專利名稱：水龍骨屬提取物的新型治療用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明公開了一種水龍骨屬提取物的新型治療劑，特別是治療纖維化病癥。
背景技術：
組織纖維化是以細胞外基質(主要是膠原蛋白和纖維結合蛋白)過度表達和纖維原細胞增生為特征的慢性病癥。
近來，人們發(fā)現(xiàn)，轉化生長因子β(TGF-β)涉及所有的纖維化病癥，并且TGF-β獨立誘導了病癥ECM蛋白的表達。例如硬皮癥、肝纖維化、骨髓纖維化、心臟纖維化、肺纖維化、動脈粥樣硬化、胰纖維化、腎纖維化、杜普伊特倫氏病、或者佩羅尼氏病可以引證為纖維化疾病。
佩羅尼氏病的歷史、病因學及其流行病學均不為人所知。遺傳因子、創(chuàng)傷因子、高動脈壓、和/或先天因子均可以作為佩羅尼氏病的發(fā)病因子。
臨床發(fā)現(xiàn)，在佩羅尼氏病患者陰莖的白膜中有纖維狀物質生成，并且在病癥初期產(chǎn)生疼痛的疤斑。在陰莖勃起的過程中，病斑造成陰莖的內彎曲，病癥晚期會使性生活困難或者妨礙性生活。在某些情況下，臨床癥狀還包括勃起時陰莖喪失剛性。
據(jù)報道，與其它纖維化病癥相同，TFG-β也涉及佩羅尼氏病，在佩羅尼氏病患者體內此蛋白含量升高。此外，常規(guī)的佩羅尼氏病還與其它纖維化疾病相關聯(lián)，主要是杜普伊特倫氏病或者佩吉特氏病。
對纖維化疾病新型治療方法的尋找集中在可以抑制轉化生長因子(TFG-β)的產(chǎn)物上，此蛋白可以誘導ECM蛋白的合成。然而，參照生命體內病斑的臨床改善或者膠原蛋白減少獲得的結果，TFG-β減少在生命體外研究與動物模型之間沒有明顯的關聯(lián)性。
EL-Sakka等人(J Uro 1999 Jun；161(16)1980-3)公開了，秋水仙素降低了通過在其陰莖上注射TGF-β患有佩羅尼氏病鼠的TGF-β表達。
然而，Reinhart等人(Dtsch Z Verdau Stoffwechselkr 1986；46(5)257-75)公開了，使用秋水仙素治療肝臟纖維化疾病時，對于纖維化程度改善、惡化或者沒有變化的三種情況，獲得了相同的幾率。
對于佩羅尼氏病癥，Kadioglu等人(Int Impot Res.2000 Jun；12(3)169-75)公開了，60位佩羅尼氏病患者經(jīng)過10個月秋水仙素治療，30％患者陰莖內彎曲癥狀得到改善，22％患者病情惡化，48％患者沒有變化。
當前，由于其在生命體外具有抑制TGF-β的活性(Ralph etal，the treatment of Peyroni’s disease with Tamoxifen.BrJ Urol.1992，70684-651)，三苯氧胺是佩羅尼氏病的一種治療劑。然而，三苯氧胺的臨床效果很差。因此，Teloken C等人(TheTamoxifen versus placebo in the treatment of Peyronies diseases，JUrol.1999 Dec；162(6)2003-5)公開了，在可比臨床實驗中，三苯氧胺與空白對照劑之間的測定結果相似。
減少病斑的其它方法包括向海綿體內注射多種藥劑，例如干擾素α-2b、戊脈安、或者類皮質激素。此用藥線路會給患者帶來痛苦，因此，此藥物的施用必須由有資格的人員完成。上述藥物的施用會造成副作用干擾素會造成發(fā)燒、不適和mialgia；將類皮質激素在病斑內施用，會產(chǎn)生壞疽；口服用藥的三苯氧胺會降低患者的性欲望和eyaculate。
現(xiàn)有技術中已經(jīng)公開，水龍骨屬提取物具有不同的藥用活性。EP-0503.208、ES-2.088.770、EP1172111和EP1172111的現(xiàn)有技術公開了水龍骨屬提取物的不同藥用活性。所述藥用活性可以概括為免疫活性和控制不同細胞因子的數(shù)目；控制粘著分子；抑制神經(jīng)變性疾病的活化；抗炎活性和產(chǎn)生膠原蛋白的活性。
因此，最接近的現(xiàn)有技術公開了水龍骨屬提取物的產(chǎn)生膠原蛋白活性，及其在以缺乏膠原蛋白為特征病理中的應用。
EP-503.208公開了，水龍骨屬提取物具有刺激成纖維細胞的活性，以及合成前膠原蛋白的活性。
另外，F(xiàn)R2.479.690公開了，在治療缺乏膠原蛋白的骨運動原系統(tǒng)疾病中水龍骨科提取物的應用。因此，該文章顯示，水龍骨屬提取物增加了膠原蛋白的合成，并且生成的膠原蛋白更具耐久性。
發(fā)明概述本發(fā)明解決的問題是實現(xiàn)對纖維化疾病的有效藥理治療，例如硬皮癥、肺纖維化、腎纖維化、動脈粥樣硬化、胰纖維化、心臟纖維化、肝纖維化、骨髓纖維化、杜普伊特倫氏病、特別是佩羅尼氏病，其中所述病理是以細胞外基質(ECM)過度表達為特征的。
如權利要求1所述，發(fā)明者提供的方案是水龍骨屬提取物的應用。
發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，水龍骨屬提取物在生命體外以劑量依賴的方式抑制纖維蛋白與纖維結合蛋白的合成。此種能力同樣在生命體內得到了證實；水龍骨屬提取物減少了佩羅尼氏病(一種以陰莖中纖維結合蛋白為特征的纖維化疾病)患者的膠原纖維病斑。
水龍骨屬提取物所解決的另一個問題是，所述提取物降低了轉化生長因子β的表達。如權利要求2所述，此蛋白涉及所有的纖維化病癥。此外，與三苯氧胺(控制TGF-β的參照藥物)造成的TGF-β減少相比，生命體內由水龍骨屬提取物造成的TGF-β減少更加顯著。
如技術人員所公知，以水龍骨屬提取物用藥不產(chǎn)生任何副作用，從而避免了采用抗細胞因子療法產(chǎn)生的副作用。
在優(yōu)選的具體實施方式
中，水龍骨屬提取物用藥解決的問題是改善了與佩羅尼氏病有關的臨床參數(shù)，如權利要求3所述，它們是水龍骨提取物口服用藥后，陰莖白膜中纖維化的病斑數(shù)量減少，性行為過程中的疼痛減輕，陰莖內彎曲程度減弱，患者的心理獲得了改善。佩羅尼氏病患者經(jīng)過水龍骨屬提取物治療獲得的臨床效果優(yōu)于其它藥劑產(chǎn)生的治療效果。
如權利要求9所述，口服用藥解決了與注射入佩羅尼氏病斑用藥有關的各種問題上述注射用藥必須由技術人員完成，且用藥過程給患者帶來了痛苦。
在
具體實施例方式
中，采用電介常數(shù)大于20的極性溶劑提取，獲得水龍骨屬提取物。如權利要求4、5、6、和7所述，具體地講，使用水提取獲得水龍骨屬提取物，更具體地講，使用水從水龍骨屬leucotomos中提取，獲得提取物。
為了以參數(shù)形式描述本發(fā)明提取物，權利要求8顯示了提取物中出現(xiàn)的化合物。
發(fā)明詳述水龍骨屬提取物是使用極性溶劑提取獲得的，極性溶劑指的是電介常數(shù)大于20的溶劑。根據(jù)物化手冊(54aEdition 1973)下表中列出了一些溶劑的電介常數(shù)。

在優(yōu)選實施方式中，水龍骨屬提取物可以通過水提取和蒸發(fā)溶劑獲得。
此外，還可以使用本領域技術人員所公知和現(xiàn)有技術中公開的其它操作方法，提純水龍骨屬提取物，或者改進其提取物的產(chǎn)量。因此，這些操作方法不會對本發(fā)明提取物帶來任何其它益處。這些操作方法包括優(yōu)化植物的干燥條件；溶劑組合；將植物材料去脂；添加防腐劑；添加抗菌劑；添加有利于保存和改善操作的載體；采用超臨界流體狀態(tài)的溶劑提??；優(yōu)化植物材料采集的時間；采用色譜法提純；采用活性碳或者其它材料吸附的方式提純。
在經(jīng)所在國家官方授權的情況下，本發(fā)明所述植物材料是在危地馬拉的Montes Mataque地區(qū)采集的。
植物種類的分類是由其命名者決定的，因此，根據(jù)分類法可以使用不同的名稱。
所用植物材料的分類是學名Phlebodium aureum(林內烏斯)亞屬Phlebodium屬水龍骨屬科水龍骨科此外，還存在其它可接受的同義名，例如，Polypodiumaureum(林內烏斯)或者Polypodium leucotomos(Poiret)和其它品種Polypodium aerolatum、Phlebodium aerolatum、Polypodiumaureum var、Aerolatum或者Pleopeltis aurea。
因此，“水龍骨屬”指的是水龍骨屬內的所有蕨類。
在優(yōu)選實施方式中，將Polypodium leucotomos(Poiret)的根莖干燥再用水提取，其中根莖與水的比率是1∶10。為了減少微生物的含量，采用膜過濾提取物。低壓去除溶劑，得到含水量大約25％的提取物。為了避免微生物污染并且有利于操作，可以向提取物中加入載體(淀粉、乳糖、硬脂酸鎂)。以含有120mg干燥水提取物的一次劑量形式將穩(wěn)定的提取物包裹在膠囊中。
對提取物進行色譜分析(十八烷基硅烷涂布色譜柱，5微米；流動相(3％磷酸∶水∶乙腈/25∶72∶3)；UV210nm下測定)，顯示出蘋果酸、檸檬酸、延胡索酸、奎尼酸和乳酸。為了達到分析的目的，這些酸作為提取物的標記物。
在纖維化疾病的藥物研究中，人體皮膚成纖維細胞培養(yǎng)物是適合的模型，也就是，病狀是以細胞外基質(ECM)的過度表達為特征的。
在37℃含有氚化脯氨酸(3H-譜氨酸)的條件下培養(yǎng)24小時，水龍骨屬提取物以劑量依賴方式在1、10、50、100、500ug/ml濃度下抑制膠原蛋白的合成。濃度為50ug/ml的水龍骨屬提取物抑制膠原蛋白的合成，其數(shù)值僅為對照值的40％。
水龍骨屬提取物在生命體外抑制了纖維結合蛋白的合成，其葉提取物與根莖提取物都可以抑制纖維結合蛋白的合成。在水龍骨屬提取物存在下培養(yǎng)成纖維細胞并進行免疫測定后，水龍骨屬提取物以劑量依賴的方式抑制了成纖維細胞的合成，其數(shù)值達到對照的40％。
除了具有在生命體外抑制ECM合成的活性以外，水龍骨屬提取物還在生命體內表現(xiàn)出具有抑制ECM合成的活性。將水龍骨屬提取物對佩羅尼氏病患者生命體內用藥后，患者陰莖膠原蛋白病斑的數(shù)量減少了，TFG-β表達也降低了。
針對34位佩羅尼氏病患者6個月的臨床實驗表明，水龍骨組的臨床改善與心理改進優(yōu)于三苯氧胺組。所得的結果差別顯著。
測定的結果如下


采用水龍骨屬提取物治療后，所得的結果優(yōu)于kadioglu等人公開的結果(Int.J Impot Res.2000Jun；12(3)169-75)。這些作者說明，使用秋水仙素治療10個月的佩羅尼氏病患者中，30％的患者陰莖內彎得到改善，48％保持不變，22％病情惡化。
采用每隔8小時口服720mg水龍骨屬提取物，治療水龍骨組的患者。
采用每隔24小時口服20mg三苯氧胺，治療三苯氧胺組的患者。
兩組中患者的年齡相似。
通過身體檢查與陰莖ecography確定病斑數(shù)量。
通過照片確定陰莖的內彎曲程度。
與初始數(shù)值相比，經(jīng)過處理后水龍骨組中TGF-β生成量降低了22％，而三苯氧胺組中只降低了5％。
與初始數(shù)值相比，經(jīng)過處理后水龍骨組中IL-10生成量降低了17％，而三苯氧胺組中降低了79％。
治療后，67％的水龍骨組患者表示滿意，而三苯氧胺組只有45％。
附圖詳述

圖1.由水龍骨屬提取物產(chǎn)生的對膠原蛋白合成的抑制每一個值表示的是4個平行實驗的平均值。并且表示出標準偏差。
圖2.由水龍骨屬提取物產(chǎn)生的對纖維結合蛋白合成的抑制每一個值表示的是3個平行實驗的平均值。并且表示出標準偏差。
圖3.由水龍骨屬提取物產(chǎn)生的對纖維結合蛋白合成的抑制每一個值表示的是3個平行實驗的平均值。并且表示出標準偏差。
具體實施例方式實施例1.水龍骨屬提取物對細胞外基質的影響水龍骨屬提取物先用提取48小時，再用膜過濾，接著，低壓下去除溶劑，然后，再次溶解在生理漿液中，最后冷凍干燥，獲得水龍骨屬提取物。提取物可以溶解在PBS中，再生后使用。
細胞培養(yǎng)從外科材料獲得成纖維細胞。將皮膚斷片放入4℃的RPMI1640介質和2％(雙倍用量)的青霉素和鏈霉素溶液，預培養(yǎng)2小時。去除脂肪組織后，將皮膚切成小片固定在胎牛血清(FCS)潤濕的微孔中。在5％CO2氣體環(huán)境下，將皮膚細胞培養(yǎng)在含有10％FCS和1％青霉素/鏈霉素溶液的RPMI1964介質中。此介質每周更新兩次。成纖維細胞先在Tripsin與EDTA(0.05％/0.02％)溶液中培養(yǎng)，然后傳代培養(yǎng)用于實驗。僅使用第4-14代獲得的細胞。
膠原蛋白的合成在組織培養(yǎng)的微量平板中獲得人體皮膚的成纖維細胞。在每個微孔中將10,000個細胞種植在含有10％FCS和50μg/ml L-抗壞血酸的100μl RPMI介質中。在5％二氧化碳環(huán)境下培養(yǎng)24小時后，使用含有不同濃度水龍骨屬提取物(1-1000μg/ml)和1μCi3H-脯氨酸的100ml新鮮介質更新介質。接著，培養(yǎng)24小時后，加入含有1％胃蛋白酶的100μl的1M冷乙酸提取膠原蛋白，4℃下將介質過夜培養(yǎng)。在4℃下完成下述步驟將微孔中的物質轉移至3ml聚丙烯試管中；加入含有鼠皮膚膠原蛋白可溶鹽的800ml的0.5M乙酸，用做稀釋劑；在4000g下將試管離心20分鐘；然后，將上清液轉移至干凈的試管中，并廢棄沉淀物；再向0.5M乙酸中加入250μl的25ml氯化鈉溶液，沉淀膠原蛋白；在4000g下離心試管2小時；接著，將沉淀物再次溶解在pH7.5并含有0.15摩爾氯化鈉的0.05M Tris-HCl溶液中；再加入2ml的4.5M溶液沉淀膠原蛋白；2個小時后，在4000g下離心試管30分鐘；廢棄上清液，并使用2ml的2％乙醇清洗沉淀的膠原蛋白；在4000g下離心所得溶液30分鐘；最后，將每種沉淀物溶解在250μl的0.5M乙酸中。將溶液轉移至含有5-10ml閃爍溶液的閃爍小瓶中。按照Webster和Harvey所述的方法(生物化學分析96，220-224，1979)，在液體閃爍計數(shù)器中參照外部標準，測定其放射性。
纖維結合蛋白的合成在微孔平板中培養(yǎng)成纖維細胞，初始密度是20,000細胞/毫升，所用的介質是未含F(xiàn)CS的RPMI。
在5％二氧化碳環(huán)境37℃下培養(yǎng)細胞24小時。再更新介質。向培養(yǎng)物(1-1000μg/ml)中加入不同濃度的水龍骨屬提取物。然后，使用含有1％牛血清蛋白(BSA)和土溫20的PBS將細胞清洗3次。接著，使用水與丙酮(體積比為1∶1)溶液固定細胞30分鐘，再如上所述清洗細胞3次。使用鼠產(chǎn)生的單克隆抗-纖維結合蛋白抗體(Sigma F-7384)培養(yǎng)細胞。清洗后，在37℃下使用羊產(chǎn)生的抗-鼠IgG(強特效性)-堿性磷酸酶抗體培養(yǎng)細胞1小時。再次，將細胞清洗3次，在黑暗中使用濃度為1mg/ml的磷酸p-硝基苯酯溶液，培養(yǎng)細胞15分鐘。
然后，在200g下離心微量平板5分鐘，再將100μl上清液轉移到新的微量平板中。使用ELISA讀數(shù)器，測定405nm處的吸光度。
結果水龍骨屬提取物抑制膠原蛋白合成的效果所得結果如下

圖1圖解說明了上述結果。
水龍骨屬提取物抑制纖維結合蛋白合成的效果3個平行實驗所得的結果如下

從葉獲得的水龍骨屬提取物抑制纖維結合蛋白合成的效果。
3個平行實驗所得的結果如下

圖3圖解說明了上述結果。
權利要求
1.水龍骨屬提取物在制備治療纖維化疾病藥物組合物中的應用，纖維化疾病的舉例有硬皮癥、肺纖維化、動脈粥樣硬化、骨髓纖維化、腎纖維化、心臟纖維化、杜普伊特倫氏病、佩羅尼氏病。
2.權利要求1的水龍骨屬提取物的應用，其特征在于所述提取物降低了轉化生長因子β(TGF-β)的表達。
3.權利要求1和2的水龍骨屬提取物的應用，其特征在于所述提取物至少減少了佩羅尼氏病患者陰莖的內彎曲程度，或者減少了其陰莖病斑的數(shù)量，減輕了其性交時的痛苦，或者使患者獲得心理方面的改善。
4.根據(jù)權利要求1-3中任一權利要求的水龍骨屬提取物的應用，其中藥用組合物含有通過電介常數(shù)大于20溶劑提取獲得的水龍骨屬提取物。
5.權利要求4的水龍骨屬提取物的應用，其中藥用組合物含有采用溶解水溶性化合物方式提取獲得的提取物。
6.根據(jù)權利要求1-5中任一權利要求的應用，其中提取物是從根莖獲取的。
7.權利要求6的應用，其中提取物是從水龍骨屬leucotomos(Poiret)獲取的。
8.根據(jù)權利要求1-7中任一權利要求的應用，其特征在于提取物至少含有乳酸、延胡索酸、奎尼酸、檸檬酸或者蘋果酸。
9.根據(jù)權利要求1-8中任一權利要求的應用，其特征在于藥用組合物均口服用藥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種水龍骨屬提取物的新型治療劑，特別是治療纖維化病癥。水龍骨屬提取物在制備治療纖維化疾病藥物組合物中的應用，纖維化疾病的舉例有硬皮癥、肺纖維化、動脈粥樣硬化、骨髓纖維化、腎纖維化、心臟纖維化、杜普伊特倫氏病、佩羅尼氏病。
文檔編號A61P13/12GK1678332SQ03818692
公開日2005年10月5日 申請日期2003年6月5日 優(yōu)先權日2002年6月6日
發(fā)明者埃利塞奧·金塔尼麗亞·阿爾馬格羅 申請人:核心制藥技術公司