專利名稱：來自角蛋白的矯形材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明關(guān)于用動物來源的角蛋白制備醫(yī)療材料，所述角蛋白來源于如羊毛、毛發(fā)、角、蹄和鱗。所述角蛋白材料是生物相容的、生物可整合的、以及生物可降解的，所述材料主要用于骨外科領(lǐng)域，用于骨的置換和增大，以及用于骨斷裂和骨碎片的固定和制動。
背景技術(shù)：
角蛋白是一類結(jié)構(gòu)蛋白，在生物學結(jié)構(gòu)中具有廣泛的代表性，特別是在高級脊椎動物的上皮組織中。角蛋白可分為兩種主要類型，軟角蛋白(存在于皮膚以及一些其他組織中)和硬角蛋白(形成指甲、爪子、毛發(fā)、角、羽毛和鱗)。
硬角蛋白的韌性和不溶性使它們能夠在許多生物系統(tǒng)中扮演基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的角色，這是許多來自合成聚合體的工業(yè)和消費材料的必需特性。除了擁有極好的物理特性，角蛋白作為一種蛋白，是一種具有高度化學功能性的聚合體，因而展現(xiàn)出許多合成聚合體所沒有的特性。因此，角蛋白非常適合于具有高價值、適于市場應(yīng)用的醫(yī)學產(chǎn)品的開發(fā)。在履行其功能后被身體組織吸收(再吸收)的藥物材料是高價值產(chǎn)品領(lǐng)域的一個例子，而角蛋白的特定性能使之超過其它天然的和合成的競爭材料。
Yamauchi(K.Yamauchi，M.Maniwa和T.Mori.，Journal of Biomaterial Science，Polymer edition，3，259，1998)證實，角蛋白可以加工成模具，根據(jù)它們的體外和體內(nèi)特性，可認為是生物相容性的。被用于制造這些材料的加工方法需要高濃度的還原劑，如硫醇，并且加工條件不適合于商業(yè)生產(chǎn)。
Kelly(WO 03/19673)表明，應(yīng)用商業(yè)可實施的化學物質(zhì)和加工條件，角蛋白可被加工成復合的形狀。
Blanchard(US5,358,935和US2003/003582A1)證實，應(yīng)用高濃度還原劑或強氧化劑(harsh oxidant)可從人頭發(fā)中提取角蛋白，加工生產(chǎn)出在一些軟組織應(yīng)用中有用的材料。然而，抽提和重建方法是苛刻的，并且通過角蛋白氨基酸胱氨酸至磺丙氨酸的不可逆氧化，或?qū)⑺龅鞍字糜诟叩膒H條件而引起肽水解，可導致角蛋白的降解。這就導致蛋白的許多有益特性消失了，尤其是硬組織應(yīng)用所必需的韌性。
為了生產(chǎn)適于矯形應(yīng)用的角蛋白生物材料，需要可保持角蛋白特性的加工方法，并且提供具有良好堅韌特性的材料。本發(fā)明描述了這種材料以及它們的制造方法。
US 6,432,435提出了一種組織工程支架，具有一種帶親水基團的角蛋白，所述角蛋白通過角蛋白-角蛋白二硫鍵結(jié)合。然而，該專利沒有公開磺化的角蛋白如何摻入到硬組織(如骨)的內(nèi)容。其提供的實施例都是關(guān)于它們在軟組織或多孔結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用。
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，角蛋白可被摻入到硬組織中(如骨中)，因而可用于骨損傷的治療。
身體的許多組織，包括骨，是連續(xù)更新的。新的骨基質(zhì)(其將發(fā)生礦化)主要通過特定的細胞來形成，所述細胞稱為造骨細胞，并且骨的異常組分被破骨細胞移走。與那些可被體內(nèi)其它機制(如化學降解)毀壞的材料相比，通過生物學方法移走和置換骨組織的植入的材料將具有更大的優(yōu)勢。需要將新的骨與植入材料的表面并置，從而將所述材料整合入組織，直至其完全被再吸收和置換。
骨可分為四種微結(jié)構(gòu)成分細胞、有機基質(zhì)、無機基質(zhì)和可溶性信號因子。造骨細胞是代謝活性分泌細胞，表達可溶性細胞因子和類骨質(zhì)，所述類骨質(zhì)是一種產(chǎn)物，其細胞外變體可生產(chǎn)有機不溶性基質(zhì)，主要由I型膠原組成。在骨的維持(如重新塑造)和修復過程中，造骨細胞開始表達這些產(chǎn)物。在骨髓中的單核細胞-巨噬細胞前體進入到循環(huán)中，并通過非同時的融合，生成多核的細胞，直徑最大達100微米，平均具有10-12個細胞核，稱為破骨細胞。破骨細胞具有皺折的邊緣，這構(gòu)成破骨細胞的再吸收區(qū)域，其上發(fā)生骨表面的酶促毀壞。術(shù)語“重新塑造”用于描述與成熟個體內(nèi)的骨修復和自體平衡相關(guān)的動力學活動。與自體平衡的重新塑造相關(guān)的過程的總和被稱為活化-再吸收-形成。造骨細胞被信號因子活化，并騰出一個空缺的骨區(qū)域；破骨細胞被刺激，進入到造骨細胞-空缺的位點，附著，再吸收，并對一種至今未鑒定出的信號作出反應(yīng)，停止再吸收并棄去附著物。破骨細胞再吸收的凹陷區(qū)域被一些表達類骨質(zhì)的造骨細胞重新進入，其鈣化、修復骨。在人體中，所述活化-再吸收-形成過程需要3至6個月。
在骨受損傷(如斷裂或腫瘤的手術(shù)移除)后有大量的出血，并且在2至5天里，出血形成巨大的血凝塊。在血凝塊的外圍開始發(fā)生新血管形成。在周圍軟組織中同時也發(fā)生標準的炎癥應(yīng)答，產(chǎn)生多形核白細胞、巨噬細胞以及單核細胞，聚集在血凝塊的周圍。到了第一周的最后，血凝塊的大部分因血管和早期纖維化的擴張而有機化。最早的骨(編織骨)在7天后形成。因為骨形成需要良好的血液供應(yīng)，所述編織骨的針狀體在血凝塊的外周開始形成，該位置是血管生成最多的。來自周圍軟組織以及骨髓內(nèi)的多能間質(zhì)細胞促進造骨細胞合成編織骨。往往也會形成軟骨，并最后被軟骨內(nèi)硬化所取代。包含骨-軟骨的肉芽組織稱為胼胝(發(fā)炎階段)。
在第一周后，下一階段開始，并且根據(jù)移動和固定程度的不同持續(xù)數(shù)月。通過這個階段，急性炎癥細胞已經(jīng)分散，并且修復過程開始，包括多能細胞向纖維原細胞和造骨細胞的分化。修復過程從外周進行到中心，并實現(xiàn)兩個目標一，其有機化和再吸收了血凝塊；二，更重要地，通過新血管形成構(gòu)建了胼胝，其最后橋接骨缺損位點。引起修復的活動如下。大量來自周圍骨中的破骨細胞移動到治療區(qū)域。新的血管協(xié)助這些細胞供應(yīng)營養(yǎng)，并提供更多的多能細胞用于細胞更新。所述位點被破骨細胞重新塑造(修復階段)。
在數(shù)周中，胼胝將骨末端封閉，并且開始重新塑造，其中，骨被再有機化以使原始皮質(zhì)被修復(重新塑造階段)。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種包含角蛋白并且在協(xié)助骨形成中有用的材料，和/或為公眾提供一種有效的選擇。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種用于在骨骼系統(tǒng)中保存、修復和改善骨的形態(tài)和功能的含角蛋白的材料。
本發(fā)明還提供了一種用于骨的置換和增大的多孔角蛋白材料。
本發(fā)明還提供了一種用于骨的固定和制動的致密角蛋白材料。
所述角蛋白優(yōu)選是S-磺化的，并且更優(yōu)選富含中間絲蛋白。
所述致密角蛋白材料可以通過將固體角蛋白粉末壓制或?qū)⒔堑鞍啄褐苼碇苽洹?br> 所述材料可包含最高達60％的鈣鹽。
所述材料可通過壓制和冷凍干燥固體角蛋白來制備。
或者，角蛋白溶液可被冷凍干燥。
本發(fā)明還提供了角蛋白材料在保存、修復和改善骨的形態(tài)和功能中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了一種形成富含S-磺化的角蛋白的多孔材料的方法，該方法包括a)在一種可溶性porogen存在時壓制角蛋白；
b)除去porogen并加固所述材料；c)洗滌所述蛋白材料；以及d)冷凍干燥所述材料。
本發(fā)明還提供了一種將角蛋白材料制成矯形產(chǎn)品的方法。
本發(fā)明還提供了一種用于骨置換/增大治療的富含中間絲蛋白的多孔角蛋白形式的生物相容性材料。
所述材料可通過將固體角蛋白粉末在porogen存在時進行壓制來制備，并且壓制后進行冷凍干燥。所述porogen可選自氯化鈉或其它生物相容性鹽，或甘油或其它生物相容性溶劑?？刂芇rogen的量和性質(zhì)以選擇合適的孔徑，使骨前體細胞可以滲入，從而便于植入時角蛋白材料的定居。
本發(fā)明還提供了一種將S-磺化的角蛋白材料的致密材料制成矯形產(chǎn)品的方法，該方法包括a)在加熱和水存在的條件下壓制角蛋白；b)加固所述材料；c)洗滌所述材料以除去殘留的化物物質(zhì)；以及d)干燥所述材料。
本發(fā)明還提供了一種將S-磺化的角蛋白的致密材料制成矯形產(chǎn)品的方法，該方法包括a)加固所述的含角蛋白的起始材料；b)洗滌所述材料以除去殘留的化物物質(zhì)；c)干燥所述材料；以及d)在加熱和水存在的條件下，壓制角蛋白。
本發(fā)明還提供了一種通過內(nèi)部固定以及骨碎片的固定和制動來治療骨折的用生物相容性角蛋白材料制造的矯形醫(yī)療材料，如骨板、骨釘和骨螺。
可加入水分和化學物質(zhì)。適當?shù)膽?yīng)用還原劑可從S-磺化的角蛋白中除去磺酸基團，并改造原先存在的二硫化物。
用于骨形成的角蛋白可通過WO 03/011894中描述的方法來制備，其提供了一種制備高分子量角蛋白衍生物的方法，該方法包括第一階段的消化步驟，用氧化性亞硫酸鹽解來磺化角蛋白；接著進行第二階段的重復水抽提，包括溶液和不溶性角蛋白的分離以及重新抽提不溶性角蛋白，從而生產(chǎn)出高度S-磺化的角蛋白衍生物。
WO 03/018673提供了一種來自S-磺化的角蛋白的泡沫纖維粘附材料或膜。所述方法包括溶劑澆鑄一種S-磺化的角蛋白溶液。
同時還提供了一種制備來自高度S-磺化的角蛋白中間絲蛋白的膜、纖維、泡沫或粘附材料的方法。
本發(fā)明提供了一種制備適合用在骨結(jié)構(gòu)中的角蛋白材料的方法，并且還提供了應(yīng)用在骨結(jié)構(gòu)中的角蛋白材料，基于WO 03/018673和WO 03/011894的方法。
一種可降解的角蛋白裝置具有足夠的柔韌性，通過逐漸地轉(zhuǎn)移功能性負載物進入痊愈中的骨頭，刺激新骨的生長(與目前常用的一些堅硬的永久材料不同)。而且，后續(xù)治療中不需要移走來自角蛋白的制動裝置或部件。
將富含中間絲蛋白的S-磺化的角蛋白改造成堅韌的、致密的材料，以在骨斷裂治療中用作內(nèi)部制動裝置的方法可包括在水分、化學物質(zhì)存在時，在一些情況下同時進行加熱，壓制所述的生物相容性蛋白，形成所需的形狀。材料中交聯(lián)的形成確保了其在壓制或隨后的化學治療過程中各種生物學條件下保持強度和韌性。
所述方法也涉及還原劑的調(diào)節(jié)應(yīng)用，以從S-磺化的角蛋白中除去磺酸基團，并改造天然角蛋白中原先存在的二硫化物。這具有兩個目的首先，通過形成擴展的二硫鍵交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，有效地聚合角蛋白，提供了在生物條件下的強度和韌性；第二，調(diào)節(jié)由材料的酶消化而發(fā)生的生物降解的速度和程度。通過調(diào)節(jié)生物降解的速度，本發(fā)明使角蛋白產(chǎn)品可用于需要一定范圍治療時間的治療。
在本專利說明書中，重新建立的角蛋白是完全生物相容的，不引起任何可見的異體免疫反應(yīng)。所述角蛋白通過前面描述過的發(fā)生在骨中的普通過程降解。因此在骨置換和增大中，所述角蛋白具有與自體的骨質(zhì)相似的特性。在斷裂治療情況下，用所述角蛋白制備的裝置將具有必要的物理特性，以實現(xiàn)將骨碎片固定和制動的目的，并且一旦履行了所述功能，所述角蛋白將逐漸被再吸收，最后在組織中消失。在再吸收的初期，通過向骨頭提供功能性負載物，逐漸弱化的角蛋白裝置將刺激新骨的形成。這將防止在金屬裝置中存在的壓力遮蔽效應(yīng)。此外，與金屬裝置相比，角蛋白的降解和再吸收具有巨大的優(yōu)勢，金屬裝置要么永久地保留在體內(nèi)，要么需要二次手術(shù)步驟來移除。
本發(fā)明可用于任何骨形成作用。下述過程可引起骨的形態(tài)和功能的破壞-骨生長過程中發(fā)育不規(guī)則，或異常生長；-損傷引起斷裂、斷裂脫臼，骨發(fā)生或未發(fā)生損失；-手術(shù)介入，如切除惡性或良性腫瘤/腫瘤類似病理，或切除在惡化狀態(tài)下的骨；-由一些病理狀況如感染引起的骨壞死和毀壞。
這些狀態(tài)的治療療法是盡量保存、修復或促進骨骼系統(tǒng)中受影響的骨頭的正常形成和功能。
術(shù)語“中間絲蛋白”描述了來自中間絲蛋白種類的角蛋白。角蛋白中間纖維來自硬α角蛋白，本領(lǐng)域中通常認為其包含兩個低硫多肽的家族，同時包含螺旋和非螺旋的片段，如在Marshall等，Structure and Biochemistry of Mammalian HardKeratin，Electron Microscopy Review，Vol 4，pp47-83，1991中所論述的。
“富含中間絲蛋白”是指與相應(yīng)的天然角蛋白來源中的量相比，在產(chǎn)品中含有更多的中間絲蛋白。
本發(fā)明優(yōu)選實施方案的描述本發(fā)明將通過實施例的形式加以描述，以下優(yōu)選的實施方案僅作為參考。
本發(fā)明特別地引用了一些基于來自羊毛的硬α-角蛋白的方法和應(yīng)用，然而，所述原理可同樣很好地適用于其它可選擇的α-角蛋白，或任何來源的能夠生產(chǎn)中間纖維(IF)型蛋白的α-角蛋白。
類似的制備方法已經(jīng)被申請人用于其它角蛋白來源，如羽毛，以生產(chǎn)同樣適合于以下描述的應(yīng)用的材料。本發(fā)明的特征可擴展到覆蓋限定區(qū)域的角蛋白的利用，不依賴于α-型蛋白(IF蛋白)存在的應(yīng)用。這里包括基于β或羽毛角蛋白的應(yīng)用，可與IF蛋白結(jié)合。
羊毛代表了一種便利來源的硬α-角蛋白，盡管任何其他的動物纖維或角或蹄同樣可用作所需蛋白的來源。羊毛含有約95％的角蛋白，其能寬泛地分為三種蛋白類型。中間絲蛋白典型地具有高的分子量(45-60kD)，具有部分纖絲狀三維結(jié)構(gòu)和約6％含量的半胱氨酸，其占據(jù)了羊毛纖維質(zhì)量的約58％，盡管只有部分的所述質(zhì)量在結(jié)構(gòu)中是真正形成螺旋的。高硫或超高硫蛋白，約占羊毛纖維的26％，在結(jié)構(gòu)上是球狀的，分子量范圍在10-40kD，可包含最高達30％摩爾百分數(shù)(mol％)的半胱氨酸水平。高-甘氨酸-酪氨酸蛋白是較少的類型，占羊毛纖維的6％，分子量在10kD左右，它們具有高含量的甘氨酸和酪氨酸殘基。
來自不同類型的羊毛角蛋白的蛋白擁有不同的特性，這將在特定的應(yīng)用中給予它們獨特的優(yōu)點。
本發(fā)明特別關(guān)于中間絲蛋白的應(yīng)用，以及應(yīng)用它們來生產(chǎn)材料，用于矯形手術(shù)。
但是，其它非纖維狀蛋白在更多的限定領(lǐng)域中具有它們自身的作用。
動物來源(如前面所描述的)的高度S-磺化的角蛋白，當純化以分離中間絲蛋白組分時，是一種生物相容/生物可降解的材料，非常適合用于矯形用途。所述角蛋白可通過如WO 03/011894中所論述的方法來制備。所述的S-磺化的角蛋白自身可根據(jù)WO 03/018673中的方法來制備。這些方法導致存在于原始角蛋白來源中的胱氨酸被改變成S-磺酰半胱氨酸。該基團是高度極化的，可使所述衍生的角蛋白在pH＞4的條件下變得可溶。并且，S-磺化的材料對水分是敏感的，并適合于加工成對矯形治療有用的模具。在一些情況下，保留S-磺化官能度是有用的，然而對于其它模具，作為重建過程的一部分，化學處理所述蛋白是有用的，以除去S-磺化官能度并改造角蛋白中原先存在的二硫鍵。高度極化和對水分敏感的同時，S-磺基衍生物的存在使重建的角蛋白材料易于被存在于體內(nèi)的蛋白水解酶降解。將S-磺基基團改變?yōu)殡装彼峥墒怪苽涞慕堑鞍撞牧喜蝗?，并使之具有一定程度的蛋白水解酶抗性。所述包含胱氨酸的材料在體內(nèi)以低的速度降解，該特性在一些矯形應(yīng)用中是重要的。
將S-磺酰半胱氨酸改變?yōu)殡装彼峥赏ㄟ^還原劑的應(yīng)用來實現(xiàn)，通常用包含硫醇的溶液，如巰基乙酸銨，或通過如WO 03/018673中所描述的方法。
作為一種蛋白質(zhì)材料，角蛋白非常適合作為材料用于建造矯形材料，它可結(jié)合生骨劑，如常見的成骨質(zhì)羥基磷灰石，根據(jù)重建方法的不同，含量在0-60％水平。文獻早已報導，包含在生物材料中的羥基磷灰石對痊愈具有有益的影響，也作為本發(fā)明的一部分得到證實。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述的S-磺化的角蛋白被重建成多孔的材料，用作骨的置換或增大。這通過在水和可溶性porogen存在時壓制角蛋白來實現(xiàn)，所述porogen如氯化鈉。通常，將S-磺化的角蛋白中間體磨成一定的粒度，使之利于粉末壓制，優(yōu)選為125-200微米，與水以1∶0.1至1∶10、優(yōu)選1∶1的比率混合，并和氯化鈉與1∶0.01至1∶10的比例混合。也將羥基磷灰石以質(zhì)量水平1-60％、優(yōu)選1-10％加入到混合物中。將所述混合物擠入一種模具中，施加10,000至50,000kPa范圍的壓力，時間范圍為1-30分鐘。在從模具中移出時，從顆粒狀物上切下一個柱形體，將之浸泡在化學處理溶液中，以洗去porogen并留下多孔的材料，同時從角蛋白中除去磺酸鹽官能度，并改變蛋白質(zhì)的二硫交聯(lián)。所述的化學處理可采取兩種形式的一種。首先，將包含磷酸鈉(優(yōu)選濃度為0.1M)的巰基乙酸銨溶液(優(yōu)選濃度為0.25M)緩沖至pH7.0，用于處理柱形體，持續(xù)2-48小時，優(yōu)選18小時。將顆粒物在水中洗滌，除去殘留的化學物質(zhì)。在洗滌后，將柱形體冷凍干燥?？蛇x擇地，所述的柱形體可在含有巰基乙酸的溶液中化學處理，所述溶液優(yōu)選0.1M，處理2-48小時，優(yōu)選18小時。接著在水中短暫洗滌，通過將柱形體在緩沖溶液中洗滌48-96小時，除去殘留的化學物質(zhì)。所述溶液每24小時更新一次。進一步在水中洗滌后將柱形體冷凍干燥。
材料的孔徑可通過改變制備過程中氯化鈉的量來調(diào)節(jié)。比如，采用每克蛋白0.06g氯化鈉，獲得的孔一般為50-150微米，而采用每克蛋白0.14g氯化鈉，形成的孔達到320微米。
用巰基乙酸方法獲得的多孔角蛋白材料的生物特性已經(jīng)在體外和體內(nèi)進行了證實。在體外，所述材料并非是細胞溶解性的，支持人和羊纖維原細胞的生長。如ISO10993-5中所描述的，將多孔材料直接與細胞接觸，如采用羊纖維原細胞產(chǎn)生如下所述的結(jié)果。在聚苯乙烯細胞培養(yǎng)板的孔中，加入多孔材料或不加材料作為對照，起始接種約10,000個細胞(0小時)。在接種后最初24小時中，培養(yǎng)經(jīng)歷了一段滯后期，有細胞數(shù)下降的跡象。該現(xiàn)象在所有進行的試驗中均出現(xiàn)了，除了包含測試材料的孔以外，在對照孔中也觀察到了下降。實驗已經(jīng)顯示，該滯后時間持續(xù)少于12小時，指數(shù)生長期開始了。每約24-48小時細胞數(shù)發(fā)生增倍，細胞近乎匯合(約80％匯合)標志對數(shù)生長的結(jié)束。這相當于指數(shù)期過程(5天或120小時)的結(jié)束。接著的時間-過程實驗顯示出一個細胞生長穩(wěn)定期，之后不久培養(yǎng)細胞完全鋪滿。在該點上，接觸抑制和營養(yǎng)缺失在限制生長速度中起著關(guān)鍵作用，并且單層培養(yǎng)可顯示細胞死亡信號(即膜完整性的喪失，細胞數(shù)量的降低，個體細胞的空泡化)。在該試驗中，可見到細胞附著到盤的上部表面上。通過光學顯微鏡觀察，與不含材料的對照相比，可認為所有底物上的這些細胞在形態(tài)學表現(xiàn)上是相似的。類似的對于人纖維原細胞的試驗獲得非常相似的結(jié)果，在多孔材料存在時顯示典型的纖維原細胞生長曲線，在120小時后培養(yǎng)中達到約80％鋪滿。在這個時間，對照孔已經(jīng)達到100％鋪滿。
體內(nèi)研究包括將角蛋白材料用上述方法處理，同時，所述材料的復合物包含6％羥基磷灰石，制成直徑3mm、長3mm的桿狀，用γ射線(2.8Mrads)消毒，植入到成年羊的后肢長骨的中段(皮質(zhì)骨)以及近側(cè)和遠側(cè)末端(皮質(zhì)松質(zhì)骨)。組織對于植入材料的反應(yīng)通過對活組織樣品的組織學檢測來研究，在第10天、3、6、8、12和24周進行檢測。骨組織對于用巰基乙酸制備的材料的反應(yīng)顯示出最小的異體免疫反應(yīng)，在植入的和周圍的骨之間僅有一薄層的肉牙組織(導致纖維化)形成。在3-6周中，植入材料被類骨質(zhì)組織利用，引起在由角蛋白植入材料再吸收所創(chuàng)建的空間中形成編織骨，并且，在約6-8周時新的骨被連接到周圍的骨上。從6周起，編織骨重塑入皮質(zhì)松質(zhì)骨。所述過程延續(xù)到后來，植入材料的完全整合，被成熟的骨取代，所述的骨缺陷完全愈合。
此外，通過將其制成12mm長、4mm寬、3mm厚的板并植入到羊的皮下，檢測所述多孔材料的物理特性。所述的板在Instron材料試驗機上測試，獲得的數(shù)據(jù)顯示在3-6周階段，拉伸特性減弱約10％。這與在該時間段干重損失約10％相一致。這些發(fā)現(xiàn)支持所述材料可刺激新骨形成和防止壓力遮蔽效應(yīng)的能力，并且所述材料逐漸被再吸收。
多孔角蛋白材料也可通過冷凍干燥S-磺化的角蛋白水溶液來制備，應(yīng)用如WO03/018673中所描述的方法，所述材料適合用于骨移植用途。通過將不溶性羥基磷灰石懸浮在角蛋白中，從S-磺化的角蛋白水溶液(優(yōu)選5％)中制備一種包含高比例羥基磷灰石的角蛋白材料，角蛋白與羥基磷灰石質(zhì)量比率為1∶0.1至1∶2，優(yōu)選1∶1。通過冷凍以及后續(xù)的冷凍干燥，獲得角蛋白和羥基磷灰石的混合物，其是多孔海綿體材料，適合應(yīng)用在骨移植產(chǎn)品中。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述的S-磺化的角蛋白被重建為堅韌的、致密的材料，用作骨制動產(chǎn)品。這通過壓制角蛋白來實現(xiàn)。通常，S-磺化的角蛋白磨成一定的粒度以利于粉末的壓制，優(yōu)選125-200微米，與水以1∶0.1至1∶10混合，優(yōu)選1∶1。也將羥基磷灰石以質(zhì)量百分數(shù)0-60％的水平加入到混合物中，優(yōu)選0-10％。將所述混合物擠入一種模具中，施加壓力10,000至50,000kPa，時間在1-30分鐘。在從模具中移出時，從顆粒狀物上切下一個柱形體，將之浸泡在化學處理溶液中，以洗去porogen并留下多孔材料，同時從角蛋白中除去磺酸鹽官能度，并改變蛋白質(zhì)的二硫交聯(lián)。所述的化學處理可采取兩種形式的一種。首先，將包含磷酸鈉(優(yōu)選濃度為0.1M)的巰基乙酸銨溶液(優(yōu)選濃度為0.25M)中緩沖至pH7.0，用于處理柱形體，持續(xù)2-48小時，優(yōu)選18小時。將顆粒物在水中洗滌，除去殘留的化學物質(zhì)。在洗滌后，將柱形體冷凍干燥?？蛇x擇地，所述的柱形體可在含有巰基乙酸的溶液中化學處理，所述溶液優(yōu)選0.1M，處理2-48小時，優(yōu)選18小時。接著在水中短暫洗滌，通過將柱形體在緩沖溶液中洗滌48-96小時，除去殘留的化學物質(zhì)。所述溶液每24小時更新一次。進一步在水中洗滌后將柱形體冷凍干燥。
致密角蛋白材料的生物學特性在體外進行了證實，生物物理特性在體內(nèi)進行了檢測。在體外，所述材料并非是細胞溶解性的，支持人和羊纖維原細胞的生長。在一個與前述多孔材料相似的方式中，如ISO 10993-5中所描述的，將多孔材料直接與細胞接觸，如采用羊纖維原細胞可形成隨后的結(jié)果。在聚苯乙烯細胞培養(yǎng)板的孔中加入多孔材料或不加材料作為對照，起始接種入約10,000個細胞(0小時)。在接種后最初24小時中，培養(yǎng)經(jīng)歷了一段滯后期，有細胞數(shù)下降的跡象。該現(xiàn)象在所有進行的試驗中均出現(xiàn)了，除了包含測試材料的孔以外，在對照孔中也觀察到了下降。實驗已經(jīng)顯示，該滯后時間持續(xù)少于12小時，指數(shù)生長期開始了。約每24-48小時細胞數(shù)發(fā)生增倍，近乎匯合(約80％匯合)標志對數(shù)生長的結(jié)束。這相當于指數(shù)期過程(5天或120小時)的結(jié)束。接著的時間-過程實驗顯示出一個細胞生長穩(wěn)定期，之后不久培養(yǎng)細胞完全鋪滿。在該點上，接觸抑制和營養(yǎng)缺失在限制生長速度中起著關(guān)鍵作用，并且單層培養(yǎng)可顯示細胞死亡信號(即膜完整性的喪失，細胞數(shù)量的降低，個體細胞的空泡化)。在該試驗中，可見到細胞附著到盤的上部表面上。通過光學顯微鏡觀察，與不含材料的對照相比，可認為所有底物上的這些細胞在形態(tài)學表現(xiàn)上是相似的。類似的對于人纖維原細胞的試驗獲得非常相似的結(jié)果，在多孔材料存在時具有典型的纖維原細胞生長曲線，在120小時后培養(yǎng)中達到約80％鋪滿。在這個時間，對照孔已經(jīng)達到100％鋪滿。
將用巰基乙酸處理的材料制成12mm長、4mm寬、3mm厚的板，并植入到成年大鼠的皮下，檢測所述材料的生物物理特性(彈性模數(shù)，破裂模數(shù)，拉伸強度)。在1、3、6和12周將所述的板移出大鼠，評價物理強度。在3-6周階段，彈性模數(shù)顯示下降40-70％。在該段時間上，干重的損失為5％至10％，與我們用多孔材料的板在羊中進行的研究相一致。
本發(fā)明的另一方面是一種堅韌的、致密角蛋白材料，用于骨的制動，構(gòu)建自多層角蛋白膜的加熱壓制。角蛋白膜從S-磺化的角蛋白來制備，應(yīng)用如WO 03/018673中所描述的方法。角蛋白膜也可應(yīng)用S-磺化的角蛋白溶液來制備，其中包含羥基磷灰石懸浮物。應(yīng)用該方法，可將羥基磷灰石摻入到角蛋白膜中，以角蛋白質(zhì)量的0-50％的水平加入。形成的膜可堆疊為多層，施加10,000-100,000kPa的壓力，溫度范圍為50-200℃，時間為1-60分鐘。伴隨著壓制還在壓制混合物中加入水，在相同條件下繼續(xù)進行壓制。結(jié)果獲得的材料包含角蛋白和羥基磷灰石的混合物，以致密、堅韌的塊狀形式存在。然后進行化學處理，將S-磺化的基團改造為胱氨酸。應(yīng)用巰基乙酸和巰基乙酸銨，處理和洗滌條件如前所述。一旦干燥，所述的結(jié)果材料可機械加工成一定的形狀，作為矯形手術(shù)的裝置，如骨螺或骨釘。
在一個可選擇的方式中，包含0-60％水平的羥基磷灰石的角蛋白膜在堆疊成多層前，進行化學處理。通過將膜浸入到與前述相似成分的巰基乙酸銨溶液進行處理，持續(xù)20-60分鐘。在水中多次洗滌所述的膜，除去殘留的化學物質(zhì)，干燥包含帶有S-磺基基團、被改造為胱氨酸的角蛋白的結(jié)果材料。然后將所述的膜以前述相同的方式壓制，結(jié)果材料包含角蛋白和羥基磷灰石的混合物，以致密、堅韌的塊狀形式存在。不再需要進一步的化學處理，所述材料可機械加工成一定的形狀，作為矯形手術(shù)的裝置，如骨螺或骨釘。
本發(fā)明的一個方面是應(yīng)用還原劑，如前述的巰基乙酸銨或巰基乙酸，用于從蛋白中除去磺酸鹽官能度，改造天然角蛋白中原先存在的二硫鍵。以磺酸鹽形式的角蛋白在高于pH4時是可溶的，并在體內(nèi)快速被再吸收。為了使材料在體內(nèi)保留更長的時間，并調(diào)節(jié)材料的降解和再吸收速度，使用可除去磺酸鹽官能度的還原劑。所述還原劑應(yīng)用的廣度、接觸時間以及試劑濃度可影響材料中磺酸基團與二硫鍵的比率。這進而影響了材料在體內(nèi)的強度和降解速度。其它交聯(lián)劑，如那些用于改變其它生物材料特性的試劑，比如戊二醛和二甲胺基丙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，它們可用于改變膠原質(zhì)生物材料的特性，也可用于改變角蛋白生物材料的特性。
實施例實施例1a多孔角蛋白材料將0.4g的S-磺化的角蛋白中間絲蛋白粉末磨成125-300微米大小的微粒，與0.5ml水以及0.024g氯化鈉混合，靜置5分鐘。將所述混合物擠入直徑12mm的模具中，施加15,000kPa的壓力，進行2分鐘。從模具中移出后，從該顆粒物上切下直徑3mm的柱形體，浸入化學處理溶液中，以洗去porogen并留下多孔的材料，同時從角蛋白中除去磺酸鹽官能度，并改變蛋白質(zhì)的二硫交聯(lián)。所述的化學處理可采取兩種形式的一種。首先，將包含0.1M磷酸鈉的0.25M巰基乙酸銨溶液緩沖至pH7.0，用于處理柱形體，持續(xù)18小時。將顆粒物在水中連續(xù)洗滌三次，分別是10、40和10分鐘，除去殘留的化學物質(zhì)。在洗滌后，將柱形體冷凍干燥?？蛇x擇地，所述的柱形體可在含有0.1M巰基乙酸的溶液中化學處理18小時。接著在水中短暫洗滌，通過將柱形體在0.1M TRIS、11.25mM氯化鈣溶液中洗滌72小時，除去殘留的化學物質(zhì)。所述溶液每24小時更新一次。進一步在水中洗滌后將柱形體冷凍干燥。
實施例1b包含羥基磷灰石的多孔角蛋白材料該材料的制備與實施例1a中描述的相同，但是在包含氯化鈉同時還加入0.034g羥基磷灰石，以使最終產(chǎn)物含有6％質(zhì)量水平的羥基磷灰石。
實施例1c包含羥基磷灰石的多孔角蛋白材料為了制備多孔角蛋白材料，通過在水中懸浮0.5g S-磺化的羊毛角蛋白來制備5％角蛋白溶液，接著在約2小時中，在劇烈攪拌的溶液中逐漸加入0.5ml的1M氫氧化鈉。仔細監(jiān)控溶液的pH值，觀察到因堿的加入pH升高到約10，并逐漸降低，這是因為堿因蛋白溶解而被吸收。最終獲得的pH為9.5。蛋白溶液在34,000g離心，除去任何不溶的物質(zhì)，將0.5g羥基磷灰石全部混合入溶液。將所述混合物冷凍并冷凍干燥，獲得多孔的材料。與實施例1a中所采用的方法相同，將所述材料浸入巰基乙酸銨溶液中，持續(xù)30分鐘，最后在3批水中洗滌20分鐘并冷凍干燥。
實施例2a致密角蛋白材料將0.5g角蛋白粉末磨成125-200微米大小的微粒，與0.5ml水混合并靜置5分鐘。將所述混合物擠入直徑12mm的模具中，施加15,000kPa的壓力，進行2分鐘。從模具中移出后，從該顆粒物上切下所需的形狀，如切下12mm×4mm的塊狀，將所述塊狀物浸入化學處理溶液中，以從角蛋白上除去磺酸鹽官能度，并改變蛋白質(zhì)的二硫交聯(lián)。所述的化學處理可采取兩種形式的一種。首先，將包含0.1M磷酸鈉的0.25M巰基乙酸銨溶液緩沖至pH7.0，用于處理所述塊狀物，持續(xù)18小時。接著將塊狀物在水中逐次洗滌10、40、10分鐘，除去殘留的化學物質(zhì)。洗滌后，于室溫下將塊狀物在空氣中干燥?？蛇x擇地，所述的塊狀物可在含有0.1M巰基乙酸的溶液中化學處理18小時。接著在水中短暫洗滌，通過將塊狀物在0.1M TRIS、11.25mM氯化鈣溶液中洗滌48小時，除去殘留的化學物質(zhì)。所述溶液每24小時更新一次。接著在水中進一步洗滌所述塊狀物，常溫下在空氣中干燥。
實施例2b包含羥基磷灰石的致密角蛋白材料該材料的制備與實施例2a中描述的相同，但是在起始步驟中，在角蛋白粉末中還加入0.032g羥基磷灰石，以使最終產(chǎn)物含有6％質(zhì)量水平的羥基磷灰石。
實施例2c構(gòu)建自角蛋白膜的致密角蛋白材料S-磺化的角蛋白的膜，厚約0.3mm，用如WO 03/018673中所論述的方法來制備，并切割為4×50mm。在加熱的內(nèi)部尺寸5×50mm的剛模中，將總質(zhì)量為1g的許多的膜(約50張膜)堆疊為多層，施加50,000kPa的壓力，持續(xù)5分鐘，加熱剛模使溫度保持在80-100℃。形成的角蛋白塊狀物浸入到巰基乙酸銨溶液中，如實施例1a中描述的，持續(xù)18小時，接著在水中洗滌10、40、10分鐘?？諝飧稍?。
在一種變更方式中，所用的膜包含50％的羥基磷灰石，如下方法制備1.0g S-磺化的羊毛角蛋白懸浮在水中，在約2小時中，將0.2g甘油和1.0ml的1M氫氧化鈉逐漸加入到劇烈攪拌的溶液中，仔細監(jiān)控溶液的pH值，觀察到因堿的加入pH升高到約10，并逐漸降低，這是因為堿因蛋白溶解而被吸收。最終獲得的pH為9.5。蛋白溶液在27,000g離心，除去任何不溶物，將1.0g羥基磷灰石制成含有少量99％乙醇(約1ml)的糊狀物，然后與5％溶液完全混合。將所述混合物置于100mm2的皮氏培養(yǎng)皿中，在常溫下干燥。
實施例2d構(gòu)建自預處理的角蛋白膜的致密角蛋白材料S-磺化的角蛋白膜，厚約0.3mm，用如WO 03/018673中所論述的方法來制備，在如實施例1a中所描述的巰基乙酸銨溶液中處理30分鐘。接著將膜在水中洗滌并干燥，使膜包含二硫化物而非S-磺化官能度。將這些膜切割為4×50mm。在加熱的內(nèi)部尺寸5×50mm的剛模中，將總質(zhì)量為1g的許多的膜(相當于70張膜)堆疊為多層，施加50,000kPa的壓力，持續(xù)5分鐘，加熱剛模使溫度保持在80-100℃。移走角蛋白塊狀物，在水中短暫浸泡，壓入熱模中，施加20,000kPa的壓力，持續(xù)5分鐘。在壓力下加熱剛模至80-100℃。施加30,000kPa的壓力，持續(xù)30分鐘。
在一種變更方式中，所用的膜含有50％的羥基磷灰石，如實施例2b中所描述的方法制備。含有羥基磷灰石的致密角蛋白材料以與2c相同的方法制備。
在前面的描述中，已經(jīng)列舉了已知等價的本發(fā)明的特定組分或整體的參考，所述等價形式引入在這里，具有如單獨提出相同的效應(yīng)。
工業(yè)適用性本發(fā)明在醫(yī)學領(lǐng)域，尤其在骨損傷領(lǐng)域是有用的。本發(fā)明的角蛋白材料是生物相容的，可用作骨置換和增大產(chǎn)品。比如，本產(chǎn)品可用于置換由各種臨床狀態(tài)造成損壞的骨頭，如外傷或腫瘤，并作為新骨的支架，促進愈合。多孔角蛋白支架被新的編織骨再吸收和置換，最終重新塑造為松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨。
權(quán)利要求
1.一種用于保存、修復和改善骨的形態(tài)和功能的含角蛋白的材料。
2.一種用于骨的置換和增大的含角蛋白的材料。
3.一種用于骨的固定和制動的致密角蛋白材料。
4.如權(quán)利要求1、2或3中任一項所述的材料，其特征在于，所述角蛋白是S-磺化的。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的材料，其特征在于，所述角蛋白富含中間絲蛋白。
6.如權(quán)利要求5所述的角蛋白，其通過壓制固體角蛋白粉末來制備。
7.如權(quán)利要求3所述的致密材料，其通過壓制角蛋白膜來制備。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述材料，其包含最高達60％的鈣鹽。
9.如權(quán)利要求6或7所述的材料，其特征在于，壓制之后進行固體角蛋白的冷凍干燥。
10.一種致密角蛋白材料在制造用于保存、修復和改善骨的形態(tài)和功能的醫(yī)學支撐物或支架中的應(yīng)用。
11.如權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，其特征在于，所述角蛋白材料是S-磺化的。
12.如權(quán)利要求10或11所述的應(yīng)用，其特征在于，所述角蛋白富含中間絲蛋白。
13.一種將S-磺化的角蛋白材料的致密材料制成矯形產(chǎn)品的方法，所述方法包括a)在加熱和水存在的條件下壓制角蛋白；b)加固所述材料；c)洗滌所述材料以除去殘留的化物物質(zhì)；以及d)干燥所述材料。
14.一種將S-磺化的角蛋白的致密材料制成矯形產(chǎn)品的方法，所述方法包括a)加固所述含角蛋白的起始材料；b)洗滌所述材料以除去殘留的化物物質(zhì)；c)干燥所述材料；以及d)在加熱和水存在的條件下壓制角蛋白。
15.一種形成富含S-磺化的角蛋白的多孔材料的方法，所述方法包括a)在一種可溶性porogen存在時壓制角蛋白；b)除去porogen并加固所述材料；c)洗滌所述蛋白材料；以及d)冷凍干燥所述材料。
16.如權(quán)利要求15的方法，其特征在于，所述porogen選自氯化鈉或其他生物相容性鹽，或甘油或其他生物相容性溶劑。
17.如權(quán)利要求15或16所述的方法，其特征在于，porogen的量和性質(zhì)被控制以選擇孔徑，使骨前體細胞可以滲入，從而便于植入時角蛋白材料的定居。
18.如權(quán)利要求13-17中任一項所述的方法，還包括在角蛋白起始材料中加入羥基磷灰石。
19.如權(quán)利要求13-18中任一項所述的方法，其特征在于，所述角蛋白富含中間絲蛋白。
20.用權(quán)利要求13-19中任一項所述的方法制備的角蛋白材料。
21.一種用于骨置換/增大治療的富含中間絲蛋白的多孔角蛋白形式的生物相容性材料。
22.如權(quán)利要求21所述的生物相容性材料，其特征在于，所述角蛋白是S-磺化的。
23.如權(quán)利要求21或22所述的生物相容性材料，其包含最高達60％的鈣鹽。
24.如權(quán)利要求21-23中任一項所述的生物相容性材料，其特征在于，所述材料通過壓制固體角蛋白粉末來制備。
25.如權(quán)利要求24所述的生物相容性材料，其特征在于，壓制后進行冷凍干燥。
26.如權(quán)利要求21-25中任一項所述的生物相容性材料，其特征在于，所述材料從角蛋白溶液中制備。
27.如權(quán)利要求26所述的生物相容性材料，其特征在于，所述角蛋白溶液被冷凍干燥。
28.一種通過內(nèi)部固定以及骨碎片的固定和制動來治療骨折的用生物相容性角蛋白材料制造的矯形醫(yī)療材料。
29.如權(quán)利要求28所述的矯形醫(yī)療材料，其是用S-磺化的角蛋白材料制造的。
30.如權(quán)利要求28或29所述的矯形醫(yī)療材料，其特征在于，所述角蛋白富含中間絲蛋白。
31.如權(quán)利要求28-30中任一項所述的矯形醫(yī)療材料通過壓制固體角蛋白粉末來制備。
32.如權(quán)利要求28-30中任一項所述的矯形醫(yī)療材料通過壓制角蛋白膜來制備。
33.如權(quán)利要求28-30中任一項所述的矯形醫(yī)療材料從角蛋白溶液來制備。
34.如權(quán)利要求28-30中任一項所述的矯形醫(yī)療材料包含最高達60％的鈣鹽。
35.如權(quán)利要求31-33中任一項所述的矯形醫(yī)療材料，其特征在于，在壓制后將角蛋白冷凍干燥。
36.如權(quán)利要求28-35中任一項所述的矯形材料通過權(quán)利要求13-19中任一項所述的方法來制備。
37.一種將富含中間絲蛋白的S-磺化的角蛋白改造為在骨折的治療中用作內(nèi)部固定裝置的堅韌、致密的生物相容性材料的方法。
38.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述角蛋白富含中間絲蛋白。
39.如權(quán)利要求37所述的方法，包括在水分和化學物質(zhì)存在時壓制所述生物相容性蛋白。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，在形成所需形狀時也采用加熱。
41.如權(quán)利要求37-40中任一項所述的方法，還包括控制還原劑的應(yīng)用以從S-磺化的角蛋白中除去磺酸基團，并改造原先存在于天然角蛋白中的二硫化物。
42.一種用權(quán)利要求37-41中任一項所述方法制備的富含生物相容性角蛋白的材料。
43.如權(quán)利要求28所述的矯形材料，其特征在于，所述材料是骨板、骨釘或骨螺。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種來自角蛋白的生物相容性材料，其被用于骨醫(yī)學治療的許多方面。所述角蛋白材料優(yōu)選被S－磺化并富含高分子量的中間絲蛋白。所述角蛋白材料可以是多孔的，用作骨的置換和增大產(chǎn)品；還提供了致密角蛋白材料在骨治療中的應(yīng)用，它被用作骨折和骨再生治療中的內(nèi)部固定裝置，以及所述用于骨的形態(tài)和功能的保存、修復和改善的角蛋白材料的制備方法。
文檔編號A61L27/22GK1674946SQ03819328
公開日2005年9月28日 申請日期2003年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月10日
發(fā)明者P·V·佩皮羅, S·N·G·P·J·迪亞斯, A·D·羅迪克-蘭齊洛塔, R·J·凱利 申請人:凱瑞泰克有限公司