專利名稱：：治療肝炎的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及治療肝炎。
背景技術：
：一氧化碳(CO)氣體在高濃度時是有毒的。然而，現(xiàn)在認識到它是一種重要的信號分子(Verma等，Science259381-384，1993)。已有提示表明一氧化碳作為腦內(nèi)的神經(jīng)元信使分子(Id.)和下丘腦內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因子起作用(Pozzoli等.，Endocrinology7352314-2317，1994)。和一氧化氮(NO)一樣，一氧化碳是平滑肌的松弛劑(Utz等，BiochemPharmacol.47195-201，1991；Christodoulides等，Circulation972306-9，1995)并且抑制血小板的聚集(Mansouri等，ThrombHaemost.48286-8，1982)。在一些模型中，吸入低水平的一氧化碳顯示具有抗炎效果。肝炎是一種特征為肝的炎癥的疾病。所述炎癥可通過肝小葉的彌漫狀或片狀壞死表征。肝炎的致病因子包括，例如病毒，例如特定的肝炎病毒，例如甲型，乙型，丙型，丁型，戊型和庚型肝炎病毒；酒精；和其它藥物(例如異煙肼(isoniazid)，甲基多巴(methyldopa)，對乙酰氨基酚(acetaminophen)，胺碘酮(amiodarone)和呋喃坦丁(nitrofurantoin)(見TheMerckManualofDiagnosisandTherapy，17版，第42章，第4部分)。發(fā)明簡述本發(fā)明部分基于這樣的發(fā)現(xiàn)給藥CO可阻止肝炎的發(fā)展。相應地，本發(fā)明涉及治療，預防，或降低患者患肝炎風險的方法。所述方法包括鑒定診斷為患有或易患肝炎的患者(例如診斷為患有或易患肝炎的患者)，以及給藥該患者包含有效治療患者的肝炎的量的一氧化碳的藥物組合物。藥物組合物可通過本領域已知的任何將氣體和/或液體給藥患者的方法給藥患者，例如通過吸入，吹入，輸注，注射，和/或攝取。例如，在本發(fā)明的一個實施方案中，所述藥物組合物通過吸入給藥患者。在另一實施方案中，所述藥物組合物通過口服給藥患者。在另一實施方案中，將所述藥物組合物直接給藥患者的腹腔。在另一實施方案中，所述藥物組合物通過體外膜氣體交換裝置(extracorporealmembranegasexchangedevice)或人工肺給藥患者。在另一實施方案中，所述患者是嗜酒者(alcoholic)。所述患者可以是動物，人或非人。例如，所述患者可以是任何哺乳動物，例如人，其它靈長類，豬，嚙齒類例如小鼠和大鼠，兔，豚鼠，倉鼠，母牛，馬，貓，狗，綿羊和山羊。肝炎可以是多種因素的結果，或者人被認為可能由于所述多種因素患上肝炎，所述因素例如，感染(如甲型，乙型，丙型，丁型，戊型和/或庚型肝炎病毒的感染)；飲酒(例如酗酒)；藥物使用(例如一種或多種以下藥物例如對乙酰氨基酚，麻醉藥，抗肺結核藥物，抗真菌劑，抗糖尿病藥物，神經(jīng)抑制藥物，以及用于治療HIV感染和AIDS的藥物)；自身免疫性疾病(例如自身免疫性肝炎)；和/或外科手術。所述藥物組合物可以是任何形式，例如氣體形式或液體形式。在另一實施方案中，所述方法還包括給予所述患者至少以下治療之一在患者體內(nèi)誘導HO-1或鐵蛋白；在患者體內(nèi)表達重組HO-1或鐵蛋白；以及將包含HO-1，膽紅素，膽綠素，鐵蛋白，去鐵鐵蛋白，鐵，去鐵敏(desferoxamine)或鐵葡聚糖的藥物組合物給藥該患者。還涉及CO和上述試劑之一在制備治療或預防肝炎的藥物中的用途。在另一實施方案中，肝炎(或患肝炎的危險性)不是由手術(例如腹部或移植手術)，細菌內(nèi)毒素，敗血癥性休克，和/或系統(tǒng)性感染造成的。另一方面，本發(fā)明涉及治療或預防患者的肝炎的方法，其包括以下步驟鑒定患有或易患肝炎的患者(例如診斷為患有或易患肝炎的患者)，提供包含含有一氧化碳氣體的加壓氣體的容器，將所述加壓氣體從所述容器中釋放出來以形成包含一氧化碳氣體的環(huán)境，以及將所述患者暴露于該環(huán)境，所述環(huán)境中一氧化碳的量足以治療患者的肝炎。本發(fā)明另一方面涉及對患者進行腹部手術例如肝移植的方法，所述方法包括鑒定需要腹部手術(其中所述腹部手術可能導致肝炎)的患者；對所述患者進行腹部手術，并且在進行該步驟前，期間，或以后使所述患者吸入足以降低患者患肝炎的可能性的量的一氧化碳氣體。還涉及CO在制備用于治療或預防肝炎藥物，例如氣體或液體藥物中的用途。本發(fā)明還涉及治療患有或易患不是由手術和/或內(nèi)毒素導致的肝炎(例如由本文所述任何除手術和/或內(nèi)毒素導致的肝炎)的患者的肝炎的方法。所述方法包括鑒定患有或易患不是由手術和/或內(nèi)毒素導致的肝炎的患者，并將包含治療所述患者的肝炎的有效量的一氧化碳的藥物組合物給藥所述患者。本發(fā)明還涉及將誘導肝炎的藥物(例如肝毒性藥物，例如異煙肼，甲基多巴，對乙酰氨基酚，胺碘酮或呋喃坦丁)給藥患者的方法。所述方法包括將所述藥物給藥該患者，并在給藥所述藥物之前，期間或以后將包含治療所述患者的肝炎的有效量的一氧化碳的藥物組合物給藥該患者。另一方面，本發(fā)明提供了包含醫(yī)用級壓縮CO氣體的容器。所述容器帶有表明該氣體可用來治療患者的肝炎的標簽?？蛇x或此外，所述容器還帶有表明該氣體可以和誘導肝炎的藥物(即肝毒性藥物)例如對乙酰氨基酚聯(lián)合給藥患者的標簽。CO氣體可以與氮氣混合，與一氧化氮和氮氣混合，或者與含氧的氣體混合。CO氣體在混合物中的濃度可以是至少約0.025％，例如至少約0.05％，0.10％，0.50％，1.0％，2.0％，10％，50％，或90％。本發(fā)明還涉及CO在制備治療或預防肝炎的藥物中的用途。所述藥物也可根據(jù)本發(fā)明所述的方法用于治療患有或易患肝炎的患者的肝炎的方法中。所述藥物可以是本文所述的任何形式，例如液體或氣體CO組合物。除非另有限定，本文的所有技術和科學術語具有的含義和本發(fā)明所屬領域的熟練技術人員通常所理解的一樣。適宜的方法和材料在下文中描述，但與其類似或?qū)Φ鹊姆椒ê筒牧弦部捎糜诒景l(fā)明的實踐和檢測中。所有公開出版物，專利申請，專利，和其它本文提到的參考文件的全文內(nèi)容都包含在本文中作為參考。如果有沖突，以本說明書，包括其中的定義在內(nèi)為準。所述材料，方法和實施例只作為舉例，而不是意圖作為限制。本發(fā)明的一個或多個實施方案的細節(jié)在以下說明中詳述。本發(fā)明的其它特征，目的，和優(yōu)點從說明書和權利要求書中明顯可見。圖1是柱圖，其顯示誘導HO-1防止小鼠肝細胞由于TNF-α/D-gal的誘導而出現(xiàn)細胞死亡。CoPP＝鈷原卟啉；ALT＝血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；TNF＝腫瘤壞死因子α。結果顯示為6-8只小鼠/組的均值±SD，*P＜0.005。圖2是柱圖，其顯示外源性CO防止肝細胞由于TNF-α的誘導而以cGMP/p38途徑依賴的方式和NF-κB活化依賴的方式出現(xiàn)細胞死亡。CO＝一氧化碳；Air＝室內(nèi)空氣；TNF＝腫瘤壞死因子α；BAY＝BAY11-7082(抑制NF-κB活化)；IκB＝IκBα(阻止NF-κB活化)；ODQ＝1H-(1，2，4)-噁二唑啉并(oxadiazolo)-(4，3-a)喹喔啉(quinoxalin)-1-酮(選擇性鳥苷酸環(huán)化酶抑制物)；Lac-Z＝pIEP-Lac-Z(腺病毒對照)。結果顯示為四次獨立試驗的三個重復孔的均值±SD(*P＜0.01)。圖3是柱圖，顯示外源性CO防止人肝細胞受到TNF-α/放線菌素-D(ActD)誘導而出現(xiàn)細胞死亡。CO＝一氧化碳；Air＝室內(nèi)空氣；TNF＝TNF-α/ActD。結果顯示為三次獨立試驗的重復孔的均值±SD。*P＜0.05。圖4是柱圖，顯示外源性CO導致肝細胞中NF-κB的活化增加。CO＝一氧化碳；Air＝室內(nèi)空氣；BAY＝BAY11-7082；CM＝細胞因子混合物(TNF-α(500U/ml)，IL-1β(100U/ml)，以及IFN-δ(100U/ml))。結果顯示為三次獨立試驗的重復孔的均值±SE。相對于空氣的*P＜0.001。圖5是聚丙烯酰胺凝膠的圖片，顯示了外源性CO誘導NF-κB核易位以及DNA結合的增加，這是通過電泳位移分析(EMSA)測定的。FP＝游離(free)探針(沒有核蛋白，因此無DNA結合)；TOTAL＝?jīng)]有抗體超位移(supershift)的NFκB帶。圖6A-6C是經(jīng)過免疫染色(以檢測p65的細胞核定位)的原代肝細胞的顯微照相，顯示了外源性CO導致肝細胞中NF-κB的活化增加。圖6A暴露于空氣的肝細胞。圖6B暴露于細胞因子混合物(TNF-α(500U/ml)，IL-1β(100U/ml)，以及IFN-δ(100U/ml))的肝細胞。圖6C暴露于CO的肝細胞。圖像代表6個不同的視野。柱表示10μm。圖7是柱圖，顯示外源性CO誘導的對肝細胞的保護與NF-κB依賴的iNOS表達有關。CO＝一氧化碳；Air＝室內(nèi)空氣；BAY＝BAY11-7082；CM＝細胞因子混合物。顯示的結果是來自四次獨立試驗的三個重復孔的平均值±SE。相對于空氣和空氣/BAY處理的細胞而言，*P＜0.001。圖8是Western印跡的圖，顯示與單獨暴露于TNF-α相比，在CO存在下將肝細胞暴露于TNF-α，所述肝細胞中iNOS蛋白的表達明顯升高。iNOS＝可誘導的一氧化氮合酶；CO＝一氧化碳；Air＝室內(nèi)空氣；TNF＝TNF-α/ActD；β-肌動蛋白＝對照蛋白。所述免疫印跡代表三次獨立試驗。圖9是柱圖，顯示iNOS活性缺陷的小鼠(inos-/-)的肝細胞不受到CO針對TNF-α誘導的細胞死亡的保護。CO＝一氧化碳；Air＝室內(nèi)空氣；TNF＝TNF-α/ActD；inos-/-＝iNOS剔除小鼠；L-NIO＝L-N5-(1-亞氨基乙基)鳥氨酸-2HCl。結果顯示為四次獨立試驗的三個重復孔的平均值±SE。相對于非TNF/ActD和CO/TNF/ActD-處理的細胞，*P＜0.01。圖10是柱圖，顯示外源性給予的CO阻止小鼠中TNF-α/D-Gal誘導的肝損傷。ALT＝血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；CO＝一氧化碳；Air＝室內(nèi)空氣。結果表示為18-20只小鼠的均值±SD。相對于空氣處理的細胞，*P＜0.001。圖11A-11H是肝樣品的顯微照相，顯示外源性給予的CO阻止小鼠中TNF-α/D-Gal誘導的肝損傷。圖11A和11B分別將來自小鼠的肝樣品暴露于室內(nèi)空氣和CO，并用蘇木精(haematoxylin)和伊紅(H&E)染色。圖11C和11D將TNF-α/D-Gal處理后小鼠的肝樣品分別暴露于室內(nèi)空氣和CO，并用H&E染色。圖11E和11F將TNF-α/D-Gal處理后小鼠的肝樣品分別暴露于室內(nèi)空氣和CO，并對其染色以檢測活化的capase-3。圖11G和11H將TNF-α/D-Gal處理后小鼠的肝樣品分別暴露于室內(nèi)空氣和CO，且用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)進行染色。所示圖像是來自每組4只小鼠個體的15-20個切片/肝中的代表性切片。柱表示20μm。圖12是Western印跡的圖，顯示暴露于TNF-α/D-Gal并用吸入CO處理的小鼠的肝顯示iNOS蛋白水平增加。野生型＝野生型小鼠；iNOS-/-＝iNOS缺陷的小鼠；CO＝一氧化碳；Air＝室內(nèi)空氣；TNF＝TNF-α/D-Gal；β-肌動蛋白＝對照蛋白。圖13A-13D是肝樣品的顯微照相，顯示暴露于TNF-α/D-Gal并用吸入CO處理的小鼠的肝顯示iNOS蛋白水平增加。圖13A暴露于空氣的小鼠的肝樣品。圖13B暴露于CO的小鼠的肝樣品。圖13C暴露于TNF-α/D-Gal和室內(nèi)空氣的小鼠的肝樣品。圖13D暴露于TNF-α/D-Gal和CO的小鼠的肝樣品。圖中所示為6只獨立動物和6-10個不同的切片/肝樣品的的代表性結果。柱表示20μm。圖14是柱圖，顯示CO在缺乏iNOS功能/表達時對肝損害沒有保護作用。L-NIL＝L-N6(1-亞氨基乙基)-賴氨酸-二氫氯化物(iNOS的選擇性抑制物)；CO＝一氧化碳；Air＝室內(nèi)空氣；TNF＝TNF-α/D-Gal。結果顯示為6-8只動物/組的均值±SD。相對于CO/TNF-α/D-Gal以及空氣和CO對照，*P＜0.01。圖15是Western印跡的圖，表明CO處理的小鼠的肝在存在或缺失TNF-α/D-Gal時均顯示HO-1的表達增加。CO＝一氧化碳；Air＝室內(nèi)空氣；TNF＝TNF-α/D-Gal；β-肌動蛋白＝對照蛋白。印跡是兩個獨立試驗的代表性結果。圖16是Western印跡的圖，表明如果用L-NIL抑制iNOS，CO處理的小鼠的肝在存在或缺失TNF-α/D-Gal時均顯示HO-1的表達增加。CO＝一氧化碳；Air＝室內(nèi)空氣；TNF＝TNF-α/D-Gal；β-肌動蛋白＝對照蛋白；L-NIL＝L-N6(1-亞氨基乙基)-賴氨酸-二氫氯化物(iNOS的選擇性抑制物)。印跡是兩個獨立試驗的代表性結果。圖17是柱圖，顯示CO誘導的HO-1阻止小鼠中TNF-α誘導的肝損傷。ALT＝血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；Air＝室內(nèi)空氣；TNF＝TNF-α/D-Gal；Sn＝錫原卟啉(HO-1的抑制物)；VP＝V-PYRRO(氧化氮供體)。結果表示為8-10只小鼠/組的均值±SD。相對于CO/TNF/D-Gal處理的小鼠，*P＜0.05。圖18是柱圖，顯示HO-1的誘導防止不依賴于iNOS活性的TNF-α誘導的肝損害。ALT＝血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；Air＝室內(nèi)空氣；TNF＝TNF-α/D-Gal；L-NIL＝L-N6(1-亞氨基乙基)-賴氨酸-二氫氯化物(iNOS的選擇性抑制物)；CoPP＝鈷原卟啉(HO-1的誘導物)；iNOS-/-＝iNOS缺陷的小鼠。結果顯示為6-8只小鼠/組的均值±SD。相對于Air/TNF和L-NIL/TNF，*P＜0.001。圖19是柱圖，顯示HO-1的表達是CO誘導的保護作用(防止小鼠肝細胞由于TNF-α/D-gal的誘導而出現(xiàn)細胞死亡)所需的。野生型(黑柱)＝從野生型C57BL/6J小鼠分離的肝細胞；homx-l-/-(白柱)＝從HO-1裸鼠中分離的肝細胞；CO＝一氧化碳；Air＝室內(nèi)空氣；TNF-α＝TNF-α/ActD。相對于CO處理過的非TNF-α/ActD處理的細胞和TNF-α/D-Gal處理的細胞，*P＜0.01。圖20是柱圖，顯示顯示HO-1的表達是CO誘導的保護作用(防止小鼠肝細胞由于TNF-α/ActD的誘導而出現(xiàn)細胞死亡)所需的。野生型(黑柱)＝從野生型C57BL/6J小鼠分離的肝細胞；homx-l-/-(白柱)＝從HO-1裸鼠中分離的肝細胞；SNAP＝另(s)-亞硝基-N-乙酰基-青霉胺(NO供體)；Air＝室內(nèi)空氣；TNF＝TNF-α/ActD。相對于非TNF-α/ActD處理的細胞和TNF-α/ActD處理也用NO處理過的的細胞，*P＜0.01。圖21是柱圖，顯示暴露于CO的小鼠不受對乙酰氨基酚誘導的肝損傷。ALT＝血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；Air＝室內(nèi)空氣；APAP＝對乙酰氨基酚。結果顯示為4-8只小鼠/組的均值±SD。
發(fā)明內(nèi)容本文術語“一氧化碳”(或“CO”)描述了氣態(tài)的，加壓成液態(tài)的，或者溶解于水溶液中的分子一氧化碳。本說明書術語“一氧化碳組合物″或“包含一氧化碳的藥物組合物”用于描述可給藥患者和/或器官例如肝的、含有一氧化碳的氣體或液體組合物。熟練醫(yī)師(practioner)知道在具體應用中，優(yōu)選何種形式的藥物組合物，例如氣體，液體，或氣體和液體的形式。本文術語“有效量”和“有效地治療”指一段時間內(nèi)(包括急性或慢性給藥以及定期的或連續(xù)的給藥)給藥一定量或濃度的一氧化碳，所述量或濃度在其給藥用來產(chǎn)生目的效果或生理結果的背景下是有效的。本發(fā)明所用有效量的一氧化碳包括例如預防肝炎，降低患肝炎的可能性，減輕肝炎癥狀，或者改善其它肝炎治療的效果的量。在氣體的情況下，有效量的CO通常在約0.0000001％到約0.3％重量之間，例如0.0001％到約0.25％重量，優(yōu)選CO重量至少約0.001％，例如至少0.005％，0.010％，0.02％，0.025％，0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.08％，0.10％，0.15％，0.20％，0.22％，或0.24％重量。優(yōu)選的范圍包括，例如0.001％到約0.24％，約0.005％到約0.22％，約0.005％到約0.05％，約0.010％到約0.20％，約0.02％到約0.15％，約0.025％到約0.10％，或約0.03％到約0.08％，或約0.04％到約0.06％。優(yōu)選的在CO溶液的情況下，有效量通常在約0.0001到約0.0044gCO/100g溶液，例如至少0.0001，0.0002，0.0004，0.0006，0.0008，0.0010，0.0013，0.0014，0.0015，0.0016，0.0018，0.0020，0.0021，0.0022，0.0024，0.0026，0.0028，0.0030，0.0032，0.0035，0.0037，0.0040，或0.0042gCO/100g水溶液。優(yōu)選的范圍包括，例如約0.0010到約0.0030gCO/100g液體，約0.0015到約0.0026gCO/100g液體，或者約0.0018到約0.0024gCO/100g液體。熟練的醫(yī)師應理解根據(jù)應用的情況可使用這些范圍外的量。本說明書所用術語“患者”描述根據(jù)本發(fā)明提供的方法對其進行治療的動物，人或非人。本發(fā)明涉及獸醫(yī)學應用。該術語包括但不限于哺乳動物，例如人，其它靈長類，豬，嚙齒類例如小鼠和大鼠，兔子，豚鼠，倉鼠，牛，馬，貓，狗，綿羊和山羊。本文術語“治療”是指延緩患者病情的發(fā)生，抑制，預防或緩解患者疾病(例如肝炎)的影響。本文術語“肝炎”是本領域已知的術語，在文中指患者以肝炎癥為部分特征的疾病。肝炎的致病因子包括，例如感染，如具體肝炎病毒的感染，如甲型，乙型，丙型，丁型，戊型和庚型肝炎病毒的感染；或肝毒性制劑，例如肝毒性藥物(例如，異煙肼，甲基多巴，對乙酰氨基酚，胺碘酮，和呋喃坦丁)，和毒素(例如內(nèi)毒素或環(huán)境毒素)。肝炎可見于在手術后的肝移植患者。其它可導致肝炎的藥物和毒素(即，肝毒性制劑)的實例見FeldmanSleisenger&Gordtran’sGastrointestinalandLiverDisease，第七版，的17章(LiverDiseasesCausedbyDrugs，Anesthetics，andToxins)所述，其全部內(nèi)容包含在文中作為參考。這種實例包括，但不限于，甲基多巴和苯妥英，巴比妥類，例如苯巴比妥；磺胺類(例如組合藥物如復方新諾明(磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole)和甲氧芐啶(trimethoprim))；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；水楊酸類(salicylates)；雙硫醒(disulfiram)；β-腎上腺能阻滯劑，例如，醋丁洛爾(acebutolol)，拉貝洛爾(labetalol)和美托洛爾(metoprolol))；鈣通道阻滯劑，例如硝苯地平(nifedipine)，維拉帕米(verapamil)和地爾硫(diltiazem)；合成類視黃醛(retinoids)，例如依曲替酯(etretinate)；胃酸抑制藥，例如，奧美替丁(oxmetidine)，乙溴替丁(ebrotidine)，西咪替丁(cimetidine)，雷尼替丁(ranitidine)，奧美拉唑(omeprazole)和法莫替丁(famotidine)，紐柯春(leukotriene)受體拮抗劑，例如扎魯斯特(zafirlukast)；抗肺結核藥物，例如利福平和吡嗪酰胺；抗真菌劑，例如酮康唑，特比奈酚，氟康唑，和伊曲康唑；抗糖尿病藥物，例如噻唑烷二酮類(thiazolidinediones)，例如曲格列酮和羅格列酮；用于治療神經(jīng)疾病的藥物，例如神經(jīng)抑制藥物(neurlepticagents)，抗抑郁藥(例如氟西汀(fluoxetine)，帕羅西汀(paroxetine)，萬拉法新(venlafaxine)，曲唑酮(trazodone)，托卡朋(tolcapone)，和奈法唑酮(nefazodone)，安眠藥(例如阿吡坦(alpidem)，唑吡坦(zolpidem)，和本他西泮(bentazepam))，以及其它藥物，例如單滿吖啶氨(tacrine)，硝苯呋海因(dantrolene)，利魯唑(riluzole)，替扎尼啶(tizanidine)和雙苯丙乙胺(alverine)；非類固醇類抗炎藥，例如溴芬那酸(bromfenac)；COX-2抑制物；醋酸環(huán)丙孕酮酯(cyproteroneacetate)；來氟諾米(leflunomide)；抗病毒劑，例如非阿尿苷(fialuridine)，地達諾新(didanosine)，扎西他賓(zalcitabine)，司他夫定(stavudine)，拉米夫定(lamivudine)，齊多夫定(zidovudine)，阿波卡韋(abacavir)；抗癌藥，例如他莫昔芬和甲胺蝶呤，毒品(recreationaldrug)，例如可卡因，苯環(huán)利定(phencyclidine)，和5-甲氧基-3，4-亞甲基二氧脫氧麻黃堿(methylenedioxymethamphetamine)；L-天冬酰胺酶；阿莫地喹(amodiaquine)；海蒽酮(hycanthone)；麻醉劑；例如氟烷(halothane)，安氟醚(enflurane)和異氟醚(isoflurane)；維生素，例如維生素A；以及飲食和/或環(huán)境毒素，例如吡咯烷士啶生物堿(pyrrolizidinealkaloids)，來自毒鵝膏菌(Amanitaphalloides)或其它毒蘑菇的毒素，黃曲霉素(aflatoxin)，砷(arsenic)，Bordeaux混合物(銅鹽和石灰)，氯乙烯單體(vinylchloridemonomer)，四氯化碳(carbontetrachloride)，鈹(beryllium)，二甲基甲酰胺(dimethylformamide)，二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine)，methylenedianiline，磷，十氯酮(chlordecone)(Kepone)，2，3，7，8-四氯-二苯并(dibenzo)p-二氧(雜)芑(dioxin)(TCDD)，四氯乙烷，四氯乙烯，2，4，5-三硝基甲苯，1，1，1-三氯乙烷，甲苯和二甲苯，以及已知的“草藥”，例如麻黃素和丁香油酚(eugenol)。肝炎的癥狀包括疲勞，食欲不良，胃不適，和/或黃疸(皮膚和/或眼睛發(fā)黃)。對肝炎更詳細的描述見，例如TheMerckManualofDiagnosisandTherapy，17版，第42章，第4部分，第44章，第4部分，第40章，和第4部分，其全部內(nèi)容包含在本文中作為參考。熟練醫(yī)師應理解，醫(yī)師可通過本領域已知的任何方法診斷患者患有肝炎，例如通過，用例如血液檢驗中的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平，堿性磷酸酶(AP)水平，和膽紅素水平來評估肝功能。認為可能出現(xiàn)肝炎的個體尤其可從本發(fā)明受益，主要是因為在出現(xiàn)任何肝炎的證據(jù)以前，就可以開始預防性治療。“易患”的個體包括，例如被肝炎病毒感染的患者，或者患有本文所述任何疾病和具有本文所述的危險因素的個體(例如暴露于肝毒性藥物的患者)。熟練的醫(yī)師應理解通過醫(yī)師的診斷可確定患者易患肝炎。在所述患者被診斷為患有肝炎或與肝炎相關的任何疾病，或者被診斷為具有任何與該患者患肝炎的可能性增加相關的危險因素(例如所述患者近期已經(jīng)，正在，或即將暴露于肝毒性制劑，例如肝毒性藥物如對乙酰氨基酚)的當天，將治療肝炎有效量的CO給藥該患者?；颊呖晌氲腃O的濃度可以從10ppm到1000ppm，例如，約100ppm到約800ppm，約150ppm到約600ppm，或約200ppm到約500ppm。優(yōu)選的濃度包括，例如，約30ppm，50ppm，75ppm，100ppm，125ppm，200ppm，250ppm，500ppm，750ppm，或約1000ppm。可將一氧化碳間斷或連續(xù)給藥患者?？山o藥CO約1，2，4，6，8，10，12，14，18或20天，或者20天以上，例如1，2，3，5或6個月，或者直到所述患者被診斷為不再易患肝炎。在給定的天數(shù)內(nèi)，CO可全天連續(xù)給藥，或者間斷給藥，例如每天吸入CO一次(使用高濃度CO)，或者每天吸入達23小時，例如達20，15，12，10，6，3或2小時每天，或達1小時每天。如果所述患者需要用肝毒性藥物(例如因醫(yī)師處方所開)進行治療，所述患者可以在給藥所述藥物之前，期間和/或以后用CO(例如氣體CO組合物)進行治療。例如，可將CO間斷或連續(xù)地給藥所述患者，從給藥所述藥物前0到20天即開始(且當給藥多種藥劑時，在各單獨藥劑以前)，例如開始于所述給藥前至少約30分鐘，例如約1，2，3，5，7或10小時，或約1，2，4，6，8，10，12，14，18或20天，或者20天以上?？蛇x或此外，可在給藥所述藥物的同時將CO給藥所述患者。可選或此外，可在給藥所述藥物后將CO給藥所述患者，例如在所述給藥后立刻開始，并繼續(xù)間斷性或持續(xù)給藥1，2，3，5，7或10小時，或約1，2，5，8，10，20，30，50或60天，不定期地，或者直到醫(yī)師確定不再需要給藥CO(例如當所述肝毒性藥物從身體中消除或者不再對肝造成損害)。制備氣體組合物CO組合物可以是氣體一氧化碳組合物?？捎糜诒景l(fā)明的方法中的壓縮氣體(compressedgas)或加壓氣體(pressurizedgas)，可自任何商業(yè)來源獲得，并可存在于任何類型的適合保存壓縮氣體的容器(vessel)中。例如，壓縮或加壓氣體可以自任何提供醫(yī)用壓縮氣體例如氧氣的來源獲得。本文術語“醫(yī)用級”氣體，指適合給藥本文所定義的患者的氣體。提供用于本發(fā)明的方法的包括一氧化碳的加壓氣體時，可使得所需的最終組合物中的所有氣體(例如，CO，He，NO，CO2，O2，N2)在同一容器內(nèi)，除NO和O2不能保存在一起的情況?？蛇x的，本發(fā)明的方法可使用多個含有單一氣體的容器進行。例如，可提供含或不含其它氣體的含一氧化碳的單個容器，其內(nèi)容物可選地與室內(nèi)空氣或其它容器中的內(nèi)容物混合，所述其它容器例如含有氧氣，氮氣，二氧化碳，壓縮空氣，或任何其它適合的氣體或其混合物的容器。根據(jù)本發(fā)明給藥患者的氣體組合物通常含有0％到約79％重量的氮氣，約21％到約100％重量的氧氣和約0.0000001％到約0.3％重量(相當于約1ppb或0.001ppm到約3,000ppm)的CO。優(yōu)選氣體組合物中氮氣量是約79％重量，氧氣量是約21％重量，且CO量是約0.0001％到約0.25％重量。CO的量優(yōu)選是至少約0.001％，例如，至少約0.005％，0.010％，0.02％，0.025％，0.03％，0.04％，0.05％，0.06％，0.08％，0.10％，0.15％，0.20％，0.22％，或0.24％重量。CO的優(yōu)選范圍包括約0.005％到約0.24％，約0.01％到約0.22％，約0.015％到約0.20％，約0.08％到約0.20％，和約0.025％到約0.1％重量。注意到根據(jù)應用情況，可短期(例如一次或數(shù)次呼吸)使用具有高于0.3％(例如1％或更高)的CO濃度的氣體CO組合物?？捎脷怏wCO組合物產(chǎn)生包含CO氣體的環(huán)境(atmosphere)。包含適當水平的CO氣體的環(huán)境可通過例如以下方式產(chǎn)生提供含有包含CO氣體的加壓空氣的容器，并將所述加壓氣體從所述容器中釋放到小室(chamber)或空間內(nèi)，在該小室或空間內(nèi)形成包括CO氣體的環(huán)境?？蛇x地，所述氣體可被釋放到使該氣體在呼吸面罩或呼吸管內(nèi)達到最高濃度的一種儀器中，從而在呼吸面罩或呼吸管中創(chuàng)造出包含CO氣體的環(huán)境，使得患者成為該室內(nèi)唯一暴露于明顯水平的CO的人。環(huán)境中CO的水平可通過本領域已知的任何方法檢測或監(jiān)測。這種方法包括電化學檢測，氣相色譜，放射性同位素計數(shù)，紅外吸收，比色法，和基于選擇性膜的電化學方法(見例如Sunderman等，Clin.Chem.282026-2032，1982；Ingi等，Neuron16835-842，1996)。亞百萬分數(shù)級(sub-partspermillion)CO水平可通過例如，氣相色譜和放射性同位素計數(shù)檢測。此外，本領域已知亞-ppm范圍內(nèi)的CO水平可通過中紅外氣體傳感器(midinfraredgassensor)在生物組織中檢測(見例如，Morimoto等，Am.J.Physiol.Heart.Circ.Physiol280H482-H488，2001)。CO傳感器和氣體檢測儀可自多種商業(yè)來源獲得。制備液體組合物CO藥物組合物也可以是液體CO組合物。液體可通過本領域已知的任何使氣體溶于液體的方法制成CO組合物。例如，所述液體可以置于所謂的“CO2溫育箱”中并暴露于持續(xù)的CO氣流，優(yōu)選由二氧化碳平衡，直到液體中CO達到所需的濃度。另一實施例中，CO氣體可直接″吹入(bubbled)″液體中，直到液體中CO達到所需的濃度。溶解于給定水溶液中的CO量隨溫度的降低而增加。在另一實施例中，適宜的液體可流經(jīng)允許氣體擴散的管道系統(tǒng)(tubing)，該管道系統(tǒng)在包含CO的環(huán)境(例如利用如體外膜氧合器(extracorporealmembraneoxygenator)的儀器)中運行。CO擴散進入液體產(chǎn)生液體CO組合物。很可能地，這種用于引入活動物體內(nèi)的液體組合物，當其被引入動物體內(nèi)時，溫度為或約為37℃。液體可以是本領域熟練技術人員已知的任何適合給藥患者的液體(參見，例如OxfordTextbookofSurgery，Morris和Malt編，OxfordUniversityPress(1994))。通常，所述液體是水溶液。溶液的實例包括磷酸鹽緩沖的鹽水溶液(PBS)，CelsiorTM，PerfadexTM，柯林斯(Collins)溶液，檸檬酸鹽溶液，和成斯康星大學(UniversityofWisconsin)(UW)溶液(OxfordTextbookofSurgery，Morris和Malt編，OxfordUniversityPress(1994))。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述液體是林格氏液(Ringer′ssolution)，例如，乳酸鹽林格氏溶液，或任何可輸注入患者體內(nèi)的其它液體。在另一實施方案中，液體包括血液，例如全血。任何適合的液體可通過氣體擴散器飽和到設定的CO濃度?？蛇x地，可用經(jīng)質(zhì)量控制含有給定水平的CO的預制溶液?？赏ㄟ^使用帶有與CO分析儀連接的透氣但不透液的膜的儀器進行測定來對劑量進行精確控制。可將溶液飽和到所需有效濃度并保持在這些水平。用CO組合物治療患者可用本領域已知的任何將氣體和/或液體給藥患者的方法使用一氧化碳組合物治療患者。一氧化碳組合物可給藥診斷為，或者確定易患肝炎的患者。本發(fā)明還涉及將液體或氣體一氧化碳系統(tǒng)地給藥患者(例如通過吸入和/或攝取)，以及將所述組合物局部地給藥患者的肝(例如通過導入腹腔)。系統(tǒng)地遞送CO氣體CO組合物可系統(tǒng)地遞送給患者，例如診斷為，或者確定易患肝炎的患者。氣體CO組合物通常通過嘴或鼻道吸入肺內(nèi)給藥，在肺內(nèi)CO很容易地被吸收到患者的血流內(nèi)。治療性氣體組合物中所用活性化合物(CO)的濃度有賴于CO的吸收，分布，滅活和排出(通常通過呼吸)速率以及本領域熟練技術人員已知的其它因素。還應理解，對于任何具體受試者而言，具體的劑量方案應根據(jù)個體需要和實施或監(jiān)督組合物給藥的人員的職業(yè)判斷隨時間進行調(diào)整，而且前述的濃度范圍只是示例性的，而不是為限制所要求的組合物的范圍或?qū)嵺`?？杀O(jiān)控治療并調(diào)整CO劑量來確保對患者的最適治療。本發(fā)明還涉及CO的急性，亞急性和慢性給藥，所述給藥方式有賴于例如患者肝炎的嚴重性或持續(xù)性。CO可在足以治療病情并顯示預期藥理學或生物學效應的一段時間內(nèi)(包括不定時地給藥)遞送給患者。以下是一些可用于對患者給藥氣體CO組合物的方法和器械的實例。呼吸機(ventilator)可購買醫(yī)用級CO(可有多種濃度)，所述CO與空氣或其它含有氧氣的氣體混合于加壓氣體標準罐中(例如，21％O2，79％N2)。所述氣體為非反應活性(non-reactive)的，而本發(fā)明方法所需濃度遠遠低于可燃范圍(空氣中10％)。在醫(yī)院中，推定要將氣體遞送到床邊，在那里使之與氧氣或室內(nèi)空氣在混合器(blender)內(nèi)混合，達到所需的ppm濃度(百萬分之幾)?；颊咄ㄟ^呼吸機吸入氣體混合物，呼吸機的流率根據(jù)患者的舒適程度和需要來設定。通過肺圖(即呼吸速率，潮氣量等)可確定該流率?？蓪⒎乐够颊卟槐匾亟邮艹^所需量的一氧化碳的自動防故障機制(fail-safemechamism)設計在遞送系統(tǒng)中?；颊叩腃O水平可通過研究以下指標進行監(jiān)測(1)靜脈血中可測的碳氧血紅蛋白(COHb)，和，(2)從呼吸機側(cè)部收集的呼出CO?？筛鶕?jù)患者的健康狀況和標志物調(diào)節(jié)CO暴露。如果有必要，還可通過吸入100％的氧氣洗出CO。CO是不被代謝的，因此除很小一部分被轉(zhuǎn)化成CO2，無論吸入多少最后都被呼出。CO可以和任何水平的O2混合，以治療性遞送CO而不導致隨后的低氧狀況。面罩和幕(Tent)含有CO的氣體混合物如上述方法制備，從而允許患者通過面罩或幕被動吸入。吸入濃度可改變，并通過簡單地換成吸入100％的O2進行洗滌?？捎米詣臃拦收蠙C制在面罩或幕或在其附近監(jiān)測CO水平，所述自動防故障機制可防止吸入過高濃度的CO。便攜式吸入器(Portableinhaler)加壓CO可被包裝入便攜式吸入器并吸入經(jīng)過計量的劑量，例如使得不住院的受體接受間歇性治療?？蓪⒉煌瑵舛鹊腃O包裝到容器中。該儀器可簡單到只是帶有開-關閥和管子的含有稀釋CO的小儲罐(例如低于5kg)，從所述管子中，患者可根據(jù)標準方案或需要吸入CO。靜脈內(nèi)人工肺(IntravenousArtificialLung)設計為遞送O2和去除CO2的人工肺(用于血液中氣體交換的導管器械)可用于CO遞送。該導管植入后，定位于一根大靜脈中并可系統(tǒng)性遞送所需濃度的CO或?qū)⑵溥f送到局部位點。所述遞送可以是短時間內(nèi)局部遞送高濃度CO到手術位點例如鄰近肝的局部遞送(所述高濃度在血流中迅速稀釋)，或者相對較長的時間內(nèi)暴露于較低濃度的CO(見例如，Hattler等，Artif.Organs18(11)806-812(1994)；和Golob等，ASAIOJ.，47(5)432-437(2001)).正常氣壓小室(Normobaricchamber)在某些情況下，需要將患者整體暴露于CO?；颊唔毼挥诔錆MCO的密閉艙中，其中CO的水平不會對患者造成危險，或者該水平造成可接受的危險但不會使旁觀者處于被暴露的危險。完成暴露后，用空氣(例如，21％O2，79％N2)充滿該艙，并使用CO分析儀分析樣品，以保證在允許患者離開暴露系統(tǒng)前沒有任何CO存留。系統(tǒng)性遞送液體CO組合物本發(fā)明還涉及，可產(chǎn)生包含CO組合物的水溶液用于系統(tǒng)地遞送給患者，例如從口遞送和/或輸注到患者體內(nèi)，例如通過靜脈內(nèi)，動脈內(nèi)，腹膜內(nèi)和/或皮下。例如，液體CO組合物，如CO飽和的林格氏溶液，它可以輸注給患肝炎或易患肝炎的患者。可選或此外，被CO部分或完全飽和的全(或部分)血可輸注入此患者。本發(fā)明還涉及應用能夠遞送可用的CO氣體組合物或液體CO組合物的劑量的制劑(例如CO釋放性膠，乳膏，軟膏劑，錠劑或膜片)。使用一氧化碳對器官進行局部治療可選或此外，一氧化碳組合物還可直接給藥肝，例如整個肝，或給藥肝的任何部分。氣體組合物可通過本領域已知的將氣體吹入患者的任何方法，直接給藥患者的肝。例如，在腹腔鏡操作中，氣體如二氧化碳通常進入患者的腹腔從而輔助檢查(見例如OxfordTextbookofSurgery，Morris和Malt編，OxfordUniversityPress(1994))。熟練醫(yī)師將理解類似的方法可以用于將一氧化碳組合物直接給藥患者的肝。液體CO組合物也可局部給藥患者的肝。液體形式的組合物可通過本領域已知的任何將液體給藥患者的方法給藥。和氣體組合物一樣，液體組合物可直接給藥肝。液體，例如含有溶解的CO的鹽水溶液，可以在腹腔鏡手術中注入患者的腹腔。熟練醫(yī)師將理解類似的方法可以用于將液體一氧化碳組合物直接給藥患者的肝。此外，原位暴露可以通過使用液體一氧化碳組合物在沖洗肝或其一部分來進行(見例如OxfordTextbookofSurgery，Morris和Malt編，OxfordUniversityPress(1994))。血紅素加氧酶-1，其它化合物以及其它治療在肝炎中的應用本文還涉及隨同一氧化碳的給藥而誘導或表達血紅素加氧酶-1(HO-1)。例如，HO-1可以在患有或易患肝炎的患者體內(nèi)誘導。本文術語“誘導”指用細胞本身編碼蛋白的內(nèi)源性(例如非重組的)基因，造成分離的細胞或組織，器官或動物的細胞中上述蛋白例如HO-1的生成增加。HO-1可通過本領域任何已知的方法在患者體內(nèi)誘導。例如HO-1的產(chǎn)生可通過氯高鐵血紅素(hemin)，鐵原卟啉，或鈷原卟啉誘導。各種非血紅素(non-heme)制劑包括重金屬，細胞因子，激素，一氧化氮，COCl2，內(nèi)毒素和熱休克也強烈誘導HO-1表達(Otterbein等，Am.J.Physiol.LungCellMol.Physiol.279L1029-L1037，2000；Choi等，Am.J.Respir.CellMol.Biol.159-19，1996；Maines，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.37517-554，1997；和Tenhunen等，J.Lab.Clin.Med.75410-421，1970)。多種導致氧化物應激的制劑和條件可高度誘導HO-1，所述制劑和條件包括過氧化氫，谷胱甘肽耗竭物，UV輻射和氧過多(Choi等，Am.J.Respir.CellMol.Biol.159-19，1996；Maines，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.37517-554，1997；andKeyse等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8699-103，1989)?！鞍琀O-1誘導物的藥物組合物”指包括任何能夠在患者體內(nèi)誘導HO-1的試劑的藥物組合物，例如任何上述的試劑，例如NO，氯高鐵血紅素，鐵原卟啉，和/或鈷原卟啉。通過基因轉(zhuǎn)移可增加細胞中HO-1的表達。本文術語“表達”指通過外源給藥基因(例如重組基因)造成分離的細胞或組織，器官或動物的細胞中的蛋白生成增多，所述蛋白例如HO-1或鐵蛋白。HO-1或鐵蛋白優(yōu)選是與受體的同一物種的(例如人，小鼠，大鼠等)，從而最小化任何免疫反應?？赏ㄟ^組成型啟動子(例如巨細胞病毒啟動子)或組織特異的啟動子(例如用于哺乳動物細胞的乳清蛋白啟動子或用于肝細胞的白蛋白啟動子)驅(qū)動表達。編碼HO-1或鐵蛋白的適宜基因治療載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺伴隨病毒(AAV)，痘病毒(例如痘苗病毒)，人類免疫缺陷病毒(HIV)，小鼠極小病毒(minutevirusofmice)，乙型肝炎病毒，流感病毒，單純皰疹病毒-1型，和慢病毒)可通過口服，吸入或注入肝來給藥患有或易患肝炎的患者。類似的，編碼HO-1或去鐵鐵蛋白的質(zhì)粒載體可作為例如裸露的DNA的形式，位于脂質(zhì)體中的形式，或位于微顆粒中的形式給藥。此外，外源性HO-1蛋白可通過本領域已知的任何方法直接給藥患者。外源性HO-1可直接給藥，作為上述在患者體內(nèi)誘導或表達HO-1的方法的補充或替換。所述HO-1蛋白可在脂質(zhì)體內(nèi)，和/或作為融合蛋白例如TAT融合蛋白(見例如，Becker-Hapak等，Methods24247-256，2001)的形式遞送患者?？蛇x或此外，HO-1的任何代謝產(chǎn)物例如膽紅素，膽綠素，鐵，和/或鐵蛋白可與一氧化碳聯(lián)合給藥患者，以防止或治療肝炎。此外，本發(fā)明涉及將除鐵蛋白以外的鐵結合分子，例如去鐵敏(desferoxamine)(DFO)，鐵右旋糖苷，和/或去鐵鐵蛋白，給藥患者。本發(fā)明還涉及可抑制催化任何這些產(chǎn)物降解的酶(例如膽綠素還原酶)以創(chuàng)造/增強所需的效果。上述任何物質(zhì)均可給藥，例如經(jīng)口服，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，或直接給藥肝。本發(fā)明的方法中也可以使用在給藥化合物后，將CO釋放到機體的化合物(例如釋放CO的化合物，如光可激活的的釋放CO的化合物)，例如十羰基二錳(dimanganesedecacarbonyl)，三羰基二氯釕(II)二聚體，和二氯甲烷(例如，在400-600mg/kg之間，例如約500mg/kg的劑量)，也可以在本發(fā)明方法中使用碳氧血紅蛋白以及供給CO的血紅蛋白替代物?？梢砸匀魏畏绞浇o藥患者上述任何物質(zhì)，例如通過口服，靜脈內(nèi)，或動脈內(nèi)給藥。上述任何化合物可局部和/或系統(tǒng)地給藥患者，并且可以聯(lián)合給藥。本發(fā)明還涉及通過將CO與任何其它已知治療肝炎的方法或化合物聯(lián)合給藥所述患者來治療/預防肝炎，停止或減少給藥致病藥物；將皮質(zhì)類固醇類和/或α-干擾素或其它抗病毒制劑給藥所述患者；和/或?qū)颊哌M行手術，例如肝移植。以下實施例說明了本發(fā)明的一部分，所述實施例不應理解為從任何方面限制本發(fā)明。實施例1一氧化碳減弱肝損害動物雄性C57BL/6J(CharlesRiversLaboratories，BarHarbor，ME)，8-12周大小的inos-/-小鼠和野生型同窩幼仔(在Pittisburgh大學喂養(yǎng)/寄存)用于體內(nèi)試驗中。急性肝炎損傷模型將TNF-α/D-gal(分別為0.3μg/8mg/小鼠，腹膜內(nèi))給藥多組小鼠。根據(jù)試驗條件，一些小鼠接受CO(250ppm)，選擇性NO供體O2-乙烯基1-(吡咯啶-1-基)二氮烯-1-鎓-1，2-diolate(O2-vinyl1-(pyrrolidin-1-yl)diazen-1-ium-1，2-diolate)(V-PYRRO；10mg/kg皮下注射(s.c.)，AlexisBiochem.，SanDiego，CA)或鈷原卟啉(CoPP，5mg/kg，腹膜內(nèi)(i.p.)，F(xiàn)rontierScientific，Logan，UT)。此外，必要時，給藥iNOSL-N6-(1-亞氨基乙基)-賴氨酸-二氫氯化物(L-NIL；5mg/kg，腹膜內(nèi)，AlexisBiochemicals)或HO-1抑制物錫原卟啉(Snpp；50μmol/kg，腹膜內(nèi)，F(xiàn)rontierScientific)。必要時，給藥(500mg/kg，腹膜內(nèi))對乙酰氨基酚(SigmaChem.Co.；StLouis，MO)。肝細胞培養(yǎng)小鼠原代肝細胞獲自C57BL/6J，mmk3-/-，inos-/-(圈養(yǎng)群)或hmox-l-/-小鼠，如Kim等所述(J.Biol.Chem.2721402-1411(1997))。收獲后1-3天使用肝細胞。誘導肝細胞死亡/凋亡細胞用TNF-α(10ng/ml)和放線菌素-D(Act-D；200ng/ml，SigmaChemicalCo.St.Louis，MO)處理以誘導細胞死亡。TNF-α/ActD處理已經(jīng)顯示在原代肝細胞中可誘導細胞死亡，尤其是凋亡(見，例如Kim等(J.Biol.Chem.2721402-1411(1997))。使用CO，NO供體另(s)-亞硝基-N-乙?；?青霉胺(SNAP；250-750μM)和/或其它指定的藥劑來處理肝細胞。TNF-α/ActD處理12小時后，洗滌細胞，并用結晶紫染色，以如前述(Id.)測定細胞生存力。必要時，給藥iNOS的選擇性體外抑制物，L-N5-(1-亞氨基乙基)鳥氨酸-2HCl(LNIO；1-2mM；Calbiochem，SanDiego，CA)?；蜣D(zhuǎn)移/質(zhì)粒在一些實驗中，利用腺病毒載體(10pfu/細胞)對IκBα抑制物(Hellerbrand等，Hepatology，271285-1295(1998))或β-半乳糖苷酶進行基因轉(zhuǎn)移是在TNF-α/ActD處理前12小時。NF-κB活化利用螢光素酶報道物分析評估，如Chow等所述(J.Biol.Chem.27410689-10692(1999))。簡而言之，按產(chǎn)品說明，利用LipofectinTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)將肝細胞用NF-κB受體構建體(pGL3-kappaβ螢光素酶，100ng/孔；和pIEP-Lac-z0.5μg/孔)共轉(zhuǎn)染。利用螢光素酶報道物分析(reporterassay)進行iNOS表達的評估，如Lowenstein等所述(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A909730-9734(1993))。簡言之，如上述將肝細胞用iNOS啟動子報道物構建體(pXP2；1μg/孔)和pIEP-LacZ(0.5μg/孔)進行共轉(zhuǎn)染。螢光素酶報道物分析如上述用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝細胞，并在轉(zhuǎn)染后24小時使用各種刺激對其進行處理。螢光素酶活性(以任意單位報告，A.U.)在處理起始6小時后，利用螢光素酶分析試劑盒(Promega，Madison，WI)和Berthold發(fā)光計進行測定。結果根據(jù)轉(zhuǎn)染效率和蛋白濃度進行校正。電泳位移分析在處理后從細胞中提取細胞核。使用[δ-32P]-ATP標記雙鏈DNANF-κB共有序列(GGGGACTTTCCC(SEQIDNO1))；SantaCruzBiotechnology，SantaCruz，CA)，并和5mg總核蛋白一同保溫。一些保溫是在抗p65/RelA的抗體或抗p50(SantaCruzBiotech)的抗體存在的條件下進行的，以便評估超位移(supershift)。電泳位移分析(EMSA)如Taylor等(J.Biol.Chem.27315148-15156(1998))所述進行。免疫印跡分析對培養(yǎng)基或肝勻漿物中的原代肝細胞進行Western印跡分析，利用以下物質(zhì)的抗體iNOS(TransductionLaboratories，Lexingtong，Kentucky；1∶1000)，HO-1(Calbiochem，1∶2000)，或β-肌動蛋白(SigmaChemical；1∶5000)。來自細胞培養(yǎng)實驗的30μg蛋白或來自肝勻漿的100μg蛋白上樣各孔中進行SDS-PAGE。組織學/免疫組化為進行組織學和免疫組化分析，將肝固定在2％的多聚甲醛中，并隨后在液氮中迅速冷凍。隨后對肝進行切片(7微米厚)，并用蘇木精和伊紅(H&E)進行染色。肝切片還使用試劑盒(Promega)根據(jù)產(chǎn)品說明進行TUNEL和活化caspase-3染色。用于iNOS免疫組化分析的切片用5％山羊血清(含0.2％牛血清白蛋白)封閉。隨后，將所述切片在室溫和抗iNOS抗體(TransductionLaboratories，1∶300)一起保溫1小時，然后進行洗滌并用二級抗體(與Alexa-488(MolecularProbes，Eugene，OR)偶聯(lián))進行檢測(probe)。細胞核用Hoechst染料染色。利用OlympusProvus顯微鏡獲得圖像。培養(yǎng)物中的肝細胞鋪于凝膠化的蓋玻片上，如需要進行刺激，且隨后在2％的多聚甲醛(含0.1％的TritonX-100)中固定。封閉和染色步驟與對肝切片的相似，只是利用的是抗-p65/RelA抗體(SantaCruzBiotechnology；1∶350)。CO暴露所述動物暴露于CO(濃度250ppm)。簡言之，將空氣中的1％的CO與空氣(含21％氧氣)在不銹鋼圓柱混合器中進行混合，然后以12L/分的流速將混合物導入3.70ft3玻璃暴露小室中。利用CO分析儀(Interscan，Chatsworth，CA)持續(xù)測定所述小室中的CO水平。使CO水平一直保持在250ppm。按需要將小鼠置于暴露小室中。HO-1防止肝損傷研究了HO-1是否防止急性肝衰竭。結果顯示于圖1。將鈷原卟啉(5mg/kg，腹膜內(nèi))給藥雄性C57BL/6J小鼠。24小時后，將TNF-α/D-gal(分別為0.3μg/8mg/小鼠，腹膜內(nèi))給藥小鼠。在給藥TNF-α/D-gal8小時后測定小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平。HO-1的誘導防止肝損傷，如測定的血清ALT水平所示。外源性CO保護肝細胞研究了外源性CO是否在體外防止肝細胞死亡。結果顯示于圖2和圖3。為獲得圖2所示的數(shù)據(jù)，將小鼠肝細胞與CO(250ppm)共同預孵育1小時(所有試驗的標準預處理時間)，然后加入TNF-α/Act-D(分別為10ng/200ng/ml)。在實驗過程中一直將細胞保持在CO中。12小時后，如Kim等所述(J.Biol.Chem.2721402-1411(1997))測定細胞生存力。腺病毒實驗涉及將肝細胞和10pfu/細胞的腺病毒共同保溫過夜，然后加入TNF-α/Act-D，隨后使用結晶紫測定生存力。信號分子鳥苷酸環(huán)化酶和p38MAPK的作用也在該模型中進行研究。為評估cGMP的作用并確定NF-κB的作用，分別用可溶的鳥苷酸環(huán)化酶(sGC)抑制物1H-(1，2，4)噁二唑啉并-(4，3-a)喹喔啉-1-酮(ODQ；Calbiochem；2-10μM)或NF-κB抑制物BAY11-7082(10μM)處理肝細胞。用所述抑制物處理細胞1小時，然后用Co預處理1小時。然后加入TNF-α/ActD并在12小時后測定所述細胞生存力。當cGMP不參與時，NF-κB活化對于CO激發(fā)的保護作用非常重要。暴露于CO導致與沒有暴露于CO相比，細胞死亡明顯減少(*P＜0.01)。為獲得圖3所示的數(shù)據(jù)，將來自供體的切除肝的人原代肝細胞用CO和TNF-α/ActD如上述進行處理。使原代小鼠，大鼠和人肝細胞暴露于CO抑制TNF-α誘導的凋亡。肝細胞凋亡的抑制不依賴于cGMP的生成，這是由于選擇性鳥苷酸環(huán)化酶抑制物ODQ不能逆轉(zhuǎn)CO提供的保護作用(圖2)。此外，CO處理在SB203580(3-30μM，Calbiochem)(p38MAPK活化的選擇性抑制物)以及p38的顯性上游激酶(在來自mkk3-/-小鼠的肝細胞中)(數(shù)據(jù)未顯示)存在下，抑制細胞死亡。因此，CO的作用不依賴于cGMP/p38MAPK途徑。在這些實驗中，肝細胞用CO預處理1小時，然后將TNF-α/Act-D加入培養(yǎng)基。如果CO處理在加入TNF-α后開始，觀察到的保護作用較小(數(shù)據(jù)未顯示)。NF-κB在CO保護作用中的作用研究了CO誘導的對肝細胞的保護作用是否依賴于NF-κB。圖4，5和6A-6C顯示的數(shù)據(jù)說明，CO誘導小鼠肝細胞中NF-κB核易位以及DNA結合的增加，如NF-κB螢光素酶報道物分析活性(EMSA)所測，以及免疫染色RelA/p65核易位所分別測定的那樣。為獲得圖4中的數(shù)據(jù)，對NF-κB活化的評估是利用如Chow等(J.Biol.Chem.27410689-10692(1999))所述的螢光素酶報道物分析進行的。簡言之，肝細胞用NF-κB報道物構建體和pIEP-Lac-z共轉(zhuǎn)染24小時，然后加入BAY11-7082(10μM)或載體(vehicle)。將細胞保溫1小時后用CO(250ppm)處理。螢光素酶活性(以任意單位報告；A.U.)在暴露于CO或細胞因子混合物(CM)6小時后測定，該細胞因子混合物由TNF-α(500U/ml)，IL-1β(100U/ml)，和IFN-δ(100U/ml)組成，并用作NF-κB活化的陽性對照。結果根據(jù)轉(zhuǎn)染效率和蛋白濃度進行校正。為獲得圖5的數(shù)據(jù)，利用EMSA測定CO(250ppm)處理的肝細胞中的NF-κBDNA結合。注意到NF-κB結合(總)隨時間增加，其表達在1小時(泳道1，4，7)達峰值。隨后對提取物進行超位移分析，以利用抗p50的抗體(泳道2，5，8)和抗p65的抗體(泳道3，6，9)鑒定不同的NF-κB二聚體。為獲得圖6A-6C的數(shù)據(jù)，將原代肝細胞暴露于CO(250ppm)一小時后進行免疫染色以測定核p65定位。圖像顯示在CM(用作陽性對照)和CO處理的細胞中NF-κB的核易位(指向綠色細胞核的箭頭顯示了NF-κB的易位)，與此相比在空氣處理的細胞中沒有定位(指向藍色細胞核的箭頭)。NF-κB螢光素酶報道物實驗活性在將所述細胞置于CO環(huán)境中1小時后達到峰值。細胞因子混合物(CM)包含在處理組中作為陽性信號以及最大報道物活性的標準(通過其評估CO的效應)。原代肝細胞中的轉(zhuǎn)染效率不明顯，而其報道物活性非常顯著(與對照相比*p＜0.001)。這些數(shù)據(jù)結合陽性免疫染色以及EMSA結果支持了CO誘導NF-κB的適度增加本身就可部分導致選擇性基因表達這一觀點。為評估NF-κB活性是否為CO介導的保護作用所需，利用IκBα的腺病毒基因轉(zhuǎn)移來預防NF-κB易位并用BAY11-7082(1-10mM，Calbiochem)來抑制NF-κB的活化。CO的保護效應通過抑制NF-κB的活化而被消除。NF-κB依賴的iNOS表達在CO保護作用中的作用研究了CO介導對肝細胞的保護是否需要iNOS的表達以及NO的生成。所述結果表示在圖7，8和9中。為獲得圖7中的數(shù)據(jù)，利用螢光素酶報道物實驗如Lowenstein等所述(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A909730-9734(1993))對iNOS的表達進行評估。簡言之，用iNOS啟動子報道物構建體和pIEP-LacZ共轉(zhuǎn)染肝細胞，然后將所述細胞暴露于BAY11-7082(10mM)或載體。細胞和BAY一同保溫1小時后暴露于CO(250ppm)。如上述測定螢光素酶活性(以任意單位報告；A.U.)。細胞因子混合物(CM；見上文)用作誘導iNOS表達的陽性對照，并且根據(jù)轉(zhuǎn)染效率和蛋白濃度校正結果。為獲得圖8的數(shù)據(jù)，利用免疫印跡技術評估iNOS蛋白的表達。簡言之，在存在或缺失CO(250ppm)的條件下，用TNF-α/Act-D處理肝細胞的細胞提取物6-8小時。對照細胞用單獨的空氣或CO處理。注意圖8中，TNF-α誘導的iNOS的表達最低，而用TNF-α在存在CO的條件下處理的細胞顯示對iNOS蛋白的誘導明顯更高。為獲得圖9的數(shù)據(jù)，從inos-/-或野生型C57BL/6J小鼠中分離小鼠肝細胞，并隨后用L-NIO(1mM)預處理所述細胞1小時以在給藥CO前抑制iNOS。使暴露于CO的組接受一個小時的預處理，然后向其中加入TNF-α/Act-D，并隨后再進行CO暴露。在其中iNOS的表達缺失或被抑制的細胞中，CO沒有對細胞起保護作用(如12小時后通過結晶紫排除法(crystalvioletexclusion)所評估)。在iNOS螢光素酶報道物實驗中，將肝細胞暴露于CO導致活性顯著增高(圖7)。再次將細胞因子混合物用作這些低效率轉(zhuǎn)染中的陽性對照，并作為標準來評價CO的效應。與iNOS表達的NF-κB依賴性一致，在用BAY11-7082處理的肝細胞中觀察到報道物活性降低(圖7)。此外，與單獨存在TNF-α相比，在CO存在時，由對TNF-α的反應而產(chǎn)生的iNOS蛋白明顯增加(圖8)。利用來自iNOS敲除小鼠(inos-/-)的肝細胞和用選擇性iNOS抑制物L-NIO(1mM，Calbiochem)處理的野生型小鼠肝細胞，申請人研究了在缺乏iNOS活性的條件下，CO是否防止TNF-α誘導的細胞死亡。CO不能防止缺乏iNOS活性的肝細胞不受TNF-α誘導的細胞死亡，而其對野生型肝細胞則有保護作用(圖9)?？偠灾?，這些數(shù)據(jù)顯示，CO需要NF-κB的活化和iNOS表達以防止肝細胞在體外死亡。吸入的CO防止肝衰竭在爆發(fā)性肝衰竭的TNF-α/D-gal模型中研究了吸入CO是否防止肝損傷。結果顯示在圖10和11A-11H中。為獲得圖10的數(shù)據(jù)，用CO(250ppm)預處理小鼠一小時，然后用TNF-α/D-gal(分別為0.3μg/8mg/小鼠；腹膜內(nèi))處理。接受TNF-α/D-gal處理后，小鼠回到CO暴露小室中，并且6-8小時后分析其血清的ALT。沒有暴露于CO的情況下，肝衰竭出現(xiàn)在6-8小時內(nèi)，主要由上述體外模型中的肝細胞凋亡造成。CO處理的小鼠的血清ALT比暴露于空氣的小鼠的血清ALT低74％。為獲得圖11A-11H的數(shù)據(jù)，在存在或缺乏CO(250ppm)的條件下，對取自TNF-α/D-gal處理8小時的小鼠的肝樣品進行切片，并進行以下染色蘇木精和伊紅(H&E)，活化caspase-3(如紅色強度增加所示)，以及TUNEL陽性細胞(如增強的綠色細胞染色分界所示；細胞死亡的標志)。細胞核染成藍色。暴露于CO顯著降低了TNF-α/D-gal誘導的肝損傷(如H&E染色所示)。暴露于CO的小鼠的肝也顯示TUNEL陽性細胞較少，顯示活化caspase-3的染色較少，并具有正常的結構(architecture)。接受TNF-α/D-gal的暴露于空氣的對照小鼠顯示明顯的肝炎癥，水腫，出血以及結構喪失。上述討論的結果用脂多糖(LPS，也稱為內(nèi)毒素)替代TNF來證實。在這些證實性研究中，給藥LPS/D-gal導致血清ALT水平從對照的20+/-5IU/ml升高到＞1000IU/ml(如給藥LPS/D-gal8小時后所測)。在用250ppmCO預處理的小鼠中，ALT的升高降低了75％，為250+/-75IU/ml。為進一步說明在該模型中觀察到的CO的效應，測定血清白介素-6，并發(fā)現(xiàn)呼吸CO的動物與呼吸空氣的對照相比其血清白介素-6降低了65％(數(shù)據(jù)未顯示)。這些小鼠的肝組織的組織病理學與使用TNF-α/D-gal處理的小鼠的相似。未處理的和CO處理的小鼠(無LPS/D-gal)沒有任何損傷跡象，而用空氣和LPS/D-gal處理的小鼠顯示明顯的損傷，包括水腫，出血，嗜中性細胞浸潤，以及正常形態(tài)和結構的總體破壞。反之，用CO以及LPS/D-gal處理的小鼠的肝和用CO以及TNF-α/D-gal處理的小鼠的肝受到保護的程度相同。在炎癥標志物(水腫，出血，嗜中性細胞浸潤)中幾乎觀察不到改變。其結構保持，且顯示與未處理的和CO(無LPS/D-gal)處理的小鼠中很相似?？傊?，使用LPS/D-gal誘導急性肝炎對應并證實了使用TNF/D-gal處理所得的數(shù)據(jù)。iNOS在CO預防肝損害的保護作用中的作用利用免疫印跡技術和免疫組化研究了用TNF-α/D-gal處理后，暴露于CO的小鼠的肝中iNOS蛋白的水平是否增加。此外，研究了CO是否保護inos-/-小鼠或用選擇性iNOS抑制物L-NIL(10mg/kg，腹膜內(nèi)；每兩小時給藥)處理的野生型小鼠，以確定iNOS表達是否具有功能性作用。結果顯示為圖12，13A-13D，和14。為獲得圖12的數(shù)據(jù)，用空氣或CO(250ppm)處理雄性C57BL/6J小鼠一小時，然后給藥TNF-α/D-gal(分別為0.3μg/8mg/小鼠；腹膜內(nèi))。6小時后，收獲肝以通過免疫印跡來評估iNOS表達。結果顯iNOS表達在空氣TNF-α/D-gal處理的小鼠中輕度(modestly)增加，但在用TNF-α/D-gal和CO處理的小鼠中明顯增加。如預期那樣，inos-/-小鼠顯示不表達iNOS蛋白。為獲得圖13A-13D的數(shù)據(jù)，對小鼠肝切片進行iNOS表達的免疫染色。肝切片得自存在或缺乏CO時用TNF-α/D-gal處理的小鼠，以及沒有用TNF-α/D-gal處理的空氣和CO對照。來自暴露于CO并沒有接受TNF-α/D-gal處理的小鼠的肝顯示iNOS表達輕度增加。然而，在暴露于CO并接受TNF-α/D-gal處理的小鼠的肝中觀察到所述表達明顯大幅增加(表示為綠色染色細胞增加)。所述增加的表達顯示定位在血管周圍。為獲得圖14的數(shù)據(jù)，利用inos-/-或用L-NIL(iNOS的選擇性抑制物(L-NIL；5mg/kg，腹膜內(nèi)，每兩小時給藥)處理的野生型小鼠，在缺乏iNOS活性的條件下，檢測CO誘導的保護的效率。L-NIL在給藥CO前兩小時給藥。隨后預處理CO處理的動物(250ppm)一小時，然后用TNF-α/D-gal處理。缺乏iNOS功能/表達的條件下，CO不能防止肝不受損傷(如通過血清ALT和組織病理學評估的那樣)。因此，可見吸入CO對TNF-α誘導的肝衰竭的保護效應有賴于iNOS活性。HO-1在CO防止急性肝衰竭的保護作用中的作用研究了CO和NO是否通過HO-1依賴的機制顯示預防急性肝衰竭的保護作用。數(shù)據(jù)顯示于圖15，16，17，和18。為獲得圖15的數(shù)據(jù)，進行免疫印跡以觀察在存在或缺乏CO(250ppm)時接受TNF-α/D-gal處理的小鼠的肝中HO-1的表達。在存在或缺乏TNF-α/D-gal的條件下，CO-處理的小鼠顯示HO-1表達均明顯增加。為評估iNOS對TNF-α/D-gal-誘導的HO-1在肝中的表達(數(shù)據(jù)顯示于圖16中)，將L-NIL(5mg/kg，腹膜內(nèi))在給藥小鼠，2小時后用CO(250ppm)預處理，并在此后每兩小時處理一次。對照小鼠接受L-NIL并保持于室內(nèi)空氣中。注意圖16中，CO增加載體處理的小鼠中的HO-1的表達，但在iNOS受抑制時不能誘導表達。單獨的L-NIL處理對HO-1的表達具有最小的影響。為檢驗CO-誘導的HO-1(數(shù)據(jù)顯示于圖17)的保護性作用，在用CO處理5小時前，將SnPP(50pmol/kg，皮下)，HO-1的選擇性抑制物，給藥小鼠?？蛇x地，將VPYRRO(VP)，NO供體(10mg/kg，皮下)給藥小鼠。VP被選擇性設計為直接將NO遞送到肝。最初的VP給藥后一小時，將動物暴露于CO一小時，然后給藥TNF-α/D-gal(見上文)。在6-8小時后測定血清ALT水平。注意CO不能對其中HO-1活性被阻斷的動物提供保護。當VP在2小時前給藥，并在其后每兩小時給藥一次時，其對損傷提供保護作用，如8小時后測定的血清ALT所示。為獲得圖18的數(shù)據(jù)，野生型C57BL/6J小鼠用L-NIL(飲用水中，4.5mM)預處理24小時，如Stenger等(J.Exp.Med.1831501-1514(1996))所述。隨后將CoPP給藥這些小鼠和inos-/-小鼠。L-NIL在整個試驗過程中一直保持在水中。對照和inos-/-小鼠接受正常的飲用水。給藥CoPP24小時后，將TNF-α/D-gal給藥，并在6-8小時后測定血清ALT。注意圖18中，無論是否存在iNOS，HO-1的誘導都提供了保護作用。在存在或缺失TNF-α/D-gal的條件下，來自用CO處理的小鼠的肝提取物的免疫印跡顯示HO-1的上調(diào)(圖15)。將iNOS抑制物L-NIL加入這些組消除了保護作用(圖17)，也阻止了HO-1的上調(diào)(圖16)。為測定HO-1對于CO激發(fā)的肝保護作用而言是否很重要，錫原卟啉-IX(SnPP，50μmol/kg，皮下，F(xiàn)rontierScientific)被用作HO-1活性的選擇性抑制物。SnPP顯著降低該模型中CO的保護作用(圖17)。在缺乏TNF-α/D-gal時給藥SnPP沒有任何有害或保護性作用(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結果提示，HO-1的上調(diào)對于CO的保護效應很重要。為測定如果保護作用由NO啟動，HO-1的上調(diào)是否也是需要的，用藥理學NO供體V-PYRRO/NO處理小鼠。該試劑在肝中代謝，導致肝細胞釋放NO。V-PYRRO/NO也在給藥LPS/D-gal或TNF-α/D-gal后提供保護。將小鼠隨機化，并用TNF-α/D-gal(有或沒有SnPP)處理以評估HO-1的作用。V-PYYRO/NO有保護作用(如血清ALT所分析)。但SnPP消除了該NO供體防止肝損傷的能力(圖17)。因此，似乎CO-或NO-啟動的肝保護作用至少部分依賴于HO-1。由于這些數(shù)據(jù)顯示，CO和NO需要HO-1活性以防止TNF-α-誘導的肝細胞死亡，研究了HO-1介導的保護作用是否需要iNOS活性。利用inos-/-小鼠，通過給藥CoPP誘導HO-1。24小時后(HO-1表達高峰)，注入TNF-α/D-gal，并在6-8小時后評估肝損傷。所述結果顯示HO-1的誘導能不依賴于iNOS活性而明顯防止肝損傷，導致血清ALT降低＞50％(圖18)。這些結果通過使用L-NIL證實。用含L-NIL(4.5mM)的飲用水預處理小鼠24小時。該方法有效抑制NOS活性。對照小鼠接受正常水。隨后，將CoPP給藥以誘導HO-1表達，并在24小時后，用TNF-α/D-gal攻擊小鼠。單獨的I-NIL治療不改變該模型中誘導的損傷的嚴重性。所有接受CoPP(有或沒有L-NIL)的動物中的肝損傷都可得到預防(圖18)。研究了HO-1表達是否是CO或NO誘導的對TNF-α/ActD-誘導的肝細胞死亡的預防作用所需的。數(shù)據(jù)顯示于圖19和20。為獲得圖19的數(shù)據(jù)，從HO-1裸鼠(hmox-l-/-)和野生型(C57BL/6J)同窩幼鼠中分離小鼠肝細胞，用CO(250ppm)預處理1小時，并用TNF-α/ActD進行處理。如上述測定生存力。CO明顯保護野生型肝細胞，但不能保護從hmox-l-/-小鼠中分離的肝細胞。為獲得圖20的數(shù)據(jù)，從HO-1裸鼠(hmox-l-/-)和野生型(C57BL/6J)同窩幼鼠中分離小鼠肝細胞，用NO供體SNAP(500μM)預處理1小時后用TNF-α/ActD進行處理。已經(jīng)證實SNAP保護該模型中的肝細胞。SNAP明顯防止野生型肝細胞的細胞死亡，但不提供防止從hmox-l-/-小鼠中分離的肝細胞出現(xiàn)細胞死亡的明顯保護作用。如上述，空氣處理的野生型和暴露于TNF-α/ActD的hmox-l-/-細胞如預期那樣出現(xiàn)細胞死亡，而CO-或NO-處理的野生型細胞在TNF-α/ActD存在時受到保護(圖19和20)。CO和NO顯示的保護作用在缺乏功能型HO-1(hmox-l-/-)的細胞中喪失。因此，似乎HO-1在該模型中提供的保護作用與iNOS無關，表明HO-1或其一或多種催化產(chǎn)物可在該模型中部分顯示細胞保護作用。吸入CO預防對乙酰氨基酚誘導的肝炎研究了吸入的CO是否預防對乙酰氨基酚(APAP)-誘導的肝炎。數(shù)據(jù)顯示于圖21。為獲得圖21的數(shù)據(jù)，給藥APAP(500mg/kg，腹膜內(nèi))一小時前或4小時后，將雄性C57BL/6J小鼠暴露于CO(250ppm)。隨后在整個實驗過程中將小鼠保存在CO中。給藥APAP20小時后，測定血清ALT水平。對照小鼠接受APAP，并保持在空氣中。該方案的設計是在給藥CO前讓肝炎發(fā)展4小時。CO明顯減少對肝的損傷(如血清ALT測定所示(622±44對175±137，與對照目比p＜0.01)。所述保護與各組在給藥APAP前已用CO預處理的動物中觀察到的一樣。這些數(shù)據(jù)支持了CO在臨床相關情況中的治療用途，其中治療可在肝炎開始后開始。此實施例中討論的結果顯示，在CO誘導的防止肝受到TNF-α/D-gal造成的損傷中，低濃度的CO可防止TNF-α/D-gal-誘導的爆發(fā)性肝炎，并顯示對HO-1和iNOS的獨特且以前未認識到的依賴性。不受理論所限，可能CO介導的保護通過活化NF-κB，其在存在炎性刺激的條件下，導致iNOS的上調(diào)以及隨后的NO生成。除了誘導iNOS以外，其它NF-κB依賴的抗凋亡/保護基因也可被誘導。在用CO進行1小時的預處理的過程中以及用TNF-α處理所述細胞前，存在NF-κB的明顯活化，其可以是上述細胞器激發(fā)(priming)的一部分。CO對NF-κB的活化可能部分由于來自線粒體(初步觀察)的反應性氧樣品(species)生成的輕度增加。一個小時可能使得NF-κB依賴的抗凋亡基因表達。這種假想模型中的下一步可能導致iNOS上調(diào)之后的NO生成。NO導致HO-1上調(diào)，其活性顯示保護效應。HO-1的保護效應可能是由于去掉了血紅素，或者由于其三種產(chǎn)物中的任何一或多種CO，膽綠素/膽紅素，或鐵/鐵蛋白。在整個實驗過程中一直給藥外源性CO的情況下，似乎內(nèi)源生成的CO不可能單獨介導HO-1保護。然而，CO與HO-1的其它產(chǎn)物的結合或單獨的這些其它產(chǎn)物可能與此有關。在上述研究中，在臨床相關的對乙酰氨基酚(APAP)誘導的肝炎模型中給藥CO，該模型的時間過程與人的急性肝炎的發(fā)展相似。該數(shù)據(jù)顯示，給藥APAP(500mg/kg，腹膜內(nèi))4小時后暴露于CO導致肝損傷降低62％(圖21)。在該APAP-誘導的肝損傷模型中，小鼠早在APAP給藥2-4小時后就顯示了肝炎的癥狀，并在24-48小時后出現(xiàn)死亡。因此，在肝損傷開始后給藥CO。與APAP模型的數(shù)據(jù)一致的是出血性休克小鼠模型中的結果，其中2.5小時的休克期過后，復蘇(resuscitation)過程中吸入CO治療的開始產(chǎn)生對肝損傷的保護作(24小時血清ALT降低＞65％，p＜0.01；n＝6-10/組)?？傊?，利用主要由TNF-α誘導的凋亡造成的肝損傷模型，可證實以下結論首先，吸入CO可防止該模型中的肝炎；其次，CO的保護作用需要第二氣體分子NO的生成；第三，NO至少部分通過HO-1上調(diào)顯示其有益效應；且第四，HO-1的上調(diào)無需iNOS/NO活性，即無需循環(huán)的強制(obligate)持續(xù)即可起保護作用。實施例2治療肝炎的方案以下實施例闡述了用于處理診斷為患有肝炎的患者的方案。該實施例還闡述了在手術前，期間，和/或以后處理患者的方案，所述手術例如肝移植手術。熟練醫(yī)師將理解本文所述任何方案可根據(jù)患者的個別需要進行調(diào)整，并可調(diào)整所述方案以和任何其它肝炎治療聯(lián)用。治療患者用CO治療患者可在患者被診斷為患有肝炎(例如由病毒感染和/或酗酒造成的肝炎)的當天開始。所述患者可由醫(yī)師利用任何已知方法診斷。例如，以是可利用獲自血液檢測的數(shù)據(jù)進行這樣的診斷，例如檢測血清ALT水平的實驗和檢測患者是否被特定病毒(例如，任何已知的肝炎病毒)感染的實驗。此外，醫(yī)師可根據(jù)患者的病史作出這樣的診斷(例如患者是否是嗜酒者或慢性藥物使用者)。所述患者每天可吸入濃度為約250-500ppm的CO一小時。這種治療可持續(xù)約30天，或者直到所述患者被診斷為不再患有或不再易患肝炎。肝移植的方法肝供體的處理獲取肝或其部分前，可使用吸入的一氧化碳(250ppm)處理供體一小時。給藥處理的劑量可從10ppm到1000ppm，時間從一小時到六小時，或者從開始可能處理腦死亡(尸體)供體到該器官被取出的時間的整個階段。對于人類供體，宣布腦死亡后應盡早進行處理。在一些應用中，需要在腦死亡前進行處理。對于非人動物(例如豬)用作異種移植供體的情況，如需要可用相對高水平的吸入的一氧化碳處理活供體動物，只要由此產(chǎn)生的碳氧血紅蛋白不損害待移植器官的生存力和功能。例如，可使用高于500ppm(例如，1000ppm或更高，甚至達10,000ppm，特別是短時間使用)的濃度。肝的原位處理從供體獲取肝以前，可以在肝仍在供體體內(nèi)時用溶液，例如緩沖液或介質(zhì)對其進行沖洗或灌洗。目的是使用用一氧化碳飽和的溶液沖洗肝，并將肝保持在一氧化碳的環(huán)境中，使得一氧化碳的含量保持飽和。沖洗可進行至少10分鐘，例如1小時，幾小時或更長。較理想的是，該溶液將可能的最高濃度的一氧化碳遞送到肝(或其一部分)的細胞。肝的活體外(exvivo)處理將肝從供體取出后到將其移植給受體這段時間內(nèi)，可將其保存在包含一氧化碳的介質(zhì)中。這可通過將肝保存在含有一氧化碳的介質(zhì)中進行，或者通過用這種介質(zhì)灌注肝來進行。由于這種情況出現(xiàn)在活體外而不是動物體內(nèi)，可使用非常高濃度的一氧化碳氣體(例如，10,000ppm)使該介質(zhì)被一氧化碳飽和。處理肝受體用一氧化碳處理受體可在移植手術當天手術開始前至少30分鐘開始處理。可選地，可以于在受體內(nèi)再灌注器官前至少30分鐘開始?？沙掷m(xù)至少30分鐘，例如一小時?？蓪?0ppm到3000ppm的一氧化碳劑量遞送不同時間，例如數(shù)分鐘或數(shù)小時，并可在移植當天和移植后數(shù)天給藥。例如，所述患者可在三次連續(xù)10秒的深呼吸(breathhold)中吸入例如3000ppm濃度的一氧化碳?？蛇x地，也可以采用規(guī)律呼吸而不是深呼吸的方式間斷或連續(xù)地遞送較低濃度的氣體，遞送較長時間。碳氧血紅蛋白濃度可指導對患者適當?shù)亟o藥一氧化碳。通常，受體的處理不應導致碳氧血紅蛋白水平升高到被認為可能給需要移植的患者造成可接受的危險的程度。本發(fā)明描述了一些實施方案。但應理解可進行多種修飾而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此，其它實施方案也在權利要求的范圍內(nèi)。權利要求1.治療患者的肝炎的方法，所述方法包括鑒定診斷為患有肝炎的患者；和將包含一氧化碳的藥物組合物給藥該患者，所述一氧化碳的量是治療患者肝炎的有效量。2.權利要求1的方法，其中所述藥物組合物是氣體形式，并通過吸入給藥所述患者。3.權利要求1的方法，其中所述藥物組合物是液體形式，并通過口服給藥所述患者。4.權利要求1的方法，其中所述藥物組合物直接給藥患者的腹腔。5.權利要求1的方法，其中所述患者被選自下組的病毒感染甲型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，丁型肝炎病毒，戊型肝炎病毒和庚型肝炎病毒。6.權利要求1的方法，其中所述患者是嗜酒者。7.權利要求1的方法，還包括給予患者選自以下的治療停止或者減少給藥誘導肝炎的藥物；并將皮質(zhì)類固醇或抗病毒劑給藥所述患者。8.權利要求1的方法，其中所述藥物組合物通過人工肺給藥。9.權利要求1的方法，其中將所述藥物組合物通過體外膜氣體交換裝置給藥。10.權利要求1的方法，其中所述肝炎由暴露于肝毒性劑而造成。11.治療患者的肝炎的方法，所述方法包括(a)鑒定患有或易患肝炎的患者；(b)提供含有加壓氣體的容器，所述加壓氣體包含一氧化碳氣體；(c)從所述容器中釋放加壓氣體，以形成含有一氧化碳氣體的環(huán)境；并(d)將所述患者暴露于該環(huán)境，其中環(huán)境中一氧化碳的量足以治療患者的肝炎。12.將肝毒性藥物給藥患者的方法，所述方法包括(a)將所述肝毒性藥物給藥所述患者；和(b)在(a)之前，期間，或之后，給藥該患者包含一氧化碳的藥物組合物，所述一氧化碳的量為治療該患者肝炎的有效量。13.權利要求12的方法，其中所述一氧化碳在步驟(a)前給藥。14.權利要求12的方法，其中所述一氧化碳在步驟(a)期間給藥。15.權利要求12的方法，其中所述一氧化碳在步驟(a)后給藥。16.權利要求12的方法，其中所述肝毒性藥物選自異煙肼，甲基多巴，對乙酰氨基酚，胺碘酮和呋喃坦丁。17.含有醫(yī)用級壓縮一氧化碳氣體的容器，所述容器帶有表明該氣體可用來治療患者的肝炎的標簽。18.權利要求17的容器，其中所述一氧化碳氣體和含氧的氣體混合。19.權利要求17的容器，其中混合物中的一氧化碳氣體的濃度至少約0.025％。20.權利要求17的容器，其中混合物中的一氧化碳氣體的濃度至少約0.05％。21.權利要求17的容器，其中混合物中的一氧化碳氣體的濃度至少約0.10％。22.權利要求17的容器，其中的混合物中的一氧化碳氣體的濃度至少約1.0％。23.權利要求17的容器，其中的混合物中的一氧化碳氣體的濃度至少約2.0％。24.權利要求17的容器，其中所述標簽進一步表明所述氣體可與肝毒性藥物聯(lián)合給藥患者。25.含有醫(yī)用級壓縮一氧化碳氣體的容器，所述容器帶有表明該氣體可與肝毒性藥物聯(lián)合給藥患者的標簽。26.治療患者的肝炎的方法，所述方法包括鑒定患有或易患肝炎的患者，其中所述肝炎不是由手術或內(nèi)毒素造成的；和將包含一氧化碳的藥物組合物給藥該患者，所述一氧化碳的量為治療患者肝炎的有效量。全文摘要本發(fā)明涉及治療患者的肝炎的方法，包括將包含一氧化碳的藥物組合物給藥患者。文檔編號A61M1/22GK1668314SQ03816323公開日2005年9月14日申請日期2003年5月16日優(yōu)先權日2002年5月17日發(fā)明者利奧·E·奧特拜因,奧古斯丁·M·K·喬伊,布賴恩·朱克布朗申請人:耶魯大學,聯(lián)邦高等教育系統(tǒng)匹茲堡大學