專利名稱：表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
和背景本發(fā)明涉及表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子活性的分離的多核苷酸序列及其使用方法，更具體地講，涉及在內(nèi)皮細(xì)胞中表現(xiàn)出增加的活性和特異性的經(jīng)修飾的前內(nèi)皮縮血管肽原(preproendothelin)-1(PPE-1)啟動(dòng)子。本發(fā)明還涉及對(duì)PPE啟動(dòng)子的修飾，所述修飾增強(qiáng)其在對(duì)包括低氧和血管生成在內(nèi)的生理?xiàng)l件應(yīng)答時(shí)的表達(dá)。
血管生成是新血管的形成過程，在生理過程例如胚胎和產(chǎn)后發(fā)育以及創(chuàng)傷修復(fù)中起著重要的作用。血管的形成也可以由包括炎癥(例如糖尿病性視網(wǎng)膜病和關(guān)節(jié)炎)或腫瘤(例如癌癥)在內(nèi)的病理過程所誘導(dǎo)(Folkman，1985，Perspect，Biol.Med.，29，10)。
血管生成在低氧濃度(局部缺血和腫瘤轉(zhuǎn)移等)條件下發(fā)生，因此在新血管形成中可能是一個(gè)重要的環(huán)境因素。包括紅細(xì)胞生成素、轉(zhuǎn)鐵蛋白及其受體在內(nèi)的幾個(gè)基因、大多數(shù)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)和糖酵解途徑基因、LDH、PDGF-BB、內(nèi)皮縮血管肽-1(ET-1)、VEGF和VEGF受體的表達(dá)在低氧條件下被低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)與調(diào)節(jié)這些基因轉(zhuǎn)錄的低氧效應(yīng)元件(用HRE)的特異性結(jié)合所誘導(dǎo)。這些基因在低氧條件下的表達(dá)使細(xì)胞能夠在低氧條件下發(fā)揮作用。
血管生成過程受到由腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞分泌的血管生成生長(zhǎng)因子以及胞外基質(zhì)成分和內(nèi)皮酶活性的調(diào)節(jié)(Nicosia和Ottinetti，1990，Lab.Invest.，63，115)。在血管生成的初期，內(nèi)皮細(xì)胞長(zhǎng)芽通過現(xiàn)有血管的基底膜中的間隙出現(xiàn)(Nicosia和Ottinetti，1990，參見上文；Schoefl，1963，Virehous Arch，Pathol.Anat.337，97-141；Ausprunk和Folkman，1977，Microvasc.Res.14，53-65；Paku和Paweletz，1991，Lab.Invest.63，334-346)。當(dāng)新血管形成時(shí)，它們的基底膜經(jīng)歷復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和組成變化，這些變化被認(rèn)為會(huì)影響血管生成的反應(yīng)(Nicosia等，1994，ExpBiology.164，197-206)。
不平衡的血管生成以各種病理病癥為典型特征，通常支持病理狀態(tài)的發(fā)展。例如，在實(shí)體瘤中，血管內(nèi)皮細(xì)胞比正常組織的那些細(xì)胞的分裂速度快約35倍(Denekamp和Hobson，1982 Br.J.Cancer46711-20)。這樣的異常增殖是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移所必需的(Folkman，1986 Cancer Res.46467-73)。
血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖在慢性炎性疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬和滑膜炎中也是重要的，其中這些細(xì)胞在對(duì)炎癥部位釋放的生長(zhǎng)因子應(yīng)答時(shí)增殖(Brown和Weiss，1988，Ann.Rheum.Dis.47881-5)。
在動(dòng)脈粥樣硬化中，血管中內(nèi)皮細(xì)胞的單克隆擴(kuò)充可觸發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化病斑的形成(Alpern-Elran 1989，J.Neurosurg.70942-5)。此外，在糖尿病性視網(wǎng)膜病中，失明被認(rèn)為是由眼內(nèi)基底膜的變化所引起的，眼內(nèi)基底膜的變化刺激不受控制的血管生成和視網(wǎng)膜的消耗(West和Kumar，1988，Lancet 1715-6)。
內(nèi)皮細(xì)胞也參與移植排斥。在同種異體移植排斥發(fā)作時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)促粘附?jīng)Q定簇，指導(dǎo)白細(xì)胞運(yùn)輸?shù)揭浦膊课?。?jù)認(rèn)為，白細(xì)胞粘附分子對(duì)移植物中的內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)可以被局部釋放的細(xì)胞因子所誘導(dǎo)，已知在炎性損害時(shí)發(fā)生正是如此。
另一方面，消除的血管生成在疾病發(fā)生例如動(dòng)脈粥樣硬化誘發(fā)的冠狀動(dòng)脈阻塞(例如心絞痛)、意外損傷或手術(shù)后的壞死損害、或胃腸損害例如潰瘍中也是一個(gè)主要因素。
因此，調(diào)節(jié)或改變血管生成過程在限制該過程對(duì)潛在疾病狀態(tài)的病理進(jìn)行的貢獻(xiàn)以及提供研究其病因?qū)W的有價(jià)值的方法中可具有重要的治療作用。
最近，在開發(fā)內(nèi)皮調(diào)節(jié)劑(無論是設(shè)計(jì)為抑制性的還是刺激的)中已取得了顯著進(jìn)步。例如，將膠原包被的基質(zhì)中的αFGF蛋白給予成年大鼠腹膜腔內(nèi)，導(dǎo)致形成完全血管化和正常灌注結(jié)構(gòu)(Thompson等，PNAS 867928-7932，1989)。據(jù)報(bào)道，將βFGF蛋白注射到冠狀閉塞期間的成年狗冠狀動(dòng)脈中，導(dǎo)致心肌功能障礙緩解、心肌梗塞縮小和血管供應(yīng)增加(Yanagisawa-Miwa等，Science 2571401-1403，1992)。使用βFGF蛋白獲得的相似結(jié)果在心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭幸延袌?bào)道(Harada等，J Clin Invest 94623-630，1994，Unger等，Am J Physiol266H1588-H1595，1994)。
然而，對(duì)于長(zhǎng)期功能性血管的大量形成，需要重復(fù)或長(zhǎng)期給予上述蛋白因子，從而限制了它們?cè)谂R床中的應(yīng)用。此外，除與血管生成調(diào)節(jié)因子生產(chǎn)相關(guān)的高成本之外，這些因子的有效傳遞需要將導(dǎo)管植入冠狀動(dòng)脈內(nèi)，從而進(jìn)一步增加了治療的費(fèi)用和難度。
隨著對(duì)調(diào)節(jié)血管生成過程的新基因的鑒定，已嘗試用體細(xì)胞基因治療來克服這些缺陷。雖然為了開發(fā)癌癥、心血管疾病和外周血管疾病的基因療法進(jìn)行了大量研究，但是在有效而特異性的基因傳遞方面仍有很大的障礙。一般而言，用重組病毒載體作為穿梭載體、用目標(biāo)基因進(jìn)行基因治療的主要限制因素是目標(biāo)基因特異性地靶向靶組織的能力。事實(shí)上，非特異性基因打靶，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因的系統(tǒng)表達(dá)，從而導(dǎo)致產(chǎn)生若干問題。例如，VEGF是一種血管生成過程的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)劑，其系統(tǒng)表達(dá)已在局部缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭羞M(jìn)行了試驗(yàn)，并已進(jìn)行了臨床試驗(yàn)[Hammond，H.K.和McKirnan，M.D.Cardiovasc Res49，561-7.(2001)；Gowdak，L.H.等，Circulation 102，565-71.(2000)；Rosengart，T.K.等，Ann.Surg.230，466-70；discussion 470-2.(1999)。Simovic，D等，Arch Neurol 58，761-8.(2001)]。然而，由于表達(dá)的系統(tǒng)特性，治療的所有藥征都將面臨以下問題促進(jìn)動(dòng)脈粥樣化形成[Dulak J.(2001)J Am Coll Cardiol 382137-8；和Celletti FL等(2001)JAm Coll Cardiol 2126-30]和水腫[Harrigan MR等(2002)Neurosurgery50589-598；Funatsu H等，(2002)Am J Opthalmol 13370-7；ThicketDR(2001)Am J Respir Crit Care Med 1641601-5]、血管發(fā)育不成熟、超滲透性和退化[Benjamin，L.E等(1999)J Clin Invest 103159-65；Alon，T等Nat Med 11024-8.(1995)；Benjamin，L.E.等(1997)Proc Natl AcadSci USA 948761-6]。
因此，通過對(duì)血管內(nèi)皮的靶向基因治療來調(diào)節(jié)血管生成過程在誘導(dǎo)對(duì)這些疾病的有效治療方面可能是非常重要的。
幾種內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子在現(xiàn)有技術(shù)中已有描述。例如，Aird等[Proc.Natl.Acad.Sci.(1995)927567-571]分離出可以賦予組織特異性體內(nèi)表達(dá)的人von Willebrand因子基因的5′和3′調(diào)節(jié)序列。然而，這些序列僅可介導(dǎo)報(bào)道轉(zhuǎn)基因表達(dá)的一種不均一形式。在轉(zhuǎn)基因小鼠中處于von Willebrand調(diào)節(jié)元件的控制之下的細(xì)菌LacZ報(bào)道基因，揭示出轉(zhuǎn)基因在卵黃囊和成體腦內(nèi)皮細(xì)胞亞群中的表達(dá)。然而在脾臟、肺、肝臟、腎臟、心臟、睪丸和主動(dòng)脈的血管床以及在血栓調(diào)節(jié)蛋白基因座中沒有檢測(cè)到表達(dá)。
Korhonen J等[Blood(1995)961828-35]在小鼠胚胎血管系統(tǒng)中分離出促進(jìn)轉(zhuǎn)基因均勻表達(dá)的人和小鼠TIE基因啟動(dòng)子。然而，在成體中的表達(dá)僅限于肺和腎的血管，而在心臟、腦和肝臟中沒有檢測(cè)到表達(dá)。Schlaeger M等獲得了相似的結(jié)果，他們分離出TIE-2啟動(dòng)子的1.2kb 5′側(cè)翼區(qū)，并且表明轉(zhuǎn)基因的表達(dá)限于胚胎小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞[Schlaeger TM等(1995)Development 1211089-1098]。
因此，這些序列在所有發(fā)育階段或成年動(dòng)物的所有內(nèi)皮細(xì)胞中沒有一個(gè)序列是始終如一地起作用的。此外，這些序列的有些序列并不限于內(nèi)皮。
美國專利5,747,340公開了鼠PPE-1啟動(dòng)子及其部分的應(yīng)用。然而，該專利并沒有包括可以應(yīng)用內(nèi)皮特異性增強(qiáng)子來提高用PPE啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)的表達(dá)水平而同時(shí)保留內(nèi)皮特異性的暗示或提示。此外，該專利沒有公開在低氧條件下PPE-1啟動(dòng)子被誘導(dǎo)至較高的轉(zhuǎn)錄水平。
小鼠TIE-2基因的第一內(nèi)含子中的自主內(nèi)皮特異性增強(qiáng)子最近已有描述。TIE-2啟動(dòng)子與含有該增強(qiáng)子的內(nèi)含子片段的組合使其特異性地靶向報(bào)道基因表達(dá)，并且在胚胎發(fā)生和成熟期中都始終如一地靶向所有血管內(nèi)皮細(xì)胞[Schlaeger TM(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.943058-3063]。盡管如此，血管生成轉(zhuǎn)基因的表達(dá)以及該調(diào)節(jié)元件前景迄今為止尚未有描述。
雖然將本發(fā)明付諸實(shí)施，但是本發(fā)明人構(gòu)建并使用了一種參與血管生成的內(nèi)皮細(xì)胞中表現(xiàn)出意想不到的高比活的PPE-1啟動(dòng)子的新構(gòu)型。
由于本發(fā)明PPE-1啟動(dòng)子指導(dǎo)外源基因以內(nèi)皮細(xì)胞特異性方式高表達(dá)的能力，因此本發(fā)明PPE-1啟動(dòng)子，在本文將其稱為PPE-1-3X，能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮特異性過程。因此，處于本發(fā)明修飾啟動(dòng)子控制之下的血管生成調(diào)節(jié)因子可以在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用例如心血管系統(tǒng)的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用中用作強(qiáng)有力的體內(nèi)促血管生成工具或抗血管生成工具。
發(fā)明概述按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種在真核細(xì)胞中作為啟動(dòng)子起作用的分離的多核苷酸。所述分離的多核苷酸包括一個(gè)增強(qiáng)子元件，所述增強(qiáng)子元件包括至少兩個(gè)拷貝的SEQ ID NO6中所示的序列。
按照本發(fā)明的另一方面，提供一種在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)編碼活性RNA分子或諸如酶、報(bào)道分子等的蛋白質(zhì)的目標(biāo)核酸序列的方法。所述方法包括給予受治療者一種構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括處于在真核細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)控制之下的目標(biāo)核酸序列。所述構(gòu)建體還包括一個(gè)增強(qiáng)子元件，所述增強(qiáng)子元件包括至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO6中所示的序列。
按照本發(fā)明的再一方面，提供一種調(diào)節(jié)組織中血管生成的方法。所述方法包括給予一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包括(a)一個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子；(b)至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO5中所示的低氧效應(yīng)元件；和(c)一個(gè)編碼血管生成調(diào)節(jié)劑的核酸序列，所述核酸序列處于所述啟動(dòng)子和所述低氧效應(yīng)元件的調(diào)節(jié)控制之下。
按照本發(fā)明的又一方面，提供一種在真核細(xì)胞中作為啟動(dòng)子起作用的分離的多核苷酸。所述分離的多核苷酸包括一個(gè)增強(qiáng)子元件，所述增強(qiáng)子元件包括SEQ ID NO7中所示的序列。
按照本發(fā)明的另一方面，提供一種調(diào)節(jié)組織中血管生成的方法。所述方法包括給予一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包括(a)一個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子；(b)一個(gè)增強(qiáng)子元件，所述增強(qiáng)子元件包括在SEQ ID NO7中所示的序列；(c)至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO5中所示的低氧效應(yīng)元件；和(d)一個(gè)編碼血管生成調(diào)節(jié)劑的核酸序列，所述核酸序列處于所述啟動(dòng)子、所述增強(qiáng)子元件和所述低氧效應(yīng)元件的調(diào)節(jié)控制之下。
按照本發(fā)明的再一方面，提供一種在真核細(xì)胞中作為啟動(dòng)子起作用的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包括一個(gè)增強(qiáng)子元件，所述增強(qiáng)子元件包括至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO8中所示的序列。
按照本發(fā)明的再一方面，提供一種在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)目標(biāo)核酸序列的方法，所述方法包括給予受治療者一種構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包括所述目標(biāo)核酸序列和一個(gè)增強(qiáng)子元件，所述目標(biāo)核酸序列處于在真核細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)控制之下，所述增強(qiáng)子元件包括至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO8中所示的序列。
按照本發(fā)明的又一方面，提供一種在真核細(xì)胞中作為啟動(dòng)子起作用的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包括一個(gè)增強(qiáng)子元件，所述增強(qiáng)子元件包括在SEQ ID NO8中所示的序列。
按照以下描述的本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述增強(qiáng)子元件包括三個(gè)拷貝的SEQ ID NO6中所示的序列。
按照本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述至少兩個(gè)拷貝的SEQ ID NO6中所示的序列是相鄰的。
按照本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述分離的多核苷酸還包括一個(gè)內(nèi)皮特異性啟動(dòng)子元件。
按照本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述內(nèi)皮特異性啟動(dòng)子元件包括至少一個(gè)拷貝的所述PPE-1啟動(dòng)子。
按照本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述分離的多核苷酸還包括一個(gè)低氧效應(yīng)元件。
按照本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述低氧效應(yīng)元件包括至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO5中所示的序列。
按照本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述增強(qiáng)子元件如在SEQ ID NO7中所示。
按照本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，提供一種包括要求保護(hù)的分離多核苷酸和目標(biāo)核酸序列的核酸構(gòu)建體，所述目標(biāo)核酸序列處于所述分離的多核苷酸的調(diào)節(jié)控制之下。
按照本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述目標(biāo)核酸序列選自VEGF、p55和PDGF-BB以及其它生長(zhǎng)因子、促血管生成因子或細(xì)胞因子。
按照本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，提供一種用要求保護(hù)的分離的多核苷酸轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
按照本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述啟動(dòng)子表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞特異性。
按照本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述啟動(dòng)子是在SEQ IDNO1中所示的PPE-1啟動(dòng)子。
按照本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，通過選自以下的方法實(shí)現(xiàn)給藥(i)體內(nèi)系統(tǒng)給藥；(ii)離體給予從受治療者體內(nèi)取出的細(xì)胞，并且隨后將所述細(xì)胞再回輸給所述受治療者體內(nèi)；和(iii)體內(nèi)局部給藥。
按照本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述核酸構(gòu)建體還包括一個(gè)增強(qiáng)子元件，所述增強(qiáng)子元件包括至少兩個(gè)拷貝的SEQ IDNO6中所示的序列。
按照本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子包括至少一個(gè)拷貝的所述PPE-1啟動(dòng)子。
按照本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，提供一種包括要求保護(hù)的分離的多核苷酸和目標(biāo)核酸序列的核酸構(gòu)建體，所述目標(biāo)核酸序列處于所述分離的多核苷酸的調(diào)節(jié)控制之下。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述增強(qiáng)子元件還包括至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO6中所示的序列。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述增強(qiáng)子元件包括一個(gè)拷貝的SEQ ID NO8中所示的序列和至少兩個(gè)拷貝的SEQ ID NO6中所示的序列。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述增強(qiáng)子元件還包括至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO6中所示的序列。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述至少一個(gè)拷貝包括兩個(gè)拷貝。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述核酸構(gòu)建體還包括一個(gè)增強(qiáng)子元件，所述增強(qiáng)子元件包括至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO8中所示的序列。
按照本發(fā)明的再一方面，提供一種調(diào)節(jié)組織中血管生成的方法，所述方法包括給予一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包括(a)一個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子；(b)一個(gè)增強(qiáng)子元件，所述增強(qiáng)子元件包括至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO8中所示的序列；和(c)一個(gè)編碼血管生成調(diào)節(jié)劑的核酸序列，所述核酸序列處于所述啟動(dòng)子和所述增強(qiáng)子元件的調(diào)節(jié)控制之下。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述增強(qiáng)子元件還包括至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO6中所示的序列。
按照所述優(yōu)選實(shí)施方案中的其它特征，所述增強(qiáng)子元件包括一個(gè)拷貝的SEQ ID NO8中所示的序列和至少兩個(gè)拷貝的SEQ ID NO6中所示的序列。
本發(fā)明通過提供具有內(nèi)皮細(xì)胞特異性的改進(jìn)的分離的多核苷酸序列及其使用方法成功地克服了目前已知構(gòu)型的缺點(diǎn)。在序列方面的所述改進(jìn)使先前認(rèn)為不可行的治療各種各樣的疾病、失調(diào)和病癥的方法成為可行的方法。具體地說，所述改進(jìn)涉及對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的特異性增加、目標(biāo)序列的表達(dá)水平增加和包括局部缺血和血管生成在內(nèi)的病癥引起的誘導(dǎo)增加。
附圖簡(jiǎn)述本文僅通過實(shí)施例并參考附圖描述本發(fā)明?，F(xiàn)在具體地參考附圖的細(xì)節(jié)，著重強(qiáng)調(diào)的是，所顯示的詳細(xì)資料僅僅作為實(shí)施例，為了說明性地論述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，并且提供這些詳細(xì)資料是為了提供所認(rèn)為的對(duì)本發(fā)明的原理和構(gòu)思最有用和最容易理解的描述。在這方面，沒有試圖以比基本上理解本發(fā)明所必需的更為詳細(xì)的方式來說明本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，從附圖獲取的說明，使得在實(shí)踐中如何使本發(fā)明的所述幾種形式具體化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
在附圖中

圖1是一幅直方圖，說明使用B2B細(xì)胞系作為非內(nèi)皮對(duì)照，本發(fā)明的增強(qiáng)子元件對(duì)在牛內(nèi)皮細(xì)胞系和人內(nèi)皮細(xì)胞系中螢光素酶表達(dá)的影響。
圖2是一幅直方圖，說明腺病毒載體中的本發(fā)明啟動(dòng)子對(duì)各種細(xì)胞系中螢光素酶表達(dá)的內(nèi)皮特異性。
圖3A和3B是顯微照片，說明在BAEC細(xì)胞系中，在本發(fā)明Ad5PPE-1-3X和Ad5CMV對(duì)照構(gòu)建體控制之下的GFP表達(dá)。
圖4是在內(nèi)皮細(xì)胞和非內(nèi)皮細(xì)胞中由pACPPE-1-3Xp55、pACPPE-1-3X螢光素酶和pCCMVp55誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡百分率的直方圖。
圖5是一幅直方圖，說明將按照本發(fā)明的增強(qiáng)子元件導(dǎo)入啟動(dòng)子構(gòu)建體中對(duì)低氧應(yīng)答的影響。
圖6是一幅直方圖，說明將按照本發(fā)明的增強(qiáng)子元件導(dǎo)入腺病毒載體構(gòu)建體的啟動(dòng)子中對(duì)低氧應(yīng)答的影響。
圖7是一幅直方圖，說明將按照本發(fā)明的增強(qiáng)子元件導(dǎo)入啟動(dòng)子中對(duì)牛內(nèi)皮細(xì)胞系和人內(nèi)皮細(xì)胞系中表達(dá)水平的影響。
圖8是一幅直方圖，說明在注射含有或者內(nèi)皮啟動(dòng)子(PPE-1)或者對(duì)照(CMV)啟動(dòng)子的腺病毒構(gòu)建體后在各種器官中所觀察的報(bào)道基因的表達(dá)水平。
圖9A-B是兩張顯微照片，說明Ad5CMVGFP構(gòu)建體(圖9A)和Ad5PPE-1-GFP構(gòu)建體(圖9B)在注射所述構(gòu)建體的小鼠肝臟組織中的細(xì)胞表達(dá)。
圖10是一幅直方圖，說明將按照本發(fā)明的增強(qiáng)子元件導(dǎo)入啟動(dòng)子中對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞系和非內(nèi)皮細(xì)胞系中表達(dá)水平的影響。
圖11是一幅直方圖，說明將按照本發(fā)明的增強(qiáng)子元件導(dǎo)入啟動(dòng)子中對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞系和非內(nèi)皮細(xì)胞系中表達(dá)水平的影響。
圖12A-C是顯微照片，分別說明Ad5PPE-1-3XGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞、Ad5PPE-1GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞和Ad5CMVGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的GFP表達(dá)。
圖13A-B分別說明用moi-1的Ad5PPE-1-3XGFP和Ad5CMVGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的SMC中的GFP表達(dá)。
圖14A-B顯示在HeLa細(xì)胞中進(jìn)行的與圖13A-B的實(shí)驗(yàn)相似的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖15A-B顯示在HepG2細(xì)胞中進(jìn)行的與圖13A-B的實(shí)驗(yàn)相似的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖16A-B顯示在NSF細(xì)胞中進(jìn)行的與圖13A-B的實(shí)驗(yàn)相似的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖17A-B是顯微照片，說明在分別注射Ad5PPE-1GFP構(gòu)建體和Ad5PPE-1-3XGFP構(gòu)建體的小鼠血管內(nèi)襯的內(nèi)皮細(xì)胞中的GFP表達(dá)。
圖18A-C是顯微照片，說明得自經(jīng)注射的小鼠腎臟組織的結(jié)果。注射Ad5CMVGFP的小鼠(圖18A)、注射Ad5PPE-1GFP的小鼠(圖18B；在血管壁中可見略高的GFP表達(dá)；箭頭所指)和注射Ad5PPE-1-3XGFP的小鼠(圖18C)。
圖19A-C說明在脾組織切片上進(jìn)行的、與圖18A-C中描繪的實(shí)驗(yàn)相似的實(shí)驗(yàn)。
圖20A-D和20C’-D’說明注射鹽水的對(duì)照小鼠(圖20A)、注射Ad5CMVGFP的小鼠(圖20B)、注射Ad5PPE-1GFP的小鼠(圖20C)和注射Ad5PPE-1-3XGFP的小鼠(圖20D)的腫瘤轉(zhuǎn)移肺中的GFP表達(dá)?？笴d31免疫染色(圖20C’-20D’)證實(shí)在每種腫瘤轉(zhuǎn)移組織中GFP表達(dá)和CD31表達(dá)的共定位。
圖21是一幅直方圖，說明用含有鼠PPE-1啟動(dòng)子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BAEC中的螢光素酶活性(光單位/μg蛋白)當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞在低氧條件下孵育時(shí)明顯更高。
圖22是一幅與圖21相同的直方圖，不同的只是使用Ad5PPE-1Luc和Ad5CMVLuc。
圖23是一系列與圖22相同的直方圖，說明在不同細(xì)胞系中的低氧效應(yīng)。
圖24是一幅直方圖，說明本發(fā)明的3X序列對(duì)BAEC細(xì)胞中所述PPE-1低氧應(yīng)答的影響。細(xì)胞用Ad5PPE-1Luc和Ad5PPE-1-3Xluc轉(zhuǎn)導(dǎo)。
圖25是一幅直方圖，顯示在股動(dòng)脈結(jié)扎后PPE-1-Luc轉(zhuǎn)基因小鼠不同組織中的螢光素酶表達(dá)水平。
圖26A-B是結(jié)合本發(fā)明使用的構(gòu)建體的質(zhì)粒圖譜。
圖27A-F說明Ad5PPE-1-3XVEGF和Ad5CMVVEGF對(duì)小鼠局部缺血肢體的血液灌注和血管生成的影響。圖27A-D是結(jié)扎后21天捕獲的不同治療組小鼠局部缺血肢體的代表性超聲波(US)血管生成灌注影像。黃色信號(hào)代表強(qiáng)灌注。該影像的右側(cè)代表肢體的遠(yuǎn)端。圖27A-Ad5PPE-1-3XVEGF治療的小鼠；圖27B-Ad5CMVVEGF治療的小鼠；圖27C-對(duì)照，鹽水治療的小鼠；圖27D-對(duì)照，正常肢體。圖27E-F是直方圖，說明不同治療組US影像的平均信號(hào)強(qiáng)度(圖27E)；根據(jù)不同治療組中CD31+細(xì)胞/mm2的數(shù)目測(cè)定的平均毛細(xì)血管密度(圖27F)。
圖28是一幅直方圖，說明在用Ad5PPE-1Luc(空心條帶)和Ad5CMVLuc(實(shí)心條帶)轉(zhuǎn)導(dǎo)的增殖和靜息的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)中的螢光素酶活性。
圖29是一幅直方圖，說明在用Ad5PPE-1Luc轉(zhuǎn)導(dǎo)的BAEC在正常增殖期間、靜息狀態(tài)和加入VEGF后快速增殖期間的螢光素酶活性。
圖30A-B是直方圖，說明在正常注射Ad5PPE-1Luc和Ad5CMVLuc的C57BL/6小鼠主動(dòng)脈(圖30A)和肝臟(圖30B)中的螢光素酶活性(光單位/μg蛋白)。注射后1天(n＝13)、5天(n＝34)、14天(n＝32)、30天(n＝20)和90天(n＝11)測(cè)定活性。
圖31A-B是直方圖，說明在正常注射的BALB/C小鼠中注射Ad5PPE-1Luc(空心條帶)或Ad5CMVLuc(實(shí)心條帶)后5天(圖31A)和14天(圖31B)(n＝10，對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)而言)檢測(cè)的相對(duì)螢光素酶活性(光單位/μg蛋白)?；钚砸悦恐粍?dòng)物總體螢光素酶表達(dá)的百分率表達(dá)。
圖32是一幅描繪由ApoE缺陷型小鼠解剖的主動(dòng)脈通過Sudan-IV著色的現(xiàn)有技術(shù)影像。胸主動(dòng)脈含有較少的著紅色的動(dòng)脈粥樣硬化病變，而腹部包括許多著紅色的動(dòng)脈粥樣硬化病變。(摘自125I-HDL和125I-BSA的主動(dòng)脈粥樣硬化病變影像。A.Shaish等，Pathobiology-已提交待發(fā)表)。
圖33是一幅直方圖，說明給ApoE缺陷型小鼠系統(tǒng)注射Ad5PPE-1Luc(空心條帶；n＝12)或Ad5CMVLuc(實(shí)心條帶；n＝12)后5天檢測(cè)的絕對(duì)螢光素酶活性(光單位/μg蛋白)。從腹主動(dòng)脈觀測(cè)的螢光素酶活性相當(dāng)于高病變水平，而從胸部觀測(cè)的螢光素酶活性相當(dāng)于低病變水平。
圖34是一幅直方圖，說明給誘發(fā)傷口愈合的C57BL/6小鼠系統(tǒng)注射Ad5PPE-1Luc(實(shí)心條帶)或Ad5CMVLuc(空心條帶)后5天的絕對(duì)螢光素酶活性(光單位/μg蛋白)。
圖35是一幅直方圖，說明誘發(fā)Lewis肺癌的小鼠的正常肺、腫瘤轉(zhuǎn)移肺和原發(fā)性腫瘤中的螢光素酶活性。通過給原發(fā)性腫瘤膜型的背部和轉(zhuǎn)移瘤模型的爪墊注射D122-96細(xì)胞誘發(fā)Lewis肺癌。系統(tǒng)注射Ad5PPE-1Luc(n＝9；空心條帶)或Ad5CMVLuc(n＝12；實(shí)心條帶)后5天測(cè)量螢光素酶活性?；钚砸怨鈫挝?μg蛋白表示。
圖36A-D是顯微照片，說明在腫瘤內(nèi)注射Ad5PPE-1GFP后在帶有LLC的小鼠肺和腫瘤中的GFP表達(dá)和組織形態(tài)。將組織在OCT中冷凍，然后用冷凍切片機(jī)切成10μm厚的切片。所有照片都在放大25倍的情況下拍攝。圖36A-肺轉(zhuǎn)移腫瘤血管生成性血管中的GFP；圖36B-圖36aA中拍攝的切片的CD31抗體免疫染色；圖36C-原發(fā)性腫瘤血管中的GFP表達(dá)；圖36D-說明血管的C切片的相差顯微鏡照片。
圖37是一幅直方圖，說明注射Ad5CMVLuc，Ad5PPE-1Luc和Ad5PPE-1-3X-Luc誘發(fā)的Lewis肺癌的小鼠的正常肺和腫瘤轉(zhuǎn)移肺中的螢光素酶表達(dá)。通過給轉(zhuǎn)移瘤模型的爪墊注射D122-96細(xì)胞誘發(fā)Lewis肺癌。系統(tǒng)注射Ad5CMVLuc(n＝7；黑色條帶)、Ad5PPE-1Luc(n＝6；灰色條帶)或Ad5PPE-1-3XLuc(n＝13；褐色條帶)后5天測(cè)量螢光素酶活性?；钚砸怨鈫挝?μg蛋白表示。
圖38是一幅直方圖，說明注射Ad5CMV、Ad5PPE-1Luc和Ad5PPE-1(3X)誘發(fā)的Lewis肺癌的小鼠的正常肺和腫瘤轉(zhuǎn)移肺中以肝臟活性百分率表示的螢光素酶活性(其中肝臟中的活性為100％)。
圖39A-B是顯微照片，說明注射Ad5PPE-1-3X-GFP的LLC肺轉(zhuǎn)移腫瘤的小鼠中GFP表達(dá)(圖39A)和Cd31免疫染色(圖39B)的共定位。
圖40是一幅直方圖，說明股動(dòng)脈結(jié)扎后2天、5天、10天和18天和對(duì)照(未結(jié)扎動(dòng)物-第0天；n＝8，對(duì)于每組而言)的PPE-1螢光素酶轉(zhuǎn)基因小鼠肌肉(局部缺血和正常)中的螢光素酶活性(光單位/μg蛋白)。
圖41是一幅直方圖，說明股動(dòng)脈結(jié)扎后5天(n＝6)、10天(n＝6)和18天(n＝8)和對(duì)照(未結(jié)扎的動(dòng)物-第0天)的PPE-1螢光素酶轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟、肺和肌肉主動(dòng)脈(局部缺血和正常)中的螢光素酶活性(光單位/μg蛋白)。
圖42是一幅直方圖，說明在原發(fā)性腫瘤中注射Ad5CMVLuc(實(shí)心條帶)或Ad5PPE-1Luc(空心條帶)的LLC小鼠肝臟、肺和原發(fā)性腫瘤中檢測(cè)的螢光素酶活性(光單位/μg蛋白)。
圖43A-H是原位雜交影像，說明各種轉(zhuǎn)基因組織特異性表達(dá)或組成型表達(dá)的組織分布。圖43A-C說明用VEGF特異性反義探針對(duì)來自以下的來源的代表性局部缺血肌肉的原位雜交A，Ad5PPE-1-3XVEGF治療的小鼠；B，Ad5CMVVEGF治療的小鼠；C，鹽水治療的小鼠；D，Ad5CMVVEGF治療的小鼠的肝切片。箭頭表示正染色的細(xì)胞。圖43E-G說明用來自以下的來源的代表性局部缺血肌肉的PDGF-B特異性反義探針的原位雜交E，Ad5PPE-1-3XPDGF-B治療的小鼠；F，Ad5CMVPDGF-B治療的小鼠；G，鹽水治療的小鼠；H，Ad5CMVPDGF-B治療的小鼠的肝切片。
圖44A-B是直方圖，說明Ad5PPE-1-3XVEGF或Ad5CMVVEGF對(duì)小鼠局部缺血肢體血液灌注和血管生成的遠(yuǎn)期效應(yīng)。A，股動(dòng)脈結(jié)扎后50天，不同治療組US影像中的平均信號(hào)強(qiáng)度。B，股動(dòng)脈結(jié)扎后70天，根據(jù)不同治療組中CD31+細(xì)胞/mm2的數(shù)目測(cè)定的平均毛細(xì)血管密度。
圖45A-D是直方圖，說明Ad5PPE-1-3XPDGF-B對(duì)小鼠局部缺血肢體新血管形成的早期效應(yīng)和遠(yuǎn)期效應(yīng)。圖45A-B是通過US成象測(cè)定的平均灌注強(qiáng)度(45A，股動(dòng)脈結(jié)扎后30天；45B，股動(dòng)脈結(jié)扎后80天)。圖45C-D是根據(jù)不同治療組中CD31+細(xì)胞/mm2數(shù)目測(cè)定的平均毛細(xì)血管密度(45C，股動(dòng)脈結(jié)扎后35天；45D，股動(dòng)脈結(jié)扎后90天)。
圖46A-G說明使用單獨(dú)的PDGF-B和VEGF或者結(jié)合處于內(nèi)皮特異性啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)之下使用，血管生成療法對(duì)小鼠局部缺血肢體的新血管形成和血流的遠(yuǎn)期效應(yīng)。A，股動(dòng)脈結(jié)扎后80天，不同治療組US影像中的平均信號(hào)強(qiáng)度。B，股動(dòng)脈結(jié)扎后90天，根據(jù)不同治療組CD31+細(xì)胞/mm2數(shù)目測(cè)定的平均毛細(xì)血管密度。圖46C-G是股動(dòng)脈結(jié)扎后90天，募集到局部缺血肢體肌肉成熟血管內(nèi)的平滑肌細(xì)胞。平滑肌細(xì)胞用抗α-SMactin抗體進(jìn)行免疫染色(著紅色，X20)。C，Ad5PPE-1-3XPDGF-B治療的小鼠；D，聯(lián)合療法治療的小鼠；E，Ad5PPE-1-3XVEGF治療的小鼠；F，對(duì)照，Ad5PPE-1-3XGFP治療的小鼠；G，正常對(duì)側(cè)肢體(注意到僅大血管被染色)。
圖47說明動(dòng)脈結(jié)扎后50天，單獨(dú)的PDGF-B或與促血管生成因子VEGF聯(lián)用對(duì)小鼠局部缺血肢體血液灌注的影響。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述本發(fā)明屬于可用來可靠地將高水平的目標(biāo)序列表達(dá)靶向內(nèi)皮細(xì)胞、尤其是參與血管生成的內(nèi)皮細(xì)胞的改進(jìn)的內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。
參考附圖和所附說明書，可以更好地理解本發(fā)明的原理和應(yīng)用。
在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案之前，不用說本發(fā)明不限于其在以下描述中敘述的或在實(shí)施例和附圖中說明的組分構(gòu)建和布置細(xì)節(jié)的應(yīng)用。本發(fā)明允許以各種方式實(shí)施或進(jìn)行其它實(shí)施方案或者以各種方式實(shí)施或進(jìn)行本發(fā)明。另外，不用說本文所用的短語和術(shù)語僅用于說明目的，不應(yīng)認(rèn)為是限制性的。
雖然內(nèi)皮特異性啟動(dòng)子先前已有描述(例如美國專利5,747,340)，但是這些啟動(dòng)子在將表達(dá)靶向內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)通常是無效的，或者尚未證明在體內(nèi)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞是特異性的。
內(nèi)皮細(xì)胞特異性增強(qiáng)子元件也有描述。Bu等(J.Biol Chem.(1997)272(19)32613-32622)已證明，三個(gè)拷貝(3X)的PPE-1的1X增強(qiáng)子元件(含有元件ETE-C、ETE-D和ETE-E)在體外給啟動(dòng)子序列賦予內(nèi)皮細(xì)胞特異性，然而，這樣的特異性尚未在體內(nèi)得到證實(shí)。
正如本領(lǐng)域眾所周知的，體外實(shí)驗(yàn)不能可靠地預(yù)測(cè)體內(nèi)結(jié)果。因此，Bu等給出的結(jié)果，盡管提示有內(nèi)皮細(xì)胞特異性，但是沒有提供足夠的證據(jù)證明3X增強(qiáng)子元件的體內(nèi)效用。
體內(nèi)研究的缺乏也帶來所述3X增強(qiáng)子元件在整個(gè)生物體內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞特異性的問題。該數(shù)據(jù)的缺乏暗示該元件的治療應(yīng)用也成問題，因?yàn)楫?dāng)在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)，尤其是當(dāng)用來調(diào)節(jié)血管生成時(shí)，將血管生成調(diào)節(jié)劑(例如細(xì)胞毒素)的表達(dá)特異性地靶向內(nèi)皮細(xì)胞、最好是參與血管生成的特定內(nèi)皮細(xì)胞亞群是必不可少的。
正如以下實(shí)施例部分所證明的，本發(fā)明人通過繁復(fù)的實(shí)驗(yàn)首先提供了關(guān)于所述3X增強(qiáng)子元件體內(nèi)活性的真憑實(shí)據(jù)。這樣的證據(jù)鑒定出非常適合用于治療應(yīng)用的3X元件及其序列衍生物(例如SEQ IDNO7)。
另外，在將本發(fā)明付諸實(shí)施時(shí)，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明PPE-1增強(qiáng)子序列的新構(gòu)型給啟動(dòng)子序列賦予在參與血管生成的內(nèi)皮細(xì)胞中的意外高比活。
因此，按照本發(fā)明的一方面，提供一種在哺乳動(dòng)物諸如人類中作為內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子起作用的分離的多核苷酸。
所述分離的多核苷酸包括一個(gè)增強(qiáng)子元件，所述增強(qiáng)子元件包括一個(gè)或多個(gè)拷貝的SEQ ID NO6中所示的序列和優(yōu)選一個(gè)或多個(gè)拷貝的SEQ ID NO8中所示的序列，正如在以下的實(shí)施例部分說明的，所述增強(qiáng)子元件在調(diào)節(jié)參與血管生成的內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)方面起重要作用。
本發(fā)明可使用的增強(qiáng)子元件的一個(gè)具體的新序列構(gòu)型示于SEQID NO7中。
對(duì)于本說明書和所附的權(quán)利要求書而言，術(shù)語“增強(qiáng)子”是指提高啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄效率的任何多核苷酸序列。
按照本發(fā)明的某些實(shí)施方案，所述分離的多核苷酸包括SEQ IDNO6和/或SEQ ID NO8的連續(xù)拷貝。這樣的序列最好以頭尾相接的方向排列，盡管本發(fā)明的增強(qiáng)子元件也可以反方向包括一個(gè)或多個(gè)拷貝的SEQ ID NO6或SEQ ID NO8序列的特定部分，例如在增強(qiáng)子元件的構(gòu)建中通過使用與SEQ ID NO6或SEQ ID NO8互補(bǔ)的序列。
所述分離的多核苷酸最好還包括一個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子序列元件。對(duì)于本說明書和所附的權(quán)利要求書而言，術(shù)語“啟動(dòng)子”是指能夠介導(dǎo)下游目標(biāo)序列的RNA轉(zhuǎn)錄的任何多核苷酸序列。所述內(nèi)皮特異性啟動(dòng)子元件可以包括例如至少一個(gè)拷貝的PPE-1啟動(dòng)子。
所述分離的多核苷酸最好還包括一個(gè)低氧效應(yīng)元件，例如至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO5中所示的序列。
因此，按照本發(fā)明的該方面，提供一種包括各種增強(qiáng)子元件構(gòu)型的內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。
人們將會(huì)認(rèn)識(shí)到，所述增強(qiáng)子元件序列可以位于所用的啟動(dòng)子序列內(nèi)、所述啟動(dòng)子的上游、所述啟動(dòng)子和下游目標(biāo)序列之間或者位于目標(biāo)序列內(nèi)(例如內(nèi)含子)。
本發(fā)明的分離的核酸序列可以用來調(diào)節(jié)真核組織、尤其是增殖中的內(nèi)皮細(xì)胞例如參與血管生成的內(nèi)皮細(xì)胞中的基因表達(dá)。
因此，在某些情況下，可以提供作為核酸構(gòu)建體部分的本發(fā)明分離的多核苷酸序列，所述核酸構(gòu)建體還包括處于本發(fā)明的分離的多核苷酸的調(diào)節(jié)控制之下的目標(biāo)核酸序列。人們將會(huì)認(rèn)識(shí)到，這樣一種核酸構(gòu)建體還可以包括任何額外的多核苷酸序列，例如編碼選擇標(biāo)記的序列、細(xì)菌中的復(fù)制起點(diǎn)或編碼報(bào)道多肽的序列。這樣一種核酸構(gòu)建體最好構(gòu)建用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)并且可以來源于病毒。適用于哺乳動(dòng)物表達(dá)的核酸構(gòu)建體的許多實(shí)例是本領(lǐng)域已知的；以下的實(shí)施例部分提供幾種這類構(gòu)建體的進(jìn)一步詳細(xì)描述。
對(duì)于本說明書和所附的權(quán)利要求書而言，術(shù)語“目標(biāo)序列”是指能夠被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的任何多核苷酸序列。該定義包括可翻譯成多肽的編碼序列以及反義RNA、結(jié)合DNA的RNA、核酶和肯定不會(huì)經(jīng)歷翻譯的其它分子部分的序列。下文以及在以下的實(shí)施例部分提供了可以為按照本發(fā)明的構(gòu)建體所使用的目標(biāo)核酸序列的多個(gè)實(shí)施例。
下文敘述的實(shí)施例說明，本發(fā)明改進(jìn)的內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子在體內(nèi)系統(tǒng)給予后可以可靠地將報(bào)道基因的表達(dá)靶向內(nèi)皮組織。這些實(shí)施例首次進(jìn)一步說明本發(fā)明的分離的多核苷酸可以用來優(yōu)先在局部缺血組織和/或血管生成性組織中表達(dá)報(bào)道蛋白(GFP)，從而首次提供關(guān)于所述PPE-1增強(qiáng)子元件及其衍生物在治療應(yīng)用中重要性的直接證據(jù)。
雖然諸如GFP的報(bào)道蛋白的應(yīng)用可以用于轉(zhuǎn)移性腫瘤生長(zhǎng)早期的檢測(cè)，尤其是在動(dòng)物模型中或檢測(cè)轉(zhuǎn)移瘤的非侵入性成象(Yang，M.等，Proc.Nat.Acad.of Sci.(2001)272616-2621)方面，但是這樣的應(yīng)用僅是要求保護(hù)的本發(fā)明的計(jì)劃用途中的一小部分。認(rèn)為例如AdPPE-1GFP可以與AdPPEltk、AdPPE-1p55和/或其它抗血管生成性治療聯(lián)合使用，以便通過相對(duì)非侵入性方法跟蹤和治療血管生成。
預(yù)計(jì)在例如AdPPE-1-3X-p55構(gòu)建體中用凋亡誘導(dǎo)因子(例如p55；GenBank登記號(hào)M75866)取代GFP報(bào)道基因，會(huì)將凋亡信號(hào)可靠地靶向生長(zhǎng)中腫瘤的血管生成性血管中正在快速增殖的內(nèi)皮細(xì)胞。因?yàn)檫@種載體可以系統(tǒng)給予，所以可以用其在發(fā)展中的轉(zhuǎn)移瘤病灶中有效地誘導(dǎo)凋亡，而無需發(fā)現(xiàn)那些病灶的部位。這樣的應(yīng)用代表與現(xiàn)有技術(shù)的作法相比的顯著改進(jìn)。通過在正在發(fā)育的血管系統(tǒng)中特異性地誘導(dǎo)凋亡，有可能消除血管生成。
可以用一種相反的方法來例如在動(dòng)脈粥樣硬化患者或患有由于疾病或損傷引起的外周循環(huán)明顯削弱的患者中使組織重新進(jìn)行血管形成。在這種情況下，可以使用AdPPE-1-3X-GF型構(gòu)建體，其中GF為生長(zhǎng)因子(例如細(xì)胞因子)或其修飾物(例如AdPPE-1-SEQ ID NO7-GF)?？晒┰摲矫媸褂玫暮线m生長(zhǎng)因子包括但不限于VEGF(GenBank登記號(hào)M95200)和大鼠PDGF-BB(GenBank accession；與mus-AF162784有99％同一性)和EGR-1(GenBank登記號(hào)M22326)FGFs(包括但不限于GenBank登記號(hào)XM 003306)和它們的組合。
人們將會(huì)認(rèn)識(shí)到，為避免已顯示與給予單獨(dú)的VEGF相關(guān)的血管不成熟和血管退化等問題，按照本發(fā)明該方面可優(yōu)選使用不止一種血管生成因子(有關(guān)進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參見實(shí)施例部分的實(shí)施例22和實(shí)施例26)。聯(lián)合療法可以模擬內(nèi)皮通道出芽的初期階段及隨后募集平滑肌細(xì)胞以穩(wěn)定新生血管[Richardson DM等(2001)Nat.Biotechnol.191029-1034]。按照本發(fā)明該方面的聯(lián)合療法可以通過克隆相同核酸構(gòu)建體上的目標(biāo)多核苷酸來實(shí)施，其中每個(gè)目標(biāo)多核苷酸都處于本發(fā)明的分離的核酸的調(diào)節(jié)之下。另一方面，或者優(yōu)選可以將每個(gè)目標(biāo)多核苷酸獨(dú)立克隆到本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中，從而使得可以對(duì)誘導(dǎo)型血管生成過程進(jìn)行更嚴(yán)格的調(diào)節(jié)。
將低氧效應(yīng)元件(例如SEQ ID NO5)摻入本發(fā)明的啟動(dòng)子序列中，可以用來進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)局部缺血組織的表達(dá)選擇性，因而導(dǎo)致所選組織的新血管形成。由于血液供應(yīng)得到改善，因此局部缺血得以緩解，低氧效應(yīng)元件的誘導(dǎo)停止，GF水平下降和新血管形成過程停止。
按照本發(fā)明公開內(nèi)容產(chǎn)生的啟動(dòng)子序列尤其可用來調(diào)節(jié)組織中的血管生成。正如以下實(shí)施例部分所說明的，含有本發(fā)明啟動(dòng)子序列的經(jīng)修飾的3X(SEQ.ID.NO7)和未經(jīng)修飾的PPE-1啟動(dòng)子都可在LLC模型的轉(zhuǎn)移瘤病灶中表達(dá)。然而，實(shí)施例22清楚地說明，經(jīng)修飾的3X序列特異性引起正常肺中報(bào)道基因表達(dá)水平的降低，同時(shí)特異性引起轉(zhuǎn)移瘤病灶中報(bào)道基因表達(dá)的顯著增加。在現(xiàn)有技術(shù)中既沒有暗示也沒有提示可以得到這樣的結(jié)果。因此，可以預(yù)期在基因治療方面應(yīng)用包括所述3X元件的構(gòu)建體使至腫瘤的傳遞最大化，而對(duì)周圍正常組織的毒性效應(yīng)減至最低。重要的是，如圖37所示，即使周圍組織含有內(nèi)皮成分，其情況也是如此。如實(shí)施例11所證明的，這是因?yàn)樗?X序列大大提高在快速增殖的內(nèi)皮組織中的表達(dá)水平，甚至在位于PPE-1啟動(dòng)子鄰近序列中的情況下也是如此。
例如，p55基因可以結(jié)合含有低氧效應(yīng)元件的本發(fā)明啟動(dòng)子使用，以便特異性地誘導(dǎo)生長(zhǎng)中腫瘤的凋亡。因?yàn)樯L(zhǎng)中的腫瘤塊往往由于腫瘤生長(zhǎng)常常超過周圍組織的血管生成能力而局部缺血，所以認(rèn)為這種策略是可行的?？梢耘c本發(fā)明啟動(dòng)子序列一起使用以便特異性地減小腫瘤塊的其它可表達(dá)細(xì)胞毒素包括但不限于其它促凋亡基因(proapoptotic genes)、單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk；包括在pORF-HSV1tk表達(dá)載體中，可得自InvivoGen，San Diego，CA)、制管張素(Genbank登記號(hào)X05199)、內(nèi)皮生長(zhǎng)抑素(endostatin)(Genbank登記號(hào)M33272)和制管張素-內(nèi)皮生長(zhǎng)抑素嵌合體(包括在pORF-HSV1tk表達(dá)載體中，可得自InvivoGen，San Diego，CA)。
或者，或另外，可以將制管張素基因或內(nèi)皮生長(zhǎng)抑素基因與本發(fā)明啟動(dòng)子結(jié)合使用，以便特異性地阻斷血管生成，而無需誘導(dǎo)凋亡。
因此，按照可供選擇的優(yōu)選實(shí)施方案，可以刺激或阻斷血管生成。這一靈活性將會(huì)允許本發(fā)明可變化的應(yīng)用，包括但不限于減少腫瘤塊和心臟動(dòng)脈粥樣硬化區(qū)的重新血管形成或者血液供應(yīng)不足的周圍組織的新血管形成。一個(gè)相關(guān)臨床方案是應(yīng)用按照本發(fā)明的啟動(dòng)子產(chǎn)生新血管，以增加糖尿病患者肢體的血液供應(yīng)。
可以將按照本發(fā)明的核酸構(gòu)建體本身或者以其中所述核酸構(gòu)建體與合適的載體或賦形劑混合的藥用組合物形式將所述核酸構(gòu)建體給予受治療者(哺乳動(dòng)物，最好是人類)。
本文所用的“藥用組合物”是指此中描述的一種或多種有效成分與其它化學(xué)成分諸如生理上合適的載體和賦形劑的制劑。藥用組合物的目的是為了便于將化合物給予生物體。
本文的術(shù)語“有效成分”是指負(fù)責(zé)所述生物學(xué)效應(yīng)的核酸構(gòu)建體。
在下文，短語“生理上可接受的載體”和“藥學(xué)上可接受的載體”可互換使用，是指對(duì)生物體不引起顯著刺激并且不消除所給予化合物的生物活性和特性的載體或稀釋劑。這些短語包括輔料。
本文的術(shù)語“賦形劑”是指添加到藥用組合物中以進(jìn)一步促進(jìn)有效成分給予的惰性物質(zhì)。賦形劑的實(shí)例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和各種類型的淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。
配制和給予藥物的技術(shù)可以在以下文獻(xiàn)中找到“Remington’sPharmaceutical Sciences，”Mack Publishing Co.，Easton，PA，最新版，所述文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。
本發(fā)明的藥用組合物可以通過本領(lǐng)域熟知的方法來生產(chǎn)，所述方法例如常規(guī)混合、溶解、制粒、制糖錠、研磨、乳化、裝膠囊、包合(entrapping)或凍干方法。
因此，可供按照本發(fā)明使用的藥用組合物可以以常規(guī)方法使用一種或多種包括賦形劑和輔料在內(nèi)的生理上可接受的載體來配制，所述載體有助于將有效成分加工成為可以藥用的制劑中。適宜的制劑取決于所選的給藥途徑。
對(duì)于注射，所述藥用組合物的有效成分可以配制在水溶液中、最好在生理上相容的緩沖液例如Hank氏溶液、Ringer氏溶液或生理鹽水緩沖液中。對(duì)于經(jīng)粘膜給藥，在制劑中可以使用適合待穿過的屏障的滲透劑。這類滲透劑是本領(lǐng)域眾所周知的。
人們將會(huì)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的分離的多核苷酸已基于其促進(jìn)或增強(qiáng)內(nèi)皮譜系的真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的能力分離出來。因此，用要求保護(hù)的分離的多核苷酸轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是本發(fā)明的另一實(shí)施方案。這類轉(zhuǎn)化細(xì)胞的多個(gè)實(shí)施例在下文敘述的實(shí)施例中提供。
盡管下文提供的實(shí)施例具體涉及3X序列與PPE-1啟動(dòng)子的結(jié)合使用，但是預(yù)期本發(fā)明的增強(qiáng)子序列當(dāng)與其它真核啟動(dòng)子序列一起使用時(shí)也將會(huì)發(fā)揮其細(xì)胞特異性效應(yīng)。
這樣的預(yù)期基于現(xiàn)有技術(shù)的以下發(fā)現(xiàn)已表明增強(qiáng)子元件常常是可移動(dòng)的，即它們可以從一個(gè)啟動(dòng)子序列轉(zhuǎn)移至另一個(gè)不相關(guān)的啟動(dòng)子序列并且仍然保持活性。例如參見D.Jones等(Dev.Biol.(1995)171(1)60-72)；N.S.Yew等(Mol.Ther.(2001)475-820)和L.Wu.等(Gene Ther.(2001)8；1416-26)。事實(shí)上，Bu等的早期研究(J.Biol Chem.(1997)272(19)32613-32622)強(qiáng)烈地提示，與本發(fā)明的增強(qiáng)子例如包括SEQ ID NO6的增強(qiáng)子相關(guān)的增強(qiáng)子元件可以與組成型啟動(dòng)子例如SV-40啟動(dòng)子一起使用。因此，含有包括經(jīng)修飾以包括本發(fā)明的增強(qiáng)子序列的真核啟動(dòng)子的分離的多核苷酸的構(gòu)建體、其使用方法和所述分離的多核苷酸也在要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。
因此，假定按照本發(fā)明的增強(qiáng)子元件的一種最小構(gòu)型是如SEQ IDNO8中所示的分離的多核苷酸。預(yù)期該增強(qiáng)子與各種各樣的啟動(dòng)子一起發(fā)揮作用，所述啟動(dòng)子包括但不限于內(nèi)皮特異性啟動(dòng)子(例如PPE-1；SEQ ID NO.1)和組成型啟動(dòng)子例如病毒啟動(dòng)子諸如來源于CMV和SV-40的病毒啟動(dòng)子。該增強(qiáng)子應(yīng)該能夠給各種各樣的啟動(dòng)子賦予內(nèi)皮特異性。例如通過添加一個(gè)或多個(gè)拷貝的SEQ ID NO6中所示的序列，可以增大所述增強(qiáng)子元件?？梢詫⑦@些額外的序列連續(xù)或不連續(xù)加入到SEQ ID NO.8的序列中。
本發(fā)明還包括一種應(yīng)用構(gòu)建體在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)目標(biāo)核酸序列的方法，所述構(gòu)建體依賴于包括至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO8中所示序列在內(nèi)的增強(qiáng)子元件和啟動(dòng)子，以將高水平的目標(biāo)序列表達(dá)特異性地靶向內(nèi)皮細(xì)胞。
本文所用的“對(duì)從受治療者體內(nèi)取出的細(xì)胞離體給藥并隨后將所述細(xì)胞再回輸給所述受治療者體內(nèi)”具體包括干細(xì)胞的應(yīng)用，如在(Lyden等(2001)Nature Medicine 71194-1201)中所描述的。
盡管在下文給出的實(shí)施例中描述的實(shí)驗(yàn)中使用腺病毒，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地使本發(fā)明的構(gòu)建體適合于其它病毒傳遞系統(tǒng)。
含有所述內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子的病毒載體也可以與其它增強(qiáng)所述病毒載體的打靶等方面聯(lián)合使用。這樣的方法包括短肽配體和/或雙特異性或雙功能性分子或雙功能抗體(diabodies)[Nettelbeck等，Molecular Therapy 3882；2001]。
在檢查以下非限制性實(shí)施例后，本發(fā)明的其它目的、優(yōu)點(diǎn)和新特征對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。另外，上文敘述的和所附權(quán)利要求書部分要求保護(hù)的本發(fā)明各種實(shí)施方案和方面的每個(gè)都會(huì)在以下實(shí)施例中找到實(shí)驗(yàn)的支持。
實(shí)施例現(xiàn)在參考以下實(shí)施例，連同以上的描述一起，以非限制性方式說明本發(fā)明。
一般而言，本文所用的命名法以及本發(fā)明中所用的實(shí)驗(yàn)方法包括分子技術(shù)、生物化學(xué)技術(shù)、微生物學(xué)技術(shù)和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳盡的解釋。參見例如“Molecular CloningAlaboratory Manual”Sambrook等，(1989)；“Current Protocols in MolecularBiology”第I-III卷Ausubel，R.M.編著(1994)；Ausubel等，“CurrentProtocols in Molecular Biology”，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to Molecular Cloning”，JohnWiley & Sons，New York(1988)；Watson等，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，New York；Birren等(編著)“GenomeAnalysisA Laboratory Manual Series”，第1-4卷，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(1998)；在美國專利第4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659和5,272,057號(hào)中敘述的方法；“CellBiologyA Laboratory Handbook”，第I-III卷Cellis，J.E.編著(1994)；“Current Protocols in Immunology”第I-III卷Coligan J.E.編著(1994)；Stites等(編著)，“Basic and Clinical Immunology”(第8版)，Appleton &Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(編著)，“Selected Methodsin Cellular Immunology”，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；可利用的免疫測(cè)定在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中有全面的描述，參見例如美國專利第3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771和5,281,521號(hào)；“OligonucleotideSynthesis”Gait，M.J.編著(1984)；“Nucleic Acid Hybridization”Hames，B.D.和Higgins S.J.編著(1985)；“Transcription and Translation”Hames，B.D.和Higgins S.J.編著(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney，R.I.編著(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press，(1986)；“APractical Guide to Molecular Cloning”Perbal，B.，(1984)和“Methods inEnzymology”第1-317卷，Academic Press；“PCR ProtocolsA Guide ToMethods And Applications”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等，“Strategies for Protein Purification and Characterization-ALaboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；所有所述文獻(xiàn)通過引用如同全文敘述一樣結(jié)合到本文中。其它通用參考文獻(xiàn)在該文獻(xiàn)中提供。據(jù)認(rèn)為其中的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，僅為方便讀者而提供。其中所包括的所有信息通過引用結(jié)合到本文中。
具體地說，結(jié)合下文敘述的實(shí)施例進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)使用以下方法和材料方法和材料細(xì)胞培養(yǎng)讓Lewis肺癌細(xì)胞-(D122-96)、人胚腎細(xì)胞(293)和HeLa細(xì)胞在補(bǔ)充10％胎牛血清(FCS)、50U/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素和2mM谷氨酰胺的4.5gr/l DMEM(Biological industries，Beit-Haemek，Israel)中生長(zhǎng)。讓牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞-BAEC、正常皮膚成纖維細(xì)胞-NSF、HepG2和人臍內(nèi)皮細(xì)胞-HUVEC-304(ATCC，USA)在補(bǔ)充5％FCS、50U/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素和2mM谷氨酰胺的1.0gr/l DMEM(Biological industries，Beit-Haemek，Israel)中生長(zhǎng)。給BAEC細(xì)胞補(bǔ)充完全成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Sigma，St.Louis.MO.)。讓RINrl046-38(RIN-38)在補(bǔ)充5％FCS(Biological Industries，Beit-Haemek，Israel)、50U青霉素/ml、50μg鏈霉素/ml和2mM谷氨酰胺的199Earle氏鹽(5.5mM葡萄糖)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
本文所用的“HepG2”是指ATCC-HB-8065。
本文所用的“HeLa”是指ATCC-CCL-2。
本文所用的“人支氣管上皮細(xì)胞”和“B2B”是指ATCC-CRL-9609。
本文所用的“HUVEC”和“人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞”是指ATCC-CRL-1730。
本文所用的“CHO”和“中國倉鼠卵巢”是指ATCC-61。
低氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)后26小時(shí)，將細(xì)胞在一個(gè)獨(dú)立小室中孵育，用含有用N2平衡的0.5％O2、5％CO2的氣流洗滌30分鐘。將該獨(dú)立小室置于5％CO2、37℃濕潤培養(yǎng)箱中。
細(xì)胞和組織中的螢光素酶活性為了定量測(cè)定PPE-1啟動(dòng)子的體外和體內(nèi)活性，使用螢光素酶基因表達(dá)系統(tǒng)試劑盒(Promega Corp.，Madison，WI)。轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時(shí)，洗滌細(xì)胞，然后加入200μl裂解緩沖液達(dá)15分鐘。收集細(xì)胞裂解液，于4℃離心15分鐘(14,000rpm)。隨后，加入10μl上清液至50μl螢光素酶測(cè)定緩沖液中。在發(fā)光計(jì)中測(cè)量20秒內(nèi)的所述活性。
為了測(cè)定實(shí)體組織中的螢光素酶活性，切取20mg樣品，在1ml勻漿溶液中勻漿，于4℃離心15分鐘(14,000rpm)，如上所述測(cè)定10ml上清液中的螢光素酶活性。結(jié)果以螢光素酶光單位/μg蛋白表示。采用Bradford測(cè)定，用牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)量蛋白質(zhì)。
體外和體內(nèi)的GFP活性為了測(cè)試GFP的體外表達(dá)，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，然后將其在新鮮制備的4％低聚甲醛的PBS溶液中固定30分鐘。固定后，通過熒光顯微鏡術(shù)進(jìn)行檢查。
為了測(cè)試所傳遞基因的體內(nèi)細(xì)胞分布，將組織在新鮮制備的含4％低聚甲醛的0.1M磷酸緩沖液中于4℃固定6小時(shí)，在30％蔗糖中于4℃浸泡過夜，然后在OCT化合物(Sakura，USA)中冷凍。用冷凍切片機(jī)將組織塊切成10μm厚的切片，然后直接在熒光顯微鏡(FITC濾光片)下觀察。
增殖細(xì)胞和靜息細(xì)胞為了比較增殖和靜息BAEC中的PPE-1啟動(dòng)子活性，將細(xì)胞分成兩組1.增殖細(xì)胞一在10％FCS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并有感染力的。2.靜息細(xì)胞-轉(zhuǎn)導(dǎo)前72小時(shí)內(nèi)開始在無血清培養(yǎng)基生長(zhǎng)中而有感染力的。讓所有細(xì)胞在5％CO2、37℃濕潤培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。
重組復(fù)制缺陷型腺病毒的制備構(gòu)建若干重組復(fù)制缺陷型腺病毒(5型)。包括鼠前內(nèi)皮縮血管肽原-1(PPE-1)啟動(dòng)子(SEQ ID NO1)的表達(dá)盒位于螢光素酶基因(來源于pGL2-basic GenBank登記號(hào)X65323)上游，將SV40 polyA位點(diǎn)(來源于pGL2-basic GenBank登記號(hào)X65323)連接到pPAC.plpA(無啟動(dòng)子構(gòu)建體)的BamHI限制位點(diǎn)。將GFP基因(來源于pEGFP，GenBank登記號(hào)AAB02572)于NotI限制位點(diǎn)與所述PPE-1啟動(dòng)子連接。按照Becker，T.C.等所述的方法(Methods Cell biol.43，Roth M.(編著).NewYork.Academic Press，1994，第161-189頁)，通過將pPACPPE-1Luc或Ad5PPE-1GFP與腺病毒質(zhì)粒pJM17共轉(zhuǎn)染，制備被稱為Ad5PPE-1Luc或Ad5PPE-1GFP的復(fù)制缺陷型重組腺病毒，然后收獲重組病毒體。
制備供大規(guī)模生產(chǎn)用的病毒。將濃度為109-1012噬斑形成單位/ml(pfu/ml)的病毒原液于4℃貯存。供大規(guī)模制備用的含有巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期啟動(dòng)子(GenBank登記號(hào)U47119)的病毒Ad5CMV-Luc和Ad5CMV-GFP(Quantum biotechnologies，Carlsbad，加拿大)按照關(guān)于PPE-1病毒載體所描述的方法制備，并將其用作非組織特異性對(duì)照。
所述PPE啟動(dòng)子的修飾通過將三個(gè)拷貝的Bu等(J.Biol Chem.(1997)272(19)32613-32622)發(fā)現(xiàn)的正轉(zhuǎn)錄元件(positive transcription element)插入到位于43個(gè)堿基對(duì)內(nèi)源正元件(-364至-320bp)下游的NheI限制性酶切位點(diǎn)(-286bp)，產(chǎn)生經(jīng)修飾的鼠PPE-1啟動(dòng)子。
本文稱為“3X”的增強(qiáng)子片段是鼠PPE-1啟動(dòng)子中存在的內(nèi)源序列元件(SEQ ID NO1的核苷酸坐標(biāo)407-452)的三聯(lián)拷貝。先前已經(jīng)表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞中PPE-1啟動(dòng)子活性的誘導(dǎo)依賴于該元件的存在(Bu等J.Biol Chem.(1997)272(19)32613-32622))。通過用長(zhǎng)度為96個(gè)堿基對(duì)的兩條互補(bǔ)單鏈DNA鏈(BioTechnology industries；NesTziona，Israel)(SEQ ID NO2和SEQ ID NO3)，合成3X片段。使所述兩個(gè)單鏈DNA片段退火，用Klenow片段(NEB)補(bǔ)平；所得的雙鏈DNA長(zhǎng)145個(gè)堿基對(duì)并且包括Nhe-1限制位點(diǎn)(SEQ ID NO4)。
用T4連接酶，將所述3X片段連接到內(nèi)源Nhe-1位點(diǎn)下游的鼠PPE-1啟動(dòng)子中。讓所得的構(gòu)建體在DH5α感受態(tài)細(xì)胞中繁殖，用大量制備(maxi-prep)Qiagene試劑盒產(chǎn)生大規(guī)模質(zhì)粒制備物。
另外的質(zhì)粒野生型PPE-1啟動(dòng)子含有1.4kb鼠前內(nèi)皮縮血管肽原-1(PPE-1)啟動(dòng)子、具有SV40polyA信號(hào)位點(diǎn)的螢光素酶基因(GenBank登記號(hào)X 65323)和鼠ET-1基因的第一內(nèi)含子的PPE-1-螢光素酶盒(5249bp)，來源于Harats等(J.Clin.Inv.(1995)951335-1344)使用的pEL8質(zhì)粒(8848bp)。用BamHI限制性酶，然后用提取試劑盒(Qiagen，Hilden，德國)從1％瓊脂糖凝膠中提取所述DNA片段，從pEL8質(zhì)粒中提取PPE-1-螢光素酶盒。
無啟動(dòng)子pPAC.plpA質(zhì)粒含有腺病毒5型序列的無啟動(dòng)子pPAC.plpA質(zhì)粒(7594bp)來源于ppACCMV.pLpA(8800bp)。用NotI限制性酶除去CMV啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和SV40聚腺苷酸化位點(diǎn)(1206bp)，從1％瓊脂糖凝膠中提取片段化DNA。該線狀質(zhì)粒(7594bp)用Klenow片段補(bǔ)平，用快速DNA連接試劑盒將BamHI接頭與兩個(gè)粘性末端連接。該線狀質(zhì)粒再用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，以便擴(kuò)增具有BamHl限制位點(diǎn)的pPAC.plpA。制備供大規(guī)模制備用的質(zhì)粒并用大量制備DNA純化試劑盒純化。
pPACPPE-1螢光素酶質(zhì)粒通過用T4DNA連接酶，將PPE-1-螢光素酶盒插入到pPAC.plpA質(zhì)粒的BamHI限制位點(diǎn)中，構(gòu)建pPACPPE-1螢光素酶質(zhì)粒。隨后用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。制備所述質(zhì)粒(12843bp)以進(jìn)行大規(guī)模制備，并用大量制備DNA純化試劑盒純化。
pPACPPE-1GFP質(zhì)粒通過用T4 DNA連接酶，將位于PPE-1啟動(dòng)子下游的GFP基因(來源于pEGFP，GenBank登記號(hào)AAB02572)亞克隆到NotI限制位點(diǎn)中，構(gòu)建pPACPPE-1GFP質(zhì)粒。
隨后用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。制備所述質(zhì)粒(11，801bp)以進(jìn)行大規(guī)模制備，并用大量制備DNA純化試劑盒純化。
pACPPE-1-3X螢光素酶質(zhì)粒和pACPPE-1-3X GFP質(zhì)粒通過將用BamHI限制性酶消化從含有Luc或GFP的pEL8-3X(圖26B)獲得的PPE-1-3XLuc盒或PPE-1-3XGFP盒插入到pPAC.plpA質(zhì)粒的BamHI限制位點(diǎn)中，構(gòu)建pPACPPE-1-3X螢光素酶質(zhì)粒和pPACPPE-1-3XGFP質(zhì)粒。pEL8-3X含有位于BamHI和NotI之間的經(jīng)修飾的鼠PPE-1啟動(dòng)子(1.55kb)(紅色)，所述啟動(dòng)子含有位于兩個(gè)NheI位點(diǎn)之間的三聯(lián)拷貝內(nèi)皮特異性增強(qiáng)子3X(如SEQ ID NO.7所示)。所述啟動(dòng)子、螢光素酶基因或GFP基因、SV40 poly A位點(diǎn)和內(nèi)皮縮血管肽-1基因的第一內(nèi)含子，它們一起被稱為經(jīng)修飾的PPE-1啟動(dòng)子盒，如材料和方法中所述的方法，用BamHI限制性酶對(duì)其進(jìn)行消化和提取。制備供大規(guī)模制備用的質(zhì)粒(12843bp)并用大量制備DNA純化試劑盒純化。
體外實(shí)驗(yàn)、DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)前24小時(shí)，將細(xì)胞接種到24孔或96孔培養(yǎng)皿中。對(duì)樣品孔內(nèi)的分匯合細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。然后，吸出各孔中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，將所述病毒載體以指定的感染復(fù)數(shù)(MOI)用感染培養(yǎng)基(DMEM或RPMI1640，2％FBS)稀釋并將其加入到單層中。將細(xì)胞在室溫下孵育4小時(shí)。然后，加入完全培養(yǎng)基，將該細(xì)胞在37℃、5％CO2下孵育72小時(shí)。
動(dòng)物所有動(dòng)物程序都得到Sheba Medicai Center，Tel-Hashomer的“Animal Care and Use Committee”的批準(zhǔn)。
使用以下不同的小鼠品系
(i)3月齡雄性野生型C57BL/6小鼠(Harlan farms，Jerusalem，Israel)。
(ii)3月齡雄性BALB/C小鼠(Harlan farms，Jerusalem，Israel)。
(iii)6月齡雄性和雌性ApoE基因缺陷型小鼠，C57BL/6xSJl29小鼠的雜種(Plump AS.等Cell(1991)71343-353)。
(iv)3月齡雄性和雌性小鼠，該小鼠過量表達(dá)處于鼠PPE-1啟動(dòng)子(5.9Kb)控制之下的螢光素酶基因，由Harats等產(chǎn)生(J.Clin.Inv.(1995)951335-1344)。
所有小鼠都在the Lipids and Atherosclerosis Research Institute(脂類和動(dòng)脈粥樣硬化研究所)生長(zhǎng)。
正常小鼠中的組織基因表達(dá)為了測(cè)定效率和組織特異性，如上文所述，將1010pfu/mlAd5PPElLuc或Ad5CMVLuc(作為非組織特異性對(duì)照)懸浮于100μl生理鹽水中，然后注射到小鼠尾靜脈內(nèi)。注射后1天、5天、14天、30天和90天測(cè)量螢光素酶活性。為了對(duì)已表達(dá)報(bào)道基因的細(xì)胞分布進(jìn)行定位，將Ad5PPE-1GFP或Ad5CMVGFP(1010pfu/ml，在100μl生理鹽水中)注射到3月齡正常雄性C57BL/6小鼠尾靜脈內(nèi)。注射后5天檢測(cè)GFP表達(dá)。所有小鼠看來都很健康并且在肝臟或其它組織中未見毒性或炎癥。
組織中的GFP活性為了測(cè)試所傳遞基因的體內(nèi)細(xì)胞分布，將取自注射小鼠的組織樣品在新鮮制備的含4％低聚甲醛的0.1M磷酸緩沖液中于4℃固定6小時(shí)，在30％蔗糖中于4℃浸泡過夜，然后在OCT化合物(Sakura，California，USA)中冷凍。將組織塊切成10μm厚的切片，然后直接在熒光顯微鏡(FITC濾光片)下觀察。
腫瘤植入用胰蛋白酶/EDTA收獲Lewis肺癌細(xì)胞(LLC)，用PBS洗滌3次，然后用0.1％錐蟲藍(lán)(Biological industries，Beit-Haemek，Israel)計(jì)數(shù)，以評(píng)價(jià)其活力。為了測(cè)試小鼠體內(nèi)腫瘤血管生成中的PPE-1啟動(dòng)子活性的活性水平，使用兩種不同的腫瘤膜型。
在原發(fā)性腫瘤膜型中，給小鼠背部(n＝17)皮下注射所述細(xì)胞(1×106細(xì)胞/ml，在100μl生理鹽水中)。注射后21天，將Ad5PPE-1、Ad5PPE-lGFP、Ad5CMV或Ad5CMVGFP(1010pfu/ml)注射到腫瘤組織(IT)中或進(jìn)行靜脈內(nèi)注射，然后如上所述檢測(cè)其活性。
在轉(zhuǎn)移性腫瘤膜型中，給小鼠爪墊(n＝12)注射所述細(xì)胞(5×105細(xì)胞/ml，在50μl生理鹽水)。當(dāng)腫瘤組織的直徑達(dá)到0.7mm時(shí)，在無菌麻醉?xiàng)l件下切除爪墊(帶有原發(fā)性腫瘤)。手術(shù)后14天，給小鼠尾靜脈內(nèi)注射所述病毒(Ad5PPE-1、Ad5PPE-1GFP、Ad5CMVLuc或Ad5CMVGFP)。
在這兩種腫瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，注射病毒?天處死小鼠，切下其組織，測(cè)試螢光素酶活性或GFP活性。
傷口愈合模型通過皮下注射戊巴比妥鈉(6mg/kg)，麻醉3月齡雄性C57BL/6小鼠。剃下其背上的毛，在背上作5cm的直切口。立即用4/0無菌絲線將切口縫合。通過H&E和抗yon-Willibrand抗體免疫組織化學(xué)染色，每?jī)商鞕z測(cè)愈合傷口中的血管生成過程。
作切口后10天，給所述小鼠尾靜脈系統(tǒng)注射1010pfu/mlAd5PPE-1Luc或Ad5CMVLuc。注射后5天，處死小鼠，如上所述測(cè)定切口部位和作為對(duì)照的正常對(duì)側(cè)部位的皮膚中的螢光素酶活性。
組織學(xué)檢查為了評(píng)估腫瘤和轉(zhuǎn)移組織中血管生成的程度，將所述組織切成5μm厚的切片，然后用蘇木精和伊紅(H&E)染色。用抗CD31(大鼠抗小鼠CD31單克隆抗體，Pharminogen，NJ，USA)抗體分析所述腫瘤膜型中的新血管形成。
用于VEGF和PDGF-B轉(zhuǎn)基因表達(dá)的質(zhì)粒和腺病毒載體重組復(fù)制缺陷型腺病毒血清型5按照Varda-Bloom，N.等[Tissue-specific gene therapy directed to tumor angiogenesis(靶向腫瘤血管生成的組織特異性基因治療]。(2001)Gene Ther 8，819-27]介紹的方法來構(gòu)建。簡(jiǎn)而言之，對(duì)pACCMV.pLpA質(zhì)粒進(jìn)行修飾，以包括處于巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期啟動(dòng)子調(diào)節(jié)之下的鼠VEGF165(GenBank登記號(hào)M95200)或大鼠PDGF-B(GenBank登記號(hào)AF162784)的cDNA。用相同的cDNA序列構(gòu)建pACPPE-1-3X質(zhì)粒，其中CMV啟動(dòng)子被經(jīng)修飾的鼠前內(nèi)皮縮血管肽原-1(PPE-1-3X)啟動(dòng)子取代。每個(gè)質(zhì)粒與pJM17質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，產(chǎn)生不同的重組腺病毒。讓所述病毒在HEK293細(xì)胞中繁殖并降至1010PFU/ml的濃度。對(duì)照載體用同樣方法產(chǎn)生。
小鼠后肢缺血模型和基因治療至少12周齡雄性和雌性C57B16小鼠(Harlan Laboratories Ltd.，Israel)按照Animal Care and Use Committee of Sheba Medical Center的指南進(jìn)行維護(hù)。根據(jù)先前介紹的方案[Couffinhal，T.等，Mouse model ofangiogenesis(小鼠血管生成模型).Am J Pathol 152，1667-79.(1998)]，誘導(dǎo)后肢缺血。簡(jiǎn)而言之，用戊巴比妥鈉(40mg/kg，IP)麻醉動(dòng)物。剃掉肢體被毛后，對(duì)最接近隱動(dòng)脈和膝后彎動(dòng)脈分叉處的右股動(dòng)脈進(jìn)行結(jié)扎。結(jié)扎后5天，靜脈內(nèi)給予109PFU不同的腺病毒載體。
超聲波成象采用Synergy超聲波系統(tǒng)(General Electric，USA)，于7.5MHz，以血管造影方式，按結(jié)扎后7天時(shí)間間隔，進(jìn)行超聲波成象。讓動(dòng)物蘇醒并在受約束時(shí)成象。讓動(dòng)物在常規(guī)條件下適應(yīng)至多90天。
免疫組織化學(xué)將處死的局部缺血小鼠的兩個(gè)后肢骨胳肌和肝臟組織在OCT化合物中冷凍，然后進(jìn)行冷凍切片。內(nèi)皮細(xì)胞用大鼠單克隆抗CD31抗體(PharMingen，San Diego，CA)進(jìn)行免疫染色。平滑肌細(xì)胞用小鼠多克隆抗α-SMactin抗體(SIGMA，St.Louis，MO)進(jìn)行免疫染色。背景用蘇木精染色。
原位雜交用局部缺血?jiǎng)游锏膬蓚€(gè)后肢制備5μm骨胳肌切片。用有義或反義DIG-標(biāo)記的探針對(duì)VEGF165或PDGF-B進(jìn)行原位雜交，然后用抗DIG-AP綴合物(Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany)檢測(cè)毛地黃毒苷(DIG)。背景用甲基綠染色。
影像加工運(yùn)用Image-Pro及軟件工具(Media Cybemetics，Silver Spring，MD)，對(duì)超聲波影像進(jìn)行加工。計(jì)算出每幅影像說明最增強(qiáng)的灌注的著色像素的數(shù)目。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析運(yùn)用t-檢驗(yàn)ANOVA或Mann-Whitney秩檢驗(yàn)，對(duì)各組間統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以平均值+SE表示。
實(shí)施例13X-PPE-1質(zhì)?；钚缘捏w外分析為了分析PPE-1-3X的活性，對(duì)PPE-1-3X啟動(dòng)子質(zhì)粒和未經(jīng)修飾的PPE-1啟動(dòng)子質(zhì)粒的報(bào)道基因表達(dá)進(jìn)行比較。將含有或者所述PPE-1-3X片段或者所述未經(jīng)修飾的PPE-1片段以及報(bào)道基因螢光素酶的報(bào)道基因質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染到內(nèi)皮細(xì)胞系和非內(nèi)皮細(xì)胞系以及表達(dá)所述PPE-1啟動(dòng)子的支氣管上皮細(xì)胞系(B2B)中(參見上文的材料和方法)。選擇B2B細(xì)胞系是為了提供相對(duì)于PPE-1啟動(dòng)子而言所述3X元件降低在非內(nèi)皮細(xì)胞系中表達(dá)的能力的指示。采用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺(lipofectamine)(Promega Corp.，Madison，WI)完成轉(zhuǎn)染。每種情況下，按照公認(rèn)的分子生物學(xué)實(shí)踐，用βgal-neo質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)染效率的指示劑。
轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，用裂解緩沖液(Promega Corp.，Madison，WI)收獲細(xì)胞，用發(fā)光計(jì)(TD-20e-Tumer Designs，Sunnyvale，California)分析螢光素酶活性。在平行實(shí)驗(yàn)中，分析βgal活性，以將不同的轉(zhuǎn)化效率標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果總結(jié)于圖1和表1中。處于PPE-3X控制之下的螢光素酶活性是處于未經(jīng)修飾的PPE-1控制之下的螢光素酶活性的15-20倍。在非內(nèi)皮細(xì)胞系中，用PPE-1和PPE-1-3X兩者檢測(cè)最低表達(dá)。這證明PPE-3X是用于在體內(nèi)將基因特異性地傳遞到內(nèi)皮細(xì)胞中的有前景的候選物。
表1-用PPE-1和PPE-1-3X螢光素酶構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中的螢光素酶活性
實(shí)施例2Ad5PPE-1/螢光素酶的體外活性和特異性也將PPE-1/螢光素酶、PPE-1-3X/螢光素酶、PPE-1/GFP和PPE-1-3X/GFP連接到Ad5質(zhì)粒中，以產(chǎn)生Ad5PPE-1/Luc和Ad5PPE-1-3X/luc、Ad5PPE-1/GFP和Ad5PPE-1-3X/GFP(Varda-Bloom等，(2001)Gene therapy 8819-827)。如下文詳述，分別測(cè)定這些構(gòu)建體。
為了測(cè)試Ad5PPE-1/luc的活性，對(duì)B2B(人支氣管上皮)、BAEC(牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞)和HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。這三個(gè)細(xì)胞系都表達(dá)內(nèi)皮縮血管肽基因，選擇這些細(xì)胞系以指示被測(cè)構(gòu)建體在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)水平。用不表達(dá)內(nèi)皮縮血管肽的RIN(大鼠胰島瘤)細(xì)胞系作為陰性對(duì)照，用同一構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用Ad5CMVLuc(處于CMV啟動(dòng)子控制之下的螢光素酶)作為所有細(xì)胞系中的非內(nèi)皮特異性對(duì)照。
圖2清楚地說明，用PPE-1啟動(dòng)子比用CMV啟動(dòng)子在內(nèi)皮BAEC和HUVEC細(xì)胞系達(dá)到的螢光素酶表達(dá)要高。在RIN細(xì)胞中，該細(xì)胞不是來源于內(nèi)皮，CMV啟動(dòng)子比PPE-1啟動(dòng)子產(chǎn)生的螢光素酶活性要高。這些結(jié)果證明所述未經(jīng)修飾的PPE-1啟動(dòng)子的內(nèi)皮特異性。
實(shí)施例3Ad5PPE-3XLuc和Ad5PPE-3XGFP的活性和特異性用Ad5PPE-3X/螢光素酶和Ad5PPE-3X/GFP構(gòu)建體轉(zhuǎn)染上文實(shí)施例2中所述的細(xì)胞系，以便確定3X元件對(duì)特異性和表達(dá)水平的影響。如同在實(shí)施例2中一樣，用Ad5CMVLuc作為非內(nèi)皮特異性對(duì)照。與CMV啟動(dòng)子相比，檢測(cè)在BAEC細(xì)胞系和HUVEC細(xì)胞系中處于PPE-3X啟動(dòng)子控制之下的螢光素酶表達(dá)較高。
圖3A是一張顯微照片，說明在BAEC細(xì)胞系中處于Ad5PPE-1-3X控制之下的GFP表達(dá)。圖3B是一張顯微照片，說明BAEC系中Ad5CMV的GFP表達(dá)。如這些圖所清楚顯示的，PPE-1-3X啟動(dòng)子在內(nèi)皮細(xì)胞中的活性更高。這些結(jié)果清楚地表明，所述3X元件不會(huì)降低PPE-1啟動(dòng)子的內(nèi)皮特異性。下文實(shí)施例6中給出了PPE-1啟動(dòng)子和PPE-1-3X啟動(dòng)子在細(xì)胞培養(yǎng)物中的相對(duì)活性。
實(shí)施例4
p55基因促凋亡活性的體外測(cè)定將P55(TNFR1，GenBank登記號(hào)M75866)亞克隆到PACPPE3X(含有PPE-1-3X啟動(dòng)子)和pACCMV中后，如上文所述將這些質(zhì)粒和GFP(pEGFP-C1載體；CLONTECH，Palo Alto，CA)進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)而言之，通過T4 DNA連接酶，將所述基因亞克隆到PPE-1啟動(dòng)子(而不是螢光素酶基因)下游的NotI限制位點(diǎn)中，然后將其轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，肉眼可辨別小而圓的凋亡細(xì)胞和正常細(xì)胞。用電子顯微鏡檢查用促凋亡質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示凋亡的典型外觀，證實(shí)了所述肉眼評(píng)價(jià)。
在PPE-1-3X啟動(dòng)子的控制之下，p55僅在內(nèi)皮細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡(圖4)，而CMV啟動(dòng)子沒有顯示任何細(xì)胞特異性活性。處于PPE-1-3X控制之下的螢光素酶在任何被測(cè)細(xì)胞系中都沒有誘導(dǎo)凋亡。這些結(jié)果表明，通過應(yīng)用PPE-1-3X啟動(dòng)子，在內(nèi)皮細(xì)胞中特異性地誘導(dǎo)凋亡是可行的。
實(shí)施例5低氧效應(yīng)元件(HRE)可以增強(qiáng)低氧敏感性內(nèi)皮細(xì)胞中的靶基因表達(dá)低氧是一種血管緊張性和結(jié)構(gòu)的重要調(diào)節(jié)劑。也已表明，它是一種血管生成的有效刺激物(在缺血性心臟病和癌癥中(Semenza，G.L.等(2000)Adv Exp Med Biol.；475123-30；williams，K.J.(2001)BreastCancer Res.20013；328-31和Shimo，T.(2001)Cancer Lett.174；57-64)。此外，據(jù)報(bào)道低氧調(diào)節(jié)許多基因的表達(dá)，包括促紅細(xì)胞生成素、VEGF、糖酵解酶和ET-1基因的表達(dá)。這些基因受一個(gè)共同的氧傳感途徑(oxygen-sensing pathway)-稱為低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)的誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的控制。所述HIF-1復(fù)合體通過結(jié)合靶基因的順式作用低氧效應(yīng)元件(HRE)來介導(dǎo)對(duì)低氧的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。HRE是一個(gè)位于包括以下基因的對(duì)低氧應(yīng)答的極少數(shù)基因啟動(dòng)子中的保守序列VEGF、一氧化氮合酶-2，促紅細(xì)胞生成素(erytropoietin)和包括內(nèi)皮縮血管肽-1、ET-1在內(nèi)的其它基因。ET-1啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游位置-118bp含有一個(gè)反向低氧效應(yīng)元件，所述元件含有7個(gè)堿基對(duì)并且位于GATA-2和API位點(diǎn)之間，為5’GCACGTT 3’-50堿基對(duì)(SEQ IDNO5.)。
前內(nèi)皮縮血管肽原-1(PPE-1)啟動(dòng)子含有一個(gè)潛在增加其在腫瘤或局部缺血組織的低氧微環(huán)境中表達(dá)的低氧效應(yīng)元件(HRE)，從而使其具有“腫瘤組織特異性”和/或“局部缺血組織特異性”。為了評(píng)價(jià)該HRE的實(shí)際功能，結(jié)合螢光素酶或GFP報(bào)道基因以及用腺病毒載體傳遞對(duì)PPE-1啟動(dòng)子和PPE-1-3X啟動(dòng)子進(jìn)行分析。
比較在BAEC細(xì)胞中在常氧(normoxia)和低氧(hypoxia)條件(0.5％O2達(dá)16小時(shí))下處于PPE-1啟動(dòng)子或PPE-1-3X啟動(dòng)子控制之下的螢光素酶活性。處于PPE-1啟動(dòng)子控制之下的螢光素酶活性當(dāng)暴露于低氧時(shí)提高至5倍(圖5和圖6)。此外，處于PPE-1-3X啟動(dòng)子控制之下的螢光素酶活性在低氧條件下提高至2.5倍。概括地講，將3X元件導(dǎo)入PPE 1啟動(dòng)子中仍能夠提高下游基因?qū)Φ脱鯌?yīng)答的表達(dá)水平，即使在用PPE-1-3X基因時(shí)常氧的表達(dá)水平也比用未經(jīng)修飾的PPE-1啟動(dòng)子所觀察的表達(dá)水平高。
實(shí)施例6對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞系中PPE-1-3X和PPE-1啟動(dòng)子活性的進(jìn)一步評(píng)估圖7總結(jié)了得自用pPPE-1/螢光素酶和pPPE-1-3X/螢光素酶轉(zhuǎn)染B2B、HUVEC和BAEC的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。分別在B2B、HUVEC和BAEC中觀察到處于PPE-1-3X啟動(dòng)子控制之下的螢光素酶表達(dá)高于處于PPE-1啟動(dòng)子控制之下的螢光素酶表達(dá)(是后者的30倍、8.5倍和1.5倍以上)。這些結(jié)果證實(shí)了上文所述的結(jié)果，并且可用來確立PPE-1-3X非常適合將高水平表達(dá)特異性地靶向內(nèi)皮細(xì)胞。在將來的體內(nèi)傳遞方面，用PPE-1-3X構(gòu)建體實(shí)現(xiàn)的較高表達(dá)水平意味著可給予更少量的DNA。這進(jìn)而將會(huì)用來甚至進(jìn)一步增強(qiáng)特異性。
實(shí)施例7Ad5PPE-1Luc在體內(nèi)的效率、特異性和穩(wěn)定性為了證實(shí)在實(shí)施例2-6中所觀察的表達(dá)的內(nèi)皮特異性不是細(xì)胞培養(yǎng)物的人為現(xiàn)象，如上文在“正常小鼠中的組織基因表達(dá)”中所述的方法，將Ad5PPE-1/螢光素酶構(gòu)建體注射到C57BL/6小鼠體內(nèi)。如同在所述體外研究中一樣，用Ad5CMV/螢光素酶作為陰性對(duì)照。
注射腺病毒載體后，分析血管形成組織和非血管形成組織中的螢光素酶比活和穩(wěn)定性。結(jié)果總結(jié)于圖8(相對(duì)于肝臟中表達(dá)的螢光素酶表達(dá))和表2(螢光素酶表達(dá)以機(jī)體總表達(dá)的百分率表示)。正如所預(yù)期的，在Ad5CMV/螢光素酶治療的小鼠中，在肝臟中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)螢光素酶活性(＞總機(jī)體表達(dá)的80％)。由PPE-1啟動(dòng)子控制的螢光素酶活性在肝臟中較低(總機(jī)體表達(dá)的37-54％)。與Ad5CMV/螢光素酶治療的小鼠相比(總機(jī)體表達(dá)的至多1.8％；表2)，PPE-1驅(qū)動(dòng)的表達(dá)在主動(dòng)脈中高得多(分別在注射后5天和14天為總機(jī)體表達(dá)的23-33％)。這些結(jié)果證實(shí)了在細(xì)胞培養(yǎng)物中觀察的內(nèi)皮特異性。應(yīng)該提及的是，肝臟是一個(gè)高度血管化器官。因此，如下文詳述對(duì)各種器官內(nèi)的細(xì)胞表達(dá)進(jìn)行檢查。
表2-注射基于PPE-1和CMV的構(gòu)建體后5天和14天器官中的螢光素酶表達(dá)
圖30A和圖30B證明110只注射小鼠的主動(dòng)脈(A)和肝臟(B)中的絕對(duì)螢光素酶活性(光單位/μg蛋白)。注射后1天(n＝13)、5天(n＝34)、14天(n＝32)、30天(n＝20)和90天(n＝11)測(cè)量螢光素酶活性。主動(dòng)脈中的結(jié)果代表主要在內(nèi)皮細(xì)胞中的啟動(dòng)子(PPE-1或CMV)活性，而肝臟中的結(jié)果代表其主要在肝細(xì)胞中的活性。
實(shí)施例8BALB/C小鼠中Ad5PPE-1的效率、特異性和穩(wěn)定性的體內(nèi)測(cè)定在12周齡BALB/C小鼠(每組n＝10)中重復(fù)實(shí)施例7的實(shí)驗(yàn)，以證明所觀察的結(jié)果不是特定動(dòng)物品系的人為現(xiàn)象。
因?yàn)橛孟俨《据d體得到的絕對(duì)結(jié)果在BALB/C小鼠中比在C57BL/6小鼠中低，所以螢光素酶表達(dá)以所有組織中總螢光素酶活性的百分率表示。
在注射Ad5PPE-1的小鼠脾臟(90.9％)和注射Ad5CMV的小鼠肝臟(86.2％)中觀察到注射后5天的最高相對(duì)螢光素酶表達(dá)。也觀察到注射后14天注射Ad5PPE-1的小鼠主動(dòng)脈中的相對(duì)螢光素酶活性(32.9％)與注射后5天相對(duì)螢光素酶活性(1.75％)相比的顯著增加(圖31A和圖31B；Ad5PPE-1Luc-空心條帶；Ad5CMVLuc-實(shí)心條帶)。
這些結(jié)果證實(shí)，無論用何種小鼠品系，PPE-1啟動(dòng)子的組織特異性都足以強(qiáng)烈有效地消除肝細(xì)胞表達(dá)，盡管肝細(xì)胞優(yōu)先攝入注射的DNA。
實(shí)施例9Ad5PPE-1傳遞的基因的體內(nèi)細(xì)胞定位為了確定PPE-1表達(dá)的基因在體內(nèi)的細(xì)胞表達(dá)部位，使用通過腺病毒載體Ad5PPE-1-GFP傳遞的綠色熒光蛋白(GFP)。用Ad5CMVGFP(Quantum，Canada)作為非內(nèi)皮細(xì)胞特異性陰性對(duì)照。靜脈內(nèi)注射后5天處死小鼠，并通過熒光顯微鏡術(shù)分析其組織。
在注射Ad5CMVGFP載體的小鼠中，在肝細(xì)胞中檢測(cè)到大部分表達(dá)，而在肝臟內(nèi)皮細(xì)胞中沒有檢測(cè)到表達(dá)(圖9A)。與之形成鮮明對(duì)比的是，注射Ad5PPE-1-GFP的小鼠(圖9B)顯示在肝細(xì)胞中沒有表達(dá)，但在肝臟血管內(nèi)皮細(xì)胞中有顯著表達(dá)。在其它在內(nèi)皮中檢測(cè)到幾乎所有的PPE-1驅(qū)動(dòng)的表達(dá)的組織中也獲得相似的結(jié)果，而CMV驅(qū)動(dòng)的表達(dá)是非內(nèi)皮性的。這些結(jié)果表明，內(nèi)皮特異性甚至在含有內(nèi)皮細(xì)胞和非內(nèi)皮細(xì)胞的器官中也可保持。這一發(fā)現(xiàn)對(duì)預(yù)防生長(zhǎng)中腫瘤的血管生成具有重大意義。
實(shí)施例10Ad5PPE-1-3X Luc和Ad5PPE-1-3X GFP的效率和內(nèi)皮特異性的體外測(cè)定為了測(cè)定Ad5PPE-1和Ad5PPE-1-3X在細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)報(bào)道基因螢光素酶和綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)的相對(duì)功效，用上述細(xì)胞系體外測(cè)試內(nèi)皮細(xì)胞中的比活。用Ad5CMVLuc和Ad5CMVGFP作為非組織特異性對(duì)照。Ad5PPE-1Luc和Ad5PPE-1GFP用來確定因加入所述3X序列所引起的表達(dá)水平的相對(duì)變化。
在圖10和圖11中總結(jié)的結(jié)果表明，在EC系(牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞-BAEC)中處于PPE-1-3X啟動(dòng)子控制之下的螢光素酶活性是在非內(nèi)皮細(xì)胞-大鼠胰島瘤-RIN細(xì)胞、HeLA細(xì)胞、HePG2細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞(NSF)中的活性的5-10倍(圖10和圖11)。
圖10顯示在Ad5PPE-1Luc、Ad5PPE-1-3XLuc和Ad5CMVLuc轉(zhuǎn)導(dǎo)的B2B細(xì)胞、BAEC細(xì)胞和RIN細(xì)胞中以光單位/μg蛋白表示的螢光素酶活性。在Ad5CMVLuc轉(zhuǎn)導(dǎo)的RIN細(xì)胞中觀察到最高的螢光素酶表達(dá)，然而，該構(gòu)建體在BAEC細(xì)胞和B2B細(xì)胞中表達(dá)差。在Ad5PPE-1-3Xluc轉(zhuǎn)導(dǎo)的BAEC細(xì)胞中觀察到第二高水平的螢光素酶表達(dá)。Ad5PPE-1Luc在BAEC細(xì)胞中以較低的水平表達(dá)。在B2B細(xì)胞系中，Ad5PPE-1Luc和Ad5PPE-1-3Xluc以幾乎相同的水平表達(dá)。
總的來講，在相同的感染條件下(moi＝10)，在內(nèi)皮細(xì)胞系中處于PPE-1-3X啟動(dòng)子控制之下的螢光素酶活性是處于PPE-1啟動(dòng)子控制之下的螢光素酶活性的23倍，是處于CMV啟動(dòng)子控制之下的螢光素酶活性的23-47倍。盡管如此，處于CMV啟動(dòng)子控制之下的螢光素酶表達(dá)在非內(nèi)皮RIN細(xì)胞中高達(dá)3000倍(圖10)。
為了確立PPE-1和PPE-1-3X在其它非內(nèi)皮細(xì)胞譜系中是無活性的，對(duì)HeLA、HepG2、NSF細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。用BAEC作為內(nèi)皮對(duì)照。圖11顯示在用Ad5PPE-1Luc、Ad5PPE-1-3XLuc和Ad5CMVLuc轉(zhuǎn)導(dǎo)的HeLA細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、NSF細(xì)胞和BAEC細(xì)胞中以光單位/μg蛋白表示的螢光素酶活性。用Ad5CMVLuc轉(zhuǎn)導(dǎo)，在HeLA細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和NSF細(xì)胞中引起高水平的螢光素酶表達(dá)。這些細(xì)胞系不能表達(dá)處于PPE-1控制之下的螢光素酶并且用PPE-1-3X啟動(dòng)予以低水平表達(dá)螢光素酶。正如所預(yù)期的，用Ad5PPE-1Luc或Ad5PPE-1-3Xluc轉(zhuǎn)導(dǎo)的BAEC細(xì)胞表現(xiàn)出高螢光素酶表達(dá)。
綜合考慮，這些結(jié)果表明，將所述3X序列導(dǎo)入PPE-1啟動(dòng)子中，引起內(nèi)皮細(xì)胞系中較高水平的表達(dá)，同時(shí)防止非內(nèi)皮細(xì)胞中不想要的表達(dá)。
加入所述3X序列至PPE-1啟動(dòng)子中也增加EC系(牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞-BAEC)中綠色熒光蛋白表達(dá)的水平，如描繪了以moi＝1轉(zhuǎn)導(dǎo)的BAEC中的GFP表達(dá)的圖12A-C所示。在該實(shí)驗(yàn)中，用CMV啟動(dòng)子沒有觀察到GFP的表達(dá)。
在圖12中，圖A表示Ad5PPE-1-3XGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，圖B表示Ad5PPE-1GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，而圖C表示Ad5CMVGFP。再者，將所述3X序列導(dǎo)入PPE-1啟動(dòng)子中，顯著增加所述報(bào)道基因的表達(dá)。這一結(jié)果表明，所述3X序列作為內(nèi)皮特異性增強(qiáng)子起作用的能力不隨待轉(zhuǎn)錄的下游基因而變。
此外，Ad5PPE-1-3X-GFP和Ad5PPE-1GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致在非內(nèi)皮細(xì)胞SMC、He1A、HePG2和正常皮膚成纖維細(xì)胞(NSF)中與在CMV啟動(dòng)子下的高表達(dá)相比無GFP表達(dá)，如圖13-16中總結(jié)的。
圖13顯示以moi＝1的或者Ad5PPE-1-3XGFP(圖A)或者Ad5CMVGFP(圖B)轉(zhuǎn)導(dǎo)的SMC中的GFP表達(dá)。盡管Ad5CMVGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致高水平GFP表達(dá)，但是用Ad5PPE-1-3XGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)不引起GFP表達(dá)。
圖14顯示在HeLa細(xì)胞中進(jìn)行的一個(gè)相似實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。如同在前面的圖中一樣，圖A表示用Ad5PPE-1-3XGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，圖B表示用Ad5CMVGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。再者，盡管Ad5CMVGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致高水平GFP表達(dá)，但是用Ad5PPE-1-3XGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)不引起GFP表達(dá)。
圖15顯示在HepG2細(xì)胞中進(jìn)行的一個(gè)相似實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。如同在前面的圖中一樣，圖A表示用Ad5PPE-1(3X)GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，圖B表示用Ad5CMVGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。再者，盡管Ad5CMVGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致高水平GFP表達(dá)，但是用Ad5PPE-1-3XGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)不引起GFP表達(dá)。
圖16顯示在NSF細(xì)胞中進(jìn)行的一個(gè)相似實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。如同在前面的圖中一樣，圖A表示用Ad5PPE-1-3XGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，圖B表示用Ad5CMVGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。再者，盡管Ad5CMVGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致高水平GFP表達(dá)，但是用Ad5PPE-1-3XGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)引起極低的GFP表達(dá)。
這些結(jié)果綜合起來考慮表明，高水平的內(nèi)皮特異性和高水平的內(nèi)皮表達(dá)可通過使用含有SEQ ID NO.7的3X序列的經(jīng)修飾的PPE-1啟動(dòng)子而獲得。
實(shí)施例11由Ad5PPE-1-3X傳遞的報(bào)道基因的體內(nèi)細(xì)胞定位為了測(cè)定處于PPE-1-3X啟動(dòng)子控制之下表達(dá)的報(bào)道基因的體內(nèi)細(xì)胞定位模式，如上文所述將Ad5PPE-1-3XGFP和Ad5PPE-1GFP注射到小鼠體內(nèi)。靜脈內(nèi)注射后5天，處死小鼠并通過熒光顯微鏡術(shù)分析其組織。
注射Ad5PPE-1-3XGFP的小鼠與注射Ad5PPE-1GFP的小鼠相比，在肝血管、腎血管和脾血管的內(nèi)皮細(xì)胞中觀察到顯著更高的GFP活性。圖17A和圖17B顯示代表性結(jié)果。
圖17A顯示注射Ad5PPE-1GFP的小鼠血管內(nèi)襯的內(nèi)皮細(xì)胞中的低水平GFP表達(dá)。圖17B顯示由于加入所述3X序列至所述構(gòu)建體中產(chǎn)生的水平高得多的GFP表達(dá)。
盡管在血管內(nèi)襯(lining)中高表達(dá)，但是在肝細(xì)胞、腎小球、上皮細(xì)胞和脾細(xì)胞中沒有檢測(cè)到表達(dá)(圖18和圖19)。
圖18顯示得自注射小鼠腎臟組織的代表性結(jié)果。注射Ad5CMVGFP的小鼠(圖18A)、注射Ad5PPE-1GFP的小鼠(圖18b)和注射Ad5PPE-1-3XGFP的小鼠(圖18C)在腎細(xì)胞中都表現(xiàn)出低GFP活性。在18B中，在血管壁中可見略高的GFP表達(dá)(箭頭所指)。
圖19顯示注射小鼠脾組織的代表性結(jié)果。注射Ad5CMVGFP的小鼠(圖19A)、注射Ad5PPE-1GFP的小鼠(圖19B)和注射Ad5PPE-1-3XGFP的小鼠(圖19C)在脾細(xì)胞中都表現(xiàn)出低水平的GFP活性。在注射Ad5PPE-1-3XGFP的小鼠血管可見較高的GFP活性(箭頭所指)。
這些結(jié)果證實(shí)，PPE-1啟動(dòng)子和PPE-1-3X啟動(dòng)子在體內(nèi)均為內(nèi)皮細(xì)胞特異性的。它們進(jìn)一步提示，這兩種啟動(dòng)子的活性限于非增殖性內(nèi)皮組織(即健康器官的血管)。因此，在腫瘤血管生成性模型中進(jìn)行各種測(cè)定。
實(shí)施例12腫瘤新血管形成中Ad5PPE-1構(gòu)建體的體內(nèi)測(cè)定為了確定AD5PPE將報(bào)道基因的表達(dá)特異性地靶向腫瘤中血管生成性血管的能力，使用鼠LLC模型(上文在材料和方法描述的)。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，系統(tǒng)注射Ad5PPE-1Luc或Ad5CMVLuc(各1010pfu/ml)后5天測(cè)試腫瘤新血管形成中的螢光素酶表達(dá)。
在該實(shí)驗(yàn)中，給原發(fā)性腫瘤模型和轉(zhuǎn)移性腫瘤模型系統(tǒng)注射Ad5CMVLuc，導(dǎo)致在原發(fā)性腫瘤或腫瘤轉(zhuǎn)移肺中均產(chǎn)生最低表達(dá)。該表達(dá)水平與在未經(jīng)實(shí)驗(yàn)的正常肺中由CMV指導(dǎo)的螢光素酶的最低表達(dá)相似(圖35；實(shí)心條帶；n＝12)。與之鮮明對(duì)比的是，在PPE-1啟動(dòng)子的控制下(圖35；空心條帶；n＝9)，高血管生成性肺轉(zhuǎn)移腫瘤與螢光素酶活性相關(guān)，所述螢光素酶活性為在血管化程度低的原發(fā)性腫瘤和未經(jīng)過實(shí)驗(yàn)的肺中的螢光素酶活性的約200倍。
在諸如肝臟、腎臟、心臟和胰腺的非轉(zhuǎn)移瘤組織中的螢光素酶表達(dá)最低。主動(dòng)脈中的表達(dá)水平大約是腫瘤轉(zhuǎn)移肺中所述水平的30％。
在所述LLC模型的另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用Ad5PPE-1GFP構(gòu)建體和Ad5CMVGFP構(gòu)建體來對(duì)原發(fā)性腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移肺中的報(bào)道基因表達(dá)進(jìn)行定位。
注射Ad5PPE-1GFP的小鼠在原發(fā)性腫瘤血管中顯示高水平的GFP特異性表達(dá)(圖36C)，盡管在腫瘤細(xì)胞本身沒有檢測(cè)到表達(dá)。這一觀察結(jié)果與實(shí)施例20中提供的LLC細(xì)胞培養(yǎng)模型的結(jié)果相一致。在肺轉(zhuǎn)移腫瘤中，在轉(zhuǎn)移瘤病灶的大主動(dòng)脈和血管生成性小血管兩者中均檢測(cè)到高水平的GFP表達(dá)(圖36A)。在正常肺組織中沒有檢測(cè)到表達(dá)。內(nèi)皮細(xì)胞定位為GFP表達(dá)(圖16A)和CD31抗體免疫染色(圖16B)的共定位所證實(shí)。與之形成鮮明對(duì)比的是，在注射Ad5CMVGFP的小鼠中，在原發(fā)性腫瘤和肺轉(zhuǎn)移腫瘤兩者中均沒有檢測(cè)到GFP活性。
圖36C說明腫瘤內(nèi)注射Ad5PPE-1GFP后在原發(fā)性腫瘤血管中的GFP表達(dá)。圖36D是一幅與圖C相同的說明腫瘤及其血管的相差影像。
這些結(jié)果表明，PPE-1不驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞自身中的高水平表達(dá)，而所述啟動(dòng)子卻驅(qū)動(dòng)腫瘤內(nèi)血管內(nèi)皮中、尤其是在快速增殖的血管生成性血管中的高水平表達(dá)。
給原發(fā)性皮下腫瘤模型腫瘤內(nèi)注射Ad5CMV，導(dǎo)致在腫瘤組織中的高螢光素酶表達(dá)，而在肝臟中導(dǎo)致中等水平表達(dá)(腫瘤表達(dá)量的10％；圖42)。在肺轉(zhuǎn)移腫瘤中沒有檢測(cè)到表達(dá)。另一方面，當(dāng)腫瘤內(nèi)注射時(shí)，處于PPE-1啟動(dòng)子控制之下的螢光素酶表達(dá)，導(dǎo)致在原發(fā)性腫瘤和肺轉(zhuǎn)移腫瘤中的相似螢光素酶表達(dá)水平，而在肝臟中沒有檢測(cè)到表達(dá)。
實(shí)施例13癌細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的Ad5PPE-1構(gòu)建體的測(cè)定為了測(cè)定Ad5PPE-1和Ad5CMV在癌細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)螢光素酶表達(dá)的效率，使用D122-96Lewis肺癌細(xì)胞系。
以不同的感染復(fù)數(shù)(moi)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)導(dǎo)。結(jié)果表明，兩種腺病毒載體均能夠?qū)⑽灩馑孛富蜣D(zhuǎn)導(dǎo)給這些細(xì)胞(表3)。然而，由PPE-1啟動(dòng)子指導(dǎo)的螢光素酶活性在LLC細(xì)胞中比在內(nèi)皮細(xì)胞中檢測(cè)到的所述活性低得多，分別為50光單位/μg蛋白對(duì)1000-2500光單位/μg蛋白。
表3-用Ad5PPE-1Luc和Ad5CMVLuc體外轉(zhuǎn)導(dǎo)Lewis肺癌細(xì)胞系(D122-96)
實(shí)施例14所述3X序列在腫瘤血管生成性血管中效應(yīng)的體內(nèi)測(cè)定為了確定所述3X序列對(duì)血管生成性血管中PPE-1啟動(dòng)子的影響，使用Lewis肺癌(LLC)轉(zhuǎn)移瘤模型(上文在材料和方法中描述的)。如材料和方法所述的方法，靜脈內(nèi)注射1010感染單位的Ad5PPE-1GFP、Ad5PPE-1-3XGFP或Ad5CMVGFP后5天，處死小鼠并分析其組織。
圖20A-D總結(jié)了注射鹽水的對(duì)照小鼠(圖20A)、注射Ad5CMVGFP的小鼠(圖20B)、注射Ad5PPE-1GFP的小鼠(圖20C)和注射Ad5PPE-1-3XGFP的小鼠(圖20D)的腫瘤轉(zhuǎn)移肺中的GFP表達(dá)?？笴D31免疫染色(圖20C’-20D’)證實(shí)每種轉(zhuǎn)移瘤組織中GFP表達(dá)的位置。結(jié)果表明，在對(duì)照—注射鹽水的小鼠中沒有檢測(cè)到GFP表達(dá)(圖20A)，在注射CMV的小鼠支氣管上皮周圍有微弱表達(dá)，而在這些小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移肺血管生成性血管中沒有表達(dá)(圖20B)。在注射Ad5PPE-1GFP的小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移肺中觀察到低GFP表達(dá)(圖20C和20C’)，而在注射Ad5PPE-1-3XGFP的小鼠新血管中觀察到高且特異性的表達(dá)(圖20D和20D’)。
這些結(jié)果解釋了實(shí)施例10的體內(nèi)結(jié)果和實(shí)施例2、3和6的體外結(jié)果之間明顯不一致的結(jié)果。PPE-1啟動(dòng)子和PPE-1-3X啟動(dòng)子兩者都是內(nèi)皮特異性的。然而，所述3X序列大大提高了快速增殖的內(nèi)皮組織諸如生長(zhǎng)中腫瘤的新形成的血管中的表達(dá)水平。
實(shí)施例15所述3X元件對(duì)腫瘤血管生成性血管中PPE-1啟動(dòng)子的影響為了研究本發(fā)明的3X元件對(duì)腫瘤血管生成性血管中PPE-1啟動(dòng)子功效和比活的影響，使用LLC轉(zhuǎn)移瘤模型。如上文所述的方法，靜脈內(nèi)注射1010pfu/ml Ad5PPE-1Luc、Ad5PPE-1-3XLuc、Ad5CMVLuc、Ad5PPE-1GFP、Ad5PPE-1-3X-GFP或Ad5CMVGFP后5天，處死小鼠并分析其組織的螢光素酶表達(dá)或GFP表達(dá)。
圖37是一幅直方圖，比較系統(tǒng)注射Ad5PPE-1-3Xluc、Ad5PPE-1Luc或Ad5CMVLuc后在正常肺和腫瘤轉(zhuǎn)移肺中的螢光素酶表達(dá)。各實(shí)驗(yàn)組為Ad5CMVLuc(n＝7；黑色條帶)、Ad5PPE-1Luc(n＝6；灰色條帶)和Ad5PPE-1-3XLuc(n＝13；褐色條帶)?；钚砸怨鈫挝?μg蛋白表示。
處于PPE-1-3X啟動(dòng)子控制之下的螢光素酶表達(dá)在腫瘤轉(zhuǎn)移肺中是其在正常肺中的活性的35倍，是由無所述3X元件的PPE-1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)的3.5倍(p＜0.001)。在注射Ad5PPE-1-3XLuc的小鼠的其它組織中檢測(cè)到非常低的螢光素酶活性。計(jì)算每只經(jīng)注射的動(dòng)物肺中螢光素酶表達(dá)占肝臟中表達(dá)的百分率揭示出，與正常肺中的所述活性相比，腫瘤轉(zhuǎn)移肺中的所述活性增加至10倍(圖38)。
為了將報(bào)道基因表達(dá)定位至特定細(xì)胞類型，使用GFP構(gòu)建體。圖39顯示注射Ad5PPE-1-3XGFP的小鼠腫瘤轉(zhuǎn)移肺中的GFP表達(dá)(圖39A)。通過CD31抗體免疫染色(圖39B)證實(shí)GFP表達(dá)定位于新血管中。在對(duì)照—注射鹽水的小鼠中沒有檢測(cè)到GFP表達(dá)。注射CMV的小鼠支氣管上皮周圍低水平表達(dá)，但在腫瘤轉(zhuǎn)移肺的血管生成性血管中沒有表達(dá)。
概括地講，這些結(jié)果表明，表達(dá)水平大大增加是由于將3X元件導(dǎo)入Ad5PPE-1構(gòu)建體中所致，并且這種增加的表達(dá)對(duì)腫瘤血管生成性血管是特異性的?？赡苁牵^察的效應(yīng)可能與上文所述的低氧應(yīng)答相關(guān)，進(jìn)一步提高了目標(biāo)序列的表達(dá)水平。
實(shí)施例16PPE-1低氧應(yīng)答的進(jìn)一步表征為了進(jìn)一步表征低氧對(duì)鼠PPE-1啟動(dòng)子活性的影響，用一種DNA質(zhì)粒(pEL8；圖26A)轉(zhuǎn)染牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(BAEC)。pEL8質(zhì)粒含有鼠PPE-1啟動(dòng)子(1.4kb)(紅色)、螢光素酶基因(1842bp)、SV40poly A位點(diǎn)和內(nèi)皮縮血管肽-1基因的第一內(nèi)含子，它們合稱為PPE-1啟動(dòng)子盒，如材料和方法中所述的方法，用BamHI限制性酶對(duì)其進(jìn)行消化和提取。轉(zhuǎn)染后，讓細(xì)胞經(jīng)歷低氧條件。
經(jīng)歷18小時(shí)低氧(0.5％O2)的轉(zhuǎn)染BAEC中的螢光素酶表達(dá)是常氧環(huán)境下生長(zhǎng)的細(xì)胞中的螢光素酶表達(dá)的8倍(圖21)。圖21顯示用含有鼠PPE-1啟動(dòng)子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的BAEC中的螢光素酶活性(光單位/μg蛋白)當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞在低氧環(huán)境下孵育時(shí)明顯更高。同樣的轉(zhuǎn)染效率通過與β-半乳糖苷酶報(bào)道載體共轉(zhuǎn)染和LacZ活性的測(cè)定得以證實(shí)。
為了確定由腺病毒載體傳遞的鼠PPE-1啟動(dòng)子是否也受到低氧的正調(diào)節(jié)，用Ad5PPE-1Luc轉(zhuǎn)導(dǎo)BAEC。在該實(shí)驗(yàn)中用Ad5CMVLuc作為非特異性對(duì)照。結(jié)果總結(jié)于圖22中。用Ad5PPE-1Luc轉(zhuǎn)導(dǎo)的BAEC中的低氧螢光素酶活性。與之明顯相反，在Ad5CMV轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中沒有檢測(cè)到常氧和低氧之間的顯著性差異(圖22)。
為了了解PPE-1啟動(dòng)子活性的增強(qiáng)是否是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的，用Ad5PPE-1(moi＝10)轉(zhuǎn)導(dǎo)不同的細(xì)胞系(BAEC、B2B、CHO、RIN和心肌細(xì)胞)，然后讓其經(jīng)歷低氧(0.5％O2)或常氧環(huán)境。結(jié)果總結(jié)于圖23中。螢光素酶表達(dá)在低氧環(huán)境下培養(yǎng)的B2B細(xì)胞中略微增加，而在低氧環(huán)境中培養(yǎng)的BAEC細(xì)胞中顯著增加。與常氧相比，低氧環(huán)境降低其它細(xì)胞系中的螢光素酶表達(dá)。這些結(jié)果證實(shí)，PPE-1啟動(dòng)子的低氧誘導(dǎo)主要在內(nèi)皮細(xì)胞譜系中發(fā)生。
實(shí)施例17所述3X序列對(duì)PPE-1低氧應(yīng)答的影響為了確定所述3X序列對(duì)PPE-1低氧應(yīng)答的影響，用Ad5PPE-1Luc和Ad5PPE-1(3X)Luc轉(zhuǎn)導(dǎo)BAEC。轉(zhuǎn)導(dǎo)后，如上文詳述，將BAEC細(xì)胞或者在低氧環(huán)境中或者在常氧環(huán)境中孵育。結(jié)果總結(jié)于圖24中。使用Ad5PPE-1Luc構(gòu)建體的螢光素酶表達(dá)在對(duì)低氧應(yīng)答時(shí)顯著增加(7倍)(低氧條件下為2578，而常氧條件下為322.1)。相比之下，Ad5PPE-1(3X)Luc構(gòu)建體在對(duì)低氧應(yīng)答時(shí)僅表現(xiàn)出增加至1.5倍(從常氧條件下的2874.5增加至低氧條件下的4315)。這些結(jié)果表明，當(dāng)在PPE-1啟動(dòng)子中加入所述3X序列時(shí)所觀察的高常氧表達(dá)水平在一定程度上起掩蔽低氧應(yīng)答的作用。
實(shí)施例18在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中PPE-1對(duì)低氧應(yīng)答的測(cè)定為了檢查經(jīng)歷局部低氧/局部缺血的組織中的鼠PPE-1啟動(dòng)子活性，使用如上文在材料和方法中描述的mPPE-1-Luc轉(zhuǎn)基因小鼠。如先前描述的方法(Couffinhal T.等(1998)Am.J.Pathol.152；1667-1679)，誘發(fā)小鼠發(fā)生局部后肢的局部缺血。簡(jiǎn)而言之，用戊巴比妥鈉(40mg/kg，IP)麻醉動(dòng)物。通過對(duì)隱動(dòng)脈和腘動(dòng)脈分叉近端約2mm的右股動(dòng)脈結(jié)扎，誘發(fā)后肢發(fā)生單側(cè)局部缺血。為了證實(shí)灌注時(shí)機(jī)能變化的誘導(dǎo)，通過配備7.5MHz傳感器和血管造影軟件的Synergy超聲波系統(tǒng)(GE)，第4天和第14天進(jìn)行超聲波成象。將動(dòng)物在常規(guī)條件下關(guān)養(yǎng)至多18天。
結(jié)扎后2天、5天、10天和18天，測(cè)定局部缺血肌肉、正常未結(jié)扎肌肉、肝臟、肺和主動(dòng)脈中的螢光素酶表達(dá)。
在圖25中總結(jié)的結(jié)果顯示，在結(jié)扎后數(shù)天期間，在肝臟、肺和主動(dòng)脈中沒有檢測(cè)到顯著性差異，但是螢光素酶基因表達(dá)在正常未結(jié)扎肌肉和局部缺血肌肉兩者中在股動(dòng)脈結(jié)扎后增加。結(jié)扎后5天在局部缺血肌肉中檢測(cè)到峰值螢光素酶表達(dá)，而股動(dòng)脈結(jié)扎后10天在未結(jié)扎肌肉中也檢測(cè)到峰值螢光素酶表達(dá)。這表明PPE-1啟動(dòng)子的低氧應(yīng)答在體內(nèi)系統(tǒng)中是有功能的。非局部缺血肌肉中的螢光素酶表達(dá)在所測(cè)試的天數(shù)期間與其在對(duì)照未經(jīng)手術(shù)組織中的表達(dá)(天數(shù)＝0)相比并沒有變化。相比之下，第5天在局部缺血肌肉中的螢光素酶表達(dá)明顯高于其它時(shí)間點(diǎn)。
第5天，PPE-1驅(qū)動(dòng)的螢光素酶表達(dá)是對(duì)照未經(jīng)手術(shù)小鼠的2.5倍并且是第10天和第18天局部缺血肌肉的2.5倍(圖40)。
在經(jīng)歷局部缺血的轉(zhuǎn)基因小鼠的其它非局部缺血組織包括肝臟、肺和主動(dòng)脈中的螢光素酶表達(dá)揭示出，在誘發(fā)局部缺血后18天內(nèi)，在這些組織中的螢光素酶表達(dá)沒有顯著變化(圖41)。
此外，這些結(jié)果證實(shí)，螢光素酶表達(dá)在含有高百分率的內(nèi)皮組織的組織(肺和主動(dòng)脈)中比在含有低百分率的內(nèi)皮組織的組織(肝臟和非局部缺血肌肉)中高。
實(shí)施例19細(xì)胞增殖水平對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中Ad5PPE-1Luc活性的影響為了確定細(xì)胞增殖水平對(duì)Ad5PPE-1Luc的效率和比活的影響，體外測(cè)試內(nèi)皮細(xì)胞血管生成性模型(BAEC)?；蛘咄ㄟ^除去血清誘導(dǎo)經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的BAEC靜息，或者讓其在10％FCS中生長(zhǎng)而正常增殖。簡(jiǎn)而言之，將細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)48小時(shí)或者作為靜息細(xì)胞-除去血清后72小時(shí)，或者作為增殖細(xì)胞-在正常培養(yǎng)基(10％FCS)中。螢光素酶活性以光單位/μg蛋白表示，便得對(duì)于細(xì)胞量的差異都能夠標(biāo)準(zhǔn)化。所給出的結(jié)果是得自4個(gè)代表性獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的三個(gè)重復(fù)試驗(yàn)的平均值。
處于PPE-1啟動(dòng)子控制之下的螢光素酶表達(dá)(空心條帶；圖28)在正常增殖的BAEC中是在靜息細(xì)胞中的4倍，并且在正常增殖的BAEC中是處于CMV啟動(dòng)子控制之下的螢光素酶表達(dá)的25倍(實(shí)心條帶；圖28)。此外，在增殖細(xì)胞中，處于PPE-1啟動(dòng)子控制之下的活性是處于CMV啟動(dòng)子控制之下的活性的10倍。
為了體外模擬血管生成性病癥，測(cè)試通過加入40ng/ml血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)誘導(dǎo)快速增殖的BAEC中的Ad5PPE-1Luc活性。如上文所述，比較在正常增殖細(xì)胞和靜息細(xì)胞中在這些條件下的活性。用VEGF誘導(dǎo)細(xì)胞增殖的BAEC中的螢光素酶表達(dá)是在正常增殖細(xì)胞中的44倍，而是在靜息細(xì)胞中的83倍(圖29)。
總的來講，這些實(shí)驗(yàn)表明，處于PPE-1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制之下的目標(biāo)序列的活性水平隨細(xì)胞增殖水平而變動(dòng)，其中快速增殖引起較高水平的表達(dá)。
實(shí)施例20對(duì)誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的小鼠體內(nèi)的PPE-1啟動(dòng)子的測(cè)定為了測(cè)試動(dòng)脈粥樣硬化血管中Ad5PPE-1載體的效率和特異性，給6月齡ApoE缺陷型小鼠(Plump，A.S.等Cell；1991；71343-353)系統(tǒng)注射1010pfu/ml所述病毒載體。
隨著ApoE缺陷型小鼠衰老，在不提供脂質(zhì)的飲食的誘導(dǎo)下，它們產(chǎn)生高膽固醇值和廣泛的致動(dòng)脈粥樣化斑。圖32是一張從ApoE缺陷型小鼠解剖的蘇丹-IV著色的主動(dòng)脈照片。注意到胸主動(dòng)脈含有的紅色染色的動(dòng)脈粥樣硬化病變較少，而腹部高度動(dòng)脈粥樣硬化(圖32摘自125I-HDL和125I-BSA的主動(dòng)脈粥樣硬化病變成象。A.Shaish等，Pathobiology-已提交待發(fā)表)。
圖33總結(jié)了給ApoE缺陷型小鼠系統(tǒng)注射Ad5PPE-1Luc(空心條帶；n＝12)和Ad5CMVLuc(實(shí)心條帶；n＝12)后5天所觀察到的螢光素酶表達(dá)。結(jié)果以含有較少的動(dòng)脈粥樣硬化病變的胸主動(dòng)脈和富含動(dòng)脈粥樣硬化病變的腹主動(dòng)脈中的絕對(duì)螢光素酶表達(dá)來表示。
與處于對(duì)照CMV啟動(dòng)子控制之下的表達(dá)相比，受PPE-1啟動(dòng)子控制的螢光素酶表達(dá)在高度動(dòng)脈粥樣硬化的腹部中為前者的6倍，而在輕微動(dòng)脈粥樣硬化的胸主動(dòng)脈中為它的1.6倍。
在注射Ad5PPE-1Luc的小鼠的兩個(gè)主動(dòng)脈區(qū)之間沒有觀察到顯著性差異，而在注射Ad5CMVLuc的小鼠胸主動(dòng)脈中與含有病變的腹主動(dòng)脈中的低表達(dá)相比，觀察到較高的螢光素酶表達(dá)。
這些結(jié)果表明，組成型啟動(dòng)子(CMV)在動(dòng)脈粥樣硬化最嚴(yán)重的部位往往不起作用，而PPE-1啟動(dòng)子相對(duì)而言不受疾病進(jìn)程的影響。
實(shí)施例21傷口愈合模型中PPE-1啟動(dòng)子的測(cè)定為了測(cè)試Ad5PPE-1構(gòu)建體在將螢光素酶表達(dá)靶向愈合傷口血管方面的效率和比活，使用如上文在材料和方法中描述的傷口愈合鼠。
如同在其它實(shí)驗(yàn)中一樣，用Ad5CMVLuc作為非組織特異性對(duì)照。處于PPE-1啟動(dòng)子(圖34；空心條帶)控制之下的螢光素酶活性在正常區(qū)域(6.8±3.2)和愈合傷口區(qū)域(5±1.6)中與處于CMV控制(圖34；實(shí)心條帶)之下所觀察到的活性相比都較高。
因?yàn)镃MV啟動(dòng)子和PPE-1啟動(dòng)子在愈合傷口中均表現(xiàn)出降低的表達(dá)水平，所以這些結(jié)果難以解釋。盡管這是意想不到的觀察結(jié)果，但顯然PPE-1啟動(dòng)子在正常和愈合組織中都比CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的水平高。壞死性瘢痕組織的存在可能引起在愈合傷口中用兩種啟動(dòng)子所觀察的降低的表達(dá)水平。
實(shí)施例22VEGF和PDGF-B對(duì)局部缺血肌肉血管的靶向表達(dá)體內(nèi)誘導(dǎo)血管生成時(shí)常會(huì)產(chǎn)生由內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的原發(fā)性細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。這些新生血管容易破裂，易于退化和滲漏并且灌注差。為了克服這些局限制的限制，需要定位、定時(shí)和定量給予各種能夠募集內(nèi)皮細(xì)胞以及周內(nèi)皮細(xì)胞(即小血管中的周皮細(xì)胞或較大血管中的平滑肌細(xì)胞)的血管生成因子。
經(jīng)修飾的前內(nèi)皮縮血管肽原-1啟動(dòng)子PPE-1-3X用來在局部缺血肢體肌肉的內(nèi)皮中表達(dá)VEGF或PDGF-B即將平滑肌細(xì)胞募集到分泌原的內(nèi)皮分泌型因子，從而阻止新形成的血管的超滲透性。
為了測(cè)定VEGF和PDGF-B在局部缺血組織中的表達(dá)，進(jìn)行原位雜交。如圖43A-C所示，當(dāng)在來自Ad5PPE-1-3XVEGF治療的小鼠的局部缺血肌肉切片中可以檢測(cè)到VEGF mRNA的顯著表達(dá)時(shí)，在Ad5CMVVEGF或鹽水治療的小鼠的肌肉切片中卻基本上沒有觀測(cè)到信號(hào)。同樣，在用Ad5PPE-1-3XPDGF-B治療的小鼠的局部缺血肢體肌肉中檢測(cè)到PDGF-B mRNA的存在，而在Ad5CMVPDGF-B或鹽水治療的小鼠中卻沒有(圖43E-G)。有趣的是，圖1A和圖1E中的信號(hào)模式類似血管結(jié)構(gòu)。值得注意的是，不同治療組的代表性肝切片證明VEGF或PDGF-B在Ad5CMV治療的動(dòng)物中大量表達(dá)(圖43D和圖43H)，而在Ad5PPE-1-3X載體治療的小鼠的肝臟沒有檢測(cè)到表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。
總而言之，該試驗(yàn)表明Ad5PPE-1-3X載體介導(dǎo)血管生成因子在靶器官中的可測(cè)量的表達(dá)，而組成型Ad5CMV載體幾乎只在肝組織中表達(dá)其轉(zhuǎn)基因。
實(shí)施例23PPE介導(dǎo)的VEGF表達(dá)增加的血管生成將Ad5PPE-1-3XVEGF的治療效應(yīng)與先前報(bào)道的Ad5CMVVEGF的治療效應(yīng)進(jìn)行比較。股動(dòng)脈結(jié)扎后5天，將109PFU的任一治療載體以及報(bào)道載體Ad5CMV螢光素酶和等體積的鹽水(作為對(duì)照)系統(tǒng)給予小鼠。以血管造影方式獲得兩個(gè)肢體的內(nèi)側(cè)面的超聲波(US)影像。如圖27A-D所示，在結(jié)扎后21天，對(duì)照動(dòng)物中的灌注信號(hào)減少并截?cái)?；然而，在Ad5PPE-1-3XVEGF治療的小鼠和Ad5CMVVEGF治療的小鼠的US影像中觀察到持續(xù)增強(qiáng)的信號(hào)。在兩個(gè)VEGF治療組中第21天的平均灌注強(qiáng)度是對(duì)照組的平均灌注強(qiáng)度的倍(P＜0.01)，并且與所述動(dòng)物的正常對(duì)側(cè)肢體記錄的結(jié)果相似(圖27E)。股動(dòng)脈結(jié)扎后21天進(jìn)行的免疫組織化學(xué)分析以及使用抗CD-31即內(nèi)皮特異性標(biāo)記，分別顯示了與Ad5CMVVEGF組和對(duì)照組中的585CD31+細(xì)胞/mm2和485CD31+細(xì)胞/mm2相比，在Ad5PPE-1-3XVEGF治療的小鼠局部缺血肌肉切片中的平均值為546CD31+細(xì)胞/mm2(圖27F)。該數(shù)據(jù)表明，用Ad5PPE-1-3XVEGF短時(shí)處理與Ad5CMVVEGF的有效CMV啟動(dòng)子處理同樣有效。此外，用H&E染色的小鼠肝切片顯示對(duì)肝炎或其它致病慢性變化沒有指征(數(shù)據(jù)未顯示)，從而排除腺病毒對(duì)肝細(xì)胞的向性效應(yīng)。
實(shí)施例24PPE調(diào)節(jié)的表達(dá)延長(zhǎng)VEGF基因治療的作用組織特異性表達(dá)相對(duì)于促血管生成因子的組成型表達(dá)與血管生成的誘導(dǎo)相一致。在長(zhǎng)達(dá)70天的實(shí)驗(yàn)中，對(duì)PPE調(diào)節(jié)的VEGF表達(dá)和CMV調(diào)節(jié)的VEGF表達(dá)對(duì)灌注和血管生成的影響進(jìn)行了測(cè)試。具有局部缺血肢體的小鼠如上進(jìn)行治療(參見實(shí)施例23)。US成象揭示出自給予病毒后1-2周開始在兩個(gè)治療組中灌注方面的顯著改善，而在對(duì)照組中檢測(cè)到微小變化(數(shù)據(jù)未顯示)。股動(dòng)脈結(jié)扎后50天和60天，檢測(cè)到Ad5PPE-1-3XVEGF治療的遠(yuǎn)期效應(yīng)。與Ad5CMVVEGF或鹽水治療的小鼠相比，在Ad5PPE-1-3XVEGF治療的小鼠中灌注顯著增加。Ad5CMVVEGF治療動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物之間的灌注差異隨時(shí)間間隔的增加而減少。第50天，Ad5PPE-1-3XVEGF治療組的平均灌注強(qiáng)度比Ad5CMVVEGF或鹽水治療的小鼠的平均灌注強(qiáng)度約高50％，但與對(duì)側(cè)正常肢體的平均灌注強(qiáng)度相似(p＜0.01，圖44A)。第70天處死動(dòng)物，Ad5PPE-1-3XVEGF治療小鼠肌肉切片中的毛細(xì)血管密度為747CD31+細(xì)胞/mm2，分別比Ad5CMVVEGF組(474CD31+細(xì)胞/mm2)和對(duì)照組(342CD31+細(xì)胞/mm2)高57％和117％(p＜0.01，圖44B)。
實(shí)施例25PPE啟動(dòng)子內(nèi)皮特異性PDGF-B表達(dá)增加血管生成PDGF-B是旁分泌內(nèi)皮分泌性因子，已經(jīng)表明它參與平滑肌細(xì)胞募集的血管成熟，因而也可能參與血管生成[Edelberg，J.M.等Circulation 105，608-13.(2002)；Hsu等J Cell Physiol 165，239-45.(1995)；Koyama，N.等J Cell Physiol 158，1-6.(1994)]。另外，已經(jīng)表明PDGF-B參與內(nèi)膜增厚[Sano，H.等Circulation 103，2955-60.(2001)；Kaiser，M.等Arthritis Rheum 41，623-33.(1998)]并且參與成纖維細(xì)胞增殖[Nesbit，M.等Lab Invest 81，1263-74.(2001)；Kim，W.J.等Invest Ophthalmol Vis Sci 40，1364-72.(1999)]。在體外和體內(nèi)測(cè)試PDGF-B誘導(dǎo)處于內(nèi)皮特異性調(diào)節(jié)下血管生成的能力。
同Ad5PPE-1-3XVEGF一樣，Ad5PPE-1-3XPDGF-B載體在體外誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中的血管生成變化(數(shù)據(jù)未顯示)。用10MOI的Ad5PPE-1-3XPDGF-B轉(zhuǎn)導(dǎo)在纖維蛋白包被的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致二維環(huán)狀結(jié)構(gòu)的形成和纖維蛋白降解。
對(duì)于體內(nèi)效應(yīng)，小鼠在股動(dòng)脈結(jié)扎后5天，用109PFU的Ad5PPE-1-3XPDGF-B進(jìn)行系統(tǒng)治療。結(jié)扎后30天，Ad5PPE-1-3XPDGF-B治療小鼠的平均灌注強(qiáng)度比對(duì)照組的平均灌注強(qiáng)度約高90％(圖45A)。結(jié)扎后80天，Ad5PPE-1-3XPDGF-B治療組的灌注強(qiáng)度比對(duì)照組的平均灌注強(qiáng)度高60％(圖45B)。
結(jié)扎后35天和90天，測(cè)量毛細(xì)血管密度。在短時(shí)間隔內(nèi)，Ad5PPE-1-3XPDGF-B治療小鼠局部缺血肌肉切片的平均毛細(xì)血管密度為516CD31+細(xì)胞/mm2，而在鹽水治療組中，平均毛細(xì)血管密度為439CD31+細(xì)胞/mm2(圖45C)。結(jié)扎后90天，Ad5PPE-1-3XPDGF-B治療小鼠的平均毛細(xì)血管密度略微增加到566CD31+細(xì)胞/mm2，而在對(duì)照組中檢測(cè)到中等減少(378CD31+細(xì)胞/mm2，圖45D)。
上述結(jié)果表明，Ad5PPE-1-3XPDGF-B載體本身就是一種有效的血管生成療法，它不僅在給藥后短時(shí)誘導(dǎo)血管生成，而且能夠長(zhǎng)時(shí)間維持治療效應(yīng)。在用Ad5PPE-1-3XPDGF-B治療小鼠的肝臟中沒有檢測(cè)到慢性變化。
實(shí)施例26內(nèi)皮細(xì)胞中的PDGF-B表達(dá)使血管成熟采用下列兩種治療模式，對(duì)在聯(lián)合療法中使用VEGF和PDGF-B兩者可以實(shí)現(xiàn)血管系統(tǒng)的血管生成和成熟的進(jìn)一步提高的假設(shè)進(jìn)行試驗(yàn)(i)單獨(dú)給予109PFU的Ad5PPE-1-3XVEGF和109PFU的Ad5PPE-1-3XPDGF-B；(ii)在給予Ad5PPE-1-3XVEGF后5天給予相似劑量的Ad5PPE-1-3XPDGF-B。這兩種模式均獲得相同的結(jié)果，因此將其認(rèn)為是相同結(jié)果。結(jié)扎后90天，與對(duì)照即Ad5PPE-1-3XGFP治療的小鼠相比，所述聯(lián)合療法和Ad5PPE-1-3XVEGF治療小鼠均表現(xiàn)出顯著較高的毛細(xì)血管密度，但在不同治療組中不存在顯著性差異(圖46B)。然而，聯(lián)合療法組US成象的平均灌注強(qiáng)度比Ad5PPE-1-3XVEGF治療組高至多42％(圖46A)。這可以用聯(lián)合療法組和Ad5PPE-1-3XPDGF-B治療的小鼠的局部缺血肌肉小血管進(jìn)行解釋。在用聯(lián)合療法或Ad5PPE-1-3XPDGF-B治療的小鼠肌肉切片中，對(duì)α-SMactin進(jìn)行免疫染色，觀察到血管平滑肌細(xì)胞的明顯染色(圖46C-D)。在對(duì)照小鼠和Ad5PPE-1-3XVEGF治療小鼠中可以觀察到稀疏染色(圖46E-F)。在正常肢體肌肉中，較大的小動(dòng)脈和小靜脈中存在明顯染色(圖46G)。在用Ad5PPE-1-3XPDGF-B治療的小鼠中，相似的結(jié)果早在結(jié)扎后35天就可獲得(數(shù)據(jù)未顯示)。結(jié)扎后35天，治療小鼠肝切片中的慢性變化不明顯。
這些結(jié)果在一個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中得到進(jìn)一步證實(shí)，該實(shí)驗(yàn)是測(cè)定單獨(dú)的PDGF-B和聯(lián)合療法對(duì)結(jié)扎后50天血液灌注的影響。如圖47所示，結(jié)扎后50天，聯(lián)合療法組的血液灌注強(qiáng)度與正常肢體的十分相似。該效應(yīng)是PPE-3X依賴性的，因?yàn)檫@兩種生長(zhǎng)因子的組成型表達(dá)(CMV啟動(dòng)子)僅導(dǎo)致半灌注能力。有趣的是，單獨(dú)的PDGF-B的PPE-3X依賴性表達(dá)可以介導(dǎo)與聯(lián)合療法誘導(dǎo)幾乎相同的灌注(即77％)。然而，使用組成型啟動(dòng)子，這樣的結(jié)果并不是顯而易見的。
這些結(jié)果證實(shí)，PPE-1-3X啟動(dòng)子盡管是系統(tǒng)給藥也能夠足夠強(qiáng)地激活所述治療基因，而不降低在血管生成內(nèi)皮細(xì)胞中的優(yōu)先表達(dá)。此外，這些結(jié)果還證實(shí)PDGF-B作為可介導(dǎo)其血管生成作用的促血管生成因子，而無需再加入公認(rèn)的血管生成生長(zhǎng)因子例如VEGF。
雖然結(jié)合本發(fā)明的具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是顯然許多替代方案、修改和變化對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。因此，本發(fā)明計(jì)劃包括屬于所附權(quán)利要求書的精神和廣范圍內(nèi)所有這樣的改變、修改和變化。本說明書中提及的所有出版物、專利、專利申請(qǐng)和由其登記號(hào)標(biāo)識(shí)的序列通過引用全部結(jié)合到本說明書中，其程度如同每個(gè)單獨(dú)的出版物、專利、專利申請(qǐng)和由其登記號(hào)標(biāo)識(shí)的序列具體而單獨(dú)地通過引用結(jié)合到本文中。另外，本申請(qǐng)中的任何參考文獻(xiàn)的引用或標(biāo)識(shí)不應(yīng)解釋為承認(rèn)這樣的參考文獻(xiàn)對(duì)于本發(fā)明而言是現(xiàn)有技術(shù)。
序列表<110>脈管生物生長(zhǎng)有限公司(Vascular Biogenics Ltd.)<120>表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞特異性的啟動(dòng)子及其使用方法<130>02/23345<150>US 60/248,582<151>2000-11-17<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1334<212>DNA<213>小家鼠(Mus musculus)<400>1gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtagtgta cttctgatcg60gcgatactag ggagataagg atgtacctga caaaaccaca ttgttgttgt tatcattatt120atttagtttt ccttccttgc taactcctga cggaatcttt ctcacctcaa atgcgaagta180ctttagttta gaaaagactt ggtggaaggg gtggtggtgg aaaagtaggg tgatcttcca240aactaatctg gttccccgcc cgccccagta gctgggattc aagagcgaag agtggggatc300gtccccttgt ttgatcagaa agacataaaa ggaaaatcaa gtgaacaatg atcagcccca360cctccacccc acccccctgc gcgcgcacaa tacaatctat ttaattgtac ttcatacttt420tcattccaat ggggtgactt tgcttctgga gaaactcttg attcttgaac tctggggctg480gcagctagca aaaggggaag cgggctgctg ctctctgcag gttctgcagc ggtctctgtc540tagtgggtgt tttctttttc ttagccctgc ccctggattg tcagacggcg ggcgtctgcc600tctgaagtta gccgtgattt cctctagagc cgggtcttat ctctggctgc acgttgcctg660tgggtgacta atcacacaat aacattgttt agggctggaa taaagtcaga gctgtttacc720cccactctat aggggttcaa tataaaaagg cggcggagaa ctgtccgagt cagacgcgtt780cctgcaccgg cgctgagagc ctgacccggt ctgetccgct gtccttgcgc gctgcctccc840ggctgcccgc gacgctttcg ccccagtgga agggccactt gctgaggacc gcgctgagat900
ctaaaaaaaa aacaaaaaac aaaaaacaaa aaaacccaga ggcgatcaga gcgaccagac 960accgtcctct tcgttttgca ttgagttcca tttgcaaccg agttttcttt ttttcctttt 1020tccccactct tctgacccct ttgcagaatg gattattttc ccgtgatctt ctctctgctg 1080ttcgtgactt tccaaggagc tccagaaaca ggtaggcgcc acttgcgaat ctttctactt 1140cagcgcagca gttatcgctt ctgttttcca cttttctttc tttcttttct ttcattcttt 1200cctttttatt tattttttta attactgaag ctccagcagc aagtgcctta caattaatta 1260acttctgtgt gaagcgaaag aaataaaacc cctgtttgaa tacagctgac tacaaccgag 1320tatcgcatag cttc1334<210>2<211>96<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>2gctagcgtac ttcatacttt tcattccaat ggggtgactt tgcttctgga gggtgacttt60gcttctggag ccaatgggta cttcatactt ttcatt 96<210>3<211>96<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成寡核苷酸<400>3gctagcctcc agaagcaaag tcaccccatt ggaatgaaaa gtatgaagta caatgaaaag60tatgaagtac ccattggctc cagaagcaaa gtcacc 96<210>4<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Nhe-1限制位點(diǎn)<400>4gctagc 6<210>5<211>6<212>DNA<213>小家鼠(Mus musculus)<220>
<221>misc feature<223>低氧效應(yīng)元件-E框<400>5gcacgt 6<210>6<211>44<212>DNA<213>小家鼠(Mus musculus)<220>
<221>misc_feature<223>鼠內(nèi)皮特異性增強(qiáng)子元件<400>6gtacttcata cttttcattc caatggggtg actttgcttc tgga 44<210>7<211>143<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>起源于PPE-1啟動(dòng)子的鼠增強(qiáng)子序列的三聯(lián)拷貝<400>7gtacttcata cttttcattc caatggggtg actttgcttc tggagggtga ctttgcttct60
ggagccagta cttcatactt ttcattgtac ttcatacttt tcattccaat ggggtgactt120tgcttctgga ggctagctgc cag143<210>8<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>EDc片段<400>8ctggagggtg actttgcttc tggagccagt acttcatact tttcatt 4權(quán)利要求
1.一種在真核細(xì)胞中作為啟動(dòng)子起作用的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含一個(gè)增強(qiáng)子元件，所述增強(qiáng)子元件包括至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO8中所示的序列。
2.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其中所述增強(qiáng)子元件還包括至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO6中所示的序列。
3.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其中所述增強(qiáng)子元件包括一個(gè)拷貝的SEQ ID NO8中所示的序列和至少兩個(gè)拷貝的SEQ ID NO6中所示的序列。
4.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸還包含一個(gè)內(nèi)皮特異性啟動(dòng)子元件。
5.權(quán)利要求4的分離的多核苷酸，其中所述內(nèi)皮特異性啟動(dòng)子元件包含至少一個(gè)拷貝的PPE-1啟動(dòng)子。
6.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸還包含一個(gè)低氧效應(yīng)元件。
7.權(quán)利要求6的分離的多核苷酸，其中所述低氧效應(yīng)元件包括至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO5中所示的序列。
8.權(quán)利要求1的分離的多核苷酸，其中所述增強(qiáng)子元件如SEQID NO7中所示。
9.一種包含權(quán)利要求1的分離的多核苷酸和目標(biāo)核酸序列的核酸構(gòu)建體，所述目標(biāo)核酸序列處于所述分離的多核苷酸的調(diào)節(jié)控制之下。
10.權(quán)利要求9的核酸構(gòu)建體，其中所述目標(biāo)核酸序列選自VEGF、p55和PDGF-BB。
11.一種用權(quán)利要求1的分離的多核苷酸轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
12.一種在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)目標(biāo)核酸序列的方法，所述方法包括給予受治療者一種構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含所述目標(biāo)核酸序列和一個(gè)增強(qiáng)子元件，所述目標(biāo)核酸序列處于在真核細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)控制之下，而所述增強(qiáng)子元件包括至少一個(gè)拷貝的SEQ IDNO8中所示的序列。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述啟動(dòng)子表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞特異性。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述啟動(dòng)子是SEQ ID NO1中所示的PPE-1啟動(dòng)子。
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述增強(qiáng)子元件還包括至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO6中所示的序列。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述增強(qiáng)子元件如SEQ ID NO7中所示。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO6中所示的序列包括兩個(gè)拷貝。
18.權(quán)利要求15的方法，其中所述至少兩個(gè)拷貝的SEQ ID NO6中所示的序列是相鄰的。
19.權(quán)利要求12的方法，其中所述目標(biāo)核酸序列選自VEGF、p55和PDGF-BB。
20.權(quán)利要求12的方法，其中通過選自以下的方法實(shí)現(xiàn)給藥(i)體內(nèi)系統(tǒng)給藥；(ii)對(duì)從受治療者體內(nèi)取出的細(xì)胞離體給藥，并且隨后將所述細(xì)胞再回輸給所述受治療者體內(nèi)；和(iii)體內(nèi)局部給藥。
21.一種調(diào)節(jié)組織中血管生成的方法，所述方法包括給予一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包括(a)一個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子；(b)至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO5中所示的低氧效應(yīng)元件；和(c)一個(gè)編碼血管生成調(diào)節(jié)劑的核酸序列，所述核酸序列處于所述啟動(dòng)子和所述低氧效應(yīng)元件的調(diào)節(jié)控制之下。
22.權(quán)利要求21的方法，其中通過選自以下的方法實(shí)現(xiàn)給藥(i)體內(nèi)系統(tǒng)給藥；(ii)對(duì)從受治療者體內(nèi)取出的細(xì)胞離體給藥，并且隨后將所述細(xì)胞再回輸給所述受治療者體內(nèi)；和(iii)體內(nèi)局部給藥。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述核酸構(gòu)建體還包含(d)一個(gè)增強(qiáng)子元件，所述增強(qiáng)子元件包括至少一個(gè)拷貝的SEQID NO8中所示的序列。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述增強(qiáng)子元件如SEQ ID NO7中所示。
25.權(quán)利要求23的方法，其中所述核酸構(gòu)建體還包含(e)至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO6中所示的序列。
26.權(quán)利要求24的方法，其中所述至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO6中所示的序列包括兩個(gè)相鄰的拷貝。
27.權(quán)利要求21的方法，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子包含至少一個(gè)拷貝的PPE-1啟動(dòng)子。
28.權(quán)利要求21的方法，其中所述編碼血管生成調(diào)節(jié)劑的核酸序列選自VEGF、p55和PDGF-BB。
29.一種在真核細(xì)胞中作為啟動(dòng)子起作用的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸包含一個(gè)增強(qiáng)子元件，所述增強(qiáng)子元件包括在SEQID NO7中所示的序列。
30.權(quán)利要求29的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸還包含一個(gè)內(nèi)皮特異性啟動(dòng)子元件。
31.權(quán)利要求30的分離的多核苷酸，其中所述內(nèi)皮特異性啟動(dòng)子元件包含至少一個(gè)拷貝的PPE-1啟動(dòng)子。
32.權(quán)利要求29的分離的多核苷酸，所述分離的多核苷酸還包含一個(gè)低氧效應(yīng)元件。
33.權(quán)利要求32的分離的多核苷酸，其中所述低氧效應(yīng)元件包括至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO5中所示的序列。
34.一種包含權(quán)利要求29的分離的多核苷酸和目標(biāo)核酸序列的核酸構(gòu)建體，所述目標(biāo)核酸序列處于所述分離的多核苷酸的調(diào)節(jié)控制之下。
35.權(quán)利要求34的核酸構(gòu)建體，其中所述目標(biāo)核酸序列選自VEGF、p55和PDGF-BB。
36.一種用權(quán)利要求29的分離的多核苷酸轉(zhuǎn)化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
37.一種調(diào)節(jié)組織中血管生成的方法，所述方法包括給予一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包括(a)一個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子；(b)一個(gè)增強(qiáng)子元件，所述增強(qiáng)予元件包括SEQ ID NO7中所示的序列；(c)至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO5中所示的低氧效應(yīng)元件；和(d)一個(gè)編碼血管生成調(diào)節(jié)劑的核酸序列，所述核酸序列處于所述啟動(dòng)子、所述增強(qiáng)子元件和所述低氧效應(yīng)元件的調(diào)節(jié)控制之下。
38.權(quán)利要求37的方法，其中通過選自以下的方法實(shí)現(xiàn)給藥(i)體內(nèi)系統(tǒng)給藥；(ii)對(duì)從受治療者體內(nèi)取出的細(xì)胞離體給藥，并且隨后將所述細(xì)胞再回輸給所述受治療者體內(nèi)；和(iii)體內(nèi)局部給藥。
39.權(quán)利要求37的方法，其中所述內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子包含至少一個(gè)拷貝的PPE-1啟動(dòng)子(SEQ ID NO1)。
40.權(quán)利要求37的方法，其中所述編碼血管生成調(diào)節(jié)劑的核酸序列選自VEGF、p55和PDGF-BB。
41.一種調(diào)節(jié)組織中血管生成的方法，所述方法包括給予一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包括(a)一個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞特異性啟動(dòng)子；(b)一個(gè)增強(qiáng)子元件，所述增強(qiáng)子元件包括至少一個(gè)拷貝的SEQID NO8中所示的序列；和(c)一個(gè)編碼血管生成調(diào)節(jié)劑的核酸序列，所述核酸序列處于所述啟動(dòng)子和所述增強(qiáng)子元件的調(diào)節(jié)控制之下。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述增強(qiáng)子元件還包括至少一個(gè)拷貝的SEQ ID NO6中所示的序列。
43.權(quán)利要求41的方法，其中所述增強(qiáng)子元件包括一個(gè)拷貝的SEQ ID NO8中所示的序列和至少兩個(gè)拷貝的SEQ ID NO6中所示的序列。
44.權(quán)利要求41的方法，其中所述核酸構(gòu)建體還包括一個(gè)低氧效應(yīng)元件。
全文摘要
公開了一種在真核細(xì)胞中作為啟動(dòng)子起作用的分離的多核苷酸。所述分離的多核苷酸包括本發(fā)明說明書中詳述的內(nèi)皮特異性增強(qiáng)子元件。還公開了一種在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)目標(biāo)核酸序列的方法。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1703420SQ03815262
公開日2005年11月30日 申請(qǐng)日期2003年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月1日
發(fā)明者D·哈拉特斯 申請(qǐng)人:脈管生物生長(zhǎng)有限公司