因子家族受體CXCR1和CXCR2的單克隆抗體抑制(均為p＜0.01)，而不受抗VEGF單克隆抗體或其受體Flk-1的單克隆抗體抑制(結(jié)果表示為三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值+sem)。
(C)大鼠LAD結(jié)扎兩周后心肌梗死層的Masson’s三色染色，顯示注射了鹽水的代表動物體內(nèi)基質(zhì)沉積中擴(kuò)散增加而毛細(xì)血管極少(x400)，注射了人骨髓衍生性內(nèi)皮祖細(xì)胞的代表動物體內(nèi)毛細(xì)血管擴(kuò)散增加(箭頭所示)且基質(zhì)沉積減少(x400)，同時注射人內(nèi)皮祖細(xì)胞(成血管細(xì)胞)和抗CXCR1/2單克隆抗體的代表動物體內(nèi)毛細(xì)血管數(shù)量減少(x400)。
(D)與注射鹽水或干細(xì)胞因子(SCF)相比，心內(nèi)注射1μg/ml的IL-8或SDF-1顯著增強(qiáng)了DiI-標(biāo)記的人內(nèi)皮祖細(xì)胞(成血管細(xì)胞)(98％CD34+純)向非局部缺血大鼠心臟的體內(nèi)趨化作用，p＜0.01(結(jié)果表示為三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值+sem)。以下顯示在用鹽水、IL-8或SDF-1心臟內(nèi)注射后，靜脈注射的浸潤非局部缺血大鼠心臟的DiI-標(biāo)記的人內(nèi)皮祖細(xì)胞的代表性熒光顯微鏡檢查。
圖2A-2C阻斷CXCR4/SDF-1的相互作用使靜脈注射的人內(nèi)皮祖細(xì)胞從骨髓重定向到缺血心肌。
(A)靜脈注射2-14天后大鼠骨髓中的人CD34+CD117亮內(nèi)皮祖細(xì)胞(成血管細(xì)胞)的比例在由LAD結(jié)扎導(dǎo)致的局部缺血后顯著升高(結(jié)果表示為三個動物在每個時間點(diǎn)上骨髓研究的均值+sem)(B)和(C)描繪了抗CXCR4，SDF-1或CD34單克隆抗體對人CD34+內(nèi)皮祖細(xì)胞(成血管細(xì)胞)在LAD結(jié)扎后向大鼠骨髓和心肌層運(yùn)輸?shù)挠绊?。共同施用抗CXCR4抗體或抗SDF-1抗體48小時后顯著降低了靜脈注射的人CD34+細(xì)胞向大鼠骨髓的運(yùn)輸，并增強(qiáng)了其向缺血心肌的運(yùn)輸，然而抗CD34單克隆抗體沒有任何作用(結(jié)果表示為對三個LAD結(jié)扎動物注射48小時后進(jìn)行的骨髓和心臟研究的均值+sem)圖3A-3F對人內(nèi)皮祖細(xì)胞(成血管細(xì)胞)向梗死部位的重定向運(yùn)輸誘導(dǎo)了血管生成并保護(hù)心肌細(xì)胞免于凋亡。
(A)每組中代表動物在LAD結(jié)扎2周后的心肌梗死層，經(jīng)Masson’s三色染色(上圖)或結(jié)合抗CD31后的免疫過氧化物酶染色(下圖)。接受了103或105內(nèi)皮祖細(xì)胞(成血管細(xì)胞)的大鼠梗死區(qū)顯示了三色染色染為藍(lán)色的由少孔的高度纖維化的組織組成的心肌瘢痕(x400)。相反，注射了105內(nèi)皮祖細(xì)胞和抗CXCR4單克隆抗體的大鼠梗死區(qū)則顯示肉芽組織胞質(zhì)成分顯著增加，最低限度的基質(zhì)沉積和纖維化，以及大量中等大小的人源毛細(xì)血管。注射了2×105內(nèi)皮祖細(xì)胞的大鼠梗死區(qū)除同樣顯示纖維化組織減少以及中等大小毛細(xì)血管增加外，同時還顯示大尺寸人源血管也有所增加。
(B)和(C)顯示靜脈注射(103，105，105+抗CXCR4單克隆抗體，和2×105)的人CD117亮內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量與兩周時大鼠梗死層血管發(fā)生進(jìn)展之間的關(guān)系，血管發(fā)生的程度定義為中等尺寸或大尺寸內(nèi)腔直徑(分別為平均直徑0.02mm具3-6個內(nèi)皮襯細(xì)胞和平均直徑0.05mm具大于6個內(nèi)皮襯細(xì)胞)毛細(xì)血管的平均數(shù)量/高倍視野(hpf)。結(jié)果表示為至少三個實(shí)驗(yàn)中的15個hpf的均值+sem。
(B)接受了2×105內(nèi)皮祖細(xì)胞(成血管細(xì)胞)或105內(nèi)皮祖細(xì)胞加抗CXCR4單克隆抗體的兩組其中等尺寸毛細(xì)血管的數(shù)量是其它兩組的1.7倍(p＜0.01)。
(C)接受了2×105內(nèi)皮祖細(xì)胞(成血管細(xì)胞)的組大內(nèi)腔毛細(xì)血管的數(shù)量是接受了103或105內(nèi)皮祖細(xì)胞的兩組的3.3倍(p＜0.01)，是接受了105內(nèi)皮祖細(xì)胞加抗CXCR4單克隆抗體的組的2倍(p＜0.01)。
(D)顯示同時施用抗CXCR4單克隆抗體與最高濃度的內(nèi)皮祖細(xì)胞(成血管細(xì)胞)，2×105，導(dǎo)致大內(nèi)腔毛細(xì)血管23％的另外增加。尤其引人注意的是，當(dāng)向梗死的心臟內(nèi)直接輸入1.0μg/ml SDF-1后再靜脈注射2×105內(nèi)皮祖細(xì)胞，可引起毛細(xì)血管數(shù)量另外增加2倍(p＜0.01)(結(jié)果表示為三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值+sem)。
(E)顯示兩周時接受了2×105內(nèi)皮祖細(xì)胞(成血管細(xì)胞)或105內(nèi)皮祖細(xì)胞加抗CXCR4單克隆抗體的大鼠梗死周邊區(qū)域心肌細(xì)胞凋亡的數(shù)量比接受了103內(nèi)皮祖細(xì)胞或105內(nèi)皮祖細(xì)胞的大鼠顯著降低，該數(shù)量由抗結(jié)蛋白單克隆抗體和TUNEL技術(shù)DNA末端標(biāo)記共同染色確定(結(jié)果表示為三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值+sem)。
(F)顯示與抗CXCR4單克隆抗體共同給藥或同時心內(nèi)注射SDF-1可導(dǎo)致兩周后心肌細(xì)胞凋亡另外分別減少65％和76％(二者均有p＜0.01)(結(jié)果表示為三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值+sem)。
圖4A-4H梗死層的血管再生通過包括心肌細(xì)胞保護(hù)及增殖/再生在內(nèi)的機(jī)制改善了心肌的長期功能。
(A)和(B)顯示靜脈注射(103，105，105+抗CXCR4單克隆抗體，和2×105)的人CD117亮內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量與15周時心肌功能改善的關(guān)系，定義為左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)提高的平均值(A)和收縮末期左心室面積(LVA)減少的均值(B)。接受了103或105內(nèi)皮祖細(xì)胞的兩組與鹽水注射的大鼠相比這些參數(shù)未觀察到顯著改善。相反，接受了105內(nèi)皮祖細(xì)胞加抗CXCR4單克隆抗體的大鼠LVEF有顯著恢復(fù)且LVA有顯著降低(二者p＜0.01)。接受了2×105內(nèi)皮祖細(xì)胞的組LVEF的恢復(fù)和LVA的降低更增加了50％(二者p＜0.01)。
(C)接受了2×105內(nèi)皮祖細(xì)胞(成血管細(xì)胞)的代表動物的梗死切片顯示心臟特異的肌鈣蛋白I及大鼠特異Ki-67(箭頭)的心肌細(xì)胞染色呈高頻陽性。注意Ki-67陽性的心肌細(xì)胞與毛細(xì)血管的相似性(箭頭)。
(D)接受了2×105內(nèi)皮祖細(xì)胞的代表動物的梗死切片顯示鼠源心肌細(xì)胞“指(finger)”，通過大鼠I類MHC分子的表達(dá)而測定，從梗死周邊區(qū)域向梗死區(qū)延伸。這些細(xì)胞島的心臟特異性肌鈣蛋白I及大鼠特異Ki-67(箭頭)性肌細(xì)胞染色呈高頻陽性。而接受鹽水的代表動物梗死切片沒有相同頻率的雙染陽性肌細(xì)胞。條形圖顯示接受了2×105人內(nèi)皮祖細(xì)胞的動物組具有比鹽水對照或假手術(shù)動物顯著提高的梗死周邊區(qū)循環(huán)心肌細(xì)胞的指數(shù)。
(E)顯示與LAD結(jié)扎的接受鹽水的對照相比，當(dāng)同時采取靜脈注射2×105人內(nèi)皮祖細(xì)胞和SDF-1直接注射入缺血心肌兩項(xiàng)措施時梗死周邊區(qū)域循環(huán)心肌細(xì)胞的指數(shù)另外增加了1.9倍(p＜0.01)，在兩周時循環(huán)心肌細(xì)胞的指數(shù)累積增加了8倍(結(jié)果表示為三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值+sem)。
(F)顯示與只靜脈注射2×105人內(nèi)皮祖細(xì)胞相比，同時靜脈注射抗CXCR4單克隆抗體或心肌注射SDF-1而無IL-8可導(dǎo)致LVEF增加2.8到4倍(p＜0.01)，LVEF由超聲心動圖顯象測定(結(jié)果表示為三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值+sem)。
(G)顯示在15周時，與只接受103或105人內(nèi)皮祖細(xì)胞(成血管細(xì)胞)的大鼠以及鹽水對照組相比，同時接受或105內(nèi)皮祖細(xì)胞和抗CXCR4單克隆抗體的大鼠其瘢痕/正常左心室心肌的平均比例顯著下降(p＜0.01)，而接受2.0×105內(nèi)皮祖細(xì)胞組的瘢痕/正常左心室心肌的平均比例還要低38％(結(jié)果表示為三個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的均值+sem)。
(H)LAD結(jié)扎并注射了2.0×106G-CSF激活了的人細(xì)胞15周后的大鼠心臟Masson三色切片，所注射的人細(xì)胞中含103(左)或2.0×105(右)CD117亮內(nèi)皮祖細(xì)胞。與接受了2.0×105內(nèi)皮祖細(xì)胞的大鼠心臟相比，接受了103內(nèi)皮祖細(xì)胞的大鼠心臟具有更多的前壁質(zhì)損失、膠原沉積(亮灰色)以及隔膜肥大。
圖5本圖顯示了缺血大鼠心臟中三個基因的mRNA在不同時間點(diǎn)的表達(dá)。你將發(fā)現(xiàn)LAD結(jié)扎并局部缺血后48小時和2周時HBP23(人PAG/NKEF-A，B，C基因的大鼠內(nèi)同源基因，均為peroxiredoxin(Prx)家族的一部分)的表達(dá)降低了，而維生素D3正調(diào)節(jié)蛋白VDUP-1的表達(dá)升高了。早期(48小時)的PRX降低及VDUP-1升高導(dǎo)致巰基還原酶硫氧還蛋白(TRX)的代償性升高。注意內(nèi)皮祖細(xì)胞治療逆轉(zhuǎn)了這種mRNA表達(dá)的模式。
圖6編碼VDUP-1的mRNA的對應(yīng)DNA序列(SEQ ID NO1)圖7本圖顯示了VDUP-1 mRNA編碼區(qū)對應(yīng)的VDUP-1 DNA(SEQID NO3)上的催化性DNA 5’-AT-3’切點(diǎn)。切點(diǎn)對用大寫字母表示。
圖8本圖顯示了VDUP-1 mRNA對應(yīng)的VDUP-1 DNA(SEQ ID NO3)上的催化性DNA 5’-GC-3’切點(diǎn)。切點(diǎn)對用大寫字母表示。
圖9本圖顯示了VDUP-1 mRNA對應(yīng)的VDUP-1 DNA(SEQ ID NO3)上的催化性DNA 5’-GT-3’切點(diǎn)。切點(diǎn)對用大寫字母表示。
圖10本圖顯示了VDUP-1 mRNA對應(yīng)的VDUP-1 DNA(SEQ ID NO3)上的催化性DNA 5’-AC-3’切點(diǎn)。切點(diǎn)對用大寫字母表示。
圖11本圖顯示了VDUP-1 mRNA編碼區(qū)對應(yīng)的VDUP-1 DNA(SEQID NO3)上錘頭狀核酶的切點(diǎn)。大寫的”T”代表切點(diǎn)。
圖12本圖顯示當(dāng)VDUP-1酶濃度從0.05μM到5μM時，序列特異性VDUP1 DNA酶以濃度和時間依賴型方式切割合成的大鼠VDUP-1寡核苷酸。
圖13(a)顯示與注射雜混DNA酶對照相比，在LAD結(jié)扎后48小時心肌內(nèi)注射大鼠序列特異性VDUP1 DNA酶，可導(dǎo)致兩周后梗死區(qū)心肌成纖維細(xì)胞平均75％的增殖抑制(p＜0.01)。(b)顯示與注射雜混DNA酶對照相比，注射VDUP1 DNA酶導(dǎo)致心肌細(xì)胞細(xì)胞凋亡平均減少了20％(p＜0.05)。
圖14(a)顯示對成纖維細(xì)胞增殖和心肌細(xì)胞凋亡的抑制導(dǎo)致梗死區(qū)成熟瘢痕沉積的顯著降低，從接受雜混DNA酶對照動物的平均35％降到接受VDUP1 DNA酶的動物的20％(p＜0.01)。(b)顯示接受VDUP1 DNA酶的動物心臟機(jī)能平均有50％恢復(fù)，而接受雜混對照DNA酶的動物則沒有改善(p＜0.01)，心臟機(jī)能的恢復(fù)通過射血分?jǐn)?shù)測定。
圖15(a)顯示在心肌梗死后系統(tǒng)使用同樣劑量下，G-CSF是比GM-CSF更有效的心臟新血管形成誘導(dǎo)劑。(B)顯示G-CSF是比GM-CSF更有有效的心肌細(xì)胞凋亡抑制劑。
圖16(a)顯示G-CSF是比GM-CSF更有效的心肌細(xì)胞再生誘導(dǎo)劑。
(b)顯示G-CSF在急性心肌梗死后可比GM-CSF顯著增強(qiáng)心臟機(jī)能的恢復(fù)。
圖17(a)顯示急性心肌梗死后靜脈注射抗CXCR4單克隆抗體在梗死周邊區(qū)域誘導(dǎo)出的血管顯著增多。(b)顯示與對照抗體相比更好的心臟/心肌機(jī)能恢復(fù)。
圖18顯示SDF-1 mRNA的心肌表達(dá)升高出現(xiàn)于心肌梗死的兩周而不是48小時后，這種升高被皮下注射GM-CSF所抑制。
圖19(a)顯示心肌內(nèi)注射SDF-1誘導(dǎo)了梗死周邊區(qū)域的新血管形成和(b)保護(hù)梗死周邊區(qū)域心肌細(xì)胞不發(fā)生細(xì)胞凋亡。
圖20(a)顯示心肌內(nèi)單獨(dú)施用SDF-1或與GM-CSF協(xié)同使用可誘導(dǎo)梗死周邊區(qū)域心肌細(xì)胞再生以及(b)改善心臟機(jī)能。
圖21(a)顯示人成血管細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞早在梗死后5天內(nèi)就可誘導(dǎo)新血管形成。(b)顯示人成血管細(xì)胞或內(nèi)皮祖細(xì)胞早在梗死后5天內(nèi)就可保護(hù)心肌細(xì)胞避免發(fā)生細(xì)胞凋亡。
圖22(a)顯示接受了人骨髓衍生性CD34+細(xì)胞的動物在梗死周邊區(qū)域產(chǎn)生了大量大鼠源的小的有正常周期的細(xì)胞簇，這可通過大鼠Ki67特異性的單克隆抗體來檢測。(b)顯示CD34+給藥兩周后被處死的動物組織中不再是小的有循環(huán)著的心肌細(xì)胞簇，而是在可檢測到DNA活性的梗死周邊區(qū)域出現(xiàn)很多大的、成熟的大鼠心肌細(xì)胞，這通過心肌特異肌鈣蛋白I單克隆抗體和大鼠Ki67單克隆抗體的雙染色來測定。(c)顯示了同樣染色展示的細(xì)胞循環(huán)。
圖23顯示與正常大鼠心臟相比，RT-PCR的結(jié)果顯示LAD結(jié)扎后兩周大鼠心臟內(nèi)的HBP23 mRNA水平平均降低了34％。
圖24(a)顯示一種HBP23 DNA酶對從大鼠HBP23 mRNA序列合成的23堿基寡核苷酸以劑量和時間依賴型的方式切割。(b)顯示了細(xì)胞mRNA反轉(zhuǎn)錄后RT-PCR產(chǎn)物密度分析的結(jié)果，表明相比于無序DNA，HBP23 DNA酶抑制了所培養(yǎng)大鼠細(xì)胞80％以上的穩(wěn)態(tài)mRNA水平。
圖25(a)顯示HBP23 DNA酶對由人骨髓成血管細(xì)胞引起的新血管形成無誘導(dǎo)作用，未觀察到比鹽水對照組更高的心肌毛細(xì)血管密度。(b)顯示注射HBP23 DNA酶消除了新血管形成的抗凋亡作用，但無序?qū)φ諢o此作用。(c)顯示注射HBP23 DNA酶消除了心臟機(jī)能的改善，但無序?qū)φ諢o此作用。
詳細(xì)說明這里使用的術(shù)語“VEGF”被定義為血管內(nèi)皮生長因子?！癡EGF-R”被定義為血管內(nèi)皮生長因子受體?！癋GF”被定義為成纖維細(xì)胞生長因子?！癐GF”被定義為類胰島素生長因子?！癝CF”被定義為干細(xì)胞因子?！癎-CSF”被定義為粒細(xì)胞集落刺激因子?！癕-CSF”被定義為巨噬細(xì)胞集落刺激因子?！癎M-CSF”被定義為粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子?！癕CP”被定義為單核細(xì)胞趨化蛋白。
這里使用的術(shù)語“成血管細(xì)胞”與”內(nèi)皮祖細(xì)胞”同義。
這里使用的術(shù)語“CXC”趨化因子指趨化因子的結(jié)構(gòu)。每個“C”代表一個半胱氨酸，“X”代表任意氨基酸?！癈XCR4”指CXC受體4。
這里使用的術(shù)語”CC”趨化因子指趨化因子的結(jié)構(gòu)。每個“C”代表一個半胱氨酸。
一個”心臟祖細(xì)胞”指一個心臟駐留的細(xì)胞，或急性炎癥后從別處進(jìn)入心臟的細(xì)胞，比成熟心肌細(xì)胞小，表達(dá)α肌節(jié)肌纖蛋白但呈肌鈣蛋白陰性，通常處于休眠期但能被誘導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞周期并呈Ki67染色陽性。“心臟祖細(xì)胞”可作為”心肌祖細(xì)胞”的同意詞。
“催化性的”應(yīng)指某試劑的功能是催化劑，即一種試劑可增加某化學(xué)反應(yīng)的速率而其本身并不發(fā)生永久性的結(jié)構(gòu)變化。
“核酸”應(yīng)不限于任意一種核酸，不限于DNA，RNA，寡核苷酸，或多核苷酸，及它們的類似物及衍生物。形成核酸的核苷酸可為核酸類似物或其衍生物。核酸中可能包含非核苷酸成分。
“核苷酸”應(yīng)不限于核苷酸及其類似物或衍生物。例如，核苷酸可包括堿基A，C，G，T和U，以及它們的衍生物。這些堿基的衍生物在本領(lǐng)域內(nèi)廣為人知，并被列舉于PCR系統(tǒng)，試劑及耗材中(Perkin Elmer目錄1996-1997，Roche Molecular Systems，Inc.，Branchburg，New Jersey，USA)。
“增殖”和”再生”在本申請中當(dāng)指的是心肌細(xì)胞時為同義詞。
“增殖”當(dāng)指的是心肌細(xì)胞時，應(yīng)意味著進(jìn)入細(xì)胞周期的心肌細(xì)胞相對于未治療的大鼠心臟增加的比率倍數(shù)。
“運(yùn)輸”指源于血液的細(xì)胞遷移，尤指成血管細(xì)胞/內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移。
本發(fā)明提供了一種治療受試者涉及心肌細(xì)胞損失的心臟疾病的方法，該方法包括向受試者施用適量可有效使心肌細(xì)胞在受試者心臟內(nèi)增殖的試劑，以便由此治療疾病。
在一個實(shí)施方案中所用的試劑為人內(nèi)皮祖細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中所用人內(nèi)皮祖細(xì)胞是骨髓衍生性的，在另一個實(shí)施方案中則來源于臍帶血，或胚胎或胎兒等。足以導(dǎo)致心肌細(xì)胞增殖的內(nèi)皮祖細(xì)胞的有效劑量可根據(jù)動物實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)用常規(guī)計(jì)算方法得出。在一個實(shí)施方案中該有效劑量為大約1.5×105到3×105內(nèi)皮祖細(xì)胞每公斤體重。在另一個實(shí)施方案中該有效劑量為大約3×105到4.5×105內(nèi)皮祖細(xì)胞每公斤體重。在另一個實(shí)施方案中該有效劑量為大約4.5×105到5.5×105內(nèi)皮祖細(xì)胞每公斤體重。在另一個實(shí)施方案中該有效劑量為大約5.5×105到7×105內(nèi)皮祖細(xì)胞每公斤體重。在另一個實(shí)施方案中該有效劑量為大約7×105到1×106內(nèi)皮祖細(xì)胞每公斤體重。在另一個實(shí)施方案中該有效劑量為大約1×106到1.5×106內(nèi)皮祖細(xì)胞每公斤體重。在一個實(shí)施方案中該有效劑量為大約1.5×106到4.5×106內(nèi)皮祖細(xì)胞每公斤患者體重。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中該有效劑量為大約5×105內(nèi)皮祖細(xì)胞每公斤患者體重。
在一個實(shí)施方案中所用的內(nèi)皮祖細(xì)胞是與受試者異源的。在不同的實(shí)施方案中受試者是成人或胚胎或胎兒。在另一個實(shí)施方案中所用的內(nèi)皮祖細(xì)胞來源于自體胚胎干細(xì)胞克隆。
在一個實(shí)施方案中所用試劑誘導(dǎo)了編碼peroxiredoxin的mRNA的表達(dá)。peroxiredoxin的mRNA的表達(dá)可因例如施用2(3)-叔丁基-4-羥基苯甲醚而增加(見106)，現(xiàn)已顯示當(dāng)2(3)-叔丁基-4-羥基苯甲醚施用于食物中時可增加過peroxiredoxin的表達(dá)。備選地，局部控制O2也有同樣的效果(見107)。巰基還原酶等peroxiredoxin的mRNA表達(dá)還可能被血紅素，鎘或鈷所誘導(dǎo)(見108)。過氧化物還原酶包括，但不限于，PAG，HBP23，MSP23，NKEF。
在另一個實(shí)施方案中所用試劑誘導(dǎo)了編碼NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)的mRNA的表達(dá)。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)NF-E2相關(guān)因子(Nrf2)的表達(dá)可因增加游離Nrf2水平而間接升高。由于Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中是與keap1緊密結(jié)合的，因此通過keap1反義寡核苷酸或催化性核酸(關(guān)于keap1見109)等方法降低keap1 mRNA的表達(dá)成為合適的靶點(diǎn)。通過利用nrf2的完整Neh2域，1-73位氨基酸，或只是親水區(qū)，33-73位氨基酸(見109)等方法抑制Nrf2的Neh2域與keap1的DGR域結(jié)合以阻斷Nrf2和Keap1的相互作用也能增加細(xì)胞質(zhì)游離Nrf-2。在另一個實(shí)施方案中所用試劑誘導(dǎo)了Nrf2蛋白從Keap-1上解離。在另一個實(shí)施方案中所用試劑抑制了Nrf2蛋白與Keap-1的結(jié)合。在另一個實(shí)施方案中所用試劑抑制了巰基還原酶硫氧還蛋白與VDUP-1蛋白的結(jié)合。在另一個實(shí)施方案中所用試劑抑制了c-Abl酪氨酸激酶的活化。在另外的實(shí)施方案中所用試劑為STI-571。
在一個實(shí)施方案中所用試劑為CXC趨化因子。在另外的實(shí)施方案中所用試劑是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1，白介素-8或Gro-α。在一個實(shí)施方案中所用CXC趨化因子的量為，在一個70公斤重人類受試者身上最多用10ml濃度在0.2至5μg/ml的試劑。在一個優(yōu)選方案中該劑量為約1μg/ml。在一個實(shí)施方案中所用試劑是纖溶酶原活化因子抑制劑-1。在另一個實(shí)施方案呂所用試劑是針對CXCR4表位的抗體。在一個實(shí)施方案中所用針對CXCR4表位的抗體的量為，在一個70公斤重人類受試者身上最多用10ml濃度在25至75μg/ml的試劑。對不同體重的受試者進(jìn)行了簡單計(jì)算。在一個優(yōu)選方案中該劑量是50μg/ml。
對于不同的實(shí)施方案所用試劑是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α或基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α。在不同的實(shí)施方案中趨化因子可以是通過心肌內(nèi)注射，冠狀動脈注射，和/或經(jīng)過植入物(stent)，支架，或緩釋制劑使用。
在不同的實(shí)施方案中所用試劑是G-CSF，GM-CSF，或Gro家族趨化因子。在另外的實(shí)施方案中所用試劑試劑是Gro-α。
在另外的實(shí)施方案中該方法另外包括施用有效量的第二種試劑，該試劑促進(jìn)了由人內(nèi)皮祖細(xì)胞導(dǎo)致的心肌細(xì)胞增殖。第二種試劑的有效量為在施用內(nèi)皮細(xì)胞后足以增強(qiáng)或加速心肌細(xì)胞的增殖。在另外的實(shí)施方案中內(nèi)皮祖細(xì)胞表達(dá)CD117，CD34，AC133或高水平的胞內(nèi)GATA-2活性。在一個實(shí)施方案中給藥方式包括直接注射入患者周圍循環(huán)，心肌，左心室，右心室，冠狀動脈，腦脊液，神經(jīng)組織，缺血組織或缺血后組織。
在一個實(shí)施方案中所用第二種試劑是特異性抑制維生素D3正調(diào)節(jié)蛋白-1(VDUP-1)mRNA翻譯的反義寡聚核苷酸。
在治療上有益的VDUP-1蛋白(SEQ ID NO2)表達(dá)的定向抑制可通過反義核苷酸的應(yīng)用來實(shí)現(xiàn)。反義核苷酸是與某特定mRNA上確定序列互補(bǔ)的小片斷DNA及其衍生物。VDUP-1反義核苷酸與VDUP-1mRNA(SEQ ID NO1)分子上的靶點(diǎn)特異性結(jié)合并因此抑制了其翻譯成VDUP-1蛋白(SEQ ID NO2)。
現(xiàn)已證實(shí)，相比于標(biāo)準(zhǔn)脫氧核糖核酸，以硫代磷酸為主鏈合成的反義寡核苷酸分子能顯著抵抗核酸外切酶的損傷，因此得到優(yōu)先使用。硫代磷酸VDUP-1 mRNA反義寡核苷酸可在380B型Applied Biosystems(FosterCity，CA)DNA合成儀上用標(biāo)準(zhǔn)方法合成。例如硫化可用二硫化四乙基秋蘭姆/乙腈來實(shí)現(xiàn)。在可控多孔玻璃載體的裂解后，寡聚脫氧核糖核酸在60℃氫氧化銨中處理8小時可被封閉堿基，然后用反相HPLC純化
。寡聚體在3％乙酸中被去三苯甲基化然后用2％高氯酸鋰/丙酮沉淀，在無菌水中溶解并用1M NaCl/乙醇重新沉淀為鈉鹽。全長成分的濃度可用UV光譜法測定。
本領(lǐng)域內(nèi)目前所知的任何其它此類合成方法都可作為另外的或替代的方法。用相似技術(shù)制備硫代磷酸化和烷基化衍生物等寡核苷酸是眾所周知的。
反義寡核苷酸與VDUP-1 mRNA的雜交干擾了VDUP-1 mRNA的一個或多個正常功能。被干擾的mRNA功能包括所有的生活功能，如RNA至蛋白翻譯位點(diǎn)的易位，從RNA到蛋白的翻譯，RNA剪接產(chǎn)生一個或多個mRNA，及RNA可能有的催化活性。
優(yōu)選的修飾過的寡核苷酸主鏈包括，例如，硫代磷酸，手性硫代磷酸，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基烷基磷酸三酯，3’-亞烷基膦酸酯、5’-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯等甲基及其它烷基膦酸酯，亞膦酸鹽，3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯等氨基磷酸酯，硫逐氨基磷酸酯，硫逐烷基膦酸酯，硫逐烷基磷酸三酯，磷酸硒鹽和含有正常3’-5’鍵的硼烷磷酸酯以及它們的2’-5’鍵合的類似物，還有那些具有反極性的寡核苷酸，其中一個或多個核酸間鍵合是3’到3’，5’到5’或2’到2’鍵合。還包括具有反極性的寡核苷酸，包括單獨(dú)的3’末端3’到3’的鍵合，即包括脫堿基的(核酸堿基缺失或在其替代位有一個羥基)單獨(dú)反向核苷酸殘基。還包括各種鹽類，混合鹽類及游離酸形式。
教導(dǎo)了上述含磷鍵合物制備的代表性美國專利包括，但不限于，美國專利Nos.3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,194,599；5,565,555；5,527,899；5,721,218；5,672,697和5,625,050，其中的某些和本申請所屬相同，上述每一個專利都引于此處作為參考。
按照本發(fā)明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員都理解信使RNA不僅包括三字母遺傳碼蛋白編碼信息，還涉及到形成這些人所知一些區(qū)域的核酸，包括5’-不翻譯區(qū)，3’-不翻譯區(qū)，5’帽子區(qū)和內(nèi)含子/外顯子連接處核糖核酸。因此，可根據(jù)本發(fā)明合成全部或部分定向于這些相關(guān)核糖核苷酸或信息核糖核苷酸的下述反義寡核苷酸或催化性核酸。因此這些反義寡核苷酸與翻譯起始位點(diǎn)，翻譯起始密碼子區(qū)，5’帽子區(qū)，內(nèi)含子/外顯子連接區(qū)，編碼序列，翻譯終止密碼子區(qū)或5’-及3’-不翻譯區(qū)序列有雜交特異性。相似地，催化性核酸能特異性切割轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)，翻譯起始密碼子區(qū)，5’帽子區(qū)，內(nèi)含子/外顯子連接區(qū)，編碼序列，翻譯終止密碼子區(qū)或5’-及3’-不翻譯區(qū)序列。正如在本領(lǐng)域內(nèi)所共知的，代表性的翻譯起始子為5’-AUG(在轉(zhuǎn)錄了的mRNA上；在相應(yīng)的DNA分子上是5’-ATG)。目前已揭示在體內(nèi)有功能的少數(shù)基因的翻譯起始密碼子RNA序列為5’-GUG，5’-UUG或5’-CUG，及5’-AUA，5’-ACG和5’-CUG。因此，術(shù)語“翻譯起始密碼子”可包括許多密碼子序列，盡管在真核細(xì)胞中每個序列對應(yīng)的起始氨基酸都以甲硫氨酸為代表。本領(lǐng)域還知道真核基因可有兩個或更多可替代的翻譯起始密碼子，其中的任何一個在特定的細(xì)胞或組織中，或在特定的情況下，都可被優(yōu)先用于翻譯起始。在本發(fā)明文中，“翻譯起始密碼子”指在體內(nèi)被用于起始翻譯由VDUP-1編碼基因轉(zhuǎn)錄的mRNA分子那個或那些密碼子，無論這些密碼子的序列是什么。本領(lǐng)域還知道一個基因的翻譯終止密碼子可能是三個序列中的一個，即5’-UAA，5’-UAG和5’-UGA(相應(yīng)的DNA序列分別是5’-TAA，5’-TAG，5’-TGA)。術(shù)語“翻譯起始密碼子區(qū)”指這樣一段mRNA，它包含了從翻譯起始密碼子向任一方(即5’或3’)約25至30個連續(xù)的核苷酸。這個區(qū)域是一個優(yōu)選的目標(biāo)區(qū)域。類似地，術(shù)語“翻譯終止密碼子區(qū)”指這樣一段mRNA，它包含了從翻譯終止密碼子向任一方(即5’或3’)約25至30個連續(xù)的核苷酸。這個區(qū)域也是一個優(yōu)選的目標(biāo)區(qū)域。可讀框或“編碼區(qū)”，在本領(lǐng)域共知指的是翻譯起始密碼子到翻譯終止密碼子之間的區(qū)域，也是一個有效的靶點(diǎn)區(qū)域。其它優(yōu)選的靶點(diǎn)區(qū)域包括5’-不翻譯區(qū)(5’UTR)，在本領(lǐng)域共知指mRNA上從翻譯起始密碼子向5’方向的一段區(qū)域，因此也包括了mRNA上5’帽子和翻譯起始密碼子之間的序列或相應(yīng)的基因上的核苷酸，還包括3’-不翻譯區(qū)(3’UTR)，在本領(lǐng)域共知指mRNA上從翻譯終止密碼子向3’方向的一段區(qū)域，因此也包括了mRNA上翻譯終止密碼子和3’末端之間的序列或相應(yīng)的基因上的核苷酸。mRNA剪接位點(diǎn)也是優(yōu)選的靶點(diǎn)區(qū)域，并且在與疾病相關(guān)的異常剪接或特定mRNA剪接產(chǎn)物過量表達(dá)等情況下有特殊作用。因基因重排或缺失導(dǎo)致的異常融合連接區(qū)也是優(yōu)選的靶點(diǎn)。
一旦靶點(diǎn)確定了，就可選出與靶點(diǎn)有足夠特異互補(bǔ)性的反義寡核苷酸，即既能很好雜交又有足夠的特異性，然后如期望的那樣破壞分子的功能?！半s交”在本發(fā)明中意指互補(bǔ)堿基間氫鍵，也稱為Watson-Crick堿基配對，通常發(fā)生于相對的核酸鏈上或一條核酸鏈的兩個區(qū)域。鳥嘌呤和胞嘧啶是所知的相互之間形成三個氫鍵的互補(bǔ)堿基的例子。腺嘌呤和胸腺嘧啶是所知的相互之間形成兩個氫鍵的互補(bǔ)堿基的例子。“特異性雜交”和”互補(bǔ)性”是用來表明有足夠互補(bǔ)程度的術(shù)語，指足以在DNA或RNA靶點(diǎn)和催化性核酸間形成穩(wěn)定的和特異的結(jié)合。類似地，催化性核酸在VDUP-1 mRNA分子靶點(diǎn)切割后被立即合成。
對于患有心血管疾病的哺乳動物優(yōu)先施用反義寡核苷酸或催化性核酸及其類似物或其它試劑，可使用這些試劑的天然形式或在載體介質(zhì)中的懸液，采用能降低心血管疾病有害作用的有效治療量和治療方案。根據(jù)治療需要，靶向VDUP-1 mRNA核酸序列不同區(qū)域的一種或幾種不同的催化性核酸或反義寡核苷酸或其類似物可以單一劑量或在不同時間不同量的不同的藥劑共同施用。將催化性核酸或反義寡核苷酸施用于哺乳動物的方式可先使催化性核酸或反義寡核苷酸進(jìn)入血流然后再進(jìn)入細(xì)胞，或者也可以通過電穿孔或心臟直接注射這樣的方法直接將其導(dǎo)入心肌細(xì)胞等細(xì)胞或細(xì)胞組。存在于細(xì)胞中可抑制轉(zhuǎn)錄或蛋白合成的反義寡核苷酸其給藥方式可以是靜脈注射，靜脈滴注，皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射，口服或直腸給藥。某些反義寡核苷酸的人體藥代動力學(xué)已有所研究。參見引用的參考文獻(xiàn)的全文(105)。本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)已足以確定本治療給藥方法的最佳劑量和治療方案。
本發(fā)明用到的所有試劑都可以，例如通過注射，在冠狀動脈內(nèi)或心肌內(nèi)施用。正如在其它方面所討論的，試劑可通過眾多不同的方式給藥，包括給藥物洗脫支架等支架系統(tǒng)，以及緩釋等按時間釋放的制劑。當(dāng)試劑是蛋白時，包括但不限于SDF-1，G-CSF，GM-CSF和VEGF，可直接或間接施用，或可通過誘導(dǎo)基因表達(dá)、基因治療、腺病毒傳遞及其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的這些方法給藥。
本發(fā)明中寡核苷酸或其類似物的以藥學(xué)劑量單位表示的劑量應(yīng)是對一名需要心肌細(xì)胞再生(或VDUP-1表達(dá)抑制)的人類患者每1至2天給藥1-6次或更多次的非毒性有效劑量。劑量依賴于病情的嚴(yán)重程度及待治療的異常心血管疾病的應(yīng)答效應(yīng)，治療時間可從幾天到幾個月，直到治愈或藥效開始降低為止。通常以低劑量作為對人給藥的口服劑量單位。給藥的實(shí)際劑量應(yīng)考慮患者的體重和體積，給藥性質(zhì)是預(yù)防性還是治療性，患者年齡、體重、健康狀況和性別，給藥途徑，及其它因素。
在另一個實(shí)施方案中第二種試劑是促血管生成劑(pro-angiogenicagent)。在另外的實(shí)施方案中該促血管生成劑是血管內(nèi)皮生長因子，成纖維細(xì)胞生長因子或血管生成素(angiopoietin)。在另一個實(shí)施方案中第二種試劑誘導(dǎo)促血管生成因子的表達(dá)。在另外的實(shí)施方案中第二種試劑是缺氧誘導(dǎo)因子-1。
在另一個實(shí)施方案中第二種試劑是催化性核酸，可特異性抑制維生素D3正調(diào)節(jié)蛋白-1 mRNA的翻譯。在另外的實(shí)施方案中該催化性核酸包括脫氧核糖核酸。在另一個實(shí)施方案中催化性核酸包括核糖核酸。
催化性核酸分子可切割維生素D3正調(diào)節(jié)蛋白(VDUP-1)mRNA(對應(yīng)的DNA見SEQ ID NO1，圖5)中的任何一個保守序列。由于催化性核糖核酸及脫氧核糖核酸的保守序列已知，并且VDUP-1蛋白mRNA序列已知，一種普通技術(shù)可基于本說明書容易地構(gòu)建出針對任何VDUP-1蛋白mRNA保守序列的催化性核糖核酸或脫氧核糖核酸。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中催化性脫氧核糖核酸包括10-23的結(jié)構(gòu)。催化性核糖核酸的例子包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)和錘頭狀核酶。在本發(fā)明的優(yōu)選方案中催化性核糖核酸分子形成于錘頭狀(50)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)基序(51，52，53)中，但也可形成于丁型肝炎病毒基序(55，56)，I類內(nèi)含子(60)，RNA酶P RNA(與RNA引導(dǎo)序列相關(guān))(55，56)或紅色鏈孢霉(Neurospora)VS RNA(57，58，59)中。
為了靶向VDUP-1 mRNA(SEQ ID NO1)，催化性核酸可根據(jù)VDUP-1mRNA序列上的保守切點(diǎn)5’-嘌呤嘧啶-3’(104)(見圖6-10)為編碼VDUP-1(SEQ ID NO2)mRNA相應(yīng)的DNA切點(diǎn)而設(shè)計(jì)。位于該mRNA開放環(huán)上的那些潛在的切點(diǎn)是特別優(yōu)選的靶目標(biāo)，這些潛在切點(diǎn)是根據(jù)RNADRaw 2.1等RNA折疊軟件找到的(61)?；贒NA的催化性核酸可利用這樣一種結(jié)構(gòu)，其中兩個序列特異性的臂附著到一個基于VDUP-1mRNA序列的催化核心上。關(guān)于催化性DNA結(jié)構(gòu)的另外的例子詳見于(62)和(63)。市售小鼠大腦polyA-RNA(Ambion)可作為體外切割反應(yīng)的模板以檢測催化性脫氧核糖核酸的功效。催化性RNA可如上所述進(jìn)行類似設(shè)計(jì)。錘頭狀核酶可切割一個mRNA上的任意5’-NUH-3’三聯(lián)密碼子，其中U是保守的，N是任意核苷酸，H可以是C，U，A但不能是G。例如，圖10顯示了人VDUP-1 mRNA編碼區(qū)可被錘頭狀核酶切割的位點(diǎn)。
用催化性核酸對VDUP-1 mRNA進(jìn)行切割干擾了VDUP-1 mRNA一個或幾個正常功能。被干擾的mRNA功能包括所有的生命機(jī)能，如RNA至蛋白翻譯位點(diǎn)的易位，從RNA到蛋白的翻譯，RNA剪接產(chǎn)生一個或多個mRNA，及RNA可能有的催化活性。
該核苷酸也可使用包括肌苷，脫氧肌苷，次黃嘌呤等的其它堿基。另外，電子等排的嘌呤2’脫氧呋喃糖苷類似物，2’-脫氧水粉蕈素或2’-脫氧黃苷，或其它嘌呤或嘧啶類似物也可使用。通過仔細(xì)選擇堿基和堿基類似物，可對寡核苷酸的雜交性進(jìn)行精細(xì)調(diào)整。例如，肌苷可用來減少雜交特異性，而二氨基嘌呤可用于增加雜交特異性。
腺嘌呤和鳥嘌呤可在N3，N7，N9，C2，C4，C5，C6或C8位被修飾而仍然保持其氫鍵結(jié)合的能力。胞嘧啶，胸腺嘧啶和尿嘧啶可在N1，C2，C4，C5或C6位被修飾而仍然保持其氫鍵結(jié)合的能力。某些堿基類似物與天然存在的堿基相比有不同的氫鍵結(jié)合屬性。例如，2-氨基-2’-dA與胸腺嘧啶(T)形成三個氫鍵(3)而不是通常的兩個氫鍵。已證實(shí)能增強(qiáng)雙鏈體穩(wěn)定性的堿基類似物包括但不限于，5-氟-2’-dU，5-溴-2’-dU，5-甲基-2’-dC，5-丙炔基-2’-dC，5-丙炔基-2’-dU，2-氨基-2’-dA，7-去氮雜鳥嘌呤，7-去氮雜腺嘌呤和N2-咪唑基丙基-2′-dG。
核酸類似物可通過修飾和/或置換糖基來構(gòu)建。核酸上的糖基也可通過另加一個或多個取代基進(jìn)行修飾。例如，一個或多個糖基可能含一個或多個如下取代基氨基，烷基氨基，芳烷基，雜烷基，雜環(huán)烷基，氨基烷基氨基，O，H，烷基，聚烷基氨基，取代了的甲硅烷基，F(xiàn)，Cl，Br，CN，CF3，OCF3，OCN，O-烷基，S-烷基，SOMe，SO2Me，ONO2，NH-烷基，OCH2CH＝CH2，OCH2CCH，OCCHO，烯丙基，O-烯丙基，NO2，N3和NH2。例如，糖的2’位可被修飾成含有下列基團(tuán)之一H，OH，OCN，O-烷基，F(xiàn)，CN，CF3，烯丙基，O-烯丙基，OCF3，S-烷基，SOMe，SO2Me，ONO2，NO2，N3，NH2，NH-烷基，或OCH＝CH2，OCCH，其中的烷基可以是直鏈的，支鏈的，飽和的或不飽和的。另外，核苷酸中的糖也可能被修飾和/或置換從而成為核糖或己糖(即葡萄糖，半乳糖)或含有一個或多個異頭糖。核苷酸也含有一個或多個L-糖。
教導(dǎo)如何制備上述被修飾堿基/核苷/核苷酸的代表性美國專利包括但不限于美國專利Nos.6,248,878和6,251,666，它們在此處被列為參考文獻(xiàn)。
糖可能被修飾成含有一個或多個接頭，通過這些接頭能附著到熒光標(biāo)記等其它化學(xué)試劑上。在一個實(shí)施方案中，糖與一個或多個氨基烷氧基接頭連接。在另一個實(shí)施方案中，糖含有一個或多個烷基氨基接頭。氨基烷氧基和烷基氨基接頭可通過其氨基連接到生物素，膽酸，熒光素或其它化學(xué)基團(tuán)上。
核苷酸類似物或衍生物可含有附著的側(cè)基。側(cè)基有多種功能，包括但不限于，增加細(xì)胞對寡核苷酸的攝入，增強(qiáng)靶核酸的降解，以及增強(qiáng)雜交親和力。側(cè)基可連接至寡核苷酸的任何部分，但經(jīng)常被連接到寡核苷酸鏈的末端。側(cè)基的例子包括但不限于吖啶衍生物(即2-甲氧基-6-氯-9-氨基吖啶)；交聯(lián)接頭如補(bǔ)骨脂素衍生物，重氮苯酰，原黃素，和重氮原黃素；人工核酸內(nèi)切酶；金屬絡(luò)合物如EDTA-Fe(II)，O-二氮雜菲-銅(I)，和卟啉鐵(II)；烷化基團(tuán)；氨基-1-己醇葡萄球菌核酸酶等核酸酶以及堿性磷酸酶；末端轉(zhuǎn)移酶；抗體酶；膽固醇基團(tuán)；親脂載體；多肽偶聯(lián)物；長鏈醇類；磷酸脂；氨基；巰基基團(tuán)；放射性標(biāo)記物；染料等非放射性標(biāo)記物；以及多聚賴氨酸和其它多胺。在一個實(shí)施例中，核酸包含一個與糖，硫化糖，或gylcan偶聯(lián)的寡核苷酸。偶聯(lián)物可被視為通過將非特異性DNA結(jié)合分子共價(jià)連接到選擇性雜交寡核苷酸上從而引入特異性的一個方法。
催化性核酸結(jié)合域(即非催化域)或反義寡核苷酸可以包含修飾過的基團(tuán)。例如寡核苷酸的核苷酸間鍵可包含硫代磷酸鍵。核酸中核苷酸的基團(tuán)中的一個或兩個橋連氧原子可以被-NH，-CH2或-S等類似物所替代修飾。也可利用本領(lǐng)域內(nèi)所知的其它氧類似物。硫代磷酸酯鍵可以是立體有序的也可是立體無序的。
寡核苷酸基團(tuán)中的一個或多個糖可被修飾或替代從而成為核糖，葡萄糖，庶糖，或半乳糖，或任何其它糖。備選地，硫代磷酸寡核苷酸中的一個或多個糖可在其2’位即2’烯丙基或2’-O-烯丙基被置換或修飾。2’-O-烯丙基糖的一個例子是2’-O-甲基核糖核苷酸。硫代磷酸寡核苷酸中的一個或多個糖可被另外置換或修飾形成α-異頭糖。
催化性核酸可包含非核苷酸取代。非核苷酸取代包括脫堿基(abasic)核苷酸，聚醚，多胺，聚酰胺，肽，糖，脂或聚烴化合物。此處所用術(shù)語“脫堿基”或“脫堿基核苷酸”指缺少堿基的或在1’位用其它化學(xué)基團(tuán)代替堿基的糖基。
基于動物的數(shù)據(jù)利用常規(guī)的計(jì)算方法可確定該核酸分子的有效量。在一個實(shí)施方案中，有效量包括每公斤體重大約10ng到100μg的該核酸分子。在另一個實(shí)施例中，有效量包括每公斤體重大約100ng到大約10μg核酸分子。在另外的實(shí)施方案中，有效數(shù)量包括每公斤體重從大約1μg到大約5μg核酸分子，在另外的實(shí)施方案中，有效數(shù)量包括每公斤體重大約2μg核酸分子。
在另一個實(shí)施方案中第二種試劑是心肌祖細(xì)胞。在另一個實(shí)施方案中第二種試劑是骨胳肌祖細(xì)胞。這些細(xì)胞都可從胚胎、胎兒或成人受試者分離。
在一個實(shí)施方案中第二種試劑促進(jìn)了內(nèi)皮祖細(xì)胞向受試者心臟的輸送。
在另外的實(shí)施方案中促進(jìn)了輸送的第二種試劑是針對CXCR4表位的抗體。
在另一個另外的實(shí)施方案中促進(jìn)了輸送的第二種試劑是一種CC趨化因子。在另外的實(shí)施方案中該CC趨化因子是RANTES，EOTAXIN，單核細(xì)胞化學(xué)引誘蛋白-1(monocyte chemoattractant protein(MCP)，MCP-1)，MCP-2，MCP-3，或MCP。
在另一個實(shí)施方案中促進(jìn)了輸送的第二種試劑是一種CXC趨化因子。在另外的實(shí)施方案中該CXC趨化因子是白介素-8，Gro-α，或基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1。
在一個實(shí)施方案中第二種試劑促進(jìn)了成血管細(xì)胞向患者血流中的遷移。在不同的實(shí)施方案中該試劑是G-CSF，GM-CSF，SDF-1，或VEGF。
本發(fā)明還提供了一種測定受試者心肌細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的敏感性的方法，包括(a)定量測定心肌細(xì)胞中編碼peroxiredoxin的mRNA的量；(b)定量測定心肌細(xì)胞中編碼維生素D3正調(diào)節(jié)蛋白-1的mRNA的量；(c)定量測定編碼peroxiredoxin的mRNA的量與編碼維生素D3正調(diào)節(jié)蛋白-1的mRNA的量的比率，其中低比率意味著心肌細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的高敏感性而高比例意味著心肌細(xì)胞對患者體內(nèi)的細(xì)胞凋亡的低敏感性。
本發(fā)明還提供了一種測定患者心肌細(xì)胞對細(xì)胞凋亡敏感性的方法，包括(a)定量測定心肌細(xì)胞中peroxiredoxin蛋白的表達(dá)；(b)定量測定心肌細(xì)胞中維生素D3正調(diào)節(jié)蛋白-1的表達(dá)；和(c)定量測定peroxiredoxin的表達(dá)與維生素D3正調(diào)節(jié)蛋白-1的表達(dá)的比率，其中低比率意味著心肌細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的高敏感性而高比率意味著心肌細(xì)胞對受試者中的細(xì)胞凋亡的低敏感性。
高于擁有正常心臟的對照患者至少兩倍標(biāo)準(zhǔn)偏差的比值被認(rèn)為是高比率。心肌細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的定量采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行，例如RNA印跡和蛋白質(zhì)印跡。
本發(fā)明另外提供一種心肌祖細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中心肌祖細(xì)胞是駐留在心臟，或急性炎癥后從任何地方進(jìn)入心臟的，比成熟心肌細(xì)胞小，表達(dá)α肌節(jié)肌動蛋白但呈肌鈣蛋白陰性，通常處于休眠期但能被激活進(jìn)入細(xì)胞周期并呈Ki67染色陽性。
本發(fā)明另外提供一種誘導(dǎo)受試者心臟組織內(nèi)心肌祖細(xì)胞細(xì)胞循環(huán)(cycling)的方法，包括給受試者施用適量能有效誘導(dǎo)受試者心臟組織新血管形成的試劑從而誘導(dǎo)受試者心臟組織的心臟細(xì)胞細(xì)胞循環(huán)。
本發(fā)明另外提供了一種改善受試者心臟功能的方法，包括向患者施用適量能有效誘導(dǎo)受試者心臟組織新血管形成的試劑從而改善受試者心臟功能。
本發(fā)明另外提供了一種改善受試者心臟功能的方法，包括向患者施用適量能有效誘導(dǎo)受試者心臟組織心肌細(xì)胞增殖的試劑從而改善受試者心臟功能。
心臟功能，或心肌功能，可由下列各項(xiàng)的任意組合所確定射血分?jǐn)?shù)改善，心臟灌流，心絞痛癥狀減輕，生活質(zhì)量提高，行走能力增強(qiáng)，壽命延長，心臟給藥減少，和/或心衰預(yù)防，因?yàn)檫@些術(shù)語是本領(lǐng)域內(nèi)普遍理解的。受試者心臟功能的改善通過檢測受試者在接受任何現(xiàn)有方法治療前后上述因素的改變來測定。
在本方法的一個的實(shí)施方案中，受試者患有心肌缺血或心肌梗死。在不同的實(shí)施方案中所用的試劑是G-CSF，GM-CSF，IL-8，一種Gro家族趨化因子，CXCR4抑制劑，或SDF-1抑制劑。在另外的實(shí)施方案中CXCR4抑制劑是小分子或一個單克隆抗體，CXCR4抑制劑是一種小分子并且是AMD 3100，SDF-1抑制劑是一種小分子或單克隆抗體，并且Gro家族趨化因子是Groα。在另一個實(shí)施方案中該抑制劑是AMD 070。在不同的實(shí)施方案中CXCR4抑制劑是一種催化性核酸，寡核苷酸，RNAi，(RNA干擾(interference))或一種小分子。
本發(fā)明另外提供了一種在細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，包括抑制細(xì)胞內(nèi)peroxiredoxin的表達(dá)。在一個實(shí)施方案中上述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。在不同的實(shí)施方案中該peroxiredoxin是peroxiredoxin I，II，III，IV或V。在一個實(shí)施方案中，通過使細(xì)胞與一種能與編碼peroxiredoxin的mRNA結(jié)合的催化性核酸接觸并因此抑制其表達(dá)，抑制了peroxiredoxin的表達(dá)。在不同的實(shí)施方案中抑制peroxiredoxin表達(dá)通過使細(xì)胞與反義寡核苷酸，單克隆抗體，RNA干擾或一種小分子接觸而實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明另外提供了一種治療受試者因涉及組織胞損失而導(dǎo)致的組織細(xì)胞疾病的方法，該方法包括給受試者使用適量可有效使組織細(xì)胞在受試者組織內(nèi)增殖的試劑，從而得以治療疾病。在不同的實(shí)施例中，該組織是心臟組織，腦組織，周圍血管組織，肝組織，腎組織，胃腸組織，肺組織，平滑肌組織，或橫紋肌組織。在不同的實(shí)施方案中所用的試劑是G-CSF，SDF-1，GM-CSF，IL-8，VEGF。在一個實(shí)施方案中該試劑是CXCR4/SDF-1相互作用的抑制劑。在另外的實(shí)施方案中該抑制劑是催化性核酸，單克隆抗體，反義寡核苷酸，小分子，或RNAi。在一個實(shí)施方案中該試劑是peroxiredoxin表達(dá)的誘導(dǎo)劑。在另外的實(shí)施方案中上述peroxiredoxin是peroxiredoxin I，II，III，IV或V。
在其中試劑是G-CSF的任何當(dāng)前方法中，G-CSF可以是重組蛋氨酰人G-CSF(非格司停(Filgrastim))和一甲氧基聚乙二醇的共價(jià)偶聯(lián)物，如Neulasta。非格司停是一種水溶性175個氨基酸的蛋白，分子量約19kd。非格司停由細(xì)菌發(fā)酵獲得，發(fā)酵菌株為轉(zhuǎn)化了含人G-CSF基因的基因工程質(zhì)粒的大腸桿菌。為了合成pegfilgrastim，一個20kd的一甲氧基聚乙二醇分子被共價(jià)地結(jié)合到非格司停的N-端蛋氨酰殘基上。Pegfilgrastim的平均分子量是大約39kd。Neulasta通過用0.6ml載藥注射器皮下注射而供給。每個注射器含有6mg Pegfilgrastim(基于蛋白質(zhì)量)，溶于無菌，清澈，無色，無防腐劑的溶液中(pH4.0)，該溶液含有乙酸(0.35mg)，山梨糖醇(30.0mg)，聚三梨醇酯20(0.02mg)，以及注射用水中的鈉(0.02mg)，USP。
本發(fā)明還提供了一種治療受試者因涉及組織內(nèi)細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致的組織疾病的方法，包括給受試者使用適量能有效抑制受試者體內(nèi)組織細(xì)胞凋亡抑制劑從而治療該疾病。在一個實(shí)施方案中該試劑是VDUP-1表達(dá)抑制劑。在另外的實(shí)施方案中所述VDUP-1表達(dá)抑制劑是催化性核酸，單克隆抗體，反義寡核苷酸，小分子，或RNAi。在不同的實(shí)施方案中該組織是心肌組織，腦血管組織，或腦組織。
本發(fā)明還提供了一種抑制組織中成纖維細(xì)胞或炎癥細(xì)胞的增殖從而抑制膠原形成的方法，包括使組織與VDUP-1表達(dá)抑制劑相接觸。在一個實(shí)施方案中VDUP-1表達(dá)抑制劑是催化性核酸，單克隆抗體，反義寡核苷酸，小分子，或RNAi。
在一個實(shí)施方案中上述任何一種方法的受試者是哺乳動物，在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中該哺乳動物是人類。在一個實(shí)施方案中受試者患有心血管疾病。在另外的實(shí)施方案中受試者患有充血性心力衰竭，患有心肌梗死，患有心肌缺血，患有心絞痛，或患有心肌病。
參考下述實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)可更好地理解本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解這個具體的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)只不過是在后附的權(quán)利要求中更完整地描述的本發(fā)明的一個例證。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果CXC趨化因子調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞向心臟遷移。
利用裸鼠LAD結(jié)扎模型中的心肌梗死，我們研究了CXC受體-配體相互作用在介導(dǎo)人內(nèi)皮祖細(xì)胞向缺血組織的趨化作用及隨后的血管發(fā)生誘導(dǎo)中的作用。如圖1a所示，通過G-CSF動員(mobilization)獲得的DiI標(biāo)記人CD34+細(xì)胞(＞98％CD34純度，含1-12％CD117亮內(nèi)皮祖細(xì)胞)靜脈注射后在梗死的心肌內(nèi)被選擇性檢出，但在假手術(shù)后的大鼠心肌中未檢出?？勾笫驝inc(人IL-8和Gro-α的大鼠同源物)封閉單克隆抗體或抗人CXCR1或CXCR2這兩個促血管生成趨化因子表面受體的封閉單克隆抗體的共同施用后48小時，與對照抗體相比使人骨髓衍生性CD34+細(xì)胞的心肌遷移降低了40-60％(p＜0.01)，圖1b。兩周后，接受了人CD34+細(xì)胞的大鼠與接受鹽水的大鼠比顯示出顯著增加的梗死層微血管供應(yīng)，圖1c，并且當(dāng)與抗CXCR1/2抗體共同施用時這種效果降低了50％。由于我們前面已說明CD34+細(xì)胞的血管生成性能在小CD117亮成血管細(xì)胞部分缺失后就消失了，這些結(jié)果表明CXC趨化因子通過調(diào)節(jié)成血管細(xì)胞向缺血組織遷移而影響了這些位點(diǎn)血管生成的發(fā)展。相反，盡管直接心內(nèi)注射1.0μg/mlIL-8或SDF-1入未梗死心臟后48小時導(dǎo)致心肌內(nèi)CD34+細(xì)胞浸潤增加了2.3和2.5倍(兩者都有p＜0.01)，圖1d，此條件下后兩周內(nèi)未觀察到血管生成。這些結(jié)果共同表明趨化因子誘導(dǎo)下的向缺血區(qū)的遷移，內(nèi)皮祖細(xì)胞向成熟內(nèi)皮細(xì)胞的分化及血管生成的誘導(dǎo)需要另外的因子，此因子在缺血情況下生成，但目前尚未被鑒定。
抑制CXCR4/SDF-1相互作用使內(nèi)皮祖細(xì)胞重新向心臟輸送。
盡管LAD冠狀動脈結(jié)扎導(dǎo)致靜脈注射的人內(nèi)皮祖細(xì)胞向缺血心肌部位輸送，但這也伴隨著人類細(xì)胞向大鼠骨髓的擴(kuò)散增加。如圖2a所示，靜脈注射2×106人CD34+細(xì)胞2-14天后，LAD結(jié)扎的大鼠骨髓內(nèi)人CD117亮內(nèi)皮祖細(xì)胞的含量比正常大鼠骨髓高5-8倍，p＜0.001。這可能是由缺血血清中因子的增殖效果所導(dǎo)致，正如我們前面所示，在缺血血清中培養(yǎng)2天可使CD34+CD117亮內(nèi)皮祖細(xì)胞的含量增加4-5倍(7)。因?yàn)榛钴S的處于細(xì)胞周期中的CD34+細(xì)胞向骨髓的遷移可被由骨髓組成型合成的SDF-1所促進(jìn)(31)，所以我們研究了人CD34+CD117亮內(nèi)皮祖細(xì)胞向缺血大鼠骨髓的分布是否涉及SDF-1/CXCR4的相互作用。如圖2b所示，與抗CD34對照抗體相比，共同施用人CXCR4或大鼠SDF-1的單克隆抗體可顯著抑制靜脈給藥的人內(nèi)皮祖細(xì)胞向缺血大鼠骨髓的遷移(兩者均p＜0.001)。而且，共同施用人CXCR4或大鼠SDF-1的單克隆抗體使CD34+人內(nèi)皮祖細(xì)胞向缺血大鼠心肌的輸送平均分別增加了24％和17％(兩者均p＜0.001)，圖2c。
毛細(xì)血管腔的尺寸依賴于成血管細(xì)胞的絕對數(shù)量。
接下來我們研究了成血管細(xì)胞數(shù)量，心肌新血管形成和保護(hù)心肌細(xì)胞免于凋亡之間的關(guān)系。LAD結(jié)扎兩天后動物被靜脈注射以G-CSF活化的與不同比例CD117亮內(nèi)皮祖細(xì)胞重建的CD34+人細(xì)胞(103，105，105加抗CXCR4單克隆抗體，2×105，和2×105加抗CXCR4單克隆抗體)。每種細(xì)胞群注入后的48小時，相似數(shù)量的DiI標(biāo)記的人細(xì)胞在梗死區(qū)被檢出，數(shù)據(jù)未顯示。兩周后的新血管形成誘導(dǎo)情況通過定量分析中等尺寸及大尺寸毛細(xì)血管來測量，兩個尺寸的毛細(xì)血管分別定義為有3-6個或＞6個相鄰的內(nèi)皮襯細(xì)胞。中等尺寸毛細(xì)血管的平均直徑為0.020mm+0.002，而大尺寸毛細(xì)血管的平均直徑為0.053mm+0.004(p＜0.001)。值得注意的是，大內(nèi)腔毛細(xì)血管在尺寸上與小動脈有所重疊，這些小動脈可通過含2-3個鼠源平滑肌細(xì)胞薄層而辨別出來，由結(jié)蛋白和大鼠I類MHC單克隆抗體正染色確定。如圖3a-c所示，與另外兩組相比，接受了2×105內(nèi)皮祖細(xì)胞和105內(nèi)皮祖細(xì)胞加抗CXCR4單克隆抗體中等尺寸毛細(xì)血管的數(shù)量多了1.7倍。另外，接受2×105內(nèi)皮祖細(xì)胞的組大尺寸血管的數(shù)量還比接受103或105內(nèi)皮祖細(xì)胞的組高3.3倍(p＜0.01)，比接受了105內(nèi)皮祖細(xì)胞加抗CXCR4單克隆抗體的組高2倍(p＜0.01)。如圖3d所示，最高濃度的內(nèi)皮祖細(xì)胞，2×105，與抗CXCR4單克隆抗體共同施用，導(dǎo)致大內(nèi)腔毛細(xì)血生長23％的進(jìn)一步增長。最引人注目的是，當(dāng)在梗死心臟直接心內(nèi)注射1.0μg/ml SDF-1后靜脈注射2×105內(nèi)皮祖細(xì)胞時，毛細(xì)血管的數(shù)量有2倍的進(jìn)一步提高(p＜0.01)。由于心內(nèi)注射IL-8后未發(fā)現(xiàn)相似的梗死周圍毛細(xì)血管數(shù)量的增長，我們認(rèn)為這些結(jié)果表明缺血大鼠心臟中的內(nèi)生性IL-8足以飽和體內(nèi)的成血管細(xì)胞CXCR1/2受體，反之心內(nèi)注射SDF-1導(dǎo)致了骨髓與心臟間SDF-1表達(dá)平衡的偏移，并因而導(dǎo)致成血管細(xì)胞重新定向輸送至缺血心臟。
如圖3e所示，接受105內(nèi)皮祖細(xì)胞加抗CXCR4單克隆抗體及接受2×105內(nèi)皮祖細(xì)胞的大鼠梗死區(qū)凋亡的心肌細(xì)胞數(shù)量比接受103內(nèi)皮祖細(xì)胞或只有105內(nèi)皮祖細(xì)胞的大鼠都顯著減少(兩者均有p＜0.001)。而且，與抗CXCR4單克隆抗體共同施用或心內(nèi)注射SDF-1分別導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡減少了65％和76％，圖3f(兩者均有p＜0.001)。這些結(jié)果共同表明抵抗心肌細(xì)胞凋亡的梗死后心臟保護(hù)依賴于靜脈注射內(nèi)皮祖細(xì)胞的臨界數(shù)量誘導(dǎo)的心肌新血管形成。這個臨界值顯然可通過阻止內(nèi)皮祖細(xì)胞重新向骨髓分布的策略而降低，如阻斷CXCR4/SDF-1相互作用或增強(qiáng)SDF-1在缺血心肌中的表達(dá)。
毛細(xì)血管尺寸作為心臟功能改善的決定性因素接下來我們檢查了增加向缺血心肌輸送的人內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量對心臟長期功能的影響，由靜脈注射后15周左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)的改善程度及左心室收縮末期面積(LVA)的減少來確定，圖4a和b。與接受鹽水的大鼠相比，接受103或105內(nèi)皮祖細(xì)胞的組未觀察到這些參數(shù)有所改善。相反，接受105內(nèi)皮祖細(xì)胞加抗CXCR4單克隆抗體的組這些參數(shù)表現(xiàn)出顯著改善，LVEF平均恢復(fù)22+2％并且LVA平均減少24+4％(兩者均有p＜0.001)。更令人驚奇的是，接受2×105內(nèi)皮祖細(xì)胞的組顯示出34+4％的LVEF平均恢復(fù)和37+6％的LVA平均減少(兩者均有p＜0.001)，或兩參數(shù)均有50％的進(jìn)一步改善。這些結(jié)果令我們十分驚奇，因?yàn)檫@兩組動物兩周后都表現(xiàn)出相似程度的包含了中等尺寸毛細(xì)血管的新血管形成及相似水平的對早期心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)。這暗示接受了2×105人內(nèi)皮祖細(xì)胞的大鼠額外的長期功能改善與早期大尺寸毛細(xì)血管發(fā)育有關(guān)，并且由與保護(hù)心肌細(xì)胞凋亡不同的機(jī)理所介導(dǎo)。
大毛細(xì)血管誘導(dǎo)內(nèi)生性性心肌細(xì)胞的持久性再生。
盡管心肌肥大和核酸倍增通常被認(rèn)為是哺乳動物心臟對缺血、損傷和過載的主要應(yīng)答(1，2)，最近的觀察暗示人心肌細(xì)胞具有增殖和再生的能力以應(yīng)答損傷(18，19)。因此，我們研究了注射了2×105人內(nèi)皮祖細(xì)胞后觀察到的心臟功能的額外的改善是否與心肌細(xì)胞增殖和/或再生的誘導(dǎo)有關(guān)。接受2×105人內(nèi)皮祖細(xì)胞的LAD結(jié)扎大鼠在兩周后表現(xiàn)出大量鼠源心肌細(xì)胞”手指”，這由鼠I類MHC的表達(dá)確定，從梗死周圍區(qū)域延伸至梗死區(qū)。接受103和105內(nèi)皮祖細(xì)胞的動物中類似的延伸發(fā)生的頻率有所下降，而接受鹽水的動物中凡乎沒有這種現(xiàn)象。如圖4c所示，接受2×105人內(nèi)皮祖細(xì)胞的動物中周圍梗死區(qū)的心肌細(xì)胞島包含了高頻率的有DNA活性的心肌細(xì)胞，這通過抗心肌細(xì)胞特異性肌鈣蛋白I和大鼠Ki-67的單克隆抗體反應(yīng)的雙染色來確定。相反，在接受鹽水的動物中有高頻的成纖維細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞，這些細(xì)胞與鼠Ki-67反應(yīng)，但不和梗死區(qū)內(nèi)肌鈣蛋白反應(yīng)。接受了2×105人內(nèi)皮祖細(xì)胞的大鼠梗死區(qū)周圍進(jìn)行著細(xì)胞周期的心肌細(xì)胞比梗死區(qū)遠(yuǎn)端高40倍，而梗死區(qū)遠(yuǎn)端的心肌細(xì)胞DNA活性與假手術(shù)的大鼠沒有區(qū)別。如圖4d所示，接受2×105人內(nèi)皮祖細(xì)胞的動物梗死周圍區(qū)中處于細(xì)胞周期中的心肌細(xì)胞比未梗死心臟中的高20倍(1.19+0.2％vs 0.06+0.03％，p＜0.01)，比接受鹽水的LAD結(jié)扎對照動物同一區(qū)域高3.5倍(1.19+0.2％vs 0.344+0.1％，p＜0.01)。當(dāng)直接心內(nèi)傳遞1.0μg/mlSDF-1于梗死心臟后靜脈注射2×105人內(nèi)皮祖細(xì)胞時，梗死周圍區(qū)域的處于細(xì)胞周期中的心肌細(xì)胞數(shù)量比只靜脈注射2×105人內(nèi)皮祖細(xì)胞另外增加了1.9倍(圖4e，p＜0.01)。這樣，與LAD結(jié)扎的鹽水對照相比，心內(nèi)注射SDF-1與靜脈注射2×105人內(nèi)皮祖細(xì)胞相結(jié)合在兩周時導(dǎo)致了大約8倍的周期內(nèi)細(xì)胞累計(jì)增長，同時與只靜脈注射2×105人內(nèi)皮祖細(xì)胞相比，有超過4倍的LVEF改善，這由超聲心動圖顯像確定(圖4f，p＜0.01)。共同施用抗CXCR4單克隆抗體使LVEF的改善增強(qiáng)了2.8倍(p＜0.01)，但是心內(nèi)注射IL-8卻沒帶來任何另外的益處。
15周后成纖維組織與心肌比值的定量測定顯示接受2×105內(nèi)皮祖細(xì)胞和105內(nèi)皮祖細(xì)胞加抗CXCR4單克隆抗體的組瘢痕/正常左心室心肌比例有顯著下降，分別是13％和21％，而另外兩組每組都是37-46％(p＜0.01)，圖4g。由于這兩組具有幾乎相同的抵抗早期心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)水平，我們推斷注射了2×105內(nèi)皮祖細(xì)胞組中觀察到的另外38％的瘢痕/心肌比率的降低反映了大容量新血管形成引起的營養(yǎng)供給所誘導(dǎo)的內(nèi)生性性大鼠心肌細(xì)胞增殖/再生。這個假設(shè)解釋了該組中所見到的功能改善。我們的結(jié)論是瘢痕尺寸與左心室肌肉組織的比率部分地反映了殘余心肌細(xì)胞增殖和再生能力帶來的正效應(yīng)，除初始的梗死尺寸的負(fù)效應(yīng)外還有抗細(xì)胞凋亡，心臟保護(hù)機(jī)制等正效應(yīng)。中等尺寸和大尺寸新血管系統(tǒng)的總效應(yīng)是保護(hù)細(xì)胞不發(fā)生細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖/再生的結(jié)合，如圖4h所示，其中與鹽水對照相比，注射2×105內(nèi)皮祖細(xì)胞使冠狀動脈幾乎完全補(bǔ)救，形成正常的中隔尺寸及最少的膠原沉積。
影響再生PAI-1抑制性催化性核酸促進(jìn)人成血管細(xì)胞依賴性心肌細(xì)胞再生。
我們研究了由可抑制PAI-1表達(dá)的催化性核酸(命名為E2)所誘導(dǎo)的可能的新血管形成是否與心肌細(xì)胞的再生有關(guān)。單獨(dú)注射E2沒有誘導(dǎo)心肌細(xì)胞再生，盡管引起了新血管形成的增加。將E2注射與靜脈注射人內(nèi)皮祖細(xì)胞相結(jié)合顯著地增加了心肌細(xì)胞的再生程度，比鹽水對照增加了7.5倍(p＜0.01)。雜混DNA對照酶(E0)無此效果。而且，通過左心室射血分?jǐn)?shù)確定，雖然單獨(dú)使用E2兩周后不能促進(jìn)心肌功能，但E2與人內(nèi)皮祖細(xì)胞結(jié)合使用引起的心肌功能恢復(fù)是單獨(dú)使用人內(nèi)皮祖細(xì)胞的2倍。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了心肌細(xì)胞再生作為梗死后心臟功能改善的基本機(jī)制的重要性。由于結(jié)合使用E2和人內(nèi)皮祖細(xì)胞使梗死周圍區(qū)域的大毛細(xì)血管數(shù)量比單獨(dú)使用其中的任何一種方法都高出62％，這些結(jié)果表明成血管細(xì)胞誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞再生和心臟功能改善可通過使用心肌病治療方法而得到優(yōu)化，如抑制PAI-1表達(dá)的策略，這些治療方法直接地，或者通過成血管細(xì)胞依賴的過程間接地促進(jìn)了新血管形成。
利用肌鈣蛋白和Ki67雙染色，我們另外發(fā)現(xiàn)靜脈注射人CD34+CD117亮成血管細(xì)胞使大鼠梗死周圍區(qū)心肌細(xì)胞的增殖/再生比鹽水對照增加了4倍(p＜0.01)。將E2注射與靜脈傳遞人內(nèi)皮祖細(xì)胞相結(jié)合顯著地增加了心肌細(xì)胞的再生程度，比鹽水對照增加了7.5倍(p＜0.01)。雜混DNA對照酶(E0)無此效果。
基因?qū)π募〖?xì)胞增殖的效果我們假設(shè)心肌的新血管形成誘導(dǎo)了引起心肌細(xì)胞增殖所需的信號，那么對此進(jìn)行模仿的治療性介入就可能和缺血發(fā)作或其它損傷發(fā)作引起的心臟損傷的修復(fù)和再生具有顯著的關(guān)系。
為了開始解決這個復(fù)雜的問題，我們采用了cDNA減除雜交技術(shù)。此技術(shù)使能夠比較不同情況之間基因表達(dá)模式。我們最初的方法是比較正常大鼠心臟和左前降支(descending)(LAD)冠狀動脈結(jié)扎48小時前的大鼠之間哪些基因的表達(dá)發(fā)生了變化。我們假設(shè)在缺血后48小時無論基因是被過表達(dá)還是低表達(dá)的改變的模式，新血管形成會使這種模式逆轉(zhuǎn)向非缺血大鼠心臟的狀態(tài)轉(zhuǎn)變。
利用cDNA減除雜交法我們觀察到一組基因顯著的相互表達(dá)變化，這組基因的功能通過它們對在氧化應(yīng)激或其它DNA損傷誘導(dǎo)因素后的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)節(jié)而聯(lián)系起來。雖然某些抗氧化基因如超氧化物岐化酶在缺血組織中的表達(dá)被正調(diào)節(jié)，但是由氯化高鐵血紅素，特別是亞鐵血紅素結(jié)合蛋白23(HBP23)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶所誘導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激應(yīng)答基因卻被負(fù)調(diào)節(jié)。而且，一個最近被鑒別的蛋白，維生素D3正調(diào)節(jié)蛋白(VDUP-1)在缺血心臟中被正調(diào)節(jié)，其mRNA表達(dá)被氧化應(yīng)激后的過氧化氫(H2O2)所誘導(dǎo)，其功能與HBP23相平衡。前面我們看到抗氧化劑缺乏和氧化應(yīng)激增加伴隨的心肌梗死看起來直接牽涉到梗死后心臟衰竭的發(fā)病，而上述發(fā)現(xiàn)當(dāng)與此現(xiàn)象一同考慮時顯得格外引人注目(74，75)。
如圖5所示，利用RT-PCR，HBP23和VDUP1在缺血心肌和正常大鼠心臟內(nèi)的mRNA表達(dá)的交互變化得到證實(shí)。而且，靜脈注射人成熟骨髓衍生性祖細(xì)胞和梗死區(qū)新血管發(fā)生兩周后，此時大鼠組織中這兩個基因的mRNA表達(dá)回復(fù)到正常水平。相反，在接受鹽水的LAD結(jié)扎大鼠心臟中，與48小時的表達(dá)水平相比較，兩周后未見這兩個基因mRNA的表達(dá)有所變化。為了理解新血管形成對HBP23和VDUP1在缺血后這種表達(dá)的變化模式的影響和所觀察到的保護(hù)心肌細(xì)胞抵抗凋亡并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖/再生現(xiàn)象這兩者之間的關(guān)系，詳細(xì)了解這兩個基因所編碼的產(chǎn)物對細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)程的分子作用就顯得重要起來。
當(dāng)細(xì)胞增殖時，有絲分裂周期進(jìn)程緊密地被一個正向和負(fù)向信號網(wǎng)絡(luò)所調(diào)節(jié)。細(xì)胞周期從一階段到下一階段的進(jìn)程被絲裂信號向周期表達(dá)的稱為細(xì)胞周期蛋白(cyclin)的轉(zhuǎn)導(dǎo)以及其后一個稱為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cdks)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的激活和失活所控制(67)。見于DNA損傷，末端分化及復(fù)制性衰老這些不同過程中的生長停滯是由細(xì)胞周期進(jìn)程的負(fù)調(diào)節(jié)引起的，兩個功能不同的Cdk抑制子家族，Ink4和Cip/Kip家族，引發(fā)了這種負(fù)調(diào)節(jié)(64)。p21Cip1/WAF1的細(xì)胞周期抑制活性與其核定位及參與形成細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑四聚復(fù)合物密切相關(guān)，它通過N端域與G1細(xì)胞周期蛋白-CDK結(jié)合，并且通過C端域與增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)結(jié)合，從而形成細(xì)胞周期調(diào)節(jié)子四聚復(fù)合物(68-71)。后者相互作用阻斷了PCNA激活DNA聚合酶的能力，DNA聚合酶是主要的復(fù)制性DNA聚合酶(72)。生長停滯的細(xì)胞隨后進(jìn)入凋亡途徑需要特異性凋亡刺激所提供的信號和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑的共同作用。例如，半胱天冬酶介導(dǎo)的p21位點(diǎn)切割，與細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白A相關(guān)cdk2活性的正調(diào)節(jié)一起，被表明是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟，這是因?yàn)閱适Я松L因子(73)或心肌細(xì)胞缺血而造成的(74)。
凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)是細(xì)胞因子和應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制中的中樞成分(75，76)。在基礎(chǔ)條件下，對ASK1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抵抗似乎是ASK1，細(xì)胞質(zhì)p21Cip1/WAF1(77)，和巰基還原酶硫氧還蛋白(TRX)(78)之間形成復(fù)合物的結(jié)果。p21Cip1/WAF1在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的完整表達(dá)似乎對預(yù)防ASK1應(yīng)答引起的細(xì)胞凋亡(75)和保持末端分化的狀態(tài)都很重要(77)。而且，TRX的還原形式，而不是氧化形式，與ASK1的N端部份結(jié)合，并且是ASK1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的生理抑制劑(78)。最近鑒定的VDUP1已表明與ASK1競爭結(jié)合于TRX的還原形式(78，79)，促進(jìn)了ASK1介導(dǎo)的凋亡(80)。這表明ASK1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可因?qū)е耇RX與ASK1的凈解離的過程而增強(qiáng)，如TRX-VDUP1復(fù)合物的生成，或由細(xì)胞內(nèi)伴隨氧化應(yīng)激而發(fā)生的還原狀態(tài)的改變而生成氧化的TRX。
TRX和谷胱苷肽構(gòu)成了胞內(nèi)主要的還原系統(tǒng)，這個系統(tǒng)保持了胞質(zhì)溶膠中巰基二氧化硫的狀態(tài)(81)。TRX的氧化還原活性/二巰基活性部位是在所有物種中高度保守的，Trp-Cys-Gly-Pro-Cys-Lys。其中活性位點(diǎn)的兩個半胱氨酸殘基，Cys-32和Cys-35，進(jìn)行著可逆的由一種NADPH-依賴性酶TRX還原酶催化的氧化還原反應(yīng)。這些反應(yīng)包括了通過二硫鍵進(jìn)行的電子傳遞，其中的二硫鍵形成于一類稱為peroxiredoxin(Prx)的抗氧化酶家族成員之間，這類酶顯示過氧化物酶活性(82，83)。Prxs與其它過氧化物酶不同，它們沒有輔助因子，如金屬或輔基。Prxs通常在N和C端區(qū)域有兩個保守的半胱氨酸(84)，并且它們的抗氧化活性與TRX系統(tǒng)的電子供體活性相偶聯(lián)(82，85，86)。目前已鑒別出在大鼠(亞鐵血紅素結(jié)合蛋白23，HBP23)(87)，小鼠(鼠巨噬應(yīng)激蛋白23，MSP23)(88)和人(增殖相關(guān)基因產(chǎn)物，PAG(89)和人自然殺傷細(xì)胞增強(qiáng)因子A(90))中有95％序列同源性的Prxs。
Prxs是一組氧化應(yīng)激響應(yīng)基因集合(repertoire)的成員，這組基因的表達(dá)受NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)調(diào)節(jié)，Nrf2與一種存在于每個的啟動子的抗氧化效應(yīng)元件(ARE)相結(jié)合(91)。這些包括了谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶，亞鐵血紅素加氧酶-1，和TRX。在基礎(chǔ)條件下，Nrf2與胞質(zhì)溶膠中特定的蛋白，Keap1，相結(jié)合(92)。然而，在氧化應(yīng)激條件下，Nrf2與Keap1解離并易位至胞核，在那里它誘導(dǎo)了含ARE基序的抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。盡管確切的細(xì)胞外傳導(dǎo)途徑還未被闡明，Nrf2核易位及后續(xù)的ARE激活似乎依賴于磷酯酰肌醇3-激酶(PI3激酶)激活的途徑(93)。另外，氯化高鐵血紅素是Nrf2從Keap1解離的有效誘導(dǎo)劑，導(dǎo)致TRX基因通過ARE轉(zhuǎn)錄(94)。
在細(xì)胞氧化還原快速變化期間，Prxs可能通過接受來自氧化形式TRX的電子用于維持還原TRX的胞質(zhì)溶膠水平。這種穩(wěn)態(tài)機(jī)制可能使保持足夠的還原態(tài)TRX以保證與ASK1的充分結(jié)合及預(yù)防細(xì)胞凋亡成為可能。如果內(nèi)生性Prx系統(tǒng)過載，這可能發(fā)生于有過量氧化態(tài)TRX生成的細(xì)胞氧化還原變化期間，細(xì)胞凋亡就可能因不受抑制的ASK1效應(yīng)而發(fā)生。為了抵制這種情況，在氧化應(yīng)激后必須有通過Nrf2核易位而引起的Prxs轉(zhuǎn)錄激活。這可通過氯化高鐵血紅素和PI3激酶依賴的機(jī)制下Nrf2與Keap1的解離而獲得(93，94)，也可通過增加Nrf2 mRNA和蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，正如在氧張力增強(qiáng)時發(fā)生的那樣(95，96)。
除直接與TRX反應(yīng)以外，Prx基因產(chǎn)物(PAG，HBP23，MSP23，NKEF等)特異地結(jié)合于非受體酪氨酸激酶c-Abl的SH3域，抑制了能損傷DNA的試劑等許多刺激對其的激活(97)。c-Abl通過SH3的激活誘導(dǎo)了細(xì)胞周其停滯于G1階段或誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡(98)。細(xì)胞周期停滯依賴于c-Ab1的激酶活性(96)并被c-Abl對細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶Cdk2的活性進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)并誘導(dǎo)p21表達(dá)的能力所介導(dǎo)(99)。c-Abl的細(xì)胞凋亡效應(yīng)依賴于核c-Abl磷酸化p73的能力，p73是可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的腫瘤抑制蛋白p53家族的一員(100，101)。最近，有研究表明細(xì)胞質(zhì)形式而不是核內(nèi)的c-Abl被H2O2激活而且這導(dǎo)致了c-Abl定位于線粒體，c-Abl依賴性細(xì)胞色素c釋放，以及氧化應(yīng)激后的細(xì)胞凋亡(102，103)。通過與c-Abl在體內(nèi)結(jié)合，PAG基因產(chǎn)物(有可能是另外一個Prxs)能夠抑制由c-Abl過表達(dá)而誘導(dǎo)的酪氨酸磷酸化，并且能將細(xì)胞從c-Abl基因產(chǎn)物激活的細(xì)胞生長抑制和促凋亡效應(yīng)中解救出來(97)。
我們發(fā)現(xiàn)Nrf2依賴性氧化應(yīng)激效應(yīng)基因在心肌缺血后被負(fù)調(diào)節(jié)，這可能反映了氯化高鐵血紅素和不供氧的直接效果。缺血心臟中Prx負(fù)調(diào)節(jié)的最終結(jié)果將會促進(jìn)ASK1依賴性細(xì)胞凋亡和Abl依賴性細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期停滯。同時觀察到的VDUP1表達(dá)的增加將進(jìn)一步促進(jìn)ASK1依賴性細(xì)胞凋亡。這樣，PAG或其它Prx mRNA或蛋白表達(dá)與VDUP1 mRNA或蛋白表達(dá)的比例可形成診斷檢測的基礎(chǔ)，該檢測可用來預(yù)測缺血后心肌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期停滯的風(fēng)險(xiǎn)程度，還可用來監(jiān)測心肌缺血后對特定治療的應(yīng)答，這種應(yīng)答保護(hù)心肌細(xì)胞免于凋亡性死亡并增強(qiáng)心肌的增殖和再生。
逆轉(zhuǎn)心肌缺血后Prxs被減少了的表達(dá)將增加心臟內(nèi)Prxs的水平，通過抑制c-Abl和還原氧化型的TRX以保護(hù)缺血心肌免于細(xì)胞凋亡，并通過抑制c-Abl對細(xì)胞周期進(jìn)程從G1到S階段的抑制效應(yīng)而啟動心肌細(xì)胞增殖/再生。
為了增加一組氧化應(yīng)激響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄和活性，在缺血心肌中增加Nrf2 mRNA或使Nrf2蛋白從Keap1解離，或最好讓兩者同時發(fā)生，可保護(hù)心肌細(xì)胞免于凋亡并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激后心肌細(xì)胞細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生，這組氧化應(yīng)激效應(yīng)基因的表達(dá)被Nrf2和抗氧化應(yīng)答元件(ARE)，包括Prxs，TRX和谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶，在啟動子處的結(jié)合所抑制。
心肌缺血后降低VDUP1的表達(dá)將因減少了TRX與VDUP1的結(jié)合而保護(hù)缺血心肌免于細(xì)胞凋亡，并隨之增強(qiáng)了TRX-ASK1的相互作用。
骨髓衍生性內(nèi)皮祖細(xì)胞或者任何其它過程引起的心肌層新血管形成，是一個方法的例子，這個方法導(dǎo)致了心肌缺血后Prx表達(dá)的誘導(dǎo)和VDUP1表達(dá)的減少，也保護(hù)了細(xì)胞免于氧化還原介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以及誘導(dǎo)了心肌增殖/再生。
可預(yù)見特異性抑制Nrf2與Keap1結(jié)合的小分子對抵抗細(xì)胞凋亡具有相似的保護(hù)效果并在缺血后誘導(dǎo)心肌增殖與再生。相似地，可預(yù)見特異性抑制TRX與VDUP1結(jié)合的小分子將對缺血后抵抗心肌細(xì)胞凋亡有相似的保護(hù)作用。
可預(yù)見心肌缺血后用小分子特異性地抑制c-Abl酪氨酸激酶的活性將對缺血后抵抗心肌細(xì)胞凋亡有相似的保護(hù)作用并在缺血后誘導(dǎo)心肌增殖與再生。一個用來抑制c-Abl酪氨酸激酶的小分子的例子是STI-571。在心肌梗死后使用這個或相關(guān)的分子可抵抗心肌細(xì)胞凋亡并誘導(dǎo)心肌增殖/再生。
VDUP-1特異性DNA酶切割合成的大鼠VDUP-1寡核苷酸通過減除雜交技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)VDUP1蛋白的mRNA表達(dá)在急性缺血心臟中顯著升高。已有研究表明VDUP1與胞質(zhì)蛋白硫氧還蛋白TRX結(jié)合，TRX的功能是維持胞質(zhì)內(nèi)巰基二硫化物的狀態(tài)。通過結(jié)合于還原型的TRX，VDUP1阻止了還原型TRX進(jìn)行由NADPH依賴性酶TRX還原酶催化的可逆氧化還原反應(yīng)的能力。這產(chǎn)生了因胞質(zhì)和線粒體中過量氧化基團(tuán)的生成而導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。
VDUP1與另一個通常結(jié)合于還原型TRX的胞質(zhì)蛋白，凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)，競爭和TRX的結(jié)合。ASK-1是細(xì)胞因子和應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制中的中樞成分。它的激活導(dǎo)致過量的p38 MAP激酶磷酸化和激活，p38 MAP激酶是細(xì)胞凋亡的主要介導(dǎo)者。還原型TRX，而不是氧化型TRX，結(jié)合于ASK1的N端部分，是ASK1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的生理抑制劑。VDUP1和TRX的結(jié)合導(dǎo)致ASK1和TRX的凈解離效果，潛在地促進(jìn)了ASK1介導(dǎo)的p38 MAP激酶依賴性途徑的細(xì)胞凋亡。
至于心臟內(nèi)VDUP1的過表達(dá)，其預(yù)期的效果將是由過量的p38 MAP激酶活性和氧化性氧化還原反應(yīng)損傷引起的后果，包括心肌細(xì)胞凋亡，成纖維細(xì)胞增殖，膠原分泌和瘢痕形成。類似的效果將是可預(yù)見隨之而來的VDUP在其它發(fā)生急性或慢性缺血性損傷組織中的過表達(dá)，如腦血管缺血/中風(fēng)后的大腦。
我們已經(jīng)開發(fā)了一種靶向于VDUP1 mRNA的DNA酶。這種DNA酶，一旦輸送至缺血心肌(或大腦等其它缺血組織)能抑制局部的VDUP1mRNA和蛋白表達(dá)，從而降低了p38 MAP激酶的激活和氧化損傷。
如圖12所示，酶濃度在0.05uM到5uM之間時，序列特異性VDUP1DNA酶以一種濃度-時間依賴的方式切割人工合成的大鼠VDUP1寡核苷酸。
VDUP1 DNA酶減少了成纖維細(xì)胞增殖并抵抗心肌細(xì)胞凋亡。如圖13(a)所示LAD結(jié)扎48小時后心內(nèi)注射大鼠序列特異性VDUP1 DNA酶，兩周后心臟成纖維細(xì)胞增殖比注射雜混DNA酶的對照平均抑制了75％(p＜0.01)。另外，如圖13(b)所示，VDUP1 DNA酶注射使梗死周圍區(qū)心肌細(xì)胞凋亡相對于注射雜混DNA酶的對照降低了20％。
VDUP-1 DNA酶在急性梗死后減小了心肌瘢痕并促進(jìn)了心臟功能。對成纖維細(xì)胞增殖和心肌細(xì)胞凋亡的抑制導(dǎo)致了沉積于梗死區(qū)的成熟瘢痕顯著降低，從接受對照雜混DNA酶動物的平均35％降低到接受VDUP1DNA酶動物的20％，圖14(a)(p＜0.01)。最引人注意的是其在心臟功能上的作用。如圖14(b)所示，通過射血分?jǐn)?shù)測定，接受VDUP1 DNA酶的動物顯示心臟功能平均50％的恢復(fù)，而接受無序?qū)φ誅NA酶的動物則無可見的改善(p＜0.01)。
VDUP1 DNA酶明顯防止了心肌細(xì)胞凋亡、心臟成纖維細(xì)胞增殖和瘢痕形成，使急性缺血后心臟功能顯著增強(qiáng)。這些作用可能是阻止p38 MAP激酶活化和抵抗氧化還原損傷的結(jié)果。類似的結(jié)果可通過在腦血管缺血后的大腦等其它血流減少的組織中使用VDUP1 DNA酶而得到。
G-CSFG-CSF是心肌梗死后比GM-CSF更有效的新血管形成誘導(dǎo)劑。如圖15(a)所示，左前降支(LAD)冠狀動脈結(jié)扎誘發(fā)心肌梗死后兩天進(jìn)行皮下注射10ug/kg人G-CSF四天的大鼠在兩周后梗死周圍區(qū)大內(nèi)徑血管的數(shù)量比鹽水處理的對照高約7.5倍(p＜0.01)。依同樣給藥方案使用大鼠GM-CSF就不如此有效，盡管與對照動物相比仍然誘導(dǎo)了多出4倍數(shù)量的大內(nèi)腔血管。
另外，G-CSF是在心肌梗死后比GM-CSF更有效的心肌細(xì)胞凋亡抑制劑。G-CSF注射液是比同樣給藥方案下的GM-CSF更有效的抵抗心肌細(xì)胞凋亡的試劑，圖15(b)。給藥G-CSF兩周后使梗死周圍區(qū)凋亡的心肌細(xì)胞比鹽水下理的對照降低了36+16％(p＜0.01)，而GM-CSF只使凋亡的心肌細(xì)胞降低了12+9％。
G-CSF是在心肌梗死后比GM-CSF更有效的心肌再生誘導(dǎo)劑。下面我們檢測了骨髓活化對心肌細(xì)胞循環(huán)/再生及心臟功能恢復(fù)的作用。如圖16(a所示，左前降支(LAD)冠狀動脈結(jié)扎誘發(fā)心肌梗死后兩天進(jìn)行皮下注射10ug/kg人G-CSF四天的大鼠在兩周后梗死周圍區(qū)循環(huán)期內(nèi)心胸細(xì)胞的數(shù)量比鹽水處理的對照高約3.2倍(p＜0.05)。依同樣給藥方案使用大鼠GM-CSF就不如此有效，使循環(huán)期內(nèi)心肌細(xì)胞的數(shù)量增加了2.6倍。如圖16(b)所示，這與心臟功能的恢復(fù)有關(guān)。然而通過射血分?jǐn)?shù)測量的鹽水處理動物在梗死后2到14天內(nèi)心臟功能有平均17％的損失，GM-CSF治療的動物只有10％的心臟功能損失，而G-CSF治療的動物實(shí)際上心臟功能平均提高了10％(P＜0.01)。我們認(rèn)為這些功能數(shù)據(jù)反映了G-CSF骨髓活化在心肌新血管形成，抵抗心肌細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)心肌細(xì)胞循環(huán)中的出色作用。
抗CXCR4抗體靜脈注射抗CXCR4抗體在急性梗死后增加了心肌新血管形成并改善了心肌功能。G-CSF導(dǎo)致骨髓元素活化的機(jī)理是阻斷了駐骨髓干細(xì)胞上趨化因子受體CXCR4和其配體SDF-1之間的相互作用。G-CSF誘導(dǎo)了CXCR4 N-端的切割和直接切割并使SDF-1失活的絲氨酸蛋白酶的積累。為了檢測G-CSF對心肌新血管形成和心臟功能改善的作用是否是相似的機(jī)理，我們在LAD結(jié)扎后48小時靜脈注射單克隆抗CXCR4抗體，研究了阻斷CXCR4-SDF1相互作用的效果。如圖17(a)所示，使用抗體2周后接受抗CXCR4單克隆抗體的動物在梗死周圍區(qū)的新血管形成比接受鹽水的對照或抗CXCR2單克隆抗體的對照增加了兩倍。而且，如圖17(b)所示抗CXCR4治療的動物射血分?jǐn)?shù)平均恢復(fù)了10％，而接受抗CXCR2單克隆抗體的動物心肌功能平均損失了8％(p＜0.05)。這些數(shù)據(jù)支持了這樣一個概念，所觀察到的G-CSF給藥的作用是來自于阻斷CXCR4在骨髓中的相互作用，使內(nèi)皮祖細(xì)胞向周圍循環(huán)系統(tǒng)運(yùn)動并靶向缺血心肌，在這里新血管形成的結(jié)果使心肌功能得到改善。
SDF-1SDF-1 mRNA的表達(dá)不在急性缺血心肌的早期被誘導(dǎo)，并且其較遲的誘導(dǎo)被GM-CSF所抑制。下面，我們試圖找到一種策略，在此策略下GM-CSF的作用可被促進(jìn)到接近用G-CSF單獨(dú)治療的程度，如增加急性缺血心肌中趨化信號。由于CD34+骨髓干細(xì)胞的趨化作用被CD34+細(xì)胞上的CXCR4受體和CXC趨化因子SDF-1之間的相互作用所調(diào)節(jié)，我們研究了SDF-1 mRNA的表達(dá)是否在急性缺血心肌中被誘導(dǎo)。如圖18所示，LAD結(jié)扎后48小時的實(shí)驗(yàn)動物心肌SDF-1 mRNA的表達(dá)與非缺血對照相比未觀察到任何區(qū)別。梗死后2周，心肌SDF-1 mRNA表達(dá)比鹽水處理對照增加了3.3倍(p＜0.01)。我們認(rèn)為這種延遲的SDF-1合成最可能的是反映了巨噬細(xì)胞等浸潤細(xì)胞的加工作用。相反，使用合成的GM-CSF兩周后引起SDF-1 mRNA表達(dá)大約4.5倍的抑制，降到實(shí)際比非缺血對照還低的水平。由于SDF-1是內(nèi)皮祖細(xì)胞有效的趨化因子，這些數(shù)據(jù)暗示使用合成的GM-CSF可能會因降低了SDF-1等趨化因子配體的心肌表達(dá)而導(dǎo)致內(nèi)皮祖細(xì)胞的次最佳的心肌尋靶。
急性心肌梗死后心內(nèi)注射SDF-1導(dǎo)致了新血管形成和抵抗心肌細(xì)胞凋亡。為了確定急性缺血心臟中改變了的SDF-1表達(dá)是否影響內(nèi)皮祖細(xì)胞的趨化作用和心肌功能，我們檢測了LAD結(jié)扎后48直接心內(nèi)注射SDF-1蛋白的效果。如圖19(a)和(b)所示，LAD結(jié)扎后2天在5個梗死周圍位點(diǎn)心內(nèi)注射總體積0.2ml的4ug/kg人重組SDF-1，兩周后與接受心內(nèi)注射鹽水的對照動物相比，新血管形成增加了5倍，梗死周圍區(qū)凋亡的心肌細(xì)胞減少了44+9％(兩者均有p＜0.05)。心內(nèi)注射SDF-1對新血管形成及抵抗心肌細(xì)胞凋亡程度的作用與G-CSF全身給藥得到的結(jié)果十分相近。盡管外加GM-CSF皮下給藥導(dǎo)致了心肌新血管形成的協(xié)同增加，未見有另外的抵抗心肌細(xì)胞凋亡的益處。這些結(jié)果暗示新血管形成誘導(dǎo)的抵抗心肌細(xì)胞凋亡作用是有限的，不能通過誘導(dǎo)另外的新血管而進(jìn)一步改善。
心內(nèi)注射SDF-1誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞再生。如圖20(a)所示，LAD結(jié)扎后2天在5個梗死周圍位點(diǎn)心內(nèi)注射總體積0.2ml的4ug/kg人重組SDF-1，兩周后與接受心內(nèi)注射鹽水的對照動物相比，處于細(xì)胞周期中的細(xì)胞數(shù)量增加了4.5倍(p＜0.01)。附加GM-CSF的全身給藥則導(dǎo)致心肌細(xì)胞再生的協(xié)同效應(yīng)。值得注意的是，經(jīng)SDF-1和GM-CSF結(jié)合治療的動物梗死周圍區(qū)的處于細(xì)胞周期內(nèi)的心肌細(xì)胞數(shù)量超過了只接受G-CSF治療的動物(分別比鹽水處理的對照高7倍和3.2倍，p＜0.01)。由于SDF-1和GM-CSF結(jié)合治療的動物梗死周圍區(qū)大內(nèi)腔血管的平均數(shù)量與只接受G-CSF治療的動物相似(分別為8.0和7.5/高倍視野)，因此這些數(shù)據(jù)暗示SDF-1增強(qiáng)心肌細(xì)胞循環(huán)/再生是通過與誘導(dǎo)新血管形成所不同的另外的機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。
心內(nèi)注射SDF-1改善了心臟功能并與骨髓活化有協(xié)同作用。心內(nèi)注射SDF-1導(dǎo)致了與G-CSF系統(tǒng)給藥相似程度的功能性心肌恢復(fù)(LAD結(jié)扎后2-14天之間射血分?jǐn)?shù)平均增加了10％，接受G-CSF治療的動物平均增加了10％，而鹽水處理的對照平均減少了17％，兩種治療均有p＜0.01)。最引人注意的是，SDF-1注射與用GM-CSF使骨髓活化相結(jié)合導(dǎo)致了功能恢復(fù)的顯著提高(射血分?jǐn)?shù)平均提高了21％，p＜0.01)，圖20(b)。這些數(shù)據(jù)表明心內(nèi)注射SDF-1通過兩種獨(dú)立的機(jī)制使急性缺血后心臟功能得到改善，一種直接的機(jī)制包括誘導(dǎo)心肌細(xì)胞循環(huán)和再生，另一種間接的機(jī)制通過增強(qiáng)活化的骨髓衍生性內(nèi)皮祖細(xì)胞的趨化作用和增強(qiáng)心臟新血管形成來發(fā)揮作用。最佳結(jié)果可能出現(xiàn)于心內(nèi)聯(lián)合使用SDF-1和最有效的骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞活化劑，包括G-CSF和其它抑制骨髓內(nèi)CXCR4與SDF-1相互作用的試劑。
方法與材料趨化因子活化了的人CD34+細(xì)胞的純化和鑒定從連續(xù)四天每天接受10mg/kg G-CSF(Amgen，CA)的人體內(nèi)獲得單個供體的白細(xì)胞去除后的產(chǎn)物。供體是為異源干細(xì)胞移植而經(jīng)歷骨髓活化、收獲和分離等標(biāo)準(zhǔn)通用程序的健康個體。單核細(xì)胞通過菲柯爾-泛影鈉分離，通過利用包被了抗CD34單克隆抗體的磁珠(Miltenyi Biotech，CA)得到高純CD34+細(xì)胞(＞98％陽性)。純化了的CD34細(xì)胞經(jīng)熒光素染色，這些熒光素偶聯(lián)抗CD34和CD117(Becton Dickinson，CA)，AC133(Miltenyi Biotech，CA)，CD54(Immunotech，CA)，CD62E(BioSource，MA)，VEGFR-2，Tie-2，vWF，eNOS，CXCR1，CXCR2，和CXCR4(所有Santa Cruz Biotech，CA)的單克隆抗體，染色后用FACScan(Becton Dickinson，CA)四參數(shù)熒光法進(jìn)行分析。選出的CD34表達(dá)陽性細(xì)胞再經(jīng)偶聯(lián)抗CD117單克隆抗體的藻紅蛋白(PE)(BectonDickinson，CA)染色，然后用Facstar Plus(Becton Dickinson)和PE過濾器分成亮熒光和暗熒光。GATA-2的細(xì)胞內(nèi)染色，用PharmingenCytofix/CytopermTM試劑盒從每個發(fā)亮熒光和暗熒光的細(xì)胞群中透化處理一百萬個細(xì)胞，和1μl偶聯(lián)CD117和CD34表面抗原的雙抗單克隆抗體的熒光染料(Becton Dickinson，CA)冰上共育30分鐘。4℃下重懸于250μlCytofix/CytopermTM溶液后20分鐘，再將細(xì)胞與抗GATA-2單克隆抗體或抗IgG對照標(biāo)記的熒光染料4℃下溫育30分鐘，然后用三參數(shù)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)進(jìn)行分析。
人骨髓衍生性內(nèi)皮祖細(xì)胞的趨化作用高純CD34+和CD117亮(＞98％純度)t細(xì)胞置于有膜48孔趨化作用板上(8mm孔)(Neuro Probe，MD)。37℃溫育2小時后，將板倒置，細(xì)胞在含有濃度分別為0.2，1.0和5.0μg/ml的IL-8，SDF-1α/β，和SCF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)3小時。膜用甲醇固定并經(jīng)LeukostatTM(Fischer Scientific，Ill)染色。通過10個高倍視野內(nèi)的遷移細(xì)胞計(jì)數(shù)來計(jì)算趨化作用。
實(shí)驗(yàn)動物，外科手術(shù)過程，人細(xì)胞注射，和細(xì)胞遷移入組織的定量Rowett(rnu/rnu)無胸腺裸大鼠(Harlan Sprague Dawley，Indianapolis，Indiana)經(jīng)“哥倫比亞大學(xué)動物保護(hù)和使用委員會”認(rèn)可后用于實(shí)驗(yàn)研究。麻醉后，實(shí)施左胸廓開胸術(shù)，打開心包膜，然后結(jié)扎左前降支(LAD)冠狀動脈。假手術(shù)的大鼠經(jīng)歷相似的手術(shù)過程，但沒有冠狀動脈的縫合。對于細(xì)胞遷移研究，LAD結(jié)扎后48小時把從G-CSF活化的單一供體得到的2.0×106CD34+細(xì)胞單獨(dú)或與50μg/ml已知抑制功能活性的抗人CXCR1，人CXCR2，人CXCR4，大鼠SDF-1(均來自R&D Systems，MN)，人CD34(Pharmingen，CA)，或大鼠IL-8(ImmunoLaboratories，日本)單克隆抗體共同注射入尾靜脈。對照動物L(fēng)AD結(jié)扎后接受同一濃度的同類對照抗體或鹽水。注射前，將2.0×106人細(xì)胞和2.5μg/mL熒光羰花青(carbocyanine)DiI染料在37℃下共同孵育5分鐘，然后在4℃下孵育15分鐘。用PBS洗滌后，DiI標(biāo)記的人細(xì)胞重懸于鹽水并靜脈注射。2.0×106CD34+人細(xì)胞也注射入假手術(shù)大鼠或接受了三次人IL-8，SDF-1，SCF或鹽水注射的大鼠的尾靜脈中。每組由6-10只大鼠構(gòu)成。通過測定注射兩天后被處死的大鼠心臟內(nèi)的DiI熒光強(qiáng)度定量測定人細(xì)胞注射后的心肌細(xì)胞浸潤(表示為每個高倍視野DiI陽性細(xì)胞的數(shù)量，每個樣品至少檢測5個高倍視野)。對12只大鼠在基線，2、7、14天時人細(xì)胞對大鼠骨髓滲入度的定量測定通過用流式細(xì)胞和RT-PCR技術(shù)分析I類HLA陽性細(xì)胞與大鼠骨髓細(xì)胞總量的比值來進(jìn)行。對于新血管形成和其對心肌存活性及功能的影響的研究，從G-CSF活化的單一供體得到的2.0×106DiI標(biāo)記人CD34+細(xì)胞用103，105，或2.0×105免疫純的CD34+CD117亮細(xì)胞重建，在LAD結(jié)扎后48小時注入到大鼠尾靜脈中，同時使用或不使用已知抑制活性的抗CXCR4單克隆抗體。每組包括6-10只大鼠。在第2周和第15周進(jìn)行組織和功能研究。
大鼠CXC趨化因子mRNA和蛋白表達(dá)的測定用標(biāo)準(zhǔn)方法從3只正常和12只LAD結(jié)扎的大鼠心臟中提取Poly(A)+mRNA。用RT-PCR定量測定大鼠IL-8和Gro-αmRNA在基線以及LAD結(jié)扎后6、12、24和48小時的心肌表達(dá)，用GAPDH表達(dá)測定的大鼠mRNA總量進(jìn)行歸一化。用寡(dT)15-鏈節(jié)(mer)和隨機(jī)六聚物啟動，被莫洛尼氏白血病毒反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)反轉(zhuǎn)錄后，用Taq聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，放射性標(biāo)記的雙脫氧核苷酸([a32P]-ddATP3,000Ci/mmol，Amersham，Arlington Heights，IL)，和大鼠Cinc(人IL-8/Gro-α的大鼠同源物和GAPDH，F(xiàn)isher Genosys，CA)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。大鼠Cinc和GAPDH的引物對(正鏈/反義鏈)分別是gaagatagattgcaccgatg(SEQ ID NO4)/catagcctctcacatttc SEQ ID NO5)，gcgcccgtccgccaatgagctgcgc SEQ ID NO6)/cttggggacacccttcagcatcttttgg SEQID NO7)，和ctctacccacggcaagttcaa SEQ ID NO8)/gggatgaccttgcccacagcSEQ ID NO9)。標(biāo)記了的樣品加樣于2％瓊脂糖凝膠，用電泳分離，并于-70℃下放射自顯影6小時。用市售抗IL-8/Gro大鼠同源Cinc多克隆抗體ELISA試劑盒(ImmunoLaboratories，日本)檢測LAD結(jié)扎6、12、24、48小時及基線的大鼠IL-8/Gro-α在血清中的水平。每個血清樣品中的蛋白量根據(jù)用通過已知大鼠IL-8/Gro-α蛋白濃度建立的吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。抗Cinc抗體還根據(jù)制造商的說明書稀釋1∶200倍用于免疫組化研究以鑒別LAD結(jié)扎后的大鼠心肌Cinc合成的細(xì)胞來源。染色陽性的細(xì)胞在下述抗生物素蛋白/生物素系統(tǒng)中顯棕色。
組織學(xué)及梗死尺寸測量在第2周和第15周切除后，每個實(shí)驗(yàn)動物的左心室從上至下被切成10-15個橫剖面。有代表性的切片用福爾馬林固定并作常規(guī)組織學(xué)染色(H&E)以檢測心肌的細(xì)胞構(gòu)成，表示為每個高倍視野(HPF)的細(xì)胞數(shù)量(600x)。馬森三染色，將膠原染成藍(lán)色而心肌染成紅色，被用來半定量(0-3+)評估膠原含量，1+為淺藍(lán)，2+為淺藍(lán)和深藍(lán)斑點(diǎn)，3+為深藍(lán)染色。這使心肌瘢痕的尺寸能通過數(shù)碼相機(jī)分析儀進(jìn)行檢測。梗死表面的長度，包括心表和心內(nèi)區(qū)，通過一種數(shù)碼成像面積分析儀進(jìn)行測量并表示為心室總周長的百分?jǐn)?shù)。最終的梗死尺寸取每個心臟樣品的所有切片的均值進(jìn)行計(jì)算。所有研究對操作實(shí)驗(yàn)的病理學(xué)家保密。梗死尺寸表示為左心室面積的百分?jǐn)?shù)。最終的梗死尺寸取每個心臟樣品的所有切片的均值進(jìn)行計(jì)算。
毛細(xì)血管密度定量為了定量測定毛細(xì)血管密度及其種群來源，另外的切片用定向抗大鼠或人CD31(分別是Serotec，UK，和ResearchDiagnostics，NJ)，VIII因子(Dako，CA)和大鼠或人I類MHC(AccurateChemicals，CT)的單克隆抗體(Accurate Chemicals，CT)進(jìn)行新鮮染色。在平滑肌層存在下從大毛細(xì)血管中分離出小動脈，并用抗肌肉特異性結(jié)蛋白單克隆抗體(Dako，Ca)對切片染色以進(jìn)行鑒別。使用抗生物素蛋白/生物素封閉試劑盒，大鼠可吸收的生物素?？故驣gG，和過氧化物酶結(jié)合劑(均自Vector Laboratories Burlingame，CA)進(jìn)行過氧化物免疫酶標(biāo)記法染色。梗死兩周后用抗CD31單克隆抗體標(biāo)記的切片確定毛細(xì)血管密度，并用抗VIII因子的單克隆抗體驗(yàn)證，與未受損心肌中毛細(xì)血管密度相對比。結(jié)果表示為每HPF(400x)CD31陽性毛細(xì)血管數(shù)。
心肌細(xì)胞增殖的定量測定心肌細(xì)胞DNA合成及細(xì)胞循環(huán)通過對注射了鹽水或人CD34+細(xì)胞兩周后的LAD結(jié)扎心肌組織切片進(jìn)行心肌細(xì)胞特異性肌鈣蛋白I和人或鼠特異性Ki67雙染色而測定，用健康大鼠作為陰性對照。簡單地說，石臘包埋的切片在0.1M EDTA緩沖液中用微波爐加熱，然后用1∶3000稀釋的抗大鼠Ki-67初級單克隆抗體(贈自GiorgioCatoretti，Columbia University)或1∶300稀釋的人Ki-67初級單克隆抗體(Dako，CA)進(jìn)行染色并于4℃培育過夜。洗滌后，切片與和堿性磷酸酶以1∶200稀釋比例相連的種特異性第二抗體(Vector Laboratories Burlingame，CA)共同溫育30分鐘，正染色的細(xì)胞核用BCIP/NBT底物試劑盒(Dako，CA)顯為藍(lán)色。然后切片在4℃與抗心肌特異性肌鈣蛋白I單克隆抗體(AccurateChemicals，CT)共同溫育過夜，正染色的細(xì)胞用上述抗生物素蛋白/生物素系統(tǒng)顯為棕色。心肌細(xì)胞在梗死區(qū)，梗死周圍區(qū)和遠(yuǎn)離梗死區(qū)域的細(xì)胞循環(huán)進(jìn)程以每個高倍視野表達(dá)Ki-67的肌鈣蛋白陽性細(xì)胞的比例計(jì)算。
用石臘組織切片DNA末端標(biāo)記技術(shù)測定心肌細(xì)胞凋亡對于單細(xì)胞水平的凋亡原位檢測我們采用了脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)(BoehringerMannheim，Mannheim，德國)介導(dǎo)的DNA末端標(biāo)記TUNEL法。大鼠心肌組織切片來自注射了鹽水或人CD34+細(xì)胞兩周后的LAD結(jié)扎的大鼠，以來自健康大鼠的相應(yīng)切片作為陰性對照。簡單地說，組織用二甲苯去石臘，用分級乙醇和兩次磷酸緩沖液(PBS)洗滌脫水。然后組織切片用蛋白酶K(10μg/ml溶于Tris/HCL)在37℃下消化30分鐘。然后將切片在PBS中洗滌3次，與50μl TUNEL反應(yīng)混合液(TdT和熒光標(biāo)記的dUTP)在37℃濕潤空氣中共同溫育60分鐘。陰性對照的TdT根據(jù)反應(yīng)混合液估算。在PBS中洗滌3次后，切片與熒光偶聯(lián)堿性磷酸酶(AP)特異性抗體(Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)共同孵育30分鐘。TUNEL染色在一種使細(xì)胞核中DNA片斷染為藍(lán)色的底物系統(tǒng)中顯色(BCIP/NBTsubstrate system，Dako，Carpinteria，CA)。置于于PBS中3分鐘使該反應(yīng)終止。為了確定心肌中染成藍(lán)色的凋亡細(xì)胞核的比例，用結(jié)蛋白特異性單克隆抗體對組織復(fù)染。用3％過氧化氫酶的PBS溶液作用15分鐘以封閉內(nèi)生性過氧化物酶，然后用20％山羊血清溶液洗滌?？辜♀}蛋白I抗體(Accurate Chemicals，CT)在40℃下孵育過夜(1∶200)。3次洗滌后，用抗兔IgG抗體作用切片，然后用生物素偶聯(lián)的二抗(Sigma，Saint Louis，Missouri)作用30分鐘。加入抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物(Vector Laboratories，Burlingame，CA)再作用30分鐘，置于DAB溶液混合物(Sigma，Saint Louis，Missouri)中5分鐘后肌細(xì)胞顯棕色。組織切處用顯微鏡在200倍放大下觀察。在每個200x鏡區(qū)檢察4個區(qū)域，每區(qū)域包含至少250個細(xì)胞和計(jì)約1mm2組織，包括梗死周圍區(qū)和遠(yuǎn)離梗死區(qū)。組織邊緣的被染色的細(xì)胞不被計(jì)數(shù)。結(jié)果表示為每個檢測位置上每平方毫米凋亡心肌細(xì)胞的平均數(shù)量。
心臟功能分析用一種高頻線性傳感器陣列(SONOS 5500，HewlettPackard，Andover，MA)進(jìn)行超聲心動圖研究。二維圖象通過中間乳突(mid-papillary)和頂端水平得到。舒張末期(EDV)和收縮末期(ESV)左心室體積通過雙-平面區(qū)域長度法得到，左心室射血分?jǐn)?shù)的百分?jǐn)?shù)依[(EDV-ESV)/EDV]×100計(jì)算。
CDNA減除雜交法簡單地說，從每個心臟中分離信使RNA，1μg用于用隨機(jī)引物合成cDNA的第一鏈。減除雜交法使用了PCR選擇cDAN減除試劑盒(CLONTECH)，依制造商的建議操作。當(dāng)?shù)诙満铣珊?，這兩個cDNA文庫用RsaI進(jìn)行消化?！霸囼?yàn)者(tester)”文庫的消化產(chǎn)物連接到一個特殊受體上(T7啟動子)，然后與30倍過量的減除“驅(qū)動(driver)”文庫雜交。雜交后得到的產(chǎn)物用PCR進(jìn)行擴(kuò)增。正向減除確定了缺血樣品中被過表達(dá)的基因，其中缺血組織是那個“試驗(yàn)者”，而正常組織是那個“驅(qū)動者”。在反向減除中，“試驗(yàn)者”和“驅(qū)動者”變成用來確定缺血樣品中被負(fù)調(diào)控了的蛋白。
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實(shí)驗(yàn)結(jié)果II靜脈施用人骨髓衍生性內(nèi)皮祖細(xì)胞誘導(dǎo)梗死后五天內(nèi)新血管形成并防止心肌細(xì)胞凋亡。
我們試圖確定在大鼠永久性LAD結(jié)扎的48小時內(nèi)靜脈注射人骨髓衍生性內(nèi)皮祖細(xì)胞會使心臟在多久時間內(nèi)發(fā)生新血管形成。當(dāng)動物在靜脈注射通過G-CSF活化得到的DiI標(biāo)記的人CD34+細(xì)胞(＞98％ CD34純，含6-12％CD117亮成血管細(xì)胞)兩天后被處死時，梗死周圍區(qū)可見大量DiI陽性的間質(zhì)細(xì)胞，但無法鑒別出表達(dá)DiI的確定的血管結(jié)構(gòu)，數(shù)據(jù)未顯示。相反，注入人CD34+細(xì)胞五天后被處死的動物在梗死周圍區(qū)域表現(xiàn)出大量的DiI陽性血管結(jié)構(gòu)，并且毛細(xì)血管的數(shù)量比接受鹽水的大鼠高3.5倍，圖21(a)(p＜0.01)。第五天心肌毛細(xì)血管的增長伴隨著梗死周圍區(qū)心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量相對于接受鹽水的對照動物3.3倍的降低，這通過肌鈣蛋白I和TUNEL雙染陽性來確定，圖21(b)(p＜0.01)。這些數(shù)據(jù)共同表明從骨髓衍生性成血管細(xì)胞分化和組織成成熟的、有功能的缺血心肌毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)的血管生成過程需要2到5天的時間。
人骨髓衍生性內(nèi)皮祖細(xì)胞的靜脈內(nèi)給藥誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞祖細(xì)胞的細(xì)胞循環(huán)和心肌細(xì)胞分化。
我們用免疫組織化學(xué)方法和聚焦顯微術(shù)對五天時處死的實(shí)驗(yàn)動物和對照動物的心臟組織檢查以尋找心肌細(xì)胞循環(huán)的證據(jù)，據(jù)認(rèn)為這在急性局部缺血后的成人心臟內(nèi)可能很少發(fā)生。盡管實(shí)驗(yàn)動物和對照動物在梗死后5天都未檢測到肌鈣蛋白陽性的心肌細(xì)胞循環(huán)，但接受人骨髓衍生性CD34+細(xì)胞的動物在梗死周圍區(qū)域表現(xiàn)出大量小的，循環(huán)著的大鼠源的細(xì)胞簇，這些通過大鼠Ki67特異性單克隆抗體確定。這些細(xì)胞對心肌細(xì)胞分化的標(biāo)志物心肌特異性肌鈣蛋白I呈陰性，但呈α-肌節(jié)肌動蛋白染色陽性，表明它們是成熟的心肌譜系細(xì)胞。在注射鹽水的對照動物中未見有類似的循環(huán)著的心肌細(xì)胞簇。
使用人CD34+細(xì)胞兩周后處死的動物組織不再呈現(xiàn)小的，循環(huán)著的心肌祖細(xì)胞簇，取而代之的是在梗死周圍區(qū)域高頻率的大的、具有可檢測的DNA活性的成熟大鼠心肌細(xì)胞，這通過抗心肌細(xì)胞特異性肌鈣蛋白I和大鼠Ki67單克隆抗體雙染色而確定，圖22(b)和(c)。接受人內(nèi)皮祖細(xì)胞的動物體內(nèi)梗死周圍區(qū)域的成熟心肌細(xì)胞數(shù)量比LAD結(jié)扎的接受鹽水的對高4倍(p＜0.01)，后者中有高頻率的呈成纖維細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞，它們與大鼠Ki67反應(yīng)，但不與肌鈣蛋白I反應(yīng)。我們推測梗死后接受人內(nèi)皮祖細(xì)胞14天后的動物身上看到的循環(huán)著的成熟的心肌細(xì)胞是5天時在相同解剖學(xué)部位看到的小的循環(huán)著的不成熟心肌祖細(xì)胞隨著新血管形成而分化的結(jié)果。究竟這些循環(huán)著的心肌祖細(xì)胞是通常駐留于心臟中處于休眠期的原位心臟干細(xì)胞，還是從體內(nèi)別處遷移到心臟來的，還有待研究。
HBP23，一種大鼠保護(hù)細(xì)胞抵抗氧自由基損傷的peroxiredoxin，在心肌的表達(dá)因缺血而降低，因新血管形成而升高。下面我們試圖鑒別一種分子機(jī)制以解釋梗死周圍區(qū)新血管形成和鄰近區(qū)域心肌祖細(xì)胞增殖/再生的關(guān)系。首先我們進(jìn)行cDNA減除雜交以鑒別正常大鼠心臟和LAD結(jié)扎后48小時大鼠心臟在基因表達(dá)上的變化模式。由于隨著心肌梗死發(fā)生的抗氧化劑的不足及氧化應(yīng)激的增加已經(jīng)直接關(guān)系到梗死后心臟衰竭的發(fā)病機(jī)理(13-15)，因此我們選擇檢測特定抗氧化劑基因表達(dá)的變化。有一組稱為peroxiredoxin的抗氧化劑家族，表現(xiàn)過氧化物酶活性(16)并被氧氣所誘導(dǎo)(17)，對調(diào)節(jié)細(xì)胞在缺血等氧化應(yīng)激期間得以存活起到關(guān)鍵作用。它們通過進(jìn)行可逆氧化還原反應(yīng)幫助保持半胱氨酸的巰基二氧化物狀態(tài)，其中的氧化還原反應(yīng)包括電子經(jīng)與硫氧還蛋白(TRX)間形成的二硫鍵傳遞，TRX構(gòu)成了哺乳動物細(xì)胞間的主要還原系統(tǒng)之一(18)。另外，peroxiredoxin能抑制被氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的c-Abl酪氨酸激酶活性(19，20)，還能把細(xì)胞從活化的c-Abl基因產(chǎn)物所誘導(dǎo)的前凋亡狀態(tài)或細(xì)胞周期停滯狀態(tài)中解救出來(21)。通過cDNA減除雜交，我們發(fā)現(xiàn)LAD結(jié)扎48小時后的大鼠心臟中大鼠peroxiredoxin HBP23 mRNA的表達(dá)比正常大鼠心臟減少了。RT-PCR表明，LAD結(jié)扎后兩周后大鼠心臟內(nèi)的HBP23 mRNA水平比正常大鼠平均下降了34％，圖23(p＜0.01)。相反，LAD結(jié)扎后接受了人成血管細(xì)胞兩周后大鼠心臟內(nèi)的HBP23 mRNA水平回復(fù)到比未缺血對照只差14％。由于peroxiredoxin mRNA的表達(dá)被氧氣所誘導(dǎo)，這些數(shù)據(jù)說明HBP23mRNA的表達(dá)可能為急性缺血事件所抑制，也可能被隨后的血管生成細(xì)胞依賴性新血管形成所誘導(dǎo)。
生成一種DNA酶以切割HBP23 mRNA。為了研究誘導(dǎo)的HBP23表達(dá)是否與新血管形成影響心肌細(xì)胞凋亡、再生/增殖及功能有關(guān)，我們合成了一種催化性DNA酶，其靶序列為大鼠HBP23基因上的特殊序列(22，23)。我們選擇特異性靶向大鼠HBP23上翻譯起始位點(diǎn)AUG附近的嘧啶-嘌呤連結(jié)處，該區(qū)域在不同物種之間保守并具有低的相對自由能(24)。在這個區(qū)域，大鼠HBP23序列與人的同源基因，增殖相關(guān)基因(PAG)，只相差一個堿基。為了合成對照DNA酶，HBP23 DNA酶兩條側(cè)臂上的核苷酸序列被打亂而未改變催化域。每個分子的3’端加了反向3’-3’相連的胸腺嘧啶帽以抵抗3’-到-5’核酸外切酶的消化。
該HBP23特異性DNA酶以一種劑量和時間依賴性方式對根據(jù)HBP23mRNA序列合成的23-堿基寡核苷酸進(jìn)行切割，圖24(a)。相反，該DNA酶不能切割由與大鼠HBP23寡核苷酸只相差一個堿基的人同源基因PAG合成的23-堿基寡核苷酸，表明了其精密的目標(biāo)特異性。一種對人PAG基因同樣翻譯起始位點(diǎn)有特異性的酶能有效切割PAG寡核苷酸，但不能切割由HBP23合成的寡核苷酸(數(shù)據(jù)未顯示)。雜環(huán)的對照DNA酶不能切割二者中的任何一個。為了確定該DNA酶對內(nèi)生性HBP23合成的作用，取自大鼠胎兒心臟的心肌單分子層被培養(yǎng)至?xí)喜⒂梅N性特異性DNA酶或雜混(scrambled)對照進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞mRNA反轉(zhuǎn)錄后RT-PCR產(chǎn)物的光密度分析顯示HBP23 DNA酶抑制所培養(yǎng)大鼠細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的mRNA水平比雜混DNA對照低了80％，圖24(b)。
DNA酶的體內(nèi)給藥防止了大鼠心肌內(nèi)HBP23 mRNA的誘導(dǎo)新血管形成不受影響，但其對心肌細(xì)胞凋亡、再生和功能的影響被消除了。為了研究實(shí)驗(yàn)中心肌梗死體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)的HBP23的作用，向LAD結(jié)扎后48小時的大鼠靜脈注射人骨髓衍生性內(nèi)皮祖細(xì)胞和心肌注射HBP23 DNA酶或雜混對照。如圖25(a)所示，HBP23 DNA酶對人骨髓衍生性成血管細(xì)胞誘導(dǎo)新血管形成并無影響。給藥5天后被處死時，接受人內(nèi)皮祖細(xì)胞的大鼠，無論共同注射的是HBP23 DNA還是雜混對照，與鹽水對照相比都顯示出毛細(xì)胞血管密度增加。然而，注射HBP23 DNA消除了新血管形成的抗細(xì)胞凋亡作用，圖25(b)，和心臟功能和促進(jìn)，圖25(c)，而注射雜混對照則無此現(xiàn)象。在接受了人內(nèi)皮祖細(xì)胞并表現(xiàn)出心肌新血管形成的動物中，HBP23 DNA酶處理導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡水平增加了1.7倍(p＜0.01)，并且超聲心動圖顯像表明心臟功能平均下降了38％(p＜0.01)。另外，HBP23DNA酶對心肌祖細(xì)胞增殖/再生也有顯著的影響。然而在接受成血管細(xì)胞和雜混DNA的動物中可輕易檢測到梗死周圍區(qū)表達(dá)Ki67和α-肌節(jié)肌動蛋白的大鼠小細(xì)胞簇，在接受HBP23 DNA酶的動物中則檢測不到。這些結(jié)果清楚地表明成血管細(xì)胞依賴性新血管形成保護(hù)了心肌細(xì)胞免于凋亡并通過peroxiredoxin基因產(chǎn)物所調(diào)節(jié)的途徑誘導(dǎo)駐留的心肌細(xì)胞譜系祖細(xì)胞增殖/再生。
討論在本研究中我們顯示由人骨髓衍生性內(nèi)皮祖細(xì)胞引起的缺血心肌新血管形成不但保護(hù)了梗死周圍區(qū)域成熟心肌細(xì)胞免于凋亡，而且還刺激了該位置心肌祖細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)、增殖和再生。而且，我們顯示看起來成血管細(xì)胞依賴性新血管形成調(diào)節(jié)心肌存活和自我更新的機(jī)制中至少包括了一個基因家族涉及氧化應(yīng)激伴隨的抗凋亡和前增殖途徑，peroxiredoxin家族。雖然氧張力正向調(diào)節(jié)peroxiredoxin基因的表達(dá)(17)，但這是否是成血管細(xì)胞介導(dǎo)的新血管形成對HBP mRNA表達(dá)有正向影響的唯一解釋還不清楚。由于peroxiredoxin mRNA表達(dá)被蛋白激酶Cδ所誘導(dǎo)(25)，因此骨髓衍生性成血管細(xì)胞有可能是調(diào)節(jié)蛋白激酶Cδ活性并進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞存活的細(xì)胞外信號來源，如FGF-1(26)。
伴隨著心肌梗死而產(chǎn)生的抗氧化劑缺乏和氧化應(yīng)激增加與梗死后心臟衰竭有直接關(guān)系(13-15)。我們的研究表明梗死后降低了的peroxiredoxin水平可能是隨后左心室改變及衰竭的直接原因。peroxiredoxin的抗氧化作用與TRX系統(tǒng)生理電子供體的活性相偶聯(lián)(27-29)。另外為了直接與TRX相作用，peroxiredoxin基因產(chǎn)物特異性結(jié)合于一種非受體酪氨酸激酶c-Abl的SH3域以抑制其活性(21)。由DNA損傷試劑等刺激通過SH3域引起的c-Abl活化誘導(dǎo)了細(xì)胞生長停滯于G1期或細(xì)胞凋亡(30)。細(xì)胞循環(huán)停滯依賴于c-Abl的激酶活性，該活性對細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶Cdk2進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)并誘導(dǎo)p21的表達(dá)(31)。通過在體內(nèi)與c-Abl相結(jié)合，peroxiredoxin能夠抑制由c-Abl過表達(dá)引起的酪氨酸磷酸化并將細(xì)胞從活化了的c-Abl基因產(chǎn)物的細(xì)胞生長抑制作用和促凋亡效應(yīng)中解救出來(32)。我們的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明與定向抗大鼠peroxiredoxin HBP23的DNA酶同時使用消除了缺血大鼠心臟中人成血管細(xì)胞依賴性新血管形成的抗凋亡和前增殖作用，這強(qiáng)烈證明這個基因家族是與新血管形成促進(jìn)心臟功能并防止心臟衰竭這一行為的機(jī)制直接相關(guān)的。
年輕和年老細(xì)胞混合存在于正常心肌的整個生命周期中。盡管大多數(shù)肌細(xì)胞似乎是終端分化了的，仍然有一部分年輕的肌細(xì)胞保留了復(fù)制的能力(33)。在本實(shí)驗(yàn)中，人成血管細(xì)胞依賴性新血管形成在五天內(nèi)導(dǎo)致梗死周圍區(qū)小的內(nèi)生性大鼠心肌細(xì)胞前體的增殖。分裂著的肌細(xì)胞前體可通過免疫組織化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒別，其基礎(chǔ)是細(xì)胞表面有α-肌節(jié)肌動纖維但無肌鈣蛋白I的表達(dá)，以及通過大鼠Ki67特異性抗體確定的增殖核結(jié)構(gòu)。由于在14天內(nèi)這個過程之后緊接著相同部位成熟、循環(huán)著的心肌細(xì)胞的增加，這通過形態(tài)學(xué)、肌鈣蛋白I在細(xì)胞表面的表達(dá)和Ki67的核內(nèi)表達(dá)確定，我們得出結(jié)論，循環(huán)著的心肌細(xì)胞前體在原位分化成為新的、成熟的、有功能的心肌細(xì)胞。究竟這些前體是從駐留的心肌干細(xì)胞庫中衍生而來還是來源于可再生的定向于損傷心肌的循環(huán)骨髓衍生性干細(xì)胞還有待確定。而且，雖然心肌細(xì)胞前體原位表達(dá)所需的信號似乎包含了，至少是部分地包含了peroxiredoxin基因家族成員所調(diào)節(jié)的途徑，心肌細(xì)胞分化所需的信號目前仍是未知。對這些問題的了解可打開操作內(nèi)生性心肌細(xì)胞生物學(xué)的可能性以改善心肌缺血后的治療過程。
方法與材料趨化因子活化了的人CD34+細(xì)胞的純化和鑒定從連續(xù)四天每天接受10mg/kg G-CSF(Amgen，CA)的人體內(nèi)獲得單個供體的白細(xì)胞去除后的產(chǎn)物。供體是為異源干細(xì)胞移植而經(jīng)歷骨髓活化、收獲和分離等標(biāo)準(zhǔn)通用程序的健康個體。單核細(xì)胞通過菲柯爾-泛影鈉分離，通過利用包被了抗CD34單克隆抗體的磁珠(Miltenyi Biotech，CA)得到高純CD34+細(xì)胞(＞98％陽性)。純化了的CD34細(xì)胞經(jīng)熒光素染色，這些熒光素偶聯(lián)抗CD34和CD117(Becton Dickinson，CA)，AC133(Miltenyi Biotech，CA)，CD54(Immunotech，CA)，CD62E(BioSource，MA)，VEGFR-2，Tie-2，vWF，eNOS，CXCR1，CXCR2，和CXCR4(所有Santa Cruz Biotech，CA)的單克隆抗體，染色后用FACScan(Becton Dickinson，CA)四參數(shù)熒光法進(jìn)行分析。選出的CD34表達(dá)陽性細(xì)胞再經(jīng)偶聯(lián)抗CD117單克隆抗體的藻紅蛋白(PE)(BectonDickinson，CA)染色，然后用Facstar Plus(Becton Dickinson)和PE過濾器分成亮熒光和暗熒光。GATA-2的細(xì)胞內(nèi)染色，用PharmingenCytofix/CytopermTM試劑盒從每個發(fā)亮熒光和暗熒光的細(xì)胞群中透化處理一百萬個細(xì)胞，和1μl偶聯(lián)CD117和CD34表面抗原的雙抗單克隆抗體的熒光染料(Becton Dickinson，CA)冰上共育30分鐘。4℃下重懸于250μlCytofix/CytopermTM溶液后20分鐘，再將細(xì)胞與抗GATA-2單克隆抗體或抗IgG對照標(biāo)記的熒光染料4℃下溫育30分鐘，然后用三參數(shù)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)進(jìn)行分析。
實(shí)驗(yàn)動物，外科手術(shù)過程，人細(xì)胞注射。Rowett(rnu/rnu)無胸腺裸大鼠(Harlan Sprague Dawley，Indianapolis，Indiana)經(jīng)“哥倫比亞大學(xué)動物保護(hù)和使用委員會”認(rèn)可后用于實(shí)驗(yàn)研究。麻醉后，實(shí)施左胸廓開胸術(shù)，打開心包膜，然后結(jié)扎左前降支(LAD)冠狀動脈。假手術(shù)的大鼠經(jīng)歷相似的手術(shù)過程，但沒有冠狀動脈的縫合。
組織學(xué)及梗死尺寸測量在第2周和第15周切除后，每個實(shí)驗(yàn)動物的左心室從上至下被切成10-15個橫剖面。有代表性的切片用福爾馬林固定并作常規(guī)組織學(xué)染色(H&E)以檢測心肌的細(xì)胞構(gòu)成，表示為每個高倍視野(HPF)的細(xì)胞數(shù)量(600x)。馬森三染色(Masson trichrome stain)，將膠原染成藍(lán)色而心肌染成紅色，被用來半定量(0-3+)評估膠原含量，1+為淺藍(lán)，2+為淺藍(lán)和深藍(lán)斑點(diǎn)，3+為深藍(lán)染色。這使心肌瘢痕的尺寸能通過數(shù)碼相機(jī)分析儀進(jìn)行檢測。梗死表面的長度，包括心表和心內(nèi)區(qū)，通過一種數(shù)碼成像面積分析儀進(jìn)行測量并表示為心室總周長的百分?jǐn)?shù)。最終的梗死尺寸取每個心臟樣品的所有切片的均值進(jìn)行計(jì)算。所有研究對操作實(shí)驗(yàn)的病理學(xué)家保密。梗死尺寸表示為左心室面積的百分?jǐn)?shù)。最終的梗死尺寸取每個心臟樣品的所有切片的均值進(jìn)行計(jì)算。
毛細(xì)血管密度定量為了定量測定毛細(xì)血管密度及其種群來源，另外的切片用針對大鼠或人CD31(Serotec，UK，and Research Diagnostics，NJ，respectively)，factor VIII(Dako，CA)和大鼠或人I類MHC(AccurateChemicals，CT)的單克隆抗體(Accurate Chemicals，CT)進(jìn)行新鮮染色。在平滑肌層存在下從大毛細(xì)血管中分離出小動脈，并用抗肌肉特異性結(jié)蛋白單克隆抗體(Dako，Ca)對切片染色以進(jìn)行鑒別。使用抗生物素蛋白/生物素封閉試劑盒，大鼠可吸收的生物素?？故驣gG，和過氧化物酶偶聯(lián)物(均來自Vector Laboratories Burlingame，CA)進(jìn)行過氧化物免疫酶標(biāo)記法染色。梗死兩周后用抗CD31單克隆抗體標(biāo)記的切片確定毛細(xì)血管密度，并用抗VIII因子單克隆抗體驗(yàn)證，與未受損心肌中毛細(xì)血管密度相對比。結(jié)果表示為每HPF(400x)CD31陽性毛細(xì)血管數(shù)。
心肌細(xì)胞增殖的定量測定心肌細(xì)胞DNA合成及細(xì)胞循環(huán)通過對注射了鹽水或人CD34+細(xì)胞兩周后的LAD結(jié)扎心肌組織切片進(jìn)行心肌細(xì)胞特異性肌鈣蛋白I和人或鼠特異性Ki67雙染色而測定，用健康大鼠作為陰性對照。簡單地說，石臘包埋的切片在0.1M EDTA緩沖液中用微波爐加熱，然后用1∶3000稀釋的抗大鼠Ki-67初級單克隆抗體(贈自GiorgioCatoretti，Columbia University)或1∶300稀釋的人Ki-67初級單克隆抗體(Dako，CA)進(jìn)行染色并于4℃培育過夜。洗滌后，切片與和堿性磷酸酶以1∶200稀釋比例偶聯(lián)的種性特異性第二抗體(Vector Laboratories Burlingame，CA)共同培育30分鐘，正染色的細(xì)胞核用BCIP/NBT底物試劑盒(Dako，CA)顯為藍(lán)色。然后切片在4℃與抗心肌特異性肌鈣蛋白I單克隆抗體(AccurateChemicals，CT)共同培育過夜，正染色的細(xì)胞用上述素抗生物素蛋白/生物素系統(tǒng)顯為棕色。心肌細(xì)胞在梗死區(qū)，梗死周圍區(qū)和遠(yuǎn)離梗死區(qū)域的細(xì)胞循環(huán)進(jìn)程以每個高倍視野表達(dá)Ki-67的肌鈣蛋白陽性細(xì)胞的比例計(jì)算。對于共聚焦顯微鏡，異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)的兔抗鼠IgG用作檢測細(xì)胞核內(nèi)Ki67的第二抗體。一種Cy5偶聯(lián)的抗肌節(jié)肌動纖維的鼠單克隆抗體(clone 5C5；Sigma)用于檢測心肌細(xì)胞，碘化丙錠用于鑒別所有細(xì)胞核。
用石臘組織切片DNA末端標(biāo)記技術(shù)測定心肌細(xì)胞凋亡對于單細(xì)胞水平的凋亡原位檢測我們采用了脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)(BoehringerMannheim，Mannheim，德國)介導(dǎo)的DNA末端標(biāo)記TUNEL法。大鼠心肌組織切片來自注射了鹽水或人CD34+細(xì)胞兩周后的LAD結(jié)扎的大鼠，以來自健康大鼠的相應(yīng)切片作為陰性對照。簡單地說，組織用二甲苯去石臘，用分級乙醇和兩次磷酸緩沖液(PBS)洗滌脫水。然后組織切片用蛋白酶K(10μg/ml溶于Tris/HCL)在37℃下消化30分鐘。然后將切片在PBS中洗滌3次，與50μl TUNEL反應(yīng)混合液(TdT和熒光標(biāo)記的dUTP)在37℃濕潤空氣中共同溫育60分鐘。陰性對照的TdT根據(jù)反應(yīng)混合液估算。在PBS中洗滌3次后，切片與熒光偶聯(lián)堿性磷酸酶(AP)特異性抗體(Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)共同孵育30分鐘。TUNEL染色在一種使細(xì)胞核中DNA片斷染為藍(lán)色的底物系統(tǒng)中顯色(BCIP/NBTsubstrate system，Dako，Carpinteria，CA)。置于于PBS中3分鐘使該反應(yīng)終止。為了確定心肌中染成藍(lán)色的凋亡細(xì)胞核的比例，用結(jié)蛋白特異性單克隆抗體對組織復(fù)染。用3％過氧化氫酶的PBS溶液作用15分鐘以封閉內(nèi)生性過氧化物酶，然后用20％山羊血清溶液洗滌?？辜♀}蛋白I抗體(Accurate Chemicals，CT)在40℃下孵育過夜(1∶200)。3次洗滌后，用抗兔IgG抗體作用切片，然后用生物素偶聯(lián)的二抗(Sigma，Saint Louis，Missouri)作用30分鐘。加入抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物(Vector Laboratories，Burlingame，CA)再作用30分鐘，置于DAB溶液混合物(Sigma，Saint Louis，Missouri)中5分鐘后肌細(xì)胞顯棕色。組織切處用顯微鏡在200倍放大下觀察。在每個200x鏡區(qū)檢察4個區(qū)域，每區(qū)域包含至少250個細(xì)胞和計(jì)約1mm2組織，包括梗死周圍區(qū)和遠(yuǎn)離梗死區(qū)。組織邊緣的被染色的細(xì)胞不被計(jì)數(shù)。結(jié)果表示為每個檢測位置上每平方毫米凋亡心肌細(xì)胞的平均數(shù)量。
心臟功能分析用一種高頻線性傳感器陣列(SONOS 5500，HewlettPackard，Andover，MA)進(jìn)行超聲心動圖研究。二維圖象通過中間乳突(mid-papillary)和頂端水平得到。舒張末期(EDV)和收縮末期(ESV)左心室體積通過雙-平面區(qū)域長度法得到，左心室射血分?jǐn)?shù)的百分?jǐn)?shù)依[(EDV-ESV)/EDV]×100計(jì)算。
CDNA減除雜交法這項(xiàng)技術(shù)使我們能夠?qū)碜哉４笫蠛徒?jīng)歷了左前降支(LAD)冠狀動脈結(jié)扎48小時內(nèi)的大鼠心臟中基因表達(dá)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。簡單地說，從每個心臟中分離信使RNA，1μg用于用隨機(jī)引物合成cDNA的第一鏈。減除雜交法使用了PCR選擇cDAN減除試劑盒(CLONTECH)，依制造商的建議操作。當(dāng)?shù)诙満铣珊?，這兩個cDNA文庫用RsaI進(jìn)行消化?！霸囼?yàn)者(tester)”文庫的消化產(chǎn)物連接到一個特殊受體上(T7啟動子)，然后與30倍過量的減除“驅(qū)動(driver)”文庫雜交。雜交后得到的產(chǎn)物用PCR進(jìn)行擴(kuò)增。正向減除確定了缺血樣品中被過表達(dá)的基因，其中缺血組織是那個“試驗(yàn)者”，而正常組織是那個“驅(qū)動者”。在反向減除中，“試驗(yàn)者”和“驅(qū)動者”變成用來確定缺血樣品中被負(fù)調(diào)控了的蛋白。
HBP23 mRNA表達(dá)的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析用購自Qiagen的RNeasy試劑盒(Valencia，CA)從正常大鼠心臟或經(jīng)歷LAD結(jié)扎后兩周接受鹽水或人成血管細(xì)胞的大鼠心臟中提取總RNA。RNA用SMART cDNA Synthesis Kit(Clontech，Palo Alto，CA)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。在25ul體系里進(jìn)行擴(kuò)增，初始94℃ 5分鐘，然后94℃ 30秒和94℃ 1分鐘進(jìn)行26-32個循環(huán)，用TITANIUM Taq PCR試劑盒(Clontech，Palo Alto，CA)。HBP23的引物為5′-GCTGATGAAGGTATCTCTTTCAGGGGCCTC(SEQID NO10)和5′-GATGGTCTGCCCCTTACCAATAGTGGAAG(SEQ IDNO11)。大鼠GAPDH用作內(nèi)部對照(正向引物5′TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTG 3′(SEQ ID NO12)，反向引物5′CATGTGGGCCA TGAGG TCCA CCAC 3′(SEQ ID NO13))。擴(kuò)增后的溴化乙錠染色擴(kuò)增片段條帶，用密度計(jì)進(jìn)行定量。
DNA酶和RNA底物3’-3’倒置胸腺嘧啶DNA酶通過整合DNA技術(shù)(Coralville，IA)合成，通過不含RNA酶的IE-HPLC或RP-HPLC純化。與靶DNA酶序列相對應(yīng)的短鏈RNA底物通過化學(xué)方法合成后用不含RNA酶的PAGE進(jìn)行純化，也可通過DNA模板的體外轉(zhuǎn)錄而制備。通過對分別從培養(yǎng)的大鼠胎兒心肌細(xì)胞和HUVEC中提取的總RNA進(jìn)行RT-PCR來擴(kuò)增大鼠HBP23 cDNA和人PAG cDNA，采用下列引物5′TTTACCCTCTTGACTTTACTTTTGTGTGTCCCAC 3′(正向引物)和5′CCAGCTGGGCACACTTCACCATG 3′(反向引物)。把HBP23和PAGcDNA克隆到pGEM-T載體(Promega)中得到質(zhì)粒構(gòu)建體pGEM-ratHBP23和pGEM-humanPAG。cDNA序列用自動測序儀進(jìn)行驗(yàn)證。32P-標(biāo)記的核苷酸大鼠HBP23和人PAG RNA轉(zhuǎn)錄物通過20ml體系在32℃下體外轉(zhuǎn)錄(SP6聚合酶，Promega)1小時而制備。未結(jié)合的標(biāo)記物和短核苷酸(＜350堿基)通過在Chromaspin-200柱(Clontech，Palo Alto，CA)上離心而從放射性標(biāo)記的樣品中分離。合成的RNA底物用T4多核苷酸激酶進(jìn)行32P末端標(biāo)記，并與0.05％ 5uM HBP23或雜混DNA酶共同孵育。反應(yīng)可在37℃下進(jìn)行，并通過分裝入含90％甲酰胺、20mM EDTA和加樣染料的試管中而“淬滅(quenched)”。樣品用15％的TBE-尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，用-80℃下的放射自顯影進(jìn)行檢測。原代大鼠胚胎心肌細(xì)胞來自于Clonetic(USA)，在含2％FCS、100ug/ml鏈霉素和100IU/ml青霉素的培養(yǎng)基中37℃下含5％ CO2的潮濕空氣中培養(yǎng)。細(xì)胞在第6代和第8代間用于所述實(shí)驗(yàn)。分會合(70-80％)的大鼠胚胎心肌細(xì)胞用0.5ml含0.05％ 5uM HBP23或雜混DNA酶和20ug/ml陽離子脂質(zhì)(DOTAP)的無血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染。溫育8小時后細(xì)胞用Trizol試劑(LifeSciences，CA)裂解以分離用于HBP23表達(dá)的RT-PCR的RNA，如上所述。
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<221>CDS<222>(314)..(1489)<223>
<400>1aaactaaccc ctctttttct ccaaaggagt gcttgtggag atcggatctt ttctccagca 60attgggggaa agaaggcttt ttctctgact tcgcttagtg taaccagcgg cgtatatttt 120ttaggcgcct tttcgaaaac ctagtagtta atattcattt gtttaaatct tattttattt 180ttaagctcaa actgcttaag aataccttaa ttccttaaag tgaaataatt ttttgcaaag 240gggtttcctc gatttggagc tttttttttc ttccaccgtc atttctaact cttaaaacca 300actcagttcc atc atg gtg atg ttc aag aag atc aag tct ttt gag gtg349Met Val Met Phe Lys Lys Ile Lys Ser Phe Glu Val1 5 10gtc ttt aac gac cct gaa aag gtg tac ggc agt ggc gag aag gtg gct 397Val Phe Asn Asp Pro Glu Lys Val Tyr Gly Ser Gly Glu Lys Val Ala15 20 25ggc cgg gtg ata gtg gag gtg tgt gaa gtt act cgt gtc aaa gcc gtt 445Gly Arg Val Ile Val Glu Val Cys Glu Val Thr Arg Val Lys Ala Val30 35 40agg atc ctg gct tgc gga gtg gct aaa gtg ctt tgg atg cag gga tcc 493Arg Ile Leu Ala Cys Gly Val Ala Lys Val Leu Trp Met Gln Gly Ser45 50 55 60cag cag tgc aaa cag act tcg gag tac ctg cgc tat gaa gac acg ctt 541Gln Gln Cys Lys Gln Thr Ser Glu Tyr Leu Arg Tyr Glu Asp Thr Leu65 70 75ctt ctg gaa gac cag cca aca ggt gag aat gag atg gtg atc atg aga 589Leu Leu Glu Asp Gln Pro Thr Gly Glu Asn Glu Met Val Ile Met Arg80 85 90
cct gga aac aaa tat gag tac aag ttc ggc ttt gag ctt cct cag ggg 637Pro Gly Asn Lys Tyr Glu Tyr Lys Phe Gly Phe Glu Leu Pro Gln Gly95 100 105cct ctg gga aca tcc ttc aaa gga aaa tat ggg tgt gta gac tac tgg 685Pro Leu Gly Thr Ser Phe Lys Gly Lys Tyr Gly Cys Val Asp Tyr Trp110 115 120gtg aag gct ttt ctt gac cgc ccg agc cag cca act caa gag aca aag 733Val Lys Ala Phe Leu Asp Arg Pro Ser Gln Pro Thr Gln Glu Thr Lys125 130 135 140aaa aac ttt gaa gta gtg gat ctg gtg gat gtc aat acc cct gat tta 781Lys Asn Phe Glu Val Val Asp Leu Val Asp Val Asn Thr Pro Asp Leu145 150 155atg gca cct gtg tct gct aaa aaa gaa aag aaa gtt tcc tgc atg ttc 829Met Ala Pro Val Ser Ala Lys Lys Glu Lys Lys Val Ser Cys Met Phe160 165 170att cct gat ggg cgg gtg tct gtc tct gct cga att gac aga aaa gga 877Ile Pro Asp Gly Arg Val Ser Val Ser Ala Arg Ile Asp Arg Lys Gly175 180 185ttc tgt gaa ggt gat gag att tcc atc cat gct gac ttt gag aat aca 925Phe Cys Glu Gly Asp Glu Ile Ser Ile His Ala Asp Phe Glu Asn Thr190 195 200tgt tcc cga att gtg gtc ccc aaa gct gcc att gtg gcc cgc cac act 973Cys Ser Arg Ile Val Val Pro Lys Ala Ala Ile Val Ala Arg His Thr205 210 215 220tac ctt gcc aat ggc cag acc aag gtg ctg act cag aag ttg tca tca 1021Tyr Leu Ala Asn Gly Gln Thr Lys Val Leu Thr Gln Lys Leu Ser Ser225 230 235gtc aga ggc aat cat att atc tca ggg aca tgc gca tca tgg cgt ggc 1069Val Arg Gly Asn His Ile Ile Ser Gly Thr Cys Ala Ser Trp Arg Gly240 245 250aag agc ctt cgg gtt cag aag atc agg cct tct atc ctg ggc tgc aac 1117Lys Ser Leu Arg Val Gln Lys Ile Arg Pro Ser Ile Leu Gly Cys Asn255 260 265atc ctt cga gtt gaa tat tcc tta ctg atc tat gtt agc gtt cct gga 1165Ile Leu Arg Val Glu Tyr Ser Leu Leu Ile Tyr Val Ser Val Pro Gly270 275 280tcc aag aag gtc atc ctt gac ctg ccc ctg gta att ggc agc aga tca 1213Ser Lys Lys Val Ile Leu Asp Leu Pro Leu Val Ile Gly Ser Arg Ser285 290 295 300ggt cta agc agc aga aca tcc agc atg gcc agc cga acc agc tct gag 1261Gly Leu Ser Ser Arg Thr Ser Ser Met Ala Ser Arg Thr Ser Ser Glu305 310 315atg agt tgg gta gat ctg aac atc cct gat acc cca gaa gct cct ccc 1309Met Ser Trp Val Asp Leu Asn Ile Pro Asp Thr Pro Glu Ala Pro Pro320 325 330
tgc tat atg gat gtc att cct gaa gat cac cga ttg gag agc cca acc 1357Cys Tyr Met Asp Val Ile Pro Glu Asp His Arg Leu Glu Ser Pro Thr335 340 345act cct ctg cta gat gac atg gat ggc tct caa gac agc cct atc ttt 1405Thr Pro Leu Leu Asp Asp Met Asp Gly Ser Gln Asp Ser Pro Ile Phe350 355 360atg tat gcc cct gag ttc aag ttc atg cca cca ccg act tat act gag 1453Met Tyr Ala Pro Glu Phe Lys Phe Met Pro Pro Pro Thr Tyr Thr Glu365 370 375 380gtg gat ccc tgc atc ctc aac aac aat gtg cag tga gcatgtggaa 1499Val Asp Pro Cys Ile Leu Asn Asn Asn Val Gln385 390gaaaagaagc agctttacct acttgtttct ttttgtctct cttcctggac actcactttt1559tcagagactc aacagtctct gcaatggagt gtgggtccac cttagcctct gacttcctaa1619tgtaggaggt ggtcagcagg caatctcctg ggccttaaag gatgcggact catcctcagc1679cagcgcccat gttgtgatac aggggtgttt gttggatggg tttaaaaata actagaaaaa1739ctcaggccca tccattttct cagatctcct tgaaaattga ggccttttcg atagtttcgg1799gtcaggtaaa aatggcctcc tggcgtaagc ttttcaaggt tttttggagg ctttttgtaa1859attgtgatag gaactttgga ccttgaactt acgtatcatg tggagaagag ccaatttaac1919aaactaggaa gatgaaaagg gaaattgtgg ccaaaacttt gggaaaagga ggttcttaaa1979atcagtgttt cccctttgtg cacttgtaga aaaaaaagaa aaaccttcta gagctgattt2039gatggacaat ggagagagct ttccctgtga ttataaaaaa ggaagctagc tgctctacgg2099tcatctttgc ttaagagtat actttaacct ggcttttaaa gcagtagtaa ctgccccacc2159aaaggtctta aaagccattt ttggagccta ttgcactgtg ttctcctact gcaaatattt2219tcatatggga ggatggtttt ctcttcatgt aagtccttgg aattgattct aaggtgatgt2279tcttagcact ttaattcctg tcaaattttt tgttctcccc ttctgccatc ttaaatgtaa2339gctgaaactg gtctactgtg tctctagggt taagccaaaa gacaaaaaaa attttactac2399ttttgagatt gccccaatgt acagaattat ataattctaa cgcttaaatc atgtgaaagg2459gttgctgctg tcagccttgc ccactgtgac ttcaaaccca aggaggaact cttgatcaag2519atgcccaacc ctgtgatcag aacctccaaa tactgccatg agaaactaga gggcaggtct2579tcataaaagc cctttgaacc cccttcctgc cctgtgttag gagataggga tattggcccc2639tcactgcagc tgccagcact tggtcagtca ctctcagcca tagcactttg ttcactgtcc2699tgtgtcagag cactgagctc cacccttttc tgagagttat tacagccaga aagtgtgggc2759tgaagatggt tggtttcatg t 2780
<210>2<211>391<212>PRT<213>人<400>2Met Val Met Phe Lys Lys Ile Lys Ser Phe Glu Val Val Phe Asn Asp1 5 10 15Pro Glu Lys Val Tyr Gly Ser Gly Glu Lys Val Ala Gly Arg Val Ile20 25 30Val Glu Val Cys Glu Val Thr Arg Val Lys Ala Val Arg Ile Leu Ala35 40 45Cys Gly Val Ala Lys Val Leu Trp Met Gln Gly Ser Gln Gln Cys Lys50 55 60Gln Thr Ser Glu Tyr Leu Arg Tyr Glu Asp Thr Leu Leu Leu Glu Asp65 70 75 80Gln Pro Thr Gly Glu Asn Glu Met Val Ile Met Arg Pro Gly Asn Lys85 90 95Tyr Glu Tyr Lys Phe Gly Phe Glu Leu Pro Gln Gly Pro Leu Gly Thr100 105 110Ser Phe Lys Gly Lys Tyr Gly Cys Val Asp Tyr Trp Val Lys Ala Phe115 120 125Leu Asp Arg Pro Ser Gln Pro Thr Gln Glu Thr Lys Lys Asn Phe Glu130 135 140Val Val Asp Leu Val Asp Val Asn Thr Pro Asp Leu Met Ala Pro Val145 150 155 160Ser Ala Lys Lys Glu Lys Lys Val Ser Cys Met Phe Ile Pro Asp Gly165 170 175Arg Val Ser Val Ser Ala Arg Ile Asp Arg Lys Gly Phe Cys Glu Gly180 185 190Asp Glu Ile Ser Ile His Ala Asp Phe Glu Asn Thr Cys Ser Arg Ile195 200 205
Val Val Pro Lys Ala Ala Ile Val Ala Arg His Thr Tyr Leu Ala Asn210 215 220Gly Gln Thr Lys Val Leu Thr Gln Lys Leu Ser Ser Val Arg Gly Asn225 230 235 240His Ile Ile Ser Gly Thr Cys Ala Ser Trp Arg Gly Lys Ser Leu Arg245 250 255Val Gln Lys Ile Arg Pro Ser Ile Leu Gly Cys Asn Ile Leu Arg Val260 265 270Glu Tyr Ser Leu Leu Ile Tyr Val Ser Val Pro Gly Ser Lys Lys Val275 280 285Ile Leu Asp Leu Pro Leu Val Ile Gly Ser Arg Ser Gly Leu Ser Ser290 295 300Arg Thr Ser Ser Met Ala Ser Arg Thr Ser Ser Glu Met Ser Trp Val305 310 315 320Asp Leu Asn Ile Pro Asp Thr Pro Glu Ala Pro Pro Cys Tyr Met Asp325 330 335Val Ile Pro Glu Asp His Arg Leu Glu Ser Pro Thr Thr Pro Leu Leu340 345 350Asp Asp Met Asp Gly Ser Gln Asp Ser Pro Ile Phe Met Tyr Ala Pro355 360 365Glu Phe Lys Phe Met Pro Pro Pro Thr Tyr Thr Glu Val Asp Pro Cys370 375 380Ile Leu Asn Asn Asn Val Gln385 390<210>3<211>1176<212>DNA<213>人<400>3atggtgatgt tcaagaagat caagtctttt gaggtggtct ttaacgaccc tgaaaaggtg 60tacggcagtg gcgagaaggt ggctggccgg gtgatagtgg aggtgtgtga agttactcgt 120gtcaaagccg ttaggatcct ggcttgcgga gtggctaaag tgctttggat gcagggatcc 180
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<223>涉及RAT Cinc的引物<400>4gaagatagat tgcaccgatg 20<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>涉及RAT Cinc的引物<400>5catagcctct cacatttc 18
<210>6<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>涉及RAT Cinc的引物<400>6gcgcccgtcc gccaatgagc tgcgc 25<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>涉及RAT Cinc的引物<400>7cttggggaca cccttcagca tcttttgg 28<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>涉及RAT Cinc的引物<400>8ctctacccac ggcaagttca a 21<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>涉及RAT Cinc的引物<400>9gggatgacct tgcccacagc 20<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>涉及HBP23的引物<400>10gctgatgaag gtatctcttt caggggcctc30
<210>11<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>涉及HBP23的引物<400>11gatggtctgc cccttaccaa tagtggaag 29<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>涉及GADPH的引物<400>12tgaaggtcgg agtcaacgga tttg 24<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>涉及GADPH的反向引物<400>13catgtgggcc atgaggtcca ccac 2權(quán)利要求
1.一種治療受試者涉及心肌細(xì)胞損失的心臟疾病的方法，該方法包含向所述受試者施用適量有效導(dǎo)致心肌細(xì)胞在受試者心臟內(nèi)增殖的試劑，以便由此治療所述疾病。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑是人內(nèi)皮祖細(xì)胞。
3.權(quán)利要求2的方法，其另外包括施用有效量的第二種試劑，該試劑增加由所述人內(nèi)皮祖細(xì)胞導(dǎo)致的心肌細(xì)胞增殖。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述試劑是反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸特異性地抑制維生素D3正調(diào)節(jié)蛋白-1(VDUP-1)mRNA的翻譯。
5.權(quán)利要求3的方法，其中所述試劑是催化性核酸，該催化性核酸特異性地抑制維生素D3正調(diào)節(jié)蛋白-1mRNA的翻譯。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述催化性核酸包含脫氧核糖核苷酸。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述催化性核酸包含核糖核酸。
8.權(quán)利要求3的方法，其中所述第二種試劑是促血管生成劑。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述促血管生成劑是血管內(nèi)皮生長因子，成纖維細(xì)胞生長因子或血管生成素。
10.權(quán)利要求3的方法，其中所述第二種試劑誘導(dǎo)促血管生成因子的表達(dá)。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述第二種試劑是缺氧誘導(dǎo)因子-1。
12.權(quán)利要求3的方法，其中所述第二種試劑促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向受試者心臟的輸送。
13.權(quán)利要求12的方法，其中促進(jìn)輸送的第二種試劑是針對CXCR4表位的抗體。
14.權(quán)利要求12的方法，其中促進(jìn)輸送的第二種試劑是CC趨化因子。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述CC趨化因子是RANTES，EOTAXIN，單核細(xì)胞化學(xué)引誘蛋白-1(MCP-1)，MCP-2，MCP-3，或MCP。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述第二種試劑是CXC趨化因子。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述CXC趨化因子是白細(xì)胞介素-8，Gro-α，或基質(zhì)衍生因子-1。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述基質(zhì)衍生因子-1是基質(zhì)衍生因子-1α或基質(zhì)衍生因子-1β。
19.權(quán)利要求3的方法，其中所述第二種試劑促進(jìn)成血管細(xì)胞向受試者血流中轉(zhuǎn)移。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述試劑是G-CSF，GM-CSF，SDF-1，或VEGF。
21.權(quán)利要求3的方法，其中所述第二種試劑是心肌細(xì)胞祖細(xì)胞。
22.權(quán)利要求3的方法，其中所述第二種試劑是骨骼肌祖細(xì)胞。
23.權(quán)利要求2的方法，其中所述人內(nèi)皮祖細(xì)胞的有效量為每kg受試者體重2.5×105至7.5×105個內(nèi)皮祖細(xì)胞。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述有效量為每kg受試者體重5×105個內(nèi)皮祖細(xì)胞。
25.權(quán)利要求2的方法，其中所述內(nèi)皮祖細(xì)胞相對于受試者是異源的。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述受試者是成年人。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述受試者是胚胎或胎兒。
28.權(quán)利要求2的方法，其中所述施用包含直接注射入所述受試者的外周循環(huán)，心肌，左心室，右心室，冠狀動脈，腦脊液，神經(jīng)組織，局部缺血組織或局部缺血后組織。
29.權(quán)利要求2的方法，其中所述人內(nèi)皮祖細(xì)胞表達(dá)CD117，CD34或AC133。
30.權(quán)利要求2的方法，其中所述內(nèi)皮祖細(xì)胞表達(dá)高水平的胞內(nèi)GATA-2活性。
31.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑誘導(dǎo)編碼peroxiredoxin的mRNA的表達(dá)。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述試劑是2(3)-叔丁基-4-羥基苯甲醚。
33.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑誘導(dǎo)編碼NF-E2-相關(guān)因子2(Nrf2)的mRNA的表達(dá)。
34.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑誘導(dǎo)Nrf2蛋白從Keap-1上的解離。
35.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑抑制Nrf2蛋白與Keap-1的結(jié)合。
36.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑抑制巰基還原酶硫氧還蛋白與VDUP-1蛋白的結(jié)合。
37.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑抑制c-Abl酪氨酸激酶的激活。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述試劑是STI-571。
39.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑是CXC趨化因子。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述趨化因子是基質(zhì)衍生因子-1，I1-8或Gro-α。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述試劑是基質(zhì)衍生因子-1并且在心肌內(nèi)給藥。
42.權(quán)利要求40的方法，其中所述試劑是基質(zhì)衍生因子-1并且在冠狀動脈內(nèi)給藥。
43.權(quán)利要求40的方法，其中所述試劑是基質(zhì)衍生因子-1并且通過植入物，支架或緩釋制劑給藥。
44.權(quán)利要求39的方法，其另外包含施用第二種試劑。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述第二種試劑是GM-CSF，G-CSF，IL-8或Gro家族趨化因子。
46.權(quán)利要求44的方法，其中所述第二種試劑是CXCR4的抑制劑或SDF-1的抑制劑。
47.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑是纖溶酶原激活物抑制劑-1的抑制劑。
48.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑是針對CXCR4表位的抗體。
49.權(quán)利要求1的方法，其中所述試劑是G-CSF，GM-CSF，VDUP-1表達(dá)的抑制劑，或Gro家族趨化因子。
50.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者患有心血管疾病。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述受試者患有充血性心力衰竭。
52.權(quán)利要求50的方法，其中所述受試者患有心肌梗死。
53.權(quán)利要求50的方法，其中所述受試者患有心肌缺血。
54.權(quán)利要求50的方法，其中所述受試者患有心絞痛。
55.權(quán)利要求50的方法，其中所述受試者患有心肌病。
56.權(quán)利要求1的方法，其中所述受試者是哺乳動物。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述哺乳動物是人類。
58.一種測定受試者心肌細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的敏感性的方法，包含(a)定量測定心肌細(xì)胞中編碼peroxiredoxin的mRNA的量；(b)定量測定心肌細(xì)胞中編碼維生素D3正調(diào)節(jié)蛋白-1的mRNA的量；(c)測定編碼peroxiredoxin的mRNA的量與編碼維生素D3正調(diào)節(jié)蛋白-1的mRNA的量的比率，其中低比率表示心肌細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的高敏感性而高比率表示心肌細(xì)胞對受試者體內(nèi)的細(xì)胞凋亡的低敏感性。
59.一種測定受試者心肌細(xì)胞對細(xì)胞凋亡敏感性的方法，包含(a)定量測定心肌細(xì)胞內(nèi)peroxiredoxin蛋白的表達(dá)；(b)定量測定心肌細(xì)胞內(nèi)維生素D3正調(diào)節(jié)蛋白-1的表達(dá)；(c)測定peroxiredoxin蛋白表達(dá)與維生素D3正調(diào)節(jié)蛋白-1表達(dá)的比率，其中低比率表示心肌細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的高敏感性而高比率表示心肌細(xì)胞對受試者體內(nèi)的細(xì)胞凋亡的低敏感性。
60.一種心臟祖細(xì)胞。
61.一種誘導(dǎo)受試者心臟組織內(nèi)心肌祖細(xì)胞的細(xì)胞循環(huán)的方法，其包括向受試者施用適量有效誘導(dǎo)受試者心臟組織新血管形成的試劑，從而由此誘導(dǎo)受試者心臟組織內(nèi)心臟細(xì)胞的細(xì)胞循環(huán)。
62.一種改善受試者心臟功能的方法，其包括向受試者施用適量有效誘導(dǎo)受試者心臟組織新血管形成的試劑，從而由此改善受試者的心臟功能。
63.一種改善受試者心臟功能的方法，其包括向受試者施用適量有效誘導(dǎo)受試者心臟組織心肌細(xì)胞增殖的試劑，從而由此改善受試者的心臟功能。
64.權(quán)利要求62或63的方法，其中所述受試者患有心肌缺血或心肌梗死。
65.權(quán)利要求62或63的方法，其中所述試劑是G-CSF，GM-CSF，IL-8，Gro家族趨化因子，CXCR4的抑制劑，或SDF-1的抑制劑。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述CXCR4的抑制劑是小分子或單克隆抗體。
67.權(quán)利要求65的方法，其中所述CXCR4的抑制劑是小分子和是AMD 3100。
68.權(quán)利要求65的方法，其中所述CXCR4的抑制劑是AMD 070。
69.權(quán)利要求65的方法，其中所述CXCR4的抑制劑是催化性核酸，寡核苷酸，單克隆抗體，RNAi，或小分子。
70.權(quán)利要求65的方法，其中所述SDF-1的抑制劑是小分子或單克隆抗體。
71.權(quán)利要求65的方法，其中所述Gro家族趨化因子是Groα。
72.一種誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，其包含抑制細(xì)胞內(nèi)peroxiredoxin的表達(dá)。
73.權(quán)利要求72的方法，其中所述細(xì)胞表達(dá)peroxiredoxin。
74.權(quán)利要求73的方法，其中所述細(xì)胞由脈管系統(tǒng)供養(yǎng)，并且該脈管系統(tǒng)誘導(dǎo)peroxiredoxin的表達(dá)。
75.權(quán)利要求72的方法，其中所述peroxiredoxin是過氧化物還原酶I，過氧化物還原酶II，過氧化物還原酶III，過氧化物還原酶IV，或過氧化物還原酶V。
76.權(quán)利要求72的方法，其中對peroxiredoxin表達(dá)的抑制是通過使細(xì)胞接觸與編碼peroxiredoxin的mRNA結(jié)合的催化性核酸來實(shí)現(xiàn)的，從而抑制其表達(dá)。
77.權(quán)利要求72的方法，其中所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。
78.一種治療受試者涉及組織細(xì)胞損失的組織細(xì)胞疾病的方法，其包含向受試者施用適量有效導(dǎo)致所述受試者組織內(nèi)組織細(xì)胞增殖的試劑，從而由此治療所述受試者的組織細(xì)胞疾病。
79.權(quán)利要求78的方法，其中所述試劑是G-CSF，SDF-1，GM-CSF，IL-8，或VEGF。
80.權(quán)利要求78的方法，其中所述試劑是CXCR4/SDF-1相互作用的抑制劑。
81.權(quán)利要求80的方法，其中所述抑制劑是催化性核酸，單克隆抗體，反義寡核苷酸，小分子，或RNAi。
82.權(quán)利要求78的方法，其中所述試劑是peroxiredoxin表達(dá)的誘導(dǎo)劑。
83.權(quán)利要求79或80的方法，其中所述組織是心臟組織，腦組織，周圍血管組織，肝臟組織，腎臟組織，胃腸組織，肺組織，平滑肌組織，或橫紋肌組織。
84.權(quán)利要求20，45，65或79的方法，其中所述試劑是G-CSF，并且該G-CSF是重組甲硫氨酰人G-CSF和一甲氧基聚乙二醇的共價(jià)偶聯(lián)物。
85.一種治療受試者涉及組織細(xì)胞凋亡的組織疾病的方法，其包含向受試者施用適量有效抑制所述受試者組織細(xì)胞凋亡的試劑，從而由此治療所述疾病。
86.權(quán)利要求85的方法，其中所述試劑是VDUP-1表達(dá)的抑制劑。
87.權(quán)利要求86的方法，其中所述VDUP-1表達(dá)抑制劑是催化性核酸，單克隆抗體，反義寡核苷酸，小分子，或RNAi。
88.權(quán)利要求86的方法，其中所述組織是心臟組織，腦血管組織，或腦組織。
89.一種抑制組織內(nèi)成纖維細(xì)胞或炎癥細(xì)胞增殖而由此抑制膠原形成的方法，其包含使所述組織接觸適量的有效抑制組織內(nèi)成纖維細(xì)胞或炎癥細(xì)胞增殖的VDUP-1表達(dá)的抑制劑。
90.權(quán)利要求89的方法，其中所述VDUP-1表達(dá)抑制劑是催化性核酸，單克隆抗體，反義寡核苷酸，小分子，或RNAi。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種治療受試者涉及心肌細(xì)胞損失的心臟疾病的方法，該方法包括給受試者施用適量可有效使心肌細(xì)胞在受試者心臟內(nèi)增殖的試劑，從而得以治療疾病。本發(fā)明另外提供了其中所述試劑為人內(nèi)皮祖細(xì)胞，G－CSF，GM－CSF，SDF－1，和IL－8的該方法。本發(fā)明還提供了測定受試者心肌細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的敏感性的方法。
文檔編號A61K48/00GK1662548SQ03814715
公開日2005年8月31日 申請日期2003年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月23日
發(fā)明者S·伊泰斯庫 申請人:紐約市哥倫比亞大學(xué)信托人