專利名稱：人體原始干細(xì)胞自體同源培養(yǎng)基及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，在細(xì)胞療法允許使用的情況下，本發(fā)明與人體自體同源原始干細(xì)胞的獲取和操作有關(guān)。特別地，本發(fā)明不僅提到了這些細(xì)胞的自體同源培養(yǎng)基，也提到了該培養(yǎng)基在上述細(xì)胞和含上述細(xì)胞合成物的培養(yǎng)與繁殖中的用途。
背景技術(shù)：
在大多數(shù)破壞性或喪失功能的疾病治療中，如神經(jīng)退化病(帕金森癥和阿爾茨海默氏病)、糖尿病、肌肉疾病、心臟病和肝衰竭等，允許更換或修復(fù)受損細(xì)胞或組織的治療策略發(fā)展是生物醫(yī)學(xué)研究的最大挑戰(zhàn)之一。
細(xì)胞療法是最有前景的治療策略之一，它基于以下眾所周知的事實(shí)可獲取沒多少差別的細(xì)胞，它們能夠自我分裂生成功能迥異的細(xì)胞；而且，有時候它們甚至能自我復(fù)制。這些細(xì)胞包括干細(xì)胞和原始細(xì)胞(前驅(qū)細(xì)胞)，應(yīng)該被共稱為原始干細(xì)胞，可在胚胎甚至是成年人組織中找到。因此，細(xì)胞療法就是將足量的原始干細(xì)胞移植或植入到病人身體，以修復(fù)或恢復(fù)受損器官的功能。
細(xì)胞療法的推薦方法之一是基于原始干細(xì)胞的使用，這些細(xì)胞可來源于成年人、動物(異基因細(xì)胞)、捐贈者(外源細(xì)胞)或合適的病人(自體同源細(xì)胞)。自體同源原始干細(xì)胞的使用可避免其它細(xì)胞療法的某些不利情況，如缺乏捐贈者、需要進(jìn)行免疫抑制處理以避免病人的排斥反應(yīng)、以及與使用胚胎細(xì)胞相關(guān)的倫理局限。
盡管如此，細(xì)胞療法成為事實(shí)、發(fā)展每個病例中合適細(xì)胞及如何識別的更好知識、和發(fā)展原始干細(xì)胞的正確操作程序以利于臨床使用仍是必要的。
對于心臟病(缺血性心臟病，心功能不全等)的治療，自體同源細(xì)胞心肌成型術(shù)是細(xì)胞療法的具體范例。最新的常規(guī)說明可見于Curr.Control.TrialsCardiovasc Med.2001；2208-210(D.A.Taylor)。用于細(xì)胞心肌成型術(shù)的原始干細(xì)胞的隔離、培養(yǎng)、繁殖和使用程序與成分可見于US5130141，WO/0107568，WO/0194555，WO79854301，US2001/0038837和US5543318。

發(fā)明內(nèi)容
一般而言，本發(fā)明面臨提供適用于細(xì)胞療法的自體同源人體原始干細(xì)胞的困難。特別是對于原始干細(xì)胞在臨床使用的正確操作，包括細(xì)胞的獲得、培養(yǎng)、凈化和繁殖，面臨制訂有效程序的困難。
本發(fā)明提出的解決方案基于發(fā)明者使用自體同源培養(yǎng)基過程中觀察到的事實(shí)。該培養(yǎng)基由人體自體同源血清、營養(yǎng)物和抗凝血劑組成，可在體外培養(yǎng)。人體原始干細(xì)胞的凈化與繁殖可用于加工藥物合成物，通過細(xì)胞療法治療各種病癥。
本發(fā)明通過以下方面闡釋獲取自體同源培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由營養(yǎng)物、人體自體同源血清、肝磷脂和精蛋白組成；該培養(yǎng)基用于體外培養(yǎng)；人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的凈化與繁殖非常有用，可用于制作合適的藥物合成物，通過自體同源細(xì)胞心肌成型術(shù)治療缺血性心肌病和先天性心肌病。
一方面，本發(fā)明與人體自體同源原始干細(xì)胞培養(yǎng)基有關(guān)，該培養(yǎng)基由人體自體同源血清、營養(yǎng)物、抗凝血劑和具有反轉(zhuǎn)阻凝作用的試劑組成。
另一方面，本發(fā)明與上述的人體自體同源原始干細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法有關(guān)。在特殊的工具中，利用血漿除去法分離出人體自體同源血清，用于該培養(yǎng)基的制備。
另一方面，本發(fā)明與上述培養(yǎng)基的使用有關(guān)，使用范圍包括人體自體同源原始干細(xì)胞的體外培養(yǎng)、純化和繁殖。
另一方面，本發(fā)明與人體自體同源原始干細(xì)胞合成物的獲取方法有關(guān)。該方法包括上述人體自體同源原始干細(xì)胞在上述培養(yǎng)基中的培育，以及所獲的人體自體同源原始干細(xì)胞的純化。
另一方面，本發(fā)明與人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞合成物的獲取方法有關(guān)，該合成物對細(xì)胞療法中干細(xì)胞的使用很有用處。該獲取方法包括上述人體自體同源原始干細(xì)胞在上述培養(yǎng)基中的培育，以及所獲的人體自體同源原始干細(xì)胞的純化。
另一方面，本發(fā)明與富集在人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞中的合成物有關(guān)。
另一方面，本發(fā)明與一種藥用合成物有關(guān)。該合成物由人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞，以及一種或多種從藥物的觀點(diǎn)看來可接受的賦形劑組成。
另一方面，本發(fā)明與被稱為自體同源細(xì)胞心肌成型術(shù)的治療方法有關(guān)。該治療方法通過植入由人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞、心臟組織再生器和在自體同源培養(yǎng)基中進(jìn)行體外繁殖組成的藥用合成物，生成、再生和修復(fù)受損的心肌組織。


圖1是表征左心室功能評價的直條圖，該評價通過分析左室射血分?jǐn)?shù)得出。左室射血分?jǐn)?shù)是在外科手術(shù)前(基礎(chǔ)值)、細(xì)胞移植后40天訪視(40天)和細(xì)胞移植后3個月訪視(3個月)時，通過二維超聲波心動圖和邊界自動探測(ABD)計(jì)算得出。
圖2顯示灌注評價結(jié)果，該結(jié)果是在外科手術(shù)前(基礎(chǔ)值)和細(xì)胞移植后3個月(FU3個月)時，利用13N-銨進(jìn)行PET成像和利用PET 18F-FDG測定葡萄糖的代謝得出。圖2A對應(yīng)于5號病人心臟的影像，它表征接受細(xì)胞移植的典型病例。圖2B對應(yīng)于9號病人心臟的影像，該病人未接受細(xì)胞移植(骨骼生肌細(xì)胞培養(yǎng)受到了污染)。箭頭表示外科手術(shù)前后梗塞組織的情況。
具體實(shí)施例方式
1.自體同源培養(yǎng)基首先，本發(fā)明與人體自體同源原始干細(xì)胞的一種自體同源培養(yǎng)基有關(guān)，以下稱為“本發(fā)明的自體同源培養(yǎng)基”，它由以下成分組成1)占0.1～90％重量的人體自體同源血清；
2)含量為0.1％～10,000UI/ml的肝磷脂；3)含量為0.1％～10,000UI/ml的精蛋白；和4)含基本營養(yǎng)物(含有或不含谷酰胺)的培養(yǎng)基，它應(yīng)有足夠的數(shù)量，可占重量的100％。
本發(fā)明的自體同源培養(yǎng)基完全由人體自體同源血清加工而成，該血清來自于即將進(jìn)行人體自體同源原始干細(xì)胞移植的病人。若有要求，人體自體同源血清可進(jìn)行常規(guī)處理以降低補(bǔ)體的活性，如熱處理。
人體自體同源血清可通過常規(guī)處理從即將進(jìn)行人體自體同源原始干細(xì)胞移植的病人身上取得，例如來源于病人的血樣，或最好用血漿除去法從上述病人身上取出。在本發(fā)明的特殊工具中，血漿除去法通過使用肝磷脂作為抗凝血劑和使用精蛋白硫酸鹽起反向阻凝作用來完成。眾所周知，血漿除去法通常使用ACD(酸-檸檬酸鹽-葡萄糖抗凝血劑溶液)進(jìn)行。例如，在1升水中加入檸檬酸一水合物(8g)，檸檬酸鹽(22g)和葡萄糖一水合物(24.5g)作為抗凝血劑，然后為了反轉(zhuǎn)ACD的影響和用血漿除去法獲得血清，有必要加入鈣，鈣會在以后干擾細(xì)胞的培養(yǎng)。血漿除去法處理允許獲得非常高的血清供應(yīng)，比從病人血樣中獲得血清的方法好。由于在此處的血漿除去法中病人沒有血液損失，這對病人非常有利。此外，使用來自于血漿除去法含有肝磷脂和精蛋白的血清會使它在培養(yǎng)基中的使用沒有細(xì)胞培養(yǎng)的后續(xù)麻煩。
本發(fā)明的自體同源培養(yǎng)基含有基本的營養(yǎng)物，并可選擇是否含有谷氨酸?？傻玫胶?xì)胞培養(yǎng)基本營養(yǎng)物的商業(yè)基質(zhì)。原則上本發(fā)明可使用任何能為細(xì)胞培養(yǎng)提供基本營養(yǎng)物的基質(zhì)。特別地，HAM F12[GIBCO BRL]基質(zhì)含有這些營養(yǎng)物。
特別地，本發(fā)明的自體同源培養(yǎng)基還另含有一種抗生素。實(shí)際上，本發(fā)明目前可使用任何抗生素。特別地，本發(fā)明的自體同源培養(yǎng)基含有青霉素、鏈霉素、慶大霉素和它們的混合物四者之一。同樣地，如果愿意，本發(fā)明的自體同源培養(yǎng)基可含有抗真菌劑，例如兩性霉素B，和/或生長因素，例如成纖維細(xì)胞生長因子如天然或重組體基本成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)。
特別地，本發(fā)明的自體同源培養(yǎng)基由以下成分組成
HAM F12基質(zhì)，占重量的89％；10％來自于病人的自體同源血清；肝磷脂0.1～10,000UI/ml；精蛋白0.1～10,000UI/ml；和1％青霉素/鏈霉素和，可選0.25mg/ml兩性霉素B和/或0.1～250pg/ml重組體基本成纖維細(xì)胞生長因子(bF00000GF)。
2.本發(fā)明的自體同源培養(yǎng)基制備方法另一方面，本發(fā)明與本發(fā)明提供的人體自體同源原始干細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法有關(guān)，它包括將此處的不同組分混合攪勻。
如前所述，在較有利的方式中，上述人體自體同源血清通過血漿除去法獲得，使用肝磷脂作為抗凝血劑取得血漿，使用精蛋白起反轉(zhuǎn)阻凝作用獲得血清。通過這種方式獲得的人體自體同源血清中含有肝磷脂和精蛋白。
3.使用本發(fā)明的自體同源培養(yǎng)基另一方面，本發(fā)明與本發(fā)明的自體同源培養(yǎng)基使用于人體自體同源原始干細(xì)胞體外培養(yǎng)、純化和繁殖有關(guān)。
在培養(yǎng)基中使用人體自體同源血清繁殖人體自體同源原始干細(xì)胞有許多好處，例如，細(xì)胞繁殖可在世界上的任何地方進(jìn)行，沒有蛋白感染素疾病、病毒和動物寄生蟲病污染的風(fēng)險，而這些風(fēng)險對于使用牛胎兒血清用于細(xì)胞生長的細(xì)胞培養(yǎng)傳統(tǒng)技術(shù)是固有的。在人體細(xì)胞培養(yǎng)中使用人體自體同源血清取代牛血清有極大的益處，如(1)它避免了抗原-抗體反應(yīng)；(2)它避免了異種蛋白引起的炎性反應(yīng)；和(3)它避免了重復(fù)性的灌洗導(dǎo)致的細(xì)胞破壞，因?yàn)樵谝肴梭w之前，細(xì)胞需先在牛血漿中培養(yǎng)。實(shí)際上，目前的自體同源細(xì)胞心肌成型術(shù)的臨床經(jīng)驗(yàn)表明，用牛血漿培養(yǎng)的細(xì)胞治療2周后，病人有惡性心室心律不齊現(xiàn)象，40％病例有并發(fā)癥，需要可植入性去顫器。
4.人體自體同源原始干細(xì)胞合成物的制備方法另一方面，本發(fā)明與人體自體同源原始干細(xì)胞合成物的制備方法有關(guān)，它包括在本發(fā)明的自體同源培養(yǎng)基中孵育上述人體自體同源原始干細(xì)胞，并且純化獲得的人體自體同源原始干細(xì)胞。
實(shí)際上，任何人體自體同源原始干細(xì)胞都可以在本發(fā)明的自體同源培養(yǎng)基中培養(yǎng)和繁殖，在每個實(shí)例中，自動適應(yīng)基質(zhì)的狀態(tài)培養(yǎng)具體的細(xì)胞類型。盡管如此，特別的認(rèn)識詳述于下一節(jié)，那些人體自體同源原始干細(xì)胞是人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞。
人體自體同源原始干細(xì)胞可通過活組織檢查的方式從即將植入人體自體同源原始干細(xì)胞的合適的病人身上獲得。
允許細(xì)胞生長和分裂的情況下，在本發(fā)明的自體同源培養(yǎng)基中孵育人體自體同源原始干細(xì)胞。
人體自體同源原始干細(xì)胞的純化可通過常規(guī)方法達(dá)到。特別地，上述人體自體同源原始干細(xì)胞的純化由免疫和純化組成，它通過使用人體自體同源原始干細(xì)胞的特殊和選擇性抗體進(jìn)行，允許識別上述人體自體同源原始干細(xì)胞的體外抗原特征。方便的是，上述人體自體同源原始干細(xì)胞的特殊和選擇性抗體通過磁性細(xì)胞分離器的方式聯(lián)合形成磁性微球，以純化和富集人體自體同源原始干細(xì)胞。
前述方法獲得的人體自體同源原始干細(xì)胞可作為藥物合成物的形式，用于基因治療。
5.人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的獲取方法如前所述，特別地和優(yōu)先地，本發(fā)明的人體自體同源原始干細(xì)胞是指人體自體同源肌肉(生肌細(xì)胞)原始干細(xì)胞。
因此，另一方面，本發(fā)明與人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的獲取方法有關(guān)，適宜于在細(xì)胞療法中使用，該方法包括上述人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞在前述培養(yǎng)基中孵育和純化。
人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞可通過活組織檢查的方式，特別是骨骼肌肉活組織檢查，從即將植入人體自體同源原始干細(xì)胞的合適的病人身上獲得。
以前研究表明，在活組織檢查區(qū)域進(jìn)行活組織檢查之前，將含有刺激人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞增殖藥劑的藥物合成物引入病人體內(nèi)，以便在最初培養(yǎng)時增加上述細(xì)胞的數(shù)量。特別地，在進(jìn)行骨骼肌肉活組織檢查之前，本預(yù)處理通過肌肉將含有上述刺激人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞增殖藥劑的藥物合成物引入病人體內(nèi)，通常時間為活組織檢查前15分鐘到2天，引入位置為將進(jìn)行活組織檢查的區(qū)域。特別地，上述藥劑為局部止痛藥，如利多卡因或丁哌卡因，可刺激成肌細(xì)胞增殖，這可在以后細(xì)胞培養(yǎng)的高效率反映出來。
通過骨骼肌肉活組織檢查收集到肌肉組織樣品，該樣品經(jīng)過常規(guī)處理消化肌纖維，這在下文會詳細(xì)描述。產(chǎn)生的細(xì)胞懸浮液在本發(fā)明的自體同源培養(yǎng)基中培養(yǎng)。一般而言，通過肌肉活組織檢查萃取的樣品含有不同組織，如脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、mesenquimal原本、造血干細(xì)胞、肌纖維、維管組織(內(nèi)皮，平滑肌)、和顯然地，成肌細(xì)胞和衛(wèi)星細(xì)胞。典型地，從活組織檢查萃取的骨骼肌肉樣品中被定義為CD56+/CD45-的人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞含量低于10％。同樣地，還含有小百分比的很難鑒定的干細(xì)胞(衛(wèi)星細(xì)胞)，它們可自我復(fù)制并向肌肉細(xì)胞分化。這些肌肉細(xì)胞的抗原表達(dá)為CD56，可能是肌肉原始細(xì)胞。目前已知道，該細(xì)胞分化程序包括以下步驟衛(wèi)星細(xì)胞轉(zhuǎn)化成成肌細(xì)胞，然后長成不成熟肌細(xì)胞，再長成成熟肌細(xì)胞，最終長成肌纖維。肌肉原始細(xì)胞可能是成肌細(xì)胞和肌細(xì)胞(成熟和不成熟)，這可通過抗原CD56的存在、肌間線蛋白的胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)和抗原CD45的缺失(就是說，它們表現(xiàn)出顯型CD56+/肌間線蛋白+/CD45-)確認(rèn)。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，衛(wèi)星細(xì)胞和成肌細(xì)胞不斷增殖，最終變成肌細(xì)胞。因此，經(jīng)過孵育和細(xì)胞繁殖，培養(yǎng)基中累積了成肌細(xì)胞和肌細(xì)胞(成熟和不成熟)，它們用于藥物合成物的加工，以便將人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞注射到病人體內(nèi)。一旦被注射，它們就會在合適的病人體內(nèi)結(jié)束分化過程，長成肌肉纖維或肌纖維，顯現(xiàn)其功能。
人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞在本發(fā)明的自體同源培養(yǎng)基中的孵育在允許細(xì)胞繁殖(生長和分化)的條件下進(jìn)行。
人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的純化可用常規(guī)方法進(jìn)行。特別地，上述人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的純化包括其特定和選擇性抗體的使用，該抗體可識別上述人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的細(xì)胞外抗原特征，例如，人體抗體抗CD56(CD56是一種骨骼肌肉的細(xì)胞外抗原特征)在沒有造血細(xì)胞的特定抗原CD45時出現(xiàn)(這就是說，選擇了顯示顯型CD56+/CD45-的細(xì)胞)。
上述抗體通過磁性細(xì)胞隔離器的方式聯(lián)合形成磁性微滴，純化和富集人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞。特別地，在進(jìn)行人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的識別和隔離之前，細(xì)胞培養(yǎng)先進(jìn)行平皿接種以去除不良的成纖維細(xì)胞。在這種情況下，人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的純化由以下步驟組成細(xì)胞培養(yǎng)先進(jìn)行平皿接種以去除全部或部分不良的成纖維細(xì)胞，然后，使用人體抗體抗CD56選擇性地聯(lián)合形成磁性微滴，識別和隔離人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞，選擇出顯示顯型CD56+/CD45-的細(xì)胞。
按照前述方法獲得含有人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的合成物構(gòu)成了本發(fā)明的另一方面。
作為選擇，本發(fā)明提供了獲取人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的程序，即從骨骼肌肉活組織檢查開始制備藥物合成物，它包括1)對即將植入人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的病人施行活組織檢查，提取含有人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的骨骼肌肉組織片段；2)在允許繁殖的條件下，上述來自骨骼肌肉的人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞在本發(fā)明的自體同源培養(yǎng)基中培養(yǎng)；3)上述培養(yǎng)的人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞純化；和4)收集上述純化的人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞；和可選地，5)冷凍上述純化的人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞，直到開始制備該藥物合成物。
如前所述，在實(shí)施活組織檢查前2天到15分鐘時間內(nèi)，在將要進(jìn)行活組織檢查的區(qū)域，對病人局部注射利多卡因或丁哌卡因，刺激人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的增殖，以便在培養(yǎng)的初始階段增加該細(xì)胞的數(shù)量。
在允許繁殖的條件下，來自于骨骼肌肉的人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞在本發(fā)明的自體同源培養(yǎng)基中培養(yǎng)。它包括一系列的常規(guī)預(yù)處理，例如灌洗-去除脂肪組織，肌肉剝落，酶分解，過濾，和通過如沉淀的方法收集細(xì)胞。一般而言，肌纖維經(jīng)過酶消化會生成含大量細(xì)胞碎屑的細(xì)胞懸浮物。經(jīng)過培養(yǎng)階段，細(xì)胞和纖維碎片被去除，該懸浮物富集在肌肉原始干細(xì)胞中。
純化培養(yǎng)的人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的目的，是為了獲得在不含成纖維細(xì)胞的人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞中富集的合成物。為達(dá)到該目的，細(xì)胞培養(yǎng)可進(jìn)行第一階段的平皿預(yù)處理，它可使成纖維細(xì)胞比成肌細(xì)胞或衛(wèi)星細(xì)胞更快沉淀。然后通過任何常規(guī)方法，對上述人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的識別和分離處理，例如，通過使用該細(xì)胞特殊和選擇性抗體，可識別上述顯示CD56+/CD45-表型的人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞，通過特定可識別人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的抗體，選擇性地聯(lián)合形成磁性微滴。
另一方面，本發(fā)明與一種藥物合成物有關(guān)，該藥物含有人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞，和至少一種從藥物觀點(diǎn)看來可接受的賦形劑。特別地，該藥物適宜于從腸胃外引入病人體內(nèi)。從原理上看，任何從藥物觀點(diǎn)看來可接受和能夠傳送人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的賦形劑均可用于本發(fā)明。特別地，該藥物合成物包括白蛋白，它可用作賦形劑使人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞重新懸浮。
使用于現(xiàn)有發(fā)明的術(shù)語“藥物合成物”是指為用于細(xì)胞植入治療而制備的人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞合成物。它包括至少2,000萬細(xì)胞，細(xì)胞密度至少為5,000萬細(xì)胞/毫升，和至少40％自體同源原始干細(xì)胞CD56+/CD45-，本發(fā)明的自體同源培養(yǎng)基，和至少一種從藥物觀點(diǎn)看來可接受的賦形劑。特別地，該藥物合成物由以下成分組成2,000萬到2億細(xì)胞，細(xì)胞密度為5,000萬～7,000萬細(xì)胞/毫升，至少70％自體同源原始干細(xì)胞CD56+/CD45-，本發(fā)明的自體同源培養(yǎng)基，和數(shù)量占總重量0.1％到20％的人體白蛋白。
根據(jù)前述方法獲得的人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞以及含有它們的藥物合成物，可用于制備下列藥物合成物用于修復(fù)和/或重組心肌組織，和/或用于后天性局部缺血心機(jī)能不全的治療，和/或用于治療擴(kuò)張性心肌病和/或用于治療非缺血性心肌病。
6.治療程序另一方面，本發(fā)明與自體同源細(xì)胞心肌成型術(shù)的治療程序有關(guān)，它通過植入含有人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的藥物合成物，生成、再生和修復(fù)受損的心肌組織，因?yàn)樵摵铣晌镉性偕呐K組織、在自體同源培養(yǎng)基中保持體外繁殖的能力；上述程序包括收集來自于即將進(jìn)行植入手術(shù)病人的含有人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的材料樣品，通過本發(fā)明提供的自體同源培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞繁殖，和將自體同源原始干細(xì)胞植入該病人身體。
具體而言，本發(fā)明提供了自體同源細(xì)胞心肌成型術(shù)程序，它通過植入含有人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞、心臟組織再生器和在自體同源培養(yǎng)基上保持體外繁殖的藥物合成物，生成、再生和修復(fù)受損的心肌組織；上述程序包括以下步驟1)對取自病人的骨骼肌肉進(jìn)行活組織檢查，最好是通過肌肉注射局部麻醉劑進(jìn)行預(yù)處理，如利多卡因或丁哌卡因；2)從病人體自體同源血清開始制備人體自體同源原始干細(xì)培養(yǎng)基；3)從1)中活組織檢查和2)中培養(yǎng)基開始，制備富集了人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的合成物；4)從3)中合成物開始，制備藥物合成物；和5)在心肌損壞位置植入含自體同源原始干細(xì)胞的藥物合成物。
人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞包括成肌細(xì)胞和肌細(xì)胞(成熟和不成熟)，當(dāng)植入心臟肌肉時，有再生心臟組織的能力。
與在本現(xiàn)有說明中使用的一樣，術(shù)語“心肌損壞”指局部缺血性和先天性心肌病。特別地，根據(jù)本現(xiàn)有發(fā)明，自體同源細(xì)胞心肌成型術(shù)程序應(yīng)用于沒有進(jìn)行外科手術(shù)或經(jīng)皮膚的血管再生可能性的由心肌梗塞引起的局部缺血性心肌病病人，以及交替性心血管再生病人。自體同源細(xì)胞心肌成型術(shù)的目的是限制梗塞的擴(kuò)大，心臟組織重塑和心肌再生。缺血性心肌病的定義包括右或左心室梗塞，后一種情況伴有可能的二尖瓣局部缺血性回流。另一方面，根據(jù)本現(xiàn)有發(fā)明，自體同源細(xì)胞心肌成型術(shù)程序應(yīng)用于先天的擴(kuò)張性心肌病病人。
細(xì)胞心肌成型術(shù)的優(yōu)點(diǎn)有纖維化的減少，損害傷疤區(qū)的縮小和心室壁彈性與性能的改進(jìn)(對于恢復(fù)心臟舒張性能很重要)。
特別地，在心肌損壞病例中，通過直接注射植入4)中含自體同源原始干細(xì)胞的藥物合成物。如同本現(xiàn)有發(fā)明使用的一樣，術(shù)語“通過直接注射植入”指將本發(fā)明的藥用合成物通過心外膜或血管引入患有局部缺血性或先天性心肌病的病人體內(nèi)。特別地，按以下百分率分布將本發(fā)明的藥用合成物通過心外膜或血管引入患有局部缺血性或先天性心肌病的病人體內(nèi)約70％在損壞的周圍區(qū)域，和約30％在傷疤中部。心外膜引入可通過常規(guī)的外科手術(shù)暴露或胸腔鏡檢查完成。在外科手術(shù)接近法(典型的或小型的胸腔鏡檢查/胸骨切開術(shù))中，損壞區(qū)域暴露良好，可允許在損壞區(qū)和主要在周圍區(qū)域?qū)嵤┲委熀铣晌锏淖⑸?。含有本發(fā)明提供的人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的藥物合成物注射也可在損壞周圍區(qū)域進(jìn)行。按照本現(xiàn)有發(fā)明建議的植入物分布，通過殘余物沖洗法，植入細(xì)胞主要存活在周圍區(qū)域和現(xiàn)有的并行心肌再生血管，在某種程度上避免了在高度纖維化的局部缺血傷疤處植入后觀察到的高細(xì)胞死亡率。
另一方面，經(jīng)由皮膚靜脈通過全身性或冠狀動脈內(nèi)引入，在心肌損壞處植入4)中含有自體同源原始干細(xì)胞的藥物合成物。
另一方面，按照現(xiàn)有發(fā)明，自體同源細(xì)胞心肌成型術(shù)程序應(yīng)用于患有先天擴(kuò)張性心肌病病人時，要在兩個心室心肌的冠狀動脈中成倍數(shù)的植入本發(fā)明提供的藥物合成物。
如今，我們可為它們在心臟外科手術(shù)的使用提供新的計(jì)算機(jī)化的外科手術(shù)系統(tǒng)。機(jī)器人輔助操作的冠狀腦橋或借助于胸部入口的旁路越來越多，因?yàn)樗墒共∪私档透腥撅L(fēng)險并快速安全的恢復(fù)，同時還有極佳的美容效果。特別地，針通過視頻控制的機(jī)械手插入心肌，注射器位于胸外部，通過小直徑的擴(kuò)張器管道與針相連。這種接近方法對心功能不全病人的好處是自體同源細(xì)胞心肌成型術(shù)的治療程序可安全地進(jìn)行，不需要心臟操作，避免血動力學(xué)改變和心室纖維顫動導(dǎo)致的風(fēng)險。
細(xì)胞心肌成型術(shù)的有益影響可能會受到注射細(xì)胞死亡率的限制。為解決這個問題，本發(fā)明建議定期通過經(jīng)皮膚注射或外科手術(shù)植入本現(xiàn)有發(fā)明的自體同源原始干細(xì)胞。該方法可能會達(dá)到心肌成型術(shù)的目標(biāo)，逐漸減少梗塞區(qū)域或病理性心肌。為了該目標(biāo)，本發(fā)明包括在每個個人的細(xì)胞培養(yǎng)程序中，從隔離和冷凍細(xì)胞開始，為每一個病人定制自體同源原始干細(xì)胞庫。從儲存的自體同源原始干細(xì)胞開始，新的細(xì)胞培養(yǎng)可直接進(jìn)行繁殖，用于制備新的合成物，避免新的活組織檢查或組織消除。
以下例子用于本發(fā)明的舉例說明和解釋此處的非限定性目的。
例1本例子說明了用于自體同源細(xì)胞心肌成型術(shù)程序的人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的獲取和操作。該細(xì)胞的使用目的是在活著的組織學(xué)結(jié)構(gòu)里，恢復(fù)損壞的功能紊亂的心肌組織，以便心臟能產(chǎn)生收縮壓和舒張壓。
1.1骨骼肌肉活組織檢查在進(jìn)行外科手術(shù)活組織檢查的前一天，將2％濃度的利多卡因溶液通過肌肉注射到病人體內(nèi)，注射位置在大腿肌肉前外側(cè)和周圍。在大腿肌肉前外側(cè)切開一個5cm的切口進(jìn)行活組織檢查，在無菌的條件下，插入2到3cm3的骨骼肌肉片段(15g)。用剪刀分解取出的肌肉組織后，馬上插入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基或磷酸鹽緩沖液(PBS)中，并保存在4℃。為保證細(xì)胞的存活，應(yīng)盡可能快的開始細(xì)胞隔離、純化和培養(yǎng)程序。在低溫下，樣品存放在合適的容器中運(yùn)送到細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)室。
1.2制備自體同源培養(yǎng)基來自于血樣在輸血服務(wù)處，從病人身上抽取靜脈血液。用靜脈穿刺方法充滿50只10毫升試管，用于血清收集。在細(xì)胞和纖維蛋白沉淀后，在處于層流條件的小室中，每只試管中的血清被萃取出來，收集到空的血袋中。采取的血清樣品用于血液學(xué)和微生物試驗(yàn)(細(xì)菌和病毒)。裝有血清的帶子在-80℃冷凍，等候血液學(xué)和微生物試驗(yàn)的結(jié)果。
制備培養(yǎng)基之前，血清補(bǔ)充物在56℃加熱鈍化1小時，然后過濾。部分血清與培養(yǎng)基結(jié)合，保存在4℃，然后加熱到37℃并過濾，最后加入到有細(xì)胞培養(yǎng)基的瓶中。最終的培養(yǎng)基中含有10％的病人自體同源血清，89％ofHAM-F12(GIBCO-BRL，目錄編號21765)基質(zhì)，1％青霉素/鏈霉素，肝磷脂(2UI/ml收集的血清)，精蛋白(磷酸鹽形式)，(3UI/ml收集的血清)，可選擇是否含有兩性霉素B(0.25mg/ml)和/或0.1到250pg/ml的重組體bFGF。
剩余的人體血清冷凍在-40℃，等待制備新的培養(yǎng)基。在每次培養(yǎng)基制備時，補(bǔ)充液都要在56℃鈍化1小時后過濾。
來自于血漿除去法開始血漿除去法程序后，病人馬上引入50UI/kg劑量的非餾分肝素鈉。血漿除去法過程按照使用設(shè)備的預(yù)期例行程序執(zhí)行。在血漿除去法過程中，用含有肝磷脂的0.9％氯化鈉生理鹽水作抗凝血劑取代標(biāo)準(zhǔn)的抗凝血劑。血漿用5％白蛋白代替。一旦取得制備自體同源培養(yǎng)基需要體積的血漿，該程序?qū)⒔Y(jié)束。收集的血漿中肝磷脂的數(shù)量根據(jù)病人血漿體積計(jì)算，每1UI肝磷脂加入1.5UI精蛋白。如此繼續(xù)直到產(chǎn)生血漿凝結(jié)物。萃取的血清分布在冷凍的小等分試樣中。如同從血樣中收集的血清，該情況下的血清樣品在使用前進(jìn)行血液學(xué)和微生物分析。
1.3衛(wèi)星細(xì)胞的隔離和體外繁殖所有操作均在無菌條件下和使用層流室的情況下進(jìn)行。移植的骨骼肌肉片段在PBS溶液中沖洗。脂肪組織用剪刀清除，肌肉仔細(xì)弄碎。肌肉片段重新用PBS溶液沖洗，直到上清液部分看起來干凈，在100克時用離心機(jī)離心分離5分鐘。該組織通過2步連續(xù)酶處理離解首先，細(xì)胞在膠原酶IA(1.5ml/mg/g組織)中連續(xù)孵育1小時。每10分鐘對試管進(jìn)行機(jī)械攪拌促進(jìn)離解。換句話說，試管放在37℃、有往復(fù)/軌道攪拌的孵育器(ROSI)中。其次，用0.25胰島素1X EDTA(2ml)孵育20分鐘。沖洗細(xì)胞(300克時10分鐘)后馬上停止酶反應(yīng)，加入1ml合適的以前取得的病人血清。用40μm網(wǎng)格(網(wǎng)格為著色尼龍)過濾。對留在網(wǎng)格上的碎片重新進(jìn)行消化程序。最后通過沉淀(300克時20分鐘)收集過濾細(xì)胞，丟棄上清液。
細(xì)胞重新懸浮在新鮮的配好的培養(yǎng)基10％病人自體同源血清，89％HAM-F12(GIBCO-BRL，目錄編號21765)基質(zhì)，1％青霉素/鏈霉素，可選擇是否含有兩性霉素B(0.25mg/ml)，它含有肝磷脂(2UI/ml收集的血清)，精蛋白(磷酸鹽形式)，(3UI/ml收集的血清)，接種到瓶子中用于細(xì)胞培養(yǎng)。然后，在37℃，瓶子在潮濕空氣和5％H2O中孵育3星期。瓶子放在沒有水平梯度的孵育器中，以避免不正常的細(xì)胞增殖，孵育2到3天后，在基質(zhì)中更新去除血細(xì)胞和死細(xì)胞。當(dāng)生長到半融合(50％融合)時，采取培養(yǎng)步驟(分?jǐn)?shù)1∶5)避免在高濃度下出現(xiàn)肌原性分化。在50％融合時，應(yīng)采取多個步驟阻止多核肌管分化成單核細(xì)胞。
在培養(yǎng)的每個步驟，細(xì)胞通過胰蛋白酶化作用收集(在孵育器中，1～5分鐘期間，每個瓶中加入2ml2.5胰島素/EDTA)。通過顯微鏡觀察浮著的細(xì)胞可驗(yàn)證細(xì)胞的完全分離。然后加入配好的培養(yǎng)基停止反應(yīng)，最后得到的細(xì)胞懸浮液分布到另外5個瓶中。在細(xì)胞培養(yǎng)過程的每個步驟中，對細(xì)菌(好氧和厭氧細(xì)菌試驗(yàn))，病毒核真菌進(jìn)行控制。
1.4去除成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞常常污染培養(yǎng)基，為去除它們，需要獲得適當(dāng)?shù)某杉〖?xì)胞進(jìn)行繁殖。在第一遍培育實(shí)施過程中，與胰島素中和后，培養(yǎng)的細(xì)胞放在孵育器中30分鐘。這段時間足夠成纖維細(xì)胞沉淀，而大多數(shù)成肌細(xì)胞(較小)仍留在懸浮液中。收集細(xì)胞上清液并轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶。成肌細(xì)胞純度通過帶抗體人抗CD56和細(xì)胞內(nèi)肌間線蛋白染色的流式細(xì)胞計(jì)測定。含成肌細(xì)胞純度低于50％的樣品應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞富集程序。為了這個目的，在第二階段，在收獲細(xì)胞后和接種前，用老鼠抗體人抗CD56對已聯(lián)合的磁性微滴著色。用磁性細(xì)胞分離器進(jìn)行正向選擇，可獲得在成肌細(xì)胞、原始肌肉細(xì)胞中高度富集的細(xì)胞群落，它表明90％以上細(xì)胞中有CD56和肌間線蛋白。
通常地，為獲得需要的細(xì)胞數(shù)量，應(yīng)進(jìn)行多次培育?？偟亩?，在3個星期的末期，可獲得2億多細(xì)胞。該數(shù)量可在多鏈培養(yǎng)系統(tǒng)中培育逐步上升。
1.5定制庫細(xì)胞的隔離在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，每個病人的可冷凍細(xì)胞能夠隔離。從這些儲存的細(xì)胞開始，可進(jìn)行新的細(xì)胞培養(yǎng)繁殖，以周期性重復(fù)進(jìn)行心肌內(nèi)注射(避免重復(fù)進(jìn)行新的活組織檢查)。第二遍培育時，高度富集CD56陽性細(xì)胞的樣品用5％DMSO冷凍保存，經(jīng)過冷凍程序最終儲存在液氮中。細(xì)胞濃度應(yīng)為2,500～5,000萬細(xì)胞/毫升。如果有必要，細(xì)胞解凍、進(jìn)行體外繁殖并在成肌細(xì)胞基質(zhì)中培養(yǎng)以備后用(經(jīng)皮膚植入)。
1.6注射介質(zhì)細(xì)胞植入的日子，收獲細(xì)胞并在注射介質(zhì)(0.5％人體白蛋白和配好的培養(yǎng)基)中清洗，在植入前保存在冰中。通過流式細(xì)胞計(jì)，評價成肌細(xì)胞的最終純凈比例。使用Malassez血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(用臺盼藍(lán)著色)測定細(xì)胞濃度和生存能力。同樣地，在植入之前，評價細(xì)胞培養(yǎng)的無菌性(Gram測試)。
1.7細(xì)胞培養(yǎng)程序細(xì)胞植入可通過心外膜或心血管引入實(shí)施。心外膜引入可通過常規(guī)的外科手術(shù)暴露或胸腔鏡檢查實(shí)行。在外科手術(shù)接近法(典型的或小型的胸腔鏡檢查/胸骨切開術(shù))中，損壞區(qū)域暴露良好，可允許在梗塞區(qū)和主要在周圍區(qū)域完成10次細(xì)胞懸浮液注射。為了這個目的，使用23～26Gx4cm彎針。建議的細(xì)胞密度約為5,000～7,000萬細(xì)胞/毫升。注射緩慢進(jìn)行約15分鐘。每次注射后，針孔應(yīng)該用打印壓力堵住(1～2分鐘)，避免細(xì)胞懸浮液的回流。
成肌細(xì)胞植入方案-植入至少2,000萬細(xì)胞，最好約2億細(xì)胞。
-細(xì)胞密度5,000～7,000萬細(xì)胞/毫升。
-培養(yǎng)時間約21天。
-成肌細(xì)胞濃度超過70％-2-8℃平均細(xì)胞壽命96小時。
例2
本實(shí)例是實(shí)施的I/II階段臨床試驗(yàn)，目的是評價含有本發(fā)明的人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的合成物對患有心肌梗塞病人進(jìn)行心肌內(nèi)移植的適宜性和安全性。
材料和方法2.1病人選擇本試驗(yàn)對總數(shù)為12個病人施行，他們至少在包括進(jìn)本協(xié)議4星期前患過心肌梗塞，他們預(yù)計(jì)要實(shí)行冠狀動脈旁路手術(shù)。選擇病人時，已考慮了年齡(包括30～80歲年齡范圍)，心臟功能(左室射血分?jǐn)?shù)超過25％)和沒有惡性心律不齊或肌肉營養(yǎng)不良?xì)v史，在肝腎功能障礙、HIV、肝炎、懷孕測試中均沒有顯示陽性結(jié)果。
2.2肌肉活組織檢查、培養(yǎng)和人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞特征用作治療合成物的人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞制備按例1中描述的實(shí)施。
在無菌條件下，用利多卡因氫氯化物進(jìn)行預(yù)處理后，從大腿前外側(cè)肌肉收集肌肉活組織檢查樣品。在整個程序中，使用了本發(fā)明的人體自體同源培養(yǎng)基，它含有79％HAM F12(GIBCO-BRL)基質(zhì)。如同上例中1.2段說明的一樣，病人體自體同源血清通過血漿除去法獲得，在前一天施行以取得肌肉活組織檢查樣品(每個病人取800～2,135ml，平均1,735ml)。
為隔離衛(wèi)星細(xì)胞，用胰島素e/EDTA(0.5mg/ml和0.53mm EDTA，GIBCO-BRL)孵育進(jìn)行酶消化，接著用膠原酶(0.5mg/ml GIBCO-BRL)進(jìn)行酶消化。如上例中說明的一樣，實(shí)施細(xì)胞繁殖和成纖維細(xì)胞去除程序。收獲的成肌細(xì)胞純度用流式細(xì)胞計(jì)測量，并用特別的單克隆人體N-CAM(CD56)、CD45和肌間線蛋白抗體著色。
從每個病人取得的平均生肌細(xì)胞是221×106(總是在105～390×106范圍內(nèi))，生肌細(xì)胞CD56+/CD45-的平均純度是65.6±6.4％。
2.3細(xì)胞移植在外科程序之前，用電子發(fā)射斷層掃描(PET)、超聲心動圖和心電圖(Holter心電圖24小時)測定每個病人心肌的功能和生存能力。實(shí)施肌肉活組織檢查后，使用冠狀動脈旁路進(jìn)行身體外循環(huán)3到4星期。病人平均接受2次移植(1～4)。
一旦縫合所有移植，重建自發(fā)的心臟搏動，細(xì)胞植入通過心外膜引入實(shí)施，在梗塞區(qū)域和周圍區(qū)域至少重復(fù)注射10次。按超聲波心動描記術(shù)觀點(diǎn)，這些區(qū)域確認(rèn)為屬于運(yùn)動功能減退，不能運(yùn)動或運(yùn)動障礙。注射使用了眼套管23G(Maersk醫(yī)藥有限公司。Redditch，B98 9NL GB)。在外科程序之前，用超聲心動圖確認(rèn)要接受細(xì)胞植入的區(qū)域，目的是在以后對細(xì)胞移植進(jìn)行監(jiān)督時評價上述區(qū)域的收縮性。
外科程序之后，病人接受連續(xù)的遙感技術(shù)監(jiān)測。每6個小時取一次血樣，評價心臟壞死酶的存在情況。為防止發(fā)炎，手術(shù)后使用了甲基強(qiáng)的松龍(500mg)。為防止心臟無節(jié)律，據(jù)報道用經(jīng)口乙胺碘呋酮進(jìn)行了3個月的處理。為了對實(shí)施的心肌成型術(shù)程序的進(jìn)行響應(yīng)監(jiān)測，用PET(移植后3個月)和超聲心動圖(移植后40天和3個月)進(jìn)行跟蹤監(jiān)測。同樣地，通過Holter心電圖(移植后40天和3個月)監(jiān)測存在的心律失常情況。
根據(jù)法律要求，本協(xié)議和所有實(shí)施的程序已先前獲得臨床試驗(yàn)的地方倫理委員會的批準(zhǔn)。
超聲波心動描記術(shù)研究。整體和局部心肌收縮性通過二維超聲波心動描記術(shù)(用超聲系統(tǒng)Sonos 5500，Phillips)測定。局部左心室壁的運(yùn)動分析按照美國超聲波心動描記術(shù)協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)委員會規(guī)定的程序施行(Schiller NB等人著，JAM Soc超聲波心動描記術(shù).1989；2358-367)左心室被分成16節(jié)段，每一節(jié)段室壁的運(yùn)動都進(jìn)行評價，即1＝正常，2＝運(yùn)動功能減退，3＝運(yùn)動不能，4＝運(yùn)動障礙。局部運(yùn)動指數(shù)(節(jié)段性室壁運(yùn)動指數(shù)，WMSI)由評價節(jié)段數(shù)目分開的每一節(jié)段指數(shù)疊加和決定。WMSI指數(shù)由細(xì)胞植入處理過的節(jié)段和其它沒有處理的節(jié)段決定。左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)從心臟內(nèi)邊界的自動探測系統(tǒng)獲得(自動邊界探測ABD)(Perez JE等人著，J.Am.Coll.Cardiol.1992；19336-344)。每一節(jié)段的局部收縮性也通過彩色室壁運(yùn)動分析技術(shù)和組織多普勒進(jìn)行了評價。評價通過雙盲試驗(yàn)進(jìn)行(沒有預(yù)先通知的2個獨(dú)立觀察者)。試驗(yàn)中心臟左室的最后舒張體積的重現(xiàn)性為2.8±6.4(CV 5.5％)，左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)的重現(xiàn)性為0.3±4.6(CV 6.6％)。
電子發(fā)射斷層掃描成像(PET)。在外科手術(shù)處理前和細(xì)胞移植3個月之后，用PET評價心肌血液流動和葡萄糖的新陳代謝。
灌注和新陳代謝試驗(yàn)在PET斷層X光攝影裝置(ECAT EXACT HR+，Siemens/CTI，諾克斯維爾，美國)中實(shí)施，它可獲得62幅軸斷面視圖，其平面間的空間分辨率為4.5mm。為研究葡萄糖的新陳代謝，生產(chǎn)了示蹤劑(18F-FDG)和為了灌注的研究(13N-銨)，在放射性藥物試驗(yàn)中心的回旋加速器中進(jìn)行(旋風(fēng)18/9，離子柱應(yīng)用，比利時)。
每個病人的影像原始記錄從使用鍺-68光源將心臟定位在可視范圍，進(jìn)行2分鐘傳送試驗(yàn)開始，接著是實(shí)行5分鐘光子衰減校正結(jié)果。緊接著，13N-銨通過靜脈注射，以10ml/min的恒定流速進(jìn)行灌注(9.25MBq/Kg，最大740MBq)。動態(tài)影像的獲得從注射時刻開始。在20分鐘內(nèi)用可變的持續(xù)時間方案拍攝了動態(tài)序列的連續(xù)影像12x10s，4x10s，4x30s，3x300s。PET數(shù)據(jù)獲得根據(jù)參考書目中說明的草案施行(Muzik O等人著，J.Nucl.Med.1993；34336-344)。一旦影像需收集用于灌注評價，推遲50分鐘允許13N-銨放射性的自然衰減(裂變的半衰期是9.9分鐘)。隨后，影像獲取從葡萄糖的新陳代謝試驗(yàn)開始，按照正常血糖高胰島素血癥壓片鉗技術(shù)方法施行(Knuuti MJ等人著，J.Nucl.Med.1992；331255-1262)。葡萄糖水平穩(wěn)定在含量范圍為85～95mg/dl 4.6MBq/Kg，最大370MBq之后，用靜脈彈丸將18F-FDG注射到體內(nèi)。獲得的18F-FDG系列影像從注射時開始，遵照上述Knuuti等人著的草案說明將持續(xù)60分鐘(8x15s，2x30s，2x120s，1x180s，4x300s，3x600s)。
結(jié)束獲得影像后，片段傳送完成，進(jìn)行衰減校正前，新陳代謝試驗(yàn)的影像使用OSEM(有序子集最大期望)方法重組，用了2次迭代和8個子集。所有試驗(yàn)(灌注和新陳代謝)均應(yīng)用了6mm FWHM(半高寬)高斯濾波器(高斯平滑濾波器)。為了通常分析，軸斷面影像根據(jù)左心室短軸、垂直長軸和水平長軸重新取向。
最后，在短軸上使用了左心室中部區(qū)域6個鄰近部分用作定性分析。根據(jù)3室模型計(jì)算心肌血流絕對速度(Muzik O等人著，J.Nucl.Med.1993；3483-91)和通過Patlak圖形分析(Patlak CS等人著，J.Cereb.Blood Flow Metab.，1985；5584-590)估計(jì)葡萄糖的利用速率(心肌葡萄糖利用速rMGU)。
結(jié)果2.4細(xì)胞移植和手術(shù)后變化試驗(yàn)中病人的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床和功能特征匯集于下表1和2。
表1 病人特征

縮寫詞性別。M男；F女NYHA分類“紐約心臟協(xié)會”分類FU外科手術(shù)和細(xì)胞移植3個月后實(shí)施的跟蹤評價旁路定位。LAD動脈下面左前方；RC右冠狀動脈；OM鈍形動脈邊界；Dg冠狀動脈對角線。
在操作冠狀動脈旁路過程中，一旦完成了移植，恢復(fù)了自發(fā)的心臟搏動，梗塞區(qū)域可目測，注射3～5ml含有生肌細(xì)胞濃度為20×106細(xì)胞/毫升的溶液。注射區(qū)域用隨后的超聲波心動描記術(shù)識別。進(jìn)行移植之前，收集好用于上述移植的細(xì)胞后，立即實(shí)施微生物培養(yǎng)以防污染。由于這個原因，9號病人沒有進(jìn)行移植，因?yàn)樗募?xì)胞在進(jìn)行革蘭氏染色時顯陽性。盡管如此，該病人仍進(jìn)行了后續(xù)的協(xié)議試驗(yàn)。
表2 病人特征

縮寫詞LVEF左室射血分?jǐn)?shù)。
FU外科手術(shù)和細(xì)胞移植3個月后實(shí)施的跟蹤評價。
2D二維；ABD心臟內(nèi)邊界自動探測。
病人移植手術(shù)后的變化并不表示為并發(fā)癥。由于在先前的臨床試驗(yàn)中，移植骨骼肌肉細(xì)胞時已觀察到心臟心律不齊，對移植手術(shù)后的病人留院監(jiān)測(連續(xù)的遙感技術(shù))，并進(jìn)行了術(shù)后40天和3個月監(jiān)測(Holter心電圖，24小時)。在任何情況下，均觀察到了心律不齊大大增加。而且，移植手術(shù)后未成熟心室的搏動次數(shù)有所減少。但是，6號病人在外科手術(shù)40天后出現(xiàn)了斷斷續(xù)續(xù)的心室亢進(jìn)癥。在施行外科手術(shù)程序過程中，該病人進(jìn)行了動脈瘤切除術(shù)。如何解釋這個現(xiàn)象呢？
移植手術(shù)后，心臟和肝中酶的血清分析沒有表現(xiàn)出重大變化，而且逐漸恢復(fù)到其正常比率。在間接測量炎癥時，同時測定了蛋白質(zhì)c。在移植手術(shù)后和跟蹤監(jiān)測過程中，沒有發(fā)現(xiàn)重大變化。
所有病人均已出院，仍然活著。
2.5左心室功能通過二維超聲波心動描記術(shù)測量，左室射血分?jǐn)?shù)已從外科手術(shù)前的35.5±2.3％(平均值±標(biāo)準(zhǔn)平均偏差)增加到移植后3個月的53.5±4.98％(p＜0.05)。用心內(nèi)膜邊界監(jiān)測(ABD)的自動超聲波心動描記術(shù)測定的心臟整體收縮性，從39.8±3.26％增加到了56.3±3.1％(p＜0.05)(圖1)。
同時，局部收縮性也有改善。運(yùn)動不能/運(yùn)動功能衰減/運(yùn)動障礙的平均數(shù)從7(5～10，手術(shù)前)降低到3(0～5，移植后3個月)。
局部基礎(chǔ)WMSI運(yùn)動指數(shù)從平均1.72±0.14減少到移植3個月后的1.25±0.07(p＜0,05)(表3)。為區(qū)分來自于生肌細(xì)胞移植和血管再生導(dǎo)致的心臟功能潛在受益，比較了接受細(xì)胞移植的節(jié)段和未接受細(xì)胞移植的節(jié)段WMSI指數(shù)的改善情況。與基礎(chǔ)指數(shù)(外科手術(shù)前)相比，WMSI在手術(shù)后3個月急劇減少，接受細(xì)胞移植的節(jié)段有較大的減少(表3)。
WMSI的減少與NYHA分類的改善有關(guān)聯(lián)。NYHA分類從2.2±0.2的基礎(chǔ)值改善到3個月后的1.5±0.26(p＜0.01)。
表3 局部功能(用節(jié)段性室壁運(yùn)動指數(shù)(WMSI)測量)

2.6心肌灌注和可行性研究對7個病人外科手術(shù)前(前1～5天)和移植3個月后進(jìn)行測試，研究灌注(PET-銨)和新陳代謝(FDG-葡萄糖)。對每一區(qū)域指定定量的數(shù)值比率，評估示蹤物的滯留量。在外科手術(shù)前所有心肌的平均葡萄糖滯留量為0.158±0.026μmol.g-1.min-1，但術(shù)后3個月為0.270±0.008μmol.g-1.min-1(p＜0.05)。通過梗塞區(qū)域(心肌梗塞引起的壞死組織)的差動分析，證實(shí)了銨和葡萄糖滯留量的顯著增加，它表明了在梗塞區(qū)域心肌可行性的改善(表4)。也可參見圖2。
表4 電子發(fā)射斷層掃描影像(PET)。通過13N-銨滯留量(ml.g-1.min-1)評估血流和通過18F-FDG(μmol.g-1.min-1)評估葡萄糖的新陳代謝

討論本研究的主要結(jié)論有1.對于有心肌梗塞病史和動過冠狀動脈旁路手術(shù)的病人，向心肌直接植入自體同源骨骼肌肉細(xì)胞是可行而且安全的。2.雖然不能清楚區(qū)分旁路手術(shù)的衍生影響和細(xì)胞移植的衍生影響，功能性和可行性研究表明自體同源生肌細(xì)胞的移植有助于改善左心室的收縮性，也有助于組織的修復(fù)。3.骨骼成肌細(xì)胞能夠移植，但最少需要到外科手術(shù)后3個月。
盡管為證實(shí)骨骼成肌細(xì)胞是否能充分地移植，可能有必要直接研究心肌，但通過PET可清楚地顯示在梗塞區(qū)域葡萄糖滯留量增加，該處以前未探測到有活力的組織，一旦實(shí)施移植后，該處就可以探測到有活力的組織。另一方面，雖然本研究沒有包括對照病人，但由于細(xì)胞培養(yǎng)的衛(wèi)生物污染，9號病人僅做了冠狀動脈旁路手術(shù)，在3個月的跟蹤監(jiān)測中沒有顯示葡萄糖利用有重大改變(圖2B)，雖然這些沒有最后定性，他的18F-FDG-PET結(jié)果是令人鼓舞的。
這些結(jié)果表明移植了自體同源骨骼肌肉細(xì)胞的冠狀動脈旁路顯著改善了心臟收縮性，射血分?jǐn)?shù)有明顯的增加，特別是WMSI指數(shù)有明顯降低。從以上結(jié)果不能得出心臟功能的改善僅由于旁路。接受了細(xì)胞移植的心肌片段顯示較高改善，同一片段上葡萄糖的滯留量增加，這一事實(shí)表明心臟功能的改善不能完全歸功于旁路。為獲得自體同源細(xì)胞移植是造成心臟功能改善原因的明顯證據(jù)，有必要進(jìn)行移植避免其它治療的共同作用。除非細(xì)胞通過經(jīng)皮注射植入，現(xiàn)今它已不是倫理問題。
其它臨床試驗(yàn)的近期研究表明，自體同源骨骼成肌細(xì)胞的植入與心臟心律不齊有關(guān)(Menasche P等人著，柳葉刀(Lancet)2001；357279-280。Menasche P等人著，J.Am.Coll.Cardiol.2003；411078-1083。Hagege AA等人著，柳葉刀(Lancet)2003；361491-492。Pagani FD等人著，J.Am.Coll.Cardiol.2003；41879-888)。事實(shí)上，一些病人要求植入心臟內(nèi)去顫器。到目前為止，仍不確切知道這些心律不齊的原因，但它們可能與電再入回路的形成(可能由于植入的骨骼成肌細(xì)胞連接點(diǎn)處沒有間隙)、植入細(xì)胞的數(shù)量和體積、或自體同源生肌細(xì)胞的使用有關(guān)。有必要指出，這些草案中使用了牛胎兒血清用作自體同源生肌細(xì)胞的培養(yǎng)和體外繁殖，這構(gòu)成了異基因蛋白源。在3星期的固定時間里，人體細(xì)胞與牛血清在上述動物蛋白的細(xì)胞表面接觸。這些細(xì)胞的移植會在纖維化后引起炎癥反應(yīng)。實(shí)施的臨床病理學(xué)試驗(yàn)表明，按照本方法移植的細(xì)胞植入了沒有進(jìn)行血管再生的纖維化模式內(nèi)。該組織結(jié)構(gòu)代表了再入回路的風(fēng)險，它可誘導(dǎo)嚴(yán)重的心室心律不齊異變。與這些研究不一樣的是，在目前的臨床試驗(yàn)中，使用了在完全的自體同源培養(yǎng)基上繁殖的自體同源骨骼肌肉細(xì)胞，避免了免疫反應(yīng)。這可解釋為什么本臨床試驗(yàn)沒有觀察到這些心律不齊現(xiàn)象。
權(quán)利要求
1.人體自體同源原始干細(xì)胞的自體同源培養(yǎng)基，包含1)占0.1～90％重量的人體自體同源血清；2)含量為0.1％～10,000UI/ml的肝磷脂；3)含量為0.1％～10,000UI/ml的精蛋白；和4)含基本營養(yǎng)物(含有或不含谷酰胺)的培養(yǎng)基，它應(yīng)有足夠的數(shù)量，可占重量的100％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述培養(yǎng)基，其特征在于，上述人體自體同源血清經(jīng)過了處理，其目的是鈍化該補(bǔ)充物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述培養(yǎng)基，其特征在于，上述人體自體同源血清從病人的血樣獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述培養(yǎng)基，其特征在于，上述人體自體同源血清通過對病人供給的血清使用血漿除去法獲得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述培養(yǎng)基，其特征在于，上述血漿除去法使用肝磷脂作為抗凝血劑、精蛋白硫酸鹽作為反抗凝血劑進(jìn)行。
6.根據(jù)上述權(quán)利要求任一培養(yǎng)基，其特征在于，另外含有抗生素。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述培養(yǎng)基，其特征在于，其中使用的抗生素從青霉素、鏈霉素、慶大霉素和它們的混合物中選出。
8.根據(jù)上述權(quán)利要求任一培養(yǎng)基，其特征在于，另外含有兩性霉素B，和/或成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述培養(yǎng)基，其特征在于，由以下成分組成HAMF12基質(zhì)占重量的89％；10％來自于病人體自體同源血清；肝磷脂0.1％即100UI/ml；精蛋白0.1％即100UI/ml；和1％青霉素/鏈霉素和，可選0.25mg/ml兩性霉素B和/或0.1～250pg/ml重組體基本成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)。
10.權(quán)利要求1～9中任一人體自體同源原始干細(xì)胞的自體同源培養(yǎng)基的制備方法，它含有人體自體同源血清、肝磷脂、精蛋白、含有或不含有谷氨酰胺的基本營養(yǎng)物的混合物，另外可選是否含有抗生素，和/或兩性霉素B，和/或成纖維細(xì)胞生長因子。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，其中所述人體自體同源血清通過血漿除去法獲得。
12.權(quán)利要求1～9中任一人體自體同源原始干細(xì)胞的自體同源培養(yǎng)基的使用，用于自體同源原始干細(xì)胞的體外培養(yǎng)、純化和繁殖。
13.用權(quán)利要求1～9中任一人體自體同源原始干細(xì)胞的自體同源培養(yǎng)基，制備人體自體同源原始干細(xì)胞合成物的方法，包括在人體自體同源原始干細(xì)胞的自體同源培養(yǎng)基中孵育所述自體同源原始干細(xì)胞，和純化獲得的人體自體同源原始干細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述方法，其特征在于，使用允許識別上述人體自體同源原始干細(xì)胞的細(xì)胞外抗原特征的特殊抗體，純化獲得的人體自體同源原始干細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述方法，其特征在于，其中用于上述人體自體同源原始干細(xì)胞的上述特殊和選擇性抗體聯(lián)合生成磁性微滴。
16.獲取人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的方法，對它們用于細(xì)胞治療很有用，它包括在權(quán)利要求1～9中任一人體自體同源原始干細(xì)胞的自體同源培養(yǎng)基中孵育上述自體同源原始干細(xì)胞，和純化獲得的人體自體同源原始干細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述方法，其特征在于，其中人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的純化包括使用人抗CD56抗體，可選是否聯(lián)合形成磁性微滴，和選擇顯示表型為CD56+/CD45-的細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述方法，其特征在于，其中人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的純化包括進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，然后用平皿預(yù)接種，目的是使上述細(xì)胞培養(yǎng)中存在的成纖維細(xì)胞沉淀；接著，使用人抗CD56抗體，識別和隔離人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞，可選是否聯(lián)合形成磁性微滴，和選擇顯示表型為CD56+/CD45-的細(xì)胞。
19.從肌肉組織活組織檢查獲取人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的程序，用于制備藥物合成物，它包括1)對即將植入人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的病人施行活組織檢查，提取含有人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的骨骼肌肉組織片段；2)在允許繁殖的條件下，上述來自骨骼肌肉的人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞在權(quán)利要求1～9中任一所述制備的自體同源培養(yǎng)基中培養(yǎng)；3)純化上述培養(yǎng)的人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞；和4)收集上述純化的人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞；和可選地，5)冷凍上述純化的人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞，直到開始制備該藥物合成物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述程序，其特征在于，在活組織檢查區(qū)域，在進(jìn)行活組織檢查之前，將含有刺激人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞增殖藥劑的藥物合成物局部引入病人體內(nèi)。
21.根據(jù)權(quán)利要求19所述程序，其特征在于，其中藥劑含有局部麻醉劑，該麻醉劑為利多卡因和丁哌卡因兩者之一。
22.根據(jù)權(quán)利要求19所述程序，其特征在于，其中人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的純化由以下步驟組成細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行平皿預(yù)接種以去除全部或部分不良的成纖維細(xì)胞，然后，使用人抗CD56抗體識別和隔離人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞，可選擇是否聯(lián)合形成磁性微滴，最后選擇出顯示顯型CD56+/CD45-的細(xì)胞。
23.合成物在人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞中富集，其中含有至少70％在權(quán)利要求1～8中任一所述人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的自體同源培養(yǎng)基中培養(yǎng)的人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞。
24.一種藥物合成物，包括以下成分至少2,000萬細(xì)胞，細(xì)胞密度至少為5,000萬細(xì)胞/毫升，和至少40％自體同源原始干細(xì)胞CD56+/CD45-，權(quán)利要求1～9中任一所述自體同源原始干細(xì)胞的自體同源培養(yǎng)基，和至少一種從藥物觀點(diǎn)看來可接受的賦形劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述藥物合成物，其特征在于，包括2,000萬到2億細(xì)胞，細(xì)胞密度為5,000萬～7,000萬細(xì)胞/毫升，至少70％自體同源原始干細(xì)胞CD56+/CD45-，權(quán)利要求1～9中任一所述自體同源原始干細(xì)胞的自體同源培養(yǎng)基，和數(shù)量占總重量0.1％到20％的人體白蛋白。
26.一種自體同源細(xì)胞心肌成型術(shù)的治療程序，其特征在于，通過植入含有人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的藥物合成物，生成、再生和修復(fù)受損的心肌組織，因?yàn)樵摵铣晌镉性偕呐K組織、在自體同源培養(yǎng)基中保持體外繁殖的能力；上述程序包括收集來自于即將進(jìn)行植入手術(shù)病人的含有人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的材料樣品，在權(quán)利要求1～9中任一所述自體同源原始干細(xì)胞的自體同源培養(yǎng)基中培養(yǎng)進(jìn)行細(xì)胞繁殖，和將自體同源原始干細(xì)胞植入該病人身體。
27.一種自體同源細(xì)胞心肌成型術(shù)程序，其特征在于，通過植入含有人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞、心臟組織再生器和在自體同源培養(yǎng)基上體外繁殖的藥物合成物，生成、再生和修復(fù)受損的心肌組織；上述程序包括以下步驟1)對取自病人的骨骼肌肉進(jìn)行活組織檢查，最好是通過肌肉注射局部麻醉劑進(jìn)行預(yù)處理；2)從病人自體同源血清開始制備權(quán)利要求1～9中任一所述人體自體同源原始干細(xì)培養(yǎng)基；3)從1)中活組織檢查和2)中培養(yǎng)基開始，制備富集于人體自體同源肌肉原始干細(xì)胞的合成物；4)從3)中合成物開始，制備藥物合成物； 和5)在心肌損壞位置植入含由4)中人體自體同源原始干細(xì)胞的藥物合成物。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述程序，其特征在于，通過在梗塞傷疤周圍區(qū)域直接注射、或在兩個心室的冠脈內(nèi)注射，植入上述含有人體自體同源原始干細(xì)胞的藥物合成物。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述程序，其特征在于，其中上述含有人體自體同源原始干細(xì)胞的藥物合成物的植入經(jīng)由皮膚靜脈通過全身性或冠脈內(nèi)引入。
30.根據(jù)權(quán)利要求27所述程序，其特征在于，其中上述含有人體自體同源原始干細(xì)胞的藥物合成物的植入通過自動化和計(jì)算機(jī)化的系統(tǒng)實(shí)施。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人體自體同源原始干細(xì)胞的自體同源培養(yǎng)基，包含占0.1～90％重量的人體自體同源血清；含量為0.1％～10,000UI/ml的肝磷脂；含量為0.1％～10,000UI/ml的精蛋白；和含基本營養(yǎng)物(含有或不含谷酰胺)的培養(yǎng)基，它應(yīng)有足夠的數(shù)量，可占重量的100％，本發(fā)明培養(yǎng)基可用于自體同源原始干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和繁殖。包含所述干細(xì)胞的合成物能植入病人體內(nèi)，用自體同源細(xì)胞心肌成型術(shù)，生成、再生和修復(fù)受損的心肌組織。
文檔編號A61K35/34GK1665922SQ03815599
公開日2005年9月7日 申請日期2003年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月2日
發(fā)明者費(fèi)利佩·普羅斯珀-卡多索, 吉澤斯·赫雷羅斯-岡薩雷斯, 胡安·卡洛斯·查科斯 申請人:納瓦拉省科技研究所, 胡安·卡洛斯·查科斯