專利名稱：用于轉(zhuǎn)移活性劑的非聚合造血細胞凝塊的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及活性劑轉(zhuǎn)移，更具體地涉及在非聚合造血細胞凝塊幫助下的活性劑的轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明的背景用生物學(xué)因子和細胞來治療軟骨、骨組織、脊椎盤、以及軟組織的損傷對于增強缺損的修復(fù)來說是一種新興的方法。重組蛋白和蛋白生長因子的給藥促進了組織的生長，導(dǎo)致了如治療濃度的維持要求非常高的負荷劑量或者重復(fù)給藥等令人失望的結(jié)果，由此在增加了成本、復(fù)雜性，以及由于非目標器官的暴露而產(chǎn)生的不必要的副作用的風(fēng)險的同時，降低了修復(fù)的功效。
一種打算用于促進重組蛋白應(yīng)用于組織修復(fù)的方法，已經(jīng)打算將它們結(jié)合到不會引起排斥反應(yīng)的基質(zhì)或者是緩慢釋放的裝置中，用于植入到組織缺損，由此使該蛋白質(zhì)局部化于損害部位并且可能提供用于遷移細胞生殖的三維空間結(jié)構(gòu)。已經(jīng)被評定用于修補肌肉與骨骼組織的基質(zhì)包括多種合成的或天然的聚合物。這些方法也有局限性，那就是在數(shù)量上載入到基質(zhì)中的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)可能格外的昂貴，很少有延長和均衡的釋放，而且新成形的修復(fù)組織可以受到外來的植入材料不利地影響?；蜣D(zhuǎn)移提供了一種方法，可能克服蛋白質(zhì)輸送到被損害的組織的許多局限性。(BONADIO et al.，1999；Evans和Robbins，1995；Evans et al.，1995；Kang et al.，1997；Smith et al.，2000)本發(fā)明的概要本發(fā)明提供了一種新穎的用活性物質(zhì)，如，基因轉(zhuǎn)移載體，細胞和可溶性蛋白質(zhì)，治療受損害組織的方法。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的非聚合造血細胞凝塊的用途可以用于將物質(zhì)輸送到受試體。非聚合造血細胞凝塊行使作為轉(zhuǎn)移載體的職責(zé)，用于轉(zhuǎn)移物質(zhì)到受試體。
首先，本發(fā)明提供的是一種用于轉(zhuǎn)移物質(zhì)到受試體的方法。該方法包括向受試體服用包括物質(zhì)的非聚合造血細胞凝塊，以轉(zhuǎn)移該物質(zhì)到受試體。
其次，本發(fā)明提供的是一種制備非聚合造血細胞凝塊物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的方法。該方法包括向非聚合造血細胞的樣品添加物質(zhì)，并且包括物質(zhì)的造血細胞形成非聚合造血細胞凝塊。
再次，本發(fā)明提供一種物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，包括有物質(zhì)結(jié)合在其中的非聚合造血細胞凝塊。
該非聚合造血細胞凝塊可包括骨髓細胞，血細胞或?qū)纬赡龎K的任何一種其它細胞。該物質(zhì)可包括基因轉(zhuǎn)移載體；其他細胞，如基因工程細胞或原初細胞；蛋白質(zhì)，如重組或可溶性蛋白；生物活性分子或能夠影響受試體的任何其他類型的物質(zhì)。
非聚合造血細胞凝塊可能被輸送到任何形式的組織中。例如，在某些具體實施方案中，該組織是骨，軟組織，軟骨，韌帶，腱，半月板，以及無脊椎動物盤或身體的任何其它部位。
在某些實施方案中，非聚合造血細胞凝塊的形狀和大小可以由容器來決定。非聚合造血細胞凝塊可均勻分布著物質(zhì)。在其他具體實施方案中，非聚合造血細胞凝塊可以是遺傳上修飾過的，以表達至少一個生長因子和其他促進組織修復(fù)的基因產(chǎn)品。
在其他具體實施方案中，非聚合造血細胞凝塊的量可以由將被修復(fù)的組織所的大小所決定。
在還有一些其他的具體實施方案中，非聚合造血細胞凝塊可以從受試體上采集得到。在另一個具體實施方案中，骨質(zhì)細胞可以從髂骨嵴獲得，從暴露在骨髓之下骨軟骨的缺損獲得，或者是從受試體的任何其他可以獲得骨髓細胞的區(qū)域獲得。
物質(zhì)可以任意地以溶液的形式存在。
包含物質(zhì)非聚合造血細胞凝塊可以用滴定方法測定。該滴定可以使用吸液管完成。
在一些具體實施方案中，該非聚合造血細胞凝塊與至少是一種原初細胞和基因修飾過的細胞的懸濁液混合，形成細胞懸濁液。細胞懸濁液可包括另外的基因載體或無其他基因載體。
在其他的具體實施方案中，該轉(zhuǎn)移過程可以緩慢的，局部化的從非聚合造血細胞凝塊中釋放出該物質(zhì)。該非聚合造血細胞凝塊可以以允許有效地轉(zhuǎn)移該物質(zhì)的方式成型。物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)可以導(dǎo)致在物質(zhì)釋放的區(qū)域的組織的再生。
在一些具體實施方案中，非聚合造血細胞凝塊通過在室溫下或在被置于容器中的時候的凝結(jié)15-30分鐘的造血細胞的樣品中制備。非聚合造血細胞凝塊這時可從該容器中獲得。
非聚合造血細胞凝塊也可以通過在磷酸鹽緩沖鹽水中清洗過的造血細胞的樣品中制備。任何沒有結(jié)合的物質(zhì)都可以該非聚合造血細胞凝塊上除去。
依照其他具體實施方案，非聚合造血細胞凝塊可以植入到受試體中。物質(zhì)可以被轉(zhuǎn)移到該受試體。轉(zhuǎn)移過程可以是緩慢的從非聚合造血細胞凝塊局部釋放物質(zhì)。非聚合造血細胞凝塊轉(zhuǎn)移系統(tǒng)也可以隨意地用于再生組織。
造血細胞的樣品可以從受試體上采集，或者從造血細胞的另外的來源獲得。該受試體可以是相同的或不同的隨后會被植入凝塊的受試體。
圖形的詳細描述本發(fā)明的不同的具體實施方案將在下面通過實例和參考附隨的圖形而被描述，其中如

圖1所示是已經(jīng)用于基因治療的基因的范例表；如圖2所示是人類的血凝塊和膠原質(zhì)粘多糖基質(zhì)負荷能力的曲線圖；如圖3所示是含預(yù)先感染的兔子骨髓細胞的人血凝塊和在凝結(jié)24小時以后的圖片；如圖4所示是2毫米厚度，30毫米直徑的人類的血凝塊(在組織培養(yǎng)皿中形成的)；如圖5所示是GFP陽性細胞在第1天(圖5a)和第21天(圖5b)的凝結(jié)狀況如圖6所示是包括有被Ad TGF-β感染的兔骨髓細胞的兔血凝塊的TGF-β產(chǎn)量的曲線圖；如圖7所示是TGF-β相對于周圍媒介的表達的曲線圖，其中“BL”代表血“BM”，骨髓；如圖8所示是TGF-β在分解兔骨髓和血凝塊中的表達的示圖；如圖9所示是腺病毒在凝塊中穩(wěn)定性的示圖；如圖10所示是在第三天的活的兔子的有機體內(nèi)的基因表達示圖；如圖11所示是使用Gomori三色試劑盒著色的兔骨髓凝塊在生物體外6周后的圖片；如圖12所示是使用Gomori三色試劑盒著色的含Ad TGF-β的兔骨髓凝塊在生物體外6周后的圖片。
本發(fā)明的詳細描述本發(fā)明在此公開，物質(zhì)可以通過向受試體服用包括有該物質(zhì)的非聚合造血細胞凝塊而被轉(zhuǎn)移到受試體。在現(xiàn)有技術(shù)中用于轉(zhuǎn)移物質(zhì)到受試體的技術(shù)方法，有許多局限性。例如其中一些是昂貴的，復(fù)雜的，并且極少能夠有所需要的持續(xù)和均衡的釋放。
在此所使用的“造血細胞凝塊”是包括可以在不同的條件下形成凝塊的任何類型的造血細胞的凝塊。實例包括血凝塊和骨髓凝塊。骨髓或血的抽吸物可以通過最低限度的侵入手術(shù)輕易地從受試體獲得。與之相比較，制造人造基質(zhì)更加的耗時，昂貴，并且勞動強度大。為了形成血凝塊，由缺損的大小確定的一定量的血細胞，可以通過抽血從受試體采集得到。同樣，為了形成骨髓細胞凝塊，適當數(shù)量的骨髓抽吸物可以從富含骨髓的來源獲得，例如從骼骨嵴，從暴露在骨髓之下骨軟骨的缺損獲得，或者是從其他適當?shù)奈恢?。骨髓抽吸物和血液通常都有相同的密度并且有相似的凝結(jié)特性。
骨髓或血凝塊在組織修復(fù)中的使用提供了有利的條件，血凝塊的形成和骨髓細胞的轉(zhuǎn)移都是在骨軟骨缺損，骨，腱，半月板，或者椎間盤的缺損產(chǎn)生之后的自愈反應(yīng)的一部分。另外，骨髓凝塊富含干細胞，而干細胞保留了形成身體的不同組織的能力；由此，凝塊扮演著用于修復(fù)反應(yīng)的天生的小環(huán)境。如果與適當?shù)纳飫┙Y(jié)合，該造血凝塊有促進個別組織類型修復(fù)的潛能。
造血細胞可以從凝塊將被遞送的相同的受試體，從另外一個物質(zhì)將不會被遞送的受試體，從一個生長在生物體外的實驗室樣品，或從其他任何造血細胞的來源分離出來。很明顯，不同的情形和物質(zhì)將會促成造血細胞凝塊的不同的來源。例如，如果該造血細胞凝塊是從物質(zhì)將被轉(zhuǎn)移進去的相同的受試體獲得，那么凝塊完全是天生的并且對受試體來說是自體的。因此，造血細胞較小可能干涉物質(zhì)的轉(zhuǎn)移，抑制物質(zhì)想得到的效果或產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
該造血細胞凝塊可以是任何尺寸和形狀的。例如，該造血細胞凝塊可以以其在凝結(jié)過程期間自然形成的任何形狀使用。作為選擇的，也可以使造血細胞凝塊形成特殊的形狀和尺寸。具有特殊的尺寸或形狀的造血細胞凝塊在修復(fù)特殊的組織缺損時可能是有用的。在那樣的情況下，制造尺寸小于被矯正和治療的特殊的缺損的凝塊可能是很值得的。
一種使用成型容器用于制備特殊尺寸和形狀的造血細胞凝塊的方法。例如，該造血細胞凝塊可以在容器中形成，因而，造血細胞的樣品和物質(zhì)的混合物將在容器中凝結(jié)。以這樣的方式，該凝塊的尺寸和形狀將由容器的尺寸和形狀所確定。造血細胞凝塊也可以以允許有效地轉(zhuǎn)移像藥這樣的物質(zhì)的方式成形，也就是，甚至是在沒有組織缺損的情況下。造血細胞凝塊的固體狀態(tài)允許凝塊可以被輕易地操縱和植入到受損害的位置。
所前所述，造血細胞凝塊可以用于修復(fù)缺損的組織。凝塊可以放置到組織內(nèi)以幫助康復(fù)過程。優(yōu)選的，對修復(fù)過程中同樣有益的物質(zhì)被結(jié)合到凝塊中。在一些情況下，凝塊在修復(fù)過程期間可以單獨使用，僅僅提供用于細胞向內(nèi)生長的基質(zhì)，但是優(yōu)選的，如細胞，藥或基因載體的物質(zhì)，被結(jié)合到其中。有缺損的組織可以是任何需要修補的組織。例如，該組織可以是骨和不同的軟組織，包括卻不僅僅限于軟骨，韌帶，腱，半月板和椎間盤。另外，造血細胞凝塊可以用來作為生物體外系統(tǒng)用于為隨后的植入過程制造或修復(fù)組織。對于生物體內(nèi)組織的形成，造血細胞凝塊可以用該細胞播種，并且在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)。
該造血細胞凝塊也可以在沒有任何組織需要修復(fù)的情況下用于轉(zhuǎn)移藥或細胞到受試體。例如，凝塊可以用來作為任何其他的持續(xù)釋放裝置，用于轉(zhuǎn)移化合物的到受試體。該特殊的用途取決于被轉(zhuǎn)移到受試體的藥，細胞或基因載體的類型。
在此所使用的“受試體”是脊椎動物，如人，非人類的靈長類動物，牛，馬，豬，綿羊，山羊，狗，貓，或嚙齒類動物。
造血細胞凝塊的形成，可以發(fā)生在不同的狀態(tài)下，如在室溫下。例如，兔或人的血液和骨髓抽吸物的凝結(jié)物將會在大約15-30分鐘內(nèi)出現(xiàn)。如果有必要的話，凝塊可以因此通過在內(nèi)部操作而產(chǎn)生和植入。
一旦造血細胞凝塊已經(jīng)形成，任何沒有結(jié)合的物質(zhì)都可以從凝塊除去。例如，讓造血細胞凝塊在如磷酸鹽緩沖液的溶液中清洗。更詳細的用于制備凝塊的實例在通過描述下面的實驗之后被闡述明了。那些本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員都能夠由此聯(lián)想到其他的用于制備造血細胞凝塊的方法。
在此所使用的“非聚合造血細胞凝塊”是如前所詳述過的造血細胞凝塊，其中聚合體基質(zhì)沒有被結(jié)合到凝塊中，或者用來作為凝塊的構(gòu)造物。大多數(shù)用于組織修復(fù)的藥物轉(zhuǎn)移裝置使用聚合物基質(zhì)作為構(gòu)造物用于轉(zhuǎn)移藥物。聚合物基質(zhì)由聚合物形成，如改良的或天然的多糖，如脫乙酰殼多糖，殼多糖，hyaluronan，粘多糖，硫酸軟骨素，硫酸角質(zhì)素，硫酸皮膚素，肝素，或硫酸肝素。聚合物可以是天然的，重組的或合成的蛋白質(zhì)，例如可溶性膠原質(zhì)或可溶性凝膠，或者是多聚氨基酸，如聚賴氨酸。聚合物也可以是聚乳酸，聚乙醇酸，合成的均聚和嵌段共聚物，包括羧基的，氨基的，磺酸基的，磷的，有或沒有附加官能團的次磷官能團，沒有限制地，如羥基，硫醇，allcoxy，芳氧基，酰氧基，和芳?；Ａ硗?，聚合物可包括orthoesters，酐，丙烯共延胡索酸酯，[propylene-co-fumarates]或有一個或更多α-羥基羧酸單體的聚合物，(如，α-羥基乙酸(羥基乙酸)和/或羥基丙酸(乳酸))。
聚合物可以最初溶解或懸浮于包括無機鹽，如氯化鈉，鉀，鈣，磷酸鎂，硫酸鹽，和羧酸鹽的緩沖液中。聚合物也可以溶于或懸浮于包括有機鹽，如甘油磷酸鹽，果糖磷酸鹽，葡萄糖磷酸鹽，L-絲氨酸磷酸鹽，腺苷磷酸鹽，[glycerol-phosphate，fructosephosphate，glucose phosphate，L-Serine phosphate，adenosinephosphate]葡糖胺，氨基半乳糖，HEPES，PIPES和MES的緩沖液中。
優(yōu)選的，物質(zhì)被結(jié)合到非聚合造血細胞凝塊中。在此所使用的“物質(zhì)”是任何將對受試體有影響的組合物，包括診斷的影響。物質(zhì)可以是，例如，細胞或任何其他活性劑，如，藥或有能力表達肽的基因載體，小分子，等。物質(zhì)是外源性的物質(zhì)。也就是說，它是被加入造血細胞樣品的，并且是在它取自它以前的環(huán)境(如，受試體，生物體外的環(huán)境，等)之前細胞樣品中所沒有的。物質(zhì)的樣品包括基因傳遞載體(病毒的和非病毒的)，其他細胞，遺傳工程的或天然的、重組的、可溶的或任何其他類型的蛋白質(zhì)或者其他生物活性分子，如生長因子。
在此所使用的活性劑，是對生物學(xué)有機體有診斷的，預(yù)防疾病的，或治療上效果的任何化合物?；钚詣┌ɑ衔?，如蛋白質(zhì)，縮氨酸，抗體，多聚糖，核酸(如，RNA，DNA，PNA，它們的復(fù)合體(如，三重的))，糖類，糖蛋白類，氨基酸，病毒，不同種類大分子的混合物(如，天然產(chǎn)品的提取物)和大分子混合體(如，蛋白質(zhì)/核酸混合體，清蛋白綴合蛋白，含無機分子接頭的藥，有機分子，或它們的組合物)。
生物活性劑是對生物有機體具有預(yù)防疾病或治療效果的任何化合物。在有些實施方案中，該生物活性劑可以是下面的任何物質(zhì)腎上腺素能藥；腎上腺皮質(zhì)類固醇；腎上腺皮質(zhì)抑制劑；認知治療劑，抗血小板，醛固酮拮抗劑；氨基酸；合成代謝的；復(fù)素藥；止痛劑；麻醉劑；厭食劑；抗痤瘡劑；抗腎上腺素能藥；抗變應(yīng)性劑；抗-Alzheimer′s，抗阿米巴藥；補血藥；抗心絞痛藥；抗關(guān)節(jié)炎藥；止喘藥；抗動脈粥樣硬化藥；抗菌藥；抗膽堿能藥；抗凝血劑；抗痙攣藥；抗抑郁劑；抗糖尿病藥劑；抗利尿劑；止吐劑；抗癲癇藥劑；抗溶解纖維蛋白的藥物；抗真菌素；止血藥；抗組胺劑；抗高血脂藥；抗高血壓藥；抗低血壓藥；抗傳染藥；抗炎藥；抗菌劑；抗偏頭痛藥；抗有絲分裂藥；抗霉菌藥，止惡心藥，抗瘤劑，抗中性白細胞減少癥，抗寄生蟲藥；抗增生藥劑；安定藥；治療風(fēng)濕藥劑；康皮脂溢劑；抑制分泌藥劑；止痙攣的藥；抗血栓形成藥；抗?jié)兯?；抗病毒藥；抗焦慮藥，抑制食欲藥；血糖調(diào)節(jié)劑；骨吸收抑制劑；支氣管擴張藥；心血管疾病治療劑；類乙酰膽堿藥；COX1抑制劑，COX2抑制劑，直接凝血酶抑制劑，鎮(zhèn)靜劑；診斷輔助藥劑；利尿劑；多巴胺能藥；雌激素受體增效劑；溶解纖維蛋白藥劑；熒光劑；游離氧基清除劑；腸胃蠕動效應(yīng)劑；腎上腺皮質(zhì)激素；GPIIbIIIa拮抗劑，毛發(fā)生長促進劑；止血劑；組胺H2受體增效劑；荷爾蒙；人類生長激素，膽固醇過少藥；低血糖癥藥劑；促使血清脂質(zhì)減少藥劑；催眠藥，降血壓藥；顯像藥劑；免疫學(xué)的藥劑，如免疫劑，免疫調(diào)節(jié)劑，免疫控制劑，免疫促進劑，免疫抑制劑；角質(zhì)分離劑劑；LHRH增效劑；情緒調(diào)節(jié)劑；黏液溶解劑；散瞳劑；鼻解充血藥；神經(jīng)肌肉阻斷劑；神經(jīng)元保護劑；NMDA拮抗劑；荷爾蒙固醇衍生物；纖維蛋白酶原激活劑；血小板活性因子拮抗劑；血小板聚合抑制劑；質(zhì)子泵抑制劑，神經(jīng)藥物；放射性藥物；滅疥癬藥；致硬化劑；鎮(zhèn)靜劑；鎮(zhèn)靜催眠劑；選擇性腺苷A1拮抗劑；5-羥色胺拮抗劑；5-羥色胺抑制劑；5-羥色胺受體拮抗劑；抑制素，類固醇；甲狀腺激素；甲狀腺抑制劑；抑甲狀腺腺藥；鎮(zhèn)定劑；肌萎縮性側(cè)索硬化癥藥；腦缺血藥劑；Paget′s癥劑；不穩(wěn)定心絞痛劑；血管縮小劑；血管擴張劑；傷口治療劑；黃嘌呤氧化酶抑制劑。
一個優(yōu)選的非聚合造血細胞凝塊的用途是修復(fù)骨和組織的缺損。最可能連接軟骨、骨和軟組織修復(fù)的蛋白質(zhì)，是β轉(zhuǎn)移生長因子(TGF-β)超家族的組成部分包括TGF-βS1-3，各種各樣的骨成型素蛋白(BMPs)，纖維原細胞生長因子，生長激素，和胰島素類生長因子(IGFs)。
在體內(nèi)服用重組蛋白以增強軟骨的形成和軟骨的修復(fù)以及骨和軟組織的形成和修復(fù)，已經(jīng)在不同的缺損模式下和實驗動物中進行了研究。(Hunziker，2001；Nixon et al.，1999；Sellers etal.，1997)盡管得到有希望的結(jié)果，但是重組蛋白在臨床上的應(yīng)用還是受到這些分子較短的生物半壽期以及缺乏有效地維持和目標轉(zhuǎn)移方式而受到阻礙。直接注射蛋白生長因子進入到組織損傷的位置，由于因子受到體內(nèi)液體的稀釋很快地產(chǎn)生代謝變化或是散布到其它組織中，已經(jīng)導(dǎo)致令人失望的結(jié)果。這樣，維持治療的濃度要求非常高的負荷劑量或重復(fù)給藥。這樣就減小了修復(fù)的功效，同時增加了成本，復(fù)雜性和非目標器官受影響產(chǎn)生不必要的副作用的風(fēng)險。在此所描述的非聚合造血細胞凝塊克服了許多這些方面的問題，正如在下面的實驗中所證實的。
凝塊通常也被用于轉(zhuǎn)移基因到受試體，或是到受試體的特殊的組織。在此所使用的“基因”，是長度大于三十個核苷酸的離體的核酸分子，更有代表性的是一百個核苷酸或更多。它一般會在適當?shù)膯右蜃拥目刂浦?，啟動因子可以是誘導(dǎo)型的，阻遏型的，或組成型的。在置換或補充所期望的功能，或達到所需要的效果，如抑制瘤的生長，等方面有用的任何基因，都能夠使用在此所述的凝塊引導(dǎo)。啟動因子可以是普通的啟動因子，在多種哺乳動物細胞中表達，或細胞特異性的，或是細胞質(zhì)相對的核特異性的。這些對于本領(lǐng)域內(nèi)的那些普通技術(shù)人員來說都是眾所周知的，并且能夠運用通常的分子生物學(xué)實驗方案來創(chuàng)設(shè)。
依照本發(fā)明的方法的任何類型的基因都是有用的。用于特殊情況下的特殊基因?qū)⑷Q于被治療的情況和/或所希望的治療結(jié)果。已經(jīng)用于基因治療的有代表性的基因范例表如表1所示。在本發(fā)明的一些實施方案中，列于表1中的任何一個基因或基因的組合到可以被結(jié)合到本發(fā)明的轉(zhuǎn)移裝置中。
基因轉(zhuǎn)移提供了可以克服將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到受損組織的許多方法的局限性。本發(fā)明在此公開了一種通過應(yīng)用基因轉(zhuǎn)移載體，細胞和可溶性蛋白來醫(yī)治受損組織的新穎的方法。通過將編碼具有修復(fù)或治療潛能蛋白質(zhì)的cDNAs轉(zhuǎn)移到受損或疾病部位的特異細胞，遺傳修飾的細胞成為藥物產(chǎn)生的局部因子，允許持續(xù)地合成特殊蛋白。
適合于這樣的基因的合適的啟動因子、強化因子、載體等，都已經(jīng)公布在文獻中。一般，有用的基因替換或補充功能，包括基因編碼缺乏酶，如腺苷脫氨酶(ADA)，已經(jīng)用于治療ADA缺乏和輔助因子如胰島素的以及凝結(jié)因子VIII的臨床試驗中。影響調(diào)節(jié)的基因也能夠單獨或與基因補充或替換特殊功能相結(jié)合來給藥。例如，編碼抑制特殊的蛋白編碼基因表達的蛋白的基因可以通過本發(fā)明所述的凝塊給藥?；蚩梢匀∽曰蛟从诓煌膩碓矗ㄎ墨I參考，Genbank，或商業(yè)上的供應(yīng)者。如果相對較小，它們可以使用固相合成法來合成，從保藏樣品獲得，如美國類型培養(yǎng)基American Type solid phase ROCKVILLE，MD保藏物，或者使用公開的序列信息重新分離制備。
除了基因之外，物質(zhì)也可以是通過它們的長度和功能從基因中辨別出來的短的寡核苷酸如反義的，以及核糖核酸構(gòu)成酶。和這些短的寡核苷酸不同的是，基因編碼蛋白也因此優(yōu)選的是最低長度大于100個堿基對，更優(yōu)選的是數(shù)百個堿基對。
在此所使用的載體，是不被降解的轉(zhuǎn)移基因到細胞中的媒介物，并且包括在其將被輸送進入的細胞中產(chǎn)生基因表達的啟動因子。
基因表達載體中的基因可以轉(zhuǎn)染進入宿主細胞和細胞系，如在生物體外的原核的基因(如，E.coli)，或真核狀態(tài)的基因(如，樹突狀細胞，B cells，CHO cells，COS cells，酵母基因表達系統(tǒng)和在昆蟲細胞中的重組桿狀病毒的基因表達)，這一點也已經(jīng)經(jīng)過驗證。這些細胞因而可以被結(jié)合到凝塊中。尤其有益的是哺乳動物細胞中，如人，鼠，倉鼠，豬，山羊，靈長類動物，等。它們可以是廣泛的多樣性的組織，并且包括初生細胞和細胞系。特殊樣品包括角化細胞，外周血白細胞，骨髓干細胞和胚胎干細胞?；虮磉_載體要求相關(guān)的基因序列可操作的連接到受試體。
在一些實施方案中，用于轉(zhuǎn)移基因的病毒載體選自包括腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，痘病毒包括牛痘病毒和弱化的痘病毒，澤姆利基森林病毒，委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒，逆轉(zhuǎn)錄酶病毒，仙臺病毒，和Ty-病毒樣顆粒的組群。已經(jīng)用于轉(zhuǎn)移外源性核酸的病毒和病毒樣顆粒的樣品包括復(fù)制缺陷型病毒(如，Xiang et al.，濾過性微生物學(xué)219220-227，1996；Eloit et al.，J.VirolL.75375-5381，1997；Chengalvala et al.，疫苗15335-339，1997)，改良的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒(Townsend et al.，J.VirolL.713365-3374，1997)，非復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄酶病毒(Irwin et AL.，J.VirolL.685036-5044，1994)，復(fù)制缺陷型澤姆利基森林病毒(Zhao etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 923009-3013，1995)，金絲雀痘病毒和極度弱化的牛痘病毒的衍生物(Paoletti，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9311349-11353，1996)，非復(fù)制牛痘病毒(Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9311341-11348，1996)，復(fù)制牛痘病毒(Moss，Dev.Biol.Stand，8255-63，1994)，委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Davis et AL.，J.Virol.703781-3787，1996)，仙臺病毒(Pugachev et al.，濾過性微生物學(xué)212587-594，1995)和Ty-病毒樣顆粒(Allsopp et al.，Eur.J.Immumol 261951-1959，1996)。在優(yōu)選的實施方案中，該病毒載體是腺病毒或α-病毒。
另一個優(yōu)選的用于確定的應(yīng)用的病毒是腺病毒相關(guān)病毒，雙鏈DNA病毒。腺病毒相關(guān)病毒能夠感染廣泛范圍的細胞類型和物種，并且可以被改變?yōu)閺?fù)制缺乏型。它還有進一步的優(yōu)勢，如耐熱性和脂溶穩(wěn)定性，在包括造血細胞的不同的細胞譜系中的高轉(zhuǎn)導(dǎo)作用頻率，以及缺乏重復(fù)感染抑制從而允許多重系列的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。腺病毒相關(guān)病毒可以以部位特異性方式結(jié)合到人類細胞的DNA中，由此最小化插入突變作用的可能性以及插入基因表達的可變性。另外，野生型腺病毒相關(guān)病毒感染已經(jīng)在缺乏選擇壓力的情況下在組織培養(yǎng)中觀察超過100代，這意味著腺病毒相關(guān)病毒基因組整合作用是相對穩(wěn)定的事件。腺病毒相關(guān)病毒也可以以染色體外的形式發(fā)揮作用。
一般而言，其他優(yōu)選的濾過性毒菌都基于非致細胞病的真核病毒，其中非必需基因已經(jīng)被有價值的基因所替代。非致細胞病的病毒包括逆轉(zhuǎn)錄酶病毒，它的生命周期包括逆向轉(zhuǎn)錄基因組的濾過性毒菌的RNA以隨附的前病毒的整合作用進入到宿主細胞的DNA中的方式進入到DNA中。腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄酶病毒已經(jīng)被認可用于人類基因治療的試驗。一般而言，逆轉(zhuǎn)錄酶病毒都是復(fù)制缺乏型的(如，能夠直接合成所需要的蛋白質(zhì)，但是不能制造感染性顆粒)。這樣在遺傳學(xué)上改變反轉(zhuǎn)錄的基因表達載體對于在活的有機生物體內(nèi)的高效率的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)作用有綜合的效用。用于生產(chǎn)復(fù)制缺乏型的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒的標準的試驗設(shè)計(包括的步驟有外源性的遺傳物質(zhì)結(jié)合進入質(zhì)粒，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染包裝的細胞系，通過包裝細胞系制造重組的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒，從組織培養(yǎng)培養(yǎng)基采集濾過性毒菌顆粒，然后用濾過性毒菌顆粒感染靶細胞)在Kriegler.M的《基因轉(zhuǎn)移和基因表達，實驗室手冊》，W.H.Freeman公司，紐約(1990)，和Murry，E.J.Ed.的《分子生物學(xué)方法》第7卷Humana出版有限公司，克利夫頓，新澤西(1991)。
優(yōu)選的前述核酸轉(zhuǎn)移載體(1)包括在哺乳動物的細胞中可以轉(zhuǎn)錄和翻譯的外源性的基因物質(zhì)，以及(2)可任選的包括在表面上的選擇性地結(jié)合到如哺乳動物細胞的靶細胞的表面上的受體的配合體，并由此獲得進入靶細胞的入口。
不同的技術(shù)可被用于引導(dǎo)本發(fā)明的核酸進入細胞，依靠的不管是核酸在生物體外被引導(dǎo)，還是在宿主的活的生物體內(nèi)被引導(dǎo)。這樣的技術(shù)包括核酸CaPO4沉淀物的轉(zhuǎn)染，DEAE關(guān)聯(lián)性核酸的轉(zhuǎn)染，用前述的包括所關(guān)注的核酸的病毒來轉(zhuǎn)染或感染，脂質(zhì)體作為引起媒介的轉(zhuǎn)染，等等。對于確定的用途，可以優(yōu)選地將核酸靶中具體細胞，尤其是如果在凝塊被植入或給藥到離靶細胞較遠的位置。在這樣的實例中，用來轉(zhuǎn)移本發(fā)明的核酸進入到細胞中(如，逆轉(zhuǎn)錄酶病毒，或其他病毒；脂質(zhì)體)的載體在從凝塊釋放以后，可以將靶分子附于細胞上。例如，分子，如在靶細胞或用來作為在靶細胞上的受體配合體上的，與表面膜蛋白相區(qū)別的抗體，可以約束或結(jié)合到核酸轉(zhuǎn)移載體內(nèi)。在脂質(zhì)體用于轉(zhuǎn)移基因的情況中，與細胞內(nèi)吞作用有關(guān)的表面膜蛋白的結(jié)合的蛋白質(zhì)可摻入到脂質(zhì)體的組成中，用于定向和/或促進攝取。這樣的蛋白質(zhì)包括衣殼蛋白或其向性的于特殊的細胞類型的碎片，用于在循環(huán)中經(jīng)歷細胞內(nèi)化作用的蛋白的抗體，導(dǎo)向細胞內(nèi)局部化作用以及增強細胞內(nèi)半壽期的蛋白質(zhì)，等等。該物質(zhì)可以以任何狀態(tài)存在，如溶液，固體，載體，氣體或任何其他能夠使該物質(zhì)與造血細胞混合以形成凝塊的狀態(tài)。
對于直接的基因轉(zhuǎn)移，采集到的血液或骨髓可被加入到包括基因轉(zhuǎn)移載體(病毒的，或非病毒)或蛋白質(zhì)的溶液中，該溶液存在于適當?shù)某尚统叽绾统尚托螤畹钠髅蠡蛘呷魏纹渌軌蛟试S細胞樣品與物質(zhì)混合的器皿中。該混合物可以用吸液管滴定或者任何其他能夠?qū)⒃撐镔|(zhì)與細胞樣品混合的裝置或方法得到。
對于在活的有機體外的基因轉(zhuǎn)移方法，造血細胞，如，血液或骨髓抽吸物可以與含有或不含有附加的載體的天然的或遺傳修飾的細胞的懸浮液混合。該細胞然后被結(jié)合到凝塊中接著又被送回到生物體內(nèi)。
本發(fā)明也包括產(chǎn)品。該產(chǎn)品是物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。在此所使用的“物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)”是包括物質(zhì)的非聚合造血細胞凝塊，這樣，非聚合造血細胞凝塊可轉(zhuǎn)移物質(zhì)到受試體。
在給藥的時候，該組合物(包括物質(zhì)的非聚合造血細胞凝塊)可以以制藥上可接受的制劑的形式給藥。這樣的制劑可以常規(guī)地包括制藥上可接受的鹽的濃縮物，緩沖劑，防腐劑，適合的載體和任意其他非結(jié)合性治療劑。
組合物可以通過任何常規(guī)的途徑給藥，包括注射或多次逐步地輸注。給藥方式可以是，如，直接注射或植入的，口服的，靜脈的，腹膜內(nèi)的，肌肉的，腔內(nèi)的，肺內(nèi)的，黏膜的(如，直腸的，陰道的，眼睛的，皮膚的，鼻內(nèi)的，等)，皮下的，氣霧劑，或經(jīng)皮的。給藥可以是全身的或局部的。
本發(fā)明的組合物以有效量給藥?！坝行Я俊笔侵竼为?，或更多的劑量一起，引起所期望的反應(yīng)的組合物的量。所期望的反應(yīng)，當然取決于被治療的特殊狀況以及細胞或在凝塊內(nèi)被給藥的活性劑的類型。這些因素對于本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員來說是眾所周知的，并且可以僅僅通過常規(guī)的實驗來處理。通常優(yōu)選的是，在此使用單獨的成分或其化合物的最大的劑量，也就是，依照可靠的醫(yī)學(xué)判斷的最大的安全劑量。本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員將會明白，無論如何，患者可能因為醫(yī)學(xué)上的原因、心理上的原因、或?qū)嶋H上任何其他原因，而堅持較低的劑量或者的可以容忍的劑量。在前述的方法中使用的該組合物優(yōu)選的是無菌的，并且包括用于在重量和體積適當?shù)膯卧獌?nèi)通過給藥到患者以產(chǎn)生所期望的反應(yīng)的有效量的物質(zhì)。
在給藥時，本發(fā)明的制藥上的制劑以制藥上可接受的量和制藥上可接受的組合物的形式應(yīng)用。術(shù)語“制藥上可接受的”的意思是指無毒性，不會干擾活性成分的生物學(xué)行為的效力。這樣的制劑可以常規(guī)地包括鹽，緩沖劑，防腐劑，適合的載體，以及任意其它治療劑。在藥中使用的時候，該鹽應(yīng)該是制藥上可接受的，但是非制藥上可接受的鹽也可以方便地用于制備其制藥上可接受的鹽，并且不會被排斥在本發(fā)明的范圍之外。這樣的藥學(xué)上或制藥上可接受的鹽包括，但是不僅僅限于，通過下面的酸所制備的鹽氯化氫的，溴化氫的，含硫的，含氮的，含磷的，馬來酸的，乙酸的，水揚酸的，檸檬酸的，甲酸的，丙二酸的，丁二酸的，等等。同樣，制藥上可接受的鹽也可以制備成堿金屬的或堿土鹽，如鈉，鉀或鈣鹽。
實例在生物體外實例1血或骨髓凝塊的負荷能力為了確定可以被加入到人血中而不會破壞凝結(jié)過程的液體的最大的量，200μl的血和漸增量的PBS混合。在加入的PBS的量差不多有血量的兩倍的時候，凝結(jié)狀態(tài)仍然存在。如表2所示的是，這一發(fā)現(xiàn)與有相同數(shù)量的能夠被膠原質(zhì)粘多糖基質(zhì)(膠原質(zhì)gag基質(zhì))吸收的液體量的比較。在吸收液體方面，凝塊和膠原質(zhì)gag基質(zhì)之間液體的吸收沒有重大的區(qū)別。
為了確定人類的血凝塊是否能夠并入細胞，培養(yǎng)兔骨髓細胞的單細胞層，然后用攜帶著編碼有綠色熒光蛋白(GFP)的基因的腺病毒載體感染。在24小時以后，大約600,000個熒光細胞被胰蛋白酶化并且通過離心過濾作用分離出來。細胞顆粒狀物各自重懸浮于450μl的人類血液中。這些血和細胞的構(gòu)成物隨后在微離心管中凝結(jié)。1小時以后采集凝塊，浸入1ml的PBS中并且在HAM的F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，每樣都在12個井盤中。
人血凝塊在凝結(jié)24小時以后，顯現(xiàn)了的高密度的綠色熒光兔骨髓細胞，正如圖3所表示的。分析凝結(jié)以后在Eppendorf管中的殘存液顯示沒有殘留的綠色細胞，說明所有的轉(zhuǎn)導(dǎo)兔骨髓細胞都已經(jīng)被保留在人血凝塊中。
實例2凝塊的形成實驗室使用不同的器皿來完成凝結(jié)，確定了凝塊可以成形為廣泛的多樣性的形狀和大小。凝塊因而可以足夠穩(wěn)定的產(chǎn)生保留，以被植入任何大小和形狀的缺損中，其實例如圖4所示。
實例3帶有遺傳改良細胞的血凝塊和骨髓凝塊的播種(以模擬生物體外基因轉(zhuǎn)移途徑)為了模擬生物體外的基因轉(zhuǎn)移途徑，4組兔血凝塊進行了生物體外實驗1.僅450μl的兔血2.450μl的兔血與含400,000個兔骨髓細胞的懸濁液混合3.450μl的兔血與含400,000個用表達GFP的重組腺病毒基因修飾過的兔骨髓細胞的懸濁液混合
4.450μl的兔血與含400,000個用表達TGF-β的重組腺病毒基因修飾過的兔骨髓細胞的懸濁液混合每一組實驗重復(fù)4次。凝塊通過熒光微顯微鏡法在第1，3，7，14，和21天進行檢測。通過運用酶聯(lián)免疫吸附測定來測量培養(yǎng)基中TGF-β的量來確定凝塊中TGF-β的表達，凝塊和轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達TGF-β的細胞一起種的。
凝塊內(nèi)的熒光細胞在生物體外接受至少21天的觀測。圖5a顯示細胞在第1天的狀況，圖5b顯示的是細胞在21天后的狀況。同樣TGF-β基因表達也至少觀測21天，其在第7天達到最大，結(jié)果如圖6所示。
實例4在血凝塊和骨髓凝塊中的細胞直接轉(zhuǎn)導(dǎo)作用(以模擬直接的基因轉(zhuǎn)移方法)為了確定血凝塊或骨髓凝塊中的細胞是否可以支持轉(zhuǎn)基因表達，將血和骨髓與腺病毒的載體、Ad TGF-β以及Ad GFP混合。
1.僅450μl的兔血2.450μl的兔血和10μl的Ad GFP3.450μl的兔血和10μl的Ad TGF-β4.僅450μl的兔骨髓抽吸物5.450μl的兔骨髓抽吸物和10μl的Ad GFP6.450μl的兔骨髓抽吸物和10μl的Ad TGF-β
每一組實驗重復(fù)4次。凝塊以如前所述的方法形成并且用微顯微鏡法在第1，3，7，14，和21天進行檢測。在相同的時間點完成對經(jīng)過調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基的酶聯(lián)免疫吸附測定，以檢測TGF-β基因表達。
觀測在血凝塊和骨髓凝塊中的GFP基因表達直到第14天，其結(jié)果如圖7所示。
觀測骨髓凝塊中的TGF-β產(chǎn)物直到第7天連，其在第3天達到最大，然后在第14天減小到背景水平。
相反，在被Ad TGF-β感染的血凝塊中沒有可檢測到水平的TGF-β基因表達。在培養(yǎng)基中沒有分泌的TGF-β可能是由于生長因子在凝塊中被捕捉，或者是由于其他的載體的差異。
量化在血凝塊中采集到的這些轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物殘留在的進一步的實驗，通過相同的程序來完成，其結(jié)果如圖8所示。
1.兔血(450μl)2.兔骨髓(450μl)3.兔血(450μl)和Ad TGF-β(10μl)4.兔骨髓(450μl)和TGF-β(10μl)在培養(yǎng)的第2天，采集凝塊，在PBS中沖洗，用機械的方式分解，然后在HAM的F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在第3，7，14，21天化驗TGF-β的水平。
血和骨髓凝塊中TGF-β的水平在基因轉(zhuǎn)移后的第3天達到高值，但是在第7天下落到非常低的水平。然而，骨髓凝塊與血凝塊相比較，表達出六倍高的TGF-β全部的基因表達，很可能是由于其更高的細胞結(jié)構(gòu)。同樣，與血相比較，骨髓的使用對于在直接基因轉(zhuǎn)移之后的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的基因表達似乎更有效。
實例5在血凝塊和骨髓凝塊中的腺病毒的穩(wěn)定性執(zhí)行進一步的研究，以確定有傳染性的病毒載體是否能夠被保留在凝塊中并維持轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，其結(jié)果如圖9所示。
血凝塊和骨髓凝塊被Ad GFP感染并培養(yǎng)，正如前面所述的。凝塊在不同的時間點被機械地分解并且經(jīng)歷離心作用以除去細胞殘片。采集上層清液并用于感染293細胞的單分子層培養(yǎng)物。在24小時候分析細胞的熒光性。
熒光細胞確實出現(xiàn)在被上層清液感染的培養(yǎng)液中，該上層清液取自被破碎的凝塊的第1，3，和7天的樣品。
這一結(jié)果表明了從凝塊中采集到的病毒載體，Ad GFP，能夠在培養(yǎng)液中保留其傳染性至少7天。
在活的生物體內(nèi)實例6使用自體的血凝塊和骨髓凝塊直接轉(zhuǎn)移基因到兔膝部的受損軟骨為了達到這樣的目的，腺病毒基因轉(zhuǎn)移載體與由新西蘭白兔獲得的血或骨髓抽吸物混合并凝結(jié)，該腺病毒基因轉(zhuǎn)移載體上的基因用熒光素酶、GFP、和/或Lac Z編碼過。在凝結(jié)(大約30分鐘)之后，血或骨髓載體結(jié)構(gòu)被植入到在同一兔子的股骨踝通過外科手術(shù)形成的骨軟骨缺損處。植入后，縫合關(guān)節(jié)囊并使動物蘇醒。在第3天后，殺死兔子并且從受損部位采集凝塊。通過定量的分析，測定在凝塊中的熒光酶的活性。通過定性的分析，在顯微鏡下對熒光細胞進行觀察。對鄰近的滑膜同樣進行轉(zhuǎn)基因表達的檢測。
如圖10所示，在采集到的被混合了AD熒光酶的血凝塊和骨髓凝塊中觀測到高水平的熒光酶轉(zhuǎn)基因表達。同樣，在采集到的被Ad GFP感染的凝塊中觀測到大量的熒光細胞。在直接靠近缺損部位的滑液的內(nèi)層也觀測到了少量綠色細胞。然而，在滑膜的其他區(qū)域未發(fā)現(xiàn)基因表達。這些結(jié)果與直接基因轉(zhuǎn)移包括Ad GFP的膠原質(zhì)GAG基質(zhì)到骨軟骨缺損之后觀測到的較高的綠色熒光滑液內(nèi)層形成了對照。這樣，血和骨髓凝塊在植入到活的生物體內(nèi)時，提供更多的包括局部化的轉(zhuǎn)基因表達。
實例7使用兔血凝塊和骨髓凝塊對于軟骨生成或骨生成的潛能本試驗研究在血和骨髓凝塊中的內(nèi)源性前體細胞對于改變表型以及在血凝塊和骨髓凝塊中進行成軟骨或成骨分化的能力。為了達到這一目的，從新西蘭白兔采集用于總共6組試驗的血和骨髓1.兔血(450μl)(1個凝塊)2.兔血(450μl)和Ad GFP(10μl)(3個凝塊)3.兔血(450μl)和Ad TGF-β(10μl)(4個凝塊)4.兔骨髓(450μl)(1個凝塊)5.兔骨髓(450μl)和Ad GFP(10μl)(5個凝塊)
6.兔骨髓(450μl)和Ad TGF-β(10μl)(3個凝塊)凝塊在HAM的F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)6周。采集后混合，裝填石蠟，切片并檢查組織結(jié)構(gòu)。切片用蘇木精曙紅和Gomori三色試劑盒(藍色膠原質(zhì)著色)染色。切片通過三個不同的個體以未知的方式被檢查。
在未被生長因子基因修飾過的骨髓凝塊中(僅僅是骨髓并且是與Ad GFP混合的骨髓)，內(nèi)源性細胞的多能性是顯而易見的。肌肉類、脂肪類和纖維組織區(qū)域在6周后發(fā)現(xiàn)了所有這些凝塊，如圖11所示。富含Ad TGF-β的骨髓凝塊說明了更多的同質(zhì)分化，沒有觀察到肌肉類組織。代之以，更多的纖維組織被觀察到，如圖12所示。
在血凝塊中的細胞分化并不明顯。然而，載體的不同的濃縮物和化合物可能導(dǎo)致分化。這些結(jié)果暗示在骨髓凝塊中的細胞是多潛能的，具有區(qū)分許多組織類型的能力。
因為腺病毒載體是研究基因產(chǎn)物過度表達影響的強有力的工具，所以它們成為在此所描述的實驗的載體的選擇。然而，據(jù)預(yù)測，其它的基因轉(zhuǎn)移載體，如，腺病毒相關(guān)型病毒(AAV)和逆轉(zhuǎn)錄酶的載體可能比源自腺病毒的載體有更加廣闊的臨床應(yīng)用前景。
實例8Ad TGF-β改良的用于修補的軟骨組織的骨髓凝塊的用途本試驗研究在修補的軟骨組織中的骨髓凝塊的用途。在兔膝關(guān)節(jié)鉆一個3毫米寬和8毫米深的孔，穿過軟骨并且進入到骨和骨髓，由此造成骨軟骨缺損。對照缺損或者維持未治療狀態(tài)(未使用的缺損)或者接受未被改良過的骨髓凝塊。將預(yù)先已經(jīng)用包括轉(zhuǎn)移生長因子beta-1(TGF-β)基因的腺病毒感染的骨髓凝塊植入到保留的骨軟骨缺損中。
在手術(shù)六周后取樣品作載玻片并且用蘇木精曙紅(H&E)和甲苯胺藍染色。H&E是普通的酸堿組織染料；甲苯胺藍作為粘多糖(GAGs)指示劑。
在維持未治療狀態(tài)的對照缺損中，形成了與傍側(cè)軟骨不相似的纖維性修復(fù)。通過植入改良的骨髓凝塊而被處理過的其他的對照缺損僅僅顯示在骨的表面，并且沒有GAGs。
用預(yù)先感染的包括TGF-β的骨髓凝塊處理過的缺損，有成軟骨的出現(xiàn)，顯示了強壯的細胞外基質(zhì)。在多數(shù)修復(fù)中，修復(fù)基質(zhì)用深藍色染色，標示GAGs的存在。在修復(fù)基質(zhì)之內(nèi)的細胞在形態(tài)學(xué)上類似軟骨細胞，但是卻成群地出現(xiàn)。在軟骨修復(fù)組織下面是粗壯的骨形成物。同樣，軟骨層和旁側(cè)組織大約位于相同的深度。這些結(jié)果顯示，雖然該修復(fù)組織不是完美的，利用這種方法基因轉(zhuǎn)移，在凝結(jié)的骨髓抽吸物內(nèi)的細胞生物朝著積極的方式被改變。
權(quán)利要求
1.一種用于轉(zhuǎn)移物質(zhì)到受試體的方法，該方法包括給受試體服用包含物質(zhì)的非聚合造血細胞凝塊以轉(zhuǎn)移所述物質(zhì)到該受試體。
2.依照權(quán)利要求1的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊包括骨髓細胞。
3.依照權(quán)利要求1的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊包括血細胞。
4.依照權(quán)利要求1的方法，其中，物質(zhì)包括基因轉(zhuǎn)移載體。
5.依照權(quán)利要求1的方法，其中，物質(zhì)包括其他細胞。
6.依照權(quán)利要求5的方法，其中，其他細胞包括基因工程細胞。
7.依照權(quán)利要求5的方法，其中，其他細胞包括原初細胞。
8.依照權(quán)利要求1的方法，其中，物質(zhì)包括蛋白質(zhì)。
9.依照權(quán)利要求1的方法，其中，物質(zhì)包括重組蛋白。
10.依照權(quán)利要求1的方法，其中，物質(zhì)包括可溶性蛋白。
11.依照權(quán)利要求1的方法，其中，物質(zhì)包括生物活性分子。
12.依照權(quán)利要求1的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊被轉(zhuǎn)移進入骨中。
13.依照權(quán)利要求1的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊被轉(zhuǎn)移到軟組織中。
14.依照權(quán)利要求1的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊被轉(zhuǎn)移到至少是軟骨、韌帶、腱、半月板和無脊椎動物盤之一中。
15.依照權(quán)利要求1的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊的形狀和尺寸通過模子來確定。
16.依照權(quán)利要求1的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊上均勻分布著物質(zhì)。
17.依照權(quán)利要求1的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊是基因修飾的以表達至少一種生長因子以及其它促進組織修復(fù)的基因產(chǎn)物。
18.依照權(quán)利要求1的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊的體積由將被修復(fù)的組織的大小確定。
19.依照權(quán)利要求1的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊是從受試體采集的。
20.依照權(quán)利要求2的方法，其中，骨髓細胞是從髂骨嵴獲得的。
21.依照權(quán)利要求2的方法，其中，骨髓細胞是從暴露在骨髓下層的骨軟骨缺陷處獲得。
22.依照權(quán)利要求1的方法，其中，物質(zhì)以溶液的形式存在。
23.依照權(quán)利要求1的方法，其中，包含物質(zhì)的非聚合造血細胞凝塊是通過滴定法測定的。
24.依照權(quán)利要求23的方法，其中，滴定是使用吸液管來完成的。
25.依照權(quán)利要求1的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊與至少是原初細胞和基因修飾細胞之一的懸浮液混合后，形成細胞懸浮液。
26.依照權(quán)利要求25的方法，其中，細胞懸浮液包含至少一種基因載體。
27.依照權(quán)利要求25的方法，其中，細胞懸浮液中不包含其他的基因載體。
28.依照權(quán)利要求1的方法，其中，轉(zhuǎn)移過程是緩慢，局部的從非聚合造血細胞凝塊釋放物質(zhì)。
29.依照權(quán)利要求1的方法，其中，該非聚合造血細胞凝塊以一種允許有效地轉(zhuǎn)移物質(zhì)的方式成形。
30.依照權(quán)利要求1的方法，進一步包括在物質(zhì)轉(zhuǎn)移區(qū)域的再生組織。
31.依照權(quán)利要求1的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊由凝結(jié)15-30分鐘的造血細胞樣品產(chǎn)生的。
32.依照權(quán)利要求1的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊是由可以在室溫下凝結(jié)的造血細胞樣品產(chǎn)生的。
33.依照權(quán)利要求1的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊是由放置在容器中凝結(jié)的造血細胞樣品產(chǎn)生的。
34.依照權(quán)利要求33的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊是從該容器中獲得的。
35.依照權(quán)利要求1的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊是由在磷酸鹽緩沖液中清洗過的造血細胞樣品產(chǎn)生的。
36.依照權(quán)利要求1的方法，其中，將任何沒有結(jié)合的物質(zhì)從非聚合造血細胞凝塊除去。
37.一種制備非聚合造血細胞凝塊物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的方法，該方法包括向造血細胞樣品中添加物質(zhì)，以及使造包含物質(zhì)的血細胞樣品形成非聚合造血細胞凝塊。
38.依照權(quán)利要求37的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊被植入受試體中。
39.依照權(quán)利要求37的方法，其中，物質(zhì)被轉(zhuǎn)移到該受試體。
40.依照權(quán)利要求39的方法，其中，該轉(zhuǎn)移過程是緩慢，局部的從非聚合造血細胞凝塊釋放該物質(zhì)。
41.依照權(quán)利要求37的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊以一種允許有效地轉(zhuǎn)移該物質(zhì)的方式成形。
42.依照權(quán)利要求37的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊轉(zhuǎn)移系統(tǒng)被用于使組織再生。
43.依照權(quán)利要求37的方法，其中，該造血細胞樣品是從受試體上采集的。
44.依照權(quán)利要求37的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊是在容器中形成的。
45.依照權(quán)利要求44的方法，進一步包括從容器中獲取非聚合造血細胞凝塊。
46.依照權(quán)利要求37的方法，進一步包括沖洗該非聚合造血細胞凝塊。
47.依照權(quán)利要求46的方法，其中，任何沒有結(jié)合的物質(zhì)通過清洗而除去。
48.依照權(quán)利要求46的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊是在磷酸鹽緩沖液中被沖洗的。
49.依照權(quán)利要求37的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊凝結(jié)15-30分鐘。
50.依照權(quán)利要求37的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊在室溫下凝結(jié)。
51.依照權(quán)利要求37的方法，其中，造血細胞包括骨髓細胞。
52.依照權(quán)利要求37的方法，其中，造血細胞包括血細胞。
53.依照權(quán)利要求37的方法，其中，物質(zhì)包括基因轉(zhuǎn)移載體。
54.依照權(quán)利要求37的方法，其中，物質(zhì)包括其他細胞。
55.依照權(quán)利要求54的方法，其中，其他細胞包括基因工程細胞。
56.依照權(quán)利要求54的方法，其中，其他細胞包括原初細胞。
57.依照權(quán)利要求37的方法，其中，物質(zhì)包括蛋白質(zhì)。
58.依照權(quán)利要求37的方法，其中，物質(zhì)包括重組蛋白。
59.依照權(quán)利要求37的方法，其中，物質(zhì)包括可溶性蛋白。
60.依照權(quán)利要求37的方法，其中，物質(zhì)包括生物活性分子。
61.依照權(quán)利要求38的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊被轉(zhuǎn)移到骨中。
62.依照權(quán)利要求38的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊被轉(zhuǎn)移到軟組織中。
63.依照權(quán)利要求38的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊被轉(zhuǎn)移到至少是軟骨、韌帶、腱、半月板和無脊椎動物盤之一中。
64.依照權(quán)利要求37的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊的形狀和尺寸通過模子來確定。
65.依照權(quán)利要求37的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊上均勻分布著物質(zhì)。
66.依照權(quán)利要求37的方法，其中，造血細胞經(jīng)過基因修飾以表達生長因子和其它利于組織修復(fù)的基因產(chǎn)物中至少一項。
67.依照權(quán)利要求37的方法，其中，非聚合造血細胞凝塊的體積由將被修復(fù)的組織的大小確定。
68.依照權(quán)利要求51的方法，其中，骨髓細胞由髂骨嵴獲得。
69.依照權(quán)利要求51的方法，其中，骨髓細胞由暴露在骨髓下層的骨軟骨缺陷獲得。
70.依照權(quán)利要求37的方法，其中，物質(zhì)以溶液的形式存在。
71.依照權(quán)利要求37的方法，其中，包含物質(zhì)的非聚合造血細胞凝塊是經(jīng)滴定測定的。
72.依照權(quán)利要求71的方法，其中，滴定是使用吸液管來完成的。
73.依照權(quán)利要求37的方法，其中，造血細胞和至少是原初細胞和基因修飾細胞之一的懸浮液混合后，形成細胞懸浮液。
74.依照權(quán)利要求73的方法，其中，細胞懸浮液包括至少一種基因載體。
75.依照權(quán)利要求73的方法，其中，細胞懸浮液中不包括其他的基因載體。
76.一種物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，包括有物質(zhì)結(jié)合在其中的非聚合造血細胞凝塊。
77.依照權(quán)利要求76的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，非聚合造血細胞凝塊以允許有效地轉(zhuǎn)移該物質(zhì)的方式成形。
78.依照權(quán)利要求76的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，非聚合造血細胞凝塊包括骨髓細胞。
79.依照權(quán)利要求76的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，非聚合造血細胞凝塊包括血細胞。
80.依照權(quán)利要求76的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，物質(zhì)包括基因轉(zhuǎn)移載體。
81.依照權(quán)利要求76的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，物質(zhì)包括其他細胞。
82.依照權(quán)利要求81的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，其他細胞包括基因工程細胞。
83.依照權(quán)利要求81的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，其他細胞包括原初細胞。
84.依照權(quán)利要求81的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，物質(zhì)包括蛋白質(zhì)。
85.依照權(quán)利要求81的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，物質(zhì)包括重組蛋白。
86.依照權(quán)利要求76的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，物質(zhì)包括可溶性蛋白。
87.依照權(quán)利要求76的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，物質(zhì)包括生物活性分子。
88.依照權(quán)利要求76的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，非聚合造血細胞凝塊被配制以轉(zhuǎn)移到骨中。
89.依照權(quán)利要求76的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，非聚合造血細胞凝塊被配制以轉(zhuǎn)移到軟組織中。
90.依照權(quán)利要求76的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，非聚合造血細胞凝塊被配制以轉(zhuǎn)移到至少是軟骨、韌帶、腱、半月板和無脊椎動物盤之一中。
91.依照權(quán)利要求76的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，非聚合造血細胞凝塊的形狀和尺寸通過模子來確定。
92.依照權(quán)利要求76的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，非聚合造血細胞凝塊上均勻分布著物質(zhì)。
93.依照權(quán)利要求76的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，非聚合造血細胞凝塊是經(jīng)過基因修飾以表達至少是生長因子和其它利于組織修復(fù)的基因產(chǎn)物之一。
94.依照權(quán)利要求76的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，非聚合造血細胞凝塊的體積由將被修復(fù)的組織的大小確定。
95.依照權(quán)利要求76的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，非聚合造血細胞凝塊是在分離的造血細胞樣品中制備。
96.依照權(quán)利要求78的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，骨髓細胞是從髂骨嵴的骨髓細胞中分離出來的。
97.依照權(quán)利要求78的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，骨髓細胞是從暴露在骨髓下層的骨軟骨缺陷分離出來的。
98.依照權(quán)利要求76的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，物質(zhì)至少是原初細胞和基因修飾細胞之一。
99.依照權(quán)利要求76的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，非聚合造血細胞凝塊是通過造血細胞樣品凝結(jié)15-30分鐘的方法來制備的。
100.依照權(quán)利要求76的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，非聚合造血細胞凝塊是通過造血細胞樣品在室溫下凝結(jié)的方法來制備的。
101.依照權(quán)利要求76的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，非聚合造血細胞凝塊是通過造血細胞樣品在一個容器中凝結(jié)的方法來制備的。
102.依照權(quán)利要求101的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，進一步包括從該容器中獲取非聚合造血細胞凝塊。
103.依照權(quán)利要求76的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，非聚合造血細胞凝塊是通過在磷酸鹽緩沖液中清洗非聚合造血細胞凝塊的方法來制備的。
104.依照權(quán)利要求76的物質(zhì)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其中，該非聚合造血細胞凝塊是通過從該非聚合造血細胞凝塊中除去任何沒有結(jié)合的物質(zhì)的方法來制備的。
全文摘要
本發(fā)明包括轉(zhuǎn)移物質(zhì)的方法和裝置。物質(zhì)的轉(zhuǎn)移包括向受試體服用有物質(zhì)結(jié)合在其中的非聚合造血細胞凝塊。該非聚合造血細胞凝塊起到物質(zhì)的轉(zhuǎn)移載體的作用。
文檔編號A61K38/00GK1674923SQ03818816
公開日2005年9月28日 申請日期2003年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月6日
發(fā)明者阿南弗·帕施爾, 格林·帕爾默, 史蒂文·格希維茲安, 克里斯托弗·埃文斯 申請人:布賴漢姆婦女醫(yī)院