專利名稱：加利車霉素衍生物－載體綴合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于制備具有較高載藥量及顯著減少的低綴合部分(LCF)的單體細(xì)胞毒性藥物/載體綴合物(“綴合物”)的方法。具體地說，本發(fā)明涉及抗CD22抗體-單體加利車霉素綴合物。本發(fā)明也涉及本發(fā)明的綴合物、純化所述綴合物的方法、包含所述綴合物的藥用組合物以及所述綴合物的用途。
背景技術(shù)：
開發(fā)用于系統(tǒng)藥物療法的藥物綴合物是靶特異性細(xì)胞毒性藥物。該概念涉及將治療藥與對(duì)確定的靶細(xì)胞群體具有特異性的載體分子偶聯(lián)。對(duì)抗原具有高親和力的抗體是作為靶向部分的自然選擇。因?yàn)楦哂H和力單克隆抗體的利用度，抗體靶向治療的前景才變得光明。已經(jīng)與單克隆抗體綴合的毒性物質(zhì)包括毒素、低分子量細(xì)胞毒性藥物、生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑和放射性核素?？贵w-毒素綴合物通常稱為免疫毒素，而由抗體和低分子量藥物(例如甲氨蝶呤和多柔比星)組成的免疫綴合物則稱為化學(xué)免疫綴合物。免疫調(diào)節(jié)劑包括已知具有調(diào)節(jié)功能的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，例如淋巴因子、生長因子和補(bǔ)體激活眼鏡蛇毒因子(CVF)。放射免疫綴合物由放射性同位素組成，可以用作治療劑，通過它們的輻射來殺死細(xì)胞；或者用于造影。將具有細(xì)胞毒性藥物抗體介導(dǎo)特異性靶向腫瘤細(xì)胞，預(yù)期不僅提高它們的抗腫瘤效果，而且阻止正常組織的非靶向攝入，因而增加了它們的治療指數(shù)。
本發(fā)明涉及免疫綴合物，所述免疫綴合物包含與細(xì)胞毒性藥物綴合的、作為靶向載體并且對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞表面的抗原決定簇具有特異性的抗體。本發(fā)明涉及細(xì)胞毒性藥物-抗體綴合物，其中所述抗體對(duì)B細(xì)胞惡性腫瘤、淋巴增生性疾病和慢性炎性疾病的抗原決定簇具有特異性。本發(fā)明也涉及用于制備免疫綴合物的方法以及它們的治療用途。
許多用于治療各種疾病(包括癌癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)的基于抗體的療法已獲批準(zhǔn)用于臨床，或者用于各種惡性腫瘤(包括B細(xì)胞惡性腫瘤例如非霍奇金淋巴瘤)的臨床試驗(yàn)。一種這樣的基于抗體的療法是利妥昔單抗(RituxanTM)，這是一種未標(biāo)記的嵌合人γ1(+mγ1V區(qū))抗體，所述抗體對(duì)在B細(xì)胞上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原CD20具有特異性。這些基于抗體的療法或者依賴于補(bǔ)體介導(dǎo)細(xì)胞毒性(CDCC)或針對(duì)B細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)，或者依賴于使用放射性核素，例如131I或90Y，所述療法對(duì)臨床醫(yī)生和患者來說都有相應(yīng)的制備和應(yīng)用問題。因此，需要生產(chǎn)能夠克服現(xiàn)有基于抗體療法缺點(diǎn)的免疫綴合物，以治療各種惡性腫瘤，包括造血細(xì)胞惡性腫瘤如非霍奇金淋巴瘤(NHL)；所述免疫綴合物能容易而高效地生產(chǎn)，可以重復(fù)使用而不誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
已經(jīng)開發(fā)了包含有效抗細(xì)菌劑和抗腫瘤劑家族成員的免疫綴合物，用于治療骨髓瘤，所述有效抗細(xì)菌劑和抗腫瘤劑家族成員統(tǒng)稱為加利車霉素或LL-E33288復(fù)合物(參見美國專利第4,970,198號(hào)(1990))。最有效的加利車霉素命名為γ1，在本文中簡稱為γ。這些化合物含有可以與合適的硫醇反應(yīng)形成二硫化物的甲基三硫，同時(shí)引入一個(gè)用于將加利車霉素衍生物連接到載體上的官能團(tuán)(例如酰肼或其它官能團(tuán))。(參見美國專利第5,053,394號(hào))。特異性靶向劑(載體)的利用度和綴合方法都限制了單體加利車霉素衍生物/載體綴合物在開發(fā)用于各種各樣的癌癥的療法中的應(yīng)用，當(dāng)與載體綴合的加利車霉素衍生物的量(即載藥量)增加時(shí)，所述綴合方法導(dǎo)致形成蛋白聚集體。因?yàn)檩^高的載藥量增加了綴合物的固有效力，所以載體上負(fù)載的藥物量越高越好，只要能穩(wěn)定保持載體蛋白的親和力。聚集蛋白有非特異性毒性和免疫原性，因而在治療應(yīng)用中必須除去，否則，聚集蛋白的存在使得生產(chǎn)這些綴合物的規(guī)?；に嚫鼮槔щy，并且降低產(chǎn)物收率。載體蛋白上負(fù)載的加利車霉素的量(載藥量)、在綴合反應(yīng)中形成的聚集體量和最終可以獲得的純化單體綴合物的收率都是相關(guān)的。因此，必須通過調(diào)整加入到綴合反應(yīng)中活性加利車霉素衍生物的量，在較高載藥量和最終單體收率之間找到平衡。
當(dāng)用交聯(lián)劑進(jìn)行描述于美國專利第5,877,296號(hào)和美國專利第5,773,001號(hào)的綴合反應(yīng)時(shí)，細(xì)胞毒性藥物綴合物、尤其是加利車霉素綴合物趨向聚集是個(gè)大問題，所述專利文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。在這種情況下，產(chǎn)生的大部分綴合物都呈聚集狀態(tài)，很難純化用原來的工藝(CMA工藝)制備的綴合物，用于治療應(yīng)用。對(duì)于某些載體蛋白來說，實(shí)際上甚至連中等負(fù)荷的綴合物都不能制備，除非是小規(guī)模制備。因此，關(guān)鍵是需要改進(jìn)細(xì)胞毒性藥物(例如加利車霉素)與載體綴合的方法，使聚集體量最小化，因而容許盡可能高的載藥量并產(chǎn)生合理的產(chǎn)物收率。
先前已經(jīng)公開了以較高載藥量/收率并且減少聚集來制備單體加利車霉素衍生物/載體的綴合方法(參見美國專利第5,712,374號(hào)和美國專利第5,714,586號(hào)，通過引用全部結(jié)合到本文中)。雖然這些方法生產(chǎn)的綴合制備物具有顯著減少的聚集體含量，但是后來發(fā)現(xiàn)所制備的綴合物含有不需要的高水平(HPLC面積百分比為45-65％)的低綴合部分(LCF)，所述低綴合部分大多是由未綴合抗體組成的部分。產(chǎn)物中LCF的存在，低效利用了所述抗體，因?yàn)樗缓屑?xì)胞毒性藥物。它也會(huì)與加利車霉素-載體綴合物競爭靶，并有可能降低后者的中靶率(targetability)，結(jié)果降低了細(xì)胞毒性藥物的效果。因此，最好有改進(jìn)的綴合方法，能導(dǎo)致顯著較低水平的LCF并且具有可接受的聚集水平，而不顯著改變綴合物的物理性能。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于制備具有較高負(fù)荷及顯著減少的低綴合部分(LCF)的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物(“綴合物”)的方法。具體地說，本發(fā)明涉及單體加利車霉素衍生物-載體綴合物的生產(chǎn)、所述綴合物、組合物、所述綴合物的純化方法和所述綴合物的用途。更具體地說，本發(fā)明涉及制備單體加利車霉素衍生物-抗CD22抗體綴合物(CMC-544)的方法。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明公開了用于制備所述綴合物的改進(jìn)的綴合方法，所述方法產(chǎn)生顯著較低水平的LCF(低于10％)而不顯著改變物理或化學(xué)特性。本發(fā)明也公開了對(duì)所述綴合方法的進(jìn)一步改進(jìn)，所述改進(jìn)不僅顯著降低了LCF的水平，而且比以前公開的方法顯著減少的聚集，產(chǎn)生顯著增加的載藥量。本發(fā)明的綴合物具有下式Pr(-X-W)m其中Pr為蛋白質(zhì)性載體，X為包含任何可與蛋白質(zhì)性載體反應(yīng)的反應(yīng)基的產(chǎn)物的接頭，W為細(xì)胞毒性藥物；m為純化綴合產(chǎn)物的平均負(fù)荷，致使細(xì)胞毒性藥物占所述綴合物的7-9％(重量)；且(-X-W)m為細(xì)胞毒性藥物衍生物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的綴合物是通過包括下述步驟的本發(fā)明方法產(chǎn)生的(1)向蛋白質(zhì)性載體中加入細(xì)胞毒性藥物衍生物，其中所述細(xì)胞毒性藥物衍生物是所述蛋白質(zhì)性載體的4.5-11％(重量)；(2)在非親核的、蛋白相容的、pH范圍約7-9的緩沖溶液中，將所述細(xì)胞毒性藥物衍生物和蛋白質(zhì)性載體溫育，產(chǎn)生單體細(xì)胞毒性藥物/載體綴合物，其中所述溶液還包含(a)有機(jī)助溶劑，和(b)包含至少一種C6-C18羧酸或其鹽的添加劑，其中所述溫育是在約30℃至約35℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行約15分鐘至24小時(shí)；和(3)將步驟(2)產(chǎn)生的綴合物進(jìn)行層析分離方法，以從未綴合蛋白質(zhì)性載體、細(xì)胞毒性藥物衍生物和聚集綴合物中分離出細(xì)胞毒性藥物的負(fù)荷范圍是4-10％(重量)、低綴合部分(LCF)小于10％的所述單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/蛋白質(zhì)性載體綴合物。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述綴合物的蛋白質(zhì)性載體選自激素、生長因子、抗體、抗體片段、抗體模擬物以及它們的基因工程或酶工程對(duì)應(yīng)物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)性載體是抗體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體選自單克隆抗體、嵌合抗體、人抗體、人源化抗體、單鏈抗體、Fab片段和F(ab)2片段。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述人源化抗體針對(duì)細(xì)胞表面抗原CD22。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人源化抗CD22抗體是CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，并且包含輕鏈可變區(qū)5/44-gL1(SEQ IDNO19)和重鏈可變區(qū)5/44-gH7(SEQ ID NO27)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人源化抗CD22抗體是CDR移植抗體，并且包含具有SEQ ID NO28中所示的序列的輕鏈。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人源化抗CD22抗體是CDR移植抗體，并且包含具有SEQ ID NO30中所示的序列的重鏈。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人源化抗CD22抗體是CDR移植抗體，并且包含具有SEQ ID NO28中所示的序列的輕鏈以及具有SEQ ID NO30中所示的序列的重鏈。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述人源化抗CD22抗體是CDR移植抗體，所述抗體是通過親和力成熟方案獲得的變異抗體并且對(duì)人CD22具有增加的特異性。
在另一方面，用于產(chǎn)生本發(fā)明的單體細(xì)胞毒性藥物/載體綴合物的細(xì)胞毒性藥物是微管蛋白聚合抑制劑、與DNA結(jié)合并破壞DNA的烷化劑、蛋白質(zhì)合成抑制劑或酪氨酸激酶抑制劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞毒性藥物選自加利車霉素、塞替派、紫杉烷類、長春新堿、柔紅霉素、多柔比星、表柔比星、埃斯波霉素、放線菌素、authramycin、偶氮絲氨酸、博來霉素、他莫昔芬、伊達(dá)比星、多拉司他汀/auristatins、hemiasterlins和美登素類(maytansinoids)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞毒性藥物是加利車霉素。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述加利車霉素是γ加利車霉素或N-乙酰γ加利車霉素衍生物。
在又一方面，所述細(xì)胞毒性藥物用3-巰基-3-甲基丁酰肼官能化，并通過可水解接頭與蛋白質(zhì)性載體綴合，所述接頭能夠在結(jié)合和進(jìn)入靶細(xì)胞后能夠從所述綴合物中釋放所述細(xì)胞毒性藥物。
在該方面的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述可水解接頭是4-(4-乙酰苯氧基)丁酸(AcBut)。
在本發(fā)明的又一方面，辛酸或其鹽、或癸酸或其鹽在綴合方法中用作添加劑，以減少聚集并增加載藥量。
在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明的綴合物用層析分離方法純化。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于分離所述單體藥物衍生物-載體綴合物的層析分離方法是大小排阻層析法(SEC)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于分離所述單體藥物衍生物-載體綴合物的層析分離方法為HPLC、FPLC或葡聚糖凝膠S-200層析法。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于分離所述單體藥物衍生物-載體綴合物的層析分離方法是疏水作用層析法(HIC)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用苯基瓊脂糖凝膠6FF層析介質(zhì)(Phenyl Sepharose 6Fast Flow chromatographic medium)、丁基瓊脂糖凝膠4FF層析介質(zhì)、辛基瓊脂糖凝膠4FF層析介質(zhì)、Toyopearl Ether-650M層析介質(zhì)、常量制備(Macro-Prep)甲基HIC介質(zhì)或常量制備叔丁基HIC介質(zhì)來進(jìn)行HIC。在一個(gè)更特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用丁基瓊脂糖凝膠4FF層析介質(zhì)進(jìn)行HIC。
在另一方面，本發(fā)明涉及按照本發(fā)明的方法制備的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物。在該方面的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所用的細(xì)胞毒性藥物是加利車霉素，所用的載體是抗體。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體選自單克隆抗體、嵌合抗體、人抗體、人源化抗體、單鏈抗體、Fab片段和F(ab)2片段。在一個(gè)更特別優(yōu)選的方面，使用針對(duì)細(xì)胞表面抗原CD22的人源化抗體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人源化抗CD22抗體是CDR移植抗體，并且包含輕鏈可變區(qū)5/44-gL1(SEQ ID NO19)和重鏈可變區(qū)5/44-gH7(SEQ ID NO27)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述人源化抗CD22抗體是CDR移植抗體，并且包含具有SEQ ID NO28中所示的序列的輕鏈。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人源化抗CD22抗體是CDR移植抗體，并且包含具有SEQ ID NO30中所示的序列的重鏈。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人源化抗CD22抗體是CDR移植抗體，并且包含具有SEQ ID NO28中所示的序列的輕鏈和具有SEQ ID NO30中所示的序列的重鏈。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述人源化抗CD22抗體是CDR移植抗體，所述抗體是通過親和力成熟方案獲得的變異抗體并且對(duì)人CD22具有增加的特異性。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述加利車霉素是γ加利車霉素或N-乙酰γ加利車霉素。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述加利車霉素衍生物用3-巰基-3-甲基丁酰肼官能化。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于將所述藥物與所述載體綴合的接頭是可水解接頭，所述接頭能夠在結(jié)合和進(jìn)入靶細(xì)胞后能夠從所述綴合物中釋放所述細(xì)胞毒性藥物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述可水解接頭是4-(4-乙酰苯氧基)丁酸(AcBut)。
本發(fā)明的另一方面涉及具有下式的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物Pr(-X-S-S-W)m，其中Pr為抗CD22抗體；X為包含任何可與抗體反應(yīng)的反應(yīng)基的產(chǎn)物的可水解接頭；W為加利車霉素基團(tuán)；m為純化綴合產(chǎn)物的平均負(fù)荷，致使加利車霉素占所述綴合物的4-10％(重量)；且(-X-S-S-W)m為用本發(fā)明方法產(chǎn)生的加利車霉素衍生物。
在該方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體選自單克隆抗體、嵌合抗體、人抗體、人源化抗體、單鏈抗體、Fab片段和F(ab)2片斷。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體是對(duì)人CD22具有特異性的抗CD22抗體，并且包含重鏈和輕鏈，其中所述重鏈的可變區(qū)包含CDR，所述CDR具有如下給出的序列中的至少一種對(duì)于CDR-H1在

圖1中的H1(SEQ ID NO1)，對(duì)于CDR-H2在圖1中的H2(SEQ IDNO2)或H2’(SEQ ID NO13)或H2”(SEQ ID NO15)或H2(SEQ IDNO16)，或?qū)τ贑DR-H3在圖1中的H3(SEQ ID NO3)；而所述輕鏈的可變區(qū)包含CDR，所述CDR具有如下給出的序列中的至少一種對(duì)于CDR-L1在圖1中的L1(SEQ ID NO4)、對(duì)于CDR-L2在圖1中的L2(SEQ ID NO5)或?qū)τ贑DR-L3在圖1中的L3(SEQ IDNO6)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗CD22抗體包含重鏈和輕鏈，其中所述重鏈的可變區(qū)包含CDR，所述CDR具有如下給出的序列中的至少一種CDR-H1的SEQ ID NO1，CDR-H2的SEQ ID NO2或SEQ ID NO13或SEQ ID NO15或SEQ ID NO16，或CDR-H3的SEQ ID NO3；而所述輕鏈的可變區(qū)包含CDR，所述CDR具有如下給出的序列中的至少一種CDR-L1的SEQ ID NO4、CDR-L2的SEQID NO5或CDR-L3的SEQ ID NO6。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗CD22抗體包含CDR-H1的SEQ ID NO1；CDR-H2的SEQ ID NO2或SEQ ID NO13或SEQ IDNO15或SEQ ID NO16；CDR-H3的SEQ ID NO3；CDR-L1的SEQID NO4；CDR-L2的SEQ ID NO5；和CDR-L3的SEQ ID NO6。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述人源化抗CD22抗體是CDR移植抗CD22抗體，所述抗體包括含有人受體構(gòu)架區(qū)和非人類供體CDR的可變區(qū)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述人源化抗CD22抗體具有人受體構(gòu)架，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)基于人亞型I共有序列并在位置1、28、48、71和93包含非人類供體殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述人源化抗體在位置67和69還包含非人類供體殘基。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述CDR移植人源化抗體包含輕鏈可變區(qū)，所述可變區(qū)包含基于人亞型I共有序列的人受體構(gòu)架區(qū)，在位置2、4、37、38、45和60還包含非人類供體殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述CDR移植抗體在位置3還包含非人類供體殘基。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述CDR移植抗體包含輕鏈可變區(qū)5/44-gL1(SEQ ID NO19)和重鏈可變區(qū)5/44-gH7(SEQ ID NO27)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述CDR移植抗體包含具有SEQ IDNO28中所示的序列的輕鏈和具有SEQ ID NO30中所示的序列的重鏈。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述CDR移植抗體包含具有SEQ IDNO28中所示的序列的輕鏈和具有SEQ ID NO30中所示的序列的重鏈。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗CD22 CDR移植抗體是通過親和力成熟方案獲得的變異抗體并且對(duì)人CD22具有增加的特異性。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗CD22抗體是嵌合抗體，所述嵌合抗體包含分別示于SEQ ID NO7和SEQ ID NO8的單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)序列和重鏈可變區(qū)序列。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗CD22抗體包括含有截短的供體CDR序列的雜種CDR，其中供體CDR序列中的缺失部分被不同序列取代，形成功能性CDR。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞毒性藥物衍生物是γ加利車霉素或N-乙酰γ加利車霉素衍生物。
在另一方面，本發(fā)明涉及用于制備單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物的穩(wěn)定的凍干組合物的方法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物的穩(wěn)定的凍干組合物通過下述步驟制備(a)將所述單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物溶于溶液中，使其終濃度為0.5-2mg/ml，所述溶液包含濃度為1.5％-5％(重量)的防凍劑、濃度為0.5-1.5％(重量)的聚合填充劑、濃度為0.01M-0.1M的電解質(zhì)、濃度為0.005-0.05％(重量)的增溶劑、濃度為5-50mM的緩沖劑(使得所述溶液的最終pH為7.8-8.2)和水；(b)在+5℃至+10℃的溫度下，將以上溶液分裝到小瓶中；(c)在-35℃至-50℃的冷凍溫度下，將所述溶液進(jìn)行冷凍；(d)在20-80微米汞柱(microns)的初始干燥壓力下，在-10℃至-40℃的擱板溫度下，對(duì)所述冷凍溶液進(jìn)行初始凍干步驟達(dá)24-78小時(shí)；和(e)在20-80微米汞柱的干燥壓力下，在+10℃至+35℃的擱板溫度下，對(duì)步驟(d)的凍干產(chǎn)物進(jìn)行第二個(gè)凍干步驟達(dá)15-30小時(shí)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于將所述細(xì)胞毒性藥物/載體綴合物凍干的防凍劑選自糖醇、甘露醇、山梨醇、肌醇、聚乙二醇、醛糖酸、糖醛酸、醛糖二酸、醛糖、酮糖、氨基糖、糖醇、肌醇、甘油醛、阿拉伯糖、來蘇糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、塔羅糖、庚糖、葡萄糖、果糖、葡糖酸、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α-吡喃葡糖苷、麥芽糖、異抗壞血酸、抗壞血酸、內(nèi)酯、山梨糖、葡糖二酸、赤蘚糖、蘇糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、赤蘚酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、葡糖醛酸、葡糖酸、葡糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、蔗糖、海藻糖、神經(jīng)氨酸、阿聚糖、果聚糖、巖藻聚糖、半乳聚糖、聚半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、果聚糖、巖藻依聚糖、卡拉膠、半乳卡羅聚糖(galactocarolose)、果膠、果膠酸、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原、支鏈淀粉、纖維素、葡聚糖、石臍素、殼多糖、瓊脂糖、角蛋白、軟骨素、皮膚素、透明質(zhì)酸、海藻酸、黃原酸膠、淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、乙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、丙三醇和季戊四醇。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述防凍劑是蔗糖，其濃度為1.5％(重量)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于凍干工藝的所述聚合填充劑選自葡聚糖40或羥乙基淀粉40，其濃度為0.9％(重量)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于凍干溶液的所述電解質(zhì)是氯化鈉，其濃度為0.05M。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在凍干工藝中使用增溶劑。優(yōu)選的增溶劑是表面活性劑。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表面活性劑是聚山梨酯80，其濃度為0.01％(重量)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所用的緩沖劑是氨丁三醇，其濃度為0.02M。在凍干工藝開始時(shí)，所述溶液的pH最好是8.0。在所述工藝開始之前，在+5℃的溫度下，將含有所述細(xì)胞毒性藥物/載體綴合物的溶液分裝到小瓶中。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，小瓶中的所述溶液在-45℃進(jìn)行冷凍；在60微米汞柱的初始干燥壓力下，在-30℃的擱板溫度下，對(duì)所述冷凍溶液進(jìn)行初始凍干步驟達(dá)60小時(shí)；在60微米汞柱的干燥壓力下，在+25℃的擱板溫度下，對(duì)所述凍干產(chǎn)物進(jìn)行第二個(gè)凍干步驟達(dá)24小時(shí)。
本發(fā)明的另一方面涉及一種組合物，所述組合物包含治療有效劑量的按照本發(fā)明方法制備的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物中的載體是選自以下的蛋白質(zhì)性載體激素、生長因子、抗體和抗體模擬物。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)性載體是人單克隆抗體、嵌合抗體、人抗體或人源化抗體。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人源化抗體針對(duì)細(xì)胞表面抗原CD22。
在本發(fā)明該方面的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗CD22抗體對(duì)人CD22具有特異性，所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中所述重鏈的可變區(qū)包含CDR，所述CDR具有如下給出的序列中的至少一種對(duì)于CDR-H1在圖1中的H1(SEQ ID NO1)，對(duì)于CDR-H2在圖1中的H2(SEQ ID NO2)或H2’(SEQ ID NO13)或H2”(SEQ IDNO15)或H2(SEQ ID NO16)，或?qū)τ贑DR-H3在圖1中的H3(SEQID NO3)；而所述輕鏈的可變區(qū)包含CDR，所述CDR具有如下給出的序列中的至少一種對(duì)于CDR-L1在圖1中的L1(SEQ ID NO4)、對(duì)于CDR-L2在圖1中的L2(SEQ ID NO5)或?qū)τ贑DR-L3在圖1中的L3(SEQ ID NO6)。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗CD22抗體包含重鏈和輕鏈，其中所述重鏈的可變區(qū)包含CDR，所述CDR具有如下給出的序列中的至少一種CDR-H1的H1(SEQ ID NO1)，CDR-H2的SEQ ID NO2或SEQ ID NO13或SEQ ID NO15或SEQ ID NO16，或CDR-H3的SEQ ID NO3；而所述輕鏈的可變區(qū)包含CDR，所述CDR具有如下給出的序列中的至少一種CDR-L1的SEQ ID NO4、CDR-L2的SEQID NO5或CDR-L3的SEQ ID NO6。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗CD22抗體包含CDR-H1的SEQ ID NO1；CDR-H2的SEQ ID NO2或SEQ ID NO13或SEQ IDNO15或SEQ ID NO16；CDR-H3的SEQ ID NO3；CDR-L1的SEQID NO4；CDR-L2的SEQ ID NO5；和CDR-L3的SEQ ID NO6。
在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人源化抗CD22抗體是CDR移植人源化抗CD22抗體，所述抗體包含輕鏈可變區(qū)5/44-gL1(SEQ IDNO19)和重鏈可變區(qū)5/44-gH7(SEQ ID NO27)。
在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述人源化抗CD22抗體是對(duì)人CD22具有特異性的CDR移植抗體，所述抗體包含輕鏈和重鏈，所述輕鏈具有SEQ ID NO28的序列，而所述重鏈具有SEQ ID NO30的序列。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述CDR移植抗體是變異抗體，所述抗體對(duì)人CD22具有增加的特異性，所述抗體是通過親和力成熟方案獲得的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單體細(xì)胞毒性藥物是加利車霉素，優(yōu)選γ加利車霉素或N-乙酰加利車霉素。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物可任選含有額外的生物活性劑。所述生物活性劑可以是細(xì)胞毒性藥物、生長因子或激素。
本發(fā)明的又一方面涉及治療增生性疾病患者的方法，所述方法通過給予所述患者治療有效量的本發(fā)明的組合物。所述組合物可以通過以下途徑給藥皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、經(jīng)皮、透皮、鼻內(nèi)、局部、腸內(nèi)(entereally)、陰道內(nèi)、舌下或直腸。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物通過靜脈內(nèi)途徑給藥。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將所述組合物給予增生性疾病例如癌癥的人類患者。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述癌癥是B細(xì)胞惡性腫瘤。所述B細(xì)胞惡性腫瘤可以是表達(dá)細(xì)胞表面抗原CD22的白血病或淋巴瘤。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是癌或肉瘤。
本發(fā)明的另一方面涉及治療B細(xì)胞惡性腫瘤的方法，所述方法通過給予所述惡性腫瘤患者治療有效量的包含本發(fā)明細(xì)胞毒性藥物-抗CD22抗體綴合物的組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述B細(xì)胞惡性腫瘤是淋巴瘤、尤其是非霍奇金淋巴瘤。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用于制備本發(fā)明綴合物的細(xì)胞毒性藥物選自以下藥物加利車霉素、塞替派、紫杉烷類、長春新堿、柔紅霉素、多柔比星、表柔比星、放線菌素、authramycin、偶氮絲氨酸、博來霉素、他莫昔芬、伊達(dá)比星、多拉司他汀/auristatins、hemiasterlins、美登素類和埃斯波霉素。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞毒性藥物是γ加利車霉素或N-乙酰加利車霉素。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療包括給予本發(fā)明的細(xì)胞毒性藥物綴合物以及一種或多種選自以下的生物活性劑抗體、生長因子、激素、細(xì)胞因子、抗激素、黃嘌呤、白介素、干擾素和細(xì)胞毒性藥物。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物活性劑是針對(duì)B細(xì)胞惡性腫瘤表達(dá)的細(xì)胞表面抗原的抗體。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，針對(duì)B細(xì)胞惡性腫瘤表達(dá)的細(xì)胞表面抗原的抗體選自抗CD19抗體、抗CD20抗體和抗CD33抗體。所述抗體包括抗CD20抗體即利妥昔單抗(RituxanTM)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物活性劑是細(xì)胞因子或生長因子，包括但不限于白介素2(IL-2)、TNF、CSF、GM-CSF和G-CSF。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，生物活性劑是激素，包括雌激素、雄激素、孕酮和皮質(zhì)類固醇。
在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物活性劑選自以下的細(xì)胞毒性藥物多柔比星、柔紅霉素、伊達(dá)比星、阿柔比星、佐柔比星、米托蒽醌、表柔比星、卡柔比星、諾拉霉素、美諾立爾、pitarubicin、戊柔比星、阿糖胞苷、吉西他濱、曲氟尿苷、安西他濱、依諾他濱、阿扎胞苷、去氧氟尿苷、噴司他丁、溴尿苷、卡培他濱、克拉曲濱、地西他濱、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、谷氏菌素、嘌羅霉素、替加氟、噻唑呋林、阿霉素、順鉑、卡鉑、環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪、長春堿、長春新堿、米托蒽醌、博來霉素、氮芥、潑尼松、丙卡巴肼、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶(flurouracils)、依托泊苷、泰素、泰素類似物和絲裂霉素。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療有效的所述細(xì)胞毒性藥物-抗CD22抗體綴合物的組合物與作為治療方案組成部分的一種或多種細(xì)胞毒性藥物組合聯(lián)合給藥，其中細(xì)胞毒性藥物組合選自CHOPP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼)；CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松)；COP(環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松)；CAP-BOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博來霉素、長春新堿和潑尼松)；m-BACOD(甲氨蝶呤、博來霉素、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、地塞米松和亞葉酸)；ProMACE-MOPP(潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼)；ProMACE-CytaBOM(潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、阿糖胞苷、博來霉素和長春新堿)；MACOP-B(甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松、博來霉素和亞葉酸)；MOPP(氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼)；ABVD(阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪)；MOPP(氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼)與ABV(阿霉素/多柔比星、博來霉素和長春堿)交替使用；MOPP(氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼)與ABVD(阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪)交替使用、ChIVPP(苯丁酸氮芥、長春堿、丙卡巴肼和潑尼松)；IMVP-16(異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)；MIME(米托胍腙、異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)；DHAP(地塞米松、高劑量阿糖胞苷和順鉑)；ESHAP(依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷和順鉑)；CEPP(B)(環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素)；CAMP(洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和潑尼松)；以及CVP-1(環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在給予一種或多種上述細(xì)胞毒性藥物組合之前，先給予治療有效的本發(fā)明細(xì)胞毒性藥物-抗CD22抗體綴合物的組合物。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在給予作為治療方案組成部分的一種或多種上述細(xì)胞毒性藥物組合之后，再給予治療有效的本發(fā)明細(xì)胞毒性藥物-抗CD22抗體綴合物的組合物。
本發(fā)明的另一方面涉及治療侵襲性淋巴瘤的方法，所述方法包括將治療有效的單體加利車霉素衍生物-抗CD22抗體綴合物的組合物與一種或多種生物活性劑聯(lián)合給予需要所述治療的患者。
本發(fā)明的又一方面涉及本發(fā)明的組合物在治療增生性疾病例如癌癥患者中的用途。具體地說，所述癌癥是在其細(xì)胞表面表達(dá)CD22抗原的B細(xì)胞惡性腫瘤。具體地說，所述B細(xì)胞惡性腫瘤是白血病或淋巴瘤。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述癌癥是癌或白血病。
在一個(gè)實(shí)施方案中，治療有效量的所述組合物通過以下途徑給藥皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、經(jīng)皮、透皮、鼻內(nèi)、局部、腸內(nèi)、陰道內(nèi)、舌下或直腸給藥。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療有效量的本發(fā)明的藥用組合物通過靜脈內(nèi)途徑給藥。
本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物在治療B細(xì)胞惡性腫瘤(例如非霍奇金淋巴瘤)患者中的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物與一種或多種生物活性劑一起給藥。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物活性劑選自抗體、生長因子、激素、細(xì)胞因子、抗激素、黃嘌呤、白介素、干擾素和細(xì)胞毒性藥物。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述生物活性劑是針對(duì)在B細(xì)胞惡性腫瘤上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原的抗體，例如抗CD19抗體、抗CD20抗體和抗CD33抗體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗CD20抗體是利妥昔單抗(RituxanTM)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物活性劑包括細(xì)胞因子或生長因子，例如白介素2(IL-2)、TNF、CSF、GM-CSF和G-CSF或激素(包括雌激素、雄激素、孕酮和皮質(zhì)類固醇)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物活性劑是選自以下的細(xì)胞毒性藥物多柔比星、柔紅霉素、伊達(dá)比星、阿柔比星、佐柔比星、米托蒽醌、表柔比星、卡柔比星、諾拉霉素、美諾立爾、pitarubicin、戊柔比星、阿糖胞苷、吉西他濱、曲氟尿苷、安西他濱、依諾他濱、阿扎胞苷、去氧氟尿苷、噴司他丁、溴尿苷、卡培他濱、克拉曲濱、地西他濱、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、谷氏菌素、嘌羅霉素、替加氟、噻唑呋林、阿霉素、順鉑、卡鉑、環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪、長春堿、長春新堿、米托蒽醌、博來霉素、氮芥、潑尼松、丙卡巴肼、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、依托泊苷、泰素、泰素類似物和絲裂霉素。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療有效量的所述單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物與作為治療方案組成部分的一種或多種細(xì)胞毒性藥物組合一起給藥，其中所述細(xì)胞毒性藥物組合選自CHOPP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼)；CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松)；COP(環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松)；CAP-BOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博來霉素、長春新堿和潑尼松)；m-BACOD(甲氨蝶呤、博來霉素、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、地塞米松和亞葉酸)；ProMACE-MOPP(潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼)；ProMACE-CytaBOM(潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、阿糖胞苷、博來霉素和長春新堿)；MACOP-B(甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松、博來霉素和亞葉酸)；MOPP(氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼)；ABVD(阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪)；MOPP(氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼)與ABV(阿霉素/多柔比星、博來霉素和長春堿)交替使用；MOPP(氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼)與ABVD(阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪)交替使用；ChIVPP(苯丁酸氮芥、長春堿、丙卡巴肼和潑尼松)；IMVP-16(異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)；MIME(米托胍腙、異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)；DHAP(地塞米松、高劑量阿糖胞苷和順鉑)；ESHAP(依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷和順鉑)；CEPP(B)(環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素)；CAMP(洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和潑尼松)；CVP-1(環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松)、ESHOP(依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷、長春新堿和順鉑)；EPOCH(依托泊苷、長春新堿和多柔比星給予96小時(shí)，同時(shí)給予快速濃注環(huán)磷酰胺和口服潑尼松)、ICE(異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺和依托泊苷)、CEPP(B)(環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素)、CHOP-B.(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和博來霉素)、CEPP-B(環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼和博來霉素)以及P/DOCE(表柔比星或多柔比星、長春新堿、環(huán)磷酰胺和潑尼松)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在給予作為治療方案組成部分的一種或多種細(xì)胞毒性藥物組合之前，先給予所述單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在給予作為治療方案組成部分的一種或多種細(xì)胞毒性藥物組合之后，再給予治療有效劑量的所述單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物。
在又一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，將治療有效劑量的所述單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物與針對(duì)B細(xì)胞惡性腫瘤的細(xì)胞表面抗原的抗體聯(lián)合給藥，并任選包含作為治療方案組成部分的一種或多種細(xì)胞毒性藥物組合。
在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物在制備用于治療增生性疾病的藥物中的用途。所述藥物可以單獨(dú)用于或與其它生物活性劑聯(lián)合用于治療B細(xì)胞增生性疾病。
附圖簡述圖1顯示小鼠單克隆抗體5/44的CDR的氨基酸序列(SEQ IDNOS1-6)。
圖2顯示小鼠單克隆抗體5/44輕鏈可變區(qū)(VL)的DNA序列和蛋白質(zhì)序列。
圖3顯示小鼠單克隆抗體5/44重鏈可變區(qū)(VH)的全序列。
圖4顯示CDR-H2中的糖基化位點(diǎn)和活性賴氨酸的去除策略。
圖5顯示5/44輕鏈序列的移植設(shè)計(jì)。DPK-9是人種系受體構(gòu)架序列。垂直線表示在鼠源殘基和人源殘基之間存在不同。下劃線的序列表示保留在移植物中的供體殘基。CDR以粗斜體字母表示(對(duì)于DPK-9未顯示)。移植物gL1有6個(gè)供體構(gòu)架殘基，gL2有7個(gè)。
圖6顯示5/44重鏈序列的移植設(shè)計(jì)；DP7是人種系受體構(gòu)架序列。垂直線表示在鼠源殘基和人源殘基之間存在不同。下劃線的序列表示保留在移植物中的供體殘基。CDR以粗斜體字母表示(對(duì)于DP7未顯示)。移植物gH4和gH6有6個(gè)供體構(gòu)架殘基。移植物gH5和gH7有4個(gè)供體構(gòu)架殘基。
圖7顯示載體pMRR14的圖譜。
圖8顯示載體pMRR10.1的圖譜。
圖9顯示嵌合5/44突變體的Biacore測定結(jié)果。
圖10顯示5/44 gH1和gL1基因裝配的寡核苷酸。
圖11顯示中間載體pCR2.1(544gH1)的質(zhì)粒圖譜。
圖12顯示中間載體pCR2.1(544gL1)的質(zhì)粒圖譜。
圖13顯示用于制備其它移植物的寡核苷酸盒。
圖14是一幅曲線圖，顯示熒光標(biāo)記的小鼠5/44抗體和移植變異體之間的競爭測定。
圖15是一幅曲線圖，顯示熒光標(biāo)記的小鼠5/44抗體和移植變異體之間的競爭測定。
圖16顯示移植重鏈和移植輕鏈的全部DNA序列和蛋白質(zhì)序列。
圖17是抗體-NAc-γ加利車霉素DMH綴合物的示意圖。
圖18是一幅曲線圖，顯示CMC-544對(duì)RAMOS B細(xì)胞淋巴瘤生長的影響。
圖19是一幅曲線圖，顯示在裸鼠的體內(nèi)異種移植模型中CMC-544對(duì)大B細(xì)胞淋巴瘤的影響。
圖20是一幅曲線圖，比較了用CMA-676綴合方法和CMC-544綴合方法制備的CMC-544對(duì)RL淋巴瘤生長的影響。
圖21是一幅曲線圖，顯示用利妥昔單抗(RituxanTM)治療的大RL淋巴瘤對(duì)CMC-544治療敏感。
圖22是一幅曲線圖，顯示利妥昔單抗(RituxanTM)對(duì)CMC-544的細(xì)胞毒性效應(yīng)的影響。
圖23是一幅曲線圖，顯示CMC-544、利妥昔單抗(RituxanTM)和CMA-676對(duì)帶有彌散性早期RAMOS B淋巴瘤的SCID小鼠存活率的影響。
圖24是一幅曲線圖，顯示CMC-544、利妥昔單抗(RituxanTM)和CMA-676對(duì)帶有彌散性晚期RAMOS B淋巴瘤的SCID小鼠存活率的影響。
圖25是一幅曲線圖，顯示CMC-544、利妥昔單抗(RituxanTM)和CMA-676對(duì)帶有彌散性晚期RAMOS B淋巴瘤的SCID小鼠存活率的影響。
圖26是一幅曲線圖，顯示CMC-544、利妥昔單抗(RituxanTM)和CMA-676對(duì)帶有彌散性晚期RAMOS B淋巴瘤的SCID小鼠存活率的影響。
圖27是一幅曲線圖，顯示CMC-544、利妥昔單抗(RituxanTM)和CMA-676對(duì)帶有彌散性晚期RAMOS B淋巴瘤的SCID小鼠存活率的影響。
圖28是一幅曲線圖，顯示CMC-544+/-利妥昔單抗(RituxanTM)對(duì)RL非霍奇金淋巴瘤的抗腫瘤活性。
圖29是一幅曲線圖，顯示CMC-544和CHOP對(duì)RL非霍奇金淋巴瘤的抗腫瘤活性。
發(fā)明詳述本發(fā)明的綴合物包含細(xì)胞毒性藥物，所述細(xì)胞毒性藥物是用包含任何與蛋白質(zhì)性載體反應(yīng)的反應(yīng)基的接頭衍生的，以形成細(xì)胞毒性藥物衍生物-蛋白質(zhì)性載體綴合物。具體地說，本發(fā)明的綴合物包含細(xì)胞毒性藥物，所述細(xì)胞毒性藥物是用包含任何與用作蛋白質(zhì)性載體的抗體反應(yīng)的反應(yīng)基的接頭衍生的，以形成細(xì)胞毒性藥物衍生物-蛋白質(zhì)性載體綴合物。具體地說，所述抗體針對(duì)B細(xì)胞惡性腫瘤上的細(xì)胞表面抗原。下面描述了制備和純化所述綴合物的改進(jìn)方法。使用具體的助溶劑、添加劑和具體的反應(yīng)條件以及分離方法，結(jié)果形成了具有顯著減少的LCF的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/抗體綴合物。單體形式而不是聚集形式具有重大的治療價(jià)值，而且LCF最小化以及顯著減少的聚集導(dǎo)致以具有治療意義的方式利用所述抗體原料，阻止LCF與較高綴合部分(HCF)競爭。
I.載體本發(fā)明的載體/靶向劑最好是蛋白質(zhì)性載體/靶向劑。載體/靶向劑包括激素、生長因子、抗體、抗體片段、抗體模擬物和它們的基因工程或酶工程對(duì)應(yīng)物，在下文中以單獨(dú)形式或以基團(tuán)形式都稱為“載體”。載體的基本特征是能識(shí)別和結(jié)合與不需要的細(xì)胞相關(guān)的抗原或受體，然后使其內(nèi)化。應(yīng)用于本發(fā)明的載體的實(shí)例公開于美國專利第5,053,394號(hào)，所述專利文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。用于本發(fā)明的優(yōu)選的載體是抗體和抗體模擬物。
許多非免疫球蛋白的蛋白支架已經(jīng)用于產(chǎn)生抗體模擬物，所述抗體模擬物以抗體特異性與抗原表位結(jié)合(PCT公布號(hào)WO00/34784)。例如，已經(jīng)通過從單克隆抗體的重鏈可變區(qū)缺失3個(gè)β鏈，設(shè)計(jì)了與免疫球蛋白折疊有關(guān)的“微型抗體(minibody)”支架(Tramontano等，J.Mol.Recognit.79，1994)。該蛋白包括61個(gè)殘基，可用于展示2個(gè)高變環(huán)。這兩個(gè)環(huán)已經(jīng)隨機(jī)化，根據(jù)抗原結(jié)合選擇的產(chǎn)物、但至此是所述構(gòu)架看來因?yàn)槿芙舛葐栴}而在應(yīng)用方面受到一定的限制。另一種用于展示環(huán)的構(gòu)架是淀粉酶抑肽，這是一種特異性抑制哺乳動(dòng)物α-淀粉酶的蛋白，該蛋白具有74個(gè)殘基，為6鏈β折疊夾心結(jié)構(gòu)，由2個(gè)二硫鍵連接在一起(McConnell和Hoess，J.Mol.Biol.250460，1995)。該支架包含3個(gè)環(huán)，但是迄今為止，這些環(huán)中只有2個(gè)檢查到隨機(jī)化潛力。
已檢驗(yàn)了作為構(gòu)架的其它蛋白，并已用于在α螺旋表面(Nord等，Nat.Biotechnol.15772，1997；Nord等，Protein Eng.8601，1995)、在α螺旋束中α螺旋之間的環(huán)上(Ku和Schutz，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 926552，1995)和在由二硫橋限制的環(huán)上(例如小蛋白酶抑制劑上的環(huán))(Markland等，Biochemistry 358045，1996；Markland等，Biochemistry358058，1996；Rottgen和Collins，Gene 164；243，1995；Wang等，J.Biol.Chem.27012250，1995)展示隨機(jī)殘基。
可用于本發(fā)明的抗體載體的實(shí)例包括單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體及它們的生物活性片段。所述抗體最好是針對(duì)在增生性疾病例如癌癥的靶細(xì)胞和/或組織上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原。針對(duì)靶細(xì)胞上細(xì)胞表面抗原的特異性抗體的實(shí)例包括但不限于以下抗體針對(duì)在大多數(shù)B細(xì)胞淋巴瘤上過量表達(dá)的CD22抗原的抗體；G5/44(鼠抗CD22單克隆抗體的人源化形式)；針對(duì)細(xì)胞表面抗原CD33的抗體(所述細(xì)胞表面抗原在某些人骨髓瘤、尤其是急性髓樣白血病中普遍存在)；hP67.6(抗CD33鼠抗體的人源化形式)(參見美國專利第5,773,001號(hào))；針對(duì)PEM抗原的抗體(所述抗原存在于上皮起源的許多腫瘤，稱為mP67.6(參見I.D.Bernstein等，J.Clin.Invest.791153(1987)和I.D.Bernstein等，J.Immunol.128867-881(1992))；針對(duì)在許多實(shí)體瘤(稱為hu3S193，(參見美國專利第6,310,185 B1號(hào))上過量表達(dá)的Lewis Y糖抗原的人源化抗體。另外，有幾種市售的抗體，例如利妥昔單抗(RituxanTM)和曲妥單抗(HerceptinTM)，也可用作載體/靶向劑。利妥昔單抗(RituxanTM)是用于治療各種B細(xì)胞淋巴瘤的嵌合抗CD20抗體，而曲妥單抗(HerceptinTM)是用于治療乳腺癌的人源化抗Her2抗體。
在本文中用作本發(fā)明的載體的實(shí)例是針對(duì)細(xì)胞表面抗原CD22的CDR移植人源化抗體分子，稱為G5/44。該抗體是針對(duì)在某些人淋巴瘤上普遍存在的細(xì)胞表面抗原CD22的鼠抗CD22單克隆抗體的人源化形式。本文所用的術(shù)語“CDR移植抗體分子”是指這樣的抗體分子其中重鏈和/或輕鏈包含一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)，必要時(shí)，包含從供體抗體(例如鼠單克隆抗體)移植到受體抗體(例如人抗體)的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)構(gòu)架中的修飾CDR(下文稱為CDR)。所述CDR移植抗體最好具有包含人受體構(gòu)架區(qū)和一個(gè)或多個(gè)上述供體CDR的可變區(qū)。
當(dāng)移植CDR時(shí)，可以使用任何合適的與所述CDR所來源的供體抗體的類別/類型有關(guān)的受體可變區(qū)構(gòu)架序列，包括小鼠構(gòu)架區(qū)、靈長類構(gòu)架區(qū)和人構(gòu)架區(qū)?？捎糜诒景l(fā)明的人構(gòu)架的實(shí)例有KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat等，Seq.of Proteinsof Immunol.Interest，1310-334(1994))。例如，KOL和NEWM可用于重鏈，REI可用于輕鏈，而EU、LAY和POM既可用于重鏈又可用于輕鏈。
在本發(fā)明的CDR移植抗體中，最好使用具有與供體抗體的鏈同源的抗體作為受體抗體。受體的重鏈和輕鏈不必來源于同一抗體，并且如果需要，可包含具有來自不同鏈的構(gòu)架區(qū)的混合鏈。
另外，在本發(fā)明的CDR移植抗體中，構(gòu)架區(qū)不必具有與受體抗體的那些序列完全相同的序列。例如，罕見殘基可變?yōu)楦?jīng)常出現(xiàn)的該受體鏈類別或類型的殘基。或者，可改變在受體構(gòu)架區(qū)所選的殘基以便它們對(duì)應(yīng)于在供體抗體的相同位置存在的殘基或?qū)?yīng)于在供體抗體的相同位置存在的殘基的保守取代的殘基。應(yīng)最小限度的保持這些使供體抗體的親和力恢復(fù)必需的改變。PCT公布號(hào)WO91/09967中公開了在需要改變的受體構(gòu)架區(qū)內(nèi)選擇殘基的方案，所述專利文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。
供體殘基是來自供體抗體(即來自最初獲得CDR的抗體)的殘基。
本發(fā)明的抗體可包含其中可變區(qū)包含作為CDR-H2(如Kabat等定義，(參見上文))的H2’的重鏈，其中為提高抗體對(duì)抗原的親和力而去除潛在的糖基化位點(diǎn)序列。
另外，本發(fā)明的抗體可包含其中可變區(qū)包含作為CDR-H2(如Kabat等定義，(參見上文))的H2”的重鏈，其中賴氨酸位于位置60。該賴氨酸殘基被其它氨基酸所取代，所述賴氨酸殘基位于CDR-H2內(nèi)暴露的位置并認(rèn)為其有可能與綴合劑反應(yīng)，從而導(dǎo)致抗原結(jié)合親和力下降。
另外，本發(fā)明的抗體可包含其中可變區(qū)包含作為CDR-H2(如Kabat等定義，(參見上文))的H2的重鏈，其中潛在的糖基化位點(diǎn)序列和位置60的賴氨酸殘基被其它氨基酸所取代。
本發(fā)明的抗體可包含具有全長重鏈和輕鏈的完全抗體；其生物活性片段，例如Fab、修飾Fab、Fab’、F(ab’)2或Fv片段；輕鏈或重鏈單體或二聚體；或單鏈抗體，例如其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過肽接頭連接的單鏈Fv。同樣，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)可與其它合適的抗體結(jié)構(gòu)域組合。
本發(fā)明的抗體也可包括修飾Fab片段，其中所述修飾是添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，以便讓效應(yīng)分子或報(bào)道分子連接到其重鏈的C末端。加入的氨基酸最好形成含有可以連接效應(yīng)分子或報(bào)道分子的一個(gè)或兩個(gè)半胱氨酸殘基的修飾鉸鏈區(qū)。
可以選擇與所述抗體想要的功能、尤其是需要或不需要的效應(yīng)物功能有關(guān)的本發(fā)明的抗體恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(如果有的話)。例如，所述恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM結(jié)構(gòu)域。具體地說，當(dāng)所述抗體是準(zhǔn)備用于治療用途并且需要抗體效應(yīng)物功能時(shí)，可以使用人IgG恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域、尤其是IgG1和IgG3同種型恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。或者，當(dāng)所述抗體準(zhǔn)備用于治療目的并且抗體效應(yīng)物功能不需要或不必要時(shí)，可以使用IgG2和IgG4同種型，或者可以使IgG1Fc區(qū)突變，以消除所述效應(yīng)物功能。
本發(fā)明抗體的結(jié)合親和力至少5×10-8M、優(yōu)選至少1×10-9M、更優(yōu)選至少0.75×10-10M、最優(yōu)選至少0.5×10-10M。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及免疫毒素綴合物和使用抗體變異體或抗體模擬物制備這樣的綴合物的方法。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體的變異體針對(duì)CD22，顯示出對(duì)CD22的改進(jìn)的親和力。所述變異體可以通過許多的親和力成熟方案獲得，所述親和力成熟方案包括CDR突變(Yang等，J.Mol.Biol.254，392-403，1995)、鏈改組(Marks等，Bio/Technology，10，779-783，1992)、大腸桿菌(E.coli)增變株的應(yīng)用(Low等，J.Mol.Biol.，250，359-368，1996)、DNA改組(Patten等，Curr.Opin.Biotechnol.，8，724-733，1997)、噬菌體展示(Thompson等，J.Mol.Biol.，256，77-88，1996)和性PCR(Crameri等，Nature，391，288-291，1998)。
任何合適的宿主細(xì)胞/載體系統(tǒng)都可用于表達(dá)編碼包含本發(fā)明抗體的載體的DNA序列。細(xì)菌系統(tǒng)例如大腸桿菌和其它微生物系統(tǒng)可部分用于表達(dá)抗體片段，例如Fab和F(ab’)2片段、尤其是Fv片段和單鏈抗體片段，例如單鏈Fv。真核生物(例如哺乳動(dòng)物)的宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可用于制備較大抗體，包括完整抗體分子。合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括CHO、骨髓瘤、酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、NSO、VERO或PER C6細(xì)胞。合適的表達(dá)系統(tǒng)也包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物。
II.治療藥適用于本發(fā)明的治療藥如下抑制或破壞微管蛋白聚合的細(xì)胞毒性藥物、與DNA結(jié)合和破壞DNA的烷化劑以及抑制蛋白質(zhì)合成或必需的細(xì)胞蛋白質(zhì)(例如蛋白激酶、酶和細(xì)胞周期蛋白)的藥物。這樣的細(xì)胞毒性藥物的實(shí)例包括但不限于塞替派、紫杉烷類、長春新堿、柔紅霉素、多柔比星、表柔比星、放線菌素、authramycin、偶氮絲氨酸、博來霉素、他莫昔芬、伊達(dá)比星、多拉司他汀/auristatins、hemiasterlins、加利車霉素、埃斯波霉素和美登素類。優(yōu)選的細(xì)胞毒性藥物是加利車霉素，所述藥物是甲基三硫抗腫瘤抗生素的實(shí)例。適用于本發(fā)明的加利車霉素的實(shí)例已經(jīng)公開于例如美國專利第4,671,958號(hào)、美國專利第4,970,198號(hào)、美國專利第5,053,394號(hào)、美國專利第5,037,651號(hào)和美國專利第5,079,233號(hào)，所述專利文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。優(yōu)選的加利車霉素是γ-加利車霉素衍生物或N-乙酰γ-加利車霉素衍生物。
III.細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物本發(fā)明的綴合物具有式Pr(-X-W)m，其中Pr為蛋白質(zhì)性載體，X為包含任何可與蛋白質(zhì)性載體反應(yīng)的反應(yīng)基的產(chǎn)物的接頭，W為細(xì)胞毒性藥物；m為純化綴合產(chǎn)物的平均負(fù)荷，致使加利車霉素占所述綴合物的4-10％(重量)；且(-X-W)m為細(xì)胞毒性藥物優(yōu)選X具有下式(CO-Alk1-Sp1-Ar-Sp2-Alk2-C(Z1)＝Q-Sp)其中Alk1和Alk2獨(dú)立地為化學(xué)鍵或支鏈或直鏈(C1-C10)亞烷基；Sp1為化學(xué)鍵、-S-、-O-、-CONH-、-NHCO-、-NR′-、-N(CH2CH2)2N-或-X-Ar′-Y-(CH2)n-Z，其中X、Y和Z獨(dú)立地為化學(xué)鍵、-NR′-、-S-或-O-，條件是當(dāng)n＝0，則Y和Z中至少一個(gè)必須為化學(xué)鍵，且Ar′為任選被1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)以下基團(tuán)取代的1，2-亞苯基、1，3-亞苯基或1，4-亞苯基(C1-C5)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)烷硫基、鹵素、硝基、-COOR′、-CONHR′、-(CH2)nCOOR′、-S(CH2)nCOOR′、-O(CH2)nCONHR′或-S(CH2)nCONHR′，條件是當(dāng)Alk1為化學(xué)鍵，則Sp1為化學(xué)鍵；n為0-5的整數(shù)；R′為任選被1個(gè)或2個(gè)以下基團(tuán)取代的支鏈或直鏈(C1-C5)鏈-OH、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)烷硫基、鹵素、硝基、(C1-C3)二烷基氨基或(C1-C3)三烷基銨-A-，其中A-為形成鹽的藥學(xué)上可接受的陰離子；Ar為任選被1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)以下基團(tuán)取代的1，2-亞苯基、1，3-亞苯基或1，4-亞苯基(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)烷硫基、鹵素、硝基、-COOR′、-CONHR′、-O(CH2)nCOOR′、-S(CH2)nCOOR′、-O(CH2)nCONHR′或-S(CH2)nCONHR′，其中n和R′如上定義，或是1，2-亞萘基、1，3-亞萘基、1，4-亞萘基、1，5-亞萘基、1，6-亞萘基、1，7-亞萘基、1，8-亞萘基、2，3-亞萘基、2，6-亞萘基或2，7-亞萘基或 其中每個(gè)亞萘基或噻吩嗪任選被1、2、3或4個(gè)以下基團(tuán)取代(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)烷硫基、鹵素、硝基、-COOR′、-CONHR′、-O(CH2)nCOOR′、-S(CH2)nCOOR′或-S(CH2)nCONHR′，其中n和R′如上定義，條件是當(dāng)Ar為噻吩嗪時(shí)，Sp1是一個(gè)僅與氮連接的化學(xué)鍵；Sp2為化學(xué)鍵、-S-或-O-，條件是當(dāng)Alk2為化學(xué)鍵，則Sp2為化學(xué)鍵；Z1為H、(C1-C5)烷基或任選被1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)以下基團(tuán)取代的苯基(C1-C5)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)烷硫基、鹵素、硝基、-COOR′、-ONHR′、-O(CH2)nCOOR′、-S(CH2)nCOOR′、-O(CH2)nCONHR′或-S(CH2)nCONHR′，其中n和R′如上定義；
Sp為直鏈或支鏈二價(jià)或三價(jià)(C1-C18)基團(tuán)、二價(jià)或三價(jià)芳基或雜芳基、二價(jià)或三價(jià)(C3-C18)環(huán)烷基或雜環(huán)烷基、二價(jià)或三價(jià)芳基-或雜芳基-芳基(C1-C18)基團(tuán)、二價(jià)或三價(jià)環(huán)烷基-或雜環(huán)烷基-烷基(C1-C18)基團(tuán))或二價(jià)或三價(jià)(C2-C18)不飽和烷基，其中雜芳基最好是呋喃基、噻吩基、N-甲基吡咯基、吡啶基、N-甲基咪唑基、噁唑基、嘧啶基、喹啉基、異喹啉基、N-甲基咔唑基、aminocourmarinyl或吩嗪基，其中如果Sp為三價(jià)基團(tuán)時(shí)，則Sp可以額外地被以下基團(tuán)取代低級(jí)(C1-C5)二烷基氨基、低級(jí)(C1-C5)烷氧基、羥基或低級(jí)(C1-C5)烷硫基；且Q為＝NHNCO-、＝NHNCS-、＝NHNCONH-、＝NHNCSNH-或＝NHO-。
Alk1最好為支鏈或直鏈(C1-C10)亞烷基；Sp1為化學(xué)鍵、-S-、-O-、-CONH-、-NHCO-或-NR′-，其中R′如上定義，條件是當(dāng)Alk1為化學(xué)鍵時(shí)，Sp1為化學(xué)鍵；Ar為任選被1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)以下基團(tuán)取代的1，2-亞苯基、1，3-亞苯基或1，4-亞苯基(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)烷硫基、鹵素、硝基、-COOR′、-CONHR′、-O(CH2)nCOOR′、-S(CH2)nCOOR′、-O(CH2)nCONHR′或-S(CH2)nCONHR′，其中n和R′如上定義，或者Ar為1，2-亞萘基、1，3-亞萘基、1，4-亞萘基、1，5-亞萘基、1，6-亞萘基、1，7-亞萘基、1，8-亞萘基、2，3-亞萘基、2，6-亞萘基或2，7-亞萘基，其中每個(gè)亞萘基任選被1、2、3或4個(gè)以下基團(tuán)取代(C1-C6)烷基、(C1-C5)烷氧基、(C1-C4)烷硫基、鹵素、硝基、-COOR′、-CONHR′、-O(CH2)nCOOR′、-S(CH2)nCOOR′、-O(CH2)nCONHR′或-S(CH2)nCONHR′。
Z1為(C1-C5)烷基或任選被1個(gè)、2個(gè)或3個(gè)以下基團(tuán)取代的苯基(C1-C5)烷基、(C1-C4)烷氧基、(C1-C4)烷硫基、鹵素、硝基、-COOR′、-CONHR′、-O(CH2)nCOOR′、-S(CH2)nCOOR′、-O(CH2)nCONHR′或-S(CH2)nCONHR′；Alk2和Sp2同時(shí)為化學(xué)鍵；且Sp和Q如上定義。
美國專利第5,773,001號(hào)(通過引用全部結(jié)合到本文中)公開了從加利車霉素制備的并且與親核衍生物、尤其是酰肼和相關(guān)親核試劑一起使用的接頭。這些接頭在所述藥物和接頭之間形成的鍵是可以水解以獲得更好活性的情況下尤其有用。這些接頭含有兩個(gè)官能團(tuán)。一個(gè)官能團(tuán)一般是用于與載體反應(yīng)的羧基。酸性官能團(tuán)被適當(dāng)活化后，可以與載體的游離氨基(例如抗體或其他蛋白質(zhì)性載體的賴氨酸側(cè)鏈的氨基等)形成酰胺鍵。另一個(gè)官能團(tuán)通常是羰基，即醛基或酮基，所述基團(tuán)可以與適當(dāng)修飾的治療藥反應(yīng)。所述羰基可以與藥物上的酰肼基團(tuán)反應(yīng)，形成腙鍵。該鍵是可水解的，可以在與靶細(xì)胞結(jié)合后讓治療藥從所述綴合物中釋放出來。
用于本發(fā)明的最優(yōu)選的雙官能接頭是4-(4-乙酰苯氧基)丁酸(AcBut)，所述接頭產(chǎn)生優(yōu)選的產(chǎn)物，其中所述綴合物由以下部分組成通過與3-巰基-3-甲基丁酰肼反應(yīng)而官能化的β-加利車霉素、γ-加利車霉素或N-乙酰γ加利車霉素、AcBut接頭和人或人源化IgG抗體靶向載體。
IV.單體綴合在制備具有用于治療應(yīng)用所必要的良好載藥量和合理收率的單體藥物綴合物中，許多細(xì)胞毒性藥物(包括加利車霉素)的天然疏水性產(chǎn)生問題。由接頭(例如美國專利第5,773,001號(hào)中公開的AcBut接頭)帶來的鍵疏水性增加，以及將所述治療藥物與所述載體(抗體)分開的共價(jià)距離的增加，使這一問題更加嚴(yán)重。
具有較高載藥量的細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物發(fā)生聚集的原因是所述藥物的疏水性。通常不得不限制載藥量，以獲得合理量的單體產(chǎn)物。因?yàn)檫^量聚集，在某些情況下，例如用美國專利第5,877,296號(hào)的綴合物、用美國專利第5,053,394號(hào)公開的反應(yīng)條件，以用于治療應(yīng)用的收率和負(fù)荷制備綴合物常常是困難的。這些反應(yīng)條件在綴合反應(yīng)中使用DMF作為助溶劑。因此，需要有容許較高載藥量/收率而不聚集、而且材料也沒有內(nèi)在損失的方法。
降低聚集的改進(jìn)方法描述于美國專利第5,712,374號(hào)和第5,714,586號(hào)，所述專利文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。這些專利中公開的蛋白質(zhì)性載體包括但不限于蛋白，例如用于靶向所述細(xì)胞毒性治療藥的人抗體或人源化抗體，例如在該專利文獻(xiàn)中公開的hP67.6和其它人源化抗體等。在這些專利中，發(fā)現(xiàn)使用一種非親核的、蛋白相容緩沖液，通常產(chǎn)生具有較高載藥量/收率和減少的聚集、具有良好活性的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物，所述緩沖液含有(i)作為助溶劑的丙二醇和(ii)包含至少一種C6-C18羧酸的添加劑。這些專利中所述優(yōu)選的酸是C7-C12酸，最優(yōu)選的酸是辛酸(例如辛酸)或其鹽。用于從N-羥基琥珀酰亞胺(OSu)酯或其它類似的活化酯制備綴合物的優(yōu)選的緩沖液是磷酸緩沖鹽溶液(PBS)或N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES緩沖液)。用于這些綴合反應(yīng)的緩沖液不能含有游離胺或親核試劑。對(duì)于其它類型的綴合物，可接受的緩沖液可以容易地確定。或者，人們發(fā)現(xiàn)使用含有叔丁醇、不含其它添加劑的非親核的、蛋白相容的緩沖液液，可以產(chǎn)生具有較高載藥量/收率和減少聚集的單體加利車霉素衍生物/載體綴合物。
對(duì)于不同蛋白，形成單體綴合物所需的助溶劑的用量有所不同，可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定，無需過度實(shí)驗(yàn)。對(duì)于不同抗體，有效形成單體綴合物所需的添加劑量也不相同。該用量也可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定，無需過度實(shí)驗(yàn)。在美國專利第5,712,374號(hào)和第5,714,586號(hào)中，向綴合反應(yīng)中加入丙二醇和添加劑，以產(chǎn)生具有較高載藥量/收率和聚集減少的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物，其中加入丙二醇的用量范圍是總?cè)芤旱?0％-60％(體積)、優(yōu)選10％-40％(體積)、最優(yōu)選約30％(體積)；而加入的添加劑包含至少一種C6-C18羧酸或其鹽、優(yōu)選辛酸或其鹽，其用量范圍是20mM-100mM、優(yōu)選40mM-90mM、最優(yōu)選約60mM-90mM。除了丙二醇外，也可以使用其它蛋白相容的有機(jī)助溶劑，例如乙二醇、乙醇、DMF、DMSO等。可以使用一些或所有所述有機(jī)助溶劑，將所述藥物轉(zhuǎn)移到所述綴合混合物中。
或者，在這些專利中，所述C6-C18羧酸或其鹽的濃度可以增至150-300mM，而所述助溶劑濃度可以降至1-10％。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述羧酸是辛酸或其鹽。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述羧酸是癸酸或其鹽。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述羧酸是辛酸或其鹽，所述辛酸的濃度是200mM，與5％丙二醇或乙醇一起。
在這些專利的另一個(gè)替代的實(shí)施方案中，可以將濃度范圍為總?cè)芤旱?0％-25％(體積)、優(yōu)選15％(體積)的叔丁醇加入到綴合反應(yīng)中，產(chǎn)生具有較高載藥量/收率和減少聚集的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物。
這些已確定的綴合條件已用于形成現(xiàn)已作為MylotargTM在市場上銷售的CMA-676(吉姆單抗奧佐米星)。自從將該療法引入到急性髓樣白血病(AML)后，通過使用離子交換層析，已經(jīng)知道加利車霉素不是以均勻方式在所述抗體上分布。大多數(shù)加利車霉素分布在約一半的所述抗體上，同時(shí)另一半以只含有少量加利車霉素的LCF形式存在。因此，關(guān)鍵是需要改進(jìn)用于將細(xì)胞毒性藥物(例如加利車霉素)綴合到載體上的方法，使聚集量最小化并且容許較高的均勻的載藥量以及顯著改進(jìn)的綴合產(chǎn)物收率。
一個(gè)具體的實(shí)例是被稱為CMC-544的G5/44-NAc-γ-加利車霉素DMH AcBut綴合物，一般性示于圖17。為了開發(fā)CMC-544，希望LCF的量減少到小于總抗體量的10％，并且考慮了各種選擇以降低LCF水平。所述免疫綴合物的其它特征，例如抗原結(jié)合和細(xì)胞毒性，必須不受最終解決方法的影響。所考慮的選擇包括對(duì)所述抗體的遺傳或物理修飾、層析分離技術(shù)或?qū)Ψ磻?yīng)條件的改進(jìn)。
采用老的反應(yīng)條件(CMA-676工藝條件)，進(jìn)行G5/44抗體與NAc-γ-加利車霉素DMH AcBut Osu的反應(yīng)，生產(chǎn)出具有與CMA-676相似的物理性能(載藥量、LCF和聚集)的產(chǎn)品。然而，人們認(rèn)為綴合后高水平(50-60％)的LCF是不需要的。通過評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法中的關(guān)鍵反應(yīng)變量(例如溫度、pH、加利車霉素衍生物投入和添加劑濃度)，確定最佳反應(yīng)條件。對(duì)這些實(shí)驗(yàn)的分析證明，加利車霉素的投入和添加劑濃度對(duì)低綴合部分LCF水平和聚集體形成具有最顯著影響，而溫度和pH的影響較小。在另外的實(shí)驗(yàn)中，也顯示出蛋白質(zhì)性載體(抗體)和助溶劑(乙醇)的濃度對(duì)控制LCF和聚集體水平的影響都比較小(與加利車霉素投入和添加劑濃度相比)。為了使LCF降至＜10％，將所述加利車霉素衍生物的投入增至相對(duì)于反應(yīng)中抗體量的3％-8.5％(w/w)。將所述添加劑從濃度為200mM的辛酸或其鹽(CMA-676工藝)改變成濃度為37.5mM的癸酸或其鹽。在稍微升高的溫度(30-35℃)和pH(8.2-8.7)下，所述綴合反應(yīng)進(jìn)行得更好。在所述反應(yīng)條件中引入這些改變，將LCF降至小于10％，同時(shí)增加了加利車霉素負(fù)荷，所述改變的反應(yīng)條件在下文中稱為CMC-544工藝條件或“新”工藝條件。采用CMA-676和CMC-544工藝條件獲得的結(jié)果比較示于表1。
表1CMA-676和CMC-544工藝條件的比較
加利車霉素投入的增加使載藥量從2.5-3.0％(重量)增至7.0-9.0(重量)(最通常為7.5-8.5％(重量))，而沒有引起反應(yīng)中蛋白聚集的增加。因?yàn)闇p少了聚集體和LCF，CMC-544工藝條件產(chǎn)生了更均一的產(chǎn)物。采用這一新綴合方法，以幾克抗體的規(guī)模，已經(jīng)重復(fù)制備了CMC-544。
在上述反應(yīng)中，抗體的濃度范圍可以是1-15mg/ml，加利車霉素衍生物(例如N-乙酰γ-加利車霉素DMH AcBut OSu酯(用于制備圖17所示的綴合物))的濃度范圍可以是所述抗體的約4.5-11％(重量)。所述助溶劑是乙醇，已經(jīng)證明要得到好結(jié)果，乙醇的濃度范圍為6-11.4％(體積)。在PBS、HEPES、N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-(4-丁磺酸)(HEPBS)或其它pH為8-9的相容的緩沖液中，在溫度范圍為30℃至約35℃下以及在時(shí)間范圍為15分鐘至24小時(shí)內(nèi)，進(jìn)行所述反應(yīng)。對(duì)于其它類型的綴合物，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定可接受的pH范圍。對(duì)于不同抗體，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用稍有改動(dòng)的上述添加劑組合能改進(jìn)載藥量和單體綴合物收率，人們知道在實(shí)際條件下或選用添加劑時(shí)，任何具體的蛋白質(zhì)性載體需要稍加改動(dòng)，以達(dá)到最佳結(jié)果。
V.綴合物的純化和分離綴合后，可采用常規(guī)方法，將所述單體綴合物從未綴合反應(yīng)物(例如蛋白質(zhì)性載體和游離細(xì)胞毒性藥物/加利車霉素)和/或所述綴合物的聚集形式中分離出來，所述常規(guī)方法例如大小排阻層析法(SEC)、疏水作用層析法(HIC)、離子交換層析法(IEC)或?qū)游鼍劢?CF)。純化的綴合物是單體，通常含有4-10％(重量)的細(xì)胞毒性藥物/加利車霉素。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述綴合物采用疏水作用層析法(HIC)純化。在上述用于生產(chǎn)規(guī)模制備細(xì)胞毒性藥物/加利車霉素-抗體綴合物的工藝(CMA-676工藝)中，采用的單獨(dú)的綴合后分離步驟是大小排阻層析法(SEC)。雖然該步驟對(duì)于去除聚集綴合物以及在制劑中完成緩沖交換來說都非常有效，但在降低LCF含量上卻無效。因此，所述基于SEC的工藝完全依賴于所述綴合反應(yīng)的化學(xué)特性，來控制終產(chǎn)物中LCF含量。SEC的另一個(gè)缺點(diǎn)是限制了用于上柱的綴合反應(yīng)混合物的體積(一般不超過5％的工藝柱床體積)。這嚴(yán)重地限制了在給定的生產(chǎn)空間中可以進(jìn)行的每批規(guī)模(因而限制了生產(chǎn)能力)。最后，所述SEC純化方法也導(dǎo)致所述綴合物溶液的顯著稀釋，這限制了制劑中能可靠地達(dá)到的蛋白質(zhì)濃度。
當(dāng)具有高疏水性的細(xì)胞毒性藥物(例如加利車霉素衍生物)用于綴合時(shí)，疏水作用層析法(HIC)是優(yōu)選的候選方法，能有效分離綴合和未綴合的抗體。比起SEC，HIC具有三個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)(1)具有有效降低LCF含量和聚集體的能力；(2)HIC的上柱量大得多；和(3)HIC避免了產(chǎn)物的過度稀釋。
許多的高容量HIC介質(zhì)適于生產(chǎn)規(guī)模應(yīng)用，例如丁基、苯基和辛基瓊脂糖凝膠4FF(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)可在綴合工藝后能夠從單體綴合組分中有效地分離出未綴合組分和綴合物聚集體。
VI.組合物和制劑本發(fā)明也提供用于制備治療或診斷組合物/制劑的方法，所述方法包括將本發(fā)明的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物與藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體混合在一起。
所述單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物可以是所述治療或診斷組合物/制劑中唯一的活性組分，或者可以與其它活性組分(包括其它抗體組分或非抗體組分)一起使用，所述其它抗體組分例如抗CD19抗體、抗CD20抗體、抗CD33抗體、抗T細(xì)胞抗體、抗IFNγ抗體或抗LPS抗體；所述非抗體組分例如細(xì)胞因子、生長因子、激素、抗激素、細(xì)胞毒性藥物和黃嘌呤。
可用于治療增生性疾病(例如癌癥)并且可以與本發(fā)明的細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物聯(lián)合使用的細(xì)胞因子和生長因子包括干擾素、白介素例如白介素2(IL-2)、TNF、CSF、GM-CSF和G-CSF。
通常用于治療增生性疾病(例如癌癥)并且可與本發(fā)明細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物聯(lián)合使用的激素包括雌激素，例如己烯雌酚和雌二醇；雄激素，例如睪酮和氟甲睪酮制劑；孕酮，例如梅格施和普維拉；以及皮質(zhì)類固醇，例如潑尼松、地塞米松和氫化可的松。
抗激素例如抗雌激素(即他莫昔芬)、抗雄激素(即氟他胺)和抗腎上腺藥通常用于治療增生性疾病(例如癌癥)，并且可以與本發(fā)明細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物聯(lián)合使用。
通常用于治療增生性疾病(例如癌癥)并且可與本發(fā)明的細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物聯(lián)合使用的化療藥/抗腫瘤藥包括但不限于阿霉素、順鉑、卡鉑、長春堿、長春新堿、博來霉素、甲氨蝶呤、多柔比星、氟尿嘧啶、依托泊苷、泰素及其各種類似物以及絲裂霉素。
所述組合物最好包含治療有效量的本發(fā)明綴合物。本文所用的術(shù)語“治療有效量”是指治療、緩解或預(yù)防目標(biāo)疾病或病癥所需的治療藥的劑量，或者是表現(xiàn)出可檢測的治療或預(yù)防效果所需的治療藥的劑量。對(duì)于任何綴合物，可以在開始的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中或在動(dòng)物模型中評(píng)價(jià)所述治療有效量，所述動(dòng)物模型通常是嚙齒動(dòng)物、兔、狗、豬或靈長類。所述動(dòng)物模型也可用于確定合適濃度范圍和給藥途徑。所述信息可以用來確定給予人體的有用劑量和途徑。
給予人類患者的精確有效劑量將取決于所述患者的疾病狀態(tài)的嚴(yán)重程度、一般健康狀況、年齡、體重和性別、飲食、給藥時(shí)間和頻率、藥物組合、對(duì)治療的反應(yīng)敏感性和耐受性/反應(yīng)。該劑量可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定，并且由臨床醫(yī)生進(jìn)行判斷。一般來說，有效劑量為0.1mg/m2-50mg/m2、優(yōu)選0.4mg/m2-30mg/m2、更優(yōu)選2mg/m2-9mg/m2，所述劑量是以蛋白質(zhì)性載體為基礎(chǔ)來計(jì)算。
可以將組合物單獨(dú)給予患者，或者可以與其它試劑、藥物或激素聯(lián)合給藥。本發(fā)明的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/抗體綴合物的給藥劑量取決于待治療病癥的性質(zhì)、惡性淋巴瘤或白血病的程度，并取決于將所述綴合物是用于預(yù)防還是用于治療已有的病癥。
給藥頻率取決于所述綴合物的半壽期及其效果的持續(xù)時(shí)間。如果所述綴合物的半壽期短(例如2-10小時(shí))，每天必須給予1次或多次?；蛘撸绻鼍Y合物分子的半壽期長(例如2-15天)，可只須每天給藥一次、每周一次、甚至每1個(gè)月或2個(gè)月一次。
組合物也可含有藥學(xué)上可接受的載體，用于所述抗體綴合物的給藥。所述載體自身不應(yīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)接受所述組合物的個(gè)體有害的抗體，也不應(yīng)有毒。合適的載體可以是大的、緩慢代謝的大分子例如蛋白、多肽、脂質(zhì)體、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和失活的病毒粒子。
可以使用藥學(xué)上可接受的鹽，例如無機(jī)酸的鹽或有機(jī)酸的鹽，所述無機(jī)酸的鹽例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽和硫酸鹽；所述有機(jī)酸的鹽例如乙酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽和苯甲酸鹽。
在這些組合物中的藥學(xué)上可接受的載體可額外地包括液體，例如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，在所述組合物中可以存在輔料，例如潤濕劑或乳化劑或pH緩沖物質(zhì)。所述載體使所述組合物能夠配制成片劑、丸劑、糖錠劑、膠囊劑、液體制劑、凝膠劑、糖漿劑、膏劑或混懸劑，用于讓患者攝入。
優(yōu)選的給藥形式包括適于胃腸外給藥的形式，例如通過注射或輸注，例如通過快速濃注或連續(xù)輸注。當(dāng)產(chǎn)物用于注射或輸注時(shí)，可以采用混懸劑、溶液劑或溶于油或水性溶媒的乳劑形式，而且可以含有配方劑，例如懸浮劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。
雖然緩沖的綴合溶液的穩(wěn)定性對(duì)短時(shí)穩(wěn)定性是足夠的，但是長期穩(wěn)定性差。為了增強(qiáng)所述綴合物的穩(wěn)定性并增加其存放期，所述抗體-藥物綴合物可以凍干成為干形式，臨用前用合適的無菌液體重建。蛋白質(zhì)溶液凍干的相關(guān)問題已有文獻(xiàn)充分描述。在冷凍和干燥工藝中可發(fā)生二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)的損失。因此，可以采用作為所述綴合物的非晶形穩(wěn)定劑的防凍劑，在凍干工藝中保持所述蛋白的結(jié)構(gòu)完整性。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的防凍劑是糖醇，例如糖醇、甘露醇、山梨醇、肌醇、聚乙二醇和它們的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述防凍劑是糖酸，包括醛糖酸、糖醛酸、醛糖二酸和它們的組合。
本發(fā)明的防凍劑也可以是糖類。合適的糖是含有兩個(gè)或多個(gè)羥基的醛化合物或酮化合物。所述糖可以是環(huán)狀或線狀，包括例如醛糖、酮糖、氨基糖、糖醇、肌醇、醛糖酸、糖醛酸或醛糖二酸或它們的組合。所述糖也可以是單糖、二糖或多糖，例如二糖或多糖。合適的糖包括例如甘油醛、阿拉伯糖、來蘇糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、塔羅糖、庚糖、葡萄糖、果糖、葡糖酸、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α-吡喃葡糖苷、麥芽糖、異抗壞血酸、抗壞血酸、內(nèi)酯、山梨糖、葡糖二酸、赤蘚糖、蘇糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、赤蘚酮糖、核糖、木酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、葡糖醛酸、葡糖酸、葡糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、蔗糖、海藻糖或神經(jīng)氨酸或它們的衍生物。合適的多糖包括例如阿聚糖、果聚糖、巖藻聚糖、半乳聚糖、聚半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖(例如菊糖等)、果聚糖、巖藻依聚糖、卡拉膠、半乳卡羅聚糖、果膠、果膠酸、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原、支鏈淀粉、纖維素、葡聚糖、石臍素、殼多糖、瓊脂糖、角蛋白、軟骨素、皮膚素、透明質(zhì)酸、海藻酸、黃原酸膠或淀粉。其中尤其有用的糖是蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖以及它們的組合。蔗糖是特別有用的防凍劑。
本發(fā)明的防凍劑最好是糖或可以作為多羥基醇的糖醇。多羥基化合物是含有不止一個(gè)羥基的化合物。所述多羥基化合物最好是線狀的。合適的多羥基化合物包括例如二元醇(例如乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇)、丙三醇或季戊四醇；或它們的組合。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述防凍劑是蔗糖、海藻糖、甘露醇或山梨醇。
一旦配制好，本發(fā)明的組合物可以直接給予患者。待治療的所述患者可以是動(dòng)物。然而，最好所述組合物適合給予人類患者。
本發(fā)明的組合物可以通過任何常規(guī)途徑給藥，所述常規(guī)途徑包括但不限于口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、透皮、經(jīng)皮(參見PCT公布號(hào)WO 98/20734)、皮下、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、腸內(nèi)、局部、舌下、陰道內(nèi)或直腸途徑。也可采用無針注射器(Hyposprays)給予本發(fā)明的組合物。所述組合物通?？梢灾苽涑勺⑸溆萌芤簞┗蚧鞈覄?。也可在注射前，制備適于溶于液體溶媒的溶液劑或混懸劑的固體形式。
所述組合物的直接給藥通常是通過皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射來完成，或者通過向組織的胞間隙給藥來完成。也可以將所述組合物給予病灶部位中。給藥治療可以是單給藥時(shí)間表或多給藥時(shí)間表。
人們知道，所述組合物中的活性組分是細(xì)胞毒性藥物/蛋白質(zhì)性載體綴合物。因此，它對(duì)胃腸道中的降解將會(huì)是敏感的。因此，如果所述組合物是采用胃腸道途徑給藥的話，需要讓所述組合物含有保護(hù)所述綴合物免遭降解、但當(dāng)它從胃腸道吸收后又能釋放所述綴合物的試劑。
對(duì)藥學(xué)上可接受的載體的充分討論可見于Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company，N.J.1991)。
本發(fā)明尤其提供了單體加利車霉素衍生物/人源化抗CD22抗體(G5/44)即CMC-544，用于治療以細(xì)胞在其表面表達(dá)CD22抗原為特征的增生性疾病。
本發(fā)明還提供CMC-544在制備用于治療以細(xì)胞表達(dá)CD22為特征的增生性疾病的組合物或藥物中的用途。
CMC-544也可用于任何療法，其中最好是降低存在于用本文公開的所述組合物或藥物治療的患者中表達(dá)CD22的細(xì)胞水平。具體地說，所述組合物或藥物用于治療增生性疾病(即淋巴瘤和白血病)的人類患者或動(dòng)物患者，所述淋巴瘤和白血病在其細(xì)胞表面表達(dá)CD22抗原。這些表達(dá)CD22的細(xì)胞可以在體內(nèi)循環(huán)，或者以不需要的大量數(shù)目定位于體內(nèi)特定部位。
CMC-544也優(yōu)選用于治療B淋巴細(xì)胞譜系惡性腫瘤包括淋巴瘤和白血病，最優(yōu)選非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、多發(fā)性骨髓瘤、急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)和慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)。CMC-544可單獨(dú)使用或與其它生物活性劑聯(lián)用，以治療B細(xì)胞惡性腫瘤患者。
常用的生物活性劑包括生長因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性藥物。常用于治療增生性疾病(例如癌癥)并且可與CMC-544聯(lián)合使用的細(xì)胞毒性藥物包括蒽環(huán)霉素，例如多柔比星、柔紅霉素、伊達(dá)比星、阿柔比星、佐柔比星、米托蒽醌、表柔比星、卡柔比星、諾拉霉素、美諾立爾、pitarubicin和戊柔比星，至多3天；以及嘧啶核苷或嘌呤核苷，例如阿糖胞苷、吉西他濱、曲氟尿苷、安西他濱、依諾他濱、阿扎胞苷、去氧氟尿苷、噴司他丁、溴尿苷、卡培他濱、克拉曲濱、地西他濱、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、谷氏菌素、嘌羅霉素、替加氟、噻唑呋林?？膳cCMC-544聯(lián)用的其它化療藥/抗腫瘤藥包括阿霉素、順鉑、卡鉑、環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪、長春堿、長春新堿、米托蒽醌、博來霉素、氮芥、潑尼松、丙卡巴肼、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、依托泊苷、泰素及其各種類似物以及絲裂霉素。CMC-544可以同時(shí)與一種或多種這樣的治療藥一起給藥?；蛘?，CMC-544可以與一種或多種這樣的治療藥序貫給藥。
CMC-544也可單獨(dú)給藥，或者與作為治療方案組成部分的其它生物活性劑和化療藥同時(shí)或序貫給藥，所述其它生物活性劑例如生長因子、細(xì)胞因子、類固醇、抗體例如抗CD20抗體、利妥昔單抗(RituxanTM)。用于治療惡性淋巴增生性疾病的確定治療方案包括CHOPP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼)、CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松)、COP(環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松)、CAP-BOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博來霉素、長春新堿和潑尼松)、m-BACOD(甲氨蝶呤、博來霉素、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、地塞米松和亞葉酸)、ProMACE-MOPP(潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼)、ProMACE-CytaBOM(潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、阿糖胞苷、博來霉素和長春新堿)、MACOP-B(甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、固定劑量潑尼松、博來霉素和亞葉酸)、MOPP(氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼)、ABVD(阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪)、MOPP與ABV(阿霉素/多柔比星、博來霉素和長春堿)交替使用以及MOPP(氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼)與ABVD(阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪)交替使用以及ChIVPP(苯丁酸氮芥、長春堿、丙卡巴肼和潑尼松)。治療可包含誘導(dǎo)治療期、鞏固治療期和維持治療期。CMC-544也可單獨(dú)給藥，或者與作為誘導(dǎo)治療期、鞏固治療期和維持治療期組成部分的任何上述治療方案同時(shí)或序貫給藥。
本發(fā)明的綴合物也可與作為組合化療方案組成部分的其它生物活性劑和化療藥同時(shí)給藥，用于治療復(fù)發(fā)性侵襲性淋巴瘤。所述治療方案包括IMVP-16(異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)、MIME(米托胍腙、異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)、DHAP(地塞米松、高劑量阿糖胞苷和順鉑)、ESHAP(依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷和順鉑)、EPOCH(依托泊苷、長春新堿和多柔比星給予96小時(shí)，同時(shí)給予快速濃注環(huán)磷酰胺和口服潑尼松)、CEPP(B)(環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素)、CAMP(洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和潑尼松)、CVP-1(環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松)、CHOP-B.(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和博來霉素)、CEPP-B(環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼和博來霉素)和P/DOCE(表柔比星或多柔比星、長春新堿、環(huán)磷酰胺和潑尼松)。用于侵襲性淋巴瘤的其它治療方案可包括在1期首先用CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松)-利妥昔單抗(RituxanTM)-CMC-544治療，接著在2期和3期用CHOP-利妥昔單抗(RituxanTM)CHOP-CMC-544或CHOP-利妥昔單抗(RituxanTM)-CMC-544治療?；蛘?，1期首先用COP(環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松)-利妥昔單抗(RituxanTM)-CMC-544，接著在2期和3期用COP-利妥昔單抗(RituxanTM)、COP-CMC-544或COP-利妥昔單抗(RituxanTM)-CMC-544治療。在另一個(gè)實(shí)施方案中，侵襲性淋巴瘤的治療可以包括在1期首先或第二用所述抗體藥物綴合物CMC-544治療，接著在2期和3期用以下治療方案CMC-544和CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松)、CMC-544和COP(環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松)、CMC-544和利妥昔單抗(RiruxanTM)或單用利妥昔單抗(RituxanTM)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，侵襲性淋巴瘤的治療可以包括首先或一線用抗體藥物綴合物CMC-544治療，接著在2期和3期單獨(dú)用CMC-544或與其它治療方案聯(lián)用，所述其它治療方案包括但不限于ESHOP(依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷、長春新堿和順鉑)、EPOCH(依托泊苷、長春新堿和多柔比星給予96小時(shí)，同時(shí)給予快速濃注環(huán)磷酰胺和口服潑尼松)、IMVP-16(異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)、ASHAP(多柔比星、甲強(qiáng)龍制劑、Ara-C和順鉑)、MIME(米托胍腙、異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷)和ICE(異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺和依托泊苷)。該應(yīng)用中提供的用于化學(xué)治療惡性腫瘤的各種細(xì)胞毒性藥物的細(xì)節(jié)(包括聯(lián)合化療方案、劑量等)可參見Cancer Principles and Practiceof Oncology，Vincent T，DeVita，Samuelo Hellman，Steven A.Rosenberg編著，第6版，Lippincott，Williams and Wilkins出版(2001)和Physician’s Cancer Chemotherapy Drug Manual，Edward Chu和VincentT.DeVita編著，Jones and Bartlett出版(2002)。
本發(fā)明也提供治療患有以細(xì)胞表達(dá)CD22為特征的增生性疾病或有罹患該病風(fēng)險(xiǎn)的人類患者或動(dòng)物患者的方法，所述方法包括給予所述患者有效量的本發(fā)明CMC-544。
在以下具體工作實(shí)施例中進(jìn)一步描述了本發(fā)明，所述實(shí)施例是為了進(jìn)一步描述本發(fā)明的目的，而不是限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1候選抗體的產(chǎn)生一系列的抗CD22抗體是采用以下的選擇標(biāo)準(zhǔn)從雜交瘤中選出的與Daudi細(xì)胞結(jié)合，在Daudi細(xì)胞上內(nèi)化，與外周血單核細(xì)胞(PBMC)結(jié)合，在PBMC上內(nèi)化，親和力(大于10-9M)，小鼠γ1和產(chǎn)率。5/44是作為優(yōu)選的抗體而被選出的。
I.嵌合5/44抗體分子的基因克隆和表達(dá)a)5/44雜交瘤細(xì)胞的制備及其RNA制備雜交瘤5/44是用人CD22蛋白免疫小鼠后通過常規(guī)雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的。RNA是采用RNEasy試劑盒(Qiagen，Crawley，UK；目錄號(hào)74106)從5/44雜交瘤細(xì)胞制備的。如下所述，將所獲得的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
b)CD22在NHL腫瘤上的分布使用5/44抗CD22單克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究，來檢查染色的發(fā)生率和分布。在該項(xiàng)研究中包括對(duì)照抗CD20抗體和抗CD79a抗體，以確定腫瘤的B細(xì)胞區(qū)。
共研究了50個(gè)腫瘤，并且采用Working Formulation和REAL分類系統(tǒng)將這些腫瘤如下分類·7個(gè)B成淋巴細(xì)胞性白血病/淋巴瘤(高/I)·4個(gè)B-CLL/小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤(低/A)·3個(gè)淋巴漿細(xì)胞樣瘤(lymphoplasmacytoid)/免疫細(xì)胞瘤(低/A)
·1個(gè)外套細(xì)胞淋巴瘤(中/F)·14個(gè)濾泡性中心細(xì)胞淋巴瘤(低至中/D)·13個(gè)彌散性大細(xì)胞淋巴瘤(中至高/G，H)·6個(gè)不能分類的淋巴瘤(K)·2個(gè)T細(xì)胞淋巴瘤用0.1μg/ml的5/44抗體，有40個(gè)B細(xì)胞淋巴瘤對(duì)CD22抗原呈陽性，并且當(dāng)將濃度提高至0.5μg/ml時(shí)，又有6個(gè)呈陽性。對(duì)于剩下的2個(gè)B細(xì)胞瘤來說，在0.1μg/ml時(shí)呈陰性，剩余的組織不足以用較高濃度測試。然而，用另一種稱為6/13的抗CD22抗體(Celltech，Slough，UK)進(jìn)行的平行試驗(yàn)給出比5/44更強(qiáng)的染色，結(jié)果所有48個(gè)B細(xì)胞淋巴瘤對(duì)CD22的染色呈陽性。
因此，可以推斷CD22抗原在B細(xì)胞淋巴瘤上廣泛表達(dá)并因此為NHL的免疫療法提供了一個(gè)合適的靶。
c)5/44VH和VL的PCR克隆使用逆轉(zhuǎn)錄酶合成編碼5/44重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的cDNA序列，產(chǎn)生存在于總RNA中的mRNA的單鏈cDNA拷貝。然后采用特定的寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，使用cDNA為模板用于擴(kuò)增鼠V區(qū)序列。
i)cDNA合成在含有以下試劑的20μl反應(yīng)體積中合成cDNA50mM Tris-HCl(pH 8.3)，75mM KCl，10mM二硫蘇糖醇，3mM MgCl2，dATP、dTTP、dCTP和dGTP各0.5mM，20單位RNAsin，75ng隨機(jī)六核苷酸引物，2μg 5/44 RNA和200單位莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶。42℃保溫60分鐘后，通過95℃加熱5分鐘終止該反應(yīng)。
ii)PCR使用對(duì)重鏈和輕鏈具有特異性的引物組合，將cDNA的等分樣品進(jìn)行PCR。將設(shè)計(jì)成與信號(hào)肽的保守序列一起退火的簡并引物庫用作正向引物。所有這些序列都依次含有一個(gè)自其5’端7個(gè)核苷酸開始的限制位點(diǎn)(VLSfuI；VHHindIII)、使所獲得的mRNA最佳翻譯的序列GCCGCCACC(SEQ ID NO50)、一個(gè)起始密碼子和基于已知小鼠抗體的前導(dǎo)肽序列的20-30個(gè)核苷酸(Kabat等，Sequence ofproteins of immunological interest，第5版，1991，U.S.Department ofHealth and Human Services，Public Health Service，National Institutes ofHealth(美國健康與人類服務(wù)部，公共健康服務(wù)，國家健康協(xié)會(huì)))。
將3’引物設(shè)計(jì)成跨越該抗體的構(gòu)架4 J-C接點(diǎn)并含有酶BsiWI的限制位點(diǎn)，以使VLPCR片段的克隆容易進(jìn)行。重鏈3’引物為設(shè)計(jì)成跨越該抗體J-C接點(diǎn)的混合物。該3’引物包括ApaI限制位點(diǎn)，以使克隆容易進(jìn)行。該引物的3’區(qū)含有基于在已知的小鼠抗體中發(fā)現(xiàn)的那些序列的混合序列(Kabat等，1991，參見上文)上述引物組合能使VH和VL的PCR產(chǎn)物直接克隆到合適的表達(dá)載體中(參見下文)，從而制備嵌合(小鼠-人)重鏈和輕鏈，并用于這些在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的基因制備所需同種型的嵌合抗體。
按以下方法進(jìn)行用于PCR的保溫(100μl)。每份反應(yīng)物含有10mMTris-HCl(pH 8.3)，1.5mM MgCl2，50mM KCl，0.01％ w/v明膠，dATP、dTTP、dCTP和dGTP各0.25mM，10pmole 5’引物混合物，10pmole 3’引物，1μl cDNA和1單位Taq聚合酶。將反應(yīng)物在95℃保溫5分鐘然后經(jīng)過以下循環(huán)94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃1分鐘。30個(gè)循環(huán)后，通過瓊脂糖凝膠電泳分析每份反應(yīng)物的等分樣品。
對(duì)于重鏈V區(qū)來講，擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物只有當(dāng)在構(gòu)架I的起始位點(diǎn)內(nèi)退火的引物庫取代信號(hào)肽引物庫時(shí)才能獲得。將片段克隆到DNA測序載體中。測定DNA序列并翻譯以給出推導(dǎo)出的氨基酸序列。該推導(dǎo)出的序列可通過參照通過實(shí)驗(yàn)確定的N端蛋白質(zhì)序列來證實(shí)。圖1顯示小鼠單克隆抗體5/44的CDR的氨基酸序列。圖2和圖3分別表示小鼠單克隆抗體5/44的成熟輕鏈V區(qū)和重鏈V區(qū)的DNA/蛋白質(zhì)序列。
iii)PCR片段的分子克隆然后將鼠V區(qū)序列克隆到表達(dá)載體pMRR10.1和pMRR14(圖7和圖8)中。這些是用于分別含有編碼人κ輕鏈和人γ-4重鏈恒定區(qū)的DNA的輕鏈和重鏈表達(dá)的載體。使用SfuI和BsiWI限制位點(diǎn)，通過限制性消化并與測序載體連接，將所述VL區(qū)亞克隆到表達(dá)載體中，產(chǎn)生質(zhì)粒pMRR10(544cL)(圖8)。使用5’引物通過PCR擴(kuò)增重鏈DNA引入信號(hào)肽，由于這在所述克隆策略一使用來自不同的近交(in-house)雜交瘤(稱為162)的小鼠重鏈抗體前導(dǎo)序列并沒有獲得。該5’引物具有以下的序列5’GCGCGCAAGCTTGCCGCCACCATGGACTTCGGATTCTCTCTCGTGTTCCTGGCACTCATTCTCAAGGGAGTGCAGTGTGAGGTGCAGCTCGTCGAGTCTGG3’(SEQ ID NO51)。
反向引物與用于最初的VH基因克隆的引物相同。將所得PCR產(chǎn)物用酶HindIII和ApaI消化，然后將其亞克隆，并確證其DNA序列，產(chǎn)生質(zhì)粒pMRR14(544cH)(圖7)。將這兩種表達(dá)載體瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中，產(chǎn)生嵌合c5/44抗體。按照生產(chǎn)商的方案(InVitrogenLife Technology，Groningen，The Netherlands.目錄號(hào)11668-027)，使用Lipofectamine試劑，完成這一步。
II.糖基化位點(diǎn)和活性賴氨酸的去除在CDR-H2中觀察到一個(gè)潛在的N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)序列，該序列具有氨基酸序列N-Y-T(圖3)。對(duì)5/44及其片段(包括Fab)進(jìn)行的SDS-PAGE、蛋白質(zhì)印跡法和凝膠糖染色法表明該位點(diǎn)的確糖基化(未顯示)。另外，在CDR-H2內(nèi)暴露的位置觀察到賴氨酸殘基，其通過提供與可以綴合抗體的試劑綴合的額外位點(diǎn)，有可能降低所述抗體的結(jié)合親和力。
一個(gè)PCR策略是用于在CDR-H2序列中引入氨基酸取代，以去除糖基化位點(diǎn)和/或活性賴氨酸，如圖4所示。使用編碼突變N55Q、T57A或T57V的正向引物來去除所述糖基化位點(diǎn)(圖4)，并產(chǎn)生含有取代K60R的第4個(gè)正向引物，以去除所述活性賴氨酸殘基(圖4)。在這些PCR擴(kuò)增的每一個(gè)中都使用構(gòu)架4反向引物。PCR產(chǎn)物用酶XbaI和ApaI消化并插入到pMRR14(544cH)(也用XbaI和ApaI切割)中，產(chǎn)生編碼這些突變體的表達(dá)質(zhì)粒。N55Q、T57A和T57V突變通過遠(yuǎn)離共有序列N-X-T/S處改變氨基酸序列可去除所述糖基化位點(diǎn)，同時(shí)K60R突變導(dǎo)致潛在的活性賴氨酸被帶同樣正電荷的殘基精氨酸取代。將所得cH變異質(zhì)粒與cL質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染，產(chǎn)生已表達(dá)嵌合抗體變異體。
III.嵌合基因活性的評(píng)價(jià)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞并通過BiaCore分析測定親和力常數(shù)后，對(duì)所得嵌合基因的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
采用BIA技術(shù)，對(duì)嵌合5/44或其變異體與CD22-mFc構(gòu)建體結(jié)合的親和力進(jìn)行研究，其中所述嵌合5/44或其變異體的糖基化位點(diǎn)或活性賴氨酸已被去除。結(jié)果示于圖9。所有結(jié)合測定都在BIAcoreTM2000儀器(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，瑞典)中進(jìn)行。通過固定化抗小鼠Fc捕獲CD22mFc，進(jìn)行該項(xiàng)測定。該抗體存在于可溶相中。將樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照(50μl)注射到固定化抗小鼠Fc上，然后注射到可溶相中的抗體上。每個(gè)循環(huán)之后，所述表面用50μl的40mM HCl以30μl/min再生。運(yùn)用BIAevaluation 3.1軟件(Pharmacia)，進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析。
與嵌合5/44相比，構(gòu)建體T57A中糖基化位點(diǎn)的去除導(dǎo)致締合速率(on-rate)稍微加快而解離速率(off-rate)顯著減慢，得到的親和力改進(jìn)約為5倍。N55Q突變對(duì)親和力沒有影響。該結(jié)果是意想不到的，因?yàn)檫@表明糖本身的去除對(duì)結(jié)合沒有明顯的影響(如同N55Q改變一樣)。僅在T57A改中中觀察到改進(jìn)的親和力。一種可能的解釋是，無論是否存在糖，位置57的蘇氨酸對(duì)結(jié)合都產(chǎn)生負(fù)面影響，所述結(jié)合在蘇氨酸轉(zhuǎn)變成丙氨酸時(shí)去除。丙氨酸較小是重要的并且蘇氨酸的負(fù)面影響與其大小有關(guān)的假設(shè)，可以從使用T57V突變得到的結(jié)果得到支持57位被纈氨酸取代并不好(結(jié)果未顯示)。
通過K60R突變?nèi)コ嚢彼釟埢鶎?duì)親和力無影響，即引入精氨酸殘基消除了潛在的活性位點(diǎn)而不影響親和力。
因此，用于去除糖基化位點(diǎn)和用于去除活性賴氨酸的突變均包括在人源化設(shè)計(jì)中。
實(shí)施例25/44的CDR移植上面已經(jīng)描述了5/44抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因的分子克隆及其制備嵌合(小鼠/人)5/44抗體的用途。小鼠5/44 VL區(qū)和VH區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列分別示于圖2和圖3(SEQ ID NO7和SEQ ID NO8)。按照Adair等(PCT申請?zhí)朩O 91/09967)的方法，本實(shí)施例描述了將5/44抗體CDR移植到人構(gòu)架上，以降低人體內(nèi)的可能免疫原性。
I.5/44輕鏈的CDR移植蛋白質(zhì)序列與來自人亞型Iκ輕鏈V區(qū)的共有序列比對(duì)表明有64％序列同一性。因此，為構(gòu)建CDR移植輕鏈，所選的受體構(gòu)架區(qū)對(duì)應(yīng)于人VK亞型I種系O12，DPK9序列的那些序列。構(gòu)架4受體序列來源于人J區(qū)種系序列JK1。
鼠5/44構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列與受體序列的比較在圖5給出，并顯示在供體鏈和受體鏈之間有27處不同。在每個(gè)位置，對(duì)鼠源殘基通過對(duì)堆積(packing)或在VH/VL界面產(chǎn)生影響而直接或間接對(duì)抗原結(jié)合產(chǎn)生貢獻(xiàn)的可能性進(jìn)行分析。如果認(rèn)為一個(gè)鼠源殘基重要并且與人源殘基在大小、極性或電荷方面明顯不同，那么就該保留鼠源殘基?；诖朔治觯瑯?gòu)建了兩種具有SEQ ID NO19和SEQ ID NO20(圖5)給出的序列的CDR移植輕鏈。
II.5/44重鏈的CDR移植采用與用于輕鏈描述的方案相同的策略，完成5/44重鏈的CDR移植。發(fā)現(xiàn)5/44重鏈的V區(qū)與屬于亞型I的人重鏈同源(70％序列同一性)，因此用人亞型I種系構(gòu)架VH1-3，DP7的序列作為受體構(gòu)架。構(gòu)架4受體序列來源于人J區(qū)種系序列JH4。
5/44重鏈與構(gòu)架區(qū)的比較示于圖6，其中可以發(fā)現(xiàn)5/44重鏈與受體序列在位置22不同。分析這些序列中的任何序列可能對(duì)抗原結(jié)合的貢獻(xiàn)，從而構(gòu)建了5種具有以下給定序列的CDR移植重鏈SEQID NO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26和SEQ IDNO27(圖6)。
III.用于移植序列的基因的構(gòu)建將基因設(shè)計(jì)成編碼移植序列g(shù)H1和gL1，并設(shè)計(jì)和構(gòu)建系列重疊寡核苷酸(圖10)。采用PCR裝配技術(shù)來構(gòu)建CDR移植V區(qū)基因。配制100μl含有以下組分的反應(yīng)體積10mM Tris-HCl(pH8.3)，1.5mMMgCl2，50mM KCl，0.001％明膠，dATP、dTTP、dCTP和dGTP各0.25mM，“內(nèi)部”引物(T1、T2、T3、B1、B2、B3)各1pmole，“外部”引物(F1、R1)各10pmole和1單位Taq聚合酶(AmpliTaq，AppliedBioSystems，目錄號(hào)N808-0171)。PCR循環(huán)參數(shù)為94℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃1分鐘，30個(gè)循環(huán)。然后將反應(yīng)產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，切下電泳條帶，使用QIAGEN離心柱(QIAquick凝膠提取試劑盒，目錄號(hào)28706)進(jìn)行回收。用30μl體積洗脫DNA。然后按照生產(chǎn)商的說明，將gH1和gL1 DNA的等分樣品(1μl)克隆到InVitrogen TOPO TA克隆載體pCR2.1 TOPO(目錄號(hào)K4500-01)中。該非表達(dá)載體用作克隆中間體，以便于對(duì)大量克隆進(jìn)行測序。使用載體特異性引物，通過DNA測序來鑒定含有g(shù)H1和gL1的正確克隆，產(chǎn)生質(zhì)粒pCR2.1(544gH1)和pCR2.1(544gL1)(圖11和圖12)。
使用寡核苷酸盒置換法來產(chǎn)生人源化移植物gH4、gH5、gH6和gH7以及gL2。圖13表示寡核苷酸盒的設(shè)計(jì)。為構(gòu)建每種變異體，用所示的限制性酶(對(duì)于重鏈而言為XmaI/SacII，對(duì)于輕鏈而言為XmaI/BstEII)切下載體(pCR2.1(544gH1)或pCR2.1(544gL1))。將大載體片段用瓊脂糖凝膠電泳純化并用于與寡核苷酸盒連接。這些盒由2種互補(bǔ)寡核苷酸(如圖13所示)組成，在200μl體積(12.5mM Tris-HCl(pH 7.5)、2.5mM MgCl2、25mM NaCl、0.25mM二硫赤蘚糖醇)中以0.5pmole/μl的濃度混合。通過在水浴(500ml體積)中加熱至95℃達(dá)3分鐘，然后讓反應(yīng)物慢慢冷卻至室溫，完成退火。將已退火的寡核苷酸盒用水稀釋10倍，然后將其連接到合適的切割載體中。用DNA測序來證實(shí)正確的序列，產(chǎn)生質(zhì)粒pCR2.1(5/44-gH4-7)和pCR2.1(5/44-gL2)。然后將這些經(jīng)證實(shí)的移植序列亞克隆到表達(dá)載體pMRR14(重鏈)和pMR10.1(輕鏈)中。
IV.CDR移植序列的CD22結(jié)合活性在各種組合中，將編碼移植變異體的載體與原始嵌合抗體鏈一起共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中。在競爭測定中，比較原始小鼠5/44抗體的結(jié)合對(duì)與Ramos細(xì)胞(得自ATCC，一種表達(dá)表面CD22的伯基特淋巴瘤成淋巴細(xì)胞性人細(xì)胞系)結(jié)合的競爭的結(jié)合活性。該測定被認(rèn)為是比較移植物與細(xì)胞表面CD22結(jié)合的能力的最佳方法。結(jié)果示于圖14和圖15。正如所見到的，在任何移植物之間存在非常小的差異，在競爭抗鼠親代方面所有都表現(xiàn)出比嵌合體更有效。在CDR-H3(gH5和gH7)末端引入3個(gè)額外的人源殘基并不會(huì)明顯影響結(jié)合。
選擇與最少數(shù)量的鼠源殘基結(jié)合的移植物即gL1gH7。輕鏈移植物gL1有6個(gè)供體殘基。殘基V2、V4、L37和Q45是潛在的重要堆積殘基。殘基H38位于VH/VL界面。殘基D60為靠近CDR-L2的表面殘基并且可直接對(duì)抗原結(jié)合作出貢獻(xiàn)。這些殘基中，V2、L37、Q45和D60存在于來自其它亞型的人κ基因的種系序列。重鏈移植物gH7有4個(gè)供體構(gòu)架殘基(根據(jù)CDR移植中使用的結(jié)構(gòu)定義(參見Adair等(1991)(PCT申請?zhí)朩O 91/09967)，殘基R28被認(rèn)為是CDR-H1的一部分)。殘基E1和A71為靠近CDR的表面殘基。殘基I48為潛在的堆積殘基。殘基T93存在于VH/VL界面。這些殘基中，E1和A71存在于人亞型I的其它種系基因中。殘基I48存在于人種系亞型4中，而T73存在于人種系亞型3中。
輕鏈和重鏈兩者的全部DNA序列和蛋白質(zhì)序列，包括由載體提供的恒定區(qū)基因內(nèi)的內(nèi)含子的大致位置，如圖16所示，并分別在SEQID NO29和SEQ ID NO28中給出(對(duì)于輕鏈)以及分別在SEQ IDNO31和SEQ ID NO30中給出(對(duì)于重鏈)。
從這些載體中切下編碼這些輕鏈和重鏈基因的DNA。重鏈DNA在5’HindIII位點(diǎn)消化，然后用大腸桿菌DNA聚合酶I的克列諾片段處理，產(chǎn)生5’平端。在3’EcoRI位點(diǎn)切割，產(chǎn)生重鏈片段，然后通過瓊脂糖凝膠純化。以同樣的方式，產(chǎn)生輕鏈片段，在5’SfuI位點(diǎn)平端化并用3’EcoRI位點(diǎn)。將這兩個(gè)片段克隆到基于DHFR的表達(dá)載體中并用來在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞系。
實(shí)施例3NAc-γ加利車霉素DMH ACBUT與人源化抗CD22抗體(G5/44)的綴合在典型的綴合反應(yīng)中，將人源化抗CD22抗體(G5/44)綴合到NAc-γ加利車霉素DMH AcBut OSu(加利車霉素衍生物)(參見圖17)上，其中所述目標(biāo)蛋白質(zhì)濃度為7.5mg/ml，而所述目標(biāo)加利車霉素衍生物負(fù)荷為蛋白的8.5％(重量)。目標(biāo)反應(yīng)的pH是8.5±0.2，其它反應(yīng)組分的目標(biāo)濃度如下50mM N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-(4-丁磺酸)(HEPBS)、37.5mM癸酸鈉和9％v/v總乙醇。反應(yīng)在33℃±2℃進(jìn)行1小時(shí)。純化前該典型反應(yīng)的分析結(jié)果如下蛋白7.34mg/ml；加利車霉素負(fù)荷82.7μg/mg；聚集體93.25％；和未綴合蛋白(LCF)1.07％(HPLC的UV面積％)。
檢測了不同的表面活性添加劑及其濃度對(duì)產(chǎn)物收率和純度的影響，以確定它們對(duì)綴合單體生產(chǎn)的影響(參見表2)。除了添加劑及其濃度外，在所有條件都保持恒定下進(jìn)行反應(yīng)。分析這些反應(yīng)產(chǎn)生的所述綴合物的蛋白質(zhì)濃度、加利車霉素負(fù)荷、聚集體含量和LCF。雖然范圍從C6(己酸)至C12(十二烷酸)的所有正羧酸都得到可接受的結(jié)果，但是用濃度為30mM-50mM的癸酸得到最佳的總體結(jié)果(低LCF、低聚集體和單體綴合物的高收率)。
表2添加劑的種類和濃度對(duì)綴合結(jié)果的影響
實(shí)施例4層析純化方法I.層析分離方法雖然已鑒定丁基瓊脂糖凝膠4FF為最好的HIC介質(zhì)，但是使用其它樹脂例如辛基瓊脂糖凝膠FF、PPG-600C(Tosoh Biosep)、FractogelEMD Propyl(EM Processing)和Source 15ISO(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)、用略有變動(dòng)的層析條件，也可得到可接受的結(jié)果。
用于純化的原料是含有7.2mg/mL蛋白、加利車霉素衍生物負(fù)荷為83μg/mg、聚集體含量為10.1％(HPLC面積％)和LCF含量為5.6％(HPLC面積％)的綴合反應(yīng)混合物。
綴合反應(yīng)完成后，加入磷酸鉀溶液，將反應(yīng)混合物稀釋4倍，使最終磷酸鹽濃度為0.7M(pH 8.2)?；旌虾?，將該溶液通過0.45μm濾器過濾。將稀釋液加樣到丁基瓊脂糖凝膠4FF柱上。柱上負(fù)載的總蛋白量為29mg/ml床體積。用0.7M磷酸鉀洗滌后，用0.7M-4mM磷酸鉀(pH 8.2)分步梯度洗脫柱子。將分步梯度洗脫的流分合并用于進(jìn)一步處理，合并液由聚集體和LCF各小于1％(面積)的單體綴合物組成。將該合并液加樣到葡聚糖凝膠G-25(Amersham Biosciences)脫鹽柱上，用于與適合于制劑的緩沖液交換，所述緩沖液由20mMTris-Cl和100mM氯化鈉(pH 8.0)組成。純化并經(jīng)緩沖液交換的CMC-544制備物具有以下特征加利車霉素負(fù)荷81μg/mg；聚集體0.4％(HPLC面積％)；LCF0.8％(HPLC面積％)。
實(shí)施例5NAc-γ加利車霉素DMH ACBUT-G5/44免疫綴合物(CMC-544)的結(jié)合分析對(duì)用上述綴合方法產(chǎn)生的人源化抗CD22抗體(G5/44)與加利車霉素的免疫綴合物(CMC-544)進(jìn)行結(jié)合研究分析，以確定使用改進(jìn)工藝產(chǎn)生的所述綴合物是否具有任何對(duì)抗原結(jié)合的副作用。表3顯示所述綴合方法對(duì)所述抗原與抗體結(jié)合親和力沒有任何影響。用老綴合方法或新綴合方法制備的CMC-544免疫綴合物均以相似的親和力與靶抗原結(jié)合，所述親和力與未綴合的抗體G5/44沒有差異。
表3用CMA-676綴合方法和CMC-544綴合方法制備的CMC-544的結(jié)合親和力
用BIAcore 2000(BIAcore AB，Uppsala，Sweden)進(jìn)行生物傳感器分析。用標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)化學(xué)在蛋白密度約2000共振單位時(shí)，將CD22mFc共價(jià)固定在N-羥基琥珀酰亞胺活化的羧甲基葡聚糖包埋的生物傳感器芯片(CM5)上。CMC-544樣品或G5/44樣品在HBS緩沖液(10mMHEPES(pH 7.4)、含有150mM NaCl、3mM EDTA和0.005％聚山梨酯20(v/v))中稀釋，然后以1-100nM的濃度范圍、以30μl/分的流速、在3分鐘內(nèi)注射到CD22mFc包埋的生物傳感器芯片表面，進(jìn)行結(jié)合。結(jié)合后，用HBS緩沖液將所述芯片洗滌15分鐘，來監(jiān)測結(jié)合抗體的解離。用15μl再生緩沖液(10mM NaOH和200Mm NaCl)洗滌生物傳感器芯片達(dá)30秒，使抗原表面再生，然后在下一次循環(huán)之前穩(wěn)定2分鐘。采用1∶1朗繆爾結(jié)合曲線擬合模型和BIA評(píng)價(jià)程序(版本3.0，BIAcore)，用非線性最小二乘方回歸分析，來計(jì)算動(dòng)力學(xué)常數(shù)。通過表面胞質(zhì)基因共振分析，用共價(jià)固定在生物傳感器芯片上的CD22mFc評(píng)價(jià)抗原與CMC-544的結(jié)合。CMC-544和G5/44與CD22mFc結(jié)合的動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果顯示，當(dāng)所述數(shù)據(jù)在補(bǔ)償了質(zhì)量轉(zhuǎn)移后完全符合1∶1朗繆爾結(jié)合模式，CMC-544和未綴合的G544均以相近的親和力結(jié)合CD22(CMC-544:CD22 KD＝200pM；G5/44:CD22 KD＝235pM)。與加利車霉素的綴合不影響G5/44有效結(jié)合CD22mFc的能力。
用流式細(xì)胞儀也檢測了CMC-544和G5/44與在B淋巴瘤細(xì)胞表面表達(dá)的CD22的結(jié)合。在該評(píng)價(jià)中，將抗CD33 mAb吉姆單抗(hP67.6)及其加利車霉素綴合物CMA-676(吉姆單抗奧佐米星)用作同種型匹配的對(duì)照。利妥昔單抗(RituxanTM)，即一種嵌合人IgG1抗人CD20 mAb用作陽性對(duì)照。純化人多克隆IgG1和IgG4也可用作陰性對(duì)照。CMC-544和G5/44與Ramos或RL BCL上的CD22的結(jié)合是相似的，由人多克隆IgG4來區(qū)別。RL BCL顯示出比Ramos BCL低的CD22表面表達(dá)。相反，CMA-676或gL1gH7與兩種BCL的結(jié)合與人多克隆IgG4的結(jié)合相似，這與它們?nèi)狈D33表達(dá)是一致的(數(shù)據(jù)未顯示)。相同細(xì)胞證明了抗CD20利妥昔單抗(RituxanTM)的強(qiáng)結(jié)合。與hP67.6和CMA-676不同，CMC-544和G5/44都證明不與CD22-CD33+HL-60白血病細(xì)胞結(jié)合(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明，G5/44與加利車霉素的綴合不影響其抗原特異性。CMC-544特異性識(shí)別人B細(xì)胞上的CD22，但不能識(shí)別鼠、大鼠、犬、豬或靈長類(狒狒和獼猴)B細(xì)胞上的CD22(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例6CMC-544的體外和體內(nèi)效應(yīng)分析I.體外細(xì)胞毒性比較了用CMA-676和CMC-544工藝制備的CMC-544在體外對(duì)CD22+B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系、RL、Daudi、Raji和Ramos生長的影響。靶向人CD33(CMA-676)的同種型匹配的加利車霉素綴合物用于顯示所述綴合物的抗原非特異性效應(yīng)。在評(píng)價(jià)中使用未綴合的NAcγ加利車霉素DMH(所述藥物在酸水解時(shí)從所述綴合物中釋放)，顯示所用的每種所述細(xì)胞系都對(duì)加利車霉素的致死效應(yīng)敏感。表4顯示這些基于加利車霉素等同物評(píng)價(jià)的結(jié)果，而表5是以綴合的抗體蛋白的濃度的表達(dá)方式來顯示這些結(jié)果。CD22-介導(dǎo)的加利車霉素向CD22+細(xì)胞的傳遞，在殺死靶細(xì)胞的效率上是未綴合藥物本身的至少10倍。同種型匹配的對(duì)照綴合物(CMA-676)顯示細(xì)胞毒性小于或等于未綴合的加利車霉素衍生物。顯然，表4中用CMC-544綴合方法制備的綴合物可以以比用CMA-676綴合方法制備的綴合物較低抗體濃度，產(chǎn)生相等的細(xì)胞毒性效應(yīng)。
表4綴合的加利車霉素對(duì)生長的抑制(加利車霉素的IC50Pm)
*ND，未檢測表5綴合的抗體對(duì)生長的抑制(抗體的IC50μg/ml)
*ND，未檢測體內(nèi)細(xì)胞毒性。在B細(xì)胞淋巴瘤異種移植物中，進(jìn)一步評(píng)價(jià)了用CMC-544工藝制備的CMC-544。在這些研究中，使用了兩種B細(xì)胞淋巴瘤，即RAMOS和RL。RL淋巴瘤來源于非伯基特NHL的細(xì)胞系，而RAMOS最初來源于伯基特淋巴瘤。在圖18所示的示例性實(shí)驗(yàn)中，顯示了CMC-544及其鼠抗體對(duì)應(yīng)物以劑量依賴性方式對(duì)抑制RAMOS B細(xì)胞淋巴瘤的生長有效。
所述人源化抗體綴合物顯示出比其鼠對(duì)應(yīng)物更有效。在這項(xiàng)研究中，能引起對(duì)淋巴瘤生長的顯著抑制的加利車霉素綴合物最低劑量是10μg/kg綴合的NAc-γ加利車霉素DMH。相反，以與綴合物相似的時(shí)間表、10mg/Kg腹膜內(nèi)給予未綴合的抗體G5/44，對(duì)腫瘤生長無效。
用RL淋巴瘤模型進(jìn)行了同樣的研究。表6顯示對(duì)三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的綜合分析，在所述實(shí)驗(yàn)中評(píng)價(jià)了CMC-544在裸鼠中對(duì)大小為300-400mg的RL NHL腫瘤的抗腫瘤效應(yīng)。以劑量依賴性方式的CMC-544在3周期限內(nèi)引起腫瘤消退。從這些研究的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析中，確定了CMC-544在RL淋巴瘤模型中最小有效劑量為20μg/kg(基于加利車霉素含量)。這三次研究中都沒有死亡。CMC-544的更高劑量(60-320μg/kg)引起RL淋巴瘤幾乎完全消退。綜上所述，從兩個(gè)B細(xì)胞淋巴瘤模型中獲得的結(jié)果清楚地證明了CMC-544引起腫瘤消退的能力。
表6CMC-544對(duì)裸鼠體內(nèi)RL NHL異種移植物的抗腫瘤效應(yīng)
用RAMOS和RL淋巴瘤模型，也調(diào)查了所述新工藝制備的CMC-544抑制大的已建立的B細(xì)胞淋巴瘤異種移植物生長的能力。保持原來的第1天、第5天和第9天給藥時(shí)間表，將CMC-544或同種型匹配的陰性對(duì)照綴合物(CMA-676)以160μg/Kg綴合的加利車霉素的劑量經(jīng)腹膜內(nèi)給予后，讓腫瘤生長，直到腫瘤重量達(dá)1.5g或2g。所述同樣的給藥時(shí)間表較早顯示出引起小的已分期的腫瘤的長時(shí)間持續(xù)消退(參見表6)。如圖19所示，將CMC-544給予帶有大RAMOS淋巴瘤的小鼠引起先前存在的淋巴瘤體積的逐漸消退，到第20天時(shí)，3/4帶瘤小鼠已沒有腫瘤。對(duì)這些無瘤小鼠監(jiān)測到第50天，沒有發(fā)現(xiàn)已消退的RAMOS淋巴瘤的任何重新生長。相反，一個(gè)同種型匹配的對(duì)照CMA-676對(duì)腫瘤生長沒有影響。5只用CMA-676治療的帶有大腫瘤的小鼠中有4只在第15天前處死，因?yàn)樗鼈兊哪[瘤負(fù)荷已達(dá)到接近其體重的15％。
在RL淋巴瘤模型中，使用CMC-544進(jìn)行了相似的實(shí)驗(yàn)。以與上述相似的時(shí)間表、以160μg/kg的劑量腹膜內(nèi)給予CMC-544，在30天內(nèi)引起超過90％的先前存在的RL淋巴瘤塊的消退。然而到第45天，該組有2只帶有已縮小的淋巴瘤的小鼠顯示出腫瘤重新生長。這些結(jié)果表明CMC-544能引起小的以及大的已建立的淋巴瘤的消退。在少數(shù)研究中(本文未顯示)，在原先CMC-544誘導(dǎo)的消退以后，少數(shù)重新生長的RL淋巴瘤用CMC-544再次治療。這些研究顯示RL腫瘤對(duì)CMC-544的第二次治療仍有反應(yīng)，重新消退。因此，用CMC-544的治療對(duì)小的和大的B細(xì)胞淋巴瘤塊有效，并具有重復(fù)治療的潛力。
H.用CMA-676綴合方法和CMC-544綴合方法制備的綴合物的體內(nèi)比較圖20顯示代表性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中帶有分期的RL淋巴瘤的小鼠按照標(biāo)準(zhǔn)給藥時(shí)間表接受用CMA-676綴合方法和CMC-544綴合方法制備的兩個(gè)不同劑量(80μg/kg和320μg/kg CMC-544綴合的加利車霉素)的CMC-544。正如預(yù)期的一樣，觀察到的抗腫瘤效應(yīng)是劑量依賴性的，兩種CMC-544制備物在功效上沒有差異。相反，未綴合的N-乙酰-γ加利車霉素DMH經(jīng)腹膜內(nèi)給予160μg/kg卻是無活性的。然而，應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，對(duì)于每種劑量的綴合的加利車霉素，用CMA-676工藝制備的CMC-544比起用CMC-544工藝制備的以綴合物形式給予的抗體蛋白的量要高4倍。因?yàn)榘邢蚓Y合物中加利車霉素含量是引起抗腫瘤效應(yīng)的根本原因，可通過采用新方法、使用小得多的靶向抗體的量制備所述綴合物，來傳遞所需量的加利車霉素。用CMC-544工藝制備的增加負(fù)荷的所述綴合物是有效的，是因?yàn)槿狈︼@著量的低綴合部分(LCF)。
III.利妥昔單抗(RituxanTM)抗腫瘤的治療有待探索的另一個(gè)問題是，在市售的抗CD20利妥昔單抗(RituxanTM)治療終止后，B細(xì)胞淋巴瘤的生長是否還會(huì)對(duì)CMC-544治療有反應(yīng)。為了這一目標(biāo)，用利妥昔單抗(RituxanTM)治療發(fā)展中(未分期的)RL淋巴瘤達(dá)3周。只要在利妥昔單抗(RituxanTM)治療持續(xù)期間，RL淋巴瘤的生長就受到抑制。當(dāng)利妥昔單抗(RituxanTM)治療一停止，RL淋巴瘤就快速生長到約1g的大小，這時(shí)用CMC-544以腹膜內(nèi)給予160μg/Kg的劑量進(jìn)行治療。正如圖21和圖22所示，這些RL淋巴瘤仍然對(duì)CMC-544有反應(yīng)，其中80％的小鼠到60天成為無瘤小鼠。因此，用3個(gè)劑量的CMC-544能引起B(yǎng)細(xì)胞淋巴瘤的消退，而所述淋巴瘤本來只能被連續(xù)給予利妥昔單抗(RituxanTM)來抑制。
實(shí)施例8CMC-544的體外和體外效應(yīng)I.結(jié)合和毒性研究評(píng)價(jià)了CMC-544與CD22結(jié)合以及它在體外和體內(nèi)模型中的活性。也比較了CMC-544與CMA-676即一種hP67.6(IgG4)與AcBut連接的加利車霉素的同種型匹配對(duì)照綴合物以及利妥昔單抗(RituxanTM)，即一種嵌合IgG1抗CD20 mAb(IDEC Pharmceuticals，SanDiego，CA.)，后者是市售的，購自Medworld Pharmacy(Chestnut Ridge，NY)。以下抗體用于G5/44結(jié)合結(jié)構(gòu)域的研究BU12(Celltech，Slough，UK)；BLCAM、HD239(Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA)；RFB-4(Ancell Corp，Bayport，MN)；SHCL-1、Leu 14(Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)；4KB 128和To 15(Dako Corp，Carpinteria，CA)；M6/13和M5/44(Celltech，Slough，UK)。用于阻斷研究的其它抗體是SJ10(Immunotech，F(xiàn)ullerton，CA)和M17.1.1、M19.1.1、M38.1.1(Celltech，Slough，UK)。用于研究的細(xì)胞系包括伯基特淋巴瘤細(xì)胞系Ramos(CRL-1923)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)細(xì)胞系RL(CRL-2261)，都來自American Type Culture Collection。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)支原體檢測實(shí)驗(yàn)(ATCC，Manassas，VA)，來檢查所述細(xì)胞系沒有支原體。所述細(xì)胞系在加有以下成分的RPMI培養(yǎng)基中保持懸浮培養(yǎng)10％FBS、10mM HEPES、1mM丙酮酸鈉、0.2％葡萄糖、100U/ml青霉素G鈉和100μg/ml硫酸鏈霉素。
通過BIAcore分析、使用Fc-CD22固定化BIAcore CM5芯片，評(píng)價(jià)G5/44是否能抑制已知對(duì)CD22具有特異性的鼠mAb的結(jié)合。比較在有或沒有用G5/44預(yù)先飽和固定化Fc-CD22所獲得的表面胞質(zhì)基因共振單位(RU)。用BIACORE 2000進(jìn)行生物分子相互作用的分析?？贵w通過空白對(duì)照表面(流動(dòng)吸收池1，作為對(duì)照，沒有偶聯(lián)蛋白)，F(xiàn)c-CD22的檢測表面(流動(dòng)吸收池2)通過胺偶聯(lián)化學(xué)固定在CM5傳感器芯片上，達(dá)到9,042 RU水平。獲得的傳感器值(sensorgram)為流動(dòng)吸收池2的響應(yīng)值(RU)減去流動(dòng)吸收池1的響應(yīng)值(RU)。在引入針對(duì)CD22的鼠mAb(先前已表征它們的結(jié)合)之前，通過用G5/44(100μg/ml)飽和流動(dòng)吸收池得到第二傳感器值。在測定出G5/44的響應(yīng)值后，立即將鼠抗CD22 mAb單獨(dú)灌注，而不去除G544。也記錄了由于鼠抗CD22 mAb與G5/44包埋的CD22的結(jié)合而產(chǎn)生的第二次組合響應(yīng)值。如果所述鼠抗體結(jié)合CD22的位點(diǎn)與G5/44占據(jù)的位點(diǎn)無關(guān)，那么組合響應(yīng)值將增加。如果G5/44與CD22的結(jié)合干擾或阻止了第二抗體的結(jié)合，那么組合響應(yīng)值將不會(huì)增加。每個(gè)第二次組合測量值都用G5/44:CD22相互作用的“解離(off-rate)”而校正。
G5/44只阻斷那些結(jié)合CD22表位A/Ig樣結(jié)構(gòu)域1(SHCL1 Leu 14和HD239)的抗體的結(jié)合，表明G5/44也結(jié)合在該CD22結(jié)構(gòu)域中。與CD22表位B/Ig樣結(jié)構(gòu)域3(RFB-4)、CD22表位C/Ig樣結(jié)構(gòu)域4(To15)和CD22 Ig樣結(jié)構(gòu)域2(4KB128)結(jié)合的抗體不被G5/44阻斷。這些結(jié)果表明，G5/44在CD22上的結(jié)合位點(diǎn)位于第一個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域中，因?yàn)樗柚沽四切┳R(shí)別第一個(gè)CD22的Ig樣結(jié)構(gòu)域(表位A)的抗CD22 mAb的結(jié)合。未知其亞型特異性的另一個(gè)抗CD22抗體即M6/13(Celltech，Slough，UK)也被G5/44(Celltech，Slough，UK)阻斷，因而繪制出M6/13與CD22的表位A/Ig樣結(jié)構(gòu)域1的結(jié)合位點(diǎn)的圖譜。所述抗體M5/44是具有與G5/44相同特異性的G5/44的鼠親代，抑制G5/44的結(jié)合，作為陽性對(duì)照。在這些評(píng)價(jià)中，抗CD19抗體BU12作為陰性對(duì)照。結(jié)果概述于表7。
表7具有確定特異性的鼠抗CD22 M/AB與用G544預(yù)處理的FC-CD22的結(jié)合。用表面胞質(zhì)基因共振單位(RU)表示結(jié)合反應(yīng)
采用對(duì)CD22各個(gè)結(jié)構(gòu)域具有已知結(jié)合特異性的鼠mAb，研究了G5/44阻斷這些抗體結(jié)合B細(xì)胞的能力。另外，也研究了所述mAb阻斷G5/44結(jié)合B細(xì)胞的能力。在這些研究中，1×105Ramos細(xì)胞首先在4℃暴露給鼠抗CD22抗體(10μg/ml人源化G5/44或小鼠單克隆抗CD22)達(dá)1小時(shí)，然后將所述細(xì)胞暴露給G5/44(10μg/ml)。細(xì)胞在4℃再保溫1小時(shí)。當(dāng)用所述抗體處理后，B細(xì)胞聚集成團(tuán)，用PBS-1％ BSA洗滌，然后在4℃加入100μl的1∶100稀釋度的溶于PBS-1％ BSA的合適的第二抗體(或者FITC-山羊抗人(重鏈和輕鏈)或FITC-山羊抗小鼠(重鏈和輕鏈))達(dá)30分鐘。細(xì)胞再次聚集成團(tuán)，洗滌，重懸于PBS-1％ BSA中，然后加入到盛有250μl PBS-1％甲醛的試管中。用BD FAC Sort流式細(xì)胞儀測定與細(xì)胞相關(guān)的熒光強(qiáng)度。
結(jié)果顯示，先將G5/44暴露給CD22+B細(xì)胞，導(dǎo)致隨后抗CD22mAb M5/44和M6/13的結(jié)合受到顯著抑制。相反，抗CD22 mAbRFB4、To15、HD239和4KB與B細(xì)胞的結(jié)合不被G5/44抑制。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，G5/44不導(dǎo)致對(duì)HD239與B細(xì)胞結(jié)合的顯著抑制，是意料之外的，尤其是當(dāng)BIAcore分析表明G5/44能阻斷HD239結(jié)合CD22時(shí)?？梢愿鶕?jù)它們與CD22相對(duì)親和力的差異，來解釋G5/44沒有強(qiáng)烈抑制HD239的結(jié)合。當(dāng)檢驗(yàn)以上鼠抗CD22 mAb抑制G5/44結(jié)合CD22+B細(xì)胞的能力時(shí)，SHCL1和M6/13、而不是其它抗CD22mAb抑制G5/44的結(jié)合。HD239和SHCL1與CD22的第一Ig樣結(jié)構(gòu)域的結(jié)合表位已經(jīng)繪制成圖。然而，M6/13或M5/44識(shí)別的表位沒有繪制成圖。以上阻斷研究細(xì)節(jié)表明，以上抗體識(shí)別位于CD22第一Ig樣結(jié)構(gòu)域上的表位，該表位通稱為表位A。
將兩萬個(gè)Ramos細(xì)胞在有或沒有利妥昔單抗(RituxanTM)存在下，與不同劑量的CMC-544一起溫育96小時(shí)。96小時(shí)后，通過流式細(xì)胞儀分析碘化丙錠排阻，測定細(xì)胞活力。計(jì)算3-6孔的平均活力，計(jì)算不同處理中細(xì)胞活力抑制的劑量反應(yīng)。用零濃度的CMC-544計(jì)算細(xì)胞活力抑制的背景反應(yīng)。用邏輯回歸，在0.01-3ng加利車霉素DMH/ml的劑量范圍內(nèi)，檢測CMC-544是否引起對(duì)Ramos細(xì)胞生長的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的劑量依賴性抑制。也用邏輯回歸確定CMC-544與利妥昔單抗(RituxanTM)的相互作用是否是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的。還計(jì)算了半數(shù)抑制濃度(IC50)，記錄了相對(duì)于單獨(dú)用CMC-544處理的每次處理的有效性。用SAS版本8.2的PROBIT程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
研究結(jié)果顯示，CMC-544在0.01-3ng加利車霉素DMH/ml的劑量范圍內(nèi)引起對(duì)Ramos細(xì)胞生長的劑量依賴性抑制。單用CMC-544的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.029ng/ml。將濃度為2μg/ml、20μg/ml和200μg/ml的利妥昔單抗(RituxanTM)加入到用CMC-544處理過的細(xì)胞中，確定利妥昔單抗(RituxanTM)與CMC-544細(xì)胞毒性活性的相互作用是否是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的。加入20μg/ml和200μg/ml的利妥昔單抗(RituxanTM)而不加CMC-544，對(duì)細(xì)胞生長沒有顯著影響(溶媒生長分別為111.7％和94.0％)。當(dāng)與CMC-544聯(lián)用時(shí)，所有這三個(gè)濃度的(RituxanTM)在CMC-544劑量反應(yīng)曲線的斜率和截距上產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.05)左移。與2μg/ml和200μg/ml利妥昔單抗聯(lián)用，在劑量反應(yīng)曲線中產(chǎn)生最大改變。這兩條曲線彼此沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與20μg/ml劑量聯(lián)用相比有顯著性差異(p＜0.05)。第二項(xiàng)研究(結(jié)果未報(bào)道)證實(shí)了在第一項(xiàng)研究中觀察到的結(jié)果。2μg/ml、20μg/ml和200μg/ml利妥昔單抗(RituxanTM)加CMC-544的聯(lián)用的半數(shù)抑制濃度分別為0.0072ng/ml、0.0081ng/ml和0.0072ng/ml。CMC-544加利妥昔單抗(RituxanTM)的半數(shù)抑制濃度比單用CMC-544的IC50效果高約4倍。
II在SCID小鼠中的體內(nèi)抗腫瘤活性皮下異種移植和全身彌散性B細(xì)胞淋巴瘤給予雌性、無胸腺裸小鼠(18-22g)全身輻射(400rads)。輻射進(jìn)一步抑制小鼠的免疫系統(tǒng)，增加了對(duì)腫瘤的接受。輻射3天后，小鼠在右側(cè)背部經(jīng)皮下注射溶于Matrigel的107RL細(xì)胞(CollaborativeBiomedical Products，Belford，MA，在RPMI培養(yǎng)基中1∶1稀釋)。當(dāng)腫瘤達(dá)到合適大小時(shí)(0.3g，一般在21天后)，按0.2ml/只小鼠腹膜內(nèi)給予溶于無菌鹽水的CMC-544、利妥昔單抗(RituxanTM)或CHOP療法(參見下文)。給藥的頭一天被認(rèn)為是第1天。在第5天和第9天給予兩個(gè)額外劑量(治療＝q4D×3)。CHOP療法由以下藥物組成環(huán)磷酰胺(C)，(CytoxanTM，Bristol-Meyers Squibb Co.，Princeton，NJ)40mg/kg腹膜內(nèi)；鹽酸多柔比星(H)，(Sigma-Aldrich，Co.，St Louis，MO)3.3mg/kg腹膜內(nèi)；長春新堿(O)，(GensiaSicor Pharmaceuticals，Irvine，CA)0.5mg/kg腹膜內(nèi)；以及潑尼松(P)(Roxane Labs.，Columbia，OH)0.2mg/kg口服。按照與CMC-544和利妥昔單抗(RituxanTM)相同的給藥時(shí)間表(q4D×3)，給予CHO，而潑尼松是每兩天口服給藥一次，共5個(gè)劑量(q2D×5)。至少每周測量一次腫瘤，計(jì)算腫瘤質(zhì)量(g)＝0.5(腫瘤寬度/2)(腫瘤長度)。計(jì)算組平均值SEM，并采用多重T-檢驗(yàn)與溶媒治療組比較統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。記錄組平均50天，或直到小鼠死亡(所述死亡破壞了組平均值)或直到所述腫瘤生長太大(＞3.5g)而不得不對(duì)該小鼠處以安樂死。之后，報(bào)告所有治療組中每個(gè)小鼠的腫瘤大小。也記錄在每次研究結(jié)束時(shí)每個(gè)治療組中無瘤小鼠的數(shù)目。
為了確定CMC-544單用或與其它生物活性劑聯(lián)用對(duì)彌散性淋巴瘤的效果，使用了SCID小鼠模型。通過鼠尾靜脈給雄性SCID小鼠(CB17 SCID)(20-25g)注射106Ramos細(xì)胞(0.2ml)。在細(xì)胞注射后或者3天或者9天，腹膜內(nèi)給予所述小鼠溶媒、綴合物(CMC-544或CMC-676)或利妥昔單抗(RituxanTM)，總共3個(gè)劑量。對(duì)于3天治療時(shí)間表，小鼠在第3天、第7天和第11天給藥。對(duì)于9天治療時(shí)間表，小鼠在第9天、第13天和第17天給藥。在9天治療時(shí)間表中，也如下所述給予CMC-544和利妥昔單抗(RituxanTM)的組合。每天監(jiān)測小鼠，看是否有后肢癱瘓，如有則處死它們。每個(gè)治療組使用7-10只小鼠。計(jì)算組平均存活時(shí)間(±SD)、存活時(shí)間的中位值、最小值和最大值。通過非參數(shù)顯著性在0.05水平的對(duì)數(shù)-秩檢驗(yàn)(Log-rank test)，確定各組間存活分布差異。用Kaplan-Meier方法建立存活曲線。
開始的研究檢查了兩個(gè)不同給藥時(shí)間表對(duì)帶有彌散性淋巴瘤的SCID小鼠的效應(yīng)。第一項(xiàng)研究檢查在靜脈內(nèi)注射腫瘤細(xì)胞后第3天(發(fā)展中模型)開始給藥，而第二項(xiàng)研究是在腫瘤細(xì)胞注射后延遲到第9天(已建立的模型)才給藥。在每項(xiàng)研究中，腹膜內(nèi)給予3個(gè)劑量的CMC-544(160μg/kg)、CMA-676(160μg/kg)或利妥昔單抗(RituxanTM)(20mg/kg)，分別給予4天(Q4D×3)。在發(fā)展中模型中，溶媒處理的小鼠平均存活時(shí)間是27天(圖23，表8)。CMA-676即CMC-544的同種型匹配對(duì)照沒有顯著延長存活時(shí)間(p＞0.05)。CMC-544顯著延長存活時(shí)間至41天，而利妥昔單抗具有深遠(yuǎn)效應(yīng)，延長存活時(shí)間至125天以上(顯著大于CMC-544，p＜0.05)。延遲給藥直到腫瘤細(xì)胞有機(jī)會(huì)傳播(歸巢(homing))并沉積在靶細(xì)胞(已建立的模型)上，這改變了CMC-544和利妥昔單抗(RituxanTM)的結(jié)果。再次使用CMA-676對(duì)存活時(shí)間沒有顯著影響(圖24，表8)。利妥昔單抗(RituxanTM)增加了平均存活時(shí)間至62.6天，而CMC-544增加平均存活時(shí)間至83.5天。在所述已建立的模型中，CMC-544和利妥昔單抗(RituxanTM)間沒有顯著性差異。
表8存活時(shí)間的描述性測定
進(jìn)行了初步研究，以確定利妥昔單抗(RituxanTM)對(duì)CMC-544的存活反應(yīng)是否有效應(yīng)，無論是正效應(yīng)還是負(fù)效應(yīng)。在有或沒有利妥昔單抗(RituxanTM)(20mg/kg，標(biāo)記為高劑量藥物聯(lián)用(HD))存在下，給予CMC-544(160μg/kg)。另外，較低劑量CMC-544(80μg/kg)與較低劑量的利妥昔單抗(RituxanTM)(10mg/kg)聯(lián)合給藥。因?yàn)樵撗芯恐行∈罅坑邢蓿詻]有分別以80μg/kg或10mg/kg的劑量單獨(dú)給予所述化合物。將CMC-544(80μg/kg)與利妥昔單抗(RituxanTM)(10mg/kg)聯(lián)用標(biāo)記為中等劑量聯(lián)用(MD)，并用于確定藥物低劑量聯(lián)用對(duì)SCID小鼠存活的可行性。單獨(dú)給予CMC-544(160μg/kg)和利妥昔單抗(RituxanTM)(20mg/kg)，結(jié)果如在以上已建立的模型中報(bào)告所述。每次延長平均存活時(shí)間分別至58.5天和50.5天(圖25，表9)。在聯(lián)用中，高劑量聯(lián)用的平均存活時(shí)間稍有(雖然在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著，p＞0.05)增加至64.4天。80μg/kg CMC-544和10mg/kg利妥昔單抗(RituxanTM)的中等劑量聯(lián)用，顯著增加了(p＜0.05與溶媒處理相比)存活時(shí)間平均至92.4天。這些結(jié)果表明，CMC-544和利妥昔單抗(RituxanTM)的低劑量聯(lián)用是有保證的。
表9最初聯(lián)用研究的存活時(shí)間的描述性檢測
CMC MD＝CMC544中等劑量，80μg/kgCMC HD＝CMC-544高劑量，160μg/kgRitux MD＝利妥昔單抗中等劑量，10mg/kgRitux HD＝利妥昔單抗高劑量，20mg/kg用CMC-544和利妥昔單抗(RituxanTM)進(jìn)行了進(jìn)一步聯(lián)合用藥研究。進(jìn)行了下列治療組的治療濃度為40μg/kg、80μg/kg和160μg/kg的CMC-544；濃度為5mg/kg、10mg/kg和20mg/kg的利妥昔單抗(RituxanTM)；以及40μg/kg CMC-544加5mg/kg利妥昔單抗(RituxanTM)、80μg/kg的CMC-544加10mg/kg利妥昔單抗(RituxanTM)以及160μg/kg的CMC-544加20mg/kg利妥昔單抗(RituxanTM)。所有劑量的利妥昔單抗(RituxanTM)都稍微延長了平均存活時(shí)間至33-40天的范圍，(與溶媒治療組平均存活時(shí)間25.8相比，所有劑量p＜0.05，圖26，表10)。高劑量(160μg/kg)的CMC-544延長了平均存活時(shí)間至85天，與早期兩項(xiàng)研究報(bào)告的結(jié)果一致。CMC-544與利妥昔單抗(RituxanTM)的聯(lián)用對(duì)存活時(shí)間沒有顯著改善(圖27，表10)。與高劑量CMC-544相比，兩個(gè)低劑量的CMC-544(80μg/kg和40μg/kg)各自都顯著改進(jìn)了(p＜0.05)平均存活時(shí)間。對(duì)于40μg/kg和80μg/kg劑量的CMC-544，90％和80％的小鼠仍然分別存活了125天。兩個(gè)藥物聯(lián)用組中100％的小鼠存活至125天。低劑量的CMC-544比高劑量(160μg/kg)更有效。
在所實(shí)驗(yàn)的劑量(參見上文)內(nèi)，利妥昔單抗(RituxanTM)與CMC-544聯(lián)用，對(duì)CMC-544在SCID小鼠中彌散性B細(xì)胞模型的活性沒有明顯效應(yīng)。在Balb/c裸鼠中，采用皮下RL B淋巴瘤異種移植模型，也評(píng)價(jià)了CMC-544與利妥昔單抗(RituxanTM)聯(lián)用是否增強(qiáng)或抑制了抗腫瘤活性。在皮下B淋巴瘤模型中，選擇平均腫瘤重量為300mg的腫瘤，然后在研究中，腹膜內(nèi)給予兩次治療。在有或沒有利妥昔單抗(RituxanTM)(20mg/kg Q4D×3)存在下，使用20μg/kg或80μg/kg(Q4D×3)的CMC-544。與利妥昔單抗(RituxanTM)的聯(lián)用既不顯著增強(qiáng)也不顯著抑制(p＞0.05)CMC-544的療效(圖28)。在該研究中，單獨(dú)給予利妥昔單抗(RituxanTM)，抑制RL B淋巴瘤生長(與溶媒治療相比，在第20天對(duì)腫瘤生長有57％的抑制，p＜0.05)，與用低劑量CMC-544所觀察的結(jié)果類似。
聯(lián)合化療方案CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松)最常見用于治療非霍奇金淋巴瘤患者。在已建立的RL B淋巴瘤異種移植物中，比較了CHOP與CMC-544的抗腫瘤效應(yīng)。CHOP方案中單個(gè)組分均以它們各自在裸鼠中估計(jì)的最大耐受劑量(數(shù)據(jù)未報(bào)告)來使用，所述劑量如下環(huán)磷酰胺(C)40mg/kg腹膜內(nèi)、多柔比星(H)3.3mg/kg腹膜內(nèi)、長春新堿(O)0.5mg/kg腹膜內(nèi)和潑尼松(P)0.2mg/kg口服。CHO按Q4D×3給藥，P是口服給藥，Q2D×5。CMC-544以相當(dāng)于160μg/kg加利車霉素的劑量經(jīng)腹膜內(nèi)給藥，Q4D×3。CHOP治療一開始就引起對(duì)RL B淋巴瘤生長的顯著抑制(圖29)。然而，3周后，腫瘤以與溶媒治療組相同的生長率重新生長。相反，CMC-544的抗腫瘤效應(yīng)是完全的，持續(xù)整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期。這些結(jié)果表明，用顯著低于裸鼠中最大非致死劑量的劑量的CMC-544，比CHOP聯(lián)合療法更加有效。
這些研究顯示，利妥昔單抗(RituxanTM)加上CMC-544顯著增加了CMC-544在Ramos B淋巴瘤細(xì)胞中的細(xì)胞毒活性。最近，也報(bào)道了利妥昔單抗(RituxanTM)和糖皮質(zhì)激素在Ramos細(xì)胞中的協(xié)同相互作用。另外，利妥昔單抗(RituxanTM)與10μM地塞米松聯(lián)用時(shí)，觀察到在8個(gè)額外細(xì)胞系中的4個(gè)有協(xié)同生長抑制。
已報(bào)道單獨(dú)使用0.4-10μg/ml的利妥昔單抗(RituxanTM)，引起對(duì)Ramos細(xì)胞生長的顯著抑制，雖然抑制程度小(最大18％)。另外，當(dāng)它以10μg/ml濃度與8個(gè)B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系溫育(48小時(shí)溫育)時(shí)，在其中的6個(gè)細(xì)胞系中有活性。Ghetie等證明，10μg/ml利妥昔單抗(RituxanTM)與Ramos細(xì)胞一起溫育24小時(shí)后，增加了6.2％的凋亡(與溶媒治療細(xì)胞中的3.5％相比)。在當(dāng)前的研究中，劑量為20μg/ml和200μg/ml的利妥昔單抗(RituxanTM)在單獨(dú)使用時(shí)，對(duì)Ramos細(xì)胞生長沒有影響。在小鼠中，無論在彌散性模型或皮下異種移植模型中，CMC-544和利妥昔單抗(RituxanTM)之間都沒有任何相互作用的證據(jù)。藥物聯(lián)合實(shí)驗(yàn)沒有干擾彼此的效應(yīng)，也沒有增強(qiáng)它們。在彌散性模型中降低每種藥物劑量是否將改變觀察結(jié)果，還有待確定。
已由Flavell等描述了Ramos細(xì)胞的彌散性B細(xì)胞淋巴瘤模型。溶媒治療的小鼠的中位存活時(shí)間據(jù)報(bào)告是34-36天。小鼠逐漸產(chǎn)生后肢癱瘓，發(fā)展到垂死，不久后死亡。對(duì)其器官進(jìn)行組織學(xué)分析，揭示出最常見的受累器官是腎上腺、脾臟和蛛網(wǎng)膜下隙。蛛網(wǎng)膜下隙浸潤常延伸到大腦。當(dāng)將利妥昔單抗(RituxanTM)給予處于病程早期的彌散性SCID小鼠時(shí)，表現(xiàn)良好(圖23)，但當(dāng)在模型建立期的第9天給予時(shí)，表現(xiàn)較差(圖24)。利妥昔單抗(RituxanTM)，作為IgG1同種型，最有可能是通過小鼠宿主效應(yīng)機(jī)制起作用。這些機(jī)制包括補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和/或通過存在于SCID小鼠的自然殺傷細(xì)胞募集的抗體依賴性細(xì)胞毒性。注射的Ramos腫瘤細(xì)胞可能在早期、在所述細(xì)胞有機(jī)會(huì)浸潤到受累器官之前，對(duì)被利妥昔單抗(RituxanTM)激活的宿主免疫機(jī)制更敏感。在SCID小鼠的彌散性腫瘤模型中，尚未測試未綴合的G5/44抗體(CMC-544的靶向分子)，但當(dāng)將它給予皮下異種移植物時(shí)，沒有影響。預(yù)期G5/44作為IgG4同種型，不會(huì)激活宿主效應(yīng)機(jī)制，因此也不會(huì)產(chǎn)生抗腫瘤活性。
加利車霉素綴合的G5/44(CMC-544)與利妥昔單抗(RituxanTM)的作用相反，當(dāng)給予所述疾病的建立期時(shí)產(chǎn)生更好的結(jié)果。CMC-544在建立期中表現(xiàn)更好的原因尚不清楚，但是建立期更能代表臨床狀況。CMA-676作為同種型匹配的未結(jié)合的對(duì)照綴合物，對(duì)平均存活時(shí)間沒有顯著影響。在彌散性SCID模型中的結(jié)果清楚地表明，需要降低CMC-544的劑量，以確定最大有效劑量(MED)。160μg/kg劑量的活性比80μg/kg和40μg/kg的較低劑量更小。尚不清楚為什么是這樣，但是160μg/kg劑量可能超過MED。計(jì)劃進(jìn)一步研究該問題。
Mohammad等在彌散性大細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系DLCL的皮下異種移植物模型中，使用CHOP療法(環(huán)磷酰胺(C)40mg/kg IV、多柔比星(H)3.3mg/kg靜脈內(nèi)、長春新堿(O)0.5mg/kg靜脈內(nèi)和潑尼松(P)0.2mg/kg口服)。用于CHOP療法的劑量確定為它們的最大耐受劑量。CHO療法(靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)給藥，每天一次，共5天)被認(rèn)為是“有活性的”，產(chǎn)生T/C為25.8％。沒有記錄到腫瘤治愈。在所述模型中的結(jié)果由Mohammad等描述，看來與在本文所述RL模型中的CHOP療法(腹膜內(nèi)給藥，Q4D×3)中觀察的相似。在各項(xiàng)研究中，CHOP與CMC-544不同，都不導(dǎo)致長期治愈。
表10聯(lián)合用藥研究中存活時(shí)間的描述性測定
CMC LD＝CMC-544低劑量，40μg/kg Ritux LD＝利妥昔單抗低劑量，5mg/kgCMC MD＝CMC-544中等劑量，80pg/kgRitux MD＝利妥昔單抗中等劑量，10mg/kgCMC HD＝CMC-544高劑量，160μg/kgRitux HD＝利妥昔單抗高劑量，20mg/kg實(shí)施例9穩(wěn)定的CMC-544制劑通過添加稀釋劑、賦形劑、載體和穩(wěn)定劑制備用于體內(nèi)給藥的穩(wěn)定的CMC-544制劑。在HIC層析分析后，通過SEC-HPLC和多波長UV分析來分析層析部分。選取合適的流分合并，進(jìn)行上述分析，所述分析提供聚集體含量、蛋白質(zhì)濃度和加利車霉素負(fù)荷的信息。加入賦形劑、穩(wěn)定劑、填充劑和緩沖劑以穩(wěn)定所述溶液。因?yàn)镃MC-544可通過許多降解途徑而降解，在開發(fā)制劑時(shí)，需要考慮物理不穩(wěn)定性。在開發(fā)制劑時(shí)，一個(gè)主要的考慮是加利車霉素從所述抗體上水解的速率必須最小化，而又必須保持所述抗CD-22抗體的物理和化學(xué)完整性。另外，在某些pH和濃度條件下會(huì)發(fā)生加利車霉素-抗體綴合物的沉淀也需要達(dá)到最小化。
在開發(fā)單體加利車霉素衍生物-抗體綴合物制劑中，所述制劑的pH是關(guān)鍵，因?yàn)樗苁菇到夂臀锢聿环€(wěn)定性最小化。選擇pH為8.0，以使加利車霉素的水解最小化，并保持所述綴合物適當(dāng)?shù)娜芙庑?。用SDS-PAGE和抗原結(jié)合ELISA獲得的額外數(shù)據(jù)表明，在pH為8.0時(shí)能保持所述抗體顯著的結(jié)構(gòu)完整性和特異性。因此，選擇氨丁三醇為緩沖劑，以保持pH為8.0。一種替代的緩沖液可包括磷酸氫鈉或磷酸氫鉀。緩沖液濃度范圍可以是5-50mM。認(rèn)為優(yōu)選的pH范圍是7.5-8.5，使穩(wěn)定性/溶解性最佳化。終產(chǎn)物的通用pH規(guī)范為7.0-9.0。
雖然所述綴合物的緩沖液的穩(wěn)定性對(duì)短時(shí)間來說是足夠的，但是長期穩(wěn)定性差。凍干法用于延長所述綴合物的存放期。關(guān)于蛋白質(zhì)溶液凍干的問題已有大量文獻(xiàn)資料，在冷凍和干燥工藝中會(huì)發(fā)生二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)的損失。所述制劑中包含作為所述綴合物的非晶形穩(wěn)定劑的蔗糖，在冷凍和干燥工藝中，能保持所述抗體的結(jié)構(gòu)完整性。采用濃度為1.5-5.0％w/v蔗糖。另外，一種濃度為0.5-1.5％(重量)的聚合填充劑，例如葡聚糖40或羥乙基淀粉，可以摻入以增加凍干餅的外觀和物理硬度。這些材料以相當(dāng)?shù)偷臐舛葮?gòu)成了凍干餅，可用于使凍干制劑總固形物含量最小化，因而可以更快凍干。制劑研究采用濃度為0.9％(重量)的葡聚糖40。
制劑中包含聚山梨酯80，以提高所述綴合物的溶解性。采用優(yōu)選的濃度為0.01％，有用的范圍為0.005-0.05％。也向所述制劑中加入濃度為0.91-0.05％(體積)吐溫。
所述制劑中也可以含有電解質(zhì)，可用來改進(jìn)最終純化方法的效果。通常使用的氯化鈉濃度為0.01M-0.1M。額外的電解質(zhì)，例如硫酸鈉，也可用來替代氯化鈉，因?yàn)樗芨菀椎貎龈?。最好是，CMC-544終溶液中包含1.5％(重量)蔗糖、0.9％(重量)葡聚糖40、0.01％吐溫80、50mM氯化鈉、0.01％(重量)聚山梨酯80和20mM氨丁三醇。
所述溶液在凍干之前的代表性配方如下0.5mg/mL CMC-544、1.5％(重量)蔗糖、0.9％(重量)葡聚糖40、0.05M氯化鈉、0.01-0.05％(體積)吐溫、0.01％(重量)聚山梨酯80、0.02M氨丁三醇和水，pH 8.0。在+5℃至10℃(最好在+5℃)的溫度下，將所述溶液分裝到安瓿中；將所述溶液在-35℃至-50℃(最好在-45℃)的溫度下進(jìn)行冷凍；對(duì)冷凍的溶液在20-80微米汞柱(最好在60微米汞柱)的凍干壓力下進(jìn)行初始凍干步驟；將凍干產(chǎn)品在-10℃至-40℃(最好在-30℃)的擱板溫度下，保持24-72小時(shí)(最好60小時(shí))；最后在20-80微米汞柱(最好在60微米汞柱)的凍干壓力下、在+10℃至+35℃(最好在+25℃)的擱板溫度下，對(duì)凍干產(chǎn)品進(jìn)行二次凍干達(dá)15-30小時(shí)(最好達(dá)24小時(shí))。用升壓實(shí)驗(yàn)檢查初次干燥的終點(diǎn)。在凍干周期結(jié)束時(shí)，向安瓿內(nèi)充氮并封口。
表11說明了用CMC-544和CMC-676的制劑的差異。CMA-676制劑和CMC-544制劑之間的顯著性差異包括在新制劑中降低了蛋白質(zhì)濃度(0.5mg/mL)、使用了氨丁三醇作為緩沖劑以及存在0.01％吐溫80。這導(dǎo)致新制劑中的重建的CMC-544變得澄清，而重建的CMA-676制劑卻是渾濁的(參見表12和表13)。
表11CMA-676制劑和CMC-544制劑的比較
表12在5℃下，CMA-676制劑和CMC-544制劑的穩(wěn)定性和理化結(jié)果
表13凍干并儲(chǔ)存在25℃下的CMA-676制劑和CMC-544制劑的穩(wěn)定性和理化結(jié)果
以上引用的所有參考文獻(xiàn)和專利通過引用結(jié)合到本文中。本發(fā)明的各種修改和變化都包括在上述說明書中并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將會(huì)是顯而易見的。對(duì)所述綴合方法、對(duì)用所述方法制備的綴合物以及對(duì)包含所述綴合物的組合物/制劑的各種修改和變化都認(rèn)為是包括在所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
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<223>N55Q<220>
<221>
<400>10Gly Asn Gln Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys Gly1 510<210>11<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>T57A<220>
<221>
<400>11Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys Gly1 510
<210>12<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>T57V<220>
<221>
<400>12Gly Asn Asn Tyr Val Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys Gly1 510<210>13<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CDR-H2(T57)A H′<220>
<221>
<400>13Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Lys Arg Asn Leu Lys1 5 10 15Gly<210>14<211>13<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>K60R<220>
<221>
<400>14Gly Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Arg Arg Asn Leu Lys Gly1 5 10<210>15<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CDR-H2(K60R)R H″<220>
<221>
<400>15Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Thr Thr Tyr Arg Arg Asn Leu Lys1 5 10 15Gly<210>16<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>CDR-H2(T57A K60R)H
<220>
<221>
<400>16Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Asn Leu Lys1 5 10 15Gly<210>17<211>70<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<223>DPK9<220>
<221>
<400>17Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala20 2530Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly3540 45Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp5055 60Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys65 70
<210>18<211>11<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<223>JK1<220>
<221>
<400>18Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg1 510<210>19<211>113<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>gL1<220>
<221>
<400>19Asp Val Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 510 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Asn Ser20 25 30Tyr Gly Asn Thr Phe Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly Lys Ala3540 45Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 5560Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 707580Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly85 90 95Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110Arg<210>20<211>113<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>gL2<220>
<221>
<400>20Asp Val Val Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Asn Ser2025 30Tyr Gly Asn Thr Phe Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly Lys Ala3540 45Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile65 70 75 80Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly85 90 95Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105 110Arg<210>21<211>80<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<223>DP7<220>
<221>
<400>21Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Trp Val20 25 30Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Lys Phe Gln Gly35 40 45Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu50 55 60
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg65 70 75 80<210>22<211>11<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
<223>JH4<220>
<221>
<400>22Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser1 5 10<210>23<211>121<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>gH1<220>
<221>
<400>23Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 51015Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr202530
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile3540 45Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Gln Tyr Thr Thr Tyr Lys Arg Asn Leu5055 60Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr6570 7580Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly100 105110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>24<211>121<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>gH4<220>
<221>
<400>24Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 51015Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr20 2530Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Asn Leu50 55 60Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr65 707580Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys8590 95Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly100 105110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>25<211>121<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>gH5<220>
<221>
<400>25Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr2025 30Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile354045
Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Asn Leu5055 60Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr65 707580Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 9095Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>26<211>121<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>gH6<220>
<221>
<400>26Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 51015Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr202530Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile354045
Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Lys Phe5055 60Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr65 707580Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys859095Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>27<211>121<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>gH7<220>
<221>
<400>27Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala1 51015Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Asn Tyr202530Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile354045Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg Arg Lys Phe
5055 60Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr65 70 7580Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys8590 95Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly100 105110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115120<210>28<211>239<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>移植輕鏈的全序列<220>
<221>
<400>28Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Leu Leu Phe Trp Ile Pro1 5 1015Ala Ser Arg Gly Asp Val Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser20 25 30Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser35 40 45Leu Ala Asn Ser Tyr Gly Asn Thr Phe Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys50 55 60
Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe65 70 7580Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe8590 95Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr100 105110Cys Leu Gln Gly Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys115 120125Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro130 135 140Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu145 150 155 160Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp165 170 175Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp180 185 190Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys195 200 205Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln210 215 220Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 235<210>29<211>781<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>移植輕鏈的全序列<220>
<221>
<400>29ttcgaagccg ccaccatgaa gttgcctgtt aggctgttgg tgcttctgtt gttctggatt 60cctgcttccc ggggtgacgt tcaagtgacc cagagcccat ccagcctgag cgcatctgta 120ggagaccggg tcaccatcac ttgtagatcc agtcagagtc ttgcaaacag ttatgggaac 180acctttttgt cttggtatct gcacaaacca ggtaaagccc cacaattgct catctacgga 240atctctaaca gatttagtgg tgtaccagac aggttcagcg gttccggaag tggtactgat 300ttcaccctca cgatctcgtc tctccagcca gaagatttcg ccacttatta ctgtttacaa 360ggtacacatc agccgtacac attcggtcag ggtactaaag tagaaatcaa acgtacggta 420gcggccccat ctgtcttcat cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc 480tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg 540gataacgccc tccaatcggg taactcccag gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac 600agcacctaca gcctcagcag caccctgacg ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa 660gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac 720aggggagagt gttagaggga gaagtgcccc cacctgctcc tcagttccag cctgggaatt 780c 781<210>30<211>467<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>移植重鏈的全序列<220>
<221>
<400>30Met Asp Phe Gly Phe Ser Leu Val Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe35 4045Thr Asn Tyr Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg65 70 7580Arg Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser8590 95Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala115 120 125Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys130 135 140Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu145 150 155 160Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro165170 175Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr180 185 190Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val195 200205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn210 215 220Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser225 230 235 240Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly245 250 255Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met260 265 270Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln275 280 285Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val290 295 300His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr305 310 315 320Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly325 330 335Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile340 345 350Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val355 360 365Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser370 375 380Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro405 410 415Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val420 425 430Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met435 440 445His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser450 455 460Leu Gly Lys465<210>31<211>2160<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>移植重鏈的全部DNA序列<220>
<221>
<400>31aagcttgccg ccaccatgga cttcggattc tctctcgtgt tcctggcact cattctcaag 60ggagtgcagt gtgaggtgca attggtccag tcaggagcag aggttaagaa gcctggtgct 120tccgtcaaag tttcgtgtaa ggctagcggc tacaggttca caaattattg gattcattgg 180gtcaggcagg ctccgggaca aggcctggaa tggatcggtg gcattaatcc cgggaataac 240tacgctacat ataggagaaa attccagggc agagttacga tgaccgcgga cacctccaca 300agcactgtct acatggagct gtcatctctg agatccgagg acaccgcagt gtactattgt 360actagagaag gctacggtaa ttacggagcc tggttcgcct actggggcca gggtacccta 420gtcacagtct cctcagcttc tacaaagggc ccatccgtct tccccctggc gccctgctcc 480aggagcacct ccgagagcac agccgccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 540ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 600
gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 660ttgggcacga agacctacac ctgcaacgta gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 720aagagagttg gtgagaggcc agcacaggga gggagggtgt ctgctggaag ccaggctcag 780ccctcctgcc tggacgcacc ccggctgtgc agccccagcc cagggcagca aggcatgccc 840catctgtctc ctcacccgga ggcctctgac caccccactc atgcccaggg agagggtctt 900ctggattttt ccaccaggct ccgggcagcc acaggctgga tgcccctacc ccaggccctg 960cgcatacagg ggcaggtgct gcgctcagac ctgccaagag ccatatccgg gaggaccctg 1020cccctgacct aagcccaccc caaaggccaa actctccact ccctcagctc agacaccttc 1080tctcctccca gatctgagta actcccaatc ttctctctgc agagtccaaa tatggtcccc 1140catgcccacc atgcccaggt aagccaaccc aggcctcgcc ctccagctca aggcgggaca 1200ggtgccctag agtagcctgc atccagggac aggccccagc cgggtgctga cgcatccacc 1260tccatctctt cctcagcacc tgagttcctg gggggaccat cagtcttcct gttcccccca 1320aaacccaagg acactctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac 1380gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat 1440aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1500ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1560aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggtgg gacccacggg 1620gtgcgagggc cacatggaca gaggtcagct cggcccaccc tctgccctgg gagtgaccgc 1680tgtgccaacc tctgtcccta cagggcagcc ccgagagcca caggtgtaca ccctgccccc 1740atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta 1800ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac 1860cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaggc taaccgtgga 1920caagagcagg tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca 1980caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctctgggt aaatgagtgc cagggccggc 2040aagcccccgc tccccgggct ctcggggtcg cgcgaggatg cttggcacgt accccgtcta 2100catacttccc aggcacccag catggaaata aagcacccac cactgccctg gctcgaattc 2160<210>32<211>94<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>544gH1 T1<220>
<221>
<400>32agtgtgaggt gcaattggtc cagtcaggag cagaggttaa gaagcctggt gcttccgtca 60aagtttcgtg taaggctagc ggctacaggt tcac 94<210>33<211>96<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>544gH1 T2<220>
<221>
<400>33gtggcattaa tcccgggaat cagtacacta catataaaag aaatctaaag ggcagagcaa 60cgctgaccgc ggacacctcc acaagcactg tctaca 96<210>34<211>95<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>544gH1 T3<220>
<221>
<400>34agagaaggct acggtaatta cggagcctgg ttcgcctact ggggccaggg taccctagtc 60acagtctcct cagcttctac aaagggccca agaaa95<210>35<211>94
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>544 gH1 B1<220>
<221>
<400>35ggaccaattg cacctcacac tgcactccct tgagaatgag tgccaggaac acgagagaga 60atccgaagtc catggtggcg gcaagctttt attc 94<210>36<211>97<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>544gH1 B2<220>
<221>
<400>36gattcccggg attaatgcca ccgatccatt ccaggccttg tcccggagcc tgcctgaccc 60aatgaatcca ataatttgtg aacctgtagc cgctagc 97<210>37<211>93<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>544gH1B3<220>
<221>
<400>37cgtaattacc gtagccttct ctagtacaat agtacactgc ggtgtcctcg gatctcagag 60atgacagctc catgtagaca gtgcttgtgg agg 93<210>38<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>544gH1 F1<220>
<221>
<400>38gaataaaagc ttgccgccac c 21<210>39<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>544gH1 R1<220>
<221>
<400>39tttcttgggc cctttgtaga ag 22<210>40<211>87<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>544gL1 T1<220>
<221>
<400>40gcttcccggg gtgacgttca agtgacccag agcccatcca gcctgagcgc atctgtagga 60gaccgggtca ccatcacttg tagatcc 87<210>41<211>90<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>544gL1 T2<220>
<221>
<400>41tatctgcaca aaccaggtaa agccccacaa ttgctcatct acggaatctc taacagattt 60agtggtgtac cagacaggtt cagcggttcc 90<210>42<211>91<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>544gL1 T3<220>
<221>
<400>42agatttcgcc acttattact gtttacaagg tacacatcag ccgtacacat tcggtcaggg 60tactaaagta gaaatcaaac gtacggcgtg c91<210>43<211>88<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>544gL1 B1<220>
<221>
<400>43gaacgtcacc ccgggaagca ggaatccaga acaacagaag caccaacagc ctaacaggca 60acttcatggt ggcggcttcg aatcatcc88<210>44<211>88<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>544gL1 B2<220>
<221>
<400>44ctttacctgg tttgtgcaga taccaagaca aaaaggtgtt cccataactg tttgcaagac 60tctgactgga tctacaagtg atggtgac88<210>45<211>90
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>544gL1B3<220>
<221>
<400>45aacagtaata agtggcgaaa tcttctggct ggagagacga gatcgtgagg gtgaaatcag 60taccacttcc ggaaccgctg aacctgtctg 90<210>46<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>544gL1 F1<220>
<221>
<400>46ggatgattcg aagccgccac 20<210>47<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>544gL1 R1<220>
<221>
<400>47gcacgccgta cgtttgattt c 21<210>48<211>339<212>DNA<213>小鼠<220>
<223>小鼠單克隆抗體5/44 VL的DNA序列<220>
<221>
<400>48gatgttgtgg tgactcaaac tccactctcc ctgcctgtca gctttggaga tcaagtttct 60atctcttgca ggtctagtca gagtcttgca aacagttatg ggaacacctt tttgtcttgg 120tacctgcaca agcctggcca gtctccacag ctcctcatct atgggatttc caacagattt 180tctggggtgc cagacaggtt cactggcagt ggttcaggga cagatttcac actcaagatc 240agcacaataa agcctgagga cttgggaatg tattactgct tacaaggtac acatcagccg 300tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgt339<210>49<211>363<212>DNA<213>小鼠<220>
<223>小鼠單克隆抗體5/44 VH的DNA序列<220>
<221>
<400>49gaggtccaac tgcagcagtc tgggactgta ctggcaaggc ctggggcttc cgtgaagatg 60tcctgcaagg cttctggcta caggtttacc aactactgga ttcactgggt aaaacagagg 120
cctgggcagg gtctagaatg gattggtggt attaatcctg gaaataatta tactacgtat 180aagaggaact tgaagggcaa ggccacactg actgcagtca catccgccag cactgcctac 240atggacctca gcagcctgac aagtgaggac tctgcggtct attactgtac aagagagggc 300tatggtaact acggggcctg gtttgcttac tggggccagg ggactctggt caccgtctcc 360tca 363<210>50<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物內(nèi)的序列<400>50gccgccacc 9<210>51<211>101<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>5′寡核苷酸引物<400>51gcgcgcaagc ttgccgccac catggacttc ggattctctc tcgtgttcct ggcactcatt 60ctcaagggag tgcagtgtga ggtgcagctc gtcgagtctg g 10權(quán)利要求
1.一種用于制備具有減少的低綴合部分(LCF)的單體細(xì)胞毒性藥物/載體綴合物的方法，所述綴合物具有下式Pr(-X-W)m其中Pr為蛋白質(zhì)性載體，X為包含任何可與蛋白質(zhì)性載體反應(yīng)的反應(yīng)基的產(chǎn)物的接頭，W為細(xì)胞毒性藥物；m為純化綴合產(chǎn)物的平均負(fù)荷，致使細(xì)胞毒性藥物占所述綴合物的7-9％重量；且(-X-W)m為細(xì)胞毒性藥物衍生物，所述方法包括下述步驟(1)將所述細(xì)胞毒性藥物衍生物加入到所述蛋白質(zhì)性載體中，其中所述細(xì)胞毒性藥物衍生物是所述蛋白質(zhì)性載體的4.5-11％重量；(2)將所述細(xì)胞毒性藥物衍生物和蛋白質(zhì)性載體在非親核的、蛋白相容的、pH范圍為約7-9的緩沖液中溫育，產(chǎn)生單體細(xì)胞毒性藥物/載體綴合物，其中所述溶液還包含(a)有機(jī)助溶劑和(b)包含至少一種C6-C18羧酸或其鹽的添加劑，并且其中所述溫育是在約30℃至約35℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行約15分鐘至24小時(shí)；和(3)將步驟(2)產(chǎn)生的綴合物進(jìn)行層析分離方法，以從未綴合蛋白質(zhì)性載體、細(xì)胞毒性藥物衍生物和聚集綴合物中分離出細(xì)胞毒性藥物的負(fù)荷范圍是4-10％重量、低綴合部分(LCF)小于10％的所述單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/蛋白質(zhì)性載體綴合物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)性載體選自激素、生長因子、抗體、抗體片段、抗體模擬物以及它們的基因工程或酶工程對(duì)應(yīng)物。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述蛋白質(zhì)性載體是抗體。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述抗體選自單克隆抗體、嵌合抗體、人抗體、人源化抗體、單鏈抗體、Fab片段和F(ab)2片段。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述人源化抗體針對(duì)細(xì)胞表面抗原CD22。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述人源化抗CD22抗體是CDR移植抗體，所述抗體包含輕鏈可變區(qū)5/44-gL1即SEQ ID NO19和重鏈可變區(qū)5/44-gH7即SEQ ID NO27。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述人源化抗CD22抗體是CDR移植抗體，所述抗體包含具有SEQ ID NO28中所示的序列的輕鏈。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述人源化抗CD22抗體是CDR移植抗體，所述抗體包含具有SEQ ID NO30中所示的序列的重鏈。
9.權(quán)利要求5的方法，其中所述人源化抗CD22抗體是CDR移植抗體，所述抗體包含具有SEQ ID NO28中所示的序列的輕鏈以及具有SEQ ID NO30中所示的序列的重鏈。
10.權(quán)利要求5的方法，其中所述人源化抗CD22抗體是CDR移植抗體，所述CDR移植抗體是通過親和力成熟方案獲得的變異抗體并且對(duì)人CD22具有增加的特異性。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞毒性藥物是微管蛋白聚合抑制劑。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞毒性藥物是與DNA結(jié)合并且破壞DNA的烷化劑。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞毒性藥物抑制蛋白質(zhì)合成。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞毒性藥物是酪氨酸激酶抑制劑。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞毒性藥物選自加利車霉素、塞替派、紫杉烷類、長春新堿、柔紅霉素、多柔比星、表柔比星、埃斯波霉素、放線菌素、authramycin、偶氮絲氨酸、博來霉素、他莫昔芬、伊達(dá)比星、多拉司他汀/auristatins、hemiasterlins和美登素類。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞毒性藥物是加利車霉素。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述加利車霉素是γ加利車霉素或N-乙酰γ加利車霉素。
18.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞毒性藥物用3-巰基-3-甲基丁酰肼官能化。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述接頭是在結(jié)合和進(jìn)入靶細(xì)胞后能夠從所述綴合物中釋放所述細(xì)胞毒性藥物的可水解接頭。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述可水解接頭是4-(4-乙酰苯氧基)丁酸(AcBut)。
21.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(2)(b)的添加劑是辛酸或其鹽。
22.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(2)(b)的添加劑是癸酸或其鹽。
23.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(3)的層析分離方法是大小排阻層析法(SEC)。
24.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(3)的層析分離方法為HPLC、FPLC或葡聚糖凝膠S-200層析法。
25.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(3)的層析分離方法是疏水作用層析法(HIC)。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述疏水作用層析法(HIC)是通過使用苯基瓊脂糖凝膠6FF層析介質(zhì)、丁基瓊脂糖凝膠4FF層析介質(zhì)、辛基瓊脂糖凝膠4FF層析介質(zhì)、Toyopearl Ether-650M層析介質(zhì)、常量制備甲基HIC介質(zhì)或常量制備叔丁基HIC介質(zhì)來進(jìn)行。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述疏水作用層析法(HIC)是通過使用丁基瓊脂糖凝膠4FF層析介質(zhì)來進(jìn)行。
28.一種用權(quán)利要求1的方法制備的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物。
29.權(quán)利要求28的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體，其中所述細(xì)胞毒性藥物是加利車霉素。
30.權(quán)利要求28的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物，其中所述載體是抗體。
31.權(quán)利要求30的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物，其中所述抗體選自單克隆抗體、嵌合抗體、人抗體、人源化抗體、單鏈抗體、Fab片段和F(ab)2片段。
32.權(quán)利要求31的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物，其中所述人源化抗體針對(duì)細(xì)胞表面抗原CD22。
33.權(quán)利要求32的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物，其中所述人源化抗CD22抗體是CDR移植抗體，所述抗體包含輕鏈可變區(qū)5/44-gL1即SEQ ID NO19和重鏈可變區(qū)5/44-gH7即SEQ IDNO27。
34.權(quán)利要求32的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物，其中所述人源化抗CD22抗體是CDR移植抗體，所述抗體包含具有SEQ IDNO28中所示的序列的輕鏈。
35.權(quán)利要求32的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物，其中所述人源化抗CD22抗體是CDR移植抗體，所述抗體包含具有SEQ IDNO30中所示的序列的重鏈。
36.權(quán)利要求32的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物，其中所述人源化抗CD22抗體是CDR移植抗體，所述抗體包含具有SEQ IDNO28中所示的序列的輕鏈和具有SEQ ID NO30中所示的序列的重鏈。
37.權(quán)利要求32的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物，其中所述人源化抗CD22抗體是CDR移植抗體，所述抗體是通過親和力成熟方案獲得的變異抗體并且對(duì)人CD22具有增加的特異性。
38.權(quán)利要求32的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物，其中所述細(xì)胞毒性藥物衍生物是加利車霉素。
39.權(quán)利要求38的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物，其中所述加利車霉素是γ加利車霉素或N-乙酰γ加利車霉素。
40.權(quán)利要求38或39的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物，其中所述加利車霉素衍生物用3-巰基-3-甲基丁酰肼官能化。
41.權(quán)利要求38的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體，其中所述接頭是在結(jié)合和進(jìn)入靶細(xì)胞后能夠從所述綴合物中釋放所述細(xì)胞毒性藥物的可水解接頭。
42.權(quán)利要求41的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物，其中所述可水解接頭是4-(4-乙酰苯氧基)丁酸(AcBut)。
43.一種單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，所述綴合物具有下式Pr(-X-S-S-W)m其中Pr為抗CD22抗體；X為包含任何可與抗體反應(yīng)的反應(yīng)基的產(chǎn)物的可水解接頭；W為加利車霉素基團(tuán)；m為純化綴合產(chǎn)物的平均負(fù)荷，致使加利車霉素占所述綴合物的4-10％重量；且(-X-S-S-W)m為加利車霉素衍生物。
44.權(quán)利要求43的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述抗體選自單克隆抗體、嵌合抗體、人抗體、人源化抗體、單鏈抗體、Fab片段和F(ab)2片段。
45.權(quán)利要求44的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述抗CD22抗體是對(duì)人CD22具有特異性的抗CD22抗體，所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中所述重鏈的可變區(qū)包含CDR，所述CDR具有如下給出的序列中的至少一種對(duì)于CDR-H1在圖1中的H1即SEQ ID NO1，對(duì)于CDR-H2在圖1中的H2即SEQ ID NO2，或H2’即SEQ ID NO13或H2”即SEQ ID NO15或H2即SEQ IDNO16，或?qū)τ贑DR-H3在圖1中的H3即SEQ ID NO3；而所述輕鏈的可變區(qū)包含CDR，所述CDR具有如下給出的序列中的至少一種對(duì)于CDR-L1在圖1中的L1即SEQ ID NO4、對(duì)于CDR-L2在圖1中的L2即SEQ ID NO5或?qū)τ贑DR-L3在圖1中的L3即SEQ IDNO6。
46.權(quán)利要求44的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中所述重鏈的可變區(qū)包含CDR，所述CDR具有如下給出的序列中的至少一種CDR-H1的SEQID NO1，CDR-H2的SEQ ID NO2或SEQ ID NO13或SEQ ID NO15或SEQ ID NO16，或CDR-H3的SEQ ID NO3；而所述輕鏈的可變區(qū)包含CDR，所述CDR具有如下給出的序列中的至少一種CDR-L1的SEQ ID NO4、CDR-L2的SEQ ID NO5或CDR-L3的SEQ IDNO6。
47.權(quán)利要求44的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述抗體分子包含CDR-H1的SEQ ID NO1；CDR-H2的SEQID NO2或SEQ ID NO13或SEQ ID NO15或SEQ ID NO16；CDR-H3的SEQ ID NO3；CDR-L1的SEQ ID NO4；CDR-L2的SEQ IDNO5；和CDR-L3的SEQ ID NO6。
48.權(quán)利要求44的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述人源化抗體是CDR移植抗CD22抗體。
49.權(quán)利要求48的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述抗體包括含有人受體構(gòu)架區(qū)和非人類供體CDR的可變區(qū)。
50.權(quán)利要求49的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述抗體的重鏈可變區(qū)的人受體構(gòu)架區(qū)基于人亞型I共有序列并且在位置1、28、48、71和93還包含非人類供體殘基。
51.權(quán)利要求50的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述抗體在位置67和69還包含非人類供體殘基。
52.權(quán)利要求48的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述CDR移植抗體包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含基于人亞型I共有序列的人受體構(gòu)架區(qū)并且在位置2、4、37、38、45和60還包含非人類供體殘基。
53.權(quán)利要求52的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述CDR移植抗體在位置3還包含非人類供體殘基。
54.權(quán)利要求48的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述CDR移植抗體包含輕鏈可變區(qū)5/44-gL1即SEQ IDNO19和重鏈可變區(qū)5/44-gH7即SEQ ID NO27。
55.權(quán)利要求48的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述CDR移植抗體包含具有SEQ ID NO28中所示的序列的輕鏈。
56.權(quán)利要求48的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述DR移植物抗體包含具有SEQ ID NO30中所示的序列的重鏈。
57.權(quán)利要求48的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述CDR移植抗體包含具有SEQ ID NO28中所示的序列的輕鏈和具有SEQ ID NO30中所示的序列的重鏈。
58.權(quán)利要求48的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述CDR移植抗體是通過親和力成熟方案獲得的變異抗體并且對(duì)人CD22具有增加的特異性。
59.權(quán)利要求44的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述抗CD22抗體是嵌合抗體，所述嵌合抗體包含分別示于SEQ ID NO7和SEQ ID NO8的單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)序列和重鏈可變區(qū)序列。
60.權(quán)利要求44的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述抗CD22抗體包括含有截短的供體CDR序列的雜種CDR，其中所述供體CDR中的缺失部分被不同序列取代，形成功能性CDR。
61.權(quán)利要求43的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述加利車霉素衍生物是γ加利車霉素或N-乙酰γ加利車霉素衍生物。
62.權(quán)利要求61的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述加利車霉素衍生物用3-巰基-3-甲基丁酰肼官能化。
63.權(quán)利要求43的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述可水解接頭是在結(jié)合和進(jìn)入靶細(xì)胞后能夠從所述綴合物中釋放加利車霉素的雙官能接頭。
64.權(quán)利要求63的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述雙官能接頭是4-(4-乙酰苯氧基)丁酸(AcBut)。
65.一種制備單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物的穩(wěn)定的凍干組合物的方法，所述方法包括(a)將所述單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體綴合物溶于溶液中，使其終濃度為0.5-2mg/ml，所述溶液包含濃度為1.5％-5％重量的防凍劑、濃度為0.5-1.5％重量的聚合填充劑、濃度為0.01M-0.1M的電解質(zhì)、濃度為0.005-0.05％重量的增溶劑、致使所述溶液的最終pH為7.8-8.2的濃度為5-50mM的緩沖劑以及水；(b)在+5℃至+10℃的溫度下，將上述溶液分裝到小瓶中；(c)在-35℃至-50℃的冷凍溫度下，將所述溶液進(jìn)行冷凍；(d)在20-80微米汞柱的初始干燥壓力下，在-10℃至-40℃的擱板溫度下，對(duì)所述冷凍溶液進(jìn)行初始凍干步驟達(dá)24-78小時(shí)；和(e)在20-80微米汞柱的干燥壓力下，在+10℃至+35℃的擱板溫度下，對(duì)步驟(d)的凍干產(chǎn)物進(jìn)行第二個(gè)凍干步驟達(dá)15-30小時(shí)。
66.權(quán)利要求65的方法，其中所述細(xì)胞毒性藥物衍生物是微管蛋白聚合抑制劑。
67.權(quán)利要求65的方法，其中所述細(xì)胞毒性藥物衍生物是與DNA結(jié)合并破壞DNA的烷化劑。
68.權(quán)利要求65的方法，其中所述細(xì)胞毒性藥物衍生物是蛋白質(zhì)合成抑制劑。
69.權(quán)利要求65的方法，其中所述細(xì)胞毒性藥物衍生物是酪氨酸激酶抑制劑。
70.權(quán)利要求65的方法，其中所述細(xì)胞毒性藥物衍生物選自加利車霉素、塞替派、紫杉烷類、長春新堿、柔紅霉素、多柔比星、表柔比星、放線菌素、authramycin、偶氮絲氨酸、博來霉素、他莫昔芬、伊達(dá)比星、多拉司他汀/auristatins、hemiasterlins和美登素類。
71.權(quán)利要求65的方法，其中所述細(xì)胞毒性藥物衍生物是加利車霉素。
72.權(quán)利要求65的方法，其中所述細(xì)胞毒性藥物衍生物是γ加利車霉素或N-乙酰加利車霉素。
73.權(quán)利要求65的方法，其還任選包含治療有效濃度的生物活性劑。
74.權(quán)利要求73的方法，其中所述生物活性劑是細(xì)胞毒性藥物。
75.權(quán)利要求73的方法，其中所述生物活性劑是生長因子。
76.權(quán)利要求73的方法，其中所述生物活性劑是激素。
77.權(quán)利要求73的方法，其中所述防凍劑選自糖醇、甘露醇、山梨醇、肌醇、聚乙二醇、醛糖酸、糖醛酸、醛糖二酸、醛糖、酮糖、氨基糖、糖醇、肌醇、甘油醛、阿拉伯糖、來蘇糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、塔羅糖、庚糖、葡萄糖、果糖、葡糖酸、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α-吡喃葡糖苷、麥芽糖、異抗壞血酸、抗壞血酸、內(nèi)酯、山梨糖、葡糖二酸、赤蘚糖、蘇糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、塔羅糖、赤蘚酮糖、核糖、木酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、葡糖醛酸、葡糖酸、葡糖二酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、蔗糖、海藻糖、神經(jīng)氨酸、阿聚糖、果聚糖、巖藻聚糖、半乳聚糖、聚半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、果聚糖、巖藻依聚糖、卡拉膠、半乳卡羅聚糖、果膠、果膠酸、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原、支鏈淀粉、纖維素、葡聚糖、石臍素、殼多糖、瓊脂糖、角蛋白、軟骨素、皮膚素、透明質(zhì)酸、海藻酸、黃原酸膠、淀粉、蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、乙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、丙三醇和季戊四醇。
78.權(quán)利要求65的方法，其中所述防凍劑是蔗糖。
79.權(quán)利要求78的方法，其中所述蔗糖濃度為1.5％重量。
80.權(quán)利要求65的方法，其中所述聚合填充劑是葡聚糖40，其濃度為0.9％重量。
81.權(quán)利要求65的方法，其中所述聚合填充劑是羥乙基淀粉40，其濃度為0.9％重量。
82.權(quán)利要求65的方法，其中所述電解質(zhì)是氯化鈉，其濃度為0.05M。
83.權(quán)利要求65的方法，其中所述增溶劑是表面活性劑。
84.權(quán)利要求83的方法，其中所述表面活性劑是聚山梨酯80，其濃度為0.01％重量。
85.權(quán)利要求65的方法，其中所述緩沖劑是氨丁三醇，其濃度為0.02M。
86.權(quán)利要求65的方法，其中步驟(a)的溶液pH為8.0。
87.權(quán)利要求65的方法，其中將步驟(b)的溶液在+5℃的溫度下分裝到小瓶中。
88.權(quán)利要求65的方法，其中步驟(c)的小瓶中所述溶液在-45℃的冷凍溫度下進(jìn)行冷凍。
89.權(quán)利要求65的方法，其中步驟(d)的冷凍溶液在60微米汞柱的初始干燥壓力下，在-30℃的擱板溫度下，進(jìn)行初始凍干步驟達(dá)60小時(shí)。
90.權(quán)利要求65的方法，其中步驟(d)的凍干產(chǎn)物在步驟(e)中在60微米汞柱的干燥壓力下，在+25℃的擱板溫度下，進(jìn)行第二個(gè)凍干步驟達(dá)24小時(shí)。
91.一種組合物，所述組合物包含治療有效量的用權(quán)利要求65的方法制備的單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體組合物。
92.權(quán)利要求91的組合物，其中在單體細(xì)胞毒性藥物衍生物/載體組合物中的載體是蛋白質(zhì)性載體。
93.權(quán)利要求92的組合物，其中所述蛋白質(zhì)性載體選自激素、生長因子、抗體和抗體模擬物。
94.權(quán)利要求93的組合物，其中所述抗體是人單克隆抗體。
95.權(quán)利要求93的組合物，其中所述抗體是嵌合抗體。
96.權(quán)利要求93的組合物，其中所述抗體是人抗體。
97.權(quán)利要求93的組合物，其中所述抗體是人源化抗體。
98.權(quán)利要求97的組合物，其中所述人源化抗體針對(duì)細(xì)胞表面抗原CD22。
99.權(quán)利要求98的組合物，其中所述抗CD22抗體對(duì)人CD22具有特異性，所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中所述重鏈的可變區(qū)包含CDR，所述CDR具有如下給出的序列中的至少一種對(duì)于CDR-H1在圖1中的H1即SEQ ID NO1，對(duì)于CDR-H2在圖1中的H2即SEQ ID NO2，或H2’即SEQ ID NO13或H2”即SEQ ID NO15或H2即SEQ ID NO16，或?qū)τ贑DR-H3在圖1中的H3即SEQ IDNO3；而所述輕鏈的可變區(qū)包含CDR，所述CDR具有如下給出的序列中的至少一種對(duì)于CDR-L1在圖1中的L1即SEQ ID NO4、對(duì)于CDR-L2在圖1中的L2即SEQ ID NO5或?qū)τ贑DR-L3在圖1中的L3即SEQ ID NO6。
100.權(quán)利要求98的組合物，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中所述重鏈的可變區(qū)包含CDR，所述CDR具有如下給出的序列中的至少一種CDR-H1的SEQ ID NO1，CDR-H2的SEQ ID NO2或SEQID NO13或SEQ ID NO15或SEQ ID NO16，或CDR-H3的SEQ IDNO3；而所述輕鏈的可變區(qū)包含CDR，所述CDR具有如下給出的序列中的至少一種CDR-L1的SEQ ID NO4、CDR-L2的SEQ ID NO5或CDR-L3的SEQ ID NO6。
101.權(quán)利要求98的組合物，其中所述抗體包含CDR-H1的SEQID NO1；CDR-H2的SEQ ID NO2或SEQ ID NO13或SEQ ID NO15或SEQ ID NO16；CDR-H3的SEQ ID NO3；CDR-L1的SEQ IDNO4；CDR-L2的SEQ ID NO5；和CDR-L3的SEQ ID NO6。
102.權(quán)利要求98的組合物，其中所述人源化抗CD22抗體是CDR移植人源化抗CD22抗體，所述抗體包含輕鏈可變區(qū)5/44-gL1即SEQID NO19和重鏈可變區(qū)5/44-gH7即SEQ ID NO27。
103.權(quán)利要求98的組合物，其中所述人源化抗CD22抗體是對(duì)人CD22具有特異性的CDR移植抗體，所述抗體包含具有SEQ IDNO28中所示的序列的輕鏈。
104.權(quán)利要求98的組合物，其中所述人源化抗CD22抗體是對(duì)人CD22具有特異性的CDR移植抗體，所述抗體包含具有SEQ IDNO30中所示的序列的重鏈。
105.權(quán)利要求98的組合物，其中所述人源化抗CD22抗體是對(duì)人CD22具有特異性的CDR移植抗體，所述抗體包含輕鏈和重鏈，所述輕鏈具有SEQ ID NO28中所示的序列，而所述重鏈具有SEQ IDNO30中所示的序列。
106.權(quán)利要求98的組合物，其中所述人源化抗CD22抗體是CDR移植抗體，所述抗體是對(duì)人CD22具有增加的特異性的變異抗體，其中所述變異抗體是通過親和力成熟方案獲得的。
107.權(quán)利要求91的組合物，其中所述細(xì)胞毒性藥物是加利車霉素。
108.權(quán)利要求107的組合物，其中所述加利車霉素是γ加利車霉素或N-乙酰加利車霉素。
109.權(quán)利要求91的組合物，所述組合物還任選包含生物活性劑。
110.權(quán)利要求109的組合物，其中所述生物活性劑是細(xì)胞毒性藥物。
111.權(quán)利要求109的組合物，其中所述生物活性劑是生長因子。
112.權(quán)利要求109的組合物，其中所述生物活性劑是激素。
113.一種治療增生性疾病患者的方法，所述方法包括給予治療有效量的權(quán)利要求91的組合物。
114.權(quán)利要求113的治療方法，其中治療有效量的所述組合物通過以下途徑給藥皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、經(jīng)皮、透皮、鼻內(nèi)、局部、腸內(nèi)、陰道內(nèi)、舌下或直腸。
115.權(quán)利要求113的治療方法，其中治療有效量的所述組合物通過靜脈內(nèi)途徑給藥。
116.權(quán)利要求113的方法，其中所述患者是人類患者，而所述增生性疾病是癌癥。
117.權(quán)利要求116的方法，其中所述癌癥是B細(xì)胞惡性腫瘤。
118.權(quán)利要求117的方法，其中所述B細(xì)胞惡性腫瘤是白血病。
119.權(quán)利要求118的方法，其中所述白血病表達(dá)細(xì)胞表面抗原CD22。
120.權(quán)利要求117的方法，其中所述B細(xì)胞惡性腫瘤是淋巴瘤。
121.權(quán)利要求120的方法，其中所述淋巴瘤表達(dá)細(xì)胞表面抗原CD22。
122.權(quán)利要求116的方法，其中所述癌癥是癌。
123.權(quán)利要求116的方法，其中所述癌癥是肉瘤。
124.一種治療B細(xì)胞惡性腫瘤的方法，所述方法包括給予需要所述治療的患者治療有效的包含細(xì)胞毒性藥物-抗CD22抗體綴合物的組合物。
125.權(quán)利要求124的方法，其中所述B細(xì)胞惡性腫瘤是淋巴瘤。
126.權(quán)利要求125的方法，其中所述B細(xì)胞惡性腫瘤是非霍奇金淋巴瘤。
127.權(quán)利要求124的方法，所述方法包括給予治療有效的所述細(xì)胞毒性藥物-抗CD22抗體綴合物的組合物以及一種或多種生物活性劑。
128.權(quán)利要求124的方法，其中所述細(xì)胞毒性藥物綴合物抗CD22中的細(xì)胞毒性藥物選自加利車霉素、塞替派、紫杉烷類、長春新堿、柔紅霉素、多柔比星、表柔比星、放線菌素、authramycin、偶氮絲氨酸、博來霉素、他莫昔芬、伊達(dá)比星、多拉司他汀/auristatins、hemiasterlins、美登素類和埃斯波霉素。
129.權(quán)利要求124的方法，其中所述細(xì)胞毒性藥物是加利車霉素。
130.權(quán)利要求126的方法，其中所述加利車霉素是γ加利車霉素或N-乙酰加利車霉素。
131.權(quán)利要求127的方法，其中所述一種或多種生物活性劑選自抗體、生長因子、激素、細(xì)胞因子、抗激素、黃嘌呤、白介素、干擾素和細(xì)胞毒性藥物。
132.權(quán)利要求131的方法，其中所述生物活性劑是抗體。
133.權(quán)利要求132的方法，其中所述抗體針對(duì)在B細(xì)胞惡性腫瘤上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原。
134.權(quán)利要求133的方法，其中針對(duì)在B細(xì)胞惡性腫瘤上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原的所述抗體選自抗CD19抗體、抗CD20抗體和抗CD33抗體。
135.權(quán)利要求134的方法，其中所述抗CD20抗體是利妥昔單抗。
136.權(quán)利要求131的方法，其中所述細(xì)胞因子或生長因子選自白介素2(IL-2)、TNF、CSF、GM-CSF和G-CSF。
137.權(quán)利要求131的方法，其中所述激素是類固醇激素并且選自雌激素、雄激素、孕酮和皮質(zhì)類固醇。
138.權(quán)利要求131的方法，其中所述細(xì)胞毒性藥物選自多柔比星、柔紅霉素、伊達(dá)比星、阿柔比星、佐柔比星、米托蒽醌、表柔比星、卡柔比星、諾拉霉素、美諾立爾、pitarubicin、戊柔比星、阿糖胞苷、吉西他濱、曲氟尿苷、安西他濱、依諾他濱、阿扎胞苷、去氧氟尿苷、噴司他丁、溴尿苷、卡培他濱、克拉曲濱、地西他濱、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、谷氏菌素、嘌羅霉素、替加氟、噻唑呋林、阿霉素、順鉑、卡鉑、環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪、長春堿、長春新堿、米托蒽醌、博來霉素、氮芥、潑尼松、丙卡巴肼、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、依托泊苷、泰素、泰素類似物和絲裂霉素。
139.權(quán)利要求131的方法，其中治療有效的所述細(xì)胞毒性藥物-抗CD22抗體綴合物的組合物與作為治療方案組成部分的一種或多種細(xì)胞毒性藥物組合聯(lián)合給藥，其中所述細(xì)胞毒性藥物組合選自A.CHOPP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；B.CHOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松；C.COP，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；D.CAP-BOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博來霉素、長春新堿和潑尼松；E.m-BACOD，即甲氨蝶呤、博來霉素、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、地塞米松和亞葉酸；F.ProMACE-MOPP，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；G.ProMACE-CytaBOM，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、阿糖胞苷、博來霉素和長春新堿；H.MACOP-B，即甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松、博來霉素和亞葉酸；I.MOPP，即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；J.ABVD，即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪；K.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABV即阿霉素/多柔比星、博來霉素和長春堿交替使用；L.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABVD即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪交替使用；M.ChIVPP，即苯丁酸氮芥、長春堿、丙卡巴肼和潑尼松；N.IMVP-16，即異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；O.MIME，即米托胍腙、異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；P.DHAP，即地塞米松、高劑量阿糖胞苷和順鉑；Q.ESHAP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷和順鉑；R.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；S.CAMP，即洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和潑尼松；T.CVP-1，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；U.ESHOP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷、長春新堿和順鉑；V.EPOCH，即依托泊苷、長春新堿和多柔比星給予96小時(shí)，同時(shí)給予快速濃注環(huán)磷酰胺和口服潑尼松；W.ICE，即異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺和依托泊苷；X.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；Y.CHOP-B.，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和博來霉素；和Z.P/DOCE，即表柔比星或多柔比星、長春新堿、環(huán)磷酰胺和潑尼松。
140.權(quán)利要求131的方法，其中在給予作為治療方案組成部分的一種或多種細(xì)胞毒性藥物組合之前，先給予治療有效的所述細(xì)胞毒性藥物-抗CD22抗體綴合物的組合物，其中所述細(xì)胞毒性藥物組合選自A.CHOPP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；B.CHOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松；C.COP，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；D.CAP-BOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博來霉素、長春新堿和潑尼松；E.m-BACOD，即甲氨蝶呤、博來霉素、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、地塞米松和亞葉酸；F.ProMACE-MOPP，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；G.ProMACE-CytaBOM，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、阿糖胞苷、博來霉素和長春新堿；H.MACOP-B，即甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、固定劑量潑尼松、博來霉素和亞葉酸；I.MOPP，即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；J.ABVD，即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪；K.MOPP與ABV即阿霉素/多柔比星、博來霉素和長春堿交替使用；L.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABVD即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪交替使用；M.ChIVPP，即苯丁酸氮芥、長春堿、丙卡巴肼和潑尼松；N.IMVP-16，即異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；O.MIME，即米托胍腙、異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；P.DHAP，即地塞米松、高劑量阿糖胞苷和順鉑；Q.ESHAP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷和順鉑；R.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；S.CAMP，即洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和潑尼松；T.CVP-1，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；U.ESHOP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷、長春新堿和順鉑；V.EPOCH，即依托泊苷、長春新堿和多柔比星給予96小時(shí)，同時(shí)給予快速濃注環(huán)磷酰胺和口服潑尼松；W.ICE，即異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺和依托泊苷；X.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；Y.CHOP-B.，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和博來霉素；和Z.P/DOCE，即表柔比星或多柔比星、長春新堿、環(huán)磷酰胺和潑尼松。
141.權(quán)利要求131的方法，其中在給予作為治療方案組成部分的一種或多種細(xì)胞毒性藥物組合之后，再給予治療有效的所述細(xì)胞毒性藥物-抗CD22抗體綴合物的組合物，其中所述生物活性劑組合選自A.CHOPP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；B.CHOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松；C.COP，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；D.CAP-BOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博來霉素、長春新堿和潑尼松；E.m-BACOD，即甲氨蝶呤、博來霉素、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、地塞米松和亞葉酸；F.ProMACE-MOPP，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；G.ProMACE-CytaBOM，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、阿糖胞苷、博來霉素和長春新堿；H.MACOP-B，即甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、固定劑量潑尼松、博來霉素和亞葉酸；I.MOPP，即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；J.ABVD，即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪；K.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABV即阿霉素/多柔比星、博來霉素和長春堿交替使用；L.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABVD即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪交替使用；M.ChIVPP，即苯丁酸氮芥、長春堿、丙卡巴肼和潑尼松；N.IMVP-16，即異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；O.MIME，即米托胍腙、異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；P.DHAP，即地塞米松、高劑量阿糖胞苷和順鉑；Q.ESHAP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷和順鉑；R.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；S.CAMP，即洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和潑尼松；T.CVP-1，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；U.ESHOP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷、長春新堿和順鉑；V.EPOCH，即依托泊苷、長春新堿和多柔比星給予96小時(shí)，同時(shí)給予快速濃注環(huán)磷酰胺和口服潑尼松；W.ICE，即異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺和依托泊苷；X.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；Y.CHOP-B.，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和博來霉素；和Z.P/DOCE，即表柔比星或多柔比星、長春新堿、環(huán)磷酰胺和潑尼松。
142.權(quán)利要求131的方法，其中治療有效的所述細(xì)胞毒性藥物-抗CD22抗體綴合物的組合物與一種針對(duì)在B細(xì)胞惡性腫瘤上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原的抗體一起給藥，并且任選包含作為治療方案組成部分的一種或多種細(xì)胞毒性藥物組合，其中所述細(xì)胞毒性藥物組合選自A.CHOPP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；B.CHOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松；C.COP，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；D.CAP-BOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博來霉素、長春新堿和潑尼松；E.m-BACOD，即甲氨蝶呤、博來霉素、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、地塞米松和亞葉酸；F.ProMACE-MOPP，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；G.ProMACE-CytaBOM，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、阿糖胞苷、博來霉素和長春新堿；H.MACOP-B，即甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、固定劑量潑尼松、博來霉素和亞葉酸；I.MOPP，即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；J.ABVD，即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪；K.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABV即阿霉素/多柔比星、博來霉素和長春堿交替使用；L.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABVD即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪交替使用；M.ChIVPP，即苯丁酸氮芥、長春堿、丙卡巴肼和潑尼松；N.IMVP-16，即異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；O.MIME，即米托胍腙、異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；P.DHAP，即地塞米松、高劑量阿糖胞苷和順鉑；Q.ESHAP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷和順鉑；R.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；S.CAMP，即洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和潑尼松；T.CVP-1，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；ESHOP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷、長春新堿和順鉑；U.ESHOP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷、長春新堿和順鉑；V.EPOCH，即依托泊苷、長春新堿和多柔比星給予96小時(shí)，同時(shí)給予快速濃注環(huán)磷酰胺和口服潑尼松；W.ICE，即異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺和依托泊苷；X.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；Y.CHOP-B.，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和博來霉素；和Z.P/DOCE，即表柔比星或多柔比星、長春新堿、環(huán)磷酰胺和潑尼松。
143.一種治療侵襲性淋巴瘤的方法，所述方法包括給予需要所述治療的患者治療有效的單體加利車霉素衍生物-抗CD22抗體綴合物的組合物以及一種或多種生物活性劑。
144.權(quán)利要求143的方法，其中所述單體加利車霉素衍生物-抗CD22抗體綴合物是CMC-544。
145.權(quán)利要求91的組合物在治療增生性疾病患者中的用途，其包括給予治療有效量的所述組合物。
146.權(quán)利要求145的用途，其中治療有效量的所述組合物通過以下途徑給藥皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、經(jīng)皮、透皮、鼻內(nèi)、局部、腸內(nèi)、陰道內(nèi)、舌下或直腸。
147.權(quán)利要求145的用途，其中治療有效量的本發(fā)明藥用組合物通過靜脈內(nèi)途徑給藥。
148.權(quán)利要求145的用途，其中所述患者是人類患者，而所述增生性疾病是癌癥。
149.權(quán)利要求148的用途，其中所述癌癥是B細(xì)胞惡性腫瘤。
150.權(quán)利要求149的用途，其中所述B細(xì)胞惡性腫瘤是白血病。
151.權(quán)利要求150的用途，其中所述自血病表達(dá)細(xì)胞表面抗原CD22。
152.權(quán)利要求149的用途，其中所述B細(xì)胞惡性腫瘤是淋巴瘤。
153.權(quán)利要求152的用途，其中所述淋巴瘤表達(dá)細(xì)胞表面抗原CD22。
154.權(quán)利要求148的用途，其中所述癌癥是癌。
155.權(quán)利要求148的用途，其中所述癌癥是肉瘤。
156.一種包含用于治療B細(xì)胞惡性腫瘤的細(xì)胞毒性藥物-抗CD22抗體綴合物的組合物的用途，其包括給予需要所述治療的患者治療有效量的包含細(xì)胞毒性藥物-抗CD22抗體綴合物的組合物。
157.權(quán)利要求156的用途，其中所述B細(xì)胞惡性腫瘤是淋巴瘤。
158.權(quán)利要求157的用途，其中所述B細(xì)胞惡性腫瘤是非霍奇金淋巴瘤。
159.權(quán)利要求156的用途，其包括給予治療有效的所述細(xì)胞毒性藥物-抗CD22抗體綴合物的組合物以及一種或多種生物活性劑。
160.權(quán)利要求156的用途，其中所述細(xì)胞毒性藥物-抗CD22抗體綴合物中的細(xì)胞毒性藥物選自加利車霉素、塞替派、紫杉烷類、長春新堿、柔紅霉素、多柔比星、表柔比星、放線菌素、authramycin、偶氮絲氨酸、博來霉素、他莫昔芬、伊達(dá)比星、多拉司他汀/auristatins、hemiasterlins、美登素類和埃斯波霉素。
161.權(quán)利要求156的用途，其中所述細(xì)胞毒性藥物是加利車霉素。
162.權(quán)利要求161的用途，其中所述加利車霉素是γ加利車霉素或N-乙酰加利車霉素。
163.權(quán)利要求159的用途，其中所述生物活性劑選自抗體、生長因子、激素、細(xì)胞因子、抗激素、黃嘌呤、白介素、干擾素和細(xì)胞毒性藥物。
164.權(quán)利要求163的用途，其中所述生物活性劑是抗體。
165.權(quán)利要求164的用途，其中所述抗體針對(duì)在B細(xì)胞惡性腫瘤上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原。
166.權(quán)利要求165的用途，其中針對(duì)在B細(xì)胞惡性腫瘤上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原的所述抗體選自抗CD19抗體、抗CD20抗體和抗CD33抗體。
167.權(quán)利要求166的用途，其中所述抗CD20抗體是利妥昔單抗。
168.權(quán)利要求163的用途，其中所述細(xì)胞因子或生長因子選自白介素2(IL-2)、TNF、CSF、GM-CSF和G-CSF。
169.權(quán)利要求163的用途，其中所述激素是類固醇激素并且選自雌激素、雄激素、孕酮和皮質(zhì)類固醇。
170.權(quán)利要求163的用途，其中所述細(xì)胞毒性藥物選自多柔比星、柔紅霉素、伊達(dá)比星、阿柔比星、佐柔比星、米托蒽醌、表柔比星、卡柔比星、諾拉霉素、美諾立爾、pitarubicin、戊柔比星、阿糖胞苷、吉西他濱、曲氟尿苷、安西他濱、依諾他濱、阿扎胞苷、去氧氟尿苷、噴司他丁、溴尿苷、卡培他濱、克拉曲濱、地西他濱、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、谷氏菌素、嘌羅霉素、替加氟、噻唑呋林、阿霉素、順鉑、卡鉑、環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪、長春堿、長春新堿、米托蒽醌、博來霉素、氮芥、潑尼松、丙卡巴肼甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、依托泊苷、泰素、泰素類似物和絲裂霉素。
171.權(quán)利要求163的用途，其中治療有效的所述細(xì)胞毒性藥物-抗CD22抗體綴合物的組合物與作為治療方案組成部分的一種或多種細(xì)胞毒性藥物組合聯(lián)合給予，其中所述細(xì)胞毒性藥物組合選自A.CHOPP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；B.CHOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松；C.COP，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；D.CAP-BOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博來霉素、長春新堿和潑尼松；E.m-BACOD，即甲氨蝶呤、博來霉素、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、地塞米松和亞葉酸；F.ProMACE-MOPP，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；G.ProMACE-CytaBOM，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、阿糖胞苷、博來霉素和長春新堿；H.MACOP-B，即甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松、博來霉素和亞葉酸；I.MOPP，即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；J.ABVD，即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪；K.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABV即阿霉素/多柔比星、博來霉素和長春堿交替使用；L.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABVD即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪交替使用；M.ChIVPP，即苯丁酸氮芥、長春堿、丙卡巴肼和潑尼松；N.IMVP-16，即異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；O.MIME，即米托胍腙、異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；P.DHAP，即地塞米松、高劑量阿糖胞苷和順鉑；Q.ESHAP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷和順鉑；R.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；S.CAMP，即洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和潑尼松；T.CVP-1，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；U.ESHOP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷、長春新堿和順鉑；V.EPOCH，即依托泊苷、長春新堿和多柔比星給予96小時(shí)，同時(shí)給予快速濃注環(huán)磷酰胺和口服潑尼松；W.ICE，即異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺和依托泊苷；X.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；Y.CHOP-B.，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和博來霉素；和Z.P/DOCE，即表柔比星或多柔比星、長春新堿、環(huán)磷酰胺和潑尼松。
172.權(quán)利要求163的用途，其中在給予作為治療方案組成部分的一種或多種細(xì)胞毒性藥物組合之前，先給予治療有效的所述細(xì)胞毒性藥物-抗CD22抗體綴合物的組合物，其中所述細(xì)胞毒性藥物組合選自A.CHOPP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；B.CHOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松；C.COP，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；D.CAP-BOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博來霉素、長春新堿和潑尼松；E.m-BACOD，即甲氨蝶呤、博來霉素、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、地塞米松和亞葉酸；F.ProMACE-MOPP，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；G.ProMACE-CytaBOM，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、阿糖胞苷、博來霉素和長春新堿；H.MACOP-B，即甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、固定劑量潑尼松、博來霉素和亞葉酸；I.MOPP，即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；J.ABVD，即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪；K.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABV即阿霉素/多柔比星、博來霉素和長春堿交替使用；L.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABVD即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪交替使用；M.ChIVPP，即苯丁酸氮芥、長春堿、丙卡巴肼和潑尼松；N.IMVP-16，即異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；O.MIME，即米托胍腙、異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；P.DHAP，即地塞米松、高劑量阿糖胞苷和順鉑；Q.ESHAP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷和順鉑；R.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；S.CAMP，即洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和潑尼松；T.CVP-1，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；U.ESHOP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷、長春新堿和順鉑；V.EPOCH，即依托泊苷、長春新堿和多柔比星給予96小時(shí)，同時(shí)給予快速濃注環(huán)磷酰胺和口服潑尼松；W.ICE，即異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺和依托泊苷；X.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；Y.CHOP-B.，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和博來霉素；和Z.P/DOCE，即表柔比星或多柔比星、長春新堿、環(huán)磷酰胺和潑尼松。
173.權(quán)利要求163的用途，其中在給予作為治療方案組成部分的一種或多種細(xì)胞毒性藥物組合之后，再給予治療有效的所述細(xì)胞毒性藥物-抗CD22抗體綴合物的組合物，其中所述生物活性劑組合選自A.CHOPP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；B.CHOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松；C.COP，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；D.CAP-BOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博來霉素、長春新堿和潑尼松；E.m-BACOD，即甲氨蝶呤、博來霉素、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、地塞米松和亞葉酸；F.ProMACE-MOPP，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；G.ProMACE-CytaBOM，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、阿糖胞苷、博來霉素和長春新堿；H.MACOP-B，即甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、固定劑量潑尼松、博來霉素和亞葉酸；I.MOPP，即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；J.ABVD，即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪；K.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABV即阿霉素/多柔比星、博來霉素和長春堿交替使用；L.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABVD即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪交替使用；M.ChIVPP，即苯丁酸氮芥、長春堿、丙卡巴肼和潑尼松；N.IMVP-16，即異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；O.MIME，即米托胍腙、異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；P.DHAP，即地塞米松、高劑量阿糖胞苷和順鉑；Q.ESHAP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷和順鉑；R.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；S.CAMP，即洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和潑尼松；T.CVP-1，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；U.ESHOP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷、長春新堿和順鉑；V.EPOCH，即依托泊苷、長春新堿和多柔比星給予96小時(shí)，同時(shí)給予快速濃注環(huán)磷酰胺和口服潑尼松；W.ICE，即異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺和依托泊苷；X.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；Y.CHOP-B.，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和博來霉素；和Z.P/DOCE，即表柔比星或多柔比星、長春新堿、環(huán)磷酰胺和潑尼松。
174.權(quán)利要求163的用途，其中治療有效的所述細(xì)胞毒性藥物-抗CD22抗體綴合物的組合物與一種針對(duì)在B細(xì)胞惡性腫瘤上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原的抗體聯(lián)合給予，并且任選包含作為治療方案組成部分的一種或多種細(xì)胞毒性藥物組合，其中所述細(xì)胞毒性藥物組合選自A.CHOPP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；B.CHOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松；C.COP，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；D.CAP-BOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博來霉素、長春新堿和潑尼松；E.m-BACOD，即甲氨蝶呤、博來霉素、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、地塞米松和亞葉酸；F.ProMACE-MOPP，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；G.ProMACE-CytaBOM，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、阿糖胞苷、博來霉素和長春新堿；H.MACOP-B，即甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松、博來霉素和亞葉酸；I.MOPP，即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；J.ABVD，即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪；K.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABV即阿霉素/多柔比星、博來霉素和長春堿交替使用；L.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABVD即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪交替使用；M.ChIVPP，即苯丁酸氮芥、長春堿、丙卡巴肼和潑尼松；N.IMVP-16，即異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；O.MIME，即米托胍腙、異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；P.DHAP，即地塞米松、高劑量阿糖胞苷和順鉑；Q.ESHAP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷和順鉑；R.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；S.CAMP，即洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和潑尼松；T.CVP-1，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；U.ESHOP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷、長春新堿和順鉑；V.EPOCH，即依托泊苷、長春新堿和多柔比星給予96小時(shí)，同時(shí)給予快速濃注環(huán)磷酰胺和口服潑尼松；W.ICE，即異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺和依托泊苷；X.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；Y.CHOP-B.，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和博來霉素；和Z.P/DOCE，即表柔比星或多柔比星、長春新堿、環(huán)磷酰胺和潑尼松。
175.權(quán)利要求43的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物在治療B細(xì)胞惡性腫瘤患者中的用途，其包括給予需要所述治療的患者治療有效量的所述綴合物。
176.權(quán)利要求175的用途，其中所述患者患有B細(xì)胞惡性腫瘤。
177.權(quán)利要求176的用途，其中所述B細(xì)胞惡性腫瘤是淋巴瘤。
178.權(quán)利要求177的用途，其中所述B細(xì)胞惡性腫瘤是非霍奇金淋巴瘤。
179.權(quán)利要求175的用途，其中所述綴合物與一種或多種生物活性劑一起給藥。
180.權(quán)利要求175的用途，其中所述加利車霉素衍生物是γ加利車霉素或N-乙酰加利車霉素衍生物。
181.權(quán)利要求179的用途，其中所述生物活性劑選自抗體、生長因子、激素、細(xì)胞因子、抗激素、黃嘌呤、白介素、干擾素和細(xì)胞毒性藥物。
182.權(quán)利要求181的用途，其中所述生物活性劑是抗體。
183.權(quán)利要求182的用途，其中所述抗體針對(duì)在B細(xì)胞惡性腫瘤上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原。
184.權(quán)利要求183的用途，其中針對(duì)在B細(xì)胞惡性腫瘤上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原的所述抗體選自抗CD19抗體、抗CD20抗體和抗CD33抗體。
185.權(quán)利要求184的用途，其中所述抗CD20抗體是利妥昔單抗。
186.權(quán)利要求181的用途，其中所述細(xì)胞因子或生長因子選自白介素2(IL-2)、TNF、CSF、GM-CSF和G-CSF。
187.權(quán)利要求181的用途，其中所述激素是類固醇激素并且選自雌激素、雄激素、孕酮和皮質(zhì)類固醇。
188.權(quán)利要求181的用途，其中所述細(xì)胞毒性藥物選自多柔比星、柔紅霉素、伊達(dá)比星、阿柔比星、佐柔比星、米托蒽醌、表柔比星、卡柔比星、諾拉霉素、美諾立爾、pitarubicin、戊柔比星、阿糖胞苷、吉西他濱、曲氟尿苷、安西他濱、依諾他濱、阿扎胞苷、去氧氟尿苷、噴司他丁、溴尿苷、卡培他濱、克拉曲濱、地西他濱、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、谷氏菌素、嘌羅霉素、替加氟、噻唑呋林、阿霉素、順鉑、卡鉑、環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪、長春堿、長春新堿、米托蒽醌、博來霉素、氮芥、潑尼松、丙卡巴肼、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、依托泊苷、泰素、泰素類似物和絲裂霉素。
189.權(quán)利要求181的用途，其中治療有效量的所述單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物與作為治療方案組成部分的一種或多種細(xì)胞毒性藥物組合一起給藥，其中所述細(xì)胞毒性藥物組合選自A.CHOPP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；B.CHOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松；C.COP，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；D.CAP-BOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博來霉素、長春新堿和潑尼松；E.m-BACOD，即甲氨蝶呤、博來霉素、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、地塞米松和亞葉酸；F.ProMACE-MOPP，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；G.ProMACE-CytaBOM，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、阿糖胞苷、博來霉素和長春新堿；H.MACOP-B，即甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松、博來霉素和亞葉酸；I.MOPP，即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；J.ABVD，即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪；K.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABV即阿霉素/多柔比星、博來霉素和長春堿交替使用；L.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABVD即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪交替使用；M.ChIVPP，即苯丁酸氮芥、長春堿、丙卡巴肼和潑尼松；N.IMVP-16，即異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；O.MIME，即米托胍腙、異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；P.DHAP，即地塞米松、高劑量阿糖胞苷和順鉑；Q.ESHAP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷和順鉑；R.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；S.CAMP，即洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和潑尼松；T.CVP-1，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；U.ESHOP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷、長春新堿和順鉑；V.EPOCH，即依托泊苷、長春新堿和多柔比星給予96小時(shí)，同時(shí)給予快速濃注環(huán)磷酰胺和口服潑尼松；W.ICE，即異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺和依托泊苷；X.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；Y.CHOP-B.，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和博來霉素；和Z.P/DOCE，即表柔比星或多柔比星、長春新堿、環(huán)磷酰胺和潑尼松。
190.權(quán)利要求181的用途，其中在給予作為治療方案組成部分的一種或多種細(xì)胞毒性藥物組合之前，先給予治療有效量的所述單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述細(xì)胞毒性藥物組合選自A.CHOPP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；B.CHOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松；C.COP，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；D.CAP-BOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博來霉素、長春新堿和潑尼松；E.m-BACOD，即甲氨蝶呤、博來霉素、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、地塞米松和亞葉酸；F.ProMACE-MOPP，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；G.ProMACE-CytaBOM，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、阿糖胞苷、博來霉素和長春新堿；H.MACOP-B，即甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、固定劑量潑尼松、博來霉素和亞葉酸；I.MOPP，即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；J.ABVD，即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪；K.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABV即阿霉素/多柔比星、博來霉素和長春堿交替使用；L.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABVD即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪交替使用；M.ChIVPP，即苯丁酸氮芥、長春堿、丙卡巴肼和潑尼松；N.IMVP-16，即異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；O.MIME，即米托胍腙、異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；P.DHAP，即地塞米松、高劑量阿糖胞苷和順鉑；Q.ESHAP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷和順鉑；R.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；S.CAMP，即洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和潑尼松；T.CVP-1，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；U.ESHOP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷、長春新堿和順鉑；V.EPOCH，即依托泊苷、長春新堿和多柔比星給予96小時(shí)，同時(shí)給予快速濃注環(huán)磷酰胺和口服潑尼松；W.ICE，即異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺和依托泊苷；X.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；Y.CHOP-B.，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和博來霉素；和Z.P/DOCE，即表柔比星或多柔比星、長春新堿、環(huán)磷酰胺和潑尼松。
191.權(quán)利要求181的用途，其中在給予作為治療方案組成部分的一種或多種細(xì)胞毒性藥物組合之后，再給予治療有效量的所述單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物，其中所述生物活性劑組合選自A.CHOPP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；B.CHOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松；C.COP，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；D.CAP-BOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博來霉素、長春新堿和潑尼松；E.m-BACOD，即甲氨蝶呤、博來霉素、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、地塞米松和亞葉酸；F.ProMACE-MOPP，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；G.ProMACE-CytaBOM，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、阿糖胞苷、博來霉素和長春新堿；H.MACOP-B，即甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松、博來霉素和亞葉酸；I.MOPP，即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；J.ABVD，即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪；K.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABV即阿霉素/多柔比星、博來霉素和長春堿交替使用；L.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABVD即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪交替使用；M.ChIVPP，即苯丁酸氮芥、長春堿、丙卡巴肼和潑尼松；N.IMVP-16，即異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；O.MIME，即米托胍腙、異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；P.DHAP，即地塞米松、高劑量阿糖胞苷和順鉑；Q.ESHAP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷和順鉑；R.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；S.CAMP，即洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和潑尼松；T.CVP-1，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；U.ESHOP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷、長春新堿和順鉑；V.EPOCH，即依托泊苷、長春新堿和多柔比星給予96小時(shí)，同時(shí)給予快速濃注環(huán)磷酰胺和口服潑尼松；W.ICE，即異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺和依托泊苷；X.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；Y.CHOP-B.，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和博來霉素；和Z.P/DOCE，即表柔比星或多柔比星、長春新堿、環(huán)磷酰胺和潑尼松。
192.權(quán)利要求181的用途，其中治療有效量的所述單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物與一種針對(duì)在B細(xì)胞惡性腫瘤上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原的抗體一起給藥，并且任選包含作為治療方案組成部分的一種或多種細(xì)胞毒性藥物組合，其中所述細(xì)胞毒性藥物組合選自A.CHOPP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；B.CHOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松；C.COP，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；D.CAP-BOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博來霉素、長春新堿和潑尼松；E.m-BACOD，即甲氨蝶呤、博來霉素、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、地塞米松和亞葉酸；F.ProMACE-MOPP，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；G.ProMACE-CytaBOM，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、阿糖胞苷、博來霉素和長春新堿；H.MACOP-B，即甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松、博來霉素和亞葉酸；I.MOPP，即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；J.ABVD，即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪；K.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABV即阿霉素/多柔比星、博來霉素和長春堿交替使用；L.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABVD即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪交替使用；M.ChIVPP，即苯丁酸氮芥、長春堿、丙卡巴肼和潑尼松；N.IMVP-16，即異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；O.MIME，即米托胍腙、異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；P.DHAP，即地塞米松、高劑量阿糖胞苷和順鉑；Q.ESHAP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷和順鉑；R.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；S.CAMP，即洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和潑尼松；T.CVP-1，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；U.ESHOP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷、長春新堿和順鉑；V.EPOCH，即依托泊苷、長春新堿和多柔比星給予96小時(shí)，同時(shí)給予快速濃注環(huán)磷酰胺和口服潑尼松；W.ICE，即異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺和依托泊苷；X.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；Y.CHOP-B.，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和博來霉素；和Z.P/DOCE，即表柔比星或多柔比星、長春新堿、環(huán)磷酰胺和潑尼松。
193.權(quán)利要求43的單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物在制備用于治療增生性疾病的藥物中的用途。
194.權(quán)利要求193的用途，其中所述加利車霉素是γ加利車霉素或N-乙酰加利車霉素。
195.權(quán)利要求193的用途，其中所述增生性疾病是B細(xì)胞惡性腫瘤。
196.權(quán)利要求195的用途，其中所述B細(xì)胞惡性腫瘤是非霍奇金淋巴瘤。
197.權(quán)利要求193的用途，其中所述藥物任選包含一種或多種生物活性劑。
198.權(quán)利要求197的用途，其中所述生物活性劑選自抗體、生長因子、激素、細(xì)胞因子、抗激素、黃嘌呤、白介素、干擾素和細(xì)胞毒性藥物。
199.權(quán)利要求198的用途，其中所述生物活性劑是抗體。
200.權(quán)利要求199的用途，其中所述抗體針對(duì)在B細(xì)胞惡性腫瘤上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原。
201.權(quán)利要求200的用途，其中針對(duì)在B細(xì)胞惡性腫瘤上表達(dá)的細(xì)胞表面抗原的所述抗體選自抗CD19抗體、抗CD20抗體和抗CD33抗體。
202.權(quán)利要求202的用途，其中所述抗CD20抗體是利妥昔單抗。
203.權(quán)利要求198的用途，其中所述細(xì)胞因子或生長因子選自白介素2(IL-2)、TNF、CSF、GM-CSF和G-CSF。
204.權(quán)利要求198的用途，其中所述激素是類固醇激素并且選自雌激素、雄激素、孕酮和皮質(zhì)類固醇。
205.權(quán)利要求198的用途，其中所述細(xì)胞毒性藥物選自多柔比星、柔紅霉素、伊達(dá)比星、阿柔比星、佐柔比星、米托蒽醌、表柔比星、卡柔比星、諾拉霉素、美諾立爾、pitarubicin、戊柔比星、阿糖胞苷、吉西他濱、曲氟尿苷、安西他濱、依諾他濱、阿扎胞苷、去氧氟尿苷、噴司他丁、溴尿苷、卡培他濱、克拉曲濱、地西他濱、氟尿苷、氟達(dá)拉濱、谷氏菌素、嘌羅霉素、替加氟、噻唑呋林、阿霉素、順鉑、卡鉑、環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪、長春堿、長春新堿、米托蒽醌、博來霉素、氮芥、潑尼松、丙卡巴肼、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、依托泊苷、泰素、泰素類似物和絲裂霉素。
206.權(quán)利要求198的用途，其中所述細(xì)胞毒性藥物是選自以下的組合藥物A.CHOPP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；B.CHOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松；C.COP，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；D.CAP-BOP，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博來霉素、長春新堿和潑尼松；E.m-BACOD，即甲氨蝶呤、博來霉素、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、地塞米松和亞葉酸；F.ProMACE-MOPP，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；G.ProMACE-CytaBOM，即潑尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、依托泊苷、亞葉酸、阿糖胞苷、博來霉素和長春新堿；H.MACOP-B，即甲氨蝶呤、多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松、博來霉素和亞葉酸；I.MOPP，即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼；J.ABVD，即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪；K.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABV即阿霉素/多柔比星、博來霉素和長春堿交替使用；L.MOPP即氮芥、長春新堿、潑尼松和丙卡巴肼與ABVD即阿霉素/多柔比星、博來霉素、長春堿和達(dá)卡巴嗪交替使用；M.ChIVPP，即苯丁酸氮芥、長春堿、丙卡巴肼和潑尼松；N.IMVP-16，即異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；O.MIME，即米托胍腙、異環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤和依托泊苷；P.DHAP，即地塞米松、高劑量阿糖胞苷和順鉑；Q.ESHAP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷和順鉑；R.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；S.CAMP，即洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和潑尼松；T.CVP-1，即環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松；U.ESHOP，即依托泊苷、甲潑尼龍、高劑量阿糖胞苷、長春新堿和順鉑；V.EPOCH，即依托泊苷、長春新堿和多柔比星給予96小時(shí)，同時(shí)給予快速濃注環(huán)磷酰胺和口服潑尼松；W.ICE，即異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰胺和依托泊苷；X.CEPP(B)，即環(huán)磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、潑尼松和博來霉素；Y.CHOP-B.，即環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松和博來霉素；和Z.P/DOCE，即表柔比星或多柔比星、長春新堿、環(huán)磷酰胺和潑尼松。
全文摘要
描述了用于制備具有比用以前報(bào)道的方法顯著提高的載藥量及顯著減少的聚集和低綴合部分(LCF)的單體細(xì)胞毒性藥物/載體綴合物的方法。也描述了細(xì)胞毒性藥物衍生物/抗體綴合物、包含所述綴合物的組合物以及所述綴合物的用途。還描述了單體加利車霉素衍生物/抗CD22抗體綴合物、包含所述綴合物的組合物以及所述綴合物的用途。
文檔編號(hào)A61K47/38GK1665532SQ03815260
公開日2005年9月7日 申請日期2003年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月2日
發(fā)明者A·昆茲, J·K·莫蘭, J·T·拉比諾, N·雅因, E·J·維杜納斯, J·M·辛普森, P·D·羅賓斯, N·莫錢特, J·F·迪約瑟夫, M·E·魯彭, N·K·達(dá)姆勒, A·G·波普萊維爾 申請人:惠氏控股公司