專利名稱：熱激蛋白用于增強(qiáng)抗體療法功效的用途的制作方法
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1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療任何疾病的方法和藥物組合物，其中所述疾病的治療可被增強(qiáng)的免疫反應(yīng)改善，例如感染性疾病、原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤性疾病(即，癌癥)或神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病。具體來說，本發(fā)明涉及包括熱激/應(yīng)激蛋白(HSP)或HSP復(fù)合物單獨(dú)或彼此組合施用，聯(lián)合免疫反應(yīng)劑的施用的方法。本發(fā)明還提供了包含一種或多種HSP或HSP復(fù)合物聯(lián)合免疫反應(yīng)劑的藥物組合物。此外，本發(fā)明涉及本發(fā)明的方法和組合物用于增高或改善被動(dòng)免疫療法和效應(yīng)細(xì)胞功能的用途。
2.發(fā)明背景2.1免疫反應(yīng)生物體的免疫系統(tǒng)對(duì)病原體或其它有害因子產(chǎn)生兩類反應(yīng)-體液反應(yīng)和細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)(參見Alberts，B.等，1994，Molecular Biologyof the Cell.1195-96)。當(dāng)靜息B細(xì)胞被抗原激活而增殖并成熟為抗體分泌細(xì)胞時(shí)，其產(chǎn)生并分泌具有獨(dú)特抗原結(jié)合部位的抗體。已知該抗體分泌型反應(yīng)是體液應(yīng)答。另一方面，T細(xì)胞的種類繁多的反應(yīng)統(tǒng)稱為細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。T細(xì)胞主要有兩類，細(xì)胞毒性T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞。細(xì)胞毒性T細(xì)胞直接殺死被病毒或某些其它細(xì)胞內(nèi)微生物感染的細(xì)胞。與之對(duì)照，輔助性T細(xì)胞輔助激發(fā)其它細(xì)胞的反應(yīng)例如，它們輔助活化巨噬細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞和B細(xì)胞(參見Alberts，B.等，1994，Molecular Biology of the Cell.1228)。細(xì)胞毒性T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞均可識(shí)別肽片段形式的抗原，所述肽片段由異源蛋白抗原在靶細(xì)胞內(nèi)降解而產(chǎn)生，且由此其均依賴主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子，該分子結(jié)合這些肽片段，將其攜帶至細(xì)胞表面，然后將其呈遞給T細(xì)胞(參見Alberts，B.等，1994，Molecular Biologyof the Cell.1228)。一般在抗原呈遞細(xì)胞(APC)上可發(fā)現(xiàn)豐富的MHC分子。
除上述獲得性免疫外，先天免疫也在生物體的免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。先天免疫系統(tǒng)是抵御疾病的第一道防線并能提供廣泛、但相對(duì)非特異性的宿主反應(yīng)，該反應(yīng)缺乏抗原特異性和免疫記憶特性，而這些特性是獲得性免疫的特征。先天免疫的效應(yīng)機(jī)制包括抗微生物肽，粒細(xì)胞和吞噬細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞和補(bǔ)體旁路，這些機(jī)制產(chǎn)生并控制適應(yīng)性免疫反應(yīng)。Medzhitov和Janeway，2000，New EnglandJ Med 343338-344；Moretta，2002，Nature Reviews Immunology 2957-964。
2.2抗原呈遞抗原呈遞細(xì)胞(APC)，例如巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，是先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵組分。呈遞給T細(xì)胞的抗原通常存在于其它細(xì)胞(APC)的表面。APC能俘獲淋巴源性和血源性抗原并(在內(nèi)化和降解之后)將抗原性肽片段(與主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的細(xì)胞表面分子結(jié)合的)呈遞給T細(xì)胞。然后APC可活化T細(xì)胞(細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng))從而克隆擴(kuò)增，這些子細(xì)胞可以或者發(fā)展為細(xì)胞毒性T細(xì)胞，或者發(fā)展為輔助性T細(xì)胞，其順次活化具有相同的與MHC結(jié)合的抗原的活化B(體液應(yīng)答)細(xì)胞從而克隆擴(kuò)增并產(chǎn)生特異性抗體(參見Alberts，B.等，1994，Molecular Biology of the Cell.1238-45)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩類抗原加工機(jī)制。第一類包括經(jīng)由APCs胞吞作用的蛋白攝取，抗原在囊泡內(nèi)片段化，與II類MHC分子關(guān)聯(lián)以及在細(xì)胞表面上的表達(dá)。該復(fù)合物被表達(dá)CD4的輔助性T細(xì)胞識(shí)別。另一類用于在細(xì)胞內(nèi)合成的蛋白(如病毒抗原)，其包括蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的片段化。以該方式制備的肽與I類MHC分子關(guān)聯(lián)并被表達(dá)CD8的細(xì)胞毒性T細(xì)胞識(shí)別(參見Alberts，B.等，1994，Molecular Biology ofthe Cell.1233-34)。
T細(xì)胞的刺激涉及T細(xì)胞和APC共同表達(dá)的多種輔助分子。共刺激分子是那些促進(jìn)T細(xì)胞生長(zhǎng)和活化的輔助分子。通過刺激，共刺激分子誘導(dǎo)例如白介素1(IL-1)或白介素2(IL-2)、干擾素等的細(xì)胞因子釋放，所述細(xì)胞因子能促進(jìn)T細(xì)胞生長(zhǎng)和表面受體的表達(dá)(參見Paul，1989，F(xiàn)undamental Immunology.109-10)。
正常情況下，APC是靜息的，其需要活化才能產(chǎn)生功能。鑒定活化APCs的信號(hào)非常困難，這是尚未解決的問題(參見Banchereau等，1998，Nature 392245-252；Medzhitov，等，1998，Curr.Opin.Immunol.1012-15)。
2.3被動(dòng)免疫療法被動(dòng)免疫療法(也稱為被動(dòng)免疫)是指直接給予患者免疫反應(yīng)劑，該免疫反應(yīng)劑例如包括針對(duì)病原體、腫瘤或病原性蛋白上表位的抗原結(jié)合區(qū)和含有Fc受體-結(jié)合部位，補(bǔ)體結(jié)合部位或介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞作用區(qū)域的結(jié)構(gòu)域的分子，如抗體。該免疫反應(yīng)劑可預(yù)防性地施用以便，例如抑制感染或治療性地施用以便減輕或消除感染，減少或清除癌細(xì)胞或清除或移除病原性蛋白，例如神經(jīng)變性疾病和/或淀粉樣蛋白病中所出現(xiàn)的蛋白聚集或沉積。被動(dòng)免疫療法與主動(dòng)免疫療法不同，后者包括用抗原免疫患者從而誘導(dǎo)體內(nèi)免疫反應(yīng)，例如產(chǎn)生抗體或細(xì)胞毒性T細(xì)胞。而在被動(dòng)免疫療法中，將免疫反應(yīng)劑，例如抗體給予患者，導(dǎo)致效應(yīng)細(xì)胞的刺激，例如具有Fc受體的細(xì)胞能與給予的抗體或其它免疫反應(yīng)劑的Fc部分(即，F(xiàn)c受體結(jié)合部位)發(fā)生相互作用，從而導(dǎo)致針對(duì)具有被抗體識(shí)別的表位的細(xì)胞、病原體或蛋白的細(xì)胞性免疫功能如抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性(例如，ADCC)或抗體介導(dǎo)的調(diào)理作用和/或吞噬作用。依賴FcR效應(yīng)細(xì)胞功能的抗體-介導(dǎo)的腫瘤治療的療效可通過使用特定細(xì)胞因子而得到修飾。Keler，等，2000，J.Immunol.1645746-5752。治療性和/或預(yù)防性抗體包括但不限于與細(xì)胞表面分子結(jié)合并對(duì)抗正常功能的抗體(例如，封閉抗體)，與細(xì)胞表面分子結(jié)合并模擬正常功能的抗體(抗體激動(dòng)劑)和螯合抗體。
2.4 CTLA-4細(xì)胞毒性T細(xì)胞抗原-4(CTLA-4)是一種在活化的T細(xì)胞表面上低水平表達(dá)的糖蛋白。CTLA-4與CD28相似，而對(duì)B7家族成員(例如B7-1和B7-2)的親和力高于CD28。T淋巴細(xì)胞上CTLA-4與B7配體的結(jié)合介導(dǎo)負(fù)性信號(hào)，抑制IL-2分泌和細(xì)胞增殖?？傊?，CTLA-4-介導(dǎo)的T細(xì)胞活化抑制導(dǎo)致T-細(xì)胞調(diào)節(jié)的免疫反應(yīng)，特別是早期T-細(xì)胞活化事件的“轉(zhuǎn)換”。(Brunner，等，1999 J.Immunol.1625813-5820.)近期發(fā)現(xiàn)經(jīng)抗-CTLA-4抗體治療阻斷CTLA-4功能，導(dǎo)致多種免疫反應(yīng)增強(qiáng)并促成誘導(dǎo)腫瘤免疫(Leach，等，1996，Science 2711734-1736；PCT公開WO 00/322231和WO 01/14424)。移植了B16黑素瘤細(xì)胞的小鼠經(jīng)過抗-CTLA-4 mAb和產(chǎn)生GM-CSF的腫瘤細(xì)胞疫苗的聯(lián)合治療顯示出腫瘤消退和CD8+T細(xì)胞水平增高。已經(jīng)公開了以預(yù)防性模式(即，在腫瘤攻擊之前)給予該聯(lián)合治療，即使在無CD8+T細(xì)胞的情況下也能導(dǎo)致完全保護(hù)。數(shù)據(jù)證實(shí)在荷瘤小鼠可誘導(dǎo)治療性自體反應(yīng)CD8+T細(xì)胞。(Van Elsas，等，2001，J.Exp.Med.194481-489)?？?CTLA-4抗體聯(lián)合GM-CSF腫瘤細(xì)胞疫苗的聯(lián)合施用已經(jīng)證明了能有效抵抗已建立的B16-BL6黑素瘤細(xì)胞，但當(dāng)各療法單獨(dú)施用時(shí)已經(jīng)報(bào)道了僅能產(chǎn)生較小效果。(Van Elsas，等，1999，J.Exp.Med.190355-366)。此外，已經(jīng)報(bào)道了CTLA-4的阻斷與輔助性功能的增強(qiáng)相關(guān)并誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞擴(kuò)增。(Hernandez，等，2001，J.Immun.3908-3914)。已經(jīng)觀察到通過施用抗-CTLA-4抗體的阻斷導(dǎo)致宿主對(duì)細(xì)胞內(nèi)病原體抗性增強(qiáng)，肝和脾中產(chǎn)生IFN-g和IL-4細(xì)胞數(shù)量增加，以及所導(dǎo)致的肝肉芽腫反應(yīng)增強(qiáng)(Murphy，等，1998，J.Immun.4153-4160)。
2.5熱激蛋白熱激蛋白(HSP)(此處還可互換地指應(yīng)激蛋白)，可選自任何滿足下列條件的細(xì)胞蛋白。其是當(dāng)細(xì)胞受到應(yīng)激性刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)濃度升高的蛋白，其能結(jié)合其它蛋白或肽，且其能在存在三磷酸腺苷(ATP)或低pH的情況下釋放結(jié)合的蛋白或肽。此外，HSP包括由應(yīng)激誘發(fā)的蛋白構(gòu)成性表達(dá)的保守性細(xì)胞性同系物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Hsp-60、Hsp-70和Hsp-90家族由在氨基酸序列與應(yīng)激蛋白相關(guān)(例如具有大于35％的氨基酸同一性)的蛋白組成，但它們的表達(dá)水平并不因應(yīng)激性刺激而改變。因此，可以預(yù)計(jì)如這里所使用的應(yīng)激蛋白的定義，包括與這三個(gè)家族的成員至少具有35％～55％，優(yōu)選55％～75％，最優(yōu)選75％～85％的氨基酸同一性的其它蛋白，其突變蛋白，類似物和變體，所述三個(gè)家族的成員在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平在應(yīng)答應(yīng)激性刺激時(shí)受到激發(fā)。
要鑒別的第一種應(yīng)激蛋白是HSP。如其名字所示，HSP是在對(duì)熱激的反應(yīng)中由細(xì)胞合成的。迄今為止，根據(jù)分子量鑒定了HSP的三個(gè)主要家族。該家族被稱為hsp60、hsp70和hsp90，其中數(shù)字表示以千道爾頓計(jì)的應(yīng)激蛋白的大致分子量。后來發(fā)現(xiàn)這些家族的多個(gè)成員在對(duì)包括(但不限于)營(yíng)養(yǎng)流失，代謝中斷(metabolic disruption)，氧自由基和細(xì)胞內(nèi)病原體感染的其它應(yīng)激性刺激中被誘導(dǎo)產(chǎn)生。(參見Welch，May 1993，Scientific American 56-64；Young，1990，Annu.Rev.Immunol.8401-420；Craig，1993，Science 2601902-1903；Gething，等，1992，Nature 35533-45；和Lindquist，等，1988，Annu.Rev.Genetics 22631-677)，上述文件公開的內(nèi)容均引入此處作為參考。預(yù)期屬于這三個(gè)家族的hsp/應(yīng)激蛋白可用于實(shí)施本發(fā)明。
HSP是高豐度，可溶性和高度保守的細(xì)胞內(nèi)分子。作為細(xì)胞內(nèi)伴隨物(chaperones)，HSP參與蛋白成熟的許多生物化學(xué)途徑并在應(yīng)激和正常細(xì)胞自動(dòng)調(diào)節(jié)時(shí)發(fā)揮功能活性。很多應(yīng)激能破壞細(xì)胞蛋白的三維結(jié)構(gòu)和折疊。殘留的不正確，錯(cuò)誤折疊的蛋白形成能最終殺死細(xì)胞的聚集物。HSP與這些受損蛋白結(jié)合，輔助其再折疊為其適當(dāng)?shù)臉?gòu)象。在正常(非應(yīng)激性)細(xì)胞自動(dòng)調(diào)節(jié)中，細(xì)胞代謝需要HSP。HSP輔助新合成的多肽折疊，由此抑制與其它蛋白的相互作用過早成熟。而且，HSP輔助蛋白穿過細(xì)胞多種區(qū)室的轉(zhuǎn)運(yùn)。
主要HSP在應(yīng)激細(xì)胞中可積累至非常高的水平，但其在未受應(yīng)激的細(xì)胞中僅表現(xiàn)為低至中等水平。例如，在正常溫度下很難檢測(cè)到高度可誘導(dǎo)性哺乳動(dòng)物的hsp70，但在經(jīng)受熱激時(shí)其成為細(xì)胞內(nèi)合成最活躍的蛋白(Welch，等，1985，J.Cell.Biol.1011198-1211)。與之相反，正常溫度下hsp90和hsp60蛋白在大多數(shù)(但不是全部)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中非常豐富且可被熱進(jìn)一步誘導(dǎo)(Lai，等，1984，Mol.Cell.Biol.42802-2810；van Bergen enHenegouwen，等，1987，Genes Dev.1525-531)。
HSP已被發(fā)現(xiàn)具有免疫特性和抗原特性。用分離自特定腫瘤的gp96或p84/86免疫小鼠使小鼠具有針對(duì)該特定腫瘤而非針對(duì)抗原不同的腫瘤的免疫(Srivastava，P.K.，等，1988，Immunogenetics 28205-207；Srivastava，P.K.，等，1991，Curr.Top.Microbiol.Immunol.167109-123)。而且，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)hsp70能引發(fā)針對(duì)其分離自的腫瘤的免疫性而不能引發(fā)針對(duì)抗原不同的腫瘤的免疫性。然而，發(fā)現(xiàn)肽缺乏hsp70會(huì)喪失其特異性免疫原性活性(Udono，M.，和Srivastava，P.K.，1993，J.Exp.Med.1781391-1396)。這些發(fā)現(xiàn)提示熱激蛋白實(shí)質(zhì)上具有抗原性，而是與抗原肽形成非共價(jià)復(fù)合物，而該復(fù)合物能引發(fā)針對(duì)抗原肽的特異性免疫(Srivastava，P.K.，1993，Adv.Cancer Res.62153-177；Udono，H.，等，1994，J.Immunol.1525398-5403；Suto，R.，等，1995，Science 2691585-1588)。近年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)hsp60和hsp70能刺激的單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞或細(xì)胞毒性T細(xì)胞生成炎癥前細(xì)胞因子，如TNFα和IL-6(Breloer等，1999，J.Immuno l.1 623141-3147；Chen等，1999，J.Immunol.1623212-3219；Ohashi等，2000，J.Immunol.164558-561；Asea等，2000，Nature Medicine，6435-442；Todryk等，1999，J.Immunol.1631398-1408)。還已發(fā)現(xiàn)Hsp70靶向未成熟樹突狀細(xì)胞并使其更能俘獲抗原(Todryk等，1999，J.Immunol.1631398-1408)。已經(jīng)推測(cè)hsp60和hsp70表達(dá)的釋放或誘導(dǎo)(例如由于細(xì)胞死亡)可作為免疫反應(yīng)應(yīng)被提高的信號(hào)(Chen等，1999，J.Immunol.1623212-3219；Ohashi等，2000，J.Immunol.164558-561；Todryk等，1999，J.Immunol.1631398-1408；Basu等，2000，J.Immunol.121539-1546)。
美國(guó)專利號(hào)5,750,119，5,837,251和6,017,540中已經(jīng)公開了HSP和肽(純化自癌細(xì)胞)的非共價(jià)復(fù)合物用于治療和預(yù)防癌癥的用途。
美國(guó)專利號(hào)5,985,270和5,830,464中已經(jīng)公開了體外敏化抗原呈遞細(xì)胞的HSP-肽復(fù)合物用于過繼免疫治療中的用途。
還可從感染了病原體的細(xì)胞中分離HSP-肽復(fù)合物并將其用于治療和預(yù)防由病原體，例如病毒和其它細(xì)胞內(nèi)病原體(包括細(xì)菌，原生動(dòng)物，真菌和寄生蟲)導(dǎo)致的感染；參見美國(guó)專利號(hào)5,961,979和6,048,530。
還可通過HSP和抗原肽的體外結(jié)合制備免疫原性HSP-肽復(fù)合物，所述復(fù)合物用于治療和預(yù)防癌癥和感染性疾病的用途已經(jīng)公開于美國(guó)專利號(hào)5,935,576和6,030,618中。熱激蛋白聯(lián)合特定抗原用于治療癌癥和感染性疾病的用途也已公開于PCT公開號(hào)WO97/06821，1997年2月27日。
從細(xì)胞裂解產(chǎn)物中純化HSP-肽復(fù)合物也已經(jīng)公開；參見例如美國(guó)專利號(hào)5,750,119和5,997,873。
3.發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生或增強(qiáng)免疫反應(yīng)的方法和組合物，其包括施用熱激蛋白(HSP)制劑和免疫反應(yīng)劑。所述方法和組合物可用于改善單獨(dú)施用HSP制劑和/或單獨(dú)施用免疫反應(yīng)劑的個(gè)體中的治療效果。具體而言，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生或增強(qiáng)由免疫反應(yīng)劑引發(fā)的免疫反應(yīng)，和/或改善免疫反應(yīng)劑功效的方法和組合物，其包括施用HSP制劑。因此，所述方法和組合物包括施用HSP制劑以便增強(qiáng)被動(dòng)免疫療法。在特定實(shí)施方案中，所述方法和組合物包括施用HSP制劑并可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)劑激發(fā)效應(yīng)細(xì)胞功能的能力。本發(fā)明還涉及用于增強(qiáng)由HSP制劑引發(fā)的免疫反應(yīng)的方法和組合物，其包括施用免疫反應(yīng)劑。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的方法和組合物可用于疾病或病癥的預(yù)防和治療，其中治療或預(yù)防可被增強(qiáng)的免疫反應(yīng)所改善，例如感染性疾病、原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤性疾病(即，癌癥)、神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病或蛋白沉積或淀粉樣蛋白病。因此，本發(fā)明包括用以治療或預(yù)防感染性疾病、原發(fā)性腫瘤性疾病和轉(zhuǎn)移性腫瘤性疾病(即，癌癥)、神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病或蛋白沉積或淀粉樣蛋白病的方法和組合物，其包括施用一種或多種免疫反應(yīng)劑聯(lián)合HSP制劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過使用HSP制劑產(chǎn)生或增強(qiáng)由免疫反應(yīng)劑引發(fā)的免疫反應(yīng)的方法，其中所述HSP制劑能增強(qiáng)由單獨(dú)施用時(shí)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)次優(yōu)的免疫反應(yīng)劑的量所引發(fā)的免疫反應(yīng)。在特定實(shí)施方案中，當(dāng)HSP制劑不聯(lián)合免疫反應(yīng)劑使用以引發(fā)免疫反應(yīng)時(shí)，單獨(dú)施用所述HSP制劑不能產(chǎn)生或增強(qiáng)所述免疫反應(yīng)。在選擇性的實(shí)施方案中，HSP制劑和免疫反應(yīng)劑均可在單獨(dú)和/或聯(lián)合施用時(shí)引發(fā)免疫反應(yīng)。
在特定實(shí)施方案中，HSP制劑以累加模式增強(qiáng)免疫反應(yīng)劑的作用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，HSP制劑以協(xié)同模式增強(qiáng)免疫反應(yīng)劑的作用。在另一實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)劑以累加模式增強(qiáng)免疫反應(yīng)劑的作用。優(yōu)選地，以協(xié)同模式增強(qiáng)該作用。因此，在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明包括疾病的治療或預(yù)防方法，所述方法能夠提供比單獨(dú)施用HSP制劑和/或單獨(dú)施用免疫反應(yīng)劑更好的治療譜。本發(fā)明包括具有累加功效或累加療效并降低或避免不需要的或不良的反應(yīng)的聯(lián)合治療。本發(fā)明還包括治療效果高于累加性的協(xié)同性聯(lián)合，同時(shí)能降低或避免不需要的或不良的反應(yīng)。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法能治療或預(yù)防疾病或病癥，其中通過增強(qiáng)的免疫反應(yīng)改善治療，采用較少和/或較低頻率劑量的免疫反應(yīng)劑和/或HSP以便降低由單獨(dú)施用免疫反應(yīng)劑和/或HSP導(dǎo)致的不需要的或不良的反應(yīng)的發(fā)生率，同時(shí)保持或增強(qiáng)治療效果，優(yōu)選增強(qiáng)患者順應(yīng)性，改善治療和/或減少不需要的或不良的反應(yīng)。
本發(fā)明的方法和組合物不僅可用于未治療的患者還可用于治療對(duì)單獨(dú)施用HSP或單獨(dú)施用免疫反應(yīng)劑部分或完全無應(yīng)答的患者。在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于在已經(jīng)表現(xiàn)出或可能對(duì)包括分別或同時(shí)施用免疫反應(yīng)劑和/或HSP的治療具有抗性或無應(yīng)答的患者中治療疾病或病癥的方法和組合物，其中治療被增強(qiáng)的免疫反應(yīng)改善。
用于本發(fā)明的方法和組合物的HSP制劑可包括(但不限于)，未結(jié)合任何分子的游離HSP，和HSP與另一分子，例如肽的分子復(fù)合物。HSP-肽復(fù)合物包括與肽共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的HSP。所述HSP-肽復(fù)合物可包括與肽結(jié)合的HSP，所述肽來源于興趣腫瘤、病原體或細(xì)胞類型和/或患者。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽是由免疫反應(yīng)劑識(shí)別的相同靶點(diǎn)或來源于興趣腫瘤、病原體或細(xì)胞類型和/或患者?？蛇x地，HSP-肽復(fù)合物可包含結(jié)合內(nèi)源性肽的HSP，而所述肽無須是來自與免疫反應(yīng)劑的靶點(diǎn)相同的來源。本發(fā)明的特定方法不需要HSP在施用于個(gè)體之前與任何特異性抗原或抗原肽共價(jià)或非共價(jià)的結(jié)合。用于本發(fā)明的方法和組合物的HSP制劑還包括HSP融合蛋白。HSP融合蛋白可包括與任何抗原肽序列融合的HSP，其中肽序列來源于興趣腫瘤、病原體或細(xì)胞類型和/或蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述肽序列是與免疫反應(yīng)劑識(shí)別的相同的靶點(diǎn)或來源于興趣腫瘤、病原體或細(xì)胞類型和/或蛋白。
用于本發(fā)明的方法和組合物的免疫反應(yīng)劑可包括(但不限于)，抗體、工程化以使其包含抗體的抗原結(jié)合部分的分子或蛋白、工程化以使其包含介導(dǎo)抗體依賴性免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合區(qū)域的分子或蛋白、與興趣抗原特異性相互反應(yīng)的肽或域，或具有任何與興趣抗原/抗原表位相互作用的抗原結(jié)合區(qū)域和介導(dǎo)抗體依賴性免疫反應(yīng)，如效應(yīng)細(xì)胞反應(yīng)或過程的抗體的恒定區(qū)的域的分子。所述抗原結(jié)合區(qū)域識(shí)別特異性靶點(diǎn)而恒定區(qū)的域介導(dǎo)抗體依賴性免疫效應(yīng)細(xì)胞反應(yīng)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)劑是抗體，優(yōu)選用于體內(nèi)治療性或預(yù)防性用途的抗體，本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)所述治療性或預(yù)防性抗體的功效的方法和組合物，其包括施用HSP制劑。在特定實(shí)施方案中，抗體激發(fā)效應(yīng)細(xì)胞功能的能力通過施用HSP制劑得以增強(qiáng)。在特定實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞或病原體或致病蛋白和致病肽的抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性和/或吞噬作用通過治療性抗體與HSP制劑聯(lián)合使用而得以增強(qiáng)。治療性抗體優(yōu)選是細(xì)胞毒性抗體和/或調(diào)理素化抗體。因此，本發(fā)明提供了方法和組合物，其中HSP制劑與免疫反應(yīng)劑聯(lián)合使用從而增強(qiáng)針對(duì)巨噬細(xì)胞，自然殺傷(NK)細(xì)胞和多形核細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞功能(即，抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性和吞噬作用)。所述免疫反應(yīng)劑優(yōu)選是抗體，更優(yōu)選是細(xì)胞毒性抗體和/或調(diào)理素化抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過刺激效應(yīng)細(xì)胞，即誘導(dǎo)和/或活化所述細(xì)胞上的Fc受體而產(chǎn)生被動(dòng)免疫療法的HSP-介導(dǎo)的增強(qiáng)。
用于本發(fā)明的方法的抗體包括(但不限于)，單克隆抗體、多克隆抗體、合成抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab′)片段、二硫聯(lián)Fv(sdFv)和抗獨(dú)特型(抗-Id)抗體(包括，例如針對(duì)本發(fā)明抗體的抗-Id抗體)，以及上述任何一種的表位-結(jié)合片段。特別地，用于本發(fā)明的方法的抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含免疫特異性結(jié)合興趣靶點(diǎn)的抗原結(jié)合部位的分子。本發(fā)明的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何型(例如IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)、類(例如IgG，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2)或亞類。
不受任何理論限制，濃度增高的HSP可誘導(dǎo)細(xì)胞因子生成以及抗原呈遞分子和共刺激分子的表面表達(dá)。因此，對(duì)個(gè)體施用的HSP制劑可通過增加抗原呈遞的效率和功效而增強(qiáng)免疫反應(yīng)劑的功效。
在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，將免疫反應(yīng)劑施用于接受HSP制劑的個(gè)體以便改善治療結(jié)果。在特定實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)劑增強(qiáng)通過施用HSP制劑而引發(fā)的免疫反應(yīng)。
在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，抗體是抗-CTLA-4抗體。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，抗體是抗-c-erb-2抗體，優(yōu)選是特別用于治療或預(yù)防表達(dá)Her2/neu癌基因的癌癥中的人rhu 4D5(Herceptin)。而在另一特定實(shí)施方案中，抗體是用于治療例如(但不限于)NK-細(xì)胞-抗性淋巴瘤的癌癥的抗-腫瘤MoAb(MS11G6)，IgG2a抗-獨(dú)特型抗體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，HSP制劑與針對(duì)癌癥的抗-腫瘤或抗-癌抗體治療聯(lián)合施用。在可選的實(shí)施方案中，HSP制劑與針對(duì)病原體的抗體治療聯(lián)合施用。而在另一實(shí)施方案中，HSP制劑與針對(duì)病原性或不需要的蛋白或被神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病或病癥影響的細(xì)胞的抗體治療聯(lián)合施用。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可通過對(duì)個(gè)體施用治療量的免疫反應(yīng)劑和HSP制劑而用于產(chǎn)生針對(duì)與神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病、癌癥或感染性疾病因子相關(guān)的表位或任何荷有上述疾病相關(guān)表位的部分、細(xì)胞或分子的免疫反應(yīng)。在需要針對(duì)癌癥類型的免疫反應(yīng)的情況下，使用特異性結(jié)合(或“識(shí)別”)該癌癥類型的抗原，例如腫瘤相關(guān)抗原的免疫反應(yīng)劑。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物包括施用特異性結(jié)合癌癥類型的抗原的免疫反應(yīng)劑聯(lián)合HSP制劑用于治療或預(yù)防所述癌癥類型。在需要引發(fā)針對(duì)感染性疾病的因子的免疫反應(yīng)的情況下，施用特異性結(jié)合感染性疾病因子的抗原或病理性蛋白(例如，毒素)的免疫反應(yīng)劑。在選擇性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物包括施用特異性結(jié)合感染性疾病因子的免疫反應(yīng)劑聯(lián)合HSP制劑來治療或預(yù)防所述感染性疾病。而在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物包括施用特異性結(jié)合神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病相關(guān)抗原性分子的免疫反應(yīng)劑聯(lián)合HSP制劑來治療或預(yù)防所述神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病。優(yōu)選地，所述免疫反應(yīng)劑是抗體。
本發(fā)明還包括包含對(duì)先前已經(jīng)接受或目前正在接受其它類型的醫(yī)學(xué)治療(包括抗癌劑，抗生素和抗-感染性病原體劑)的患者聯(lián)合施用HSP制劑和免疫反應(yīng)劑的方法和組合物。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了活化抗原呈遞細(xì)胞的方法，其包括將APC與HSP制劑接觸以及聯(lián)合施用所述活化的APC和免疫反應(yīng)劑。因此，本發(fā)明提供了增強(qiáng)由免疫反應(yīng)劑引發(fā)的免疫反應(yīng)的方法和組合物，其包括施用活化的APC和/或HSP制劑。優(yōu)選地，HSP制劑在不施用免疫反應(yīng)劑時(shí)不能有效地引發(fā)免疫反應(yīng)。在特定實(shí)施方案中，HSP制劑不表現(xiàn)被免疫反應(yīng)劑識(shí)別的靶點(diǎn)的免疫原性。在選擇性的實(shí)施方案中，HSP制劑的免疫原性表現(xiàn)出被免疫反應(yīng)劑識(shí)別的靶點(diǎn)的免疫原性。HSP制劑的免疫原性可通過本領(lǐng)域已知的任何方法在體內(nèi)或體外進(jìn)行檢測(cè)。
在特定實(shí)施方案中，包括施用免疫反應(yīng)劑和施用活化的APC和/或HSP制劑的本發(fā)明的方法和組合物可用于治療任何疾病或病癥，其中所述疾病的治療可通過增強(qiáng)的免疫反應(yīng)，特別是抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)得以改善，例如但不限于感染性疾病、癌癥或神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病或病癥。
本發(fā)明還包括遞送與免疫反應(yīng)劑聯(lián)合的作為輔助治療的一種或多種HSP的方法；用于給藥的藥物組合物和配方，其包括一種或多種HSP制劑和一種或多種免疫反應(yīng)劑，包含所述藥物組合物的藥盒；和采用本發(fā)明的預(yù)防性或治療性藥物組合物治療或預(yù)防將被增強(qiáng)的免疫反應(yīng)改善的疾病如感染性疾病、原發(fā)性腫瘤性疾病和轉(zhuǎn)移性腫瘤性疾病(即，癌癥)，神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病或蛋白沉積或淀粉樣蛋白病的方法。所述方法，藥盒和組合物可進(jìn)一步包括施用活化的APC。
4.發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生或增強(qiáng)免疫反應(yīng)的方法和組合物，其包括施用熱激蛋白(HSP)制劑和免疫反應(yīng)劑。所述方法和組合物可用于改善單獨(dú)施用HSP制劑和/或單獨(dú)施用免疫反應(yīng)劑的個(gè)體中的治療效果。特別地，本發(fā)明提供了用于改善免疫反應(yīng)劑的預(yù)防效果或治療效果的方法和組合物。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生或增強(qiáng)由免疫反應(yīng)劑引發(fā)的免疫反應(yīng)的方法和組合物，其包括施用HSP制劑。因此，所述方法和組合物包括施用HSP制劑以便增強(qiáng)被動(dòng)免疫療法。在特定實(shí)施方案中，所述方法和組合物包括施用HSP制劑并可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)劑激發(fā)效應(yīng)細(xì)胞功能的能力。本發(fā)明還涉及用于增強(qiáng)由HSP制劑引發(fā)的免疫反應(yīng)的方法和組合物，其包括施用免疫反應(yīng)劑。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的方法和組合物可用于疾病或病癥的預(yù)防和治療，其中治療或預(yù)防可被增強(qiáng)的免疫反應(yīng)所改善，例如感染性疾病、原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤性疾病(即，癌癥)，神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病或蛋白沉積或淀粉樣蛋白病。因此，本發(fā)明包括用以治療或預(yù)防感染性疾病、原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤性疾病(即，癌癥)、神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病或蛋白沉積或淀粉樣蛋白病的方法和組合物，其包括聯(lián)合施用一種或多種免疫反應(yīng)劑HSP制劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過使用HSP制劑產(chǎn)生或增強(qiáng)由免疫反應(yīng)劑引發(fā)的免疫反應(yīng)的方法，其中HSP制劑促進(jìn)免疫反應(yīng)劑誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，所述免疫反應(yīng)劑的量在單獨(dú)使用時(shí)不足以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。在特定實(shí)施方案中，當(dāng)HSP制劑不聯(lián)合免疫反應(yīng)劑使用以引發(fā)免疫反應(yīng)時(shí)，單獨(dú)施用所述HSP制劑不能產(chǎn)生或增強(qiáng)所述免疫反應(yīng)。在選擇性的實(shí)施方案中，HSP制劑和免疫反應(yīng)劑均可在單獨(dú)和/或聯(lián)合施用時(shí)引發(fā)免疫反應(yīng)。
在特定實(shí)施方案中，HSP制劑以累加模式增強(qiáng)免疫反應(yīng)劑的作用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，HSP制劑以協(xié)同模式增強(qiáng)免疫反應(yīng)劑的作用。在另一實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)劑以累加模式增強(qiáng)免疫反應(yīng)劑的作用。優(yōu)選地，以協(xié)同模式增強(qiáng)所述作用。因此，在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明包括方法疾病治療或預(yù)防方法，所述方法能夠提供比單獨(dú)施用HSP制劑和/或單獨(dú)施用免疫反應(yīng)劑更好的治療譜。本發(fā)明包括具有累加功效或累加療效而降低或避免不需要的或不良的反應(yīng)的聯(lián)合治療。本發(fā)明還包括治療效果高于累加的協(xié)同性聯(lián)合，同時(shí)能降低或避免不需要的或不良的反應(yīng)。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法能治療或預(yù)防疾病或病癥，其中通過增強(qiáng)的免疫反應(yīng)改善治療，采用較少和/或較低頻率劑量的免疫反應(yīng)劑和/或HSP以便降低由單獨(dú)施用免疫反應(yīng)劑和/或HSP而導(dǎo)致的不需要的或不良的反應(yīng)的發(fā)生率，而同時(shí)保持或增強(qiáng)治療效果，優(yōu)選增強(qiáng)患者順應(yīng)性，改善治療和/或減少不需要的或不良的反應(yīng)。
本發(fā)明的方法和組合物不僅可用于未治療的患者還可用于治療對(duì)單獨(dú)施用HSP或單獨(dú)施用免疫反應(yīng)劑部分或完全無應(yīng)答的患者。在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于治療已經(jīng)表現(xiàn)出或可能對(duì)包括分別或同時(shí)施用免疫反應(yīng)劑和/或HSP的治療具有抗性或無應(yīng)答的患者的疾病或病癥的方法和組合物，且其中治療被增強(qiáng)的免疫反應(yīng)改善。
用于本發(fā)明的方法和組合物的HSP制劑可包括(但不限于)，未與任何分子結(jié)合的游離HSP，和HSP與另一分子，例如肽的分子復(fù)合物。HSP-肽復(fù)合物包括與肽共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的的HSP。所述HSP-肽復(fù)合物可包括與肽結(jié)合的HSP，所述肽來源于興趣腫瘤、病原體或細(xì)胞類型和/或患者，優(yōu)選的所述肽是由免疫反應(yīng)劑識(shí)別的相同靶點(diǎn)。可選地，HSP-肽復(fù)合物可由HSP與內(nèi)源性肽結(jié)合所組成，而無須是來自與免疫反應(yīng)劑的靶點(diǎn)相同來源的肽。本發(fā)明的特定方法不需要HSP在對(duì)個(gè)體施用之前與任何特異性抗原或抗原肽共價(jià)或非共價(jià)的結(jié)合。本發(fā)明包括包含共價(jià)或非共價(jià)與體外產(chǎn)生的外源性肽結(jié)合的HSP的HSP-肽復(fù)合物的用途，以及分離自細(xì)胞來源的內(nèi)源性HSP-肽復(fù)合物的用途。
用于本發(fā)明的方法和組合物的免疫反應(yīng)劑可包括(但不限于)，抗體、工程化以使其包含抗體的抗原結(jié)合部分的分子或蛋白、工程化以使其包含介導(dǎo)抗體依賴性免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合區(qū)域的分子或蛋白、與興趣抗原特異性相互反應(yīng)的肽或域，或任何與興趣抗原/抗原表位相互作用的抗原結(jié)合區(qū)域。所述抗原結(jié)合區(qū)域優(yōu)選與介導(dǎo)抗體依賴性免疫反應(yīng)、免疫效應(yīng)細(xì)胞反應(yīng)或過程的抗體恒定區(qū)的域相關(guān)聯(lián)。所述免疫效應(yīng)劑優(yōu)選是純化的。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)劑是抗體，優(yōu)選用于體內(nèi)治療性或預(yù)防性用途的抗體，本發(fā)明提供了用于增強(qiáng)所述治療性或預(yù)防性抗體的功效的方法和組合物，其包括施用HSP制劑。在所述實(shí)施方案中，抗體激發(fā)效應(yīng)細(xì)胞功能的能力通過施用HSP制劑而得以增強(qiáng)。在特定實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞或病原體或致病蛋白和致病肽的抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性和/或吞噬作用通過使用治療性抗體聯(lián)合HSP制劑而得以增強(qiáng)。治療性抗體優(yōu)選是細(xì)胞毒性抗體和/或調(diào)理素化抗體。因此，本發(fā)明提供了方法和組合物，其中HSP制劑與免疫反應(yīng)劑聯(lián)合使用從而增強(qiáng)針對(duì)巨噬細(xì)胞，自然殺傷(NK)細(xì)胞和多形核細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞功能(即，抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性和吞噬作用)。所述免疫反應(yīng)劑優(yōu)選是抗體，更優(yōu)選是細(xì)胞毒性抗體和/或調(diào)理素化抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過刺激效應(yīng)細(xì)胞，即誘導(dǎo)和/或活化所述細(xì)胞上的Fc受體而產(chǎn)生被動(dòng)免疫療法的HSP-介導(dǎo)的增強(qiáng)。
在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，將免疫反應(yīng)劑施用于接受HSP制劑的個(gè)體以便改善治療結(jié)果。在特定實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)劑增強(qiáng)了施用HSP制劑而引發(fā)的免疫反應(yīng)。在其它實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)劑能使HSP引發(fā)的T細(xì)胞活化成為可能。
在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，抗體是抗-CTLA-4抗體。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，抗體是抗-c-erb-2抗體，優(yōu)選是特別用于治療或預(yù)防表達(dá)Her2/neu癌基因的癌癥中的人rhu 4D5(Herceptin)。而在另一特定實(shí)施方案中，抗體是用于治療例如(但不限于)NK-細(xì)胞-抗性淋巴瘤的癌癥的抗-腫瘤MoAb(MS11G6)，IgG2a抗-獨(dú)特型抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗體是Toll樣受體(TLR)，例如TLR 2、7、8或9的激動(dòng)劑。在另一實(shí)施方案中，所述抗體是41BB(參見例如，Miller等，2002，J.Immunol.1691792-1800)、OX40、ICOS或CD40的激動(dòng)劑。而在另一實(shí)施方案中，所述抗體是Fas配體或PD1的拮抗劑。在另一實(shí)施方案中，所述抗體是與恒定NKT細(xì)胞的T細(xì)胞受體(TCR)的CDR3環(huán)結(jié)合并擴(kuò)增和/或活化這些細(xì)胞的Mab 6B11。參見公開于2002年11月7日的US 2002/0164331。
在一個(gè)實(shí)施方案中，HSP制劑與針對(duì)癌癥的抗-腫瘤抗體治療聯(lián)合施用。在可選的實(shí)施方案中，HSP制劑與針對(duì)病原體的抗體治療聯(lián)合施用。而在另一實(shí)施方案中，HSP制劑與針對(duì)被神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病或病癥影響的細(xì)胞的抗體治療聯(lián)合施用。
不受任何理論的限制，濃度增高的HSP可誘導(dǎo)細(xì)胞因子的生成和抗原-呈遞及共刺激分子的表面表達(dá)。因此，對(duì)個(gè)體施用的HSP制劑確信可以通過增建抗原呈遞的效率和功效而增強(qiáng)免疫反應(yīng)劑的功效。在特定實(shí)施方案中，HSP制劑確信能夠增強(qiáng)抗體-介導(dǎo)的反應(yīng)如細(xì)胞效應(yīng)子作用。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可通過對(duì)個(gè)體施用治療量的免疫反應(yīng)劑和HSP制劑而用于產(chǎn)生針對(duì)與神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病，癌癥或感染性疾病因子相關(guān)的表位或任何荷有上述疾病相關(guān)表位的部分、細(xì)胞或分子的免疫反應(yīng)。在需要針對(duì)癌癥類型的免疫反應(yīng)的情況下，使用特異性結(jié)合(或“識(shí)別”)該癌癥類型的抗原，例如腫瘤相關(guān)抗原的免疫反應(yīng)劑。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物包括聯(lián)合施用特異性結(jié)合癌癥類型的抗原的免疫反應(yīng)劑與HSP制劑而用于治療或預(yù)防所述癌癥類型。在需要引發(fā)針對(duì)感染性疾病的因子的免疫反應(yīng)的情況下，施用特異性結(jié)合感染性疾病因子的抗原或病理性蛋白(例如，毒素)的免疫反應(yīng)劑。在選擇性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物包括聯(lián)合施用特異性結(jié)合感染性疾病因子的免疫反應(yīng)劑與HSP制劑來治療治療或預(yù)防所述感染性疾病。而在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物包括聯(lián)合施用特異性結(jié)合與神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病相關(guān)的抗原性分子的免疫反應(yīng)劑與HSP制劑來治療或預(yù)防所述神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病。優(yōu)選地，所述免疫反應(yīng)劑是抗體。
本發(fā)明還包括包含對(duì)先前已經(jīng)接受或目前正在接受其它類型的醫(yī)學(xué)治療(包括抗癌劑，抗生素和抗-感染劑)的患者施用HSP制劑聯(lián)合免疫反應(yīng)劑的方法和組合物。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了活化抗原呈遞細(xì)胞的方法，其包括將APC與HSP制劑接觸并聯(lián)合施用所述活化的APC和免疫反應(yīng)劑。因此，本發(fā)明提供了增強(qiáng)由免疫反應(yīng)劑引發(fā)的免疫反應(yīng)的方法和組合物，其包括施用活化的APC和/或HSP制劑。優(yōu)選地，HSP制劑在不施用免疫反應(yīng)劑時(shí)不能有效地引發(fā)免疫反應(yīng)。在特定實(shí)施方案中，HSP制劑不表現(xiàn)被免疫反應(yīng)劑識(shí)別的靶點(diǎn)的免疫原性。在選擇性的實(shí)施方案中，HSP制劑的免疫原性表現(xiàn)出被免疫反應(yīng)劑識(shí)別的靶點(diǎn)的免疫原性。HSP制劑的免疫原性可通過本領(lǐng)域已知的任何方法在體內(nèi)或體外進(jìn)行檢測(cè)。
在特定實(shí)施方案中，包括施用免疫反應(yīng)劑和施用活化的APC和/或HSP制劑的本發(fā)明的方法和組合物可用于任何疾病或病癥的治療，其中所述疾病的治療將通過增強(qiáng)的免疫反應(yīng)，特別是抗體介導(dǎo)的免疫反應(yīng)而得以改善，例如但不限于感染性疾病、癌癥或神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病或病癥。
本發(fā)明還包括遞送與免疫反應(yīng)劑聯(lián)合的作為輔助治療的一種或多種HSP的方法；用于給藥的藥物組合物和配方，其包括一種或多種HSP制劑和一種或多種免疫反應(yīng)劑，包含所述藥物組合物的藥盒；和采用本發(fā)明的預(yù)防性或治療性藥物組合物治療或預(yù)防將被增強(qiáng)的免疫反應(yīng)改善的疾病如感染性疾病、原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤性疾病(即，癌癥)、神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病或蛋白沉積或淀粉樣蛋白病的方法。所述方法，藥盒和組合物可進(jìn)一步包括施用活化的APC。
4.1預(yù)防方法/治療方法本發(fā)明提供了產(chǎn)生或增加由免疫反應(yīng)劑引發(fā)的免疫反應(yīng)的方法，包括施用聯(lián)合HSP制劑和免疫反應(yīng)劑。本發(fā)明包括治療或預(yù)防疾病或病癥的方法，其中治療或預(yù)防可被增強(qiáng)的免疫反應(yīng)改善。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，增強(qiáng)的免疫反應(yīng)包括例如抗體依賴的細(xì)胞性細(xì)胞毒性(例如，ADCC)或針對(duì)具有抗體識(shí)別的表位的細(xì)胞、病原體或蛋白的抗體-介導(dǎo)的調(diào)理作用和/或吞噬作用和通過效應(yīng)細(xì)胞機(jī)制的補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷的增強(qiáng)。在特定實(shí)施方案中，HSP制劑誘導(dǎo)T-細(xì)胞活化而免疫反應(yīng)劑，例如抗體，能通過增強(qiáng)T細(xì)胞活化而增強(qiáng)免疫反應(yīng)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，“治療”是指癌癥、感染性疾病或神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病或其至少一種可辨別癥狀的改善。在另一實(shí)施方案中，“治療”是指至少一種與癌癥、感染性疾病、神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病相關(guān)的可檢測(cè)的(不一定是個(gè)體可辨別的)身體參數(shù)的改善。而在另一實(shí)施方案中，“治療”是指抑制癌癥、感染性疾病、神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病的進(jìn)展，可以是身體上的，例如可辨別癥狀的穩(wěn)定，生理學(xué)上的，例如身體參數(shù)的穩(wěn)定或二者皆有。而在另一實(shí)施方案中，“治療”是指延遲癌癥、神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病的發(fā)病。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物用作對(duì)抗癌癥、感染性疾病、神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病的預(yù)防性檢測(cè)。如此處所使用的，“預(yù)防”是指降低給定癌癥、感染性疾病、神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病的患病風(fēng)險(xiǎn)。在實(shí)施方案的一種模式中，本發(fā)明的方法和組合物包括施用HSP制劑和施用免疫反應(yīng)劑作為對(duì)癌癥、感染性疾病、神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病遺傳易感的人類個(gè)體的預(yù)防性檢測(cè)。在實(shí)施方案的另一模式中，本發(fā)明的方法和組合物用作對(duì)癌癥非遺傳易感的個(gè)體或暴露于感染性疾病因子的個(gè)體的預(yù)防性檢測(cè)。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物可用于治療或預(yù)防感染性疾病或神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病的臨床表現(xiàn)或發(fā)病。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防感染性疾病、癌癥、神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病或蛋白沉積或淀粉樣蛋白病的方法，包括聯(lián)合施用HSP制劑和一種或多種免疫反應(yīng)劑。在特定實(shí)施方案中，將HSP制劑與一種或多種免疫反應(yīng)劑同時(shí)施用于哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人類。
在一個(gè)實(shí)施方案中，同時(shí)施用HSP制劑和免疫反應(yīng)劑。在另一實(shí)施方案中，對(duì)個(gè)體依次并以能使HSP制劑與免疫反應(yīng)劑同時(shí)發(fā)揮作用以便提供高于其單獨(dú)施用時(shí)的有益效果的時(shí)間間隔施用HSP制劑和免疫反應(yīng)劑。例如，各藥劑(例如HSP制劑和免疫反應(yīng)劑)可同時(shí)或以任何次序在不同的時(shí)間點(diǎn)順次施用；但是，若非同時(shí)施用，其在施用時(shí)間上應(yīng)充分接近以便提供需要的治療性或預(yù)防性效果。各藥劑可以任何適宜形式和通過任何適宜途徑分開施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，HSP制劑和免疫反應(yīng)劑以相同的施用模式進(jìn)行施用。在另一實(shí)施方案中，HSP制劑和免疫反應(yīng)劑以不同的施用途徑進(jìn)行施用。各藥劑的施用可以在相同或不同的位點(diǎn)，例如手臂和腿部。
在多個(gè)實(shí)施方案中，預(yù)防劑或治療劑以間隔小于1小時(shí)、間隔1小時(shí)、間隔1小時(shí)～2小時(shí)、間隔2小時(shí)～3小時(shí)、間隔3小時(shí)～4小時(shí)、間隔4小時(shí)～5小時(shí)、間隔5小時(shí)～6小時(shí)、間隔6小時(shí)～7小時(shí)、間隔7小時(shí)～8小時(shí)、間隔8小時(shí)～9小時(shí)、間隔9小時(shí)～10小時(shí)、間隔10小時(shí)～11小時(shí)、間隔11小時(shí)～12小時(shí)、間隔不超過24小時(shí)或間隔不超過48小時(shí)進(jìn)行施用。在另一實(shí)施方案中，預(yù)防劑或治療劑以間隔1、2、4、8、12、24或48小時(shí)進(jìn)行施用。在其它實(shí)施方案中，HSP制劑和免疫反應(yīng)劑以間隔2～4日、間隔1周、間隔1～2周、間隔2～4周、間隔1個(gè)月、間隔1～2個(gè)月或間隔2或更多個(gè)月進(jìn)行施用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)相同的患者隨訪施用兩種或多種組分。優(yōu)選地，在能使HSP制劑和免疫反應(yīng)劑在相同時(shí)間均為活性的時(shí)間框架內(nèi)對(duì)個(gè)體施用HSP制劑和免疫反應(yīng)劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過測(cè)定HSP制劑和免疫反應(yīng)劑的半衰期能夠確定所述時(shí)間框架。
在特定實(shí)施方案中，在施用免疫反應(yīng)劑之前施用HSP制劑。在替代的具體實(shí)施方案中，在施用免疫反應(yīng)劑之后施用HSP制劑。
在特定實(shí)施方案中，將HSP制劑和/或免疫反應(yīng)劑循環(huán)施用于個(gè)體。循環(huán)治療包括施用一段時(shí)間HSP制劑，然后施用一段時(shí)間免疫反應(yīng)劑和/或任何第三藥劑然后重復(fù)該順次施用。循環(huán)治療降低了對(duì)一種或多種治療抗性的反展，避免或減少各治療的副作用，和/或改善治療效果。在所述實(shí)施方案中，本發(fā)明預(yù)期了施用HSP制劑4～6日后，優(yōu)選2～4日后，更優(yōu)選1～2日后施用免疫反應(yīng)劑，隨后4～6日后，優(yōu)選2～4日后，更優(yōu)選1～2日后施用HSP制劑等的交替施用。所述循環(huán)可按需重復(fù)多次。
在其它實(shí)施方案中，以與免疫反應(yīng)劑合理的相同時(shí)間對(duì)個(gè)體施用HSP制劑。優(yōu)選地，該兩種施用在彼此低于1分鐘～約5分鐘，約5分鐘～約10分鐘，約10分鐘至30分鐘，約30分鐘至約60分鐘的的時(shí)間框架內(nèi)，例如以相同的醫(yī)師隨訪實(shí)施。
在其它實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)劑和HSP制劑可同時(shí)施用。在特定實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)劑和HSP制劑作為單一藥物組合物施用。在所述實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物以每日一次，每日兩次或每次三次進(jìn)行施用。在其它實(shí)施方案中，按照每周一次、每周二次、每?jī)芍芤淮?、每月一次、每六周一次、每?jī)蓚€(gè)月一次、每年兩次或每年一次施用藥物組合物。而且應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到用于治療的免疫反應(yīng)劑的有效劑量可在具體療程期間增加或減少。
本發(fā)明還提供了另一治療方法。在該實(shí)施方案中，當(dāng)個(gè)體的APC需要處于活化狀態(tài)時(shí)，將HSP制劑施用于個(gè)體。HSP制劑可在一段時(shí)間內(nèi)規(guī)律的施用，例如，每日至數(shù)周(1～2周，2～4周，4～6周，最長(zhǎng)達(dá)兩個(gè)月)，其可在免疫反應(yīng)劑療法之前、與之重疊和/或之后。HSP制劑能改善治療的效果。不受任何理論或機(jī)理的限制，對(duì)個(gè)體施用HSP制劑能例如，通過增加自然殺傷(NK)細(xì)胞和/或加速樹突狀細(xì)胞的成熟而增強(qiáng)個(gè)體非特異性免疫機(jī)制的反應(yīng)性。在特定實(shí)施方案中，經(jīng)由HSP制劑的APC活化是體外的且根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物隨后施用所述活化的APC。與要施用的HSP制劑相同或不同的HSP制劑可用于活化APC。各HSP制劑可以或不表現(xiàn)免疫反應(yīng)劑所識(shí)別的抗原性分子的免疫原性。
在另一實(shí)施方案中，在施用免疫反應(yīng)劑后的1小時(shí)～24小時(shí)的時(shí)間框架內(nèi)對(duì)個(gè)體施用HSP制劑。該時(shí)間框架可延長(zhǎng)施用低釋放(或持續(xù)釋放)型免疫反應(yīng)劑。本方法確信可以輔助活化效應(yīng)細(xì)胞，如存在于施用位點(diǎn)或在施用位點(diǎn)附近的尚未經(jīng)由存在的免疫反應(yīng)劑而被活化的APC。
而在另一實(shí)施方案中，在在施用免疫反應(yīng)劑前的1～12小時(shí)、12小時(shí)～24小時(shí)、24～48小時(shí)的時(shí)的間框架內(nèi)對(duì)個(gè)體施用HSP制劑。該方法確信能在個(gè)體APC在遭遇免疫反應(yīng)劑預(yù)活化個(gè)體的APC。
在其它實(shí)施方案中，同時(shí)進(jìn)行療程，即HSP制劑和免疫反應(yīng)劑的各劑量以一定的時(shí)間間隔分開施用以便使HSP制劑能與免疫反應(yīng)劑一同發(fā)揮作用。例如，可每周一次施用HSP制劑聯(lián)合每?jī)芍芤淮位蛎咳芤淮问┯妹庖叻磻?yīng)劑。換言之，即使各藥劑不能同時(shí)或在相同的患者隨訪中施用，HSP制劑和免疫反應(yīng)劑的給藥方案仍要同時(shí)實(shí)施。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在相同的藥物組合物中同時(shí)施用HSP制劑和一種或多種免疫反應(yīng)劑。在另一實(shí)施方案中，在分開的藥物組合物中同時(shí)施用HSP制劑和一種或多種免疫反應(yīng)劑。在另一實(shí)施方案中，在施用一種或多種免疫反應(yīng)劑之前或之后施用HSP制劑。本發(fā)明預(yù)期了通過相同或不同的給藥途徑施用HSP制劑聯(lián)合一種或多種免疫反應(yīng)劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，HSP制劑經(jīng)皮內(nèi)給藥。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)劑由靜脈內(nèi)給藥。在一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，HSP制劑經(jīng)皮內(nèi)給藥而免疫反應(yīng)劑由靜脈內(nèi)給藥。在特定實(shí)施方案中，當(dāng)將HSP制劑與有可能產(chǎn)生不良的或不需要的副作用(包括但不限于毒性)的免疫反應(yīng)劑同時(shí)施用時(shí)，所述免疫反應(yīng)劑宜于以低于引發(fā)不良副作用的閾值的劑量進(jìn)行施用。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過次優(yōu)量的免疫反應(yīng)劑誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，其中HSP制劑促進(jìn)免疫反應(yīng)劑誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，所述免疫反應(yīng)劑的量在單獨(dú)使用時(shí)不誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。所述HSP制劑可以表現(xiàn)或可不表現(xiàn)由免疫反應(yīng)劑識(shí)別的抗原性分子的免疫原性。在特定實(shí)施方案中，次優(yōu)量是不足以有效誘導(dǎo)免疫反應(yīng)或預(yù)防上或治療上所需效果的量。特別地，所述方法包括如下步驟(a)對(duì)個(gè)體施用一定量的熱激蛋白制劑；和(b)對(duì)個(gè)體施用需要針對(duì)其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的免疫反應(yīng)劑，該免疫反應(yīng)劑的量在缺少步驟(a)的情況下是次優(yōu)的，由此在個(gè)體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。其中所述HSP制劑可以表現(xiàn)或可不表現(xiàn)由免疫反應(yīng)劑識(shí)別的抗原性分子的免疫原性。
而在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過次-免疫原性量的HSP制劑誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，其中免疫反應(yīng)劑促進(jìn)HSP制劑誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，所述HSP制劑的量在單獨(dú)使用時(shí)不足以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。所述HSP制劑可以表現(xiàn)或可不表現(xiàn)由免疫反應(yīng)劑識(shí)別的抗原性分子的免疫原性。
本發(fā)明提供了通過對(duì)個(gè)體施用包含免疫反應(yīng)劑和HSP的藥物組合物來治療、預(yù)防和改善與疾病、病癥或感染相關(guān)的一種或多種癥狀的方法。在優(yōu)選的方面，免疫反應(yīng)劑和HSP為基本上純化的(即，基本上不含限制其功效或產(chǎn)生不需要的副作用的物質(zhì))。根據(jù)本發(fā)明，將本發(fā)明的包含免疫反應(yīng)劑和HSP的組合物施用患有癌癥、感染性疾病或神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病的人類個(gè)體作為治療。
本發(fā)明還涉及采用本發(fā)明的組合物治療感染性疾病、原發(fā)性腫瘤性疾病和轉(zhuǎn)移性腫瘤性疾病(即，癌癥)、神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病，蛋白沉積/淀粉樣蛋白病或可被增強(qiáng)的免疫反應(yīng)改善的疾病的任何其它治療的方法。
4.2患者群施用HSP制劑和免疫反應(yīng)劑的個(gè)體優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，例如非靈長(zhǎng)類(例如牛、豬、馬、貓、狗、鼠等)和靈長(zhǎng)類(例如猴，如短尾猴和人類)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，個(gè)體是人。
在其它多種實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物用于治療或預(yù)防任何疾病或病癥，其中治療性或預(yù)防性免疫反應(yīng)劑用于治療或預(yù)防。疾病或病癥優(yōu)選能順應(yīng)通過增強(qiáng)的免疫反應(yīng)的治療或預(yù)防，更優(yōu)選為感染性疾病、癌癥或神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病所述組合物可用于預(yù)防多種癌癥，例如，由家族史導(dǎo)致的易感性的個(gè)體或由于環(huán)境因素而患癌癥風(fēng)險(xiǎn)提高的個(gè)體，用于預(yù)防感染性疾病，例如，暴露于感染性疾病因子風(fēng)險(xiǎn)增高的個(gè)體，以及用于預(yù)防神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病，例如對(duì)神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病遺傳易感的個(gè)體。
本發(fā)明的方法和組合物可用于首次治療的患者、先前接受或目前正在接受HSP制劑治療的患者、先前接受或目前正在接受免疫反應(yīng)劑治療的患者或先前接受或目前正在接受其它藥劑或組合治療的患者，所述其它藥劑或組合包括但不限于抗癌劑，抗生素，抗菌劑，抗真菌劑和抗病毒劑。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，將HSP制劑施用于先前接受了或目前正在接受免疫治療劑治療的患者。在另一實(shí)施方案中，將免疫治療劑施用于先前接受了或目前正在接受HSP制劑治療的患者。而在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，將HSP制劑施用于先前接受了或目前正在接受包括(但不限于)，抗癌劑、抗生素、抗菌劑、抗真菌劑或抗病毒劑，任選地與免疫治療劑聯(lián)合治療的患者。在另一實(shí)施方案中，將免疫治療劑施用先前接受了或目前正在接受包括(但不限于)，抗癌劑、抗生素、抗菌劑、抗真菌劑或抗病毒劑，任選地聯(lián)合HSP制劑治療的患者。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將包括免疫反應(yīng)劑和HSP制劑的本發(fā)明的藥物組合物施用于先前接受了或目前正在接受包括(但不限于)，抗癌劑、抗生素、抗菌劑、抗真菌劑或抗病毒劑治療的患者。
本發(fā)明的方法和復(fù)合物還可用于治療預(yù)先接受HSP制劑或免疫反應(yīng)劑治療的且目前單獨(dú)施用的各治療方法均不能有效治療的患者。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將包括HSP制劑和免疫反應(yīng)劑的本發(fā)明的組合物施用于對(duì)單獨(dú)HSP制劑單因素治療敏感性不足的患者。在另一實(shí)施方案中，將包括HSP制劑和免疫反應(yīng)劑的本發(fā)明的組合物施用于對(duì)單獨(dú)免疫反應(yīng)劑單因素治療耐受的患者。而在另一實(shí)施方案中，將包括HSP制劑和免疫反應(yīng)劑的本發(fā)明的組合物施用于對(duì)單獨(dú)施用HSP制劑和單獨(dú)施用免疫反應(yīng)劑均耐受的但不對(duì)二者一起施用耐受的患者。在另一實(shí)施方案中，將包括HSP制劑和免疫反應(yīng)劑的本發(fā)明的組合物施用于未接受任何形式內(nèi)科治療的患者。
4.3癌癥的治療和預(yù)防本發(fā)明包括治療或預(yù)防個(gè)體中癌癥或癌轉(zhuǎn)移的方法，包括任何次序的下列步驟對(duì)個(gè)體施用免疫反應(yīng)劑，所述免疫反應(yīng)劑包括識(shí)別癌細(xì)胞的抗原或表位(如癌癥中免疫原性量的抗原，例如但不限于腫瘤特異性抗原，以及腫瘤相關(guān)抗原或表現(xiàn)其抗原性的分子)的組分；和對(duì)個(gè)體施用HSP制劑，該HSP制劑的量能在個(gè)體中有效誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對(duì)免疫反應(yīng)劑識(shí)別的組分的免疫反應(yīng)。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法可用于防止、抑制或減少癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移。在特定實(shí)施方案中，相對(duì)于不聯(lián)合施用所述HSP制劑和所述免疫反應(yīng)劑的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，聯(lián)合施用HSP制劑和免疫反應(yīng)劑能抑制或降低至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％或至少10％癌性細(xì)胞的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移。
可根據(jù)本發(fā)明的方法治療的癌癥包括(但不限于)，白血病(例如，急性白血病如急性淋巴細(xì)胞性白血病和急性髓細(xì)胞性白血病)、新生物、腫瘤(例如，非何杰金氏淋巴瘤，纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏腫瘤、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠質(zhì)瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜細(xì)胞瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)、重鏈病(B-細(xì)胞淋巴瘤)、轉(zhuǎn)移癌或特征在于不受控制性細(xì)胞生長(zhǎng)的任何疾病或病癥。
腫瘤抗原或腫瘤相關(guān)抗原包括癌胚細(xì)胞(CG)抗原(MAGE、NY-ESO-1)、突變抗原(MUM-1、p53、CDK-4)、過表達(dá)自體抗原(p53、HER2/NEU)、病毒抗原(來自乳頭狀瘤病毒、Epstein-Barr病毒)、源自非主要開放讀碼框mRNA序列的腫瘤蛋白(NY-ESO1、LAGE1)、MelanA、MART-1、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、酪氨酸酶、gp100、gp75、HER-2/neu、c-erb-B2、CEA、PSA、MUC-1、CA-125、Stn、TAG-72、KSA(17-1A)、PSMA、p53(點(diǎn)突變的和/或過表達(dá)的)、RAS(點(diǎn)突變的)、EGF-R、VEGF、GD2、GM2、GD3、抗-Id、CD20、CD19、CD22、CD36、II類畸變、B1、CD25(IL-2R)(抗-TAC)或HPV。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的方法或組合物用于治療或預(yù)防個(gè)體中癌癥或癌轉(zhuǎn)移，包括施用HSP制劑和免疫反應(yīng)劑，其中免疫反應(yīng)劑是抗-CTLA-4抗體或抗-41BB抗體。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的方法或組合物用于治療或預(yù)防個(gè)體中癌癥或癌轉(zhuǎn)移，包括施用HSP制劑和免疫反應(yīng)劑，其中免疫反應(yīng)劑是抗-抗體單克隆抗體。而在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，將本發(fā)明的方法或組合物用于治療或預(yù)防個(gè)體中癌癥或癌轉(zhuǎn)移，包括施用HSP制劑和免疫反應(yīng)劑，其中免疫反應(yīng)劑是Herceptin。
4.4感染性疾病的治療本發(fā)明還包括治療或預(yù)防個(gè)體中感染性疾病的方法，包括以任何次序的對(duì)個(gè)體施用免疫反應(yīng)劑；和對(duì)個(gè)體施用熱激蛋白制劑的步驟，該熱激蛋白制劑的量能聯(lián)合免疫反應(yīng)劑在個(gè)體中有效誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對(duì)組分的免疫反應(yīng)。
可通過采用免疫反應(yīng)劑結(jié)合本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的感染性疾病由包括(但不限于)病毒、細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物和寄生蟲的感染性病原體導(dǎo)致。某些通用的針對(duì)感染性疾病的免疫反應(yīng)劑及其適宜劑量和用途是本領(lǐng)域已知的并已在現(xiàn)有技術(shù)中公開，例如醫(yī)師參考手冊(cè)(56th ed.，2002)。
可根據(jù)本發(fā)明治療的感染性病原體包括但不限于病毒，細(xì)菌，真菌，和原生動(dòng)物病的因子。
可通過采用免疫反應(yīng)劑結(jié)合本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的病毒病包括(但不限于)、由甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流行性感冒病毒、水痘病毒、腺病毒、I型單純皰疹病毒(HSV-I)、II型單純皰疹病毒(HSV-II)、牛疫病毒、鼻病毒、?？刹《尽⑤啝畈《?、呼吸道合胞病毒、乳頭狀瘤病毒、乳多泡病毒、巨細(xì)胞病毒、棘狀病毒、蟲媒病毒、漢坦病毒、柯薩奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、天花病毒、EB病毒、I型人免疫缺陷病毒(HIV-I)、II型人免疫缺陷病毒(HIV-II)以及病毒病因子如腦膜炎病毒、腦炎病毒、登革熱病毒或天花病毒所導(dǎo)致的病毒病。
可通過采用免疫反應(yīng)劑結(jié)合本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的細(xì)菌性疾病由包括(但不限于)分枝桿菌、立克次氏體，支原體，奈瑟菌屬，肺炎葡萄球菌，博氏疏螺旋體(萊姆病)，炭疽桿菌(炭疽)，破傷風(fēng)，鏈鎖狀球菌，葡萄球菌，分枝桿菌，破傷風(fēng)，百日咳病毒，霍亂，瘟疫，白喉病毒，衣原體，金黃色釀膿葡萄球菌和軍團(tuán)桿菌屬的細(xì)菌所導(dǎo)致。
可通過采用免疫反應(yīng)劑結(jié)合本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的原生動(dòng)物病和/或寄生蟲病由包括(但不限于)利什曼原蟲，kokzidioa，hypanosoma，瘧疾，衣原體，發(fā)疹傷寒等的病原體，南美洲錐蟲病，絲蟲，弓形蟲病，血吸蟲病和絳蟲的原生動(dòng)物和/或寄生蟲所導(dǎo)致。
4.5神經(jīng)變性疾病的治療還可以使用特異性結(jié)合細(xì)胞或結(jié)構(gòu)例如包括肽和/或蛋白原纖維的細(xì)胞外沉積物或斑塊(其是神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病的標(biāo)志)中或上的抗原性分子的免疫反應(yīng)劑，。優(yōu)選地，需要治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病時(shí)，可使用特異性結(jié)合包含神經(jīng)變性疾病相關(guān)抗原分子的表位或淀粉樣蛋白病相關(guān)抗原分子的表位的分子的免疫反應(yīng)劑，所述分子包括但不限于原纖維肽或蛋白。所述神經(jīng)變性疾病相關(guān)抗原分子可以是與下列疾病相關(guān)的分子阿耳茨海默氏病、年齡相關(guān)性認(rèn)知能力喪失、老年癡呆、帕金森氏病、肌萎縮側(cè)索硬化、威爾遜氏病、大腦性癱瘓、進(jìn)行性核上性麻痹、關(guān)島病、露易小體癡呆(Lewy body dementia)、朊病毒病、海綿狀腦病、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病、多聚谷氨酰胺病、亨延頓氏舞蹈病、強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良、弗里德利希共濟(jì)失調(diào)(Freidrich′s ataxia)、共濟(jì)失調(diào)、吉累斯·德拉圖雷特氏綜合征、癲癇發(fā)作病癥、癲癇、慢性癲癇發(fā)作病癥、中風(fēng)、腦外傷、脊髓創(chuàng)傷、AIDS癡呆、酒精中毒、孤獨(dú)癥、視網(wǎng)膜缺血、青光眼、自主功能病癥、高血壓、神經(jīng)精神病癥、神經(jīng)分裂癥或情感分裂性精神障礙。
2001年7月26日公開的WO01/52890中描述了所述抗原分子的實(shí)例，所述文件全文引入此處作為參考，該實(shí)例包括(但不限于)β-淀粉樣蛋白或其片段、寡聚Aβ復(fù)合物或其片段、ApoE4-Aβ復(fù)合物、tau蛋白或其片段、淀粉樣前蛋白或其片段、突變體淀粉樣前蛋白或其片段、早老素或其片段、早老素突變體或其片段、突觸蛋白(synuclein)或其片段或朊病毒蛋白或其片段，以及上述任何蛋白或其片段的抗原性衍生物。淀粉樣蛋白病相關(guān)抗原分子是與特征在于形成淀粉樣沉著物或斑塊的蛋白和/或肽原纖維細(xì)胞外沉積的疾病相關(guān)的分子，所述疾病包括但不限于II型糖尿病以及與慢性炎性或感染性疾病狀態(tài)和惡性腫瘤，例如骨髓瘤相關(guān)的淀粉樣變性病。例如但不限于阿耳茨海默氏病和朊病毒病，如克-雅二氏病的特定淀粉樣蛋白病，還可以是神經(jīng)變性疾病。
4.6HSP制劑本領(lǐng)域已知的任何HSP或HSP制劑均可以用于本發(fā)明的組合物和方法。為了本發(fā)明的目的，HSP制劑可包括(但不限于)不與任何分子結(jié)合的游離HSP，HSP和其它分子例如肽的分子復(fù)合物，以及HSP融合蛋白。HSP-肽復(fù)合物包括共接或非共價(jià)結(jié)合于肽的HSP。HSP-肽復(fù)合物可包括與來源于興趣病原體或細(xì)胞類型和/或蛋白(例如，抗體所識(shí)別的相同靶點(diǎn))的肽結(jié)合的HSP?？蛇x地，HSP-肽復(fù)合物可包括與內(nèi)源性肽但不一定是與治療性抗體的靶點(diǎn)相同來源的肽結(jié)合的HSP。本發(fā)明的方法無須在施用于個(gè)體前與任何特異性抗原或抗原肽共價(jià)或非共價(jià)的結(jié)合體。HSP制劑可以從或也可以不從要施用制劑的個(gè)體中獲得。HSP、HSP-肽復(fù)合物或HSP融合蛋白優(yōu)選是純化的。HSP制劑可包括包含HSP的粗制細(xì)胞裂解產(chǎn)物，裂解產(chǎn)物的量對(duì)應(yīng)于100～108細(xì)胞等效物。當(dāng)肽與HSP結(jié)合時(shí)，肽可以是任何肽，其可以與HSP非共價(jià)、共價(jià)結(jié)合或融合。HSP可合宜地作為與HSP非共價(jià)結(jié)合的復(fù)合物群而從大多數(shù)細(xì)胞性來源中純化。HSP可通過暴露于低pH和/或三磷酸腺苷或其它本領(lǐng)域已知方法而與非共價(jià)結(jié)合的肽分離。一般來說，HSP制劑與免疫反應(yīng)劑分開施用。肽可以是與免疫反應(yīng)劑或所針對(duì)的感染性疾病或病癥不相關(guān)的肽。為了受者的便利和舒適，HSP制劑可在施用前立即與免疫反應(yīng)劑混合。
在多個(gè)實(shí)施方案中，HSP的來源優(yōu)選是真核生物，更優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，而最優(yōu)選是人類。因此，本發(fā)明的方法所使用的HSP制劑包括真核生物的HSP，哺乳動(dòng)物的HSP和人類的HSP。HSP制劑來源的真核來源和接受HSP制劑的個(gè)體優(yōu)選是相同物種。
在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，HSP制劑可包括HSP，所述HSP包含但不限于hsp60、hsp70、hsp90、hsp110、gp96、grp170或鈣網(wǎng)織蛋白(單獨(dú)或彼此聯(lián)合)。優(yōu)選地，HSP是hsp60、hsp70、hsp90、hsp110、gp96、grp170或鈣網(wǎng)織蛋白。本發(fā)明還包括HSP-肽復(fù)合物，如hsp60-肽復(fù)合物、hsp70-肽復(fù)合物、hsp90-肽復(fù)合物、hsp110-肽復(fù)合物、gp96-肽復(fù)合物、grp170-肽復(fù)合物或鈣網(wǎng)織蛋白-肽復(fù)合物。本發(fā)明還包括HSP融合蛋白，如hsp60融合蛋白、hsp70融合蛋白、hsp90融合蛋白、hsp110融合蛋白、gp96融合蛋白、grp170融合蛋白或鈣網(wǎng)織蛋白融合蛋白。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，HSP制劑包括單個(gè)HSP、HSP復(fù)合物或HSP融合蛋白。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，HSP制劑包括HSP、HSP復(fù)合物或HSP融合蛋白的混合物。優(yōu)選地，HSP、HSP復(fù)合物和/或HSP融合蛋白的混合物包括兩種或多種基本上純的HSP、HSP復(fù)合物和/或HSP融合蛋白。如此處所使用的，“基本上純的”是指基本上不含正常情況下與天然狀態(tài)下的HSP或HSP復(fù)合物向伴隨的化合物并表現(xiàn)出恒定和可再現(xiàn)性色譜反應(yīng)，洗脫模式和生物學(xué)活性?；旧霞兊腍SP復(fù)合物并不除去與HSP共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的肽或與HSP內(nèi)源性結(jié)合的肽。術(shù)語(yǔ)“基本上純的”不意在排出HSP、HSP復(fù)合物或HSP融合蛋白與其它化合物的人工或合成混合物。下面提供了HSP，HSP復(fù)合物和HSP融合蛋白及其制備方法的大量非限制性實(shí)例。
在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)HSP制劑不與免疫反應(yīng)劑聯(lián)合施用以便誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)時(shí)，單獨(dú)施用HSP制劑不能誘導(dǎo)由免疫反應(yīng)劑所誘導(dǎo)的抗原特異性免疫反應(yīng)。在另一實(shí)施方案中，HSP制劑能誘導(dǎo)由免疫反應(yīng)劑所誘導(dǎo)的抗原特異性免疫反應(yīng)。
預(yù)計(jì)屬于hsp60，hsp70和hsp90家族的所有HSP(包括所述HSP的片段)均可用于實(shí)施本發(fā)明。
在本發(fā)明中，可使用純化的未結(jié)合HSP、共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合于特異性肽或非特異性肽的HSP(此處統(tǒng)稱為HSP-肽復(fù)合物)、HSP融合蛋白，及其制劑。下面描述了結(jié)合或非結(jié)合形式的HSP的純化。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過重組表達(dá)或肽合成(下面也有詳述)合成HSPs和HSP融合蛋白。
在另一實(shí)施方案中，預(yù)期HSP可以是與應(yīng)激蛋白的三個(gè)主要家族成員具有至少35％～55％，優(yōu)選55％～75％，最優(yōu)選75％～85％氨基酸同一性的其它蛋白，突變蛋白，其類似物和其變異體，所述應(yīng)激蛋白響應(yīng)應(yīng)激性刺激而增強(qiáng)其在細(xì)胞中的表達(dá)水平。屬于HSP類的應(yīng)激蛋白的制備，分離和純化是本領(lǐng)域已知的并公開于現(xiàn)有技術(shù)中，例如鈣網(wǎng)織蛋白制備或純化公開于Basu和Srivastava，1999 J.Expt.Med.189797-802，該文獻(xiàn)全文引入此處作為參考。本發(fā)明還包括制備和純化HSPs和HSP-肽復(fù)合物的方法，該方法描述如下，其以實(shí)例性而非限制性的方式給出。
4.6.1Hsp70或Hsp70-肽復(fù)合物的制備和純化hsp70-肽復(fù)合物的純化已在先公開于，參見例如，Udono等，1993，J Exp.Med.1781391-1396?？墒褂孟率龇椒?以示例性而非限制性的方式給出)首先，將人類或哺乳動(dòng)物的細(xì)胞懸浮于3體積的包含5mM磷酸鈉緩沖液(pH7)，150mM NaCl，2mM CaCl2，2mM MgCl2和1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的1×裂解緩沖液。然后，在冰上對(duì)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行聲處理，直至在顯微鏡下測(cè)定＞99％的細(xì)胞裂解。作為聲處理的替代方法，可通過機(jī)械剪切裂解細(xì)胞且在該方法中通常將細(xì)胞重懸于30mM碳酸氫鈉(pH 7.5)，1mM PMSF中，置冰上孵育20分鐘然后在Dounce勻漿器中勻漿直至＞95％的細(xì)胞裂解。
然后以1,000g離心裂解產(chǎn)物10分鐘以便除去完整的細(xì)胞，細(xì)胞核和其他的細(xì)胞碎片。所得上清液以100,000g離心90分鐘，收集上清液然后與已用包含2mM Ca2+和2mM Mg2+的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)平衡的Con A瓊脂糖混合。當(dāng)細(xì)胞被機(jī)械剪切裂解時(shí)，可在與Con A瓊脂糖混合之前，用等體積2×裂解緩沖液稀釋上清液。然后將上清液在4℃與Con A瓊脂糖結(jié)合2-3小時(shí)。收集未結(jié)合的物質(zhì)用10mM Tris-乙酸鹽(pH 7.5)，0.1mM EDTA，10mM NaCl，1mM PMSF透析36小時(shí)(三次，每次100體積)。然后將透析液以17,000 rpm(Sorvall SS34轉(zhuǎn)子)離心20分鐘。然后收集所得上清液并將其上于用20mM Tris-乙酸鹽(pH 7.5)，20mM NaCl，0.1mM EDTA和15mM 2-巰基乙醇平衡的Mono Q FPLCTM離子交換色譜柱(Pharmacia)。然后對(duì)柱子用20mM～500mM NaCl梯度進(jìn)行展開，然后通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離洗脫級(jí)分并使用適宜的抗-hsp70抗體(如來自克隆N27F3-4，獲自StressGen)通過免疫印跡進(jìn)行表征。
合并具有與抗-hsp70抗體強(qiáng)烈反應(yīng)性的級(jí)分，用硫酸銨沉淀hsp70-肽復(fù)合物；具體來說用50％～70％硫酸銨沉淀。然后17,000rpm(SS34 Sorvall 轉(zhuǎn)子)離心分離收集所得沉淀物并用70％硫酸銨洗滌。然后溶解洗滌的沉淀物，任何殘留的硫酸銨可通過經(jīng)SephadexRG25柱(Pharmacia)凝膠過濾而被清除。如有需要可將hsp70制品如上述經(jīng)Mono Q FPLCTM離子交換色譜柱(Pharmacia)再純化。
采用這種方法能將hsp70-肽復(fù)合物純化為明顯的均質(zhì)性。從1g細(xì)胞/組織中通?？杉兓?mg hsp70-肽復(fù)合物。
純化hsp70-肽復(fù)合物的修飾方法包括細(xì)胞蛋白與附著于固體基質(zhì)的ADP或ATP的不可水解的類似物接觸，從而裂解產(chǎn)物中的hsp70能與ADP或ATP的不可水解的類似物結(jié)合，然后洗脫結(jié)合的hsp70。優(yōu)選的方法使用具有附著于固體基質(zhì)的ADP(例如，ADP-瓊脂糖)的柱色譜法。所得hsp70制劑的純度較高且不存在不是與HSP-肽復(fù)合物中HSP相關(guān)的內(nèi)源性結(jié)合肽的污染蛋白。hsp70復(fù)合物產(chǎn)量還可顯著增加約高于10倍。可選地，采用ATP的不可水解的類似物(代替ADP)的色譜法可用于純化hsp70-肽復(fù)合物。以示例性而并非限制性的方式，可按下述內(nèi)容實(shí)施通過ADP-瓊脂糖色譜法純化hsp70-肽復(fù)合物在低滲緩沖液中均質(zhì)化處理Meth A肉瘤細(xì)胞(5億細(xì)胞)然后以4℃，100,000g離心裂解產(chǎn)物90分鐘。將上清液上ADP-瓊脂糖柱。在緩沖液中洗柱然后用5柱體積的3mMADP洗脫。hsp70-肽復(fù)合物在總共15級(jí)分中級(jí)分2～10中洗脫。通過SDS-PAGE分析洗脫的級(jí)分。采用這種方法可將hsp70-肽復(fù)合物純化為明顯均質(zhì)性。
從hsp70-肽復(fù)合物分離HSP可于存在ATP或低pH下實(shí)施。這兩種方法可用于從hsp70-肽復(fù)合物中洗脫肽。第一種方法包括在存在ATP下孵育hsp70-肽復(fù)合物制品。另一方法包括在低pH緩沖液中孵育hsp90-肽復(fù)合物制品。這些方法和本領(lǐng)域已知的任何其它方法均可用于從hsp-肽復(fù)合物分離HSP和肽。
4.6.2Hsp90或Hsp90-肽復(fù)合物的制備和純化可使用下述方法(以示例性而非限制性的方式給出)首先，將人類或哺乳動(dòng)物的細(xì)胞懸浮于3體積的包含5mM磷酸鈉緩沖液(pH 7)，150mM NaCl，2mM CaCl2，2mM MgCl2和1mM苯甲基磺酰氟化物(PMSF)的1×裂解緩沖液。然后，在冰上對(duì)細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行聲處理，直至在顯微鏡下測(cè)定＞99％的細(xì)胞裂解。作為聲處理的替代方法，可通過機(jī)械剪切裂解細(xì)胞且在該方法中通常將細(xì)胞重懸于30mM碳酸氫鈉(pH 7.5)，1mM PMSF中，置冰上孵育20分鐘然后在Dounce勻漿器中勻漿直至＞95％的細(xì)胞裂解。
然后以1,000g離心裂解產(chǎn)物10分鐘以便除去完整的細(xì)胞，細(xì)胞核和其他的細(xì)胞碎片。所得上清液以100,000g離心90分鐘，收集上清液然后與已用包含2mM Ca2+和2mM Mg2+的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)平衡的Con A瓊脂糖混合。當(dāng)細(xì)胞被機(jī)械剪切裂解時(shí)，可在與Con A瓊脂糖混合之前，用等體積2×裂解緩沖液稀釋上清液。然后將上清液在4℃與Con A瓊脂糖結(jié)合2-3小時(shí)。收集未結(jié)合的物質(zhì)用10mM Tris-乙酸鹽(pH 7.5)，0.1mM EDTA，10mM NaCl，1mM PMSF透析36小時(shí)(三次，每次100體積)。然后收集所得上清液并將其上于用裂解緩沖液平衡的Mono Q FPLCTM離子交換色譜柱(Pharmacia)。然后用200mM～600mM NaCl梯度洗脫蛋白。
洗脫的級(jí)分由SDS-PAGE分離，并使用如3G(AffinityBioreagents)的抗-hsp90抗體通過免疫印跡鑒定包含hsp90-肽復(fù)合物的級(jí)分。采用這種方法能將hsp90-肽復(fù)合物純化為明顯的均質(zhì)性。從1g細(xì)胞/組織中通?？杉兓?50～200μg hsp90-肽復(fù)合物。
從hsp90-肽復(fù)合物分離HSP可于存在ATP或低pH下實(shí)施。這兩種方法可用于從hsp90-肽復(fù)合物中洗脫肽。第一種方法包括在存在ATP下孵育hsp90-肽復(fù)合物制品。另一方法包括在低pH緩沖液中孵育hsp90-肽復(fù)合物制品。這些方法和本領(lǐng)域已知的任何其它方法均可用于從hsp-肽復(fù)合物分離HSP和肽。
4.6.3Gp96或Gp96-肽復(fù)合物的制備或純化可使用下述方法(以示例性而非限制性的方式給出)首先，將人類細(xì)胞或哺乳動(dòng)物的細(xì)胞團(tuán)重懸于3體積的包含5mM磷酸鈉緩沖液(pH 7)和1mM PMSF的緩沖液，然后，在冰上將細(xì)胞膨脹20分鐘，然后在Dounce勻漿器(勻漿器的適宜隙寬可根據(jù)各細(xì)胞類型而變化)中勻漿直至＞95％的細(xì)胞裂解。
然后以1,000g離心裂解產(chǎn)物10分鐘以便除去完整的細(xì)胞，細(xì)胞核和其他的細(xì)胞碎片。然后將獲自該離心步驟的上清液以100,000g離心90分鐘。純化的或者從100,000細(xì)胞團(tuán)或者從上清液中純化gp96-肽復(fù)合物。
當(dāng)從上清液中純化時(shí)，用等體積2×裂解緩沖液稀釋上清液，然后將上清液在4℃與用包含2mMCa2+和2mMMg2+的PBS平衡的Con A瓊脂糖混合2-3小時(shí)。然后，用該漿液上柱并以1×裂解緩沖液洗滌直至OD280降至基線。然后，用1/3柱床體積溶于包含2mM Ca2+和2mMMg2+的PBS的10％α-甲基甘露糖苷(α-MM)洗柱，用石蠟?zāi)て庵?，?7℃孵育15分鐘。然后將柱冷卻至室溫，從柱底移去石蠟?zāi)ぁＳ?柱體積的α-MM緩沖液上柱然后通過SDS-PAGE分析洗脫物。通常，所得物質(zhì)的純度約為60-95％，但該純度依賴于使用的細(xì)胞類型和組織對(duì)裂解緩沖液比率。然后將樣品上于用包含5mM磷酸鈉(pH 7)的緩沖液平衡的Mono Q FPLCTM離子交換色譜柱(Pharmacia)。然后用0～1M NaCl梯度從柱上洗脫蛋白而以400mM～550mM NaCl洗脫gp96級(jí)分。
然而，可用兩個(gè)附加步驟修改該方法，所述附件步驟可單獨(dú)使用或聯(lián)合使用，以便始終生成明顯均質(zhì)的gp96-肽復(fù)合物。一個(gè)可選步驟包括在Con A純化步驟之前的硫酸銨沉淀而另一可選步驟包括在ConA純化步驟之后而在Mono Q FPLCTM步驟之前的DEAE-瓊脂糖純化。
在第一個(gè)任選步驟中，如下面示例性方式所述，通過加入硫酸銨使獲自100,000g離心步驟的上清液的終濃度為50％硫酸銨。在置于冰水槽中燒杯中柔和攪拌溶液同時(shí)緩慢加入硫酸銨。將溶液在4℃攪拌約1/2～12小時(shí)然后以6,000rpm(Sorvall SS34轉(zhuǎn)子)離心所得溶液。取獲自該步驟的上清液，通過加入硫酸銨溶液使其具有70％硫酸銨飽和度，然后以6,000rpm(Sorvall SS34轉(zhuǎn)子)離心。收集獲自該步驟的細(xì)胞團(tuán)然后將其懸浮于包含70％硫酸銨的PBS中以便洗滌細(xì)胞團(tuán)。以6,000rpm(Sorvall SS34轉(zhuǎn)子)離心該混合物然后將細(xì)胞團(tuán)溶于包含2mM Ca2+和Mg2+的PBS。通過15,000rpm(Sorvall SS34轉(zhuǎn)子)短暫離心移去不溶物質(zhì)。然后，將溶液與Con A瓊脂糖混合，方法如前。
在第二個(gè)任選步驟中，如下面示例性方式所述，合并洗脫自Con A柱的包含gp96的級(jí)分，通過透析或優(yōu)選通過緩沖液在Sephadex G25柱上交換5mM磷酸鈉緩沖液(pH 7)，300mM NaCl。在緩沖液交換后，將溶液與預(yù)先用5mM磷酸鈉緩沖液(pH 7)，300mM NaCl平衡的DEAE-瓊脂糖TM混合。輕柔混合蛋白溶液和珠子1小時(shí)然后注入柱中。然后，用5mM磷酸鈉緩沖液(pH 7)，300mMNaCl洗柱，直至280nm吸光度降至基線。然后，用5體積的5mM磷酸鈉緩沖液(pH 7)，700mM NaCl從柱上洗脫結(jié)合的蛋白。合并包含蛋白的級(jí)分然后用5mM磷酸鈉緩沖液(pH 7)稀釋以便將鹽濃度降至175mM。然后將所得物質(zhì)上于用5mM磷酸鈉緩沖液(pH7)平衡的Mono Q FPLCTM離子交換色譜柱(Pharmacia)，如上述洗脫出與Mono Q FPLCTM離子交換色譜柱(Pharmacia)結(jié)合的蛋白。
然而，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過常規(guī)試驗(yàn)評(píng)估將第二可選步驟并入純化方法中的益處。此外，還應(yīng)認(rèn)識(shí)到添加各可選步驟的益處應(yīng)依賴于起始物質(zhì)的來源。
當(dāng)從100,000g細(xì)胞團(tuán)分離gp96級(jí)分時(shí)，將該細(xì)胞團(tuán)懸浮于包含1％去氧膽酸鈉或1％辛基吡喃葡萄糖苷(而無Mg2+和Ca2+)的5體積PBS中然后于冰上孵育1小時(shí)。20,000g離心懸液30分鐘然后將所得上清液以若干PBS(仍無Mg2+和Ca2+)變化進(jìn)行稀釋以便除去洗滌劑。100,000g離心稀釋液90分鐘，收集上清液，將鈣和鎂分別加入上清液至終濃度為2mM。然后通過未修飾或修飾的方法純化樣品從而從100,000g上清液中分離gp96-肽復(fù)合物，如上。
采用這種方法能將gp96-肽復(fù)合物純化為明顯的均質(zhì)性。從1g細(xì)胞/組織中可分離10～20μg gp96。
從gp96-肽復(fù)合物分離HSP可于存在ATP或低pH下實(shí)施。這兩種方法可用于從gp96-肽復(fù)合物中洗脫肽。第一種方法包括在存在ATP下孵育gp96-肽復(fù)合物制品。另一方法包括在低pH緩沖液中孵育gp96-肽復(fù)合物制品。這些方法和本領(lǐng)域已知的任何其它方法均可用于從hsp-肽復(fù)合物分離HSP和肽。
4.6.4Hsp110-肽復(fù)合物的制備或純化可使用如下方法(以示例性而非限制性的方式給出)，其公開于Wang等，2001，J.Immunol.166(1)490-7采用Dounce勻漿法將細(xì)胞或組織(例如腫瘤細(xì)胞組織)團(tuán)塊(40-60ml)在5體積的低滲緩沖液(30mN碳酸氫鈉，pH7.2和蛋白酶抑制劑)中勻漿。以4,500×g然后100,000×g離心裂解產(chǎn)物2小時(shí)。若細(xì)胞或組織來源于肝，則首先將所得上清液上于藍(lán)色瓊脂糖柱(Pharmacia)以便除去白蛋白。否則，將所得上清液上于預(yù)先用結(jié)合緩沖液(20mM Tris-HCl，pH 7.5；100mM NaCl；1mMMgCl2；1mMCaCl2；1mM MnCl2和15mM 2-ME)平衡的Con A-瓊脂糖柱(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。用包含15％α-D-o-甲基甘露糖苷(Sigma，St.Louis，MO)的結(jié)合緩沖液洗提結(jié)合的蛋白。
Con A-瓊脂糖未結(jié)合物質(zhì)首先以20mM Tris-HCl，pH 7.5；100mMNaCl；和15mM 2-ME的溶液透析，然后上于DEAE-瓊脂糖柱并以100～500mM NaCl的鹽梯度進(jìn)行洗脫。收集包含hsp110的級(jí)分，透析然后上于用20mMTris-HCl，pH 7.5；200mM NaCl；和15mM 2-ME平衡的Mono Q(Pharmacia)10/10柱。以2 00～500mM NaCl梯度洗脫結(jié)合的蛋白。通過SDS-PAGE分析級(jí)分然后通過采用對(duì)hsp110的Ab實(shí)施免疫印跡，如Wang等，1999，J.Immunol.1623378中所述。合并的級(jí)分通過Centriplus(Amicon，Beverly，MA)濃縮然后上Superose12柱(Pharmacia)。通過40mM Tris-HCl，pH 8.0；150mM NaCl；和15mM 2-ME以0.2ml/min的流速洗脫蛋白質(zhì)。
4.6.5產(chǎn)生的Grp170-肽復(fù)合物的制備或純化可使用下述方法(以示例性而非限制性的方式給出)，其公開于Wang等，2001，J.Immunol.166(1)490-7采用Dounce勻漿法將細(xì)胞或組織(例如腫瘤細(xì)胞組織)團(tuán)塊(40-60ml)在5體積的低滲緩沖液(30mN碳酸氫鈉，pH7.2和蛋白酶抑制劑)中勻漿。以4,500×g然后100,000×g離心裂解產(chǎn)物2小時(shí)。若細(xì)胞或組織來源于肝，則首先將所得上清液上于藍(lán)色瓊脂糖柱(Pharmacia)以便除去白蛋白。否則，將所得上清液上于預(yù)先用結(jié)合緩沖液(20mM Tris-HCl，pH 7.5；100mM NaCl；1mM MgCl2；1mMCaCl2；1mMMnCl2和15mM 2-ME)平衡的Con A-瓊脂糖柱(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。用包含15％α-D-o-甲基甘露糖苷(Sigma，St.Louis，MO)的結(jié)合緩沖液洗提結(jié)合的蛋白。
Con A-瓊脂糖未結(jié)合物質(zhì)首先以20mM Tris-HCl，pH 7.5；100mMNaCl；和15mM 2-ME的溶液透析，然后上于Mono Q柱并以150～400mMNaCl的鹽梯度進(jìn)行洗脫。濃縮合并的級(jí)分然后上Superose 12柱(Pharmacia)。收集包含均質(zhì)grp170的級(jí)分。
4.6.6HSP的重組表達(dá)可采用本領(lǐng)域已知方法重組制備HSP?？蓪⒕幋aHSP的核酸序列插入表達(dá)載體中從而在宿主細(xì)胞中增殖和表達(dá)。
如此處所使用的，表達(dá)構(gòu)建體是指能使HSP在適宜宿主細(xì)胞中表達(dá)的一種或多種調(diào)節(jié)區(qū)操作性相關(guān)聯(lián)的編碼HSP的核苷酸序列?！安僮餍韵嚓P(guān)聯(lián)”是指這樣一種關(guān)聯(lián)，其中調(diào)節(jié)區(qū)和要表達(dá)HSP以能允許轉(zhuǎn)錄和最終表達(dá)的方式進(jìn)行連接和定位。
表達(dá)載體可提供HSP轉(zhuǎn)錄必需的調(diào)節(jié)區(qū)。若要表達(dá)的HSP基因序列缺少其同源起始，則還可以提供翻譯起始密碼子(ATG)。在適宜的宿主構(gòu)建系統(tǒng)中，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(如RNA聚合酶)可與表達(dá)構(gòu)建體上的調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)合以便完成在宿主生物體中修飾的HSP序列的轉(zhuǎn)錄。宿主細(xì)胞與宿主細(xì)胞之間在基因表達(dá)所需的調(diào)節(jié)區(qū)精確特性上可存在變化。一般來說，需要能夠結(jié)合RNA聚合酶并啟動(dòng)操作性相關(guān)聯(lián)的核酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。所述調(diào)節(jié)區(qū)可包括轉(zhuǎn)錄和翻譯起始所涉及的那些5′非-編碼序列，如TATA盒，帽化序列，CAAT序列等。編碼序列的3′非編碼區(qū)的可包含轉(zhuǎn)錄終止調(diào)節(jié)序列，如終止子和多腺苷酸化位點(diǎn)。
為了將具有調(diào)節(jié)功能的DNA序列(如啟動(dòng)子)與HSP基因序列連接或?qū)SP基因序列插至載體的克隆位點(diǎn)，可通過本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)將提供了適宜的限制位點(diǎn)的聯(lián)接子和接頭連接至cDNAs的末端(Wu等，1987，Methods in Enzymol.152343-349)。在修飾前可用實(shí)施限制性內(nèi)切酶實(shí)施酶切以便在連接前通過單鏈DNA末端中回退消化或填補(bǔ)而形成平端?？蛇x地，可通過采用包含所需限制性酶切位點(diǎn)的引物的PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增從而將所需限制性酶切位點(diǎn)引入DNA片段。
包括與操作性調(diào)節(jié)區(qū)操作性相關(guān)聯(lián)的HSP序列的表達(dá)構(gòu)建體可直接導(dǎo)入適宜宿主細(xì)胞從而無須進(jìn)一步克隆而表達(dá)和產(chǎn)生HSP-肽復(fù)合物。參見例如，美國(guó)專利號(hào)5,580,859。該表達(dá)構(gòu)建體還可包含易于將HSP序列摻入宿主細(xì)胞基因組(例如借助同源重組)的DNA序列。此時(shí)，不一定使用包括適于適宜宿主細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體以便在宿主細(xì)胞中增殖和表達(dá)。
可以使用多種表達(dá)載體，其包括(但不限于)質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、噬菌?；蛐揎椀牟《?。通常，所述表達(dá)載體包括用于載體在適宜的宿主細(xì)胞中增殖的功能性復(fù)制起點(diǎn)，一種或多種用于插入HSP基因序列的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，和一種或多種選擇標(biāo)記。該表達(dá)載體必須用于來自包括但不限于細(xì)菌、酵母、昆蟲、哺乳動(dòng)物和人的原核或真核生物體的適宜的宿主細(xì)胞。
對(duì)于適當(dāng)加工的HSP或HSP-肽復(fù)合物的長(zhǎng)期，高產(chǎn)率的生產(chǎn)來說，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)是優(yōu)選的。穩(wěn)定表達(dá)HSP或HSP-肽復(fù)合物的細(xì)胞系可通過使用包含可選標(biāo)記載體進(jìn)行工程化處理。以示例性而非限制性的方式，在導(dǎo)入表達(dá)構(gòu)建體后，工程化細(xì)胞可在滋養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1~2日，然后移至選擇性培養(yǎng)基。表達(dá)構(gòu)建體中的可選標(biāo)記指示對(duì)選擇的抗性并最佳能使細(xì)胞穩(wěn)定地將表達(dá)構(gòu)建體摻入其染色體并在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和在細(xì)胞系中播散。所述細(xì)胞可長(zhǎng)期培養(yǎng)同時(shí)HSP持續(xù)表達(dá)。
重組細(xì)胞可在溫度、培養(yǎng)時(shí)間、光密度和培養(yǎng)基組合的標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)。然而，重組細(xì)胞的生長(zhǎng)條件可與那些表達(dá)HSP和抗原性蛋白的不同。還可使用修飾的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基來增強(qiáng)HSP的生產(chǎn)。例如，可將包含HSP及其同源啟動(dòng)子的重組細(xì)胞暴露于熱或其它環(huán)境應(yīng)激或化學(xué)應(yīng)激下。可將本領(lǐng)域任何已知的技術(shù)用于建立生產(chǎn)HSP或HSP-肽復(fù)合物的最佳條件。
4.6.6.1HSP融合蛋白的重組表達(dá)可采用本領(lǐng)域已知方法重組生產(chǎn)包含熱激蛋白序列和抗原肽序列的融合蛋白。為生產(chǎn)所述重組融合蛋白，采用與編碼抗原肽的序列融合的編碼熱激蛋白的核酸序列以本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建表達(dá)載體，如上述4.6.6節(jié)中所描述的方法。然后表達(dá)并分離HSP-抗原肽融合體。所述融合蛋白可用于引發(fā)免疫反應(yīng)。Suzue等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9413146-51。通過特異性設(shè)計(jì)分子的抗原肽部分，所述融合蛋白可用于引發(fā)免疫反應(yīng)和用于針對(duì)靶疾病或病癥的免疫治療中。
4.6.7肽合成通過重組技術(shù)生產(chǎn)HSP的一個(gè)替代方法是肽合成。例如，完整HSP或與HSP的部分相應(yīng)的肽可通過使用肽合成器進(jìn)行合成。可以使用本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)肽合成或其它合成方法。
含有HSP或其部分的氨基酸序列的肽可通過固相肽合成法進(jìn)行合成，所述方法的所使用的步驟與Merrifield，1963，J.Am.Chem.Soc.852149所公開的步驟相似。在合成期間，具有受保護(hù)側(cè)鏈的N-α-保護(hù)的氨基酸逐次加至通過其C端連接的增長(zhǎng)的多肽鏈和不溶性多聚支持物即，聚苯乙烯柱。通過連接N-α-去保護(hù)的氨基酸的氨基至已經(jīng)通過將其與試劑如二環(huán)己基碳二亞胺反應(yīng)而被活化的N-α-保護(hù)的氨基酸的羧基從而合成肽。游離氨基與活化的羧基的連接導(dǎo)致肽鍵形成。最常用的N-α-保護(hù)性基團(tuán)包括對(duì)酸敏感的Boc和對(duì)堿敏感的Fmoc。適宜化學(xué)，樹脂，保護(hù)性基團(tuán)，受保護(hù)的氨基酸和試劑的詳細(xì)內(nèi)容是本領(lǐng)域眾所周知的故此處不作詳述(參見，Atherton，等，1989，SolidPhase Peptide SynthesisA Practical Approach，IRL Press，和Bodanszky，1993，Peptide Chemistry，A Practical Textbook，2nded.，Springer-Verlag)。
所得HSP的純化可通過如采用凝膠滲透的制備性HPLC，分配色譜法和/或離子交換色譜法的常規(guī)方法進(jìn)行實(shí)施。適宜基質(zhì)和緩沖液的選擇是本領(lǐng)域眾所周知的故此處不作詳述。
4.7活化的抗原呈遞細(xì)胞(APC)在上述多個(gè)實(shí)施方案中，可將活化的APC代替HSP制劑施用于個(gè)體而用于同一目的。本發(fā)明包括活化抗原呈遞細(xì)胞的方法，包括將APC與HSP制劑接觸。在用HSP制劑活化APC的處理之前，可通過本領(lǐng)域眾所周知的方法將細(xì)胞任選地進(jìn)行富集或純化，和/或體外擴(kuò)增。APC可獲自個(gè)體，雖然也可以使用非自體APC，但個(gè)體優(yōu)選是與再施用經(jīng)處理APC(即使用自體APC)的個(gè)體相同的個(gè)體。非自體APC可以是同源的(即，來自與施用活化的APC的個(gè)體同卵雙生的個(gè)體)；或同種的(即，與施用活化的APC的個(gè)體共有至少一個(gè)相同MHC等位基因的個(gè)體)。
可采用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，例如但不限于第6節(jié)中描述的用于檢測(cè)CD11b+細(xì)胞的方法監(jiān)測(cè)APC的活化。在特定實(shí)施方案中，活化的APC可在體內(nèi)用于產(chǎn)生或增強(qiáng)由在適宜的相同時(shí)間給予個(gè)體的免疫反應(yīng)所引發(fā)的免疫反應(yīng)劑?；罨腁PC可以替代性地在上述多種時(shí)間框架例如但不限于在施用免疫反應(yīng)劑之前或之后1～24小時(shí)的時(shí)間框架內(nèi)施用，或周期性施用數(shù)日或比使用緩慢-或持續(xù)-釋放型免疫反應(yīng)劑更晚施用。優(yōu)選地，將經(jīng)處理的APC用在施用免疫反應(yīng)劑的位點(diǎn)或施用免疫反應(yīng)劑的位點(diǎn)的附近?；罨腁PC的施用可通過本領(lǐng)域任何已知的技術(shù)實(shí)施。
4.8免疫反應(yīng)劑免疫反應(yīng)劑包括抗體、工程化以使其包含抗體的抗原結(jié)合部分的分子或蛋白、工程化以使其包含識(shí)別興趣靶抗原的抗原結(jié)合區(qū)域和介導(dǎo)抗體依賴性免疫反應(yīng)的恒定區(qū)的分子或蛋白、與興趣抗原特異性相互反應(yīng)的肽或域或任何與興趣抗原/抗原表位相互作用的抗原結(jié)合區(qū)域和介導(dǎo)抗體依賴性免疫反應(yīng)，如效應(yīng)細(xì)胞反應(yīng)或過程的抗體的恒定區(qū)的域。Ab恒定區(qū)內(nèi)可用于本發(fā)明的所述域或區(qū)域的實(shí)例包括下述文件中公開的內(nèi)容，Reddy等，2000，J.Immunol.164(4)1925-33；Coloma等，1997，Nat.Biotechnol.15(2)159-63；Carayannopoulos等，1994，Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A.91(18)8348-52；Morrison，1992，Annu.Recombinant Expression Vector Immunol.10239-65；Traunecker等，1992，Int.J.Cancer Suppl.751-2；Gillies等，1990，Hum.Antibodies Hybridomas 1(1)47-54；上述文件均全文引入此處作為參考。
優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫反應(yīng)劑包括1)抗原結(jié)合區(qū)和2)介導(dǎo)一種或多種抗體依賴性免疫過程的區(qū)。抗原結(jié)合區(qū)可包括或由抗體的抗原結(jié)合區(qū)組成?？乖Y(jié)合區(qū)可包括與興趣抗原特異性作用的任何肽或區(qū)域。例如，抗原結(jié)合區(qū)可以是配體或其它興趣抗原的特異性結(jié)合部分或可以是所述配體或結(jié)合部分的片段或可來自所述配體或結(jié)合部分。
介導(dǎo)一種或多種抗體依賴性免疫過程的區(qū)域可包括如下區(qū)域或由如下區(qū)域組成能夠結(jié)合Fc受體的區(qū)域，例如結(jié)合Fc受體的抗體部分或結(jié)合部分的區(qū)域，例如抗體的補(bǔ)體結(jié)合部位。該區(qū)域還可以是結(jié)合Fc受體或補(bǔ)體的抗體的抗原結(jié)合區(qū)域。
所述抗體依賴性過程包括(但不限于)抗體依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性、補(bǔ)體活化、調(diào)理作用和吞噬作用。介導(dǎo)特定抗體依賴性過程的效應(yīng)細(xì)胞包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和多形核細(xì)胞。不受特定機(jī)理的限制，應(yīng)當(dāng)理解HSP能夠提高效應(yīng)細(xì)胞上負(fù)責(zé)介導(dǎo)抗體依賴性反應(yīng)的受體。這些受體包括Fcα和Fcγ受體，其亞型或其任何組合。因此，在特定實(shí)施方案種，介導(dǎo)一種或多種抗體依賴性免疫過程的免疫反應(yīng)劑的區(qū)域包括如下區(qū)域或由如下區(qū)域組成區(qū)域是Fc受體，優(yōu)選Fcα實(shí)體和Fcγ受體或二者的配體。在另一實(shí)施方案中，介導(dǎo)一種或多種抗體依賴性免疫過程的免疫反應(yīng)劑的區(qū)域包括如下區(qū)域或由如下區(qū)域組成所述區(qū)域能刺激免疫效應(yīng)細(xì)胞，優(yōu)選是單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、多形核細(xì)胞或兩種或多種所述細(xì)胞的任何組合的功能，由此實(shí)現(xiàn)預(yù)防性和/或治療性效果。在特定實(shí)施方案中，當(dāng)HSP制劑誘導(dǎo)免疫反應(yīng)如細(xì)胞因子釋放和/或T細(xì)胞活化時(shí)，免疫反應(yīng)劑促成或共刺激所述免疫反應(yīng)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)劑是抗體或包括抗體或多個(gè)抗體的組合物如血清。在特定實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)劑是IgA、IgG或IgM抗體或包括其片段。在一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)劑是單克隆抗體或包括單克隆抗體的片段。免疫反應(yīng)劑還可包括或由治療乙型肝炎的人免疫球蛋白、治療RSV的Respigam、免疫球蛋白凍干粉、或免疫球蛋白IV(IGIV)組成。在另一實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)劑不針對(duì)任何單個(gè)表位，而是針對(duì)包括一種或多種與表位結(jié)合的分子的混合物。所述免疫反應(yīng)劑的實(shí)例是血清或從血清或血漿中濃縮的抗體。所述血清或血漿可來自以特定抗原免疫的個(gè)體或來自未以此方式免疫的個(gè)體。
用于本發(fā)明的方法的抗體包括(但不限于)，單克隆抗體，多克隆抗體，合成抗體，多特異性抗體，人抗體，人源化抗體，嵌合抗體，單鏈Fvs(scFv)，單鏈抗體，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)(ab′)片段，二硫鍵聯(lián)Fvs(sdFv)，和抗獨(dú)特型(抗-Id)抗體(包括，例如，針對(duì)本發(fā)明的抗體的抗-Id抗體)，以及上述任何一種的表位-結(jié)合片段。特別地，用于本發(fā)明的方法的抗體包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含免疫特異性結(jié)合興趣靶點(diǎn)的抗原結(jié)合部位的分子。本發(fā)明的免疫球蛋白分子可以是任何型(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)，類(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或免疫球蛋白分子的亞類。
在另一實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)劑是含有兩種具有不同特異性的抗原結(jié)合區(qū)(即一個(gè)識(shí)別靶細(xì)胞或蛋白上的表位，而另一個(gè)識(shí)別效應(yīng)細(xì)胞的表位，例如FcR的表位)的雙特異性分子。在另一實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)劑是含有兩種針對(duì)靶細(xì)胞/蛋白上不同表位的抗原結(jié)合區(qū)域，和介導(dǎo)抗體依賴性免疫反應(yīng)的域的雙特異性分子。靶向癌細(xì)胞或病原體的所述雙特異性分子及其療效已經(jīng)在體內(nèi)和體外均進(jìn)行了檢測(cè)(例如，Wallace等，2001，J.Immunol.Mehods 248(1-2)167-82；Sundarapandiyan等，2001，J.Immunol.Mehods 248(1-2)113-23；Honeychurch等，2000，Blood 96(10)3544-52；Negri等，1995，Br J Cancer 72(4)928-33；Wang等，1994，Zhonghua ZhongLiu Za Zhi 16(2)83-7，Chinese)(上述文件均全文引入此處作為參考)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)劑是純化的。如此處所使用的描述特定肽、抗體、分子、蛋白、抗原、HSP、HSP-肽復(fù)合物等的“純化的”是指分子、蛋白、抗原等從高于1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％的正常情況下肽、抗體、分子、蛋白、抗原、HSP、HSP-肽復(fù)合物等天然與置相伴隨的蛋白、多糖和/或脂質(zhì)中分離的狀態(tài)。如果分離的分子、蛋白、抗原、HSP、HSP-肽復(fù)合物等是合成的，其被低于50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％或0.1％的化學(xué)前體物或用于合成分子、蛋白、抗原、HSP、HSP-肽復(fù)合物等的合成試劑所污染。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，肽、抗體、分子、蛋白、抗原、HSPs、HSP-肽復(fù)合物等的純度為至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。如此處所使用的，術(shù)語(yǔ)“％純度”是指由興趣分子制成的總組合物重量百分比。故此，包含50克興趣分子的100克組合物相對(duì)于興趣分子而言是50％純度的。
單克隆抗體可使用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)(包括雜交瘤、重組和噬菌體展示技術(shù)，或其組合)進(jìn)行制備。例如，單克隆抗體可采用包括本領(lǐng)域已知和教導(dǎo)的內(nèi)容的雜交瘤技術(shù)進(jìn)行制備，例如，Harlow等，AntibodiesA Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2nd ed.1988)；Hammerling，等，innonoclonal and T-CellHybridomas，pp.563-681(Elsevier，N.Y.，1981)(上述文件均全文引入此處作為參考)。此處所使用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”并不限于經(jīng)雜交瘤技術(shù)制備的抗體。術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指來自單個(gè)克隆包括真核、原核或噬菌體克隆的抗體，而非制備其的方法。
4.8.1免疫反應(yīng)劑的制備本發(fā)明的免疫反應(yīng)劑可通過本領(lǐng)域已知用于抗體合成的任何方法，特別通過化學(xué)合成或優(yōu)選通過重組表達(dá)技術(shù)進(jìn)行準(zhǔn)備。下面參照抗體免疫反應(yīng)劑描述了所述方法，但也易用于制備其它免疫反應(yīng)劑。
采用雜交瘤技術(shù)制備和篩選特異性抗體的方法是常規(guī)且本領(lǐng)域眾所周知的。在非限制性實(shí)施例中，可用興趣抗原或表達(dá)所述抗原多細(xì)胞免疫鼠。一經(jīng)檢測(cè)到免疫反應(yīng)，例如在小鼠血清中檢測(cè)到特異性針對(duì)抗原的抗體，其取小鼠脾臟并分離脾細(xì)胞。然后采用適于任何適宜的骨髓瘤細(xì)胞的眾所周知的技術(shù)融合脾細(xì)胞。通過有限稀釋選擇并克隆雜交瘤。然后通過本領(lǐng)域已知方法檢測(cè)雜交瘤克隆分泌能夠結(jié)合抗原的抗體的細(xì)胞?？赏ㄟ^用陽(yáng)性雜交瘤克隆經(jīng)腹膜內(nèi)接種小鼠生成腹水(通常包含高水平抗體)。
可通過已知的技術(shù)生成識(shí)別特異性表位的抗體片段。例如，可過采用如木瓜蛋白酶(產(chǎn)生Fab片段)或胃蛋白酶(產(chǎn)生F(ab′)2片段)的酶的免疫球蛋白分子的溶蛋白性裂解來制備Fab和F(ab′)2片段，。F(ab′)2片段包含完整輕鏈，以及重鏈的可變區(qū)，CH1區(qū)和鉸鏈區(qū)。
例如，還可采用多種本領(lǐng)域已知的噬菌體展示方法產(chǎn)生抗體。在噬菌體展示法中，功能性抗體域在攜帶了表面其的多核苷酸序列的噬菌體顆粒的表面上展示。在特定實(shí)施方案中，所述噬菌體可用于展示從全套或組合抗體文庫(kù)(例如，人或鼠)中表達(dá)的抗原結(jié)合區(qū)域，如Fab和Fv或二硫鍵穩(wěn)定化的Fv。表達(dá)結(jié)合興趣抗原的抗原結(jié)合區(qū)域的噬菌體可用抗原進(jìn)行選擇或鑒定，例如，采用標(biāo)記的抗原或結(jié)合于固體表面或珠或被固體表面或珠俘獲的抗原。用于這些方法的噬菌體通常是絲狀噬菌體，包括fd和M13?？乖Y(jié)合區(qū)域作為與噬菌體基因III或基因VIII蛋白重組融合的蛋白表達(dá)?？捎糜跍?zhǔn)備本發(fā)明的免疫球蛋白或其片段的噬菌體展示法的實(shí)例包括如下文件公開的內(nèi)容，Brinkman等，1995，J.Immunol.Mehods 18241-50；Ames等，1995，J.Immunol. Mehods 184177-186；Kettleborough等，1994，Eur.J.Immunol.24952-958；Persic等，1997，Gene 1879-18；Burton等，1994，Advances in Immunology 57191-280；PCT公開號(hào)PCT/GB91/01134；PCT公開號(hào)WO 90/02809；WO 91/10737；WO 92/01047；WO 92/18619；WO 93/11236；WO 95/15982；WO 95/20401；美國(guó)專利號(hào)5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108；上述文件均全文引入此處作為參考。
如上述參考文件所述，在噬菌體選擇后，可分離來自噬菌體的抗體編碼區(qū)并用于生成完全抗體，包括人抗體或任何其它所需片段，在任何縮寫宿主中表達(dá)，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，植物細(xì)胞，酵母和細(xì)菌，例如下述內(nèi)容。例如，重組制備Fab，F(xiàn)ab′和F(ab′)2片段的技術(shù)可采用本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行實(shí)施，所述方法例如是下述文件公開的方法PCT公開號(hào)WO 92/22324；Mullinax等，1992，BioTechniques 12(6)864-869；和Sawai等，1995，AJRI 3426-34；和Better等，1988，Science 2401041-1043，上述文件均全文引入此處作為參考?？捎糜谥苽鋯捂淔vs和抗體的技術(shù)的實(shí)例是美國(guó)專利號(hào)4,946,778和5,258,498；Huston等，1991，Methods in Enzymology20346-88；Shu等，1993，PNAS 907995-7999；和Skerra等，1988，Science 2401038-1040中公開的方法。
對(duì)于某些用途(包括抗體在人體內(nèi)的用途)，優(yōu)選使用嵌合、人源化或人抗體。嵌合抗體其中不同的抗體部分來源于不同動(dòng)物物種的分子，例如抗體含有來源于鼠單克隆抗體的可變區(qū)和來源于人免疫球蛋白的恒定區(qū)。制備嵌合抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如，Morrison，1985，Science 2291202；Oi等，1986，BioTechniques4214；Gillies等，1989，J.Immunol.Mehods 125191-202；美國(guó)專利號(hào)5,807,715；4,816,567；和4,816,397，上述文件均全文引入此處作為參考。人源化抗體是來自非人源性的能結(jié)合所需抗原的抗體分子，其含有一種或多種來自非人物種的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)和來自人免疫球蛋白的框架區(qū)。通常，人框架區(qū)中的框架殘基將被來自CDR供體抗體的相應(yīng)殘基所替代從而改變，優(yōu)先改善抗原結(jié)合性。這些框架替代可通過本領(lǐng)域眾所周知的方法進(jìn)行鑒定，例如通過對(duì)CDR和框架殘基的相互作用建模從而鑒定對(duì)抗原結(jié)合重要的框架殘基以及與特定位置的罕見框架殘基進(jìn)行序列對(duì)比。參見例如，Queen等，美國(guó)專利號(hào)5,585,089；Reichmann等，1988，Nature 332323，所述文件全文引入此處作為參考?？贵w可采用本領(lǐng)域已知的多種方法進(jìn)行人源化，所述方法包括，例如CDR-移植(EP 239,400；PCT公開號(hào)WO91/09967；美國(guó)專利號(hào)5,225,539；5,530,101和5,585,089)，膠合或表面重建(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，1991，MolecularImmunology 28(4/5)489-498；Studnicka等，1994，ProteinEngineering 7(6)805-814；Roguska等，1994，Proc Natl.Acad.Sci.USA，91969-973)，和鏈替換(美國(guó)專利號(hào)5,565,332)，上述文件由此均全文引入作為參考。
治療性和/或預(yù)防性抗體的長(zhǎng)期使用會(huì)可受到引發(fā)宿主免疫反應(yīng)的抗體的免疫原性的限制，該免疫原性限制了抗體的功能表現(xiàn)和用途。已經(jīng)發(fā)展了修飾單克隆抗體的策略(包括TolerMabTM技術(shù)(TolerRx，Cambridge，MA))以便降低抗體免疫原性，由此延長(zhǎng)和/或重復(fù)施用抗體療法同時(shí)避免了宿主免疫系統(tǒng)的中和作用。因此，保持對(duì)靶抗原的能力的同時(shí)能引發(fā)對(duì)其自身耐受性的“耐受的”單克隆抗體以及其在體內(nèi)發(fā)揮功能是根據(jù)本發(fā)明治療性或預(yù)防性處理患者所需要的。Gilliland等，1999，J.Immunol.1623663-71。
完全人抗體特別適用于人類患者的治療性或預(yù)防性治療。人抗體可通過多種本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行制備，所述方法包括上述采用來自人免疫球蛋白序列的抗體文庫(kù)的噬菌體展示法。參見美國(guó)專利號(hào)4,444,887和4,716,111；和PCT公開號(hào)WO 98/46645；WO 98/50433；WO 98/24893；WO 98/16654；WO 96/34096；WO 96/33735；和WO91/10741，上述文件均全文引入此處作為參考。
還可采用不能表達(dá)功能性內(nèi)源免疫球蛋白的，但能表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠制備人抗體。關(guān)于該制備人抗體技術(shù)的綜述，可參見Lonberg和Huszar，1995，Int.Rev.Immunol.1365-93。而對(duì)于該制備人抗體和人單克隆抗體的技術(shù)以及制備所述抗體方法步驟的詳細(xì)描述，參見例如，PCT公開號(hào)WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；歐轉(zhuǎn)專利號(hào)0 598 877；美國(guó)專利號(hào).5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771和5,939,598，上述文件均全文引入此處作為參考。此外，可從例如Abgenix，Inc.(Freemont，CA)，MedarexX(NJ)和Genpharm(San Jose，CA)等公司定購(gòu)采用與上述相似的技術(shù)直接針對(duì)選擇抗原的人抗體。
可采用被稱為“引導(dǎo)選擇”的技術(shù)生成識(shí)別選擇表位的完全人抗體。在該方法中，將所選非人類單克隆抗體，例如小鼠抗體，用于引導(dǎo)選擇識(shí)別相同表位的完全人抗體(Jespers等，1988，Bio/technology12899-903)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗體具有體內(nèi)治療性和/或預(yù)防性用途。治療性和預(yù)防性抗體的實(shí)例包括(但不限于)MDX-010(Medarex，NJ)其是目前用于臨床治療前列腺癌的人源化抗-CTLA-4抗體；SYNAGIS(MedIrnmune，MD)，其是用于治療RSV感染患者的人源化抗-呼吸道合胞病毒(RSV)單克隆抗體；HERCEPT1N(Trastuzumab)(Genentech，CA)，其是用于治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的人源化抗-HER2單克隆抗體；REMICADE(infliximab)(Centocor，PA)，其是用于治療克隆氏病(Crone′s disease)患者的嵌合抗-TNFα單克隆抗體；REOPRO(阿昔單抗)(Centocor)，其是用于預(yù)防血塊形成的抗-血小板上糖蛋白IIb/IIIa受體；ZENAPAX(daclizumab)(RochePharmaceuticals；Switzerland)，其是用于預(yù)防急性腎臟同種異體移植物排斥的免疫抑制性，人源化抗-CD25單克隆抗體。其它實(shí)例為人源化抗-CD18F(ab′)2(Genentech)；CDP860，其是人源化抗-CD18F(ab′)2(Celltech，UK)；PR0542，其是與CD4融合的抗-HIVgp120抗體(Progenics/Genzyme Transgenics)；Ostavir，其是人抗乙型肝炎病毒抗體(Protein Design Lab/Novartis)；PROTOVIRTM，其是人源化抗-CMV IgG1抗體(Protein Design Lab/Novartis)；MAK-195(SEGARD)，其是鼠抗-TNF-αF(ab′)2(KnollPharma/BASF)；IC14，其是抗-CD14抗體(ICOS Pharm)；人源化抗-VEGF IgG1抗體(Genentech)；OVAREXTM，其是鼠抗-CA 125抗體(Altarex)；PANOREXTM，其是鼠抗-17-IA細(xì)胞表面抗原IgG2a抗體(Glaxo Wellcome/Centocor)；BEC2，其是鼠抗-獨(dú)特型(GD3表位)IgG抗體(ImClone System)；IMC-C225，其是嵌合抗-EGFR IgG抗體(ImClone System)；VITAXINTM，其是人源化抗-αVβ3整聯(lián)蛋白抗體(Applied Molecular Evolution/MedImmune)；Campath1H/LDP-03，其是人源化抗CD52IgG1抗體(Leukosite)；Smart M195，其是人源化抗-CD33 IgG抗體(Protein Design Lab/Kanebo)；RITUXANTM，其是嵌合抗-CD20 IgG1抗體(IDEC Pharm/Genentech，Roche/Zettyaku)；LYMPHOCIDETM，其是人源化抗-CD22 IgG抗體(Immunomedics)；Smart ID10，其是人源化抗-HLA抗體(ProteinDesign Lab′)；ONCOLYMTM(Lym-1)是放射標(biāo)記的鼠抗-HLA DIAGNOSTICREAGENT抗體(Techniclone)；ABX-IL8是人抗-IL8抗體(Abgenix)；抗-CD11a是人源化IgG1抗體(Genentech/Xoma)；ICM3是人源化抗-ICAM3抗體(ICOS Pharm)；IDEC-114是靈長(zhǎng)源抗-CD80抗體(IDEC Pharm/Mitsubishi)；ZEVALINTM是放射標(biāo)記的鼠抗-CD20抗體(IDEC/Schering AG)；IDEC-131是人源化抗-CD40L抗體(IDEC/Eisai)；IDEC-151是靈長(zhǎng)源抗-CD4抗體(IDEC)；IDEC-152是靈長(zhǎng)源抗-CD23抗體(IDEC/Seikagaku)；SMART抗-CD3是人源化抗-CD3 IgG(Protein DesignLab)；5G1.1是人源化抗-補(bǔ)體因子5(C5)抗體(Alexion Pharm)；D2E7是人源化抗-TNF-α抗體(CAT/BASF)；CDP870是人源化抗-TNF-α Fab片段(Celltech)；IDEC-151是靈長(zhǎng)源抗-CD4 IgG1抗體(IDEC Pharm/SmithKlineBeecham)；MDX-CD4是人抗-CD4 IgG抗體(Medarex/Eisai/Genmab)；CDP571是人源化抗-TNF-αIgG4抗體(Celltech)；LDP-02是人源化抗-α4β7抗體(LeukoSite/Genentech)；OrthoClone OKT4A是人源化抗-CD4 IgG抗體(OrthoBiotech)；ANTOVATM是人源化抗-CD40L IgG抗體(Biogen)；ANTEGRENTM是人源化抗-VLA-4 IgG抗體(Elan)；MDX-33是人抗-CD64(FcγR)抗體(Medarex/Centeon)；SCH55700是人源化抗-IL-5 IgG4抗體(Celltech/Schering)；SB-240563和SB-240683分別是人源化抗-IL-5和IL-4抗體(SmithKline Beecham)；rhuMab-E25是人源化抗-IgE IgG1抗體(Genentech/Norvartis/Tanox Biosystems)；ABX-CBL是鼠抗CD-147 IgM抗體(Abgenix)；BTI-322是鼠抗-CD2 IgG抗體(Medimmune/Bio Transplant)；Orthoclone/OKT3是鼠抗-CD3IgG2a抗體(ortho Biotech)；SIMULECTTM是嵌合抗-CD25 IgG1抗體(Novartis Pharm)；LDP-01是人源化抗-β2-整聯(lián)蛋白IgG抗體(LeukoSite)；抗-LFA-1是鼠抗CD 18 F(ab′)2(Pasteur-Merieux/Immunotech)；CAT-152是人抗-TGF-β2抗體(Cambridge AbTech)；而Corsevin M是嵌合抗-因子VII抗體(Centocor)。上面列出的免疫反應(yīng)劑，以及任何其它的免疫反應(yīng)劑，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何給藥法(包括免疫反應(yīng)劑供應(yīng)者推薦的給藥法)進(jìn)行施用。
編碼抗體或其它免疫反應(yīng)劑的核苷酸序列可獲自本領(lǐng)域技術(shù)人員可得到的任何信息(即，來自Genbank、現(xiàn)有技術(shù)或通過常規(guī)克隆)。如果不能得到包含編碼特定抗體或其表位-結(jié)合片段或其它免疫反應(yīng)劑的核酸的克隆，但抗體分子或其表位-結(jié)合片段或其它免疫反應(yīng)劑的序列是已知的，編碼免疫球蛋白或其它免疫反應(yīng)劑的核酸可化學(xué)合成或獲自適宜的來源(例如，抗體cDNA文庫(kù)、或cDNA文庫(kù)、或核酸，優(yōu)選聚A+RNA，分離自表達(dá)抗體的任何組織或細(xì)胞，如選擇的表達(dá)抗體的雜交瘤細(xì)胞)，通過采用能與序列的3′和5′端雜交的合成引物的PCR擴(kuò)增或通過采用特異性針對(duì)特定基因序列的寡核苷酸探針的克隆以便鑒定，例如，來自編碼抗體的cDNA文庫(kù)的cDNA克隆。然后可采用任何本領(lǐng)域眾所周知的方法將通過PCR生成的擴(kuò)增的核酸克隆至可復(fù)制的克隆載體。在免疫反應(yīng)劑天然不存在的情況下，編碼免疫反應(yīng)劑不同區(qū)域的核酸可獲自預(yù)存文庫(kù)或已知基因或可被合成。
抗體或其它免疫反應(yīng)劑的核苷酸序列一經(jīng)確定，該抗體或其它免疫反應(yīng)劑的核苷酸序列即可采用本領(lǐng)域眾所周知的操作核苷酸序列的方法進(jìn)行操作，所述方法例如，重組DNA技術(shù)，定向誘變，PCR等(參見例如下述文件中描述的技術(shù)Sambrook等，1990，MolecularCloning，A Laboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，NY；和Ausubel等，eds.，1998，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY，上述文件全文引入此處作為參考)，通過例如在與免疫效應(yīng)細(xì)胞相互作用相關(guān)的抗體或其它免疫反應(yīng)劑的表位-結(jié)合區(qū)域或抗體或其它免疫反應(yīng)劑的恒定(Fc)區(qū)中引入氨基酸置換、刪除和/或插入而生成具有不同氨基酸序列的抗體或其它免疫反應(yīng)劑。
抗體或其它免疫反應(yīng)劑的重組表達(dá)需要構(gòu)建包含編碼抗體或其它免疫反應(yīng)劑的核苷酸序列的表達(dá)載體。編碼抗體分子或抗體的重鏈或輕鏈或其部分(優(yōu)選地，但并非必須地，包含重鏈或輕鏈可變區(qū))或其它免疫反應(yīng)劑的核苷酸序列一經(jīng)獲得，即可通過重組DNA技術(shù)采用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)制備用于生產(chǎn)抗體分子或其它免疫反應(yīng)劑的載體。因此，此處描述了通過表達(dá)包含抗體或其它免疫反應(yīng)劑編碼核苷酸序列的多核苷酸從而制備蛋白的方法?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法來構(gòu)建包含抗體或其它免疫反應(yīng)劑編碼序列以及適宜的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括，例如，體外重組DNA技術(shù)，合成技術(shù)和體內(nèi)遺傳重組?？蓪⒕幋a重鏈可變或恒定區(qū)、輕鏈可變或恒定區(qū)、重鏈和輕鏈可變區(qū)、重-和/或輕-鏈可變區(qū)的表位結(jié)合片段或抗體或其它免疫反應(yīng)劑的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的核苷酸序列克隆至用于表達(dá)的所述載體中。通過常規(guī)技術(shù)將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞然后通過常規(guī)技術(shù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
多種宿主-表達(dá)載體系統(tǒng)可用于表達(dá)本發(fā)明的抗體分子或其它免疫反應(yīng)劑。所述宿主-表達(dá)系統(tǒng)表示通過其可制備興趣編碼序列并隨后可被純化的載體，但也可表示細(xì)胞，該細(xì)胞在被適宜的核苷酸編碼序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染時(shí)，可原位表達(dá)本發(fā)明的抗體分子或其它免疫反應(yīng)劑。這些系統(tǒng)包括(但不限于)，被包含抗體或其它免疫反應(yīng)劑編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物例如細(xì)菌(例如，大腸桿菌和枯草桿菌)；被包含抗體或其它免疫反應(yīng)劑編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母(例如，釀酒酵母和畢赤酵母)；被包含抗體或其它免疫反應(yīng)劑編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)；被重組病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV；和煙草花葉病毒，TMV)感染或被包含抗體或其它免疫反應(yīng)劑編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(例如，Ti質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的的植物細(xì)胞系統(tǒng)；和荷有包含來自哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(例如，金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或來自哺乳動(dòng)物的病毒的啟動(dòng)子(例如，腺病毒晚期啟動(dòng)子；痘苗病毒7.5K啟動(dòng)子)的重組表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)(例如，COS，CHO，BHK，293，3T3和NSO細(xì)胞)。優(yōu)選地，特別適用于表達(dá)完整重組抗體分子或其它免疫反應(yīng)劑的例如大腸桿菌的細(xì)菌細(xì)胞，而更優(yōu)選真核細(xì)胞用于表達(dá)重組抗體或其它免疫反應(yīng)劑分子。例如，哺乳動(dòng)物的細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)，結(jié)合載體如來自人巨細(xì)胞病毒的主要過渡早期基因啟動(dòng)子元件是抗體的有效表達(dá)系統(tǒng)(Foecking等，1986，Gene 45101和Cockett等，1990，Bio/Techhology 82)。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，根據(jù)預(yù)期用于要表達(dá)抗體分子或其它免疫反應(yīng)劑的用途可益于選擇許多表達(dá)載體。例如，當(dāng)要制備大量所述蛋白時(shí)，對(duì)于生產(chǎn)抗體分子的藥物組合物，需要能引導(dǎo)易于純化的高水平融合蛋白產(chǎn)物表達(dá)的載體。所述載體包括(但不限于)，大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Ruther等，1983，EMBO 121791)，其中抗體或其它免疫反應(yīng)劑的編碼序列可各自被連接至載體中與lacZ編碼區(qū)的框架內(nèi)以便生成融合蛋白；和pIN載體(Inouye&Inouye，1985，NucleicsAcides Res.133101-3109，和Van Heeke&Schuster，1989，J.Biol.Chem.245503-5509)。
在昆蟲系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)用作表達(dá)異源基因的載體。該病毒生長(zhǎng)在草地夜蛾細(xì)胞中?？贵w或其它免疫反應(yīng)劑的編碼序列可各自被克隆至病毒的非必需區(qū)(例如多角體蛋白基因)并被置于AcNPV啟動(dòng)子(例如多角體蛋白啟動(dòng)子)的控制下。
在哺乳動(dòng)物的宿主細(xì)胞中，可使用大量基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)本發(fā)明的抗體分子或其它免疫反應(yīng)劑。
在腺病毒用作表達(dá)載體的情況下，將興趣抗體或其它免疫反應(yīng)劑編碼序列連接至腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合物，例如，晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)前導(dǎo)序列。然后通過體外或體內(nèi)重組將該嵌合基因插入腺病毒基因組。在表達(dá)基因組非必需區(qū)(例如，E1或E3區(qū))中的插入將導(dǎo)致重組病毒具有活性并能在感染的宿主中表達(dá)抗體分子或其它免疫反應(yīng)劑(例如，參見Logan&Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81355-359)。為有效翻譯插入的抗體或其它免疫反應(yīng)劑編碼序列還需要特異性起始信號(hào)。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子和毗鄰序列。此外，起始密碼子必須與與所需編碼序列的讀碼框同相以確保整個(gè)插入片段的翻譯。這些外源翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可以是多種來源的，可以是天然的也可以是合成的。通過包含適宜轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件，轉(zhuǎn)錄終止子等可提高轉(zhuǎn)錄效率(參見例如，Bitter等，1987，Methodsin Enzymol.153516-544)。
此外，可選擇需要以特定方式調(diào)節(jié)抗體或其它免疫反應(yīng)劑序列的表達(dá)或修飾和加工抗體或其它免疫反應(yīng)劑的宿主細(xì)胞株。蛋白產(chǎn)物的所述修飾(例如，糖基化)和加工(例如，酶切)具有對(duì)于抗體或其它免疫反應(yīng)劑的功能的重要性。不同的宿主細(xì)胞具有蛋白和基因產(chǎn)物的翻譯后加工和修飾的特征性和特異性機(jī)制?？蛇x擇適宜的細(xì)胞系或宿主細(xì)胞以確保表達(dá)的抗體或其它免疫反應(yīng)劑的正確修飾和加工。為此目的，可以使用具有適于前轉(zhuǎn)錄物的加工，基因產(chǎn)物的糖基化和磷酸化的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的真核宿主細(xì)胞。所述哺乳動(dòng)物的宿主細(xì)胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、W138，尤其是，骨髓瘤細(xì)胞如NSO細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞系，參見例如，Morrison等，美國(guó)專利號(hào)5,807,715，由此上述文件全文引入此處作為參考。
對(duì)于重組抗體或其它免疫反應(yīng)劑的長(zhǎng)期、高產(chǎn)量的生產(chǎn)，優(yōu)選穩(wěn)定的表達(dá)。例如，可對(duì)穩(wěn)定表達(dá)抗體分子或其它免疫反應(yīng)劑的細(xì)胞系進(jìn)行工程化處理。除使用包含病毒源性復(fù)制的表達(dá)載體外，可用由適宜的表達(dá)控制元件(例如，啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，序列，轉(zhuǎn)錄終止子，所腺苷酸化位點(diǎn)等)控制的DNA和可選標(biāo)記轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。引入外源DNA后，將工程化細(xì)胞在滋養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1～2日，然后移至選擇性培養(yǎng)基。重組質(zhì)粒中的可選標(biāo)記對(duì)選擇具有抗性并能使細(xì)胞將轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定整合至其染色中然后生長(zhǎng)形成細(xì)胞灶其可被順次克隆然后擴(kuò)增為細(xì)胞系。本方法還益用于表達(dá)抗體分子或其它免疫反應(yīng)劑的工程化細(xì)胞系。所述工程化細(xì)胞系可特別用于篩選和評(píng)估直接或間接與抗體分子或其它免疫反應(yīng)劑發(fā)生相關(guān)作用的組合物。
可以使用許多選擇系統(tǒng)，其包括但不限于，可分別用于tk-，hgprt-或aprt-的細(xì)胞的單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，Cell 11223)，次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska & Szybalski，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48202)和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy等，1980，Cell 228-17)基因。而且，抗代謝藥抗性可用作選擇下述基因的基礎(chǔ)dhfr，其對(duì)應(yīng)于甲氨蝶呤抗性(Wigler等，1980，Natl. Acad.Sci.USA 77357，和O′Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527)；gpt，其對(duì)應(yīng)霉酚酸抗性(Mulligan&Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072)；neo，其對(duì)應(yīng)氨基糖甙G-418抗性(Wu和Wu，1991，Biotherapy 387-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Phartnacol.Toxicol.32573-596；Mulligan，1993，Science 260926-932；和Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochena.62191-217；和May，1993，TIB TECH 11(5)155-215)；和hygro，其對(duì)應(yīng)潮霉素抗性(Santerre等，1984，Gene30147)。重組DNA技術(shù)領(lǐng)域眾所周知的方法可常規(guī)用于篩選重組克隆，所述方法公開于，例如Ausubel等(編)，1993，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY；Kriegler，1990，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，StocktonPress，NY；12和13章，Dracopoli et al.(eds)，1994，CurrentProtocols in Human Genetics，John Wiley & Sons，NY；和Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.1501，上述文件均全文引入此處作為參考。
通過載體擴(kuò)增可以增加抗體分子或其它免疫反應(yīng)劑的表達(dá)水平(綜述參見Bebbington和Hentschel，1987，The use of vectors basedon gene amplification for the expression of cloned genes inmammalian cells in DNA cloning，Vol.3.Academic Press，New York)。當(dāng)表達(dá)抗體或其它免疫反應(yīng)劑的載體系統(tǒng)中的標(biāo)記具有可擴(kuò)增性時(shí)，存在于宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中的抑制劑水平的增加將增加標(biāo)記基因的拷貝數(shù)。由于擴(kuò)增的區(qū)域與抗體或其它免疫反應(yīng)劑基因相關(guān)，故此抗體或其它免疫反應(yīng)劑的生成也增加(Crouse等，1983，Mol.Cell.Biol.3257)。
宿主細(xì)胞可被本發(fā)明的兩種表達(dá)載體，編碼重鏈源性多肽的第一載體和編碼輕鏈源性多肽的第二載體共轉(zhuǎn)染。該兩種載體可包含相同的能使得重鏈和輕鏈多肽相等表達(dá)的可選標(biāo)記或不同的可選標(biāo)記以確保保持兩種質(zhì)粒?？蛇x地，可使用編碼重鏈和輕鏈多肽，且能表達(dá)的單個(gè)載體。在該情況下，輕鏈應(yīng)置于重鏈前以避免游離重鏈的過度毒性(Proudfoot，1986，Nature 32252；和Kohler，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 772197)。重鏈和輕鏈的編碼序列可包括cDNA或基因組DNA。
本發(fā)明的抗體或其它免疫反應(yīng)劑分子一經(jīng)通過重組表達(dá)得以制備后，其可通過本領(lǐng)域已知用于純化免疫球蛋白分子或其它免疫反應(yīng)劑的任何方法，例如通過層析法(例如，離子交換層析法、親和層析法、特別是在蛋白A純化后對(duì)特異性抗原的親和層析法和大小柱層析法)，離心、差異溶解度或通過用于純化蛋白的任何其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行純化。此外，本發(fā)明抗體或其它免疫反應(yīng)劑或其片段可與此處描述的或本領(lǐng)域已知的異源多肽序列融合以利于純化。
本發(fā)明還包括與異源多肽(或其部分，優(yōu)選至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100個(gè)氨基酸的多肽)重組融合或化學(xué)結(jié)合(包括共價(jià)和非共價(jià)結(jié)合)以產(chǎn)生融合蛋白的抗體或其片段的用途。該融合不一定是直接的，也可以通過聯(lián)接序列。例如，通過抗體與特異性針對(duì)特定細(xì)胞表面受體的抗體融合或結(jié)合，抗體可用于體外或體內(nèi)將異源多肽靶向特定細(xì)胞類型。與異源多肽融合或結(jié)合的抗體還可采用本領(lǐng)域已知方法用于體外免疫測(cè)定法和純化方法中。參見例如，PCT公開號(hào)WO93/21232；EP 439,095；Naramura等，Immunol.Lett.3991-99(1994)；美國(guó)專利5,474,981；Gillies等，PNAS 891428-1432(1992)；和Fell等，J.Immunol.1462446-2452(1991)，上述文件均全文引入此處作為參考。
本發(fā)明還包括包含與抗體片段融合或結(jié)合的異源多肽的組合物。例如，異源多肽可與Fab片段、Fc片段、Fv片段、F(ab’)2片段或其部分融合或結(jié)合。多肽與抗體部分融合或結(jié)合的方法是本領(lǐng)域已知的。參見例如，美國(guó)專利號(hào)5,336,603，5,622,929，5,359,046，5,349,053，5,447,851，和5,112,946；EP 307,434；EP 367,166；PCT公開號(hào)WO96/04388和WO 91/06570；Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8810535-10539(1991)；Zheng等，J.Immunol.1545590-5600(1995)和Vil等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8911337-11341(1992)(所述文件均全文引入此處作為參考)。
本發(fā)明還包括與治療劑結(jié)合的抗體或其片段的用途。
抗體或其片段可結(jié)合于治療部分如細(xì)胞毒素，例如細(xì)胞增殖抑制劑或細(xì)胞自殺劑、治療劑或放射性金屬離子，例如α粒子輻射劑。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑包括對(duì)細(xì)胞有害的任何藥劑。實(shí)例包括紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、菲啶溴紅、依米丁、絲裂霉素、依托泊苷、鬼臼噻吩甙、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、秋水仙堿、多柔比星、柔紅霉素、dihydroxy anthracin dione、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、1-去氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素及其類似物或同系物。治療因子包括(但不限于)、抗代謝藥(例如，甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)、烷化劑(例如，氮芥、thioepa苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BCNU)和環(huán)己亞硝脲(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素C和順氯氨鉑(II)(DDP))、蒽環(huán)類抗生素(例如，柔紅霉素(之前稱為道諾霉素)和多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素(之前稱為放線菌素)、博來霉素、光神霉素和安曲霉素(AMC))和抗-有絲分裂劑(例如，長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春堿)。
此外，抗體或其片段可結(jié)合改變特定生物反應(yīng)的治療劑或藥物部分。該治療劑或藥物部分并非受經(jīng)典化學(xué)治療的限制進(jìn)行構(gòu)建。例如，該藥物部分可以是具有所需生物活性的蛋白或多肽。所述蛋白可包括，例如毒素如相思豆毒素、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素、霍亂毒素或白喉毒素；蛋白如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血小板衍生的生長(zhǎng)因子、組織纖維蛋白溶酶原激活劑、細(xì)胞凋亡劑，例如TNF-α、TNF-β、AIM I(參見，國(guó)際公開號(hào)WO97/33899)，AIM II(參見，國(guó)際公開號(hào)WO 97/34911)，F(xiàn)as配體(Takahashi等，1994，J.Immunol.，61567-1574)，和VEGI(參見，國(guó)際公開號(hào)WO 99/23105)，血栓形成劑或抗-血管生成劑，例如血管抑素或內(nèi)皮抑素；或生物反應(yīng)修飾劑例如淋巴因子(例如，白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”))或生長(zhǎng)因子(例如，生長(zhǎng)激素(“GH”))。
此外，抗體可結(jié)合治療性部分如放射性金屬離子，如α發(fā)射劑如213Bi或用于將放射性金屬離子與肽結(jié)合的大環(huán)螯合劑，所述放射性金屬離子包括但不限于，131In，131LU，131Y，131Ho，131Sm。在特定實(shí)施方案中，大環(huán)螯合劑是1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N’，N”，N-四乙酸(DOTA)，其可借助連接分子與抗體連接。所述連接分子是本領(lǐng)域所眾所周知的且公開于Denardo等，1998，Clin Cancer Res.4(10)2483-90；Peterson等，1999，Bioconjug Chem.10(4)553-7；和Zimmerman等，1999，Nucl.Med.Biol.26(8)943-50，上述文件均全文引入作為參考。
治療部分與抗體結(jié)合的技術(shù)是眾所周知的，參見例如，Arnon等，“Monoclonal For Inmunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，in Mnonclonal And Cancer Therapy，Reisfeld等(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies For DrugDelivery”，in Controlled Drug Delivery(2nd ed.)，Robinson等(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“AntibodiesCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer TherapyA Review”，inMonoclonal Antibodies′84Biological And ClinicalApplications，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody InCancer Therapy″，in Monoclonal Antibodies For Cancer DetectionAnd Therapy，Baldwin等(eds.)，pp.303-16(Academic Press 1985)和Thorpe等，1982，Immunol.Rev.62119-58.
可選地，按Segal在美國(guó)專利號(hào)4,676,980中所公開的內(nèi)容，可將抗體結(jié)合第二抗體從而形成抗體異結(jié)合物，所述文件全文引入此處作為參考。
4.9治療性/預(yù)防性應(yīng)用確定HSP治療后免疫反應(yīng)劑的免疫原性在可選的過程中，與本發(fā)明的HSP制劑一同使用的免疫反應(yīng)劑的免疫原性的產(chǎn)生或提高可采用本領(lǐng)域眾所周知及第5節(jié)中例舉說明的多種方法進(jìn)行評(píng)估。
在其它方法中，“四聚體染色”測(cè)定法(Altman等，1996，Science27494-96)可用于鑒別抗原特異性T細(xì)胞。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，包含特異性肽抗原如腫瘤特異性抗原的MHC分子被多聚化以便形成可溶性肽四聚體并被例如通過結(jié)合抗生物素蛋白鏈菌素而被標(biāo)記。然后將MHC-肽抗原復(fù)合物與獲自用免疫反應(yīng)劑和HSP制劑治療的患者的T細(xì)胞群混合。然后對(duì)表達(dá)興趣腫瘤特異性抗原的T細(xì)胞用生物素染色。
此外，采用混合的淋巴細(xì)胞靶培養(yǎng)測(cè)定法，可在4小時(shí)51Cr-釋放測(cè)定中檢測(cè)T細(xì)胞的細(xì)胞毒性(參見Palladino等，1987，Cancer Res.475074-5079)。在該測(cè)定中，在靶細(xì)胞懸液中加入混合的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物以便產(chǎn)成不同的效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞(E∶T)比率(通常是1∶1至40∶1)。通過在包含500μCi51Cr/ml的培養(yǎng)基中于37℃孵育1×106靶細(xì)胞1小時(shí)對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行預(yù)先標(biāo)記。標(biāo)記后洗滌細(xì)胞三次。每個(gè)測(cè)定點(diǎn)(E∶T比率)以三等份進(jìn)行實(shí)施并包括適宜的對(duì)照以便檢測(cè)自發(fā)性51Cr釋放(測(cè)定中不加淋巴細(xì)胞)和100％釋放(用洗滌劑裂解細(xì)胞)。細(xì)胞培養(yǎng)物孵育4小時(shí)后，200g離心5分鐘形成細(xì)胞片狀沉淀。通過γ計(jì)數(shù)器檢測(cè)釋放至上清液中的51Cr的量。按檢測(cè)樣品中的cpm值減去自發(fā)釋放的cpm值再除以總洗滌劑釋放的cpm值減去自發(fā)釋放的cpm值來檢測(cè)細(xì)胞毒性百分?jǐn)?shù)。為了阻滯MHC I類分子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，將來自K-44雜交瘤細(xì)胞(抗-MHC I類分子雜交瘤)的濃縮雜交瘤上清液加入檢測(cè)樣品至終濃度12.5％。
可選地，ELISPOT測(cè)定法可用于檢測(cè)在用免疫反應(yīng)劑和HSP制劑刺激后細(xì)胞毒性T細(xì)胞體外釋放細(xì)胞因子。采用特異性針對(duì)特定細(xì)胞因子，如白介素-2、腫瘤壞死因子α或干擾素-γ的抗體檢測(cè)細(xì)胞因子釋放(例如，參見Scheibenbogen等，1997，Int.J.Cancer 71932-936)。在已預(yù)先涂覆了特異性針對(duì)興趣細(xì)胞因子的能夠俘獲T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的抗體的微量滴定板中實(shí)施測(cè)定。在T細(xì)胞于涂覆孔中孵育24～48小時(shí)后，除去細(xì)胞毒性T細(xì)胞然后代以識(shí)別細(xì)胞因子上不同表位的第二標(biāo)記的抗體。在充分洗滌以除去未結(jié)合抗體后，將產(chǎn)生有色反應(yīng)產(chǎn)物的酶底物加入滴定板。在顯微鏡下計(jì)數(shù)產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞的數(shù)目。該方法的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)時(shí)間短，以及靈敏度無需大量細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
4.10藥物組合物本發(fā)明還提供了藥物組合物。所述預(yù)防上或治療上有效的組合物包括免疫反應(yīng)劑和HSP，以及藥學(xué)上可接受的載體。在特定實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”是指聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)構(gòu)證實(shí)或美國(guó)藥典或其它公知藥典所列用于動(dòng)物，更特別用于人類的。所述術(shù)語(yǔ)“載體”是指稀釋劑、賦形劑或載體，其可用于施用治療劑。所述藥學(xué)載體可以是無菌液體，如水和油，包括石油、動(dòng)物、植物或合成來源的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。但靜脈內(nèi)施用藥物組合物時(shí)，水是優(yōu)選的載體。氯化鈉水溶液和葡萄糖水和甘油溶液也可用作液體載體，特別用于可注射的溶液。適宜的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如有需要，組合物還可包含少量的濕潤(rùn)劑或乳化劑或pH緩沖劑。這些組合物的形式可以是溶液、懸浮液、乳狀液、片劑、丸劑、膠囊、散劑、持續(xù)釋放劑型等?？诜┬涂砂?biāo)準(zhǔn)載體如藥品級(jí)甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。適宜的藥學(xué)載體的實(shí)例公開于E.W.Martin，“Remington′sPharmaceutical Sciences”中。所述組合物可包括預(yù)防或治療有效量的免疫反應(yīng)劑和HSP，優(yōu)選以純化的形式，聯(lián)同適宜量的載體以便提供適于施用于患者的形式。劑型應(yīng)與施用方式相適應(yīng)。
本發(fā)明的免疫反應(yīng)劑和HSP還益于與一種或多種用于治療疾病、病癥或感染的藥物，例如抗癌劑、抗炎劑或抗細(xì)菌/真菌劑或抗病毒劑聯(lián)合使用?？拱﹦┑膶?shí)例包括(但不限于)順鉑、卡鉑、環(huán)磷酰胺、阿霉素、依托泊苷、異磷酰胺、紫杉醇、紫杉烷、依連洛特肯、托泊替康、2，2-二氟脫氧胞嘧啶核苷、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞濱、奧沙利鉑、5-氟尿嘧啶(5-FU)、亞葉酸、左旋咪唑、，氮芥、長(zhǎng)春瑞濱、Temodar、長(zhǎng)春新堿和紅豆杉醇。
已知多種遞藥系統(tǒng)，其可用于施用本發(fā)明包括的治療劑和預(yù)防劑，即免疫反應(yīng)劑和HSP，例如包裹于脂質(zhì)體、微粒、微膠囊、能表達(dá)免疫反應(yīng)劑的重組細(xì)胞、HSP制劑，抗體或抗體片段，受體介導(dǎo)細(xì)胞攝取作用(參見例如，Wu和Wu，1997，J.Biol.Chem.2624429-4432)，作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體部分的構(gòu)建核酸等。包含相同物質(zhì)的免疫反應(yīng)劑或HSP制劑或藥物組合物的給藥方法包括(但不限于)非消化道給藥(例如，皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮下)、硬膜外和粘膜(例如，鼻內(nèi)和經(jīng)口途徑)。在特定實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)劑，例如抗體，經(jīng)肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下給藥。給藥可以是全身的或局部的。此外，還可采用經(jīng)肺施用方式，例如通過使用吸入器或噴霧器，以及與霧化劑的制劑。參見例如，美國(guó)專利號(hào)6,019,968；5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；和4,880,078；和PCT公開號(hào)WO 92/19244；WO 97/32572；WO 97/44013；WO 98/31346；和WO 99/66903，上述文件均全文引入此處作為參考。在一個(gè)實(shí)施方案中，采用Alkermes AIRTM經(jīng)肺藥物遞送技術(shù)(Alkermes，Inc.，Cambridge，MA)施用治療劑或預(yù)防劑。
溶解度和施用位點(diǎn)時(shí)在選擇施用途徑時(shí)應(yīng)考慮的因素。施用方式可以變化，包括(但不限于)，例如皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)或粘膜。粘膜途徑還可采用經(jīng)口、直腸和鼻的方式進(jìn)行施用。考慮到上述因素，優(yōu)選在施用第二藥劑的位點(diǎn)相同的位置或毗鄰位置施用第一治療劑或預(yù)防劑。在治療腫瘤的方法中，在腫瘤附近，最優(yōu)選通過瘤內(nèi)注射施用HSP制劑。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可采用任何需要的給藥途徑施用HSP制劑和免疫反應(yīng)劑。皮內(nèi)給藥的優(yōu)點(diǎn)分別包括所用的劑量低和吸收快。皮下或肌內(nèi)給藥的優(yōu)勢(shì)分別包括適用于某些不溶性懸浮液和油性懸浮液。粘膜給藥途徑包括(但不限于)，經(jīng)口，直腸和鼻給藥。用于粘膜給藥的試劑適用于下述多種劑型。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的治療劑或預(yù)防劑通過肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下給藥。組合物可通過任何適宜途徑，例如通過輸注或彈丸注射、通過經(jīng)上皮或粘膜襯層(例如，口腔粘膜，直腸和腸粘膜等)的吸收并可與其它生物學(xué)活性劑一起施用。
在一特定實(shí)施例中，需要將藥物本發(fā)明的組合物局部施用于需要治療或預(yù)防的區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，該治療或預(yù)防可通過，例如但不限于局部輸注、注射或植入物的方式實(shí)現(xiàn)，所述植入物時(shí)多孔性、無孔性或凝膠狀物質(zhì)，包括膜，如硅膠膜或纖維。優(yōu)選使用制劑不吸收的物質(zhì)。
在另一實(shí)施方案中，組合物可在載體，特別是脂質(zhì)體中遞送(參見Langer，1990，Science 2491527-1533；Treat等，in Liposomesin the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein和Fidler(eds.)，Liss，New York，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，ibid.，pp.317-327；基本同上)。
而在另一實(shí)施方案中，組合物可在控釋系統(tǒng)或持續(xù)釋放系統(tǒng)中遞送。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)均可用于制備包含一種或多種抗體，或一種或多種融合蛋白的持續(xù)釋放劑型。參見例如，美國(guó)專利號(hào)4,526,938；PCT公開號(hào)WO 91/05548；PCT公開號(hào)WO 96/20698；Ning等，1996，″Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human ColonCancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel，″Radiotherapy&Oncology 39179-189；Song等，1995，″Antibody Mediated LungTargeting of Long-Circulating Emulsions，″PDA Journal ofPharmaceutical Science & Technology 50372-397；Cleek等，1997，″Biodegradable Polymeric Carriers for abFGF Antibody forCardiovascular Application，″Pro.Intl.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24853-854；和Lam等，″Microencapsulation ofRecombinant Humanized Mnonolconal Antibody for Local Delivery，″Proc.Int′l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24759-760，1997，上述文件均全文引入此處作為參考。在一個(gè)實(shí)施方案中，可在控釋系統(tǒng)中使用泵(參見Langer，同上；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.1420；Buchwald等，1980，Surgery 88507；和Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321574)。在另一實(shí)施方案中，可使用聚合材料來實(shí)現(xiàn)免疫反應(yīng)劑或HSP制劑的控釋(參見例如，MedicalApplications of Controlled Release，Langer和Wise(eds.)，CRCPres.，Boca Raton，F(xiàn)lorida(1974)；Controlled DrugBioavailability，Drug Product Design和Performance，Smolen和Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas，1983，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361；并參見Levy等，1985，Science 228190；During等，1989，Ann.Neurol.25351；Howard等，1989，J.Neurosurg.7 1105)；美國(guó)專利號(hào)5,679,377；美國(guó)專利號(hào)5,916,597；美國(guó)專利號(hào)5,912,015；美國(guó)專利號(hào)5,989,463；美國(guó)專利號(hào)5,128,326；PCT公開號(hào)WO 99/15154；和PCT公開號(hào)WO 99/20253)。而在另一實(shí)施方案中，可將控釋系統(tǒng)置于治療靶點(diǎn)(例如，肺)附近，有序僅需要全身劑量的部分(參見例如，Goodson，in Medical Applications of Controlled Release，如上，vol.2，pp.115-138(1984))。
Langer，1990，Science 2491527-1533中描述了其它控釋系統(tǒng)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在施用免疫反應(yīng)劑的同時(shí)施用HSP制劑。HSP制劑和免疫反應(yīng)劑的同時(shí)施用是指HSP或HSP-肽復(fù)合物作為與免疫反應(yīng)劑的混合物或與之分開，但同時(shí)進(jìn)行的共施用。本方法提供了兩種施用在彼此低于1分鐘至約5分鐘或至60分鐘的時(shí)間框架內(nèi)，例如以相同的醫(yī)師隨訪實(shí)施。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在相同位點(diǎn)或非常毗鄰位點(diǎn)與免疫反應(yīng)劑同時(shí)導(dǎo)入包括但不限于hsp60、hsp70、hsp90、hsp110、gp96、grp170或鈣網(wǎng)織蛋白(單獨(dú)或彼此聯(lián)合)的HSP制劑至個(gè)體的方法。
如果預(yù)期的治療劑或預(yù)防劑是水溶性的，則其可在適宜緩沖液例如，磷酸鹽緩沖鹽水或其它生理學(xué)上適宜的溶液(優(yōu)選無菌)中進(jìn)行配制?？蛇x地，如果所得復(fù)合物在水溶劑中具有較弱的溶解度，則其可用離子型表面活性劑如Tween或聚乙二醇進(jìn)行配制。因此，可配制復(fù)合物與其生理學(xué)上可接受的溶劑合物通過吸入或吹入(或經(jīng)口或鼻)進(jìn)行施用，或經(jīng)口、含服、胃腸外或經(jīng)施用或(腫瘤的情況下)直接注射至實(shí)體瘤中。
對(duì)于經(jīng)口給藥，藥物制劑可以是液體形式，例如溶液、糖漿劑或懸浮液或可以是在使用前可水或其它適宜載體重建的藥品。所述液體制劑可通過常規(guī)方法用藥學(xué)上可接受的添加劑如懸浮劑(例如，山梨糖醇漿、纖維素衍生物或氫化食用脂)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯膠)；非水載體(例如，杏仁油，油酯或分級(jí)化植物油)；和防腐劑(例如，甲基或丙基-對(duì)-羥苯甲酸酯或山梨酸)進(jìn)行制備。藥物制劑可采用如下形式，例如通過常規(guī)方法用藥學(xué)上可接受的賦形劑如粘合劑(例如，預(yù)膠化玉米淀粉，聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如，乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤(rùn)滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石或二氧化硅)；崩解劑(例如，馬鈴薯淀粉或淀粉羥乙酸鈉)；或濕潤(rùn)劑(例如，十二烷基硫酸鈉)制備的片劑或膠囊?？赏ㄟ^本領(lǐng)域眾所周知的方法包被片劑。
可適宜地配制經(jīng)口施用的組合物以便提供有效物質(zhì)的控釋。
對(duì)于含服施用，組合物可采取以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑形式。
可為通過注射，例如通過彈丸注射或連續(xù)輸注的非消化道給藥配制藥劑。用于注射的劑型可以是包含附加保存劑的單位劑型，例如安瓿或多劑量容器。制劑可采用如下形式，油性或水性載體的懸浮液、溶液或乳狀液，可包括配制劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?？蛇x地，有效成分可以是在使用前要用適宜的載體，例如滅菌無熱原水配制的粉劑。
組合物還可配制為直腸制劑如栓劑或保留灌腸，例如包含常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可豆脂或其它甘油酯。
除上述劑型外，本發(fā)明的藥劑還可配制為貯存制劑。所述長(zhǎng)效劑型可通過植入(例如，皮下或肌內(nèi))或通過肌內(nèi)進(jìn)行施用。因此，例如，可用適宜的聚合或疏水性材料(例如，作為可接受油中的乳狀液)或離子交換樹脂或作為略溶衍生物，例如作為略溶鹽配制制劑。脂質(zhì)體和乳狀液是眾所周知的遞送載體或親水性藥物載體的實(shí)例。
對(duì)于吸入施用，根據(jù)本發(fā)明使用的制劑易于以來自增壓包或噴霧器的噴霧劑，使用適宜的推進(jìn)劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適宜的氣體進(jìn)行遞送。在增壓氣霧劑的情況下，劑量單位可通過提供閥門以便遞送確測(cè)定量的方法進(jìn)行確定。用于吸入器或吹入器的例如明膠的膠囊和藥筒可制備為包含化合物混合粉劑和適宜的粉基如乳糖或淀粉。
包括HSP的藥物組合物配方及其制備方法可見于引入本文作為參考的現(xiàn)有技術(shù)和美國(guó)專利中。
本發(fā)明還提供了將免疫反應(yīng)劑，例如抗體或HSP制劑包裝在熔封容器如安瓿或標(biāo)示免疫反應(yīng)劑量的小藥囊中。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫反應(yīng)劑和HSP在一種或多種熔封容器中以無菌凍干粉劑或無水濃縮物的形式一同或分開提供并例如可用水或鹽水重溶至適宜濃度而施用于個(gè)體。開始可通過體外檢測(cè)估計(jì)各免疫反應(yīng)劑的有效劑量。還要依據(jù)靶抗原的性質(zhì)，腫瘤中抗原密度，腫瘤類型，施用方式，其可被本領(lǐng)域技術(shù)人員在無須過度試驗(yàn)的情況下進(jìn)行優(yōu)化。用于注射的一般有效劑量為約0.1～5mg/kg/日、優(yōu)選約1～4mg/kg/日、更優(yōu)選2～4mg/kg/周。優(yōu)選地，免疫反應(yīng)劑作為熔封容器中的無菌凍干粉劑，以至少5mg、更優(yōu)選至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg或至少75mg的單位劑量提供。
在特定實(shí)施方案中，施用于動(dòng)物的免疫反應(yīng)劑是與所述動(dòng)物物種相同的物種來源或物種反應(yīng)性。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將人或人源化抗體施用人類患者從而用于治療或預(yù)防。
根據(jù)給藥途徑和HSP制劑中HSP的類型，HSP制劑中HSP的量可為，例如，0.1～1000μg/施用。gp96或hsp70的優(yōu)選量為10～600μg/施用而如果皮內(nèi)施用HSP制劑，則為0.1～50μg，優(yōu)選10～25μg。對(duì)于hsp 90，優(yōu)選量為約50～1000ug/施用，用于皮內(nèi)施用時(shí)為約5～50μg。
在其它實(shí)施方案中，熱激蛋白是hsp60、hsp70、hsp90，gp96或鈣網(wǎng)織蛋白。HSP制劑的施用劑量很多程度上依賴要治療個(gè)體的狀況和尺寸以及免疫反應(yīng)劑的施用量，治療頻率和給藥途徑。持續(xù)治療的給藥法，包括位點(diǎn)、劑量和頻率可通過始初反應(yīng)和臨床診斷進(jìn)行指導(dǎo)。
與本發(fā)明的具體組合物使用的具體HSP的優(yōu)選量可進(jìn)行變化。對(duì)給定組合物的具體HSP量的優(yōu)化(如上述實(shí)例所證實(shí)的)處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的認(rèn)識(shí)之內(nèi)。
由于施用HSP制劑，在個(gè)體中引發(fā)免疫反應(yīng)需要較低量的免疫反應(yīng)劑。與HSP制劑使用的免疫反應(yīng)劑的量(包括次優(yōu)范圍內(nèi)的量)可通過用本領(lǐng)域眾所周知的方法在動(dòng)物模型中進(jìn)行劑量響應(yīng)試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，熱激蛋白是hsp70。藥物組合物中hsp70的量?jī)?yōu)選為10～600μg/施用，而如果皮內(nèi)施用HSP制劑則為0.1～50μg，優(yōu)選為10～25μg。
在一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，熱激蛋白是gp96。藥物組合物中g(shù)p96的量?jī)?yōu)選為10-600μg/施用，而如果皮內(nèi)施用HSP制劑則為0.1～50μg，優(yōu)選為10～25μg。
在可選的實(shí)施方案中，在標(biāo)示了HSP和免疫反應(yīng)劑量和濃度的熔封容器中以液體形式提供免疫反應(yīng)劑和HSP。優(yōu)選地，熔封容器中提供的免疫反應(yīng)劑的液體形式為至少1mg/ml、更優(yōu)選至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml或至少25mg/ml。優(yōu)選地，熔封容器中提供的HSP的液體形式為至少0.1mg/ml、更優(yōu)選至少1.0mg/ml、至少5mg/ml、至少10mg/ml、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少100mg/ml或至少250mg/ml。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物根據(jù)常規(guī)方法作為適于靜脈施用于人類藥物組合物進(jìn)行配制。典型地，用于靜脈施用的組合物是在無菌等滲水緩沖液中的溶液。需要時(shí)，組合物還可包括增溶劑和局部麻醉藥如利多卡因以便減輕注射點(diǎn)處的疼痛。
通常，本發(fā)明組合物的組分可以藥盒提供，所述組分可分開或混合于單位劑型中，例如作為熔封容器如安瓿或標(biāo)示免疫反應(yīng)劑量的小藥囊中的冷凍干燥粉或無水濃縮物。當(dāng)通過輸注施用組合物時(shí)，其可在包含無菌藥品級(jí)水或鹽水的輸注瓶中配制。當(dāng)通過注射施用組合物時(shí)，可提供注射用無菌水或鹽水安瓿以便在施用前可以混合成分。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥盒還包括用于注射組合物的注射針或注射器，優(yōu)選無菌包裝的，和/或包裝的酒精墊。可選地包括醫(yī)師或患者施用本發(fā)明的組合物的說明書。
本發(fā)明的組合物可配制為中性形式或鹽形式。藥學(xué)上可接受的鹽包括來自例如鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的陰離子形成的鹽，以及來自例如鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺，三乙胺，2-乙基氨基乙醇，組氨酸，普魯卡因等的陽(yáng)離子形成的鹽。
本發(fā)明的組合物在治療、預(yù)防和改善與疾病、病癥或感染相關(guān)的一種或多種癥狀中的有效量可通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定。配方中的精確劑量將依賴給藥途徑，個(gè)體年齡和疾病、病癥或感染的嚴(yán)重程度，并應(yīng)根據(jù)執(zhí)業(yè)醫(yī)師的判斷和各患者的狀況確定。可從獲自體外或動(dòng)物模型(例如，棉鼠或短尾猴)試驗(yàn)系統(tǒng)的劑量響應(yīng)曲線中推斷出有效劑量。用于評(píng)估HSPs和抗體或其它免疫反應(yīng)劑的效應(yīng)的模型和方法是本領(lǐng)域已知的。(Wooldridge等，1997，Blood 89(8)2994-2998，其全文引入此處作為參考)。
對(duì)抗體而言，治療上或預(yù)防上施用于個(gè)體的有效劑量一般為0.1mg/kg～200mg/kg個(gè)體體重。優(yōu)選地，對(duì)個(gè)體施用的劑量為0.1mg/kg～20mg/kg個(gè)體體重而更優(yōu)選的對(duì)個(gè)體施用的劑量為1mg/kg～10mg/kg個(gè)體體重。但是，劑量將依賴分子的血清半衰期被提高的范圍。通常，由于對(duì)外源多肽的免疫反應(yīng)，故而人抗體在人體內(nèi)的半衰期比來自其它物種的抗體的長(zhǎng)。因此，通?？梢圆捎幂^低劑量的人抗體和較低的施用頻率。此外，還可通過提高免疫反應(yīng)劑的攝取和組織透過(例如，進(jìn)入肺)例如，通過脂化從而降低免疫反應(yīng)劑的劑量和施用頻率。具體的抗體劑量還可參見關(guān)于所述抗體的廠商說明，或醫(yī)師參考手冊(cè)(56thed.，2002)中。
采用治療上或預(yù)防上有效量的免疫反應(yīng)劑和HSP對(duì)個(gè)體的治療包括單療或，優(yōu)選可包括系列治療。在優(yōu)選的實(shí)施例中，用劑量為約0.1～30mg/kg體重的免疫反應(yīng)劑，按每周一次約1～10周，優(yōu)選2～8周，更優(yōu)選約3～7周，甚至更優(yōu)選約4、5或6周對(duì)個(gè)體進(jìn)行治療。免疫反應(yīng)劑及其劑量，施用途徑和推薦用途是本領(lǐng)域已知的并已經(jīng)被公開于例如醫(yī)師參考手冊(cè)(56thed.，2002)這樣的現(xiàn)有技術(shù)中。在優(yōu)選的實(shí)例中，將HSP以約0.1～1000mg，更優(yōu)選1～500mg，最優(yōu)選2～250mg，每周一次持續(xù)約1～10周，優(yōu)選2～8周，更優(yōu)選約3～7周，和甚至更優(yōu)選4、5或6周對(duì)個(gè)體進(jìn)行治療。本領(lǐng)域技術(shù)人員能認(rèn)識(shí)到適宜的HSP劑量要依賴于要治療的病癥和免疫反應(yīng)劑的施用，以及個(gè)體。
在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包括HSPs與賦形劑的組合。優(yōu)選地，熱激蛋白是hsp60、hsp70、hsp90、gp96或鈣網(wǎng)織蛋白，而賦形劑選自非離子型表面活性劑，聚乙烯吡咯烷酮，人血清白蛋白和多種未修飾的及衍生的環(huán)糊精。更優(yōu)選地，在這些實(shí)施方案中，非離子型表面活性劑選自聚山梨酯20、聚山梨酯-40，聚山梨酯-60和聚山梨酯-80。聚乙烯吡咯烷酮可優(yōu)選為聚乙烯吡咯烷酮C15，藥物級(jí)聚乙烯吡咯烷酮。優(yōu)選的環(huán)糊精是羥丙基-β-環(huán)糊精，羥丙基-γ-環(huán)糊精，和甲基-β-環(huán)糊精。優(yōu)選地，環(huán)糊精是β-環(huán)糊精。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物包括預(yù)防上或治療上有效量的HSP制劑或免疫反應(yīng)劑，和藥學(xué)上可接受的載體。
在特定實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”是指聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)構(gòu)證實(shí)或美國(guó)藥典或其它公知藥典所列用于動(dòng)物，更特別用于人類的。所述術(shù)語(yǔ)“載體”是指稀釋劑、佐劑(例如，弗氏佐劑(完全和不完全))、賦形劑或用于施用治療劑的載體。所述藥學(xué)載體可以是無菌液體，如水和油，包括石油、動(dòng)物、植物或合成來源的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。但靜脈內(nèi)施用藥物組合物時(shí)，水是優(yōu)選的載體。氯化鈉水溶液和葡萄糖水和甘油溶液也可用作液體載體，特別用于可注射的溶液。適宜的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如有需要，組合物還可包含少量濕潤(rùn)劑或乳化劑或pH緩沖劑。這些組合物可采用溶液、懸浮液、乳狀液、片劑、丸劑、膠囊、散劑、持續(xù)釋放劑等形式。
如有需要，可將制劑置于可包含一種或多種包含HSP制劑的單位劑型的藥包或分配裝置中。藥包可例如包括金屬或塑料薄膜，如起泡包裝(blister pack)。藥包或分配裝置可包含使用說明書。
可將本發(fā)明的組合物施用動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物和最優(yōu)選人，以便治療、預(yù)防或改善與疾病、病癥或感染相關(guān)的一種或多種癥狀。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物存在于身體的外面。優(yōu)選地，本發(fā)明的免疫反應(yīng)劑已經(jīng)被確立在缺少熱激蛋白時(shí)即具有某些治療益處，以及識(shí)別與疾病、病癥或感染的病因或癥狀相關(guān)的細(xì)胞或分子上的表位。
所述組合物包括免疫反應(yīng)劑(即，包含抗原結(jié)合區(qū)和介導(dǎo)一種或多種抗體依賴性免疫過程的區(qū)域，例如，F(xiàn)c受體-結(jié)合部位的抗原結(jié)合蛋白)和HSP。
每一本發(fā)明的組合物應(yīng)包含至少一種免疫反應(yīng)劑(如本文所定義的，例如，抗體)和HSP，且本發(fā)明的組合物還可與其它治療形式聯(lián)合而用于特定的疾病。免疫特異性結(jié)合一種或多種靶抗原的一種或多種免疫反應(yīng)劑可作為預(yù)防劑或治療劑而局部或全身性用于身體。
4.11藥盒本發(fā)明還提供了用于實(shí)施本發(fā)明方法的藥盒。在特定實(shí)施方案中，藥盒包括第一容器，所述容器包含熱激蛋白制劑，所述熱激蛋白制劑的量能有效增強(qiáng)由對(duì)抗免疫反應(yīng)劑靶點(diǎn)的免疫反應(yīng)劑所引發(fā)的免疫反應(yīng)，所述靶點(diǎn)需要免疫反應(yīng)與其對(duì)抗；和第二容器，該容器包含免疫反應(yīng)劑，所述免疫反應(yīng)劑的量(在施用第一容器中的熱激蛋白制劑之前、同時(shí)或之后施用)能有效誘導(dǎo)對(duì)抗靶點(diǎn)的免疫反應(yīng)。
本發(fā)明提供的藥盒包括在一個(gè)容器中能有效治療或預(yù)防疾病或病癥的量的免疫反應(yīng)劑；和在另一容器中能有效提高或增強(qiáng)由免疫反應(yīng)劑引發(fā)的免疫反應(yīng)的熱激蛋白制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，若不依賴于施用另一容器中的熱激蛋白制劑，存在于容器中的免疫反應(yīng)劑的量對(duì)于在個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)是次優(yōu)的。該藥盒可任選地附有說明書。
本發(fā)明還提供了一種藥盒，其包括一個(gè)或多個(gè)容器，所述容器含有本發(fā)明的組合物藥物的一種或多種成分。與所述藥盒任選相伴隨的是以管理生產(chǎn)商，藥物制劑或生物制劑的使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)所規(guī)定的形式的公告，該公告應(yīng)反映出上述機(jī)構(gòu)對(duì)于施用于人類的生產(chǎn)、使用或銷售的許可。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥盒可選地進(jìn)一步包括預(yù)先確定量的免疫反應(yīng)劑(即，包含抗原結(jié)合區(qū)和介導(dǎo)一種或多種抗體依賴性免疫過程的區(qū)域，例如，F(xiàn)c受體-結(jié)合部位的抗原結(jié)合蛋白)和HSP。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，藥盒包括位于分離容器中的免疫反應(yīng)劑和HSP。
5.實(shí)施例5.1抗體介導(dǎo)的體外裂解的增強(qiáng)從原初(naive)6-8周齡小鼠的脾中獲取鼠脾細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞)。將這些效應(yīng)細(xì)胞與適宜量的HSP制劑和適宜量的單克隆抗體孵育24至72小時(shí)。在孵育期末，用51Cr標(biāo)記靶細(xì)胞(例如7-OVA或M04)。
將效應(yīng)細(xì)胞和標(biāo)記的靶細(xì)胞以確定的效應(yīng)細(xì)胞靶細(xì)胞比率于存在和不存在針對(duì)SIINFEKL/MHC I類分子(1～10μg/ml)的抗體的情況下在4℃孵育30～60分鐘。將存在HSP和抗體時(shí)的裂解與無HSP、無抗體或二者皆無的對(duì)照進(jìn)行比較。
5.2腫瘤攻擊模型中保護(hù)作用的改善C57B1/6小鼠經(jīng)皮下(SC)途徑在脅腹接種M04腫瘤(1×105)或EG7-OVA腫瘤。在接種后24至48小時(shí)，在有或無適宜量的HSP制劑的情況下經(jīng)靜脈內(nèi)(IP)途徑或經(jīng)局部皮下途徑對(duì)小鼠注射適宜量的針對(duì)SIINFEKL/MHC I類分子的免疫反應(yīng)劑(即，抗體)。通過監(jiān)測(cè)30至60日期間腫瘤的生長(zhǎng)(用測(cè)徑器進(jìn)行測(cè)量)將聯(lián)合治療的抗腫瘤作用與單獨(dú)抗體治療的抗腫瘤作用進(jìn)行比較。測(cè)定存活率，并采用Cox回歸分析評(píng)估關(guān)于時(shí)間與死亡的顯著性。而且每日檢測(cè)小鼠的毒性癥狀，包括活動(dòng)水平，皮毛褶皺(ruffled fur)，腹瀉和一般狀況。評(píng)估抗體或其它免疫反應(yīng)劑效應(yīng)的模型和方法是本領(lǐng)域已知的。(Wooldridge等，1997，Blood 89(8)2994-2998，其全文引入此處作為參考)。
5.3 細(xì)菌的改善的調(diào)理作用通過將HSP制劑加入治療性抗體治療而產(chǎn)生細(xì)菌的改善的調(diào)理作用通過孵育效應(yīng)細(xì)胞與HSP制劑以實(shí)施調(diào)理吞噬測(cè)定(HL-60)而在體外得以證實(shí)。評(píng)估所述細(xì)胞是否在特定抗體滴度下能更有效的調(diào)理肺炎葡萄球菌或金黃色釀膿葡萄球菌(例如分別具有特異性針對(duì)肺炎葡萄球菌或金黃色釀膿葡萄球菌的調(diào)理活性的人血清樣品)。
5.4Fc受體的上調(diào)在存在或不存在適宜量的HSP制劑的情況下孵育單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞或多形核細(xì)胞。將胰蛋白酶處理的細(xì)胞與特異性針對(duì)FcαR、FcγRl、FcγRII或FcγRIII的單克隆抗體于4℃孵育60分鐘。然后將細(xì)胞與抗-小鼠IgG FITC探針孵育，洗滌，低聚甲醛固定，然后用FACScan分析。監(jiān)測(cè)這些細(xì)胞上Fc受體的上調(diào)。
此外，還監(jiān)測(cè)了HSP制劑對(duì)巨噬細(xì)胞中TNF-α，IL-6和MIP-1-α的上調(diào)。
本說明書中引用的所有參考文件均全文引入此處作為參考且其全部目的如同各個(gè)申請(qǐng)或?qū)＠驅(qū)＠暾?qǐng)具體而各自地意在將其全文引入作為參考的全部目的一樣。
在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可對(duì)本發(fā)明做出多種修改和變化，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。本文所描述的具體實(shí)施方案僅以實(shí)例性方式給出，而本發(fā)明僅由所附權(quán)利要求以及所述權(quán)利要求所賦予的等效形式的全部范圍限定。
權(quán)利要求
1.一種免疫治療方法，所述方法包括對(duì)有此需要的個(gè)體施用純化的HSP制劑和純化的免疫反應(yīng)劑。
2.一種在接受免疫反應(yīng)劑的個(gè)體中改善被動(dòng)免疫治療效果的方法，所述方法包括對(duì)所述個(gè)體施用純化的HSP制劑。
3.一種在有此需要的個(gè)體中治療癌癥的方法，所述方法包括對(duì)所述個(gè)體施用純化的HSP制劑和純化的是癌癥治療劑的免疫反應(yīng)劑。
4.一種在有此需要的個(gè)體中治療感染性疾病的方法，所述方法包括對(duì)所述個(gè)體施用純化的HSP制劑和純化的是所述感染性疾病治療劑的免疫反應(yīng)劑。
5.一種在有此需要的個(gè)體中治療神經(jīng)變性病/淀粉樣蛋白病或病癥的方法，所述方法包括對(duì)所述個(gè)體施用HSP制劑和純化的是所述神經(jīng)變性病/淀粉樣蛋白病或病癥治療劑的免疫反應(yīng)劑。
6.一種免疫治療方法，所述方法包括如下步驟(a)對(duì)個(gè)體施用識(shí)別需要針對(duì)其產(chǎn)生免疫反應(yīng)的組分的抗原的純化的免疫反應(yīng)劑；和(b)對(duì)個(gè)體施用熱激蛋白制劑，其中熱激蛋白制劑不表現(xiàn)由所述免疫反應(yīng)劑識(shí)別的所述組分的抗原性；由此在個(gè)體中產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
7.一種通過免疫反應(yīng)劑在個(gè)體中增強(qiáng)或誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括如下步驟(a)對(duì)個(gè)體施用熱激蛋白制劑；和(b)對(duì)個(gè)體施用識(shí)別需要針對(duì)其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的組分的抗原的純化的免疫反應(yīng)劑，該免疫反應(yīng)劑的量在缺少步驟(a)的情況下對(duì)所述組分是次優(yōu)的，由此在個(gè)體中產(chǎn)生免疫反應(yīng)，其中熱激蛋白制劑不表現(xiàn)組分的抗原性。
8.一種在有此需要的個(gè)體中治療或預(yù)防感染性疾病的方法，所述方法包括如下步驟(a)對(duì)個(gè)體施用能夠識(shí)別與導(dǎo)致感染性疾病的感染因子相關(guān)的抗原的免疫反應(yīng)劑；和(b)對(duì)個(gè)體施用熱激蛋白制劑，該熱激蛋白制劑的量能有效聯(lián)合步驟(a)從而誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對(duì)所述感染因子的免疫反應(yīng)，其中熱激蛋白制劑不表現(xiàn)所述因子的抗原性。
9.一種在個(gè)體中治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括如下步驟(a)對(duì)個(gè)體施用能夠識(shí)別與癌細(xì)胞相關(guān)的抗原的免疫反應(yīng)劑；和(b)對(duì)個(gè)體施用熱激蛋白制劑，該熱激蛋白制劑的量能在個(gè)體中有效誘導(dǎo)或增強(qiáng)免疫反應(yīng)，其中熱激蛋白制劑不表現(xiàn)所述癌細(xì)胞的抗原性。
10.一種治療或預(yù)防個(gè)體中神經(jīng)變性病癥的方法，所述方法包括如下步驟(a)對(duì)個(gè)體施用能夠識(shí)別與所述病癥相關(guān)的分子的免疫反應(yīng)劑；和(b)對(duì)個(gè)體施用熱激蛋白制劑，該熱激蛋白制劑的量能在個(gè)體中有效誘導(dǎo)或增強(qiáng)免疫反應(yīng)，其中熱激蛋白制劑不表現(xiàn)所述分子的抗原性。
11.一種免疫治療方法，所述方法包括如下步驟(a)對(duì)個(gè)體施用識(shí)別需要針對(duì)其產(chǎn)生免疫反應(yīng)的組分的抗原的免疫反應(yīng)劑；和(b)對(duì)個(gè)體施用熱激蛋白制劑，其中熱激蛋白制劑不表現(xiàn)所述組分的抗原性；由此在個(gè)體中產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
12.一種通過免疫反應(yīng)劑在個(gè)體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括如下步驟(a)對(duì)個(gè)體施用熱激蛋白制劑；和(b)對(duì)個(gè)體施用識(shí)別需要針對(duì)其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的組分的抗原的免疫反應(yīng)劑，該免疫反應(yīng)劑的量在缺少步驟(a)的情況下具有對(duì)所述組分較差的免疫原性，由此在個(gè)體中產(chǎn)生免疫反應(yīng)，其中熱激蛋白制劑表現(xiàn)所述組分的抗原性。
13.一種在有此需要的個(gè)體中治療或預(yù)防感染性疾病的方法，所述方法包括如下步驟(a)對(duì)個(gè)體施用能夠識(shí)別與導(dǎo)致感染性疾病的感染因子相關(guān)的抗原的免疫反應(yīng)劑；和(b)對(duì)個(gè)體施用熱激蛋白制劑，該熱激蛋白制劑的量能有效聯(lián)合步驟(a)從而誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對(duì)所述感染因子的免疫反應(yīng)，其中熱激蛋白制劑表現(xiàn)所述因子的抗原性。
14.一種治療或預(yù)防個(gè)體中癌癥的方法，所述方法包括如下步驟(a)對(duì)個(gè)體施用能夠識(shí)別與癌細(xì)胞相關(guān)的抗原的免疫反應(yīng)劑；和(b)對(duì)個(gè)體施用熱激蛋白制劑，該熱激蛋白制劑的量能在個(gè)體中有效誘導(dǎo)或增強(qiáng)免疫反應(yīng)，其中熱激蛋白制劑表現(xiàn)所述癌細(xì)胞的抗原性。
15.一種治療或預(yù)防個(gè)體中神經(jīng)變性疾病的方法，所述方法包括如下步驟(a)對(duì)個(gè)體施用能夠識(shí)別與所述病癥相關(guān)的分子的免疫反應(yīng)劑；和(b)對(duì)個(gè)體施用熱激蛋白制劑，該熱激蛋白制劑的量能在個(gè)體中有效誘導(dǎo)或增強(qiáng)免疫反應(yīng)，其中熱激蛋白制劑表現(xiàn)所述分子的抗原性。
16.權(quán)利要求6、8、9、10、11、12、13、14或15的方法，其中作為施用所述免疫反應(yīng)劑結(jié)果的在個(gè)體中產(chǎn)生的免疫反應(yīng)相對(duì)于缺少步驟(b)時(shí)的所述免疫反應(yīng)增強(qiáng)。
17.一種免疫治療方法，所述方法包括如下步驟(a)對(duì)有此需要的個(gè)體施用識(shí)別需要針對(duì)其產(chǎn)生免疫反應(yīng)的組分的抗原的免疫反應(yīng)劑；和(b)對(duì)個(gè)體施用包含活化的抗原呈遞細(xì)胞的組合物，其中已將抗原呈遞細(xì)胞與熱激蛋白制劑接觸，其中熱激蛋白制劑表現(xiàn)所述組分的抗原性；由此在個(gè)體中產(chǎn)生針對(duì)所述組分的免疫反應(yīng)。
18.一種通過免疫反應(yīng)劑在有此需要的個(gè)體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括如下步驟(a)對(duì)個(gè)體施用包含活化的抗原呈遞細(xì)胞的組合物，其中已通過將抗原呈遞細(xì)胞與熱激蛋白制劑接觸而將抗原呈遞細(xì)胞活化；和(b)對(duì)個(gè)體施用識(shí)別需要針對(duì)其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的組分的抗原的免疫反應(yīng)劑，所述免疫反應(yīng)劑的量在缺少步驟(a)的情況下對(duì)于所述組分是次優(yōu)的，由此在個(gè)體中產(chǎn)生針對(duì)所述組分的免疫反應(yīng)。
19.一種在有此需要的個(gè)體中治療或預(yù)防感染性疾病的方法，所述方法包括如下步驟(a)對(duì)個(gè)體施用能夠識(shí)別與導(dǎo)致感染性疾病的感染因子相關(guān)的抗原的免疫反應(yīng)劑；和(b)對(duì)個(gè)體施用一定量的包含活化的抗原呈遞細(xì)胞的組合物，其中已通過將抗原呈遞細(xì)胞與熱激蛋白制劑接觸而將抗原呈遞細(xì)胞活化，其中包括活化的抗原呈遞細(xì)胞的組合物的量能有效地聯(lián)合步驟(a)從而在個(gè)體中誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對(duì)所述因子的免疫反應(yīng)。
20.一種在有此需要的個(gè)體中治療或預(yù)防癌癥的方法，所述方法包括如下步驟(a)對(duì)個(gè)體施用能夠識(shí)別與癌細(xì)胞相關(guān)的抗原的免疫反應(yīng)劑；和(b)對(duì)個(gè)體施用一定量的包含活化的抗原呈遞細(xì)胞的組合物，其中已通過將抗原呈遞細(xì)胞與熱激蛋白制劑接觸而將抗原呈遞細(xì)胞活化，其中包括活化的抗原呈遞細(xì)胞的組合物的量能有效地聯(lián)合步驟(a)從而在個(gè)體中誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對(duì)所述細(xì)胞的免疫反應(yīng)。
21.一種在有此需要的個(gè)體中治療或預(yù)防神經(jīng)變性疾病的方法，所述方法包括如下步驟(a)對(duì)個(gè)體施用能夠識(shí)別與所述病癥相關(guān)的分子的免疫反應(yīng)劑；和(b)對(duì)個(gè)體施用一定量的包含活化的抗原呈遞細(xì)胞的組合物，其中已通過將抗原呈遞細(xì)胞與熱激蛋白制劑接觸而將抗原呈遞細(xì)胞活化，其中包括活化的抗原呈遞細(xì)胞的組合物的量能有效地聯(lián)合步驟(a)從而在個(gè)體中誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對(duì)所述分子的免疫反應(yīng)。
22.根據(jù)權(quán)利要求17、18、19、20或21的方法，其中在施用免疫反應(yīng)劑之前施用活化的抗原呈遞細(xì)胞。
23.根據(jù)權(quán)利要求17、18、19、20或21的方法，其中在施用免疫反應(yīng)劑的同時(shí)施用活化的抗原呈遞細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求17、18、19、20或21的方法，其中在施用免疫反應(yīng)劑之后施用活化的抗原呈遞細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求18、19、20或21的方法，其中所述熱激蛋白制劑不表現(xiàn)所述組分的免疫原性。
26.一種免疫治療方法，所述方法包括如下步驟(a)對(duì)個(gè)體施用識(shí)別需要針對(duì)其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的組分的抗原的免疫反應(yīng)劑；和(b)對(duì)個(gè)體施用第一熱激蛋白制劑；和(c)對(duì)個(gè)體施用一定量包含活化的抗原呈遞細(xì)胞的組合物，其中已通過將抗原呈遞細(xì)胞與第二熱激蛋白制劑接觸而將抗原呈遞細(xì)胞活化，由此在個(gè)體中產(chǎn)生針對(duì)所述組分的免疫反應(yīng)。
27.權(quán)利要求26的方法，其中第一熱激蛋白制劑不表現(xiàn)所述組分的免疫原性。
28.權(quán)利要求26的方法，其中第二熱激蛋白制劑不表現(xiàn)所述組分的免疫原性。
29.權(quán)利要求26的方法，其中第一熱激蛋白制劑表現(xiàn)所述組分的免疫原性。
30.權(quán)利要求26的方法，其中第二熱激蛋白制劑表現(xiàn)所述組分的免疫原性。
31.一種通過免疫反應(yīng)劑在個(gè)體中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括如下步驟(a)對(duì)個(gè)體施用第一熱激蛋白制劑；和(b)對(duì)個(gè)體施用一定量包含活化的抗原呈遞細(xì)胞的組合物，其中已通過將抗原呈遞細(xì)胞與第二熱激蛋白制劑接觸而將抗原呈遞細(xì)胞活化；和(c)對(duì)個(gè)體施用識(shí)別需要針對(duì)其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的組分的抗原的免疫反應(yīng)劑，所述免疫反應(yīng)劑的量在缺少步驟(a)和/或步驟(c)的情況下對(duì)所述組分是次優(yōu)的，由此在個(gè)體中產(chǎn)生針對(duì)所述組分的免疫反應(yīng)。
32.權(quán)利要求31的方法，其中第一和第二熱激蛋白制劑不表現(xiàn)所述組分的免疫原性。
33.權(quán)利要求31的方法，其中第一和第二熱激蛋白制劑表現(xiàn)所述組分的免疫原性。
34.權(quán)利要求31的方法，其中第一熱激蛋白制劑表現(xiàn)所述組分的免疫原性。
35.權(quán)利要求31的方法，其中第二熱激蛋白制劑表現(xiàn)所述組分的免疫原性。
36.權(quán)利要求31的方法，其中第一熱激蛋白制劑不表現(xiàn)所述組分的免疫原性。
37.權(quán)利要求31的方法，其中第二熱激蛋白制劑不表現(xiàn)所述組分的免疫原性。
38.一種治療或預(yù)防個(gè)體中感染性疾病的方法，所述方法包括如下步驟(a)對(duì)個(gè)體施用能夠識(shí)別與導(dǎo)致感染性疾病的感染因子相關(guān)的抗原的免疫反應(yīng)劑；和(b)對(duì)個(gè)體施用第一熱激蛋白制劑，所述第一熱激蛋白制劑的量能聯(lián)合步驟(a)和/或(c)在所述個(gè)體中有效誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對(duì)所述因子的免疫反應(yīng)；和(c)對(duì)個(gè)體施用一定量包含活化的抗原呈遞細(xì)胞的組合物，該組合物能有效聯(lián)合步驟(a)和/或(b)從而在所述個(gè)體中誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對(duì)所述因子的免疫反應(yīng)，其中已通過將抗原呈遞細(xì)胞與第二熱激蛋白制劑接觸而將抗原呈遞細(xì)胞活化，由此在個(gè)體中產(chǎn)生針對(duì)所述因子的免疫反應(yīng)。
39.權(quán)利要求38的方法，其中第一和第二熱激蛋白制劑不表現(xiàn)所述感染因子的免疫原性。
40.權(quán)利要求38的方法，其中第一和第二熱激蛋白制劑表現(xiàn)所述感染因子的免疫原性。
41.權(quán)利要求38的方法，其中第一熱激蛋白制劑表現(xiàn)所述感染因子的免疫原性。
42.權(quán)利要求38的方法，其中第二熱激蛋白制劑表現(xiàn)所述感染因子的免疫原性。
43.權(quán)利要求38的方法，其中第一熱激蛋白制劑不表現(xiàn)所述感染因子的免疫原性。
44.權(quán)利要求38的方法，其中第二熱激蛋白制劑不表現(xiàn)所述感染因子的免疫原性。
45.一種治療或預(yù)防個(gè)體中癌癥的方法，所述方法包括如下步驟(a)對(duì)個(gè)體施用識(shí)別所述癌細(xì)胞相關(guān)抗原的免疫反應(yīng)劑；和(b)對(duì)個(gè)體施用第一熱激蛋白制劑，所述第一熱激蛋白制劑的量能聯(lián)合步驟(a)和/或(c)在所述個(gè)體中有效誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對(duì)所述癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)；和(c)對(duì)個(gè)體施用一定量包含活化的抗原呈遞細(xì)胞的組合物，該組合物能有效聯(lián)合步驟(a)和/或(b)從而在所述個(gè)體中誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對(duì)所述癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)，其中已通過將抗原呈遞細(xì)胞與第二熱激蛋白制劑接觸而將抗原呈遞細(xì)胞活化，由此在個(gè)體中產(chǎn)生針對(duì)所述癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)。
46.權(quán)利要求45的方法，其中第一和第二熱激蛋白制劑不表現(xiàn)所述癌細(xì)胞的免疫原性。
47.權(quán)利要求45的方法，其中第一和第二熱激蛋白制劑表現(xiàn)所述癌細(xì)胞的免疫原性。
48.權(quán)利要求45的方法，其中第一熱激蛋白制劑表現(xiàn)所述癌細(xì)胞的免疫原性。
49.權(quán)利要求45的方法，其中第二熱激蛋白制劑表現(xiàn)所述癌細(xì)胞的免疫原性。
50.權(quán)利要求45的方法，其中第一熱激蛋白制劑不表現(xiàn)所述癌細(xì)胞的免疫原性。
51.權(quán)利要求45的方法，其中第二熱激蛋白制劑不表現(xiàn)所述癌細(xì)胞的免疫原性。
52.一種治療或預(yù)防個(gè)體中神經(jīng)變性病癥的方法，所述方法包括如下步驟(a)對(duì)個(gè)體施用識(shí)別所述神經(jīng)變性病癥相關(guān)分子的免疫反應(yīng)劑；和(b)對(duì)個(gè)體施用第一熱激蛋白制劑，所述第一熱激蛋白制劑的量能聯(lián)合步驟(a)和/或(c)在所述個(gè)體中有效誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對(duì)所述分子的免疫反應(yīng)；和(c)對(duì)個(gè)體施用一定量包含活化的抗原呈遞細(xì)胞的組合物，該組合物能有效聯(lián)合步驟(a)和/或(b)從而在所述個(gè)體中誘導(dǎo)或增強(qiáng)針對(duì)所述分子的免疫反應(yīng)，其中已通過將抗原呈遞細(xì)胞與第二熱激蛋白制劑接觸而將抗原呈遞細(xì)胞活化，由此在個(gè)體中產(chǎn)生針對(duì)所述分子的免疫反應(yīng)。
53.權(quán)利要求52的方法，其中第一和第二熱激蛋白制劑不表現(xiàn)所述分子的免疫原性。
54.權(quán)利要求52的方法，其中第一和第二熱激蛋白制劑表現(xiàn)所述分子的免疫原性。
55.權(quán)利要求52的方法，其中第一熱激蛋白制劑表現(xiàn)所述分子的免疫原性。
56.權(quán)利要求52的方法，其中第二熱激蛋白制劑表現(xiàn)所述分子的免疫原性。
57.權(quán)利要求52的方法，其中第一熱激蛋白制劑不表現(xiàn)所述分子的免疫原性。
58.權(quán)利要求52的方法，其中第二熱激蛋白制劑不表現(xiàn)所述分子的免疫原性。
59.包含純化的HSP制劑和一種或多種純化的免疫反應(yīng)劑的組合物。
60.權(quán)利要求60的組合物，其還包括活化的APC。
61.權(quán)利要求60的組合物，其中所述組合物增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞功能。
62.一種藥盒，其包括(a)包含純化的熱激蛋白制劑的第一容器，所述純化的熱激蛋白制劑的量能夠有效增強(qiáng)由免疫反應(yīng)劑引發(fā)的免疫反應(yīng)，所述免疫反應(yīng)針對(duì)免疫反應(yīng)劑中需要針對(duì)其產(chǎn)生免疫反應(yīng)的組分；和(b)包含免疫反應(yīng)劑的第二容器，所述免疫反應(yīng)劑為純化形式且其量，在施用(a)的熱激蛋白制劑之前、同時(shí)或之后施用時(shí)，能有效誘導(dǎo)針對(duì)所述組分的免疫反應(yīng)。
63.權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述免疫反應(yīng)劑是預(yù)防性或治療性抗體。
64.權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述免疫反應(yīng)劑是單克隆抗體。
65.權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述免疫反應(yīng)劑是多克隆抗體。
66.權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述免疫反應(yīng)是增強(qiáng)的效應(yīng)細(xì)胞功能。
67.權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述免疫反應(yīng)是增強(qiáng)的細(xì)胞因子釋放。
68.權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述免疫反應(yīng)是增強(qiáng)的針對(duì)具有由所述抗體識(shí)別的表位的細(xì)胞、病原體或蛋白的抗體-依賴性細(xì)胞性細(xì)胞毒性作用或抗體-介導(dǎo)的調(diào)理作用或吞噬作用。
69.權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述熱激蛋白制劑包括選自hsp60、hsp70、hsp90、gp96、鈣網(wǎng)織蛋白或其組合的熱激蛋白。
70.權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述熱激蛋白制劑包括選自hsp60-肽復(fù)合物、hsp70-肽復(fù)合物、hsp90-肽復(fù)合物、gp96-肽復(fù)合物、鈣網(wǎng)織蛋白-肽復(fù)合物或其組合的熱激蛋白-肽復(fù)合物。
71.權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述熱激蛋白制劑包含熱激蛋白-肽復(fù)合物和純化的熱激蛋白。
72.權(quán)利要求26、31、38、45或52的方法，其中所述第一熱激蛋白制劑和第二熱激蛋白制劑各包含選自hsp60、hsp70、hsp90、gp96、鈣網(wǎng)織蛋白或其組合的熱激蛋白。
73.權(quán)利要求26、31、38、45或52的方法，其中所述第一熱激蛋白制劑和第二熱激蛋白制劑各包含選自hsp60-肽復(fù)合物、hsp70-肽復(fù)合物、hsp90-肽復(fù)合物、gp96-肽復(fù)合物、鈣網(wǎng)織蛋白-肽復(fù)合物或其組合的熱激蛋白肽復(fù)合物。
74.權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述個(gè)體為人而所述熱激蛋白制劑包括哺乳動(dòng)物的熱激蛋白。
75.權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中在施用免疫反應(yīng)劑之前施用所述熱激蛋白制劑。
76.權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中在施用免疫反應(yīng)劑的同時(shí)施用所述熱激蛋白制劑。
77.權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中所述熱激蛋白是在施用免疫反應(yīng)劑之后施用的制劑。
78.權(quán)利要求2、8、13、19或38的方法，其中所述感染性疾病由感染因子導(dǎo)致，所述感染因子選自甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、流行性感冒、水痘、腺病毒、I型單純皰疹病毒、II型單純皰疹病毒、牛瘟病毒、鼻病毒、艾柯病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞病毒、乳頭狀瘤病毒、乳多泡病毒、巨細(xì)胞病毒、棘狀病毒、蟲媒病毒、漢坦病毒、柯薩奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、I型人免疫缺陷病毒(HIV-I)、II型人免疫缺陷病毒(HIV-II)、分枝桿菌、立克次氏體、支原體、奈瑟菌屬、軍團(tuán)桿菌屬、利什曼原蟲、kokzidioa、錐蟲和衣原體。
79.權(quán)利要求3、9、14、20或45的方法，其中所述癌癥選自纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀上皮細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏腫瘤、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠質(zhì)瘤、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜細(xì)胞瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、白血病，例如急性淋巴細(xì)胞性白血病和急性髓細(xì)胞性白血病(成髓細(xì)胞性白血病、前髓細(xì)胞性白血病、粒單核細(xì)胞白血病、單核細(xì)胞性白血病和紅白血病)、慢性白血病(慢性髓細(xì)胞(粒細(xì)胞)性白血病和慢性淋巴細(xì)胞性白血病)和真性紅細(xì)胞增多癥、淋巴瘤(霍奇金病和非霍奇金病)、多發(fā)性骨髓瘤、特發(fā)性巨球蛋白血和重鏈病。
80.權(quán)利要求5、10、15、21或52的方法，其中神經(jīng)變性疾病選自阿耳茨海默氏病、年齡相關(guān)性認(rèn)知能力喪失、老年癡呆、帕金森氏病、肌萎縮側(cè)索硬化、威爾遜氏病、大腦性癱瘓、進(jìn)行性核上性麻痹、關(guān)島病、露易小體癡呆、朊病毒病、海綿狀腦病、克羅伊茨費(fèi)爾特-雅各布病、多聚谷氨酰胺病、亨延頓氏舞蹈病、強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良、弗里德利希共濟(jì)失調(diào)、共濟(jì)失調(diào)、吉累斯·德拉圖雷特氏綜合征、癲癇發(fā)作病癥、癲癇、慢性癲癇發(fā)作病癥、中風(fēng)、腦外傷、脊髓創(chuàng)傷、AIDS癡呆、酒精中毒、孤獨(dú)癥、視網(wǎng)膜缺血、青光眼、自主功能病癥、高血壓、神經(jīng)精神病癥、神經(jīng)分裂癥或情感分裂性精神障礙。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療任何疾病的方法和藥物組合物，其中所述疾病的治療可以被增強(qiáng)的免疫反應(yīng)改善，例如感染性疾病、原發(fā)性腫瘤性疾病和轉(zhuǎn)移性腫瘤性疾病(即，癌癥)或神經(jīng)變性疾病或淀粉樣蛋白病。特別地，本發(fā)明涉及包括熱激/應(yīng)激蛋白(HSP)或HSP復(fù)合物單獨(dú)或彼此組合施用，聯(lián)合免疫反應(yīng)劑的施用的方法。本發(fā)明還提供了包含一種或多種HSP或HSP復(fù)合物聯(lián)合免疫反應(yīng)劑的藥物組合物。此外，本發(fā)明涉及本發(fā)明的方法和組合物用于增強(qiáng)或改善被動(dòng)免疫療法和效應(yīng)細(xì)胞功能的用途。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1665533SQ03815669
公開日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2003年5月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月2日
發(fā)明者P·K·斯里瓦斯塔瓦 申請(qǐng)人:康涅狄格大學(xué)健康中心