專(zhuān)利名稱(chēng)：免疫調(diào)節(jié)及對(duì)涉及血清素家族受體及血腦屏障的細(xì)胞過(guò)程的作用的制作方法
與相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)根據(jù)35 U.S.C.§119(e)要求以下優(yōu)先權(quán)2002年6月17日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/389,577和2002年9月27日美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/414,831，其在此均全文引用。
背景技術(shù)：
血清素(又名5-羥色胺或5-HT)是一種神經(jīng)遞質(zhì)，在病理生理學(xué)上應(yīng)用廣泛，常用于治療多種神經(jīng)精神性障礙。血清素通過(guò)多種血清素家族受體分子(此處引用為“5-HT受體”or“5-HTR”)發(fā)揮功效。傳統(tǒng)概念中，血清素受體家族成員根據(jù)對(duì)不同血清素拮抗劑的特異性等藥理學(xué)特征分為7種亞型。因此，盡管所有這些5-HT受體都特異性地與血清素結(jié)合，它們卻由不同的基因編碼，并在藥理學(xué)上有顯著的不同。迄今為止，已經(jīng)鑒定出14種哺乳動(dòng)物的血清素受體并對(duì)其進(jìn)行了序列分析。具體來(lái)說(shuō)，已將這14種不同的5-HT受體劃分到7種藥理學(xué)亞型，分別表示為5-HT1、5-HT2、5-HT3、5-HT4、5-HT5、5-HT6和5-HT7.根據(jù)藥理學(xué)特征這7種亞型又被進(jìn)一步細(xì)分為如下幾種類(lèi)型5-HT1A、5-HT1B、5-HT1D、5-HT1E、5-HT1F、5-HT2A、5-HT2B、5-HT2C、5-HT3A、5-HT3B、5-HT4、5-HT5A、5-HT6及5-HT7。然而，當(dāng)比較這些受體的核酸和氨基酸序列時(shí)，這些亞型的相同序列百分比卻與其藥理學(xué)分型不相關(guān)。
在已被克隆的14種不同哺乳動(dòng)物血清素受體中，除一個(gè)以外其余全部是G-蛋白偶聯(lián)受體超家族的成員；也即，它們通常偶聯(lián)不同的第二信使通路而連接到鳥(niǎo)嘌呤核苷酸調(diào)節(jié)蛋白(G-蛋白)。例如，血清素受體5-HT1A、5-HT1B、和5-HT1D抑制腺苷酸環(huán)化酶；而5-HT2受體能激活磷脂酶C通路，引起多磷酸肌醇的降解。5-HT2受體屬于視紫質(zhì)樣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白家族，其顯著特征為7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)及其與G-蛋白偶聯(lián)的功能。
一直以來(lái)血清素受體亞型的區(qū)分建立于其藥理學(xué)結(jié)合特點(diǎn)、第二信使偶聯(lián)、且對(duì)于更好表征的血清素受體而言基于其生理學(xué)功效。該領(lǐng)域大多數(shù)用于表征5-HT受體的數(shù)據(jù)是建立在對(duì)組織模型的實(shí)驗(yàn)觀察上，而不是建立在某一純化的受體蛋白或基因的性質(zhì)上。
如前所述，14種血清素受體依據(jù)結(jié)構(gòu)同源性、第二信使系統(tǒng)活化、和對(duì)特定配基的藥物親和性及其他特征被歸類(lèi)為7種亞型。分子克隆的方法證明5-HT受體至少屬于2個(gè)蛋白超家族一個(gè)是有7個(gè)推定的跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD)的G-蛋白結(jié)合受體(5-HT1A、1B、1D、1E、5-HT2)；另一個(gè)是有4個(gè)推定的TMD的配基門(mén)控離子通道受體(5-HT3)。其中5-HT2亞類(lèi)又被進(jìn)一步劃分為3個(gè)類(lèi)別5-HT2A、5-HT2B及5-HT2C。據(jù)信5-HT2A和5-HT2C受體拮抗劑有助于治療抑郁、焦慮、精神病及飲食障礙。5-HT2A同5-HT2C受體整體上有約51％的氨基酸同源性，而在跨膜區(qū)同源性約有80％。在重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中對(duì)5-HT2A受體的研究表明該受體有一高一低兩個(gè)親和區(qū)。
5-HT2A和5-HT2C受體都與磷脂酶C偶聯(lián)并通過(guò)磷脂酰肌醇介導(dǎo)應(yīng)答。以激動(dòng)劑及拮抗劑研究顯示出廣泛的受體應(yīng)答，這表明有多種調(diào)節(jié)機(jī)制操縱受體活性。同時(shí)5-HT2A和5-HT2C受體也是致幻藥的作用位點(diǎn)。
在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中，認(rèn)為血清素與學(xué)習(xí)、記憶、睡眠、溫度調(diào)節(jié)、運(yùn)動(dòng)、疼痛、性欲和攻擊行為、食欲、神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)及生物節(jié)律有關(guān)。此外血清素還與一些病理生理狀況相關(guān)，例如焦慮、抑郁、強(qiáng)迫癥、精神分裂癥、自殺、自閉、偏頭痛、嘔吐、酒精中毒及神經(jīng)退化性障礙。
在哺乳動(dòng)物CNS中血清素調(diào)節(jié)多種感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)及行為功能。此生物胺神經(jīng)遞質(zhì)是由投射于CNS的腦干神經(jīng)元合成，在基底核和邊緣結(jié)構(gòu)密度最高(Steinbusch，1984，InHandbook of ChemicalNeuroanatomy 368-125，Bjorklund等，Eds.，Elsevier SciencePublishers，B.V.)。認(rèn)為5-羥色胺能的傳遞與多種行為及精神病癥相關(guān)，如焦慮、睡眠調(diào)節(jié)、攻擊性、喂食及抑郁(Cowen，1991，British J.Psych.，1597-14；和Lucki，1992，Neurosci. & Biobehav.Rev.，1683-93)。要理解5-HT如何介導(dǎo)多種生理活性需鑒定及分離相應(yīng)的5-HT受體。
最近，研究表明血清素可能在免疫系統(tǒng)中起到一定作用，因?yàn)橛袛?shù)據(jù)表明血清素受體出現(xiàn)在免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞中?！熬?實(shí)體”問(wèn)題已經(jīng)困擾不同學(xué)科的研究者幾個(gè)世紀(jì)了。一直以來(lái)都認(rèn)為劇烈的情感或壓力與免疫系統(tǒng)間有某種聯(lián)系。血清素是種廣泛分布的神經(jīng)遞質(zhì)，并在情緒障礙及抑郁癥中起主要作用。然而其在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答上的功用從未受到重視，其原理更不清楚。
胎兒在子宮中的存活一直以來(lái)都是免疫學(xué)上的矛盾現(xiàn)象。理論上胎兒應(yīng)該患有母體的異源排斥反應(yīng)。然而大多數(shù)情況下胎兒并不被排斥，這是與免疫學(xué)相矛盾的。解釋為何母體免疫系統(tǒng)選擇性的抑制對(duì)胎兒的異源排斥而保留其他所有免疫應(yīng)答完好無(wú)損已經(jīng)是免疫學(xué)的“圣杯”。如果人們能明白這個(gè)過(guò)程并將其運(yùn)用于治療中，將會(huì)為自身免疫疾病的潛在療法打開(kāi)一扇基礎(chǔ)性的新大門(mén)，并將為治療移植術(shù)的排斥癥狀開(kāi)創(chuàng)一個(gè)非凡的新方法。然而直到本發(fā)明為止，一直未能達(dá)到改性自身免疫疾病及異源排斥反應(yīng)療法所需的要求。本發(fā)明達(dá)到了這些要求。
1998年Munn等(1998，Science 2811191-1193)解決了這個(gè)難題的主要部分。這一研究小組證明“當(dāng)用吲哚胺2，3——雙加氧酶(IDO，一種由滋養(yǎng)母細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)的色氨酸分解代謝酶)的藥理抑制劑處理懷孕小鼠時(shí)，發(fā)生了所有異源妊娠的急劇的T細(xì)胞誘導(dǎo)的排斥反應(yīng)。因此，通過(guò)色氨酸分解代謝哺乳動(dòng)物孕體抑制T細(xì)胞活性并保護(hù)自身抵制排斥反應(yīng)。”換而言之，雌性懷孕不久就產(chǎn)生一種酶(IDO)，此酶能在代謝反應(yīng)的第一步就將色氨酸轉(zhuǎn)向煙酸生成。這明顯意味著色氨酸必定在啟動(dòng)和維持免疫應(yīng)答中起著重要的作用，并且/或者犬尿素生成(煙酸通路的第一步)有抑制效應(yīng)。盡管已經(jīng)明白IDO的攝入會(huì)抑制T細(xì)胞增殖并可能在異源接受現(xiàn)象中起作用(Alberati-Giani等，1998，Amino Acids 14251-255；Munn等，1999，J.Exp.Med.1891362-1373；Widner等，2000，Immunol.Today20469-473；Pan等，2000，Transpl.Immunol.8189-194；Mellor等，2001，Nature Immunol.264-68)，但仍不清楚為什么色氨酸代謝會(huì)抑制免疫應(yīng)答。
色氨酸是細(xì)胞合成新蛋白所需的10種必須氨基酸之一。盡管不很確定，但色氨酸分解代謝可能導(dǎo)致饑餓，且因此解釋了T細(xì)胞抑制現(xiàn)象。不過(guò)其他9個(gè)必須氨基酸并不參與控制T細(xì)胞應(yīng)答。但在色氨酸水平的局部耗盡及T細(xì)胞功能抑制間卻有明顯的相關(guān)性(Munn等，1999，J.Exp.Med.1891362-1373；Widner等，2000，Immunol.Today 20469-473；Frumento等，2001，Transplant.Proc.33428-430)。
色氨酸是目前所知生成5-羥色胺(又名血清素)的唯一來(lái)源。如果局部色氨酸水平的調(diào)節(jié)與在T細(xì)胞反應(yīng)中觀測(cè)到的調(diào)節(jié)經(jīng)由5-羥色胺能通路相關(guān)，那么很明顯血清素在T細(xì)胞活性中起著關(guān)鍵性作用。然而，盡管在生化史上血清素是研究最廣的生物活性分子，但直到本發(fā)明為止，血清素在T細(xì)胞活性通路中的作用一直未被確認(rèn)及研究。
曾有向有絲分裂原刺激的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物中加入外源血清素可起免疫調(diào)節(jié)功效的報(bào)道。在某些環(huán)境中，血清素刺激活化的T細(xì)胞(Foon等，1976，J.Immunol.1171545-1552；Kut等，1992，Immunopharmacol.Immunotoxicol.14783-796；Young等，1993，Immunology 80395-400)，然而大多數(shù)實(shí)驗(yàn)報(bào)道卻是加入高濃度的血清素可抑制增殖(Slauson等，1984，Cell.Immunol.84240-252；Khan等，1986，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.81378-380；Mossner & Lesch，1998，Brain，Behavior，and Immunity12249-271)。因此，如果血清素在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中起任何作用的話(huà)，它到底起什么功效？現(xiàn)有技術(shù)仍無(wú)法解答。
近幾年，有報(bào)道證明在14種藥理學(xué)特性不同的血清素受體中，淋巴細(xì)胞表達(dá)靜息細(xì)胞上的2a、2b、2c、6和7型受體(Ameisen等，1989，J.Immunol.1423171-3179；Stefulj等，2000，Brain，Behavior，and Immunity 14219-224)，而細(xì)胞活化時(shí)1a型和3型受體的活性上調(diào)(Aune等，1993，J.Immunol.1511175-1183；Meyniel等，1997，Immunol.Lett.55151-160；Stefulj等，2000，Brain，Behavior，and Immunity 14219-224)。盡管這些受體在淋巴細(xì)胞中的功能還不清楚，普遍認(rèn)為除3型離子通道受體外其他血清素受體都是有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的G-偶聯(lián)受體(所述參見(jiàn)Barnes和Sharp，1999，NeuroPharm.381083-1152)。具體言之，1型受體作用于腺苷酸環(huán)化酶使cAMP下調(diào)(De Vivo & Maayani，1986，J.Pharmacol.Exp.Ther.238248-252)。例如，弗司扣林，一種腺苷酸環(huán)化酶的激動(dòng)劑，可使cAMP上調(diào)從而可作為T(mén)細(xì)胞活化的抑制劑。另一方面加入血清素可緩解弗司扣林對(duì)T細(xì)胞的抑制(Aune等，1990，J.Immunol.1451826-1831；Aune等，1993，J.Immunol.1511175-1183)。
與1a型受體相反，6型和7型受體存在于靜息T細(xì)胞上，在對(duì)血清素應(yīng)答時(shí)經(jīng)由上調(diào)cAMP起作用(Ruat等，1993，Biochem.Biophys.Res.Commun.193268-276；Ruat等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908547-8551)。來(lái)看違反直覺(jué)，在靜息細(xì)胞上存在的6型和7型受體應(yīng)該起減緩T細(xì)胞應(yīng)答的功能而1a型受體應(yīng)對(duì)抗來(lái)自于6型和7型受體的信號(hào)。2a和2c型受體都與磷脂酶C正偶聯(lián)，且導(dǎo)致環(huán)己六醇磷酸鹽及胞內(nèi)Ca2+的聚集，從而開(kāi)啟蛋白激酶C信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)(所述參見(jiàn)Boess和Martin，1994，Neuropharmacology 33275-317)。
關(guān)于免疫應(yīng)答的功能控制，Gershon等(1975，J.Exp.Med.142732-738)推測(cè)血清素對(duì)于引發(fā)小鼠T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng)是必需的。然而此研究作者將DTH反應(yīng)對(duì)血清素的依賴(lài)性歸因于該生物胺的血管特性。
在康納迪克州West Haven的Miles Research Center所進(jìn)行的系列研究表明5-HT 1a受體出現(xiàn)在人與鼠的T細(xì)胞中并參與其活動(dòng)(Aune等，1990，J.Immunol.1451826-1831；Aune等，1993，J.Immunol.1511175-1183；Aune等，1994，J.Immunol.1531826-1831)。這些研究確定了可以通過(guò)阻斷色氨酸羥化酶(即參與色氨酸轉(zhuǎn)化到血清素的第一個(gè)酶)來(lái)抑制IL-2刺激的人T細(xì)胞的增殖；而此抑制可通過(guò)加入5-羥色氨酸(受抑制酶的代謝產(chǎn)物)被逆轉(zhuǎn)。此外，他們還在體外用5-HT 1a特異性受體拮抗劑阻斷了人T細(xì)胞增殖。在鼠模型中他們證明是1a型受體拮抗劑而不是2型受體拮抗劑能在體內(nèi)抑制對(duì)羥扎封(oxazalone)的接觸性過(guò)敏反應(yīng)而不是抗體反應(yīng)。
Laberge等(1996，J.Immunol.156310-315)證明同時(shí)用1a型和2型受體拮抗劑，則血清素能從CD8+T細(xì)胞中誘導(dǎo)趨化因子IL-16，而且這種活性在加入2型受體抑制劑后能被特異性的抑制，但1a受體拮抗劑卻不能抑制此活性。因此盡管現(xiàn)有技術(shù)指出血清素在免疫系統(tǒng)中起到一定作用，然而到底是什么樣的作用卻并不清楚，也沒(méi)有任何現(xiàn)象表明使用受體拮抗劑能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。
少數(shù)文獻(xiàn)指出血清素在免疫應(yīng)答中起一定作用。1989年著名免疫學(xué)家Philip Askenase和其同事證明，在小鼠中5-HTR2拮抗劑能抑制遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)(Amiesen等，1989，J.Immunol.1423171-3179)。Amiesen等解釋為“后期作用的DTH效應(yīng)T細(xì)胞可能表達(dá)功能5-HT2R，而這些受體需體內(nèi)活化以使T細(xì)胞局部產(chǎn)生DTH的炎癥淋巴因子依賴(lài)型現(xiàn)象”。可能因?yàn)閲X類(lèi)動(dòng)物肥大細(xì)胞中含血清素而人類(lèi)中不含，致使此結(jié)論不能用于人類(lèi)免疫應(yīng)答，所以這些結(jié)果后來(lái)被孤立。后來(lái)Aune等(1994，J.Immunol.153489-498)證明5-HTR 1a拮抗劑能在體內(nèi)抑制鼠DTH反應(yīng)，并證明抑制色氨酸羥化酶(參與色氨酸向血清素轉(zhuǎn)化的第一個(gè)酶)能抑制T細(xì)胞增殖。這些作者再次提供了重要的信息，但仍不能識(shí)別血清素在引發(fā)T細(xì)胞依賴(lài)型應(yīng)答中的重要作用。
巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞表達(dá)的受體可對(duì)血清素起反應(yīng)的第一個(gè)證據(jù)出現(xiàn)在1984年(Roszman等，1984，Soc.Neurosci.10726)。其間，已證明在14個(gè)已知藥理學(xué)特異性的血清素受體中，靜息淋巴細(xì)胞表達(dá)5-HT2A、2B、2C、6、和7型受體(Ameisen等，1989，J.Immunol.1423171-3179；Stefulj等，2000，Brain，Behavior，and Immunity14219-224)，而5-HT1A和5-HT3受體在活化時(shí)上調(diào)(Aune等，1993，J.Immunol.1511175-1183；Meyniel等，1997，Immunol.Lett.55151-160；Stefulj等，2000，Brain，Behavior，and Immunity14219-224)。
盡管還未確定血清素受體在淋巴細(xì)胞及免疫調(diào)控中的功能(如果有的話(huà))，普遍認(rèn)為，除3型離子通道受體外，其他血清素受體都是G-偶聯(lián)受體，都含有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(所述參見(jiàn)Barnes和Sharp，1999，NeuroPharm.381083-1152)。具體來(lái)說(shuō)，1型受體作用于腺苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致cAMP下調(diào)(De Vivo & Maayani，1986，J.Pharmacol.Exp.Ther.238248-252)。
與5-HT1A受體相反，5-HT6和5-HT7受體出現(xiàn)在靜息T細(xì)胞中，在對(duì)血清素應(yīng)答時(shí)經(jīng)由上調(diào)cAMP起作用(Ruat等，1993，Biochem.Biophys.Res.Commun.193268-276；Ruat等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908547-8551)。違反直覺(jué)地，在靜息細(xì)胞中表達(dá)的5-HT6和5-HT7受體應(yīng)該起減緩T細(xì)胞應(yīng)答的功能，而1a型受體應(yīng)對(duì)抗來(lái)自于5-HT6和5-HT7受體的信號(hào)。5-HT2A和5-HT2C受體都與磷脂酶C正偶聯(lián)，導(dǎo)致環(huán)己六醇磷酸鹽及胞內(nèi)Ca2+的聚集，從而開(kāi)啟蛋白激酶C的信號(hào)信號(hào)傳遞級(jí)聯(lián)(綜述參見(jiàn)Boess和Martin，1994，Neuropharmacology 33275-317)。
以前曾推測(cè)血清素是引發(fā)小鼠T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)所必需的(Gershon等，1975，J.Exp.Med.142732-738)，并推論DTH反應(yīng)對(duì)血清素的依賴(lài)性源于該生物胺的血管特性。有多種文獻(xiàn)交相報(bào)道血清素的免疫調(diào)節(jié)功效。在某些環(huán)境中，外源5-HT表現(xiàn)為刺激活化的T細(xì)胞(Foon等，1976，J.Immunol.1171545-1552；Kut等，1992，Immunopharmacol.Immunotoxicol.14783-796；Young等，1993，Immunology 80395-400)，然而大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的報(bào)道為高濃度的外源5-HT抑制活化T細(xì)胞的增殖(Slauson等，1984，Cell.Immunol.84240-252；Khan等，1986，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.81378-380；Mossner & Lesch，1998，Brain，Behavior，and Immunity 12249-271).因此，既然研究表明該神經(jīng)遞質(zhì)即上調(diào)又下調(diào)免疫應(yīng)答，那么如果血清素在免疫系統(tǒng)中起任何作用的話(huà)，它到底是什么功用？這仍然不清楚。
發(fā)展用來(lái)調(diào)整免疫應(yīng)答的療法，尤其是那種可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答特定方面而不影響其他方面的療法，是長(zhǎng)期以來(lái)的需求。因此急需識(shí)別用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的潛在治療靶點(diǎn)。本發(fā)明滿(mǎn)足了這些要求。此外還需要優(yōu)選不引起神經(jīng)精神功效而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法。本發(fā)明也滿(mǎn)足了這些要求。
發(fā)明概述本發(fā)明包含在哺乳動(dòng)物中調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法。此方法包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的抑制劑，該抑制劑抑制血清素與血清素受體的相互作用，從而調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物中的免疫應(yīng)答。
一方面，血清素受體選自1B型血清素受體、2A型血清素受體、2B型血清素受體、2C型血清素受體、4型血清素受體和6型血清素受體。
另一方面，抑制劑選自選擇性的1B型血清素受體拮抗劑、選擇性的2A型血清素受體拮抗劑、選擇性的2B型血清素受體拮抗劑、選擇性的2C型血清素受體拮抗劑、選擇性的4型血清素受體拮抗劑和選擇性的6型血清素受體拮抗劑。
另一方面，抑制劑為血清素受體拮抗劑，其選自利哌酮、氟奮乃靜、酮色林、米安色林、LY53857、SB206553、SB242084、MDL11939、SB216641和美賽西平。
一方面，抑制劑為氟奮乃靜；且另一方面，抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
另一方面，抑制劑經(jīng)改性使之實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
另一方面，改性的抑制劑為該抑制劑的酚噻嗪衍生物。
另一方面，抑制劑為氟奮乃靜且其酚噻嗪衍生物選自QSS-5和QSS-12。
本發(fā)明包括抑制哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法。該方法包括給哺乳動(dòng)物施用免疫應(yīng)答抑制量的抑制劑，該抑制劑抑制血清素與血清素受體的相互作用，從而抑制哺乳動(dòng)物中的免疫應(yīng)答。
一方面，血清素受體選自1B型血清素受體、2A型血清素受體、2B型血清素受體、2C型血清素受體、4型血清素受體和6型血清素受體。
另一方面，抑制劑選自選擇性的1B型血清素受體拮抗劑、選擇性的2A型血清素受體拮抗劑、選擇性的2B型血清素受體拮抗劑、選擇性的2C型血清素受體拮抗劑、選擇性的4型血清素受體拮抗劑和選擇性的6型血清素受體拮抗劑。
另一方面，抑制劑為血清素受體拮抗劑，其選自利哌酮、氟奮乃靜、酮色林、米安色林、LY53857、SB206553、SB242084、MDL11939、SB216641和美賽西平。
另一方面，抑制劑可為氟奮乃靜。
另一方面，抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
另一方面，抑制劑可經(jīng)改性使之實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
另一方面，改性的抑制劑為酚噻嗪的衍生物。
另一方面，抑制劑為氟奮乃靜且其酚噻嗪衍生物選自QSS-5和QSS-12。
本發(fā)明包括抑制免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)的方法。該方法包括抑制細(xì)胞上血清素受體傳遞的血清素信號(hào)，其中抑制信號(hào)也就抑制了細(xì)胞的活化，而且其中抑制血清素信號(hào)包括用有效劑量的抑制劑(可抑制血清素與血清素受體的相互作用)接觸免疫細(xì)胞，由此抑制細(xì)胞的免疫反應(yīng)。
一方面，免疫細(xì)胞選自T細(xì)胞和B細(xì)胞。
一方面，血清素受體選自1B型血清素受體、2A型血清素受體、2B型血清素受體、2C型血清素受體、4型血清素受體和6型血清素受體。
另一方面，抑制劑選自選擇性的1B型血清素受體拮抗劑、選擇性的2A型血清素受體拮抗劑、選擇性的2B型血清素受體拮抗劑、選擇性的2C型血清素受體拮抗劑、選擇性的4型血清素受體拮抗劑和選擇性的6型血清素受體拮抗劑。
另一方面，抑制劑為血清素受體拮抗劑，其選自利哌酮、氟奮乃靜、酮色林、米安色林、LY53857、SB206553、SB242084、MDL11939、SB216641和美賽西平。
另一方面，抑制劑為氟奮乃靜。
另一方面，抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
另一方面，抑制劑可經(jīng)改性使之實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
另一方面，改性的抑制劑為酚噻嗪的衍生物。
另一方面，抑制劑為氟奮乃靜且其酚噻嗪衍生物選自QSS-5和QSS-12。
本發(fā)明還包括調(diào)節(jié)患自身免疫疾病的哺乳動(dòng)物中免疫應(yīng)答的方法，這些疾病由被血清素信號(hào)活化的免疫細(xì)胞介導(dǎo)。該方法包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的抑制劑，該抑制劑可抑制血清素與血清素受體的相互作用，從而調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物中的免疫應(yīng)答。
一方面，抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
另一方面，血清素受體選自1B型血清素受體、2A型血清素受體、2B型血清素受體和2C型血清素受體。
另一方面，抑制劑選自選擇性的1B型血清素受體拮抗劑、選擇性的2A型血清素受體拮抗劑、選擇性的2B型血清素受體拮抗劑和選擇性的2C型血清素受體拮抗劑。
另一方面，該抑制劑為血清素受體拮抗劑，其選自利哌酮、氟奮乃靜、酮色林、米安色林、LY53857、SB206553、SB242084和MDL11939。
另一方面，抑制劑為一種特異性結(jié)合血清素受體的抗體。另一方面，血清素受體選自1B型血清素受體、2A型血清素受體、2B型血清素受體及2C型血清素受體。
另一方面，自身免疫疾病選自重癥肌無(wú)力、特發(fā)性炎癥肌病、慢性中性粒細(xì)胞減少癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、自身免疫溶血綜合癥、抗磷脂抗體綜合癥、炎性腸病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、心肌炎、Gillian-Barre綜合癥、血管炎、多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)脊髓炎(Devic綜合癥)、淋巴細(xì)胞性垂體炎、格雷夫斯病、愛(ài)迪生病、甲狀旁腺功能減退癥、一型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、尋常性天皰瘡、大皰性類(lèi)天皰瘡、牛皮癬、銀屑病關(guān)節(jié)炎、子宮內(nèi)膜異位、自身免疫性睪丸炎、自身免疫性勃起障礙、結(jié)節(jié)病、韋格納肉芽腫病、自身免疫性耳聾、斯耶格倫病、自身免疫色素成視網(wǎng)膜炎(autoimmune uveoretinitis)、間質(zhì)性膀胱炎、肺出血腎炎綜合癥及纖維肌痛。
另一方面，該調(diào)節(jié)作用為抑制作用。.
本發(fā)明包括抑制哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，此處免疫應(yīng)答是被T細(xì)胞上血清素受體活化所介導(dǎo)的。本方法包括用有效量的抑制劑接觸T細(xì)胞，該抑制劑可抑制血清素與血清素受體間的相互作用，從而抑制哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答。
一方面，該方法進(jìn)一步包括通過(guò)快速注射給藥抑制劑。
另一方面，血清素受體選自1B型血清素受體、2A型血清素受體、2B型血清素受體和2C型血清素受體。
另一方面，抑制劑選自選擇性的1B型血清素受體拮抗劑、選擇性的2A型血清素受體拮抗劑、選擇性的2B型血清素受體拮抗劑和選擇性的2C型血清素受體拮抗劑。
另一方面，抑制劑為血清素受體拮抗劑，其選自利哌酮、氟奮乃靜、酮色林、米安色林、LY53857、SB206553、SB242084和MDL11939。
另一方面，抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
本發(fā)明包括抑制哺乳動(dòng)物免疫細(xì)胞活化的方法，其中該活化由免疫細(xì)胞上血清素受體的活化所介導(dǎo)。該方法包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的抑制劑，該抑制劑可抑制血清素與血清素受體間的相互作用，且其中用抑制劑接觸免疫細(xì)胞，進(jìn)而抑制免疫細(xì)胞的活化。
一方面，該血清素受體選自1B型血清素受體、2A型血清素受體、2B型血清素受體和2C型血清素受體。
另一方面，該抑制劑選自選擇性的1B型血清素受體拮抗劑、選擇性的2A型血清素受體拮抗劑、選擇性的2B型血清素受體拮抗劑和選擇性的2C型血清素受體拮抗劑。
另一方面，抑制劑為血清素受體拮抗劑，其選自利哌酮、氟奮乃靜、酮色林、米安色林、LY53857、SB206553、SB242084和MDL11939。
另一方面，抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
本發(fā)明還包括抑制哺乳動(dòng)物二級(jí)免疫應(yīng)答的方法。該方法包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的抑制劑，該抑制劑可抑制血清素與血清素受體間的相互作用，從而抑制哺乳動(dòng)物的二級(jí)免疫應(yīng)答。
一方面，血清素受體選自1B型血清素受體、2A型血清素受體、2B型血清素受體、和2C型血清素受體。
另一方面，抑制劑選自選擇性的1B型血清素受體拮抗劑、選擇性的2A型血清素受體拮抗劑、選擇性的2B型血清素受體拮抗劑和選擇性的2C型血清素受體拮抗劑。
另一方面，該抑制劑為血清素受體拮抗劑，其選自利哌酮、氟奮乃靜、酮色林、米安色林、LY53857、SB206553、SB242084和MDL11939。
另一方面，抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
本發(fā)明包括治療哺乳動(dòng)物中由細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的方法，此處的細(xì)胞需經(jīng)由血清素受體傳遞血清素信號(hào)。該方法包括抑制細(xì)胞中血清素與血清素受體的相互作用，其中該抑制對(duì)細(xì)胞是有害的使得該細(xì)胞不介導(dǎo)此疾病。
一方面，對(duì)血清素相互作用的抑制是通過(guò)使細(xì)胞接觸抑制血清素與血清素受體相互作用的抑制劑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
另一方面，該血清素受體選自1型血清素受體、2型血清素受體、4型血清素受體及6型血清素受體。
再有，疾病選自多發(fā)性骨髓瘤、重癥肌無(wú)力、特發(fā)性炎癥肌病、慢性嗜中性白血球減少癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、自身免疫性溶血綜合癥、抗磷脂抗體綜合癥、炎性腸病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、心肌炎、Gillian-Barre綜合癥、血管炎、多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)脊髓炎(Devic綜合癥)、淋巴細(xì)胞性垂體炎、格雷夫斯病、愛(ài)迪生病、甲狀旁腺功能減退癥、一型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、尋常性天皰瘡、大皰性類(lèi)天皰瘡、牛皮癬、銀屑病關(guān)節(jié)炎、子宮內(nèi)膜異位、自身免疫性睪丸炎、自身免疫性勃起障礙、結(jié)節(jié)病、韋格納肉芽腫病、自身免疫性耳聾、斯耶格倫病、自身免疫性色素層視網(wǎng)膜炎、間質(zhì)性膀胱炎、肺出血腎炎綜合癥及纖維肌痛。
一方面，血清素受體是1B型血清素受體，而且其中疾病是多發(fā)性骨髓瘤。
另一方面，抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
本發(fā)明包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法。該方法包括抑制經(jīng)由細(xì)胞上的血清素受體傳遞血清素信號(hào)，其中抑制作用誘導(dǎo)凋亡；而且其中抑制細(xì)胞上血清素與血清素受體的相互作用包括用有效量的抑制此相互作用的抑制劑接觸細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
一方面，抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
本發(fā)明還包括誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法。本方法包括抑制經(jīng)由細(xì)胞上的血清素受體傳遞血清素信號(hào)，其中抑制誘導(dǎo)細(xì)胞死亡；而且其中該抑制包括用有效量的抑制劑接觸該細(xì)胞，該抑制劑可抑制血清素與血清素受體的相互作用，由此誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
另一方面，抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
本發(fā)明包括鑒別用于治療哺乳動(dòng)物自身免疫疾病的化合物的方法。該方法包括用待測(cè)化合物接觸血清素受體，并比較接觸此化合物的血清素受體及未接觸此化合物的血清素受體與血清素的結(jié)合水平，當(dāng)前者的血清素結(jié)合水平低于后者時(shí)表示此化合物可用于治療哺乳動(dòng)物自身免疫疾病。一方面，該哺乳動(dòng)物是人。
本發(fā)明包括用該方法鑒定出的化合物。
一方面，血清素受體選自1B型血清素受體、2A型血清素受體、2B型血清素受體、2C型血清素受體、4型血清素受體及6型血清素受體。
另一方面，該方法進(jìn)一步包括評(píng)估化合物穿透血腦屏障的能力并選擇實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障的化合物。本發(fā)明包括用該方法鑒定的化合物。另一方面，該化合物選自QSS-5和QSS-12。
本發(fā)明包括鑒別用于治療哺乳動(dòng)物異源移植反應(yīng)的化合物的方法。該方法包括用待測(cè)化合物接觸血清素受體，并比較接觸此化合物的血清素受體及未接觸此化合物的血清素受體與血清素的結(jié)合水平，當(dāng)前者的血清素結(jié)合水平低于后者時(shí)表示此化合物可用于治療哺乳動(dòng)物異源移植反應(yīng)。
本發(fā)明包括用該方法鑒別出的化合物。
另一方面，該方法進(jìn)一步包括評(píng)定此化合物穿透血腦屏障的能力，從而選取實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障的化合物。本發(fā)明包括用此方法鑒定的化合物。
一方面，血清素受體選自1B型血清素受體、2A型血清素受體、2B型血清素受體、2C型血清素受體、4型血清素受體及6型血清素受體。
本發(fā)明包括用于抑制T細(xì)胞活化的化合物的方法，其中活化是由T細(xì)胞上血清素受體與血清素相結(jié)合而介導(dǎo)的。該方法包括用待測(cè)化合物接觸T細(xì)胞并比較與此化合物接觸的T細(xì)胞及未與此化合物接觸的T細(xì)胞的活化水平，當(dāng)前者的活性水平低于后者時(shí)表示此化合物可用于抑制T細(xì)胞活化，其中該活化指由T細(xì)胞上2型血清素受體與血清素結(jié)合而介導(dǎo)的活化。
另一方面，該方法進(jìn)一步包括評(píng)估此化合物穿透血腦屏障的能力，并選取實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障的化合物。本發(fā)明包括用此方法鑒定的化合物。
另一方面，該方法進(jìn)一步包括改性化合物使之實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
本發(fā)明還包括鑒別經(jīng)由細(xì)胞上血清素受體影響信號(hào)傳遞的化合物的方法。本方法包括用化合物接觸細(xì)胞，并與接觸該化合物前的細(xì)胞進(jìn)行比較，評(píng)估任何細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的變化。當(dāng)接觸過(guò)該化合物的細(xì)胞與接觸該化合物前的細(xì)胞相比較，細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生變化時(shí)表明該化合物影響經(jīng)由細(xì)胞上血清素受體的信號(hào)傳遞，由此鑒別出影響經(jīng)由細(xì)胞上血清素受體信號(hào)傳遞的化合物。
本發(fā)明包括用此方法鑒別出的化合物。
另一方面，本方法進(jìn)一步包括改性該化合物使之實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。本發(fā)明包括用此方法鑒別出的化合物。
本發(fā)明包括影響細(xì)胞周期過(guò)程的方法。本方法包括抑制經(jīng)由細(xì)胞上血清素受體的信號(hào)傳遞，而且其中抑制經(jīng)由細(xì)胞上血清素受體的信號(hào)傳遞包括用有效量的抑制劑接觸細(xì)胞，該抑制劑可抑制血清素與其受體的相互作用，從而影響細(xì)胞周期過(guò)程。
一方面，抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
本發(fā)明包括影響表達(dá)血清素受體的細(xì)胞的凋亡的方法。本方法包括抑制經(jīng)由受體的信號(hào)傳遞，且其中該抑制包括用有效量的抑制劑接觸細(xì)胞，該抑制劑可抑制血清素與其受體的相互作用，從而影響細(xì)胞凋亡。
一方面，抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
本發(fā)明包括一種方法，該方法可誘導(dǎo)表達(dá)血清素受體的細(xì)胞凋亡，本方法包括抑制經(jīng)由受體的信號(hào)傳遞，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
本發(fā)明包括調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的試劑盒。該試劑盒包括有效量的抑制劑，該抑制劑可抑制血清素與其受體間的相互作用。本試劑盒還包括用藥器和使用說(shuō)明材料。
一方面，血清素受體選自1B型血清素受體、2A型血清素受體、2B型血清素受體、2C型血清素受體、4型血清素受體及6型血清素受體。
一方面，抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
本發(fā)明包括影響表達(dá)血清素受體的細(xì)胞的細(xì)胞周期過(guò)程的試劑盒。該試劑盒包括有效量的抑制劑，該抑制劑可抑制血清素與其受體間的相互作用。本試劑盒還包括用藥器和使用說(shuō)明材料。
一方面，抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
本發(fā)明包括誘導(dǎo)表達(dá)血清素受體的細(xì)胞的凋亡的試劑盒。該試劑盒包括有效量的抑制劑，該抑制劑可抑制血清素與其受體間的相互作用。本試劑盒還包括用藥器和使用說(shuō)明材料。
一方面，抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
附圖簡(jiǎn)述為闡明本發(fā)明，此處列解出用于本發(fā)明實(shí)施方案的圖例。然而，本發(fā)明并不局限于圖例所述實(shí)施方案的確實(shí)順序和實(shí)施方法。
圖一是描述巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)淋巴細(xì)胞應(yīng)有絲分裂原活化信號(hào)的增殖應(yīng)答的影響的圖表。
圖二描述血清素合成及降解的主要代謝通路。化合物的名字列在結(jié)構(gòu)圖的左側(cè)，催化單步反應(yīng)的酶列于右側(cè)。
圖三描述色氨酸水解酶抑制劑(對(duì)氯苯丙氨酸，PCPA)對(duì)人淋巴細(xì)胞有絲分裂刺激作用的影響。也即，通過(guò)加入1μg/ml ConA刺激人外周血淋巴細(xì)胞(PBL)。
圖四描述血清素、色氨酸及苯乙肼對(duì)用ConA刺激的人PBL活化的影響。在圖示時(shí)間點(diǎn)收集測(cè)定。所加試劑濃度為400μM。
圖五包括3個(gè)小圖，描述色氨酸(trp)，血清素(5-HT)，及苯乙肼(Pz)在不同ConA濃度下對(duì)人T細(xì)胞有絲分裂刺激的影響。也即，圖5A描述0.1μg/ml ConA的作用；圖5B描述1μg/ml ConA的作用；圖5C描述10μg/ml ConA的作用。每幅圖中的虛線(xiàn)為不加任何試劑時(shí)ConA的基線(xiàn)刺激水平。
圖六描述色氨酸、血清素的添加對(duì)苯乙肼對(duì)活化淋巴細(xì)胞的抑制作用。所加各試劑(Pz、Trp、和5-HT)濃度都為100μM。
圖7A描述滴定已知的選擇性5-HTR1受體激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)ConA(5μg/ml)刺激的人淋巴細(xì)胞活化的劑量反應(yīng)作用。在引發(fā)ConA刺激后72小時(shí)收集細(xì)胞并測(cè)定。用于此實(shí)驗(yàn)的藥物詳細(xì)定義如下(R)8-OH DPAT選擇性5-HTR 1A受體激動(dòng)劑；WAY 100635選擇性5-HTR1A受體拮抗劑；普萘洛爾常用5HT 1受體拮抗劑同時(shí)也是beta-腎上腺素能拮抗劑；L 694247選擇性1B/1D激動(dòng)劑；GR 55562選擇性1B/1D拮抗劑；SB 216641選擇性1B拮抗劑；和BRL 15522選擇性1D拮抗劑；BRL 54443選擇性1E/1F激動(dòng)劑。
圖7B描述滴定已知的選擇性5-HTR 1受體激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)人淋巴細(xì)胞異源刺激(也作混合淋巴細(xì)胞反應(yīng))的劑量反應(yīng)作用。在引發(fā)刺激后120小時(shí)收集細(xì)胞并測(cè)定。用于此實(shí)驗(yàn)的藥物詳細(xì)定義如下(R)8-OH DPAT選擇性5-HTR 1A受體激動(dòng)劑；WAY 100635選擇性5-HTR 1A受體拮抗劑；普萘洛爾常用5HT 1受體拮抗劑，同時(shí)也是beta-腎上腺素能拮抗劑；L 694247選擇性1B/1D激動(dòng)劑；GR 55562選擇性1B/1D拮抗劑；SB 216641選擇性1B拮抗劑；BRL 15522選擇性1D拮抗劑；BRL 54443選擇性1E/1F激動(dòng)劑。
圖8A描述滴定已知靶向5-HTR2受體的激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)ConA(5μg/ml)刺激的人淋巴細(xì)胞活化的劑量反應(yīng)作用。在引發(fā)ConA刺激后72小時(shí)收集細(xì)胞并測(cè)定。用于此實(shí)驗(yàn)的藥物詳細(xì)定義如下DOI5HT2激動(dòng)劑(受體對(duì)此化合物的延長(zhǎng)暴露可導(dǎo)致它們的下調(diào))；LY 53857選擇性5HT2A/2B/2C拮抗劑；MDL 11939選擇性5HT 2A拮抗劑；SB206553選擇性5HT2B/2C拮抗劑；SB 242084選擇性5HT 2C拮抗劑；美西麥角部分1型激動(dòng)劑/2型拮抗劑；美賽西平通用1、2、6及7型拮抗劑。
圖8B描述滴定靶向5-HTR2受體的激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)人淋巴細(xì)胞異源刺激(也作混合淋巴細(xì)胞反應(yīng))的劑量反應(yīng)作用。在引發(fā)刺激后120小時(shí)收集細(xì)胞并測(cè)定。用于此實(shí)驗(yàn)的藥物詳細(xì)定義如下DOI5HT2激動(dòng)劑(受體對(duì)此化合物的延長(zhǎng)暴露可導(dǎo)致它們的下調(diào))；LY 53857選擇性5HT2A/2B/2C拮抗劑；MDL 11939選擇性5HT 2A拮抗劑；SB206553選擇性5HT2B/2C拮抗劑；SB 242084選擇性5HT 2C拮抗劑；美西麥角部分1型激動(dòng)劑/2型拮抗劑；美賽西平通用1、2、6和7型拮抗劑。
圖9A描述滴定已知靶定或者5-HTR3、4、6或者7受體的激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)ConA(5μg/ml)刺激的人淋巴細(xì)胞活化的劑量反應(yīng)影響。在引發(fā)ConA刺激后72小時(shí)收集細(xì)胞并測(cè)定。用于此實(shí)驗(yàn)的藥物詳細(xì)定義如下SR 57222A選擇性5HT 3激動(dòng)劑；托泊西隆(Troposetron)選擇性5HT 3拮抗劑(臨床驗(yàn)證的抗催吐劑)；RS67333選擇性5HT4激動(dòng)劑(延長(zhǎng)接觸時(shí)下調(diào)受體)；SB 204070選擇性5HT 4受體拮抗劑；Ro 047690；選擇性5HT 6拮抗劑；SB 269970選擇性5HT 7拮抗劑。
圖9B描述滴定已知靶定或者5-HTR3、4、6或者7受體的激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)人淋巴細(xì)胞異源刺激(也作混合淋巴細(xì)胞反應(yīng))的劑量反應(yīng)作用。在引發(fā)刺激后120小時(shí)收集細(xì)胞并測(cè)定。用于此實(shí)驗(yàn)的藥物詳細(xì)定義如下SR 57222A選擇性5HT 3激動(dòng)劑；托泊西隆選擇性5HT 3拮抗劑(臨床驗(yàn)證的抗催吐劑)；RS 67333選擇性5HT4激動(dòng)劑(延遲接觸時(shí)下調(diào)該受體)；SB 204070選擇性5HT 4受體拮抗劑；Ro 047690；選擇性5HT 6拮抗劑；SB 269970選擇性5HT 7拮抗劑。


圖10描述鼠混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)試驗(yàn)(BALB/c相對(duì)于C57BL6)，檢測(cè)5HT3R激動(dòng)劑和選擇性5HT6R拮抗劑相對(duì)于5HT1R激動(dòng)劑作用的效用。
圖11描述當(dāng)有絲分裂刺激人淋巴細(xì)胞活化時(shí)1型5HT受體拮抗劑和2型5HT受體拮抗劑對(duì)細(xì)胞數(shù)目的影響。用10μg/ml ConA刺激細(xì)胞。加入抑制劑前用Ficoll梯度重提純細(xì)胞。用錐蟲(chóng)藍(lán)排除計(jì)數(shù)活細(xì)胞量。
圖12A描述高效選擇性2型5HT受體拮抗劑，LY 53857，對(duì)人淋巴細(xì)胞有絲分裂原刺激(用1μg/ml ConA刺激，且72小時(shí)后收集細(xì)胞)的影響。結(jié)果描述的是在0時(shí)或測(cè)定開(kāi)始后48小時(shí)時(shí)加入抑制劑的效用。
圖12B描述高效選擇性2型5HT受體拮抗劑，SB 206553，對(duì)人淋巴細(xì)胞有絲分裂原刺激(用1μg/ml ConA刺激，且72小時(shí)后收集細(xì)胞)的影響。結(jié)果描述的是在0時(shí)或測(cè)定開(kāi)始后48小時(shí)時(shí)加入抑制劑的效用。
圖12C描述高效選擇性2型5HT受體拮抗劑，MDL 11939，對(duì)人淋巴細(xì)胞有絲分裂原刺激(用1μg/ml ConA刺激，且72小時(shí)后收集細(xì)胞)的影響。結(jié)果描述的是在0時(shí)或測(cè)定開(kāi)始后48小時(shí)時(shí)加入抑制劑的效用。
圖12D描述高效選擇性2型5HT受體拮抗劑，SB 242084，對(duì)人淋巴細(xì)胞有絲分裂原刺激(用1μg/ml ConA刺激，且72小時(shí)后收集細(xì)胞)的影響。結(jié)果描述的是在0時(shí)或測(cè)定開(kāi)始后48小時(shí)時(shí)加入抑制劑的效用。
圖13描述用于研究血清素受體拮抗劑對(duì)抗環(huán)孢菌素A效用的鼠異體移植模型的結(jié)果。本文公開(kāi)數(shù)據(jù)源于細(xì)胞毒性T細(xì)胞的殺傷試驗(yàn)，其中用處理鼠的脾細(xì)胞相對(duì)于p815靶細(xì)胞。
圖14描述5HT2R選擇性拮抗劑，SB 206553，在鼠異源移植模型中的效用。3只用SB 206553處理的小鼠標(biāo)記為SB#226h、SB#226i、和SB#226j。其中2只處理的小鼠的異源反應(yīng)被全部抑制。只有一只小鼠(SB#226j)顯示出治療后沒(méi)有免疫效應(yīng)。然而，為對(duì)SB#226j給藥需重復(fù)進(jìn)行尾靜脈注射。即使注射時(shí)很小心，尾靜脈注射仍有很大的技術(shù)難度，并不總能一次性成功。
圖15為擴(kuò)增靜息和活化的淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞的RT PCR引發(fā)的膠圖象。(+)道表示建cDNA文庫(kù)前用有絲分裂原ConA刺激48小時(shí)的細(xì)胞。(-)道表示靜息細(xì)胞。
圖16是用來(lái)顯示14種不同血清素受體表達(dá)水平的DNA印記，印記用適當(dāng)?shù)膬?nèi)源寡核苷酸探測(cè)，其序列如下1Actgcagaacgtggccaattatcttattggctcttt (SEQ ID NO1)； 1Bgtggagtactcagctaaaaggactcccaagaggg(SEQ ID NO2)； 1Dctctctttttcaaccacgtgaaaatcaagcttgct (SEQ ID NO3)； 1Eatctagatcacccaggagaacgtcagcagatctcta (SEQ ID NO4)； 1Fgagcagcaaagacattataccacaagagacaagcaa (SEQ ID NO5)； 2Atcggctcttttgtgtcatttttcattcccttaacca (SEQ ID NO6)； 2Bctcaacgcctaacatggttgactgtgtctacagttt (SEQ ID NO7)； 2Ctaactgacattttcaatacctccgatggtggacgct (SEQ ID NO8)； 3Agggagttcagcatggaaagcagtaactactatgcag (SEQ ID NO9)； 3Bttcaatctatcagcaactacctccaaactcaggacc (SEQ ID NO10)； 4caccattctttgtcaccaatattgtggatcctttc (SEQ ID NO11)； 5ctttttggctggggagagacgtactctgagg (SEQ ID NO12)； 6atcctcaacctctgcctcatcagcctggac(SEQ ID NO13)； 7tgaaaggaaaaacatctccatctttaagcgagaaca (SEQ ID NO14).
圖17描述多種1類(lèi)5-HT選擇性藥物的功能行為。8-OH DPAT是選擇性1A激動(dòng)劑；WAY 100635是選擇性1A拮抗劑；普萘洛爾是通用1型受體拮抗劑(也是beta-腎上腺能拮抗劑)；SB 216641是選擇性1B拮抗劑；L694247是選擇性1B/1D激動(dòng)劑；GR 55562是選擇性1B/1D拮抗劑；BRL 54443是選擇性1E/1F激動(dòng)劑。如本發(fā)明其他部分所述，在5mg/ml ConA刺激人淋巴細(xì)胞的0時(shí)加入藥物。
圖18A是用描述于本發(fā)明其他部分的鼠異體移植模型獲得的數(shù)據(jù)。簡(jiǎn)而述之，本圖描述的數(shù)據(jù)源自單一典型性研究。2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照表示觀測(cè)到的誘導(dǎo)的細(xì)胞毒殺傷活性，反之原初的對(duì)照從未接觸P815細(xì)胞，因而提供了此種測(cè)定方法的背景測(cè)量。用美西麥角(MS)處理的小鼠顯示出對(duì)這種誘導(dǎo)的殺傷效應(yīng)的完全抑制。
圖18B是用描述于本發(fā)明其他部分的鼠異體移植模型獲得的數(shù)據(jù)。此處的數(shù)據(jù)顯示多種測(cè)定的匯合結(jié)果，此處用效應(yīng)物靶位點(diǎn)為100∶1的比率來(lái)計(jì)量抑制的百分?jǐn)?shù)。每單一柱形圖表示數(shù)據(jù)收集于一只小鼠。
圖19A描述5-HT2A/B/C受體拮抗劑LY53587在16小時(shí)時(shí)對(duì)RPMI8226細(xì)胞存活能力的影響。
圖19B描述5-HT2A/B/C受體拮抗劑LY53587在48小時(shí)時(shí)對(duì)RPMI8226細(xì)胞存活能力的影響。
圖20A描述5HT-2A/B/C受體拮抗劑在16小時(shí)時(shí)對(duì)RPMI 8226細(xì)胞線(xiàn)粒體活性的影響。
圖20B描述5HT-2A/B/C受體拮抗劑在48小時(shí)時(shí)對(duì)RPMI 8226細(xì)胞線(xiàn)粒體活性的影響。
圖20C描述5HT-2A/B/C受體拮抗劑在16小時(shí)時(shí)對(duì)RPMI 8226細(xì)胞DNA合成的影響。
圖20D描述5HT-2A/B/C受體拮抗劑在48小時(shí)時(shí)對(duì)RPMI 8226細(xì)胞DNA合成的影響。
圖21描述5HT-2A/B/C受體拮抗劑對(duì)RPMI 8226細(xì)胞DNA合成的影響。
圖22描述多種5-HT受體激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)RPMI 8226細(xì)胞增殖的影響。
圖23描述多種靶向1型5-HTR受體的5-HT受體激動(dòng)劑及拮抗劑的效用。試驗(yàn)讀數(shù)為多發(fā)性骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞的增殖。
圖24描述多種靶向2型5-HTR受體的5-HT受體激動(dòng)劑及拮抗劑的效用。試驗(yàn)讀數(shù)為多發(fā)性骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞的增殖。
圖25描述多種靶向3、4、6或7型5-HTR受體的5-HT受體激動(dòng)劑及拮抗劑的效用。試驗(yàn)讀數(shù)為多發(fā)性骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞的增殖。
圖26是一個(gè)膠圖，描述在用多種試劑(包括5-HTR 2A/2B/2C)處理的RPMI 8226細(xì)胞中與凋亡相關(guān)的典型DNA片斷化。
圖27，包括A到F的6幅小圖，描述了RPMI 8226細(xì)胞的FACS特征，這些細(xì)胞或是用多種濃度的喜樹(shù)堿、選擇性1B/D型5-HTR拮抗劑處理過(guò)的，或是用膜聯(lián)蛋白(Annexin)(沿縱坐標(biāo)方向)及碘化丙啶(PI)(橫坐標(biāo)方向)染色的所有未處理細(xì)胞。
圖28含4幅小圖，描述對(duì)應(yīng)的用蘇木精和伊紅(上)及雙苯甲酰胺(下)染色的RPMI-8226細(xì)胞圖象，這些是用2μM喜樹(shù)堿(左)處理及用50μM SB 216641處理以抑制1B型5-HT受體信號(hào)(右)9小時(shí)后的細(xì)胞。在2個(gè)處理組中都可見(jiàn)大量染色質(zhì)凝聚及核片斷化，顯示出廣泛的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。
圖29描述對(duì)應(yīng)的用蘇木精和伊紅(上)及雙苯甲酰胺(下)染色的RPMI-8226細(xì)胞圖象，這些是用50μM SB242084處理9小時(shí)以抑制2C型5-HT受體信號(hào)(右)的細(xì)胞及載體對(duì)照(左)。對(duì)照樣品可見(jiàn)均一染色質(zhì)染色，表明生存細(xì)胞；然而在用SB242084處理過(guò)的細(xì)胞中卻可見(jiàn)聚集及片段化的染色質(zhì)，表明發(fā)生細(xì)胞凋亡。
圖30包括A-D小圖，是顯微照片，顯示在5-羥色胺能信號(hào)傳遞被抑制的情況下細(xì)胞的可見(jiàn)變化。細(xì)胞在有選擇性的1B型拮抗劑(SB216641)的條件下孵育，且24小時(shí)后可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)上發(fā)生變化。
圖31描述RPMI-8226細(xì)胞對(duì)氟奮乃靜及馬來(lái)酸甲基麥角新堿的劑量依賴(lài)性細(xì)胞增殖反應(yīng)。試驗(yàn)讀數(shù)是氚標(biāo)記的脫氧胸腺嘧啶核苷結(jié)合到細(xì)胞DNA中的每分鐘計(jì)數(shù)(CPM)。
圖32描述RPMI-8226細(xì)胞對(duì)多種5-HT受體激動(dòng)劑和拮抗劑的劑量依賴(lài)性細(xì)胞增殖反應(yīng)。試驗(yàn)讀數(shù)是氚標(biāo)記的脫氧胸腺嘧啶核苷結(jié)合到細(xì)胞DNA中的每分鐘計(jì)數(shù)(CPM)。
圖33描述有絲分裂原誘導(dǎo)的T-細(xì)胞增殖試驗(yàn)中，多種5-HT受體激動(dòng)劑和拮抗劑的劑量依賴(lài)性功能行為。按本文其他部分所述，用5μg/ml ConA刺激細(xì)胞，并在72小時(shí)后收集計(jì)數(shù)。
圖34包括圖34A至34I，是一系列源于流式細(xì)胞分析的FACS圖，這些細(xì)胞是用多種濃度的氟奮乃靜處理并用PI及膜聯(lián)蛋白-V染色的RPMI 8226細(xì)胞。該FACS圖是控制流式細(xì)胞分析使之只包括PI陰性細(xì)胞(非壞死細(xì)胞)的情況下產(chǎn)生的。膜聯(lián)蛋白-V染色級(jí)別作為測(cè)量細(xì)胞凋亡的度量。圖的黑色區(qū)域表示沒(méi)經(jīng)處理的對(duì)照細(xì)胞，亮的區(qū)域表示氟奮乃靜處理的細(xì)胞。
圖35包括圖35A到35D，是一系列膠圖象，描述細(xì)胞DNA核小體間(internuclesomal)斷裂，這是細(xì)胞凋亡的一個(gè)標(biāo)志。用標(biāo)示濃度的氟奮乃靜、SB216641(5HT-1BR拮抗劑)、喜樹(shù)堿(拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑，細(xì)胞凋亡對(duì)照)處理RPMI-8226細(xì)胞，并在所示時(shí)間點(diǎn)抽提基因組DNA。
圖36，不希望受任何理論限制，描述由于T細(xì)胞和瘤B細(xì)胞上血清素和1B型5-HT受體相互作用引起的信號(hào)通路。其中1B型5-HT受體的信號(hào)傳遞特性與AKT(又名蛋白激酶B)相結(jié)合。1B型5-HT受體的激活導(dǎo)致AKT蛋白的磷酸化。而后此磷酸化形式的蛋白又使半胱天冬酶9磷酸化，從而抑制細(xì)胞凋亡反應(yīng)。撤除1B型5-HT信號(hào)，如(但不限于)使用氟奮乃靜，會(huì)關(guān)閉AKT從而使半胱天冬酶系統(tǒng)得以活化，進(jìn)而導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡。
圖37包括圖37A和37B是2個(gè)跑膠圖，表示所示滴定已知的1型5-HT選擇性拮抗劑(SB 216641)的效應(yīng)。如本文其他部分所述，數(shù)據(jù)表明阻遏1B型5-HT信號(hào)會(huì)下調(diào)AKT活性，進(jìn)而誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡。
圖38表明氟奮乃靜引起的對(duì)細(xì)胞增殖的典型抑制。氟奮乃靜為常用抗精神病藥，它是HEK-293細(xì)胞表達(dá)的人5HT2C-INI受體同工型的有效反激動(dòng)劑。圖示結(jié)果源于重復(fù)3次的實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)用于測(cè)定氟奮乃靜對(duì)HEK-293細(xì)胞表達(dá)的人5HT2C-INI受體的組成型PI水解活性的抑制能力。數(shù)據(jù)顯示為3次測(cè)定的均值dpm±S.E.M.，并獲自Rauser等(2001，J.Pharmacol.Exp.Ther.29983-89)。
圖39顯示氟奮乃靜及其2個(gè)帶正電的酚噻嗪衍生物，名為QSS-5和QSS-13的結(jié)構(gòu)式。與親本化合物氟奮乃靜相比，QSS-5和QSS-12上的額外氨基都可減少化合物的親脂性。
圖40顯示氟奮乃靜、QSS-5、和QSS-12對(duì)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的相對(duì)的細(xì)胞殺傷功效。在此測(cè)定中，用P815刺激BALB/c小鼠脾細(xì)胞，顯示了完全MHC不匹配。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序，將待測(cè)的細(xì)胞放在一起孵育7天，并用CTL測(cè)定它們裂解P815靶細(xì)胞的能力。所示數(shù)據(jù)以用未經(jīng)處理的細(xì)胞群檢測(cè)的殺傷率為參照。
圖41，包括圖41A和41B，描述多種化合物減弱細(xì)胞增殖的功效，這些細(xì)胞源于人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系。圖41A描述梯度濃度氟奮乃靜QSS衍生物對(duì)RPMI-8226細(xì)胞生長(zhǎng)的功效。圖41B描述氟奮乃靜及其QSS衍生物對(duì)于減弱U266細(xì)胞增殖的功效。2個(gè)細(xì)胞系都源于人多發(fā)性骨髓瘤。多種化合物的不同劑量按μM提供。細(xì)胞增殖用攝入的氚標(biāo)記的脫氧胸腺嘧啶核苷的吸收(計(jì)量DNA合成)表示。
圖42描述多種氟奮乃靜酚噻嗪衍生物的結(jié)構(gòu)式，例如QSS-1、QSS-3、QSS-5和QSS-6。
圖43描述不同濃度的氟奮乃靜、QSS-1、QSS-3、QSS-5和QSS-6對(duì)細(xì)胞增殖的影響。測(cè)定了所示不同濃度的化合物對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系A(chǔ)RH-77的細(xì)胞增殖的影響(用測(cè)定攝入氚標(biāo)記的脫氧胸腺嘧啶核苷測(cè)量DNA合成)。
圖44為描述血清素，多巴胺及QSS-5的分子模型。分子以CPK模式顯示，表示出不同化合物相應(yīng)的范德華原子半徑及位置。
發(fā)明詳述血清素家族受體在神經(jīng)系統(tǒng)中起重要作用，同時(shí)正如本發(fā)明所揭示的，其在免疫系統(tǒng)中也起重要作用。本文公開(kāi)的數(shù)據(jù)顯示影響2型血清素受體活化能調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。具體來(lái)說(shuō)，抑制血清素與2B/2C型或與較少量的2A受體結(jié)合可以介導(dǎo)T細(xì)胞活化的減低或抑制，也可抑制哺乳動(dòng)物中初級(jí)及二級(jí)T細(xì)胞應(yīng)答。這種對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答的抑制為自身免疫疾病、異源移植排斥反應(yīng)及其他疾病提供了一個(gè)有效的治療方法，這些疾病目前都還未見(jiàn)有效療法。
定義本發(fā)明中，下列每一術(shù)語(yǔ)有本部分所述相應(yīng)含義。
本發(fā)明中的非特指名詞指一個(gè)或多個(gè)(即至少一個(gè))文中所述物質(zhì)。例如“元素”指一個(gè)或多于一個(gè)元素。
本發(fā)明所用T細(xì)胞“活化”指T細(xì)胞與化合物，分子，或能產(chǎn)生免疫應(yīng)答的細(xì)胞(如促細(xì)胞分裂素ConA或PHA)接觸時(shí)表面標(biāo)記發(fā)生可測(cè)性上調(diào)，例如CD25，即IL2受體，引發(fā)包括p561ck的磷酸化級(jí)聯(lián)，引起細(xì)胞因子及白介素的釋放，增加DNA合成(可通過(guò)檢測(cè)嵌入原始DNA鏈的3H-胸腺嘧啶水平或通過(guò)其他方法測(cè)定)并引發(fā)細(xì)胞增殖。
本發(fā)明所用血清素“激動(dòng)劑”指當(dāng)對(duì)哺乳動(dòng)物給藥時(shí)可增強(qiáng)、提高或擴(kuò)展血清素存在或水平的生物學(xué)活性的物質(zhì)成份，此處指與不加該物質(zhì)時(shí)的血清素生物學(xué)活性相比。
血清素“拮抗劑”是指當(dāng)對(duì)哺乳動(dòng)物，如人，給藥時(shí)在可測(cè)水平抑制血清素存在或其水平的生物學(xué)活性的物質(zhì)成份。
血清素“反向激動(dòng)劑”是一種物質(zhì)成份，該成份在對(duì)哺乳動(dòng)物給藥時(shí)可檢測(cè)到將血清素能受體介導(dǎo)的信號(hào)抑制到其基線(xiàn)水平以下。例如，拮抗劑能阻止配基發(fā)揮其對(duì)受體的陽(yáng)性信號(hào)效應(yīng)，而反向激動(dòng)劑(在本領(lǐng)域也叫做“陰性拮抗劑”)會(huì)將受體介導(dǎo)的信號(hào)抑制到低于平衡水平。也即，在配基不存在的情況下經(jīng)由血清素能受體的信號(hào)也可顯現(xiàn)某一特定可測(cè)基線(xiàn)水平，而反向激動(dòng)劑能將此水平減低到基線(xiàn)以下。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“選擇性的激動(dòng)劑”或“選擇性的拮抗劑”指一種化學(xué)制劑，該制劑與靶血清素受體的親和力至少比與血清素家族受體的其他成員的親和力強(qiáng)5倍以上。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“緩解”疾病指減輕該疾病一種或多種癥狀的嚴(yán)重程度。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“異源移植”指種內(nèi)任何組織的移植，其中含有免疫標(biāo)記的不匹配，例如(但不限于)主要組織相容性復(fù)合物(MHC)和/或次要抗原。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“異源移植反應(yīng)”指針對(duì)移入受體的非自身組織的任何免疫反應(yīng)。移植程序包括(但不限于)在諸如骨髓移植及器官移植之類(lèi)操作中施用非自身細(xì)胞、組織或器官。
“反義”特指編碼蛋白的雙鏈DNA分子中非編碼的核酸序列，或指與非編碼鏈完全同源的序列。如本發(fā)明定義的，反義序列與編碼蛋白的雙鏈DNA分子的序列是互補(bǔ)的。反義序列不必獨(dú)與DNA分子編碼鏈的編碼區(qū)互補(bǔ)，反義序列可以與編碼蛋白的DNA分子的編碼鏈中特定的調(diào)節(jié)序列互補(bǔ)，該調(diào)節(jié)序列控制編碼序列的表達(dá)。
“擴(kuò)增”指任何拷貝多核苷酸序列的方法，從而可使該多核苷酸分子擴(kuò)增到更多數(shù)目，例如，反轉(zhuǎn)錄、聚合酶鏈反應(yīng)及連接酶鏈反應(yīng)。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“凋亡”指一種活性過(guò)程，包括由細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)信號(hào)誘導(dǎo)的預(yù)成細(xì)胞通路的活化，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。具體來(lái)說(shuō)，細(xì)胞死亡包括在細(xì)胞膜完整的細(xì)胞中細(xì)胞核片斷化、染色質(zhì)凝聚等現(xiàn)象。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“用藥器”指任何包括(但不限于)皮下注射、吸管之類(lèi)的儀器，用于給哺乳動(dòng)物施用本發(fā)明的抑制劑，該抑制劑可抑制血清素與2型血清素受體的相互作用，如2型血清素受體拮抗劑。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞周期過(guò)程”指任何與細(xì)胞周期及其各種時(shí)期相關(guān)的細(xì)胞功能或過(guò)程。因此細(xì)胞周期過(guò)程是指通過(guò)細(xì)胞周期任何時(shí)期的，介導(dǎo)或參與細(xì)胞進(jìn)程或與其相關(guān)的一個(gè)過(guò)程。
本發(fā)明所指抑制血清素信號(hào)傳遞對(duì)細(xì)胞“有害”是指該抑制使細(xì)胞生存力發(fā)生有害的降低。細(xì)胞生存力可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定，包括(但不限于)測(cè)定生物分子合成的水平(例如蛋白合成、核酸合成等)、錐蟲(chóng)藍(lán)排斥水平、MTT還原水平、碘化丙啶(propidiumiodide)吸收水平、細(xì)胞表面磷脂酰絲氨酸的暴露水平、DNA片斷化和/或DNA梯形成水平等等。
“疾病”指動(dòng)物的某種健康狀況，其中如動(dòng)物不能維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定且其中若疾病不能得到改善則動(dòng)物的健康就會(huì)持續(xù)惡化。反之“障礙”指另一種健康狀況，即動(dòng)物可以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，但動(dòng)物的健康狀況比不存在該障礙時(shí)略差。如不治療障礙不會(huì)引起動(dòng)物健康狀況的進(jìn)一步降低。
本發(fā)明所用“實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障”指用標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法檢測(cè)(如本發(fā)明所述、本領(lǐng)域所知或?qū)?lái)發(fā)展的測(cè)定化合物穿透血腦屏障參透性的方法)抑制劑不可在可測(cè)水平穿透血腦屏障。這些測(cè)定方法包括(但不限于)測(cè)定給動(dòng)物服藥時(shí)的神經(jīng)精神效應(yīng)。進(jìn)一步，試驗(yàn)法包括測(cè)定一定時(shí)間后越過(guò)屏障的化合物濃度或穿過(guò)本領(lǐng)域所知的血腦屏障模型的化合物濃度(及其他方法)，從而測(cè)定化合物對(duì)屏障的參透性。
可以理解用現(xiàn)有技術(shù)可使抑制劑不在可測(cè)水平滲透及穿過(guò)血腦屏障。進(jìn)一步說(shuō)，目標(biāo)抑制劑可用本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行改性而使之不能在可測(cè)水平穿透血腦屏障，或是與未改性前相比以更低的水平穿透血腦屏障。在兩種情況下，不論是化合物喪失在可測(cè)水平穿透血腦屏障的能力或是與改性前相比失掉在較低水平穿透血腦屏障的能力，都認(rèn)為該化合物已達(dá)到本部分“實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障”的目的。
本文所用術(shù)語(yǔ)“有效量”指抑制劑的量，該量足以調(diào)節(jié)細(xì)胞中經(jīng)由血清素受體的血清素信號(hào)傳遞，使之發(fā)生可測(cè)的降低?？捎帽绢I(lǐng)域眾所周知的方法檢測(cè)血清素信號(hào)的傳遞，例如(但不限于)本發(fā)明其他部分所述方法，包括測(cè)定血清素與受體結(jié)合水平和/或測(cè)定細(xì)胞活化水平。
技術(shù)人員應(yīng)理解該量是可變的，實(shí)際上可被眾多因素調(diào)節(jié)，如待治疾病或狀況、待治哺乳動(dòng)物的年齡、健康及精神狀況等等。一般來(lái)說(shuō)，劑量變動(dòng)于1mg/kg和25mg/kg之間。在一種實(shí)施方案中，通過(guò)靜脈快速注射法給藥。這種給藥方式可確保所有免疫相關(guān)細(xì)胞接觸足夠量的藥，進(jìn)而阻斷它們受體介導(dǎo)的信號(hào)。然而，本發(fā)明不局限于此種給藥方式。
本發(fā)明所用“同源的”指兩個(gè)多聚分子間亞序列的相似度，例如兩個(gè)核酸分子間，兩個(gè)DNA分子或兩個(gè)RNA分子間或兩個(gè)多肽分子間的相似度。當(dāng)兩個(gè)分子的亞單位都由相同的單體亞單位組成時(shí)，例如如果兩個(gè)DNA分子在位點(diǎn)都是腺嘌呤，則它們?cè)谠撐稽c(diǎn)是同源的。兩個(gè)序列間的同源性是由匹配或同源位點(diǎn)的數(shù)目直接決定的，例如，如果兩個(gè)化合物一半位點(diǎn)(如10個(gè)亞單位長(zhǎng)的聚合物中的5個(gè)位點(diǎn))是同源的，那么這兩個(gè)序列是50％同源；如果90％的位點(diǎn)(如10個(gè)亞單位長(zhǎng)的聚合物中的9個(gè)位點(diǎn)匹配或同源)相同，則這兩個(gè)序列分享90％的同源性。例如3’ATTGCC5’和3’TATGGC這兩個(gè)DNA序列有50％的同源性。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“免疫反應(yīng)”指刺激和/或激活免疫細(xì)胞后的可檢測(cè)結(jié)果。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答”指在T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)、和/或抗原遞呈細(xì)胞中導(dǎo)致效應(yīng)器功能活化和/或啟動(dòng)的過(guò)程。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解免疫應(yīng)答包括(但不限于)任何可檢測(cè)的輔助性T細(xì)胞或細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的抗原特異活化或異源活化、抗體的產(chǎn)生、過(guò)敏反應(yīng)的T細(xì)胞介導(dǎo)活化等。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“免疫細(xì)胞”指任何參與激發(fā)免疫應(yīng)答的細(xì)胞。這些細(xì)胞包括(但不限于)T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞等。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“抑制血清素與2型血清素受體相互作用的抑制劑”指任何在可測(cè)水平抑制經(jīng)由2型受體信號(hào)傳遞的化合物或分子。這些化合物包括血清素受體拮抗劑、反向激動(dòng)劑等本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“說(shuō)明材料”包括刷品、碟片、圖表或任何表達(dá)媒介，可用于指示本發(fā)明試劑盒中核酸、多肽和/或化合物的使用方法，使之可有效地緩解或治療多種本發(fā)明所述疾病或障礙。指導(dǎo)材料可任意或選擇性地描述緩解哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中疾病或障礙的一種或多種方法。試劑盒的指導(dǎo)材料可貼附于盛核酸、多肽和/或本發(fā)明的化合物的容器上或與盛核酸、多肽和/或化合物的容器一起包裝運(yùn)輸。又或者，指導(dǎo)材料可以與容器分開(kāi)運(yùn)輸，令使用者可結(jié)合該指導(dǎo)材料使用化合物。
“分離的核酸”指核酸片斷或片段，它們是從原來(lái)自然相連部分分離出來(lái)的，例如從正常相連部分(如自然狀況下與片斷相連的基因組序列)脫離下來(lái)的DNA片斷。此術(shù)語(yǔ)也用于指從其他成份上純化下來(lái)的核酸，這些成份與該核酸自然結(jié)合，例如細(xì)胞中與之結(jié)合的RNA、DNA或蛋白質(zhì)。因此本術(shù)語(yǔ)包括結(jié)合入載體、自發(fā)復(fù)制質(zhì)粒、原核或真核基因組DNA上的重組DNA；或是以單個(gè)分子存在(如cDNA或是由PCR或限制酶消化產(chǎn)生的基因組或cDNA片斷)不依賴(lài)于其他序列的重組DNA。還包括屬于編碼其他多肽序列的雜和基因一部分的重組DNA。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”免疫應(yīng)答指與不被治療或接觸化合物的哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答水平相比，和/或與除不接受治療其他方面都相同的哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答相比，使免疫應(yīng)答水平發(fā)生可測(cè)的升高或降低。本術(shù)語(yǔ)包括擾亂和/或影響天然信號(hào)或應(yīng)答，從而在哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人中介導(dǎo)了有益的治療反應(yīng)。
“引物”指可特異性結(jié)合到指定的多核苷酸模板上，從而為合成互補(bǔ)多核苷酸提供起始點(diǎn)的多核苷酸。當(dāng)將多核苷酸引物置于可誘導(dǎo)合成的環(huán)境中，即存在核苷酸、互補(bǔ)多核苷酸鏈、起聚合作用的試劑(如DNA聚合酶)中時(shí)，此合成反應(yīng)發(fā)生。引物一般為單鏈，但也可以為雙鏈。引物一般為脫氧核糖核酸，但大量合成及天然形成的引物被用于多種方案中。引物與模板互補(bǔ)，設(shè)計(jì)引物使之與模板雜交，作為引發(fā)合成的起始位點(diǎn)，但引物不必反映模板的全部序列。在此情況中，引物與模板的特異性雜交依賴(lài)于雜交條件的嚴(yán)格性。可用如發(fā)光、放射或熒光部分等標(biāo)記引物并用作可檢測(cè)的部分。
“重組多核苷酸”指含非天然相結(jié)合序列的多核苷酸。擴(kuò)增的或組合的重組多核苷酸可包括于適當(dāng)?shù)妮d體中，且該載體可用于轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。
重組多核苷酸也可起非編碼功能(如啟動(dòng)子、復(fù)制起點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等)。
包含重組多核苷酸的宿主細(xì)胞為“重組宿主細(xì)胞”。在重組宿主細(xì)胞中包含的重組多核苷酸的基因表達(dá)產(chǎn)生“重組多肽”。
“重組多肽”是由重組多核苷酸的表達(dá)產(chǎn)生。
“載體”是包含分離的核酸的物質(zhì)成份，可用于將分離的核酸傳遞到細(xì)胞內(nèi)部。本領(lǐng)域很多已知載體包括(但不限于)線(xiàn)性多核苷酸、與離子或兩親化合物結(jié)合的多核苷酸、質(zhì)粒及病毒。因此該術(shù)語(yǔ)“載體”包括自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《尽Ｔ撔g(shù)語(yǔ)也可理解為包括有助于將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的非質(zhì)粒及非病毒化合物，如聚賴(lài)氨酸化合物、脂質(zhì)體等。病毒載體包括(但不限于)腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等。
“表達(dá)載體”指包含重組多核苷酸，也包含與表達(dá)核酸序列相連的表達(dá)控制序列的載體。表達(dá)載體包含足夠的用于表達(dá)的順式作用元件；其他表達(dá)所需元素可由宿主細(xì)胞提供或存在于載體表達(dá)系統(tǒng)。本領(lǐng)域表達(dá)載體包括所有已知載體，如粘粒、質(zhì)粒(裸露于或包含在脂質(zhì)體中)及結(jié)合重組多核苷酸的病毒。
術(shù)語(yǔ)“血清素家族受體”指可被分類(lèi)于血清素、腎上腺素能、組胺、褪黑激素或多巴胺能受體的受體。也即，該受體特異性的與這些分子中的任一成員結(jié)合且不與樣品中其他分子結(jié)合。
“血清素受體”包括特異性與血清素結(jié)合的多肽。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“血清素信號(hào)”指作為受體介導(dǎo)的與血清素相互作用結(jié)果的任何細(xì)胞內(nèi)生化通路平衡的改變，或是特異性藥物與任何血清素特異性受體相互作用的結(jié)果，或是兩者一起引起的結(jié)果。
相似地，本發(fā)明所用“血清素的活化”受體指細(xì)胞中血清素與血清素受體的結(jié)合誘導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)外與此結(jié)合有關(guān)的特定級(jí)聯(lián)。
“受體”是與配基特異性結(jié)合的化合物。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”指受體識(shí)別并結(jié)合樣品中的血清素家族蛋白(即多巴胺能蛋白、腎上腺素能蛋白、組胺、褪黑激素及血清素)，而實(shí)質(zhì)上不識(shí)別及結(jié)合樣品中的其他分子。
本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“治療”疾病指減少疾病或障礙的頻率，減低動(dòng)物患有的一種或多種疾病或障礙癥狀的頻率。
說(shuō)明本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的新方法。本發(fā)明涉及一個(gè)發(fā)現(xiàn)，即用特異性拮抗劑抑制細(xì)胞中血清素與細(xì)胞上的2型血清素受體相互作用，和/或用反向激動(dòng)劑抑制經(jīng)由2型血清素受體的信號(hào)轉(zhuǎn)化可以抑制T細(xì)胞活化。本發(fā)明揭示了抑制多種免疫疾病、障礙或狀況的方法，即通過(guò)使用已知或開(kāi)發(fā)的2型血清素受體拮抗劑抑制血清素與2型血清素受體的相互作用，并通過(guò)抑制血清素與受體的相互作用阻止或抑制T細(xì)胞的活化，進(jìn)而可抑制由該相互作用介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
I.方法A.調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法本發(fā)明包括調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法。本方法包括因治療需要給哺乳動(dòng)物施用可抑制血清素與血清素受體間相互作用的抑制劑。因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解本發(fā)明所述教導(dǎo)表明抑制血清素與5-HT受體相互作用會(huì)抑制或阻止含該受體的T細(xì)胞活化。而后，如本文公開(kāi)數(shù)據(jù)所詳細(xì)闡述的，T細(xì)胞的抑制會(huì)阻止免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。
具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及可用多種抑制血清素與1B型、2型、4型和6型血清素受體相互作用的抑制劑來(lái)抑制此相互作用。也即，基于本文公開(kāi)數(shù)據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，抑制血清素與1B、2(A、B和/或C)、4和6型受體結(jié)合的化合物包括，但不局限于，抗體、反義核酸、核酶、小分子、肽模擬物(peptidomimetic)和藥物化合物，或是已知或是開(kāi)發(fā)中的抑制血清素與血清素受體相互作用的物質(zhì)。
基于本文公開(kāi)數(shù)據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明的抑制劑包括阻止或抑制細(xì)胞表面上血清素受體結(jié)合血清素的分子和化合物。即，本發(fā)明認(rèn)為，阻止受體表達(dá)使之不會(huì)呈現(xiàn)在細(xì)胞表面的反義和/或反義分子可作為本發(fā)明的抑制劑。
抑制血清素與1B、2、4或6型血清素受體間相互作用的抑制劑優(yōu)選1、2、4和6型受體的拮抗劑，如利哌酮、氟奮乃靜、酮色林、米安色林、LY 53857、SB 206553、SB 242084、MDL 11939、SB 216641、美賽西平及其他。此外，基于本文公開(kāi)數(shù)據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，1B、2、4和6型受體拮抗劑包括那些將來(lái)發(fā)現(xiàn)的拮抗劑，因?yàn)榧夹g(shù)人員應(yīng)理解根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知的藥理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)鑒別出的任何1B、2、4或6型受體拮抗劑，因其對(duì)血清素與血清素受體相互作用的抑制性可抑制T細(xì)胞活性，進(jìn)而可抑制免疫應(yīng)答，如其他部分所例證說(shuō)明的。因此，本發(fā)明不僅局限于在此所述特定的1B、2(A/B/C)、4和6型受體拮抗劑，而是包括那些本領(lǐng)域所知或?qū)㈤_(kāi)發(fā)出的拮抗劑。
2型血清素受體拮抗劑可特異于任何一種2A、2B和2C型受體或其任何組合。另外，本發(fā)明包括不特異的2型受體拮抗劑，其可影響血清素與任何2型受體的結(jié)合。特異及非特異的2型血清素受體拮抗劑包括(但不限于)利哌酮、米安色林、利坦色林、酮色林、美西麥角、甲氧禾胺(methoxygamine)、賽庚啶、氯氮平、SB 206553、LY 53857、MDL 11939、SB 242084、甲麥角林、N-去甲氯氮平、匹侖哌隆、氯氮平N-氧化物、氯替平、洛沙平、美舒麥角等及其任何組合。
基于本文公開(kāi)數(shù)據(jù)技術(shù)人員也應(yīng)理解，本發(fā)明包括使用實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障的化合物。因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解由于血清素受體存在于神經(jīng)細(xì)胞而且如本發(fā)明所揭示的也出現(xiàn)于免疫系統(tǒng)細(xì)胞，包括源于這些細(xì)胞的腫瘤(如多發(fā)性骨髓瘤等)，最好(但不必)抑制經(jīng)由免疫細(xì)胞上血清素受體的信號(hào)傳遞而不影響經(jīng)由神經(jīng)細(xì)胞上血清素受體的信號(hào)傳遞。在這種情況下，最好能使用可抑制信號(hào)傳遞但不可穿透血腦屏障進(jìn)而影響神經(jīng)細(xì)胞上血清素信號(hào)傳遞的化合物。
相應(yīng)地，本發(fā)明包括包括使用一種化合物，其抑制經(jīng)由細(xì)胞血清素受體的血清素信號(hào)傳遞但不會(huì)大量穿透血腦屏障。這樣的化合物為一種新的化合物，它自始在實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障的同時(shí)擁有本發(fā)明所述的其他期望的特性(如影響血清素信號(hào)傳遞、特異性抑制某些類(lèi)型的血清素受體、誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫應(yīng)答等)?；蛘?，基于本文提供的技術(shù)，技術(shù)人員應(yīng)該理解本發(fā)明包括這樣的化合物可抑制血清素信號(hào)傳遞但穿透血腦屏障，而后經(jīng)過(guò)改性使其穿透屏障的能力減低或優(yōu)選消失的化合物。
基于本文公開(kāi)數(shù)據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，改性化合物影響其穿透血腦屏障的方法是本領(lǐng)域所熟知的，同時(shí)本領(lǐng)域教導(dǎo)了用于測(cè)定物質(zhì)穿透屏障能力的多種方法。本文公開(kāi)了這樣一種方法，即將多種側(cè)基加入化合物(如氟奮乃靜)，從而使改性后的氟奮乃靜穿透血腦屏障的能力降低。本文公開(kāi)了改性后的氟奮乃靜化合物，命名為如QSS-5和QSS-12，但此應(yīng)用決不局限于這些或任何其他已知血清素抑制劑的特殊衍生物。反之，本發(fā)明包括任何有本發(fā)明抑制劑所期望的免疫調(diào)節(jié)特性且同時(shí)有期望的較低的穿透血腦屏障能力的化合物。生產(chǎn)和鑒定有這些特性的化合物是本領(lǐng)域的常規(guī)方法，如用于評(píng)估化合物穿透血腦屏障的滲透的測(cè)定法。同產(chǎn)生有期望特性的目標(biāo)化合物的方法一樣，這些測(cè)定法例舉于本發(fā)明。但是，本發(fā)明決不局限于這些或任何其他方法；而是包括產(chǎn)生和鑒定實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障但仍然抑制經(jīng)由血清素受體的血清素信號(hào)傳遞的化合物的方法，如那些本發(fā)明所公開(kāi)的、本領(lǐng)域所熟知的或?qū)?lái)會(huì)發(fā)展出的方法。
此外，基于本文公開(kāi)數(shù)據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員能容易的生產(chǎn)及鑒定新的化合物，該化合物可抑制血清素信號(hào)傳遞但實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障，而鑒定這些新化合物的方法在本發(fā)明其他部分有述，且通過(guò)鑒別及生成這樣的化合物，如(但不限于)改性后的氟奮乃靜酚噻嗪衍生物QSS-5和QSS-12，例舉了實(shí)行這些方法的成功簡(jiǎn)化例證。基于本文的公開(kāi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能鑒定本發(fā)明的其他化合物，而且技術(shù)典型的涉及這些實(shí)驗(yàn)，不需要?jiǎng)?chuàng)造性勞動(dòng)。
總之，本發(fā)明包括使用及鑒別可抑制血清素信號(hào)傳遞并且實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障的化合物。因此，下述方法都包括使用這樣的抑制劑。
此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解本發(fā)明包括抑制經(jīng)由任何已知或?qū)?lái)會(huì)被鑒定的血清素受體的血清素介導(dǎo)的信號(hào)傳遞，其中抑制血清素信號(hào)會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、存活力、凋亡等，以及其中細(xì)胞參與或介導(dǎo)免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明不局限于對(duì)經(jīng)由1B、2、4和6型血清素受體信號(hào)傳遞的抑制；而是包括(但不限于)抑制經(jīng)由血清素受體的信號(hào)傳遞，其中該抑制作用抑制免疫應(yīng)答。
基于本文公開(kāi)數(shù)據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可通過(guò)使用已知或?qū)l(fā)展出的抗體、反義核酸、核酶、小分子、肽模擬物和藥物化合物等介導(dǎo)這樣的抑制，該作用可抑制血清素與1型血清素受體的相互作用。也即，本發(fā)明包括使用1型受體抑制化合物，如(但不限于)SB-216641，其抑制1B型受體，和BRL-15572，其選擇性抑制1D型受體(參見(jiàn)Price等，1997，Naunyn-Schmiedeberg’s Arch.Pharmacol.356312-320)。因?yàn)?，如本發(fā)明其他部分公開(kāi)數(shù)據(jù)所證實(shí)的，對(duì)經(jīng)由1B型受體介導(dǎo)的血清素信號(hào)傳遞的抑制可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，且更優(yōu)選如DNA-梯所證實(shí)的凋亡，其與細(xì)胞大小的可測(cè)增加相關(guān)。
然而，本發(fā)明并不局限于這些或任何其他血清素受體抑制劑。具體來(lái)說(shuō)，如本發(fā)明前面其他部分所論述的，這些化合物包括已知化合物及將來(lái)開(kāi)發(fā)的可抑制血清素與血清素受體相互作用的化合物。已知血清素受體激動(dòng)劑及拮抗劑的列表可在英國(guó)TocrisTM商業(yè)公共網(wǎng)站獲得，該網(wǎng)站包括大量G.A.Kennet對(duì)多種血清素受體已知特性的評(píng)論，討論多種影響它們生物學(xué)活性的化合物(Kennet，發(fā)表于1997年5月，universal resource locator at Tocris company website，UnitedKingdom)。
一旦結(jié)合本文公開(kāi)知識(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明包含使用特異性結(jié)合某受體的抗體來(lái)抑制血清素與該血清素受體的結(jié)合。特異性與血清素受體結(jié)合的抗體，包括那些與每種類(lèi)型的受體結(jié)合的抗體，是本領(lǐng)域眾所周知的和/或可由技術(shù)人員通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法生產(chǎn)。
技術(shù)人員應(yīng)進(jìn)一步理解抗體可作為蛋白、編碼蛋白的核酸或兩者同時(shí)給藥。即，本領(lǐng)域有許多眾所周知的載體，可以使蛋白(包括抗體)進(jìn)入細(xì)胞或組織。因此，本發(fā)明包括施用特異性與血清素受體結(jié)合的抗體從而抑制血清素與該受體的結(jié)合，并且該抗體可直接給藥進(jìn)入細(xì)胞或是通過(guò)對(duì)細(xì)胞施用編碼該抗體的核酸使該抗體進(jìn)入細(xì)胞，本發(fā)明也包括抗體的這些給藥方法。
一般來(lái)說(shuō)，抗體不易穿透血腦屏障。因此技術(shù)人員應(yīng)理解使用抗體也提供了這樣一種優(yōu)勢(shì)，即在抑制免疫細(xì)胞血清素信號(hào)傳遞的同時(shí)，由于血腦屏障使抗體無(wú)法接近神經(jīng)細(xì)胞，因而抗體不會(huì)在可測(cè)水平影響神經(jīng)細(xì)胞中的信號(hào)傳遞。
此外，基于本文公開(kāi)數(shù)據(jù)技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明包括通過(guò)阻止細(xì)胞中血清素受體的表達(dá)(如不阻止，該細(xì)胞會(huì)表達(dá)受體)來(lái)抑制血清素信號(hào)的傳遞，否則該信號(hào)會(huì)經(jīng)由血清素受體傳遞。例如，技術(shù)人員應(yīng)理解本發(fā)明包括對(duì)細(xì)胞施用核酶或反義核酸，從而抑制細(xì)胞中的血清素受體表達(dá)，如下簡(jiǎn)述，其中設(shè)計(jì)和使用這些分子來(lái)抑制細(xì)胞中目標(biāo)蛋白表達(dá)的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。
反義分子及其在抑制基因表達(dá)方面的應(yīng)用是本領(lǐng)域眾所周知的(參見(jiàn)，Cohen，1989，InOligodeoxyribonucleotides，AntisenseInhibitors of Gene Expression，CRC Press)。反義核酸為至少與特定mRNA分子的一部分互補(bǔ)的DNA或RNA分子(Weintraub，1990，Scientific American 26240)。細(xì)胞中，反義核酸雜交到相應(yīng)的mRNA上形成雙鏈分子，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄。
用反義方法抑制基因轉(zhuǎn)錄是本領(lǐng)域所熟知，如Marcus-Sakura曾有所描述(1988，Anal.Biochem.172289)。這些反義分子可如Inoue所述的，用編碼反義分子的DNA的遺傳表達(dá)來(lái)提供給細(xì)胞(1993，美國(guó)專(zhuān)利5,190,931)。
或者，可合成反義分子而后提供給細(xì)胞。優(yōu)選的反義寡聚體為10至100，且優(yōu)選是15至50個(gè)核苷酸，因?yàn)樗鼈內(nèi)菀缀铣汕乙子趯?dǎo)入靶細(xì)胞。本發(fā)明所用的合成反義分子包括本領(lǐng)域熟知的寡核苷酸衍生物，其與未改性的寡核苷酸相比它們的生物學(xué)活性得以提高(參見(jiàn)Cohen，見(jiàn)上；Tullis，1991，美國(guó)專(zhuān)利5,023,243，在此全文引用)。
核酶及它們?cè)谝种苹虮磉_(dá)方面的應(yīng)用也是本領(lǐng)域所熟知的(參見(jiàn)，Cech等，1992，J.Biol.Chem.26717479-17482；Hampel等，1989，Biochemistry 284929-4933；Eckstein等，國(guó)際公開(kāi)文本W(wǎng)O92/07065；Altman等，美國(guó)專(zhuān)利5,168,053，在此全文引用)。核酶是RNA分子，可以類(lèi)似于DNA限制性?xún)?nèi)切酶的特性特異性剪切其他單連RNA。通過(guò)改造編碼這些RNA的核酸序列，可將分子設(shè)計(jì)成識(shí)別RNA分子中特異核酸序列并能將其剪切(Cech，1988，J.Amer.Med.Assn.2603030)。此方法的主要優(yōu)勢(shì)在于其序列特異性，只有含特殊序列的mRNAs才會(huì)失活。
核酶有兩種基本類(lèi)型，即，四膜蟲(chóng)型(Hasselhoff，1988，Nature334585)及錘頭型。四膜蟲(chóng)型核酶識(shí)別的序列為四堿基長(zhǎng)，而錘頭型核酶識(shí)別11-18堿基長(zhǎng)的序列。序列越長(zhǎng)，靶mRNA種類(lèi)中序列專(zhuān)一性發(fā)生的可能就越大。因此，錘頭型核酶比四膜蟲(chóng)型核酶更適用于使特殊mRNA種類(lèi)失活，而且18堿基識(shí)別序列比短些的識(shí)別序列更優(yōu)選，因?yàn)槎绦蛄锌赡軙?huì)在多種不相關(guān)的mRNA分子中隨機(jī)存在。
除對(duì)細(xì)胞施用抗體抑制血清素與細(xì)胞表面血清素受體的相互作用外，本發(fā)明包括施用特異性與目標(biāo)血清素受體結(jié)合的抗體或編碼該抗體的核酸，其中該分子進(jìn)一步包含細(xì)胞內(nèi)保留序列，因此抗體可與血清素受體結(jié)合并阻止其在細(xì)胞表面的表達(dá)。這些抗體，通常表示為“細(xì)胞內(nèi)抗體”是本領(lǐng)域所熟知的，如Marasco(美國(guó)專(zhuān)利6,004,490)和Beerli等所描述的(1996，Breast Cancer Research and Treatment3811-17)。因此，本發(fā)明包括含抑制血清素與目的受體結(jié)合的方法，其中受體呈現(xiàn)在細(xì)胞表面(如抗體、化學(xué)化合物、小分子、肽模擬物、藥物等)，本發(fā)明也包括抑制結(jié)合的方法，包括抑制受體呈現(xiàn)在細(xì)胞表面(如核酶、反義分子、細(xì)胞內(nèi)抗體等)，并且包括諸如將來(lái)發(fā)展的抑制細(xì)胞表面上血清素與血清素受體間配基受體相互作用的方法。
基于本文公開(kāi)的數(shù)據(jù)技術(shù)人員應(yīng)理解，抑制血清素與(1B、2、4或6型)血清素受體相互作用的抑制劑可與任何其他抑制劑一起給藥。另外，本發(fā)明包括用至少一種血清素抑制劑(如抗體、反義核酸、核酶、肽模擬物、血清素受體拮抗劑等)與其他免疫調(diào)節(jié)劑一起給藥(其之前及之后或同時(shí)給藥)，免疫調(diào)節(jié)劑為(但不限于)基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑(如抑制白介素2表達(dá)的糖皮質(zhì)素等)、為已知誘變素的烷化劑(如環(huán)磷酰胺)、作用于神經(jīng)鈣蛋白和JNK/p38激酶通路和細(xì)胞周期蛋白激酶級(jí)聯(lián)的激酶及磷酸酶的抑制劑(如環(huán)孢霉素A、他克莫絲[FK506]及雷怕霉素)、作為鳥(niǎo)嘌呤核苷酸合成的抑制劑并用于阻止異源排斥及治療進(jìn)行性排斥的嘌呤從頭合成抑制劑(如麥考酚酯motefil)、用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的嘧啶從頭合成的抑制劑(如雷抑素)等。因此，本發(fā)明包括至少用一種可抑制血清素與(1B、2、4或6型)血清素受體相互作用的抑制劑與傳統(tǒng)免疫調(diào)節(jié)物和化合物一同給藥。
此外，實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障的抑制劑可與穿透屏障的抑制劑一同給藥，并且本發(fā)明決不局限于穿透或不可穿透血腦屏障抑制劑的結(jié)合。
一旦結(jié)合本發(fā)明所授知識(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，既然免疫細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞，更具體來(lái)說(shuō)如T細(xì)胞、或抗原遞呈細(xì)胞，如B細(xì)胞或巨噬細(xì)胞)上血清素與2型血清素受體的結(jié)合是受體活化所必需的，而后受體活化介導(dǎo)T細(xì)胞活化，那么抑制血清素與受體的相互作用可調(diào)節(jié)這些免疫細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。此外，本文公開(kāi)數(shù)據(jù)表明抑制經(jīng)由1B、4或6型血清素受體的血清素信號(hào)的傳遞可抑制表達(dá)這些受體的免疫細(xì)胞的活化，抑制血清素與這些受體的結(jié)合可抑制細(xì)胞活化，因此也抑制了細(xì)胞的免疫反應(yīng)，進(jìn)而抑制由該細(xì)胞產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。也即，抑制免疫細(xì)胞上由血清素受體介導(dǎo)的相互作用會(huì)影響由所影響的免疫細(xì)胞產(chǎn)生的免疫應(yīng)答(即免疫反應(yīng))(如由受體/配基結(jié)合介導(dǎo)的有絲分裂應(yīng)答受抑制，從而T細(xì)胞增殖不發(fā)生，并且/或者發(fā)生凋亡等)，因此相對(duì)于拮抗劑不存在而其他方面相同的細(xì)胞所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，該細(xì)胞的應(yīng)答、免疫或其他方面發(fā)生可測(cè)的增加或減少。本文公開(kāi)數(shù)據(jù)清楚表明不論在活化反應(yīng)的任何階段，不論是由異源刺激或是有絲分裂刺激引發(fā)，抑制由1B、2、4和6型5HT受體介導(dǎo)的信號(hào)可導(dǎo)致應(yīng)答的立即停止。
因此，本文公開(kāi)數(shù)據(jù)充分證實(shí)了一種抑制哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)中免疫應(yīng)答的方法，因?yàn)橐种蒲逅嘏c(1B、2A、2B、2C、4和/或6型)血清素受體的結(jié)合可抑制免疫細(xì)胞活性，因此抑制該細(xì)胞引起的免疫反應(yīng)，進(jìn)而抑制該細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
相似地，本發(fā)明包括一種可抑制由免疫細(xì)胞引起的免疫反應(yīng)的方法。因?yàn)?，如本文其他部分詳?xì)說(shuō)明的，抑制免疫細(xì)胞上血清素與血清素受體的結(jié)合可抑制該細(xì)胞活化，進(jìn)而與不抑制細(xì)胞血清素結(jié)合時(shí)相比其免疫反應(yīng)受抑制，和/或與其中除血清素與血清素受體的結(jié)合不被抑制外其他方面都相同的細(xì)胞相比其免疫反應(yīng)受抑制。
相同的，基于本文公開(kāi)數(shù)據(jù)技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明包括調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，此處免疫應(yīng)答是由血清素信號(hào)活化的免疫細(xì)胞所介導(dǎo)的。因?yàn)?，如本文前面其他部分所述，免疫?xì)胞活化需要血清素與其相關(guān)1B、2A、2B、2C、4和/或6型受體結(jié)合，因此抑制該結(jié)合就抑制了活化，進(jìn)而阻止了細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解抑制血清素信號(hào)(可由本文其他部分詳述的多種方法實(shí)現(xiàn))可抑制需要該信號(hào)的免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。此外，如本文前面其他部分所揭示的，該方法包括使用實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障的抑制劑。
此外，基于本文公開(kāi)數(shù)據(jù)技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明包括抑制T細(xì)胞上血清素受體活化介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法。即，如本文前面其他部分所述，抑制免疫細(xì)胞(優(yōu)選T細(xì)胞)上血清素與血清素受體(如1B、2A、2B、2C、4和6型受體)的結(jié)合可抑制該細(xì)胞活化，并進(jìn)而抑制該細(xì)胞引起的免疫反應(yīng)及該細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。因此基于本文公開(kāi)數(shù)據(jù)技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明包括這樣的方法。
本發(fā)明也包括抑制哺乳動(dòng)物(優(yōu)選人)的免疫細(xì)胞活化的方法，其中該活化由細(xì)胞上的血清素受體活化所介導(dǎo)。再次，正如本文其他部分詳細(xì)敘述的，本文公開(kāi)數(shù)據(jù)首次證明抑制經(jīng)由免疫細(xì)胞上1B、2(A/B/C/)、4或6型血清素受體的血清素信號(hào)傳遞抑制該細(xì)胞活化，并因此也抑制了該細(xì)胞本應(yīng)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。如本文其他部分所詳述的，抑制血清素信號(hào)的方法或是本文所描述的或是本領(lǐng)域熟知的，且包含在本發(fā)明中。再次，本文公開(kāi)的每種方法都包括使用實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障的抑制劑。
基于本文公開(kāi)數(shù)據(jù)技術(shù)人員應(yīng)理解，此處公開(kāi)的方法用于抑制任何對(duì)哺乳動(dòng)物不利的免疫應(yīng)答。這些多余的免疫應(yīng)答包括(但不限于)與疾病、障礙或狀況相關(guān)的免疫應(yīng)答，包括二級(jí)免疫應(yīng)答、自身免疫應(yīng)答、異源移植排斥應(yīng)答等。
因此，本發(fā)明包括抑制哺乳動(dòng)物二級(jí)免疫應(yīng)答的方法。即當(dāng)此二級(jí)免疫應(yīng)答由需血清素信號(hào)活化的細(xì)胞所介導(dǎo)時(shí)，可如此文它處所述通過(guò)抑制細(xì)胞上血清素與1B、2、4和6型血清素受體的結(jié)合來(lái)抑制血清素信號(hào)。該抑制進(jìn)而抑制細(xì)胞活化，然后抑制該細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，如(但不限于)二級(jí)免疫應(yīng)答、CD8+細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答和/或CD4+細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
抑制血清素受體介導(dǎo)信號(hào)的化合物或分子(如，像血清素受體拮抗劑或反向激動(dòng)劑之類(lèi)的藥物化合物)可給藥于細(xì)胞、組織或動(dòng)物，或是用于抑制細(xì)胞上血清素與1B、2、4和/或6型血清素受體的相互作用。不論該抑制劑為抗體或1B、2、4和/或6型血清素受體拮抗劑，此處所描述的安全有效的抑制劑給藥方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。例如，血清素拮抗劑的給藥法參照標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)描述。即，許多影響血清素的制劑的給藥法在Physician’s Desk Reference(1996版，Medical Economics Co.，Montvale，NJ)中都有詳述，其公開(kāi)內(nèi)容在此全文引用。
此外，血清素受體抑制劑的給藥參數(shù)是藥學(xué)領(lǐng)域所熟知的且在此不必重復(fù)。
組合物也可用于治療由于受體表達(dá)改變所介導(dǎo)的疾病、障礙或狀況，因此減低或增加受體表達(dá)，或改變細(xì)胞、組織及動(dòng)物中的蛋白水平對(duì)動(dòng)物是有益的。即，當(dāng)動(dòng)物的疾病、障礙或狀況是由血清素表達(dá)水平或蛋白水平改變所介導(dǎo)或與之相關(guān)時(shí)，可用該組合物調(diào)節(jié)受體的表達(dá)或蛋白水平。
為對(duì)哺乳動(dòng)物給藥，可將化合物、抑制血清素與1B、2、4和/或6型血清素受體結(jié)合的抑制劑、多肽、或是編碼多肽的核酸、和/或與其全部或部分互補(bǔ)的反義核酸混懸在任何可藥用載體中，如HEPES緩沖的pH約7.8的鹽水中。
其他可藥用載體包括(但不限于)甘油、水、鹽水、乙醇和其他可藥用的鹽溶液，如磷酸鹽及有機(jī)酸鹽。這些及其他可藥用載體在Remington’s Pharmaceutical Sciences中有所描述(1991，MackPublication Co.，New Jersey)，其公開(kāi)內(nèi)容在此全文引用。
藥學(xué)組合物可以無(wú)菌注射液、油懸浮液或溶液的形式制備、包裝或出售。此懸浮液或溶液可根據(jù)已知技術(shù)制備，除活性成份外還可包括附加成份，如分散劑、濕潤(rùn)劑或本文所述懸浮劑。這些無(wú)菌注射制劑可通過(guò)合適的非毒性腸道外可用的稀釋劑或溶劑制備，如水或1，3-丁二醇。其他適宜的稀釋劑及溶劑包括(但不限于)Ringer溶液、等滲氯化鈉溶液和合成的單/雙甘油酯之類(lèi)的脂肪油。
本發(fā)明所用藥物組合物可以適于經(jīng)口、直腸、陰道、腸胃外、局部、肺部、鼻內(nèi)、頰、眼部或其他給藥途徑的制劑形式施用、制備、包裝和/或銷(xiāo)售。其他制劑包括投射的毫微粒、脂質(zhì)體制劑、含活性成份的再封紅細(xì)胞及免疫學(xué)基礎(chǔ)的制劑。
本發(fā)明組合物可由多種途徑給藥，包括(但不限于)經(jīng)口、直腸、陰道、腸胃外、局部、肺部、鼻內(nèi)、頰、或眼部給藥。這些給藥方法技術(shù)人員是易于理解的，并取決于多種因素，包括待治疾病類(lèi)型及程度、待治動(dòng)物或人的類(lèi)型及年齡等。
本發(fā)明方法所用藥物組合物可通過(guò)口服固體制劑、眼部用藥、栓劑、氣霧劑、局部用藥或其他類(lèi)似制劑給藥。除如硫酸乙酰肝素或其生物學(xué)等效物之類(lèi)的化合物，這些藥物組合物可包括可藥用載體及其他已知可用于提高或促進(jìn)藥物施用的成份。其他可能的制劑，如毫微粒、脂質(zhì)體、再封紅細(xì)胞及免疫學(xué)基礎(chǔ)的系統(tǒng)也可根據(jù)本發(fā)明的方法用于受體蛋白和/或編碼該蛋白的核酸的施用。
如現(xiàn)在所述，用本文所述任何方法鑒別的化合物都可制成制劑并給哺乳動(dòng)物施用以治療免疫系統(tǒng)狀況(即自身免疫疾病及異源排斥)。
本發(fā)明包括制備和使用藥學(xué)組合物，其包括用于治療多種病癥，如T細(xì)胞淋巴瘤、自身免疫病癥(見(jiàn)下文)、由實(shí)體器官移植引起的并發(fā)癥、皮膚移植排斥反應(yīng)、骨髓移植中的移植物抗宿主病等。
此種藥物組合物可以適于對(duì)目標(biāo)個(gè)體給藥的形式只包含活性成份，或者該藥物組合物可包括活性成份及一種或多種可藥用載體、一種或多種附加成份或一些以上物質(zhì)的組合。活性成份可以以生理適宜的酯或鹽的形式存在于藥物組合物中，如結(jié)合以本領(lǐng)域熟知的生理適宜的陽(yáng)離子或陰離子。
本文所用術(shù)語(yǔ)“可藥用載體”是指一種化學(xué)組分，活性成份可與之結(jié)合，且這種結(jié)合可將該活性成份給藥于目標(biāo)個(gè)體。
本文所用術(shù)語(yǔ)“生理適宜的”酯或鹽，指活性成份的酯或鹽形式，其與該藥物組合物中其他任何成份相容，其對(duì)該組合物給藥的目標(biāo)個(gè)體無(wú)毒害作用。
本文所述藥物組合物制劑可由任何藥學(xué)領(lǐng)域已知或今后開(kāi)發(fā)的方法制備。一般來(lái)說(shuō)，這樣的制備方法包括將活性成份與載體或一種/多種其他附加成份結(jié)合，然后如需要，可將產(chǎn)品制?；虬b成所需的單或多劑量單位。
盡管此處提供的藥物組合物的說(shuō)明主要針對(duì)那些適于對(duì)人給藥的藥物組合物，技術(shù)人員應(yīng)理解這些組合物通常也適于對(duì)各種動(dòng)物給藥。改性可用于對(duì)人給藥的藥物組合物以適于對(duì)多種動(dòng)物給藥是眾所周知的，如需要，獸醫(yī)藥理學(xué)家可用很常規(guī)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并實(shí)行此種改性。本發(fā)明中藥物組合物的給藥目標(biāo)個(gè)體預(yù)期包括(但不限于)人和其他靈長(zhǎng)類(lèi)、哺乳動(dòng)物(包括如牛、豬、馬、羊、貓和狗等商業(yè)相關(guān)的哺乳動(dòng)物)。
本發(fā)明方法中使用的藥物組合物可以以適宜于經(jīng)口、直腸、陰道、腸胃外、局部、肺部、鼻內(nèi)、頰部、眼部或其他給藥途徑的制劑形式制備、包裝或銷(xiāo)售。其他制劑包括投射的毫微粒、脂質(zhì)體制劑、含活性成份的再封紅細(xì)胞及免疫學(xué)基礎(chǔ)的制劑。
本發(fā)明的藥物組合物可以以單劑量單位或以多個(gè)單劑量單位形式制備、包裝或銷(xiāo)售。本文所用“單位劑量”指含預(yù)定量活性成份的不連續(xù)量的藥物組合物?；钚猿煞萘客ǔ５扔诮o目標(biāo)個(gè)體施用的活性成份劑量或此劑量的一個(gè)合適的部分量，例如此劑量的一半或三分之一。
本發(fā)明藥物組合物中的活性成份、可藥用載體及任何附加成份的相關(guān)量會(huì)根據(jù)被治療個(gè)體的特性、大小及狀況變動(dòng)，且根據(jù)該組合物的給藥方式變動(dòng)。例如，組合物可含0.1％至100％(w/w)的活性成份。
除活性成份外，本發(fā)明的藥物組合物可進(jìn)一步包括一或多種附加藥物活性劑。特殊預(yù)期的附加物包括抗吐藥及清除劑，如氰化物和氰酸鹽清除劑。
本發(fā)明藥物組合物的控制或緩釋制劑可由傳統(tǒng)技術(shù)制得。
本發(fā)明適于口服給藥的藥物組合物制劑可以以單個(gè)固體劑量單位的形式制備、包裝或出售，包括(但不限于)片劑、硬或軟膠囊、扁囊劑、含片或錠劑，每種形式都包括預(yù)定量的活性成份。其他適宜口服給藥的制劑包括(但不限于)粉或粒劑、水或油懸浮液、水或油溶液或乳劑。
本文所用“油”液，指由含碳液體分子組成且與水相比極性較弱的液體。
包含活性成份的片劑可由活性成份任選與一種或多種附加成份一起壓制或模制而得。壓制片劑可用適當(dāng)?shù)脑O(shè)備壓制存在于流動(dòng)粉狀或粒狀制品中的活性成份(任選與一種或多種粘合劑、潤(rùn)滑劑、賦形劑、表面活性劑及分散劑混和)而制備。模制片可在適當(dāng)?shù)脑O(shè)備中將活性成份、藥學(xué)適宜溶媒及至少足以濕潤(rùn)該混合物的液體一起灌模制得。用于生成片劑的可藥用賦形劑包括(但不限于)惰性稀釋劑、粒化及崩解劑、粘合劑、和潤(rùn)滑劑。已知的分散劑包括(但不限于)馬鈴薯淀粉和鈉淀粉乙交酯。已知表面活性劑包括(但不限于)十二烷基硫酸鈉。已知的稀釋劑包括(但不限于)碳酸鈣、碳酸鈉、乳糖、微晶纖維素、磷酸鈣、磷酸氫鈣、和磷酸鈉。已知的?；氨澜鈩┌?但不限于)玉米淀粉和海藻酸。已知的粘合劑包括(但不限于)明膠、阿拉伯膠、預(yù)膠化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和羥丙基甲基纖維素。已知潤(rùn)滑劑包括(但不限于)硬脂酸鎂、硬脂酸、硅石及滑石。
片劑可不被包衣或可用已知方法包衣以延遲在目標(biāo)個(gè)體腸胃道中的裂解，從而使活性成份得以緩釋并延緩吸收。例如可用單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯包衣片劑。此外，可用美國(guó)專(zhuān)利4,256,108；4,160,452中描述的方法包衣片劑以形成控制滲透的釋放片劑。為使藥物精美可口，片劑可進(jìn)一步包含甜味劑、調(diào)味劑、著色劑、防腐劑或它們的混合物。
含活性成份的硬膠囊可用生理可降解的組分制得，如明膠。這些硬膠囊包含活性成份，且可進(jìn)一步包含附加劑，如惰性固體稀釋劑，如碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土。
含活性成份的軟明膠膠囊可用生理可降解的組分制得，如明膠。這些軟膠囊包含的活性成份可與一些水或油介質(zhì)混合在一起，如花生油、液體石蠟或橄欖油。
適于口服的含本發(fā)明藥物組合物的液體制劑可以液體或干產(chǎn)品形式(使用時(shí)用水或其他適宜溶劑重構(gòu))制備、包裝及銷(xiāo)售。
液體懸浮液可用傳統(tǒng)方法制備，使活性成份懸浮于水或油溶媒中。水溶媒包括，水和等滲鹽水。油溶媒包括例如杏仁油、油脂、乙醇、如花生、橄欖、芝麻或椰子油等的植物油、分餾的植物油及如液體石蠟之類(lèi)的礦物油。液體懸浮液可進(jìn)一步包括一種或多種附加成份，包括(但不限于)懸浮劑、分散劑或濕潤(rùn)劑、乳化劑、粘滑劑、防腐劑、緩沖液、鹽、調(diào)味劑、著色劑及甜味劑。油懸浮液可進(jìn)一步包括增厚劑。已知的懸浮劑包括(但不限于)山梨醇糖漿、氫化的可食脂、海藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍樹(shù)膠、阿拉伯樹(shù)膠及纖維素衍生物，如羥甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素。已知的分散或濕潤(rùn)劑包括(但不限于)天然磷脂(如卵磷脂)、烯基氧化物與脂肪酸的縮合物、與長(zhǎng)鏈脂肪醇的縮合物、與脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的縮合物、與脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的縮合物(分別例如，聚氧乙烯硬脂酸酯、heptadecaethyleneoxycetanol、聚氧乙烯山梨醇單油酸酯及聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯)。已知的乳化劑包括(但不限于)卵磷脂及阿拉伯膠。已知的防腐劑包括(但不限于)甲基、乙基或正丙基-對(duì)羥基苯甲酸鹽、抗壞血酸及山梨酸。已知的甜味劑包括(但不限于)甘油、丙二醇、山梨醇、蔗糖及糖精。用于油懸浮液的已知增稠劑包括(但不限于)蜂蠟、硬石蠟及鯨蠟醇。
含活性物質(zhì)的水或油液體溶液可用與液體懸浮液相同的方式制備，它們的主要區(qū)別在于活性物質(zhì)是溶解而不是懸浮于其中。本發(fā)明藥物組合物的液體溶液可包括在液體懸浮液部分所述的任何成份，可理解不必加懸浮劑幫助活性物質(zhì)溶解在溶劑中。水溶劑包括水和等滲鹽等。油溶劑包括杏仁油、油酯、乙醇、植物油，如花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油，分餾的植物油及礦物油，如液體石蠟。
本發(fā)明藥物制品的粉末及粒狀制劑可用已知方法制得。這些制劑可直接對(duì)目標(biāo)個(gè)體給藥，它們可用于制得，例如，片劑、填充膠囊或通過(guò)加入水或油溶媒制成水或油懸浮液或溶液。這些制劑每個(gè)都可進(jìn)一步包含一或多種分散劑或濕潤(rùn)劑、懸浮劑及防腐劑。這些制劑中也可包括其他賦形劑，如填料及甜味劑、調(diào)味劑或著色劑。
本發(fā)明藥物組合物也可以水包油乳劑或油包水乳劑的形式制備、包裝或銷(xiāo)售。油相可為植物油，如橄欖油或花生油、礦物油，如液體石蠟或這些物質(zhì)的混合物。這些組分可進(jìn)一步包括一或多種乳化劑，如阿拉伯膠或黃蓍樹(shù)膠之類(lèi)的天然樹(shù)膠、大豆或卵磷脂之類(lèi)的天然磷脂、酯或由脂肪酸及己糖醇酐的結(jié)合物衍生的偏酯，如山梨聚糖單油酸酯及這些偏酯與環(huán)氧乙烷的縮合物，如聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯。這些乳劑也可包含附加成份，如甜味劑或調(diào)味劑。
本發(fā)明藥物組合物可在適于直腸給藥的制劑中制備、包裝或出售。該組合物可制成栓劑、保留灌腸劑及直腸或結(jié)腸沖洗液的形式。
栓劑可通過(guò)將活性成份與非刺激性藥物適宜賦形劑混合而制得，該賦形劑在常溫(即約20℃)，為固體，在直腸溫度時(shí)(即健康人的約為37℃)是液體。適當(dāng)?shù)乃幬镞m宜賦形劑包括(但不限于)可可脂、聚乙二醇及多種甘油酯。栓劑可進(jìn)一步包括多種附加成份，包括(但不限于)抗氧化劑和防腐劑。
用于直腸或結(jié)腸沖洗的保留灌腸劑或溶液可通過(guò)將活性成份及藥物適宜的液體溶媒混合制得。如本領(lǐng)域所熟知，灌腸劑可用于給藥并可包裝在適合于目標(biāo)個(gè)體直腸結(jié)構(gòu)的傳送設(shè)備上。灌腸劑可進(jìn)一步包含多種附加劑，包括(但不限于)抗氧化劑及防腐劑。
本發(fā)明藥物組合物可以在適于陰道給藥的制劑中制備、包裝或銷(xiāo)售。這些組分可以栓劑、或浸漬或包衣的可插入陰道的物質(zhì)的形式，如衛(wèi)生栓、灌洗劑、用于陰道沖洗的膠、乳液或溶液。
用化學(xué)組分浸漬或包被物質(zhì)的方法是本領(lǐng)域所熟知的，包括(但不限于)將化學(xué)組分沉淀或結(jié)合到材料表面的方法、在材料合成時(shí)將化學(xué)物質(zhì)結(jié)合到其結(jié)構(gòu)中的方法(如結(jié)合到生理可降解的物質(zhì)上)，及用吸收性材料吸收水或油溶液，再將其干燥/或不用將其干燥。
用于陰道沖洗的灌洗劑或溶液可通過(guò)將活性成份及藥物適宜液體溶媒混合制得。如本領(lǐng)域所熟知的，灌洗劑可用在適合于目標(biāo)個(gè)體陰道結(jié)構(gòu)的的傳送設(shè)備給藥并可包裝其中。灌洗劑可進(jìn)一步包含多種附加劑，包括(但不限于)抗氧化劑、抗生素、抗真菌劑及防腐劑。
如本文所用，藥物組合物的“腸胃外給藥”包括任何以目標(biāo)個(gè)體組織的物理刺口為特點(diǎn)，并將藥物組合物經(jīng)由該刺口給藥的給藥途徑。因此，腸胃外給藥包括(但不限于)通過(guò)注射該組合物給藥、通過(guò)手術(shù)切口給藥、通過(guò)組織穿透非手術(shù)傷口給藥等。具體來(lái)說(shuō)，腸胃外給藥預(yù)期包括(但不限于)皮下、腹腔內(nèi)、肌內(nèi)、胸內(nèi)注射，及腎透析輸液術(shù)。
適于腸胃外給藥的藥物組合物制劑包括與藥物適宜性溶媒(如無(wú)菌水或無(wú)菌等滲生理鹽水)結(jié)合的活性成份。這些制劑可以適合快速注射給藥或持續(xù)給藥的形式制備、包裝或銷(xiāo)售?？勺⑸渲苿┛梢砸詥挝粍┝康男问街苽?、包裝或銷(xiāo)售，如裝于安瓶或含防腐劑的多劑量容器中。腸胃外給藥制劑包括(但不限于)懸浮液、溶液、油或水載體的乳劑、糊劑及可植入的緩釋劑或可生物降解的制劑。這些制劑可進(jìn)一步包含一種或多種附加成份，包括(但不限于)用于懸浮、穩(wěn)定或分散的物質(zhì)。在一種腸胃外給藥制劑的實(shí)施方案中，所提供活性成份為干燥形式(即粉末或顆粒)，腸胃外給藥之前可在合適的媒介中重構(gòu)(如無(wú)菌無(wú)熱源水)。
藥物組合物可以以無(wú)菌注射水/油懸浮液/溶液的形式制備、包裝或銷(xiāo)售。該懸浮液或溶液可根據(jù)已知技術(shù)制備，除活性成份外還可包含附加成份，如本文所述分散劑、濕潤(rùn)劑或懸浮劑。這些無(wú)菌注射制劑可用非毒性、腸胃外適宜的稀釋劑或溶劑制得，如水或1，3-丁烷二醇。其他適宜的稀釋劑和溶劑包括(但不限于)林格溶劑、等滲氯化鈉溶劑、和脂肪油，如合成的單甘油酯或甘油二酯。其他可用的腸胃外給藥制劑包括那些含微晶形活性成份的脂質(zhì)體制劑或作為生物可降解聚合物系統(tǒng)的成份。用于緩釋或植入的組合物可包含藥物適宜多聚或疏水物質(zhì)，如乳劑、離子交換樹(shù)脂、微溶聚合物或微溶鹽。
適于局部給藥的制劑包括(但不限于)液體或半液體制劑，如搽劑、洗液、油包水或水包油乳劑(如乳脂、軟膏或糊劑)、溶液或懸浮液。局部給藥制劑可例如包含約1％到10％(w/w)的活性成份，盡管活性成份的濃度可能高達(dá)活性物質(zhì)在溶媒中的溶解極限。局部給藥制劑可進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)本文所述的附加成份。
本發(fā)明的藥物組合物可以適于經(jīng)由口腔的肺部給藥制劑中制備、包裝或銷(xiāo)售。此制劑可包括含活性成份的干燥顆粒，其直徑范圍在約0.5到約7納米且優(yōu)選在約1到6納米間。這些組合物便于使用含干粉儲(chǔ)器的設(shè)備以干粉的形式給藥，其中推進(jìn)流可直接分散這些粉末，或是使用自推溶劑/粉末分散器，例如，其中活性成份溶解或懸浮于低沸點(diǎn)推進(jìn)劑并密封于容器中的設(shè)備。這些粉末優(yōu)選包含這樣的顆粒至少98％重量的顆粒直徑大于0.5納米且至少95％數(shù)量的顆粒直徑小于7納米。更優(yōu)選，至少95％重量的顆粒直徑大于1納米且至少90％數(shù)量的顆粒直徑小于6納米。干粉組合物優(yōu)選包括固體細(xì)粉稀釋劑(如糖)，且方便地以單位計(jì)量的形式提供。
低沸點(diǎn)推進(jìn)劑通常包括在大氣壓下沸點(diǎn)低于65F的液體推進(jìn)劑。一般來(lái)說(shuō)，推進(jìn)劑可占組合物的50到99.9％(w/w)，且活性成分可占組分的0.1到20％(w/w)。推進(jìn)劑可進(jìn)一步包含附加成份，如液態(tài)非離子或固體陰離子型表面活性劑或固體稀釋劑(優(yōu)選與所含活性成份相同大小的粒子)。
本發(fā)明中配制的用于肺部輸送的藥物組合物也可以溶液或懸浮液小滴的形式提供活性成份。這些制劑可以含活性物質(zhì)的水或稀釋的醇溶液或懸浮液的形式制備、包裝或銷(xiāo)售、可選消毒且可方便地通過(guò)用噴霧或霧化設(shè)備給藥。這些制劑可進(jìn)一步包括一種或多種附加劑，包括(但不限于)調(diào)味劑，如糖精鈉、揮發(fā)油、緩沖劑、表面活性劑或防腐劑，如甲基羥基苯甲酸脂。此給藥途徑提供的小滴優(yōu)選平均直徑在約0.1到200納米間。
本文所述用于肺部遞送的制劑也可用于本發(fā)明藥物組合物的鼻部遞送。
另一適于鼻部給藥的制劑為粗粉末，含活性成份且平均顆粒直徑約在0.2到500微米之間。此制劑通過(guò)吸入給藥，即從貼近鼻孔的盛藥容器經(jīng)鼻腔快速吸入。
適于經(jīng)鼻給藥的制劑可含少至0.1％(w/w)，且多至100％(w/w)的活性成份，且可進(jìn)一步含一種或多種此處描述的附加成份。
本發(fā)明藥物組合物可以適于頰部給藥的制劑形式制備、包裝或出售。此制劑可為用傳統(tǒng)方法制成的片劑或錠劑，還可含例如0.1到20％(w/w)的活性成份，其平衡含有口腔溶解或降解組分及可選的含一或多種本文所述附加成份?；蛘?，適于頰部給藥的制劑可包括含活性成份的粉末/霧化/原子化的溶液或懸浮液。當(dāng)分散時(shí)，此粉末或氣霧制劑粒子或小滴大小最好在約0.1到200納米之間，且該制劑可進(jìn)一步包括一種或多種本文所述附加成份。
本發(fā)明的藥物組合物可以適于眼部給藥的制劑制備、包裝或銷(xiāo)售。此制劑可為眼藥水，包括如在水或油液體溶媒中含0.1-1.0％(w/w)活性成份的溶液或懸浮液。此藥滴可進(jìn)一步包括緩沖液、鹽或一或多種本文所述附加劑。其他有用的眼部用藥制劑包括那些含活性成份的微晶形或脂質(zhì)體制劑。
本文所用，“附加劑”包括(但不限于)一種或多種如下物質(zhì)賦形劑；表面活性劑；分散劑；惰性稀釋劑；?；氨澜鈩?；粘合劑；潤(rùn)滑劑；甜味劑；調(diào)味劑；著色劑；防腐劑；如明膠之類(lèi)的生理可降解組分；水載體及溶劑；油載體及溶劑；懸浮劑；分散或濕潤(rùn)劑；乳化劑；粘滑劑；緩沖劑；鹽；增稠劑；填料；乳化劑；抗氧化劑；抗生素；抗真菌劑；穩(wěn)定劑；及藥物適宜聚合或疏水材料。其他包含于本發(fā)明藥物組合物中的“附加劑”為本領(lǐng)域所熟知的，如Genaro等所述(1985，Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCo.，Easton，PA)，此處引用作為參考。
一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明用于對(duì)動(dòng)物(優(yōu)選人)給藥的化合物劑量隨眾多因素變動(dòng)，包括(但不限于)動(dòng)物類(lèi)型及待治疾病狀態(tài)類(lèi)型、動(dòng)物年齡及給藥途徑。
可給動(dòng)物施用化合物頻繁至每天數(shù)次，或以較少的頻率給藥，如一天一次、一周一次、兩周一次、一月一次或甚至更低的頻率，如數(shù)月一次或甚至一年一次或更少。技術(shù)人員應(yīng)易掌握劑量頻率，且給藥頻率取決于多種因素，如(但不限于)待治疾病類(lèi)型及嚴(yán)重程度、動(dòng)物類(lèi)型及年齡等。優(yōu)選，化合物以(但不必須)快速注射給藥，這可提供注射后至少一天的持久效用?？梢愿鼓?nèi)進(jìn)行快速注射。
技術(shù)人員應(yīng)理解通過(guò)阻止T細(xì)胞應(yīng)答的建立，本發(fā)明還提供了一種抑制二級(jí)應(yīng)答的方法，因?yàn)橥ㄟ^(guò)取消和減弱起始應(yīng)答，可抑制二級(jí)應(yīng)答產(chǎn)物。
同樣，技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明包括治療細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的方法，其中該細(xì)胞需經(jīng)由其表面血清素受體的血清素信號(hào)傳遞。因?yàn)?，如本發(fā)明他處所詳細(xì)闡述的，某些細(xì)胞需血清素信號(hào)，因此抑制信號(hào)會(huì)抑制其他情況下該細(xì)胞介導(dǎo)的特定過(guò)程。當(dāng)細(xì)胞需接受血清素信號(hào)來(lái)參與或介導(dǎo)疾病、障礙或狀況時(shí)，抑制信號(hào)會(huì)抑制細(xì)胞參與這些疾病、障礙或狀況。這些狀況、障礙和疾病在本發(fā)明其他部分詳細(xì)敘述。
基本上，一旦用本領(lǐng)域熟知方法(和/或這些方法在本發(fā)明其他部分描述和/或例證)確定疾病、障礙或狀況是由需血清素信號(hào)的細(xì)胞所介導(dǎo)的，且信號(hào)需經(jīng)1B、2、4或6型血清素受體傳遞，則可用多種方法抑制這些信號(hào)，且從而治療和/或緩解該疾病、障礙或狀況。一旦抑制了所需的血清素信號(hào)，則細(xì)胞不會(huì)再介導(dǎo)該疾病、障礙或狀況，從而治療并/緩解該疾病、障礙或狀況。可根據(jù)本發(fā)明所述方法治療的疾病包括(但不限于)重癥肌無(wú)力、特發(fā)性炎癥肌病、慢性嗜中性白血球減少癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、自身免疫性溶血綜合癥、抗磷脂抗體綜合癥、炎性腸病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、心肌炎、Gillian-Barre綜合癥、血管炎、多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)脊髓炎(Devic綜合癥)、淋巴細(xì)胞性垂體炎、格雷夫斯病、愛(ài)迪生病、甲狀旁腺功能減退癥、一型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、尋常性天皰瘡、大皰性類(lèi)天皰瘡、牛皮癬、銀屑病關(guān)節(jié)炎、子宮內(nèi)膜異位、自身免疫性睪丸炎、自身免疫性勃起障礙、結(jié)節(jié)病、韋格納肉芽腫病、自身免疫性耳聾、斯耶格倫病、自身免疫性色素層視網(wǎng)膜炎、間質(zhì)性膀胱、肺出血腎炎綜合癥及纖維肌痛。
因此，本發(fā)明包括治療或預(yù)防自身免疫疾病及異源移植排斥反應(yīng)的方法，這些疾病是由針對(duì)自身抗原和/或呈現(xiàn)于移植的細(xì)胞或組織上的非自身抗原的異?；蛟黾拥拿庖邞?yīng)答所介導(dǎo)的。進(jìn)一步，通過(guò)阻止起始免疫應(yīng)答，例如抑制介導(dǎo)應(yīng)答的細(xì)胞中的血清素信號(hào)傳遞，本發(fā)明也消除了可能發(fā)生的二級(jí)應(yīng)答。
因此，一旦結(jié)合本文提供的知識(shí)，技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明包括含抑制劑的快速注射給藥，該抑制劑可抑制血清素與血清素受體的相互作用。優(yōu)選，受體為5HT1B受體且抑制劑為氟奮乃靜。不希望受任何理論的限制，快速注射給藥可介導(dǎo)特定細(xì)胞凋亡，如活化的T細(xì)胞或癌性B細(xì)胞(如多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞)，因此不必重復(fù)給藥抑制劑，因?yàn)榭焖僮⑸浣閷?dǎo)細(xì)胞的死亡記憶或其他，否則此處的細(xì)胞會(huì)介導(dǎo)免疫應(yīng)答，而該應(yīng)答可引起移植細(xì)胞或組織排斥反應(yīng)。氟奮乃靜在5HTR1B受體上的局部濃度可介導(dǎo)該效用，此濃度足以抑制血清素信號(hào)傳遞，從而介導(dǎo)細(xì)胞死亡和/或抑制該細(xì)胞引起的免疫應(yīng)答。
此外，本發(fā)明包括治療其中已建立二級(jí)免疫應(yīng)答的疾病。這是因?yàn)榧幢悴皇侨?，大部分自身免疫疾病為慢性狀況。盡管大多數(shù)自身免疫疾病的病因還不清楚，但已了解CD4+記憶輔助T細(xì)胞和/或CD8+記憶細(xì)胞毒性T細(xì)胞參與其中。這些二級(jí)T細(xì)胞有不同的細(xì)胞標(biāo)記且以與初級(jí)T細(xì)胞不同的方式發(fā)揮作用(綜述參見(jiàn)，Dutton等，1998，Ann.Rev.Immunol.16201-223)。因此，本發(fā)明包括抑制哺乳動(dòng)物免疫細(xì)胞活化的方法，其中活化是由細(xì)胞上2型血清素受體所介導(dǎo)。本方法包括施用有效量的抑制劑，該抑制劑可抑制血清素與2型血清素受體的相互作用。這是因?yàn)?，如說(shuō)明書(shū)所論證的，抑制免疫細(xì)胞(如T細(xì)胞)上血清素與2型血清素受體的相互作用可阻止免疫細(xì)胞活化，從而抑制該細(xì)胞引起的免疫應(yīng)答。
可用本發(fā)明方法治療的自身免疫疾病包括(但不限于)重癥肌無(wú)力、特發(fā)性炎癥肌病、慢性嗜中性白血球減少癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、自身免疫性溶血綜合癥、抗磷脂抗體綜合癥、炎性腸病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、心肌炎、Gillian-Barre綜合癥、血管炎、多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)脊髓炎(Devic綜合癥)、淋巴細(xì)胞性垂體炎、格雷夫斯病、愛(ài)迪生病、甲狀旁腺功能減退癥、一型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、尋常性天皰瘡、大皰性類(lèi)天皰瘡、牛皮癬、銀屑病關(guān)節(jié)炎、子宮內(nèi)膜異位、自身免疫性睪丸炎、自身免疫性勃起障礙、結(jié)節(jié)病、韋格納肉芽腫病、自身免疫性耳聾、斯耶格倫病、自身免疫性色素層視網(wǎng)膜炎、間質(zhì)性膀胱、肺出血腎炎綜合癥及纖維肌痛。
本發(fā)明進(jìn)一步包括抑制哺乳動(dòng)物二級(jí)免疫應(yīng)答的方法。該方法包括施用有效量的抑制劑，該抑制劑可抑制血清素與2型血清素受體的相互作用。因?yàn)槿绫景l(fā)明其他部分所述，當(dāng)用2型血清素受體拮抗劑及其他抑制血清素與2型血清素受體的相互作用時(shí)，可抑制初級(jí)及二級(jí)免疫應(yīng)答。即，本發(fā)明首次論證了抑制免疫細(xì)胞上血清素與2型血清素受體的相互作用可阻止或抑制免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明為治療多種自身免疫疾病及異源抑制排斥反應(yīng)提供了新的特異性免疫調(diào)節(jié)療法，這些疾病和反應(yīng)都是由血清素與2型血清素受體相互作用引起的T細(xì)胞活化所介導(dǎo)的。
基于本文公開(kāi)的數(shù)據(jù)，技術(shù)人員應(yīng)理解本發(fā)明包括治療突發(fā)性艾滋病患者的方法。因?yàn)?，在此疾病的最終階段病人的CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)很低，而且病人通常死于偶發(fā)性感染。如果檢測(cè)遺留的CD4細(xì)胞，人們可發(fā)現(xiàn)很異常的事件，也即，大約50％的遺留CD4細(xì)胞有活性。這是因?yàn)槿嗣庖呷毕莶《?HIV)需要T細(xì)胞的活性增殖來(lái)進(jìn)行其自身復(fù)制。基于本文公開(kāi)數(shù)據(jù)且不希望受任何理論的限制，即使在AIDS末期的增值可能也需要由2型血清素受體介導(dǎo)的血清素信號(hào)。因?yàn)槿缂?xì)胞計(jì)數(shù)及本文其他公開(kāi)數(shù)據(jù)所證實(shí)的，阻斷2C型5HT信號(hào)顯然會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，所以如馬來(lái)酸二甲麥角新堿之類(lèi)的快速注射可給末期病人施用。因此通過(guò)誘導(dǎo)活化CD4細(xì)胞凋亡，可有效的消除病毒庫(kù)，因此病人也許可再生非感染的CD4細(xì)胞，進(jìn)而康復(fù)。
B.鑒別有用化合物的方法本發(fā)明包括鑒別可抑制血清素與其家族受體相互作用的化合物的方法?；诒疚乃_(kāi)數(shù)據(jù)，技術(shù)人員應(yīng)理解可通過(guò)評(píng)估T細(xì)胞活化及其他方法來(lái)檢測(cè)血清素與其家族受體的相互作用，可通過(guò)比較接觸化合物的細(xì)胞與其他方面相同只是不接觸該化合物的細(xì)胞中相同的參數(shù)來(lái)測(cè)定T細(xì)胞活化。技術(shù)人員應(yīng)理解此種化合物可用于抑制由血清素與血清素受體相互作用所介導(dǎo)和/或與其相關(guān)的疾病、障礙或狀況。基于本文所公開(kāi)內(nèi)容技術(shù)人員應(yīng)進(jìn)一步理解，其用于在減低血清素與其特異性亞型受體相互作用的同時(shí)不影響血清素與其他類(lèi)型血清素受體的作用。
基于本文所公開(kāi)內(nèi)容技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明包括鑒別可用于治療哺乳動(dòng)物自身免疫疾病或異源移植反應(yīng)的化合物的方法。方法包括鑒別抑制血清素與1B、2A、2B、2C、4及6型血清素受體相互作用的物質(zhì)或化合物。因?yàn)?，如本文其他地方所述，已發(fā)現(xiàn)抑制血清素與1B、2A、2B、2C、4及6型血清素受體的相互作用可抑制免疫細(xì)胞活化，從而抑制免疫應(yīng)答。因此，根據(jù)本發(fā)明所授知識(shí)技術(shù)人員應(yīng)理解，抑制此種相互作用的化合物是治療由血清素/受體相互作用介導(dǎo)的自身免疫疾病或異源移植反應(yīng)的潛在療法。
本方法包括將待測(cè)化合物與1B、2A、2B、2C、4及6型血清素受體接觸，并將血清素與1B、2A、2B、2C、4及6型血清素受體的結(jié)合水平與除不與此化合物接觸其他方面全一樣的1B、2A、2B、2C、4及6型血清素受體與血清素的結(jié)合水平相比較。技術(shù)人員應(yīng)理解，如接觸化合物的血清素受體與血清素的結(jié)合水平與其他方面全一樣只是不與此化合物接觸的1B、2A、2B、2C、4及6型血清素受體與血清素的結(jié)合水平相比結(jié)合水平降低，則表明該化合物抑制血清素/受體的相互作用，并因而可用于治療哺乳動(dòng)物中的自身免疫疾病或異源移植反應(yīng)?；诒疚乃_(kāi)內(nèi)容，技術(shù)人員也應(yīng)理解，本領(lǐng)域所熟知的標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測(cè)定法或?qū)?lái)出現(xiàn)的方法都可用于測(cè)定在缺少或存在待測(cè)化合物的情況下血清素與1B、2A、2B、2C、4及6型血清素受體的結(jié)合水平，進(jìn)而鑒別出有用的化合物。因此，本發(fā)明包括任何用此方法鑒定出的化合物。
本發(fā)明還包括鑒定可抑制血清素信號(hào)傳遞的化合物，如本文前面其他部分所述，其中也需考慮該化合物相對(duì)于血腦屏障的滲透性。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明包括將用本發(fā)明方法鑒別出的任何化合物進(jìn)行對(duì)血腦屏障滲透性的測(cè)定。測(cè)定化合物通過(guò)血腦屏障能力的方法或是本文所公開(kāi)的，或是本領(lǐng)域所熟知的，還包括將來(lái)出現(xiàn)的方法。因此，本發(fā)明包括測(cè)定目標(biāo)化合物穿透血腦屏障的能力，且選擇實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障的化合物。如本文前面其他部分更詳細(xì)說(shuō)明的，該化合物是有用的，因?yàn)橛袝r(shí)期望化合物可抑制非神經(jīng)細(xì)胞的血清素信號(hào)傳遞，而在可檢測(cè)水平內(nèi)不會(huì)影響神經(jīng)細(xì)胞中的血清素信號(hào)傳遞。既然血腦屏障阻止了進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞的通路，不可穿透血腦屏障的抑制劑可用于抑制目標(biāo)細(xì)胞中的血清素信號(hào)傳遞，而不會(huì)影響(至少部分不被影響)神經(jīng)細(xì)胞中的血清素信號(hào)傳遞。
此外，本發(fā)明包括改性用本文其他部分所述方法鑒別出的有用化合物，從而減低該化合物穿透血腦屏障的能力。再次，這是有用的，因?yàn)閷?shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障的化合物可用于抑制，如免疫細(xì)胞中的血清素信號(hào)傳遞，而不會(huì)影響神經(jīng)細(xì)胞中的血清素信號(hào)傳遞，因其被血腦屏障所保護(hù)。一旦結(jié)合本文公開(kāi)的知識(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，改造化合物影響其血腦屏障滲透性的方法是本領(lǐng)域所熟知的或是本文所例證的、也包括將來(lái)發(fā)展起來(lái)的方法。
本發(fā)明也包括鑒別用于抑制T細(xì)胞活化的化合物的方法，其中該活化是由血清素與1B、2A、2B、2C、4及6型血清素受體結(jié)合所介導(dǎo)的。具體來(lái)說(shuō)，該方法包括評(píng)估接觸待側(cè)化合物的T細(xì)胞的活化水平，并將此活化水平與除不接觸該化合物外其他部分都一樣的T細(xì)胞的水平相比較。與除不接觸該化合物外其他部分都一樣的T細(xì)胞的活化水平相比，如果接觸該化合物的T細(xì)胞活化水平較低則表明該化合物可用于抑制T細(xì)胞活化。因?yàn)楸景l(fā)明首次公開(kāi)了T細(xì)胞活化需要血清素與T細(xì)胞表面1B、2A、2B、2C、4及6型血清素受體的相互作用，因此當(dāng)血清素/受體相互作用被抑制時(shí)，活化被抑制，進(jìn)而可抑制該細(xì)胞引起的免疫應(yīng)答。很清楚，如本文其他部分所說(shuō)明的，抑制血清素與T細(xì)胞表面1B、2A、2B、2C、4及6型血清素受體相互作用的化合物是用于治療自身免疫疾病及異源移植排斥反應(yīng)的潛在治療化合物。
再次，本發(fā)明包括進(jìn)一步評(píng)估化合物穿透血腦屏障能力的方法，因此可鑒別和/或生產(chǎn)具備期望的抑制效應(yīng)且實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障的化合物。
拮抗血清素家族受體的化合物(即阻斷受體結(jié)合的化合物)中，SB 206553可作為一個(gè)例子，其結(jié)構(gòu)示于Forbes等，1993，J.Med.Chem.361104-1107。如本文數(shù)據(jù)所示，將此拮抗劑施用于表達(dá)受體的淋巴細(xì)胞可有效地抑制免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解如SB 206553之類(lèi)的拮抗劑可通過(guò)阻斷血清素家族受體結(jié)合來(lái)幫助調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，從而治療自身免疫疾病或其他增強(qiáng)的免疫應(yīng)答對(duì)患者有害的疾病 也可理解通過(guò)對(duì)可變位置(R)所指明的位置的修飾可改變或提高該化合物的特性，如Forbes等在1996，J.Med.Chem.394966-4977所述，表示如下 此結(jié)構(gòu)的另一實(shí)施方案中，F(xiàn)orbes等描述了一含醚的衍生物(1996，J.Med.Chem.394966-4977)，它有更好的效用但缺少有效的口服活性。該衍生物的結(jié)構(gòu)描述如下 此外，本發(fā)明包括氟奮氖靜的新衍生物，如QSS-1、QSS-3、QSS-5、QSS-6和QSS-12及其他，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖39、42和44，及其他。
此外，基于本文公開(kāi)的數(shù)據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，如以下例證所示缺少內(nèi)源血清素受體表達(dá)的細(xì)胞可用含分離的核酸的載體轉(zhuǎn)染(此分離的核酸編碼該受體)，進(jìn)而在細(xì)胞中實(shí)施該受體的表達(dá)。再用待測(cè)化合物接觸該轉(zhuǎn)染細(xì)胞，進(jìn)而鑒定該化合物是否影響與血清素受體的相互作用。因此，結(jié)合本發(fā)明本領(lǐng)域技術(shù)人員可用受體表達(dá)載體選擇性轉(zhuǎn)染在檢測(cè)水平缺少該受體的細(xì)胞，從而鑒定出選擇性影響血清素/受體結(jié)合的化合物。
此外，本發(fā)明包括對(duì)經(jīng)由血清素受體抑制信號(hào)傳遞的化合物的測(cè)定法，此處該測(cè)定基于檢測(cè)細(xì)胞的物理和/或形態(tài)變化。也即，基于本文所公開(kāi)內(nèi)容技術(shù)人員應(yīng)理解，抑制血清素信號(hào)傳遞會(huì)介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生可檢測(cè)的改變或與之相關(guān)。具體來(lái)說(shuō)，如本文其他部分公開(kāi)數(shù)據(jù)所證明，抑制細(xì)胞中血清素信號(hào)可使細(xì)胞大小和/或形態(tài)增加，且可檢測(cè)到與細(xì)胞凋亡、死亡和/或壞死相關(guān)的細(xì)胞特性。這些變化可用多種技術(shù)檢測(cè)及定量，包括(但不限于)顯微鏡方法(電鏡、光鏡等)、任何測(cè)定密度、形態(tài)之類(lèi)的技術(shù)。本發(fā)明包括所有這些方法及將來(lái)發(fā)展的方法。
本文公開(kāi)方法可快速篩選物質(zhì)以測(cè)定其抑制細(xì)胞中血清素信號(hào)傳遞的能力，在抑制血清素能信號(hào)傳遞可利于治療的方法中，這些化合物是重要的潛在治療物，包括(但不限于)開(kāi)發(fā)用于治療抑郁、嘔吐之類(lèi)的化合物及用于治療不與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病、障礙或狀況，如(但不限于)自身免疫疾病、多發(fā)性骨髓瘤、阻塞性氣道病(如哮喘)、異源移植排斥反應(yīng)等的化合物，如本文其他部分所詳細(xì)論述的。
C.治療或緩解哺乳動(dòng)物中由T細(xì)胞上異常2型血清素受體引起的疾病障礙或狀況的方法。
本發(fā)明包括緩解由血清素家族受體異常，即失常表達(dá)，引起的疾病障礙或狀況的方法。當(dāng)疾病、障礙或狀況與血清素過(guò)量/不足的表達(dá)相關(guān)時(shí)，本方法包括讓患者施用與編碼相應(yīng)受體的核苷酸互補(bǔ)的反義核酸，這些患者患有由受體表達(dá)增高而引起的疾病、障礙或狀況，即與其他方面相同的正常組織(也即檢測(cè)不出任何與待治或待緩解的疾病、障礙或癥狀相關(guān)的病理參數(shù)的組織)相比受體表達(dá)量增高。這樣可減低受體表達(dá)量，從而緩解了由受體高表達(dá)引起的疾病、障礙或狀況。這些疾病、障礙或狀況包括(但不限于)重癥肌無(wú)力、特發(fā)性炎癥肌病、慢性嗜中性白血球減少癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、自身免疫性溶血綜合癥、抗磷脂抗體綜合癥、炎性腸病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、心肌炎、Gillian-Barre綜合癥、血管炎、多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)脊髓炎(Devic綜合癥)、淋巴細(xì)胞性垂體炎、格雷夫斯病、愛(ài)迪生病、甲狀旁腺功能減退癥、一型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、尋常性天皰瘡、大皰性類(lèi)天皰瘡、牛皮癬、銀屑病關(guān)節(jié)炎、子宮內(nèi)膜異位、自身免疫性睪丸炎、自身免疫性勃起障礙、結(jié)節(jié)病、韋格納肉芽腫病、自身免疫性耳聾、斯耶格倫病、自身免疫性色素層視網(wǎng)膜炎、間質(zhì)性膀胱、肺出血腎炎綜合癥及纖維肌痛。
基于本文公開(kāi)數(shù)據(jù)技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明包括治療與5HT受體過(guò)量/不足的表達(dá)相關(guān)或由其介導(dǎo)的疾病。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解這些療法包括(但不限于)治療表達(dá)(及其他)1A型5HT受體的患者。因?yàn)槭荏w刺激引起的cAMP信號(hào)減低與6型5HT受體的上調(diào)信號(hào)相競(jìng)爭(zhēng)。因此，可用減低細(xì)胞中6型5HT受體表達(dá)治療疾病，用6型5HT受體的反義物及其他物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)2個(gè)受體信號(hào)間的平衡，進(jìn)而治療患者的疾病。
此外，基于本文所公開(kāi)內(nèi)容本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明包括治療由血清素家族受體增加或減少所介導(dǎo)的疾病。因?yàn)楸疚墓_(kāi)的數(shù)據(jù)證明某些特定疾病、障礙或狀況與血清素受體表達(dá)水平的增高或降低相關(guān)或由其介導(dǎo)。本文公開(kāi)數(shù)據(jù)證明用5-HT2B/2C特異性拮抗劑拮抗血清素家族受體的表達(dá)可抑制免疫應(yīng)答，因而淋巴細(xì)胞不會(huì)進(jìn)一步增值。該抑制可用于治療自身免疫疾病及其他與過(guò)量免疫應(yīng)答相關(guān)的疾病。因此，減低受體表達(dá)或阻斷受體結(jié)合可治療與增高的受體水平相關(guān)或由其介導(dǎo)的疾病。從而鑒別可減低血清素家族受體表達(dá)水平的化合物有助于治療和/或緩解與增加的受體表達(dá)相關(guān)的疾病、障礙或狀況。
因此抑制血清素家族受體表達(dá)的反義核酸也可用于制備治療特定疾病、障礙或狀況的藥物，當(dāng)與不感染該疾病、障礙或狀況的細(xì)胞或病人中的受體表達(dá)量相比時(shí)其受體表達(dá)量增高并由此引起該疾病、障礙或狀況。
抑制細(xì)胞中核酸表達(dá)的技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的，包括本文公開(kāi)的方法(如用抗體、反義核酸、核酶等抑制)。其他用于抑制編碼血清素家族受體核酸表達(dá)的方法包括(但不限于)使用靶向受體啟動(dòng)子特異序列的核苷酸試劑等。
基于本文所公開(kāi)內(nèi)容技術(shù)人員應(yīng)理解，使用阻止細(xì)胞中編碼受體的核酸表達(dá)的核酸來(lái)抑制或消除T細(xì)胞上2型血清素受體的核酸表達(dá)。如本文其他部分詳細(xì)說(shuō)明，已知血清素受體的核酸及氨基酸序列時(shí)，可用本領(lǐng)域所熟知的多種方法抑制細(xì)胞表面上的受體表達(dá)。這些方法包括(但不限于)抗體、核酶及反義分子。一旦技術(shù)人員獲知編碼受體的治療靶位點(diǎn)的核酸序列，就可很好的設(shè)計(jì)及使用這些化合物，因此本文不引用這些在本領(lǐng)域熟知的方法。例如，設(shè)計(jì)反義分子及核酶使之有效抑制2型血清素受體表達(dá)而不影響其他血清素家族受體表達(dá)可有效地抑制T細(xì)胞活化，其中不影響其他血清素家族受體是必要的，因?yàn)槿绱瞬趴杀苊庥捎诜翘禺愋缘囊种蒲逅嘏c其他可能必要的受體的相互作用而引起的有害效應(yīng)。
不論增高還是降低受體蛋白表達(dá)、多肽水平或其活性，基于本文公開(kāi)內(nèi)容本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，減低或誘導(dǎo)血清素表達(dá)的方法包括給藥或是表達(dá)受體或是缺少受體表達(dá)的細(xì)胞。
本發(fā)明另一實(shí)施方案中，可通過(guò)補(bǔ)充、增加、和/或用缺少受體表達(dá)的細(xì)胞替代缺陷細(xì)胞來(lái)治療患有與受體表達(dá)相關(guān)或由其介導(dǎo)的免疫疾病、障礙或狀況的個(gè)體。細(xì)胞可來(lái)自源于正常同源匹配供體的細(xì)胞或來(lái)自待治個(gè)體。細(xì)胞可用遺傳學(xué)手段改性使之抑制受體表達(dá)。
除用修復(fù)的細(xì)胞或源于匹配供體的正常細(xì)胞來(lái)替換缺陷細(xì)胞外，本發(fā)明方法還可用于增強(qiáng)目的蛋白的表達(dá)，該蛋白在動(dòng)物體分泌時(shí)有有益效用。也即，可分離細(xì)胞、將編碼血清素家族受體的基因?qū)爰?xì)胞、然后將其導(dǎo)入供體或同源匹配的受體。該受體的表達(dá)可起到治療效用。
本發(fā)明的這方面涉及基因治療，其中給個(gè)體施用治療量的血清素家族受體。
根據(jù)本發(fā)明一些方面，用編碼血清素家族受體的核酸、反義核酸或本發(fā)明的敲除靶載體轉(zhuǎn)染的重組細(xì)胞也可用作細(xì)胞治療劑以治療以血清素家族受體表達(dá)或缺乏其表達(dá)為特征的疾病、障礙或狀況。
根據(jù)本發(fā)明，將含本發(fā)明核苷酸序列的基因構(gòu)建物導(dǎo)入細(xì)胞。也即，本文稱(chēng)為“重組細(xì)胞”的細(xì)胞通過(guò)遺傳改變以引入了編碼血清素家族受體的核酸或抑制此種受體在重組細(xì)胞中表達(dá)的核酸，從而使施用重組細(xì)胞的受體發(fā)生有益的效用。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，源于相同待治個(gè)體或另一個(gè)體的細(xì)胞，或是源于非人動(dòng)物的細(xì)胞可通過(guò)遺傳改變替代缺陷基因和/或引入其表達(dá)對(duì)個(gè)體有益或抑制受體表達(dá)進(jìn)而對(duì)個(gè)體有益的基因。
在本發(fā)明某些方面，可通過(guò)提供含正常有效的編碼血清素受體的核酸復(fù)本的基因構(gòu)建體而補(bǔ)充、提高和/或替代編碼血清素家族受體的缺陷或不足的核酸來(lái)治療患有疾病、障礙或狀況的個(gè)體。
在將編碼血清素家族受體的基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中的所有案例中，核酸都連接到合適的啟動(dòng)子/調(diào)控序列上，后者是該核酸在重組細(xì)胞中表達(dá)所必須的。這種啟動(dòng)子/調(diào)控序列包括(但不限于)組成型及可誘導(dǎo)的和/或組織特異性及分化特異性的啟動(dòng)子，這在本文其他部分有所敘述。組成型啟動(dòng)子包括(但不限于)巨細(xì)胞病毒即早型啟動(dòng)子及勞氏肉瘤病毒啟動(dòng)子。此外，也可使用如那些調(diào)節(jié)持家基因表達(dá)的持家啟動(dòng)子。其他啟動(dòng)子包括優(yōu)選在中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)的啟動(dòng)子，如(但不限于)編碼神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸蛋白的基因的啟動(dòng)子。此外，可選擇啟動(dòng)子/調(diào)控元件從而誘導(dǎo)基因表達(dá)。如可使用四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Freundlich等，1997，Meth.Enzymol.283159-173)。
基因構(gòu)建物優(yōu)選可以表達(dá)載體提供，該載體包含本發(fā)明使用的有效地連接到特定啟動(dòng)子/調(diào)控序列上的血清素家族受體的編碼序列，從而當(dāng)載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞表達(dá)編碼序列。編碼序列有效地連接到細(xì)胞表達(dá)該序列所需的啟動(dòng)子/調(diào)控元件上。編碼蛋白的核酸序列可為cDNA、基因組DNA、合成DNA或其雜交物或是如mRNA之類(lèi)的RNA分子。
含有效連于啟動(dòng)子/調(diào)控元件的編碼受體的核酸序列的基因構(gòu)建物可以功能附加體分子的形式留在細(xì)胞中或是整合到該細(xì)胞的染色體DNA中。遺傳物質(zhì)可以質(zhì)粒的形式導(dǎo)入細(xì)胞并作為獨(dú)立的遺傳物質(zhì)留在細(xì)胞中。又或者，將可整合到宿主細(xì)胞染色體上的線(xiàn)性DNA導(dǎo)入細(xì)胞。當(dāng)將DNA導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，可加入促進(jìn)DNA整合到染色體上的試劑。在DNA分子中也可包含用于促進(jìn)整合的DNA序列。再或者，可將RNA導(dǎo)入細(xì)胞。
為了使表達(dá)載體上的遺傳物質(zhì)得以表達(dá)，啟動(dòng)子/調(diào)控元件必需連到編碼該蛋白的核酸序列上。為了使蛋白產(chǎn)物最大化，可選擇最適于使基因在目標(biāo)細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子/調(diào)控序列。此外，應(yīng)選擇在細(xì)胞中可最有效轉(zhuǎn)錄的密碼子。本領(lǐng)域技術(shù)人員可制得重組遺傳物質(zhì)，作為在目的細(xì)胞中有功能的表達(dá)載體。
重組遺傳物質(zhì)可導(dǎo)入細(xì)胞，該物質(zhì)可編碼平時(shí)在細(xì)胞中存在量不足和/或功能不足的蛋白從而糾正細(xì)胞的遺傳缺陷，和/或是該物質(zhì)編碼有助于治療或預(yù)防特殊相關(guān)疾病、障礙或狀況的蛋白，且抑制細(xì)胞血清素受體在細(xì)胞上表達(dá)(如敲除靶載體、反義核酸等)；除此之外，也可將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入本發(fā)明所用的重組細(xì)胞，以提供一種對(duì)該細(xì)胞期望的選擇性終結(jié)方法。這些用于靶向重組細(xì)胞進(jìn)行毀減的方法可引入重組細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明，可將使重組細(xì)胞對(duì)毀減特異性敏感的遺傳物質(zhì)裝配到重組細(xì)胞中。如可將編碼細(xì)胞毒素劑特異性靶向的受體的基因引入重組細(xì)胞?？蓪⒂糜谡T導(dǎo)選擇性細(xì)胞死亡的基因表達(dá)結(jié)構(gòu)引入重組細(xì)胞。在這樣的系統(tǒng)中，表達(dá)由該基因編碼蛋白的細(xì)胞在特殊條件下或在存在或缺少特殊試劑的情況下對(duì)靶向的致死方式敏感。如可將皰疹病毒胸腺嘧啶激酶基因(herpes tk)的表達(dá)結(jié)構(gòu)引入重組細(xì)胞，并用于誘導(dǎo)選擇性細(xì)胞死亡。當(dāng)含herpes tk基因的遺傳物質(zhì)導(dǎo)入個(gè)體中時(shí)，可產(chǎn)生herpes tk。如希望或必須殺死植入的重組細(xì)胞，可給個(gè)體施用藥物gangcyclovir，它可選擇性的殺死任何產(chǎn)生herpes tk的細(xì)胞。因此，可提供允許選擇性毀減植入的重組細(xì)胞的系統(tǒng)。
基于本文公開(kāi)內(nèi)容本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明包括在哺乳動(dòng)物中生產(chǎn)/提供血清素家族受體或抑制受體表達(dá)的重組細(xì)胞。也即，可用該細(xì)胞對(duì)動(dòng)物施用受體蛋白或是傳送分子(如敲除定向載體、反義核酸、核酶及特異性與受體結(jié)合的抗體等)。
本發(fā)明進(jìn)一步包括用表達(dá)目的受體的重組細(xì)胞作為篩選可用于治療相關(guān)免疫疾病的新血清素受體激動(dòng)劑、反向激動(dòng)劑及拮抗劑的靶物。因此，可用待側(cè)化合物接觸該細(xì)胞，而后將細(xì)胞活性與除不接觸該化合物外其他方面都相同的細(xì)胞活性相比較。接觸化合物的細(xì)胞活性比不接觸化合物的細(xì)胞活性偏高或偏低都說(shuō)明該化合物影響血清素受體介導(dǎo)的活化，并因而是可用于治療相關(guān)免疫疾病的潛在的血清素受體激動(dòng)劑、反向激動(dòng)劑和/或拮抗劑。
對(duì)動(dòng)物施用血清素家族受體可作為研究血清素或其他受體配基作用機(jī)制的模型系統(tǒng)，或是用于開(kāi)發(fā)模型系統(tǒng)以發(fā)展用于診斷和/或治療與受體表達(dá)相關(guān)的疾病、障礙或狀況。
進(jìn)一步，用表達(dá)血清素家族受體的重組細(xì)胞將血清素受體導(dǎo)入動(dòng)物可用于治療或緩解疾病、障礙或狀況，其中血清素受體水平的增高引發(fā)治療效應(yīng)。
或者，含核酸的重組細(xì)胞(該核酸的表達(dá)可抑制或減少血清素受體表達(dá)、活化和/或細(xì)胞分泌)可作為開(kāi)發(fā)用于與受體表達(dá)、活性和/或分泌相關(guān)或由其介導(dǎo)的疾病、障礙或狀況的診斷和/或治療劑的模型。本發(fā)明包括重組細(xì)胞可產(chǎn)生抑制受體表達(dá)的分子，從而可將這樣的分子導(dǎo)入動(dòng)物。或者，不希望受任何理論的限制，重組細(xì)胞自身也是功能細(xì)胞(只是不可表達(dá)受體)，可完成除不是重組細(xì)胞其他方面相同的細(xì)胞所能完成的功能，而不必不經(jīng)由血清素信號(hào)通路。
可用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的現(xiàn)有技術(shù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，細(xì)胞可來(lái)自動(dòng)物或商業(yè)可得或培養(yǎng)的已知細(xì)胞系或是體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞。因此，本發(fā)明不限于只從供體動(dòng)物或病患動(dòng)物自身獲得細(xì)胞。反之，本發(fā)明包括任何用本發(fā)明核酸改造的細(xì)胞，因此可使重組細(xì)胞或是表達(dá)或是不表達(dá)或低表達(dá)血清素受體。
可用標(biāo)準(zhǔn)方法將核酸導(dǎo)入細(xì)胞，用這些方法將基因構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞后，該細(xì)胞可表達(dá)基因編碼蛋白或表達(dá)抑制血清素受體表達(dá)的分子。在一些實(shí)施方案中，用磷酸鈣沉淀轉(zhuǎn)染、DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移、化學(xué)物質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、配基介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移或是重組病毒載體轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
當(dāng)對(duì)動(dòng)物施用本發(fā)明的分離的受體多肽、特異性與受體結(jié)合的抗體、受體的反義核酸、和/或重組細(xì)胞以提高或減少動(dòng)物中受體水平時(shí)，基于本文所公開(kāi)內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，用于對(duì)動(dòng)物給藥的多肽、核酸、抗體或細(xì)胞的量可通過(guò)測(cè)定受體表達(dá)水平或受體多肽水平或編碼存在于動(dòng)物組織中受體的核酸來(lái)滴定。
測(cè)定受體表達(dá)水平的方法(如，在蛋白質(zhì)印記或其他如ELISA之類(lèi)的免疫分析中使用抗受體的抗體)，和/或評(píng)估細(xì)胞和/或組織中受體表達(dá)水平的方法(如，RNA印記等)在本文中公開(kāi)或是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些分析方法可用于決定受體多肽、核酸、抗體、反義核酸、核酶、重組細(xì)胞等對(duì)動(dòng)物給藥以減少或增加受體表達(dá)水平的“有效量”。
D.抑制經(jīng)由血清素受體的信號(hào)傳遞的相關(guān)方法本發(fā)明包括通過(guò)抑制經(jīng)由血清素受體的血清素信號(hào)傳遞影響細(xì)胞周期過(guò)程的方法。也即，基于本文公開(kāi)內(nèi)容技術(shù)人員應(yīng)理解移除或抑制經(jīng)由5-HT受體傳遞的血清素信號(hào)可影響細(xì)胞周期過(guò)程。因?yàn)楸疚墓_(kāi)數(shù)據(jù)表明抑制血清素能信號(hào)對(duì)正進(jìn)行細(xì)胞周期的細(xì)胞有極大影響，如果消除信號(hào)會(huì)導(dǎo)致經(jīng)由凋亡的快速細(xì)胞死亡(也即，膜聯(lián)蛋白染色細(xì)胞說(shuō)明在表面有PI暴露、可檢測(cè)到DNA碎片、并且細(xì)胞大小增加、形態(tài)改變等)。因?yàn)橐郧暗难芯考杏诓话l(fā)生細(xì)胞周期的非分裂細(xì)胞，即神經(jīng)或肌肉細(xì)胞，以治療多種神經(jīng)疾病，所以本發(fā)明結(jié)果是驚人的。不希望受任何理論的限制，以前相關(guān)于多種血清素信號(hào)抑制劑使用的研究包括接觸不發(fā)生細(xì)胞周期的非分化細(xì)胞，如(但不限于)神經(jīng)元，因此實(shí)際上不會(huì)也不能觀察、識(shí)別或理解細(xì)胞周期中血清素信號(hào)的消減和/或抑制的作用效果。因此，本文公開(kāi)數(shù)據(jù)首次說(shuō)明經(jīng)由抑制血清素受體影響細(xì)胞周期的新方法。
本文公開(kāi)數(shù)據(jù)也首次說(shuō)明可生產(chǎn)和/或改性抑制血清素信號(hào)的化合物使之實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。這樣的化合物是有用的，因?yàn)橛欣氖堑难逅匾种苿┙o藥用以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答而不會(huì)影響被血腦屏障隔離的神經(jīng)細(xì)胞中的血清素信號(hào)。因此，本發(fā)明包括實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障的抑制劑實(shí)行本文其他部分公開(kāi)的所有方法的用途。
基于本文公開(kāi)內(nèi)容技術(shù)人員應(yīng)理解，特定細(xì)胞含有血清素受體，且經(jīng)由這些受體的信號(hào)對(duì)發(fā)生細(xì)胞周期的細(xì)胞是至關(guān)重要的。因此，本發(fā)明包括一種方法，該方法可通過(guò)抑制經(jīng)由受體的血清素能信號(hào)傳遞而影響細(xì)胞周期過(guò)程。技術(shù)人員進(jìn)一步理解，可用于抑制血清素能信號(hào)傳遞的化合物有很多，如(但不限于)本文其他部分所述拮抗劑。進(jìn)一步，本發(fā)明包括將來(lái)出現(xiàn)的可抑制經(jīng)由血清素受體的血清素能信號(hào)傳遞的化合物。
本方法包括鑒別目的細(xì)胞上血清素受體的存在(如果不知該細(xì)胞表達(dá)受體)，且可進(jìn)一步辨別該受體以評(píng)估用哪種(些)化合物抑制經(jīng)由該受體的信號(hào)。用于評(píng)估細(xì)胞上血清素受體存在與否的方法，及用于鑒定抑制經(jīng)由該受體信號(hào)的化合物的方法，不論是藥理學(xué)方法、重組體或其他方法，都是本領(lǐng)域所熟知的且在本文其他部分有例證說(shuō)明。本發(fā)明還包括將來(lái)出現(xiàn)的方法，這些方法可用于鑒定細(xì)胞上血清素受體存在與否及哪種(些)化合物影響經(jīng)由目的受體的信號(hào)傳遞。
本發(fā)明也包括影響細(xì)胞凋亡的方法。該方法包括抑制本應(yīng)經(jīng)由該細(xì)胞上血清素受體的信號(hào)傳遞。因?yàn)?，本文公開(kāi)數(shù)據(jù)說(shuō)明，抑制進(jìn)行細(xì)胞周期的細(xì)胞(如增殖或分裂)中血清素能信號(hào)，可介導(dǎo)該細(xì)胞凋亡。因此基于本文公開(kāi)內(nèi)容技術(shù)人員應(yīng)理解，抑制經(jīng)由5-HT受體的信號(hào)傳遞提供了一種誘導(dǎo)凋亡的新方法。
本發(fā)明方法是有用的，因?yàn)槭状问股L(zhǎng)細(xì)胞選擇性地凋亡而不會(huì)影響鄰近不分化或表面沒(méi)有或有不同血清素受體的細(xì)胞。也即，本發(fā)明方法不會(huì)影響不發(fā)生細(xì)胞周期過(guò)程的細(xì)胞或其表面不表達(dá)與靶細(xì)胞相同類(lèi)型血清素受體的細(xì)胞。因?yàn)橛?4種不同的血清素受體，基于對(duì)多種激活或拮抗經(jīng)由受體的信號(hào)的化合物的藥理特異性分為7種不同亞型，上述內(nèi)容尤其真實(shí)。因此，一旦鑒定及識(shí)別出目的細(xì)胞上的血清素受體，基于本文其他部分公開(kāi)的驚人數(shù)據(jù)技術(shù)人員應(yīng)理解，可通過(guò)選擇性抑制靶細(xì)胞中的血清素能信號(hào)傳遞誘發(fā)該細(xì)胞凋亡，而不影響其他細(xì)胞中的任何血清素能信號(hào)傳遞，此處其他細(xì)胞或沒(méi)有血清素能受體或有與靶細(xì)胞不同藥理亞型受體的細(xì)胞，因而用于誘導(dǎo)目的細(xì)胞凋亡的化合物不會(huì)影響經(jīng)由那種受體的信號(hào)傳遞。
此外，本發(fā)明包括選擇性抑制非神經(jīng)細(xì)胞中的血清素信號(hào)傳遞，而不影響被血腦屏障保護(hù)的神經(jīng)細(xì)胞中的血清素信號(hào)傳遞。也即，本發(fā)明包括使用實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障的抑制劑，從而將抑制劑的效應(yīng)限制于非神經(jīng)細(xì)胞。
基于本文公開(kāi)內(nèi)容技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法。因?yàn)椋绫疚钠渌糠炙?，本文首次證明細(xì)胞周期過(guò)程需要血清素信號(hào)，因而抑制該信號(hào)傳遞可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。具體來(lái)說(shuō)，已證明抑制需血清素信號(hào)的細(xì)胞上1B、2、4和/或6型血清素受體與血清素的結(jié)合可導(dǎo)致經(jīng)由傳統(tǒng)凋亡途徑的細(xì)胞死亡。
進(jìn)一步，基于本文公開(kāi)內(nèi)容技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明包括誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法。也即，本文公開(kāi)數(shù)據(jù)表明抑制表達(dá)1B、2、4或6型血清素受體的細(xì)胞中的血清素信號(hào)傳遞可導(dǎo)致該細(xì)胞死亡。因此，基于本文公開(kāi)內(nèi)容技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明包括由抑制血清素與(1B、2A、2B、2C、4或6型)血清素受體結(jié)合的誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法。
II.試劑盒本發(fā)明包括多種涉及抑制血清素與2型血清素受體相互作用的試劑盒，因?yàn)槿绫疚钠渌糠炙_(kāi)的，抑制此種相互作用會(huì)抑制免疫細(xì)胞活化，從而抑制免疫應(yīng)答。因此，一方面，本發(fā)明包括調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物中免疫應(yīng)答的試劑盒。該試劑盒包括有效量的抑制血清素與2型血清素受體相互作用的抑制劑。此種抑制劑包括，優(yōu)選2型血清素受體拮抗劑。且該試劑盒還包括用藥器及使用說(shuō)明材料。
此外，基于本文公開(kāi)內(nèi)容本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，抑制劑可為實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障的化合物。因?yàn)?，如本文其他部分所詳?xì)介紹的，化合物抑制非神經(jīng)細(xì)胞中的血清素信號(hào)傳遞而不影響受血腦屏障保護(hù)的神經(jīng)細(xì)胞中此類(lèi)信號(hào)傳遞是有利的。
基于本文公開(kāi)內(nèi)容技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明包括用于抑制2型受體介導(dǎo)的信號(hào)傳遞的試劑盒，它可與腺病毒載體的施用相結(jié)合，用于基于腺病毒載體的方法來(lái)對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行基因治療。因?yàn)?，盡管大多數(shù)運(yùn)載基因的有效載體為腺病毒載體，但機(jī)體對(duì)此載體仍有免疫應(yīng)答反應(yīng)，這限制了該載體在基因治療中的效用并導(dǎo)致表達(dá)喪失。因此，每個(gè)攜帶新載體(及其內(nèi)含物)的細(xì)胞都在數(shù)周內(nèi)被清除，致使技術(shù)失效。本文所公開(kāi)數(shù)據(jù)表明施用符合腺病毒相關(guān)免疫應(yīng)答的2型反向激動(dòng)劑/拮抗劑可有效地消除反應(yīng)性細(xì)胞，廢除針對(duì)載體的免疫應(yīng)答，從而使基因治療成為可能。
本發(fā)明包括多種試劑盒，它們包含如編碼血清素家族受體的核酸之類(lèi)、特異性結(jié)合這種受體的抗體及編碼該抗體的核酸、與編碼這種受體的核酸互補(bǔ)但與轉(zhuǎn)錄物是反義方向的核酸的化合物、和/或本發(fā)明的組合物、涂藥器及如何按本發(fā)明方法使用化合物的說(shuō)明材料。盡管在下文有試劑盒的例證描述，在本文公開(kāi)內(nèi)容的啟示下技術(shù)人員易于明白其他有用的試劑盒的成份。本發(fā)明包括上述每種試劑盒。
一方面，本發(fā)明包括用于緩解由血清素家族受體失常表達(dá)引起的疾病的試劑盒。依據(jù)本文公開(kāi)方法使用該試劑盒。簡(jiǎn)而述之，可用試劑盒將細(xì)胞與核酸接觸，該核酸與編碼血清素受體的核酸互補(bǔ)，其中該核酸是轉(zhuǎn)錄的反義方向，以減少受體表達(dá)；或者可用試劑盒將細(xì)胞與特異性結(jié)合受體的抗體接觸，或是與編碼抗體的核酸接觸，其中受體表達(dá)、量或活性的減少可導(dǎo)致有益的功效。此外，試劑盒包括涂藥器及介紹如何使用試劑盒的說(shuō)明材料。這些說(shuō)明簡(jiǎn)要的列舉了本文提供的例證。
試劑盒包括可藥用載體。如本文其他部分所述該組合物提供了適宜量的組分。此外，給藥途徑及給藥頻率與本文其他部分詳細(xì)說(shuō)明的相同。
本發(fā)明在此描述引用如下實(shí)施例。這些實(shí)施例只用于說(shuō)明，決不應(yīng)僅限于這些實(shí)施例來(lái)理解本發(fā)明，而應(yīng)理解為包括任何及所有明顯為本文所提供知識(shí)之結(jié)論的變化方式。
實(shí)施例例1血清素受體及免疫調(diào)節(jié)色氨酸為組成細(xì)胞新蛋白十種必須氨基酸之一。盡管不確定，色氨酸分解代謝可能導(dǎo)致饑餓，且從而解釋了所觀察到的T細(xì)胞抑制現(xiàn)象。然而，其他九種重要氨基酸不參與控制T細(xì)胞應(yīng)答。
眾所周知色氨酸有兩個(gè)代謝途徑。在一個(gè)途徑中，色氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)闊熕?。色氨酸最多只占?xì)胞所用煙酸的50％(大多數(shù)源自飲食供應(yīng)，因此其不為限速反應(yīng))。色氨酸另一個(gè)代謝命運(yùn)為轉(zhuǎn)變成5-羥色胺(5-HT)，也叫血清素(見(jiàn)圖1)。另一方面這是血清素的唯一已知來(lái)源。血清素一直是研究最廣泛的有爭(zhēng)議性的生物活性化合物。迄今為止，血清素在發(fā)動(dòng)免疫應(yīng)答方面的作用，如果有的話(huà)，還很不清楚。事實(shí)上，作為本科及研究生免疫學(xué)教學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)課本的5個(gè)主要大學(xué)水平教科書(shū)只在血小板章節(jié)提及血清素，及其在創(chuàng)傷位點(diǎn)誘導(dǎo)血管收縮的作用或是只提到它存在于嚙齒類(lèi)肥大細(xì)胞中(Sharon，1998，InBasic Immunology，Williams和Wilkins，Baltimore，MD；Kugy，1997，InImmunology，W.H.Freeman & Co；Abbas等，1997，InCellular and Molecular Immunology，W.B.Saunders；Janeway &Travers，InImmunobiology-the immune system in health anddisease，Garland Publishing，Inc.；Roitt等，1998，InImmunology，Mosby，London)。
胚胎發(fā)育觀念中，所有的淋巴細(xì)胞都衍生于神經(jīng)脊。不希望受任何理論的限制，最早的原始免疫防御可能基于“神經(jīng)沖動(dòng)”范例，因而受血清素控制。隨時(shí)間推逝，自然界增加了許多精細(xì)復(fù)雜的層面來(lái)調(diào)節(jié)這一基本通路。不希望受任何理論的限制，本文公開(kāi)數(shù)據(jù)表明色氨酸相關(guān)于IDO分解代謝的效應(yīng)事實(shí)上源于其在血清素通路中的效應(yīng)。近40年的醫(yī)學(xué)相關(guān)文獻(xiàn)表明盡管有零散的血清素可能影響某些T細(xì)胞活性的報(bào)告，直到本發(fā)明，沒(méi)有研究曾證明血清素受體活化是發(fā)動(dòng)T細(xì)胞應(yīng)答的基本性、限速性必要條件。
本文公開(kāi)數(shù)據(jù)表明5-HT在協(xié)調(diào)及絕對(duì)控制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答方面的基本功效。在本文公開(kāi)的研究中，用到了從粘附的細(xì)胞群純化的人原代外周血淋巴細(xì)胞及同樣從粘附細(xì)胞純化的鼠脾細(xì)胞。因此，獲得了半純化的(CD3-陽(yáng)性)T細(xì)胞群，而后可加入有絲分裂原，如植物血細(xì)胞凝集素(PHA)或刀豆素A(ConA)活化細(xì)胞。這些植物凝集素用作有絲分裂原因?yàn)槠渫ㄟ^(guò)交連T細(xì)胞表面受體起作用，參與初級(jí)及二級(jí)活化信號(hào)，從而引發(fā)很強(qiáng)的刺激信號(hào)。因此，基于本文公開(kāi)內(nèi)容本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，如果可調(diào)節(jié)T細(xì)胞對(duì)這些凝集素的響應(yīng)，其原理同樣可用于其他免疫原。
如本文其他部分所指出的，在某些情況中，5-HT顯示出刺激活化T細(xì)胞的效用(Kut等，1992，Immunopharmacol.Immunotoxicol.14783-796；Young等，1993，Immunology 80395-400)，然而大多數(shù)實(shí)驗(yàn)報(bào)道加入的高濃度5-HT抑制增殖(Mossner & Lesch，1998，Brain，Behavior and Immunity 12249-271)。為探討這一明顯的矛盾，我們測(cè)定了色氨酸及5-HT對(duì)T細(xì)胞基本活化通路的影響。
材料及試劑以下化合物來(lái)自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)色氨酸、5-羥色胺、血清素-鹽酸鹽、苯乙肼、2-氨基-2-降莰烷羧酸(BCH)、L-p-氯苯丙氨酸、氟西汀、m-羥芐肼雙氫氯化物(NSD-1015)、(S)-普萘洛爾、(S)-及(R)-8-OH DPAT-氫溴酸鹽、WAY 100635、LY 53857、SB 206553、SB 242084、美西麥角-馬來(lái)酸鹽、2-甲基-5-HT、Ro046790、利哌酮、3-托烷-吲哚-3-羧化物、氯氮平、酮色林、米安色林、、SDZ205557、alpha-甲基-DL-tryrosine-甲基酯鹽酸鹽。
以下化合物來(lái)自Tocris Cookson(St.Louis，MO)MDL 11939。貯存液一般配成1mM的濃度，如漢克斯平衡鹽溶液(HBSS)所述。利哌酮及MDL 11939例外，它們先溶于鹽酸(大約終體積的1/10)，而后用HBSS稀釋?zhuān)儆脷溲趸c滴定到中性pH。制備5mM濃度的L-p-氯苯丙氨酸，用含10％FBS的RPMI溶解以使其溶解度達(dá)到最大程度。
RPMI溶媒來(lái)自Gibco BRL，HBSS、胎牛血清(FBS)、人A/B血清、Histopaque-1077、M-CSF、刀豆素A(ConA)、氟西汀及BCH[2-氨基-2降莰烷羧酸]來(lái)自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。所有一次性塑料制品來(lái)自Corning Costar(Corning Inc.Life Sciences，Acton，MA).氚標(biāo)記的脫氧胸腺嘧啶核苷來(lái)自DuPont-NEN(LincolnPark，NJ)。Vacutainer收集設(shè)備及肝素處理的收集瓶來(lái)自Becton-Dickinson(Franklin Lakes，NJ)。除非特指所有細(xì)胞在37℃、5％ CO2條件下培養(yǎng)。
動(dòng)物6-8周大BALB/c/BYJ(H-2d)及C57/B6J(H-2b)小鼠來(lái)自Jackson Laboratories(Bar Harbor，ME)。
PCR引物測(cè)序引物為T(mén)7 TAATACGACTCACTATAGGG(SEQ ID NO15)，BghTAGAAGGCACAGTCGAGG(SEQ ID NO16).用于特異性擴(kuò)增5-HT受體的引物如下1A型受體1af CGGTCAAAAAGGTGGAGAAG(SEQ ID NO17)，1ar GAGGCAAGTGCTCTTTGGAG(SEQ ID NO18)，期望的產(chǎn)物大小為234bp.2A型受體2ar AGTCCTCCTGCCTGTGTAGG(SEQ ID NO19)，2afCGCCGATGATAACTTTGTCC(SEQ ID NO20)，期望的產(chǎn)物大小為247 bp.2B型受體2bf ACTGGCTGCCTTCTTCACAC(SEQ ID NO21)，2brTGTCCTTTCGAGAACCATCC(SEQ ID NO22)，期望的產(chǎn)物大小為206bp.2C型受體2cf ATGGTGAACCTGAGGAATGC(SEQ ID NO23)，2crTTCCATGCTTACTGCCATGA(SEQ ID NO24)，期望的產(chǎn)物大小為256bp.3A型受體3af CAATGAGTTCGTGGATGTGG(SEQ ID NO25)，3arTGACCACATAGAAGAGGGGC(SEQ ID NO26)，期望的產(chǎn)物大小為216bp.3B型受體3bf ACACCGTCTTCAGGGTCAAC(SEQ ID NO27)，3brGCTCTCCATACAGCGAGGAC(SEQ ID NO28)，期望的產(chǎn)物大小為270bp.4型受體4f GAGACCAAAGCAGCCAAGAC(SEQ ID NO29)，4rTTGTGGTTGAACAAGGGACA(SEQ ID NO30)，期望的產(chǎn)物大小為289bp.所有的引物由Sigma-Genosys合成(The Woodland，TX)。
反轉(zhuǎn)錄及PCR用描述于Current Protocolsin Immunology的Ficoll梯度分級(jí)來(lái)自健康捐贈(zèng)者的全血。收集外周血淋巴細(xì)胞并將之放于六孔板，每孔2×107細(xì)胞。使細(xì)胞附著于塑料1.5小時(shí)，移去懸浮細(xì)胞并用每孔107細(xì)胞的濃度從新鋪新的六孔板。用ConA(5μg/ml)刺激附著及懸浮的細(xì)胞，或保留不經(jīng)處理。用ConA刺激后48小時(shí)后，收集細(xì)胞用Qiagen RNAeasy小制備系統(tǒng)根據(jù)操作手冊(cè)(Quiagen，Chatsworth，CA)提取總RNA。用溴乙錠(EtBr)染色膠測(cè)定RNA樣品量，且在cDNA合成中每個(gè)RNA樣品用約1μg的量。用Qiagen反轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)使用手冊(cè)實(shí)行cDNA合成，使用寡T12-18引物或是受體特異性反轉(zhuǎn)錄引物。所得cDNA作為35循環(huán)的PCR反應(yīng)的模板(用Sigma的Taq DNA聚合酶)，使用的引物為5-HT受體特異性引物。50微升PCR反應(yīng)系統(tǒng)中用25pM的每種特異性引物。PCR條件為95℃進(jìn)行45秒，61.5℃進(jìn)行45秒，72℃進(jìn)行45秒。35個(gè)PCR循環(huán)后在72℃延伸10分鐘。最終PCR產(chǎn)物用瓊脂糖膠分析(TAE緩沖)(NuSieve 3∶1現(xiàn)成瓊脂糖膠來(lái)自BMA，Rockland，ME)。
為驗(yàn)證序列，如操作手冊(cè)推薦的將PCR產(chǎn)物直接克隆到TA表達(dá)載體(pCR 3.1)(Invitrogene，Carlstad，CA)。用PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP10F細(xì)胞后，將細(xì)菌細(xì)胞鋪于含25mg/ml氨芐青霉素的瓊脂板上。第二天，用快速PCR篩選方法篩選細(xì)菌克隆是否插入了片段。此種方法可每天篩選數(shù)百個(gè)克隆。
簡(jiǎn)而言之，用200微升的移液頭接觸細(xì)菌克隆，然后用50微升的無(wú)菌水浸泡移液頭，在95℃煮沸5分鐘。用25微升煮過(guò)的樣品用為模板，用T7及Bgh質(zhì)粒引物(見(jiàn)測(cè)序引物)做35循環(huán)的PCR反應(yīng)。用2％的瓊脂糖膠在TAE緩沖液中鑒定PCR產(chǎn)物。鑒定陽(yáng)性克隆，再對(duì)選出的克隆小批量制備質(zhì)粒(根據(jù)操作手冊(cè)使用Qiagen小批量質(zhì)粒制備系統(tǒng))。用正向(T7)及反向(Bgh)質(zhì)粒引物在賓州大學(xué)的測(cè)序設(shè)備上對(duì)所得質(zhì)粒測(cè)序。
巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基研究用改自Current Protocols in Immunology(1999，14.1.3-14.1.6節(jié)；Coligan等編，1994-1997，InCurrent Protocols inImmunology，vol.1-3，John Wiley & Sons Inc.)的操作方法分離C57/B6J小鼠單核細(xì)胞。股骨及脛骨來(lái)自6-8周大C57/B6J小鼠后肢(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)。移去骨頂端露出髓質(zhì)。用22口徑針(Becton-Dickinson，Lincoln Park，NJ)用含2％FBS的RPMI培養(yǎng)基沖髓出腔。用尼龍網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸浮液以去除基質(zhì)細(xì)胞。用ACK(氯化銨鉀裂解緩沖液；0.15M NH4Cl，10mM KHCO3，0.1mM EDTA)緩沖液裂解血紅細(xì)胞，如Current Protocols in Immunology(3.1.5節(jié))中所述。
以107細(xì)胞/ml的濃度在RPMI介質(zhì)中再此懸浮細(xì)胞，其含10％FBS、500單位/ml的鼠M-CSF，并將3ml/孔的細(xì)胞懸浮液鋪于6孔平板上。24小時(shí)后，收集非粘附細(xì)胞(單核細(xì)胞)以每孔0.4兆的濃度鋪于24孔平板上，介質(zhì)為含200單位/ml M-CSF及15％FBS的0.65mlRPMI。讓細(xì)胞生長(zhǎng)4天。收集6-8周大BALB/c/BYJ小鼠的脾并制得單細(xì)胞懸浮液。用上述方法除去血紅細(xì)胞。在尼龍毛柱上孵育1.5小時(shí)去除粘附細(xì)胞，收集懸浮細(xì)胞。而后將BALB/c細(xì)胞以每孔1.2×106細(xì)胞的濃度鋪于0.65ml體積(使終體積為每孔1.3ml)C57/B6細(xì)胞上面(見(jiàn)前)。讓細(xì)胞生長(zhǎng)2.5天。適當(dāng)時(shí)在此次培育初始可加入氟西汀或BCH。收集混合的細(xì)胞培養(yǎng)物，在1200RPM離心去除細(xì)胞，用0.22微米注射器(Corning)過(guò)濾器過(guò)濾。濾過(guò)培養(yǎng)基用于另一輪的細(xì)胞增殖。
鼠T細(xì)胞純化脾來(lái)自于BALB/c或C57/Black6小鼠(Jackson Laboratories)。在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)基中破碎(RPMI 1640 Medium(GibcoBRL)加有2％胎牛血清(Sigma)，1％青霉素及鏈霉素(Pen-Strep；Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)和1％L-Glu(谷氨酸；BioWhittaker))以獲得單細(xì)胞懸浮液。將細(xì)胞在1200RPM中離心10分鐘，并移除上清液。用ACK緩沖液裂解血紅細(xì)胞(RBC)(如Colligan等所述，1999，Current Protocols in Immunology，3.1.3-3.1.5節(jié))。
殘留細(xì)胞用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)基重懸，并加載于尼龍毛柱以去除粘附細(xì)胞。細(xì)胞在柱上(5％CO2，37℃)孵育約2小時(shí)。用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)基將非粘附細(xì)胞從柱上洗下。離心細(xì)胞，在致敏(Sensitization)培養(yǎng)基(RPMI 1640培養(yǎng)基，含10％牛血清、1％青霉素及鏈霉素、和1％L-Glu，beta-MKE)中重懸。
鼠促有絲分裂刺激如Current Protocols in Immunology(1999，3.1.5節(jié)，和3.12.2-3.12.4節(jié))所述方法取得6-8周大BALB/c/BYJ小鼠原代脾T細(xì)胞。所有藥物在加入細(xì)胞懸浮液前以不同濃度預(yù)鋪在96孔U低板上。所有實(shí)驗(yàn)條件至少重復(fù)3遍。純化的原代細(xì)胞以每孔100,000細(xì)胞的濃度鋪于含藥的孔中。將ConA加入細(xì)胞懸浮液，除非特殊表明其終濃度為1μg/ml?？傮w積為每孔200μl。對(duì)照組不加ConA刺激。讓細(xì)胞生長(zhǎng)60小時(shí)。每孔加1μCi氚標(biāo)記的脫氧胸腺嘧啶核苷，12小時(shí)后用半自動(dòng)PHD收集器(Brandel，Gaithersburg，MD)收集平板，72小時(shí)后加入ConA。
鼠混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)按Current Protocols in Immunology(1999，3.12.6-3.12.7節(jié))上所述方法實(shí)行。也即，獲自C57/B6J小鼠的原代脾細(xì)胞用作刺激物。按Current Protocols in Immunology(1999，3.1.5節(jié))所述方法純化，在Hahnemann醫(yī)院(Philadelphia，PA)血庫(kù)設(shè)備上照射(35Gy)。用尼龍毛柱去除BALB/c/BYJ的原代脾細(xì)胞中的粘附細(xì)胞，并用之作為應(yīng)答物。
多種抑制劑預(yù)鋪于96孔U低板且所有實(shí)驗(yàn)條件至少測(cè)定3次。將加有10％FBS含100,000 C57/B6細(xì)胞的RPMI培養(yǎng)基鋪于各孔。將200,000 BALB/c/BYJ細(xì)胞鋪在刺激物細(xì)胞上，使終體積為每孔200μl。用不含BALB/c細(xì)胞或不含C57/B6細(xì)胞的作為背景對(duì)照。4天后每孔加一微Ci的氚標(biāo)記的脫氧胸腺嘧啶核苷，并在12小時(shí)后收集平板。
人T細(xì)胞純化填好所有必須信息后從多個(gè)健康人供者取得血樣，用根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法Ficoll-Hypaque(Sigma)梯度法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBM)。從Ficoll-血清界面收集細(xì)胞，并廣泛洗去Ficoll殘留物。洗滌細(xì)胞后用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)液重懸(RPMI 1640培養(yǎng)液，加有2％胎牛血清、1％青霉素-鏈霉素及1％L-Glu)。在37℃，5％CO2孵育細(xì)胞約4小時(shí)以去處粘附細(xì)胞。收集懸浮的細(xì)胞，在致敏培養(yǎng)液中重懸細(xì)胞(RPMI 1640培養(yǎng)基，含10％人血清(Sigma)、1％青霉素-鏈霉素、和1％L-Glu及□-MKE).
藥物處理在6孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)2.0×105RPMI-8226細(xì)胞，其中加有特定的藥物濃度，總共有5mL加了10％FBS RPMI-1640。收集全部孔中物分為2個(gè)相同的樣品組用于細(xì)胞離心涂片。
細(xì)胞離心涂片從每個(gè)處理組取1.0×105RPMI-8226細(xì)胞加到細(xì)胞漏斗中，用中等加速度在500rpm離心4分鐘。然后將玻片在PBS中逐級(jí)稀釋的甲醇中固定(100％，5分鐘；80％，5分鐘；50％，5分鐘)用PBS洗滌5分鐘，然后置于PBS中4℃保存，備染色用。
組織化學(xué)用蘇木精和伊紅對(duì)細(xì)胞離心涂片玻片染色，而后進(jìn)行核染、雙苯甲酰胺染色、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)染色步驟漂洗及固定。玻片在日光及熒光下都顯現(xiàn)以使相同視野中產(chǎn)生匹配圖像(見(jiàn)圖28及29)。
人促細(xì)胞分裂刺激用靜脈穿刺從健康志愿者中取血，用Vacutainer收集設(shè)備及肝素化收集瓶收集。用HBSS 1∶1稀釋血至50ml錐形管(FisherScientific，Co.，Pittsburgh，PA)中總體積為30ml的樣品。在30ml血溶液下10.5ml Histopaque-1077分層，管子在室溫以1200RPM速度旋轉(zhuǎn)45分鐘，以獲得單個(gè)核細(xì)胞。收集棕黃層細(xì)胞，加入HBSS再離心去除殘余的Histopaque。洗滌后用含2％FBS的RPMI以每ml 5百萬(wàn)細(xì)胞的濃度重懸細(xì)胞。為去除粘附細(xì)胞，將懸浮液鋪于6孔平板(Corning Costar)，3ml/孔，在37℃，5％CO2條件下孵育2小時(shí)。孵育后收集非粘附細(xì)胞、計(jì)數(shù)并在含10％人血清的RPMI(Sigma)中重懸。
按Current Protocols in Immunology(3.12.2-3.12.4節(jié))中所述進(jìn)行促有絲分裂刺激。再將細(xì)胞懸浮液加入96孔圓底板的每孔前在其中預(yù)鋪上所有藥物。所有實(shí)驗(yàn)條件至少測(cè)定3次。將懸浮于含10％人血清的RPMI中的細(xì)胞以每孔100,000細(xì)胞的量鋪板，使其終體積為200μl。加入ConA使其終濃度為1μg/ml。用不加ConA刺激為對(duì)照樣。在37℃，5％CO2條件下孵育培養(yǎng)板。60小時(shí)后每孔加入1微居里氚標(biāo)記的脫氧胸腺嘧啶核苷，并在12小時(shí)后收集培養(yǎng)板。
人混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)程序如上所述從兩個(gè)健康非親緣捐贈(zèng)者收集血樣。按如前所述方法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。按前面所述將兩個(gè)捐贈(zèng)者懸浮細(xì)胞中的粘附細(xì)胞去除。兩個(gè)捐贈(zèng)者(供者A和B)的懸浮細(xì)胞都用作應(yīng)答物。兩個(gè)供者的剩余的粘附細(xì)胞作為對(duì)不同供者的刺激物(A懸浮細(xì)胞對(duì)B粘附細(xì)胞且A粘附細(xì)胞對(duì)B懸浮細(xì)胞)。用35 Gy照射刺激物細(xì)胞。藥物預(yù)鋪于96孔U底板(三份)。每孔鋪200,000個(gè)存在于含10％人血清的RPMI中的“刺激物”細(xì)胞。將在相同培養(yǎng)基中的200,000個(gè)“應(yīng)答物”細(xì)胞鋪在刺激物上，使終體積為200μl/孔。無(wú)刺激物細(xì)胞或無(wú)應(yīng)答物細(xì)胞的作為背景對(duì)照。培養(yǎng)板在37℃，5％CO2孵育。4.5天后每孔加入1微居里氚標(biāo)記的脫氧胸腺嘧啶核苷，并于12小時(shí)后收集培養(yǎng)板。
鼠異源移植模型用Zhan等2000年所述本領(lǐng)域認(rèn)可的鼠異源排斥模型進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證篩選。此鑒定用了整套MHC錯(cuò)配系統(tǒng)，其中在實(shí)驗(yàn)第0天將5×106P815細(xì)胞([H-2d]DBA/2肥大細(xì)胞瘤)注入C57BL/6J(H-2b)小鼠腹腔。這些小鼠一般對(duì)P815細(xì)胞產(chǎn)生劇烈的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。開(kāi)始接種P815細(xì)胞后使其產(chǎn)生CTL反應(yīng)(通常需10-14天)。在研究的第6及8天時(shí)，將實(shí)驗(yàn)藥物進(jìn)行快速靜脈注射。如圖所示在實(shí)驗(yàn)第14天處死鼠，如前所述測(cè)定異源CTL反應(yīng)(Tretiakova等，2000，Nature Biotechnology 18984-988)。處理及未處理動(dòng)物的原代脾細(xì)胞用于直接CTL讀數(shù)。新鮮原代脾細(xì)胞與[3H]標(biāo)記靶細(xì)胞(P815細(xì)胞)以100∶1、50∶1、25∶1及12.5∶1的比率在37℃一起孵育3.5小時(shí)，而后用PHD收集器收集。特異性殺傷百分率用如下公式計(jì)算％殺傷＝(S-E)/S，此處S指不存在效應(yīng)淋巴細(xì)胞時(shí)靶細(xì)胞殘留的DNA量而E指存在效應(yīng)細(xì)胞時(shí)殘留的DNA量(用每分鐘計(jì)數(shù)表示；cpm)。
本文所公開(kāi)數(shù)據(jù)首次表明色氨酸介導(dǎo)的對(duì)免疫系統(tǒng)的效應(yīng)是由于其為血清素代謝的前體。具體來(lái)說(shuō)，如本文所公開(kāi)的，進(jìn)行的系列研究證明了色氨酸傳送抑制劑或選擇性血清素重吸收抑制劑(SSRI)的效用。
阻斷色氨酸或血清素的IDO介導(dǎo)的分解代謝等效于T細(xì)胞增殖的條件化培養(yǎng)基的功能。-也即，圖1所述實(shí)驗(yàn)為在本研究“條件”期阻斷活化巨噬細(xì)胞攝取色氨酸(用色氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑2-氨基2-降莰烷羧酸)或是阻斷本研究“條件”期對(duì)血清素的吸收(用選擇性血清素重吸收抑制劑氟西汀[ProzacTM])。此測(cè)定會(huì)產(chǎn)生多種結(jié)果。有時(shí)巨噬細(xì)胞會(huì)耗盡培養(yǎng)基，有時(shí)不會(huì)(即，色氨酸有時(shí)，而不是總是，可恢復(fù)條件培養(yǎng)基中新T細(xì)胞增殖的能力)。盡管有些變化，觀測(cè)到的總體模式為如果阻斷巨噬細(xì)胞對(duì)色氨酸或血清素的攝取會(huì)阻止培養(yǎng)基的條件化效用。圖1所示實(shí)驗(yàn)中，加入色氨酸沒(méi)有效用，而加入血清素只大概地有回復(fù)效用。然而，相似的檢驗(yàn)證明色氨酸及血清素可恢復(fù)T細(xì)胞在條件化培養(yǎng)基中增殖的能力。
設(shè)計(jì)下一系列研究是為了證明血清素在引起T細(xì)胞活化應(yīng)答中的所有作用。首選檢測(cè)了血清素從頭合成在激活應(yīng)答中的作用，同時(shí)檢測(cè)了向T細(xì)胞加入外源血清素的作用。圖2顯示色氨酸轉(zhuǎn)化為血清素的代謝通路。色氨酸羥化酶是參與該代謝轉(zhuǎn)化的第一個(gè)酶。理論上，如果啟動(dòng)活化應(yīng)答需要血清素的從頭合成，那么抑制代謝轉(zhuǎn)化通路的第一個(gè)酶會(huì)抑制應(yīng)答。此外，加入缺失酶的終端產(chǎn)物來(lái)恢復(fù)活化應(yīng)答可用于顯示該抑制的特異性。
圖3所示實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)是否抑制色氨酸羥化酶會(huì)破壞T細(xì)胞對(duì)促有絲分裂信號(hào)的應(yīng)答能力。一般來(lái)說(shuō)，用對(duì)氯苯丙氨酸來(lái)抑制該酶(PCPA)。圖3所示研究表明加入PCPA可以劑量依賴(lài)的方式抑制促有絲分裂應(yīng)答，而且此抑制可由加入該酶的代謝終產(chǎn)物5-羥色氨酸得以逆轉(zhuǎn)。不存在PCPA時(shí)，加入25μM 5-羥色氨酸可明顯提高增殖應(yīng)答。
盡管數(shù)據(jù)表明血清素從頭合成可推動(dòng)T細(xì)胞活化過(guò)程向前進(jìn)行，但PCPA的抑制機(jī)制使解釋并不清晰。加入生長(zhǎng)細(xì)胞的PCPA作為氨基酸類(lèi)似物參與蛋白合成，從而進(jìn)入新生成的蛋白。盡管PCPA加入色氨酸羥化酶會(huì)破壞其酶活性，但很難預(yù)知其進(jìn)入細(xì)胞其他蛋白中產(chǎn)生的副作用。
而后，測(cè)定所加外源血清素系色氨酸的效用，并檢測(cè)色氨酸-血清素轉(zhuǎn)化中不同代謝阻斷的效用。關(guān)于代謝阻斷，在對(duì)由阻斷單胺氧化酶引起的細(xì)胞內(nèi)血清素集聚的應(yīng)答反應(yīng)中存在關(guān)閉芳香族氨基酸脫羧酶(催化5-羥色氨酸向血清素轉(zhuǎn)化的酶)活性的高敏感反饋機(jī)制(Carlsson等，1976)。此研究中，用苯乙肼(Pz)作為單胺氧化酶抑制劑。圖4顯示這些數(shù)據(jù)。高劑量的血清素與色氨酸(400μM)增加細(xì)胞的最大刺激，反之加入單胺氧化酶抑制劑Pz可完全關(guān)閉該刺激。這些數(shù)據(jù)與啟動(dòng)及維持免疫應(yīng)答需要血清素從頭合成的觀念相吻合。以前的某些研究表明5-HT刺激活化的T細(xì)胞(Kut等，1992；Young等，1993)，然而大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室報(bào)道加入高濃度的5-HT抑制增殖(Mossner& Lesch，1998)。因此，檢測(cè)了色氨酸及5-HT兩者在T細(xì)胞基本活化通路中的作用。
T細(xì)胞活化及增殖是非常復(fù)雜的且被高度調(diào)控的過(guò)程。不論是用促細(xì)胞分裂劑還是特異性抗原引發(fā)，T細(xì)胞活化過(guò)程是時(shí)間及活化信號(hào)強(qiáng)度的函數(shù)。當(dāng)活化進(jìn)程用時(shí)間相對(duì)細(xì)胞數(shù)(或DNA合成活性)的函數(shù)繪制時(shí)，圖象顯示為鐘形曲線(xiàn)。一般來(lái)說(shuō)，促細(xì)胞分裂刺激的增殖在48-60小時(shí)(取決于起始信號(hào)強(qiáng)度)達(dá)峰值，然后是平臺(tái)期，而后迅速減低為基線(xiàn)水平。事實(shí)上，如果忽略時(shí)間度量，產(chǎn)生免疫應(yīng)答的曲線(xiàn)與神經(jīng)脈沖的極為相似。
促細(xì)胞分裂刺激實(shí)驗(yàn)的建立通常使用單一、優(yōu)化好的活化促細(xì)胞分裂劑濃度，且在預(yù)先定好的終末端觀測(cè)數(shù)據(jù)。然而，如果外加試劑改變鐘形曲線(xiàn)形狀，但不改變活化水平峰值，并且實(shí)驗(yàn)者在單一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，那么可能誤讀結(jié)果?？紤]加入試劑會(huì)縮短鐘形曲線(xiàn)寬度的情況。在采樣時(shí)，縮短的鐘形曲線(xiàn)已經(jīng)接近其末端，而未處理的細(xì)胞仍在平臺(tái)期。實(shí)驗(yàn)者自然得出待側(cè)試劑抑制測(cè)定的結(jié)論，然而細(xì)胞峰效應(yīng)可能本是相同的，只是效應(yīng)時(shí)間改變了。
檢測(cè)多種化合物在不同強(qiáng)度活化信號(hào)下的效應(yīng)，而在恒定時(shí)間點(diǎn)收集(72小時(shí))。理論上，最大的起始信號(hào)強(qiáng)度，也即用最高濃度的ConA可使鐘形曲線(xiàn)前移，反之，弱些的信號(hào)會(huì)延遲曲線(xiàn)。當(dāng)維持采樣恒定時(shí)間時(shí)，用不同濃度的ConA刺激T細(xì)胞，可在活化的“鐘形曲線(xiàn)”不同點(diǎn)檢測(cè)化合物效應(yīng)。圖5表明每種試劑對(duì)被刺激的淋巴細(xì)胞的效用。信號(hào)強(qiáng)度最弱時(shí)(0.1μg/ml ConA)，色氨酸增強(qiáng)增殖應(yīng)答，此增強(qiáng)水平隨ConA濃度的增加而減弱，因此當(dāng)ConA濃度最高時(shí)無(wú)增強(qiáng)效果。直到ConA達(dá)最高劑量時(shí)血清素對(duì)測(cè)定方有效，與“鐘形曲線(xiàn)”的最近部分相吻合。因此，不希望受任何理論的限制，顯然色氨酸及血清素對(duì)活化細(xì)胞有相同功效，只是色氨酸的活性作用發(fā)生在血清素之后。
圖5A和5B中，正如預(yù)期的對(duì)脫羧酶的反饋抑制，加入苯乙肼在其最高濃度，也即10-100μM，顯示出明顯的抑制效果。然而ConA最高劑量時(shí)(10μg/ml)，觀察不到抑制作用(圖5C)，因?yàn)楸揭译乱种魄€(xiàn)在較高ConA刺激時(shí)向右漂移，所以全效抑制作用發(fā)生在苯乙肼濃度為100-400μM時(shí)。
如果觀測(cè)到的抑制是由于抑制了L-芳香酸脫羧酶而產(chǎn)生的，從而阻止色氨酸向血清素的轉(zhuǎn)化，那么向系統(tǒng)加入外源血清素，而不是色氨酸，將緩解該阻斷作用。圖六中，用1μg/ml ConA刺激人T細(xì)胞，并考察色氨酸及血清素消除已發(fā)生抑制作用的能力。此檢驗(yàn)條件下，向ConA刺激細(xì)胞加入色氨酸可提高增殖應(yīng)答，但加入血清素不能。向苯乙肼抑制的細(xì)胞中加入血清素可使測(cè)定返回到基線(xiàn)水平，然而加入色氨酸卻幾乎沒(méi)有效用(圖6)。綜合考慮，這些數(shù)據(jù)與T細(xì)胞功能活化需血清素從頭合成的理論相符，并證實(shí)了這一概念。
為了檢驗(yàn)血清素能受體信號(hào)在免疫應(yīng)答中的功效，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用已確定的5-HT受體系統(tǒng)的的激動(dòng)劑及拮抗劑來(lái)產(chǎn)生不同的免疫應(yīng)答。具體來(lái)說(shuō)，檢測(cè)1型受體在淋巴細(xì)胞活化過(guò)程中的效用。
圖7A及7B為這些實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。A圖顯示用5μg/ml ConA刺激人淋巴細(xì)胞，而B(niǎo)圖表示異源刺激人淋巴細(xì)胞的數(shù)據(jù)，也即混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。從數(shù)據(jù)可清楚看出，用化合物SB 216641對(duì)1B型5-HT受體信號(hào)的高度選擇性抑制致使對(duì)活化應(yīng)答的完全抑制。
數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明選擇性的1B型5-HT拮抗劑(SB 216641)的量效曲線(xiàn)部分取決于細(xì)胞活化方法的信號(hào)強(qiáng)度。也即，用植物凝集素ConA交連細(xì)胞外受體使之不需二級(jí)信號(hào)輸入，這時(shí)1B型5-HT的抑制具有大約200nM的IC50，然而如果使用異源刺激(較弱的信號(hào)強(qiáng)度)，相同化合物的IC50約為50nM。應(yīng)注意選擇性1B/1D拮抗劑在相應(yīng)藥理相關(guān)濃度下明顯發(fā)生抑制作用，然而高度選擇性1D拮抗劑(BRL15572)對(duì)增殖應(yīng)答沒(méi)有效用。因此，本文公開(kāi)數(shù)據(jù)證明了人1B及1D受體在免疫應(yīng)答中的功能差別，并且證明了選擇性消除1B型5-HT受體信號(hào)可完全取消淋巴細(xì)胞活化應(yīng)答。
在同系列研究中，測(cè)定了靶向2型血清素能受體的激動(dòng)劑及拮抗劑調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的能力。圖8A及8B顯示其數(shù)據(jù)。再次，比較了藥物對(duì)促細(xì)胞分裂刺激的人淋巴細(xì)胞的效用及相同藥物在人混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中的效用，分別表示在A及B圖中。在這些研究中，多種測(cè)試藥物在其相應(yīng)藥理濃度下都可抑制活化應(yīng)答，如美賽西平(通用1、2、6及7型5-HTR拮抗劑)、LY 53857(2A/2B/2C型5-HT受體選擇性抑制劑)、SB 206553(2B/2C型5-HT受體選擇性抑制劑)及SB 242084(2C型5-HT受體高選擇性抑制劑)。這些藥物的共性為其抑制2C型5-HT受體信號(hào)的能力。因此，數(shù)據(jù)表明選擇性消除1B型5-HT受體信號(hào)可完全抑制人淋巴細(xì)胞的活化進(jìn)程。
圖9A及9B顯示抑制或干擾3、4、6及7型5-HTR受體信號(hào)的效用(沒(méi)考察5型5-HT受體，因?yàn)闆](méi)有可用于特異性靶向該受體系統(tǒng)的激動(dòng)劑或拮抗劑)。3型5-HT受體的激動(dòng)劑及拮抗劑對(duì)細(xì)胞增殖能力都無(wú)效用，不論這些細(xì)胞是受促細(xì)胞分裂劑刺激還是異源刺激。4型5-HT受體的激動(dòng)劑及拮抗劑都抑制應(yīng)答。在這點(diǎn)上，一般認(rèn)為4型受體激動(dòng)劑使受體下調(diào)，導(dǎo)致信號(hào)的消減。在CD4-依賴(lài)性分析中，特異性抑制6及7型5-HT受體無(wú)效用。
盡管使用1及2型拮抗劑見(jiàn)到的功效最大，但同時(shí)也檢測(cè)了刺激3型5-HT受體及選擇性抑制6型5-HT受體的功效。具體來(lái)說(shuō)，用鼠mined淋巴細(xì)胞應(yīng)答測(cè)試(MLR)測(cè)定功效。Ro 04-679，選擇性的6型拮抗劑，對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)效用，然而用目前所知3型激動(dòng)劑，5-甲基羥色胺會(huì)使之略為上升，以前及本文都未發(fā)現(xiàn)促細(xì)胞分裂刺激及異源刺激間的抑制行為有實(shí)質(zhì)性的差異。
以前的試驗(yàn)表明3H-胸腺嘧啶核苷可插入到生長(zhǎng)DNA鏈，也即DNA合成中。不希望受任何理論的限制，如果一種化合物雖然使細(xì)胞可存活但使之不能生長(zhǎng)，而另一種化合物可誘導(dǎo)凋亡(程序化細(xì)胞死亡)，那么當(dāng)使用DNA合成作為試驗(yàn)的終點(diǎn)時(shí)，可鑒別出相同的結(jié)果。
為進(jìn)一步評(píng)定萘心安(通用1型5-HTR拮抗劑)及利哌酮(通用2型5-HTR拮抗劑)對(duì)促細(xì)胞分裂刺激的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物的效用，在試驗(yàn)過(guò)程中手工計(jì)量存活細(xì)胞數(shù)。圖11顯示細(xì)胞計(jì)量。如細(xì)胞不受刺激，則檢測(cè)不到存活細(xì)胞數(shù)的改變。用ConA刺激細(xì)胞時(shí)，可觀察到一小段滯后期，并且將在沒(méi)有抑制劑情況下觀測(cè)到的刺激應(yīng)答曲線(xiàn)同生長(zhǎng)期起始比較。1型5HT受體拮抗劑阻止細(xì)胞生長(zhǎng)。顯然，與初始細(xì)胞數(shù)相比，細(xì)胞數(shù)目不降低或增加。還不清楚這是由于無(wú)反應(yīng)力還是無(wú)法啟動(dòng)活化通路所引起的，或是由兩者共同引起的。另一方面，利哌酮先引起細(xì)胞的短暫增加，而后培養(yǎng)基中細(xì)胞消亡。需要強(qiáng)調(diào)只能通過(guò)手工計(jì)量細(xì)胞數(shù)而得這些數(shù)據(jù)；DNA合成試驗(yàn)應(yīng)表明兩種化合物產(chǎn)生相同結(jié)果。因此，基于此處顯示數(shù)據(jù)，各種抑制2型血清素受體的拮抗劑為淋巴細(xì)胞活化進(jìn)程的限速物。
因?yàn)楸疚墓_(kāi)數(shù)據(jù)表明T細(xì)胞活化信號(hào)主要是對(duì)經(jīng)由1B或2型5HT受體的信號(hào)應(yīng)答，所以設(shè)計(jì)藥理實(shí)驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)3種2型受體中哪種對(duì)免疫系統(tǒng)的影響最大。因而，檢測(cè)了一系列2型5HT拮抗劑，它們特異性不同且不與其他受體系統(tǒng)交互作用(圖12)。第一個(gè)化合物為L(zhǎng)Y 53857，靶向所有2型受體。第二個(gè)化合物為SB 206553，僅選擇性靶向2B及2C型5HT受體。第三個(gè)化合物為MDL 11939，只靶向2A型5HT受體。第四個(gè)化合物為SB 242084，是高選擇性的2C型5HT受體。所有藥物都在試驗(yàn)起始(0時(shí))或二次活化期開(kāi)始時(shí)(48小時(shí)時(shí))給藥。本文公開(kāi)數(shù)據(jù)顯示2C型5HT特異性拮抗劑有保留的全部抑制特性(見(jiàn)圖12)。不希望受任何理論限制，本文公開(kāi)數(shù)據(jù)表明2C型5HT受體信號(hào)是淋巴細(xì)胞活化過(guò)程的限速信號(hào)。
所以，本文公開(kāi)數(shù)據(jù)表明色氨酸在T細(xì)胞活化應(yīng)答時(shí)活性地轉(zhuǎn)化為血清素。此外，藥理學(xué)特性顯示1型5HT受體，尤其是1A型受體，可啟動(dòng)活化應(yīng)答。此現(xiàn)象是驚人的，因?yàn)橐郧暗募夹g(shù)顯示1A型5HT受體不存在于靜息細(xì)胞中，而且只在Tall活化時(shí)上調(diào)。與1型受體相反，2型5HT受體顯示出在活化應(yīng)答的早期及晚期相都需要血清素介導(dǎo)的信號(hào)。在應(yīng)答的任何時(shí)間點(diǎn)阻斷該信號(hào)會(huì)導(dǎo)致活化的即刻停止。具體來(lái)說(shuō)，本文公開(kāi)數(shù)據(jù)首次表明，啟動(dòng)及維持免疫應(yīng)答絕對(duì)需要通過(guò)2C 5HT受體的信號(hào)。
Mellor等(1998，Science 2811191-1193)探討了胎兒如何在異源排斥反應(yīng)中存活(胎兒為半母體半父體)。大約子宮受孕8天后，一種酶(吲哚胺2；3-雙加氧酶，IDO)上調(diào)。此酶分解代謝如色氨酸及血清素之類(lèi)的吲哚胺。在妊娠及該酶上調(diào)間的時(shí)間延遲給T細(xì)胞應(yīng)答的活化提供了充分的時(shí)間。換而言之，機(jī)體使免疫應(yīng)答可以發(fā)生并且在任何損壞發(fā)生前，IDO上調(diào)，突然撤回了血清素的局部供應(yīng)。盡管不希望受任何理論限制，很可能血清素能信號(hào)的突然消失誘導(dǎo)了活化的細(xì)胞群的凋亡，從而功能性去除了可能對(duì)胎兒有反應(yīng)的細(xì)胞，而留下了靜息細(xì)胞群以準(zhǔn)備應(yīng)答任何外來(lái)病原體。為了在體內(nèi)驗(yàn)證體外數(shù)據(jù)，選用健康的經(jīng)過(guò)技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)認(rèn)可的異源排斥模型。
因?yàn)楸疚墓_(kāi)數(shù)據(jù)提出了一種可能機(jī)制，用于解釋自然界如何對(duì)抗妊娠期由孕體產(chǎn)生的不必要的異源排斥應(yīng)答，所以用P815細(xì)胞(源于DBA小鼠肥大細(xì)胞瘤的快速生長(zhǎng)的細(xì)胞系)在C57BL6小鼠中構(gòu)建了強(qiáng)有效的排斥應(yīng)答，并檢測(cè)了異源排斥模型中5-HTR活性。該模型是基于Han等(2000)所述的本領(lǐng)域認(rèn)可的異源排斥模型。該模型中，P815細(xì)胞(H-2d)與C57BL6小鼠(H-2b)間存在完全的MHC錯(cuò)配，因此產(chǎn)生攻擊性免疫應(yīng)答。圖13所公開(kāi)數(shù)據(jù)描述了包括6個(gè)處理組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)處理組包括3只小鼠。每只小鼠在實(shí)驗(yàn)第0天腹腔注入5×106P815細(xì)胞。第一組為未處理對(duì)照組，用來(lái)建立小鼠對(duì)異源刺激的基線(xiàn)應(yīng)答。這些小鼠，不經(jīng)任何進(jìn)一步處理，與其他處理組小鼠一起在實(shí)驗(yàn)第14天處死，測(cè)試其脾細(xì)胞對(duì)P815細(xì)胞特異靶定的殺滅。
當(dāng)效應(yīng)器與靶比率為100∶1時(shí)未處理組觀測(cè)到的平均殺滅約為45％。第二組用2型5HT拮抗劑利哌酮處理，在實(shí)驗(yàn)6及8天經(jīng)由尾靜脈注射給藥(200μg/注射)。選擇給藥時(shí)間以確保藥物處理前T細(xì)胞完全活化。第三組用1型5HT拮抗劑萘心安處理。所有5HT受體拮抗劑處理組用與利哌酮處理組相同的方法處理。第四組用環(huán)孢霉素A慢性處理。在實(shí)驗(yàn)前2天開(kāi)始對(duì)小鼠注射劑量為100μg/注射的環(huán)孢霉素A，也即，在-2天開(kāi)始，研究期間每日持續(xù)注射。
環(huán)孢菌素A可有效地阻止T細(xì)胞啟動(dòng)活化應(yīng)答，目前是治療移植過(guò)程中并發(fā)癥可選藥物之一。第五及第六組用SB206553(高選擇性的2C型5HT拮抗劑)及美西麥角(臨床也叫SansertTM)處理，它們分別是是通用的1型及2型5HT拮抗劑。如本文公開(kāi)數(shù)據(jù)所示，環(huán)孢菌素A處理的小鼠如所預(yù)期的，對(duì)異源移植不形成細(xì)胞毒性應(yīng)答(圖13)。萘心安處理組不能使小鼠免受異源排斥反應(yīng)。該現(xiàn)象與1型5HT受體主要影響活化應(yīng)答早期階段的觀念一至。
利哌酮、SB206553及美西麥角處理組在不同程度上都抑制異源移植應(yīng)答。如在拮抗劑處理組觀測(cè)到的免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)的例示，圖14描述了SB 206553處理組每只鼠的個(gè)體應(yīng)答現(xiàn)象。3只處理鼠中2只鼠抑制異源移植應(yīng)答，其程度等同于用環(huán)孢霉素A處理的動(dòng)物的中所觀測(cè)到的。對(duì)藥物處理沒(méi)反應(yīng)的一只鼠需要多次注射藥物，因?yàn)槠淦鹗嫉奈察o脈注射失敗。數(shù)據(jù)表明體外劑量抑制曲線(xiàn)從無(wú)抑制迅速發(fā)展為100％抑制，就好似一個(gè)“閾型”應(yīng)答。不希望被任何理論限制，可能這只非應(yīng)答鼠沒(méi)收到全劑量藥物，或是多次注射的壓力誘導(dǎo)了小鼠的血清素應(yīng)答。
血清素作為神經(jīng)遞質(zhì)，根據(jù)存在于應(yīng)答細(xì)胞表面5HT受體的不同類(lèi)型而發(fā)揮不同的效用。免疫應(yīng)答受高度調(diào)控，并且其應(yīng)答的表達(dá)隨遞呈的抗原的性質(zhì)及環(huán)境而有細(xì)微變化。因此，不希望受任何理論限制，由于血清素在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中起重要作用，可想象應(yīng)答細(xì)胞表達(dá)不同的血清素受體群。已清楚單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞都表達(dá)血清素特異性受體。然而對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的綜述得出了令人費(fèi)解的受體表達(dá)模式。表1顯示這些研究以及其對(duì)血清素受體和免疫系統(tǒng)細(xì)胞所作出的總結(jié)。
表1
最早的藥理學(xué)研究表明2型5HT受體在T細(xì)胞中存在，然而后來(lái)的文章(由Miles Research Center發(fā)表)提供了RT PCR證據(jù)表明T細(xì)胞中存在的是1A受體而不是2型5HT受體。此外，他們發(fā)現(xiàn)1A5HT受體僅存在于T細(xì)胞中。在Serbo-Croatia的一個(gè)實(shí)驗(yàn)室(Stefulj等，2000)的工作發(fā)現(xiàn)1A及2C型5HT受體都不存在，他們使用針對(duì)14個(gè)已知藥理學(xué)差異的受體中13個(gè)受體的引物，做反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT PCR)。最近Pisa大學(xué)Marazziti等(2001，Neuropsychobiology 43123-126)指出存在2C型5HT。這些研究相互矛盾。本文公開(kāi)數(shù)據(jù)與體內(nèi)及體外數(shù)據(jù)一致。因此，用血清素受體的序列特異性引物進(jìn)行系列研究來(lái)探討5HT受體在上述試驗(yàn)所用的人細(xì)胞上的表達(dá)。
為進(jìn)行研究，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增1A、2A、2B、2C、3A、3B及4型5HT受體的PCR引物(見(jiàn)上，方法部分實(shí)驗(yàn)詳述及各引物序列)。為進(jìn)行促細(xì)胞分裂刺激及人MLR，根據(jù)本文其他部分公開(kāi)的程序純化人外周血細(xì)胞。從淋巴細(xì)胞中分離由單核細(xì)胞組成的抗原遞呈細(xì)胞。用受10μg/ml ConA刺激前的細(xì)胞群或刺激后的細(xì)胞群構(gòu)建cDNA文庫(kù)。用RT PCR用于檢測(cè)各受體的存在。
用1A型HT5特異性的引物所得的數(shù)據(jù)是出乎意料的。預(yù)期片斷大小為234bp。此條帶只在活化淋巴細(xì)胞群中略微可見(jiàn)，當(dāng)膠存照形成圖15所示圖象后檢測(cè)不到此條帶。反之，由該引物擴(kuò)增主要產(chǎn)物為一約387bp的帶，而圖15中所有其他受體的擴(kuò)增片斷都與預(yù)期片斷大小精確相符。此387bp的條帶與任何1A型5HT受體多態(tài)性或任何已知剪切形式都不相符。
圖15所示PCR擴(kuò)增的同時(shí)，用受體特異性引物PCR擴(kuò)增各個(gè)cDNA文庫(kù)，并克隆到表達(dá)載體，即TA表達(dá)載體或pCR 3.1(Invitrogen)，用于DNA測(cè)序。
盡管此處公開(kāi)的PCR數(shù)據(jù)不是定量PCR，我們?cè)噲D使本文所述所有PCR反應(yīng)在規(guī)范化的條件下進(jìn)行。圖15中用1A型5HT特異性引物擴(kuò)增的條帶在靜息淋巴細(xì)胞及活化單核細(xì)胞中的量多于其在靜息單核細(xì)胞及活化淋巴細(xì)胞中的擴(kuò)增量。將此384bp條帶及預(yù)期大小的片斷都克隆到TA載體。將用測(cè)序的方法來(lái)鑒別這些PCR產(chǎn)物。
對(duì)于2型5HT受體，2A型5HT受體在淋巴細(xì)胞上存在，并且其條帶在靜息淋巴細(xì)胞中的量強(qiáng)于在活化細(xì)胞中的量。2B型5HT受體只存在于靜息單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，且當(dāng)細(xì)胞活化時(shí)消失。2C型5HT受體既存在于靜息淋巴細(xì)胞也存在于活化淋巴細(xì)胞。沒(méi)檢測(cè)到3型5HT受體。考慮到文獻(xiàn)報(bào)道及本文實(shí)驗(yàn)所得藥學(xué)數(shù)據(jù)，其結(jié)果是驚人的。不希望受任何理論限制，可能受體mRNA中有沒(méi)預(yù)測(cè)到的多態(tài)形式或其他差異使本文所用的設(shè)計(jì)的引物不能擴(kuò)增出相應(yīng)的cDNA。用不同組引物重復(fù)此RT PCR。
此外，本試驗(yàn)檢測(cè)出預(yù)期大小的4型5HT受體擴(kuò)增條帶。此條帶出現(xiàn)在靜息淋巴細(xì)胞及活化單核細(xì)胞中。如前所述，圖15所示每一條帶都被克隆及測(cè)序驗(yàn)證。
以血清素能為基礎(chǔ)的免疫療法被自然界所用。此方法可用于設(shè)計(jì)治療多發(fā)性硬化癥、1型糖尿病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎及許多其他自身免疫疾病。同一藥物療法可用于停止排斥反應(yīng)中的免疫應(yīng)答，如遺傳錯(cuò)配實(shí)體器官排斥、血液及干細(xì)胞移植排斥及針對(duì)基因治療載體產(chǎn)生的應(yīng)答。
目前用于治療這些疾病狀態(tài)的療法不但有毒而且隨著每天服藥會(huì)阻斷患者全部免疫系統(tǒng)，使其余生都免疫妥協(xié)。盡管器官暫時(shí)得到保護(hù)或是短期不會(huì)復(fù)發(fā)，然而卻使患者很易發(fā)生偶發(fā)性感染。
本文所公開(kāi)數(shù)據(jù)使一種新的特異性治療方法成為可能。事實(shí)上，細(xì)胞在胎兒-母體期表達(dá)一種酶(IDO)，可局部降解吲哚胺，如血清素與色氨酸。免疫細(xì)胞需經(jīng)其表面的特異性受體接收血清素信號(hào)，因此血清素缺失使關(guān)鍵的活化信號(hào)(們)突然消失，從而使活化的T細(xì)胞群功能喪失，進(jìn)而保護(hù)了作為異源物的胎兒。
相關(guān)酶只在妊娠期早期需要(大約前三個(gè)月)。需注意免疫應(yīng)答抑制只局限于酶活性期的活化細(xì)胞。不希望受任何理論限制，在無(wú)其他感染或疾病的懷孕期間，只有活化的細(xì)胞是那些特異性靶向胎兒的；因此，只有這些細(xì)胞應(yīng)被抑制。血清素信號(hào)的暫時(shí)消除足以阻斷懷孕時(shí)針對(duì)胎兒的免疫應(yīng)答，然而一旦酶停止作用且局部恢復(fù)血清素水平，則可進(jìn)行任何其他正常免疫應(yīng)答。
不希望受任何理論的限制，血清素受體藥物治療易于操作，只要選擇性的模仿血清素缺失既可。不用通過(guò)去除血清素來(lái)阻止其結(jié)合，受體信號(hào)抑制劑或可與該神經(jīng)遞質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)或非競(jìng)爭(zhēng)性的抑制該受體信號(hào)，都可產(chǎn)生相同的結(jié)果。自身免疫疾病或抑制狀況都與懷孕相似，因?yàn)榻】等酥兄挥谢罨拿庖呒?xì)胞是那些靶向該“自身”組織或外源器官的細(xì)胞?？梢悦}沖式治療給藥的以血清素為基礎(chǔ)的治療可同樣靶向這些患者中的活化細(xì)胞，而當(dāng)藥物從循環(huán)中清除時(shí)，使他們的靜息免疫系統(tǒng)可隨時(shí)預(yù)備應(yīng)答。
為了改性治療性處理方法，發(fā)展并測(cè)試了新的實(shí)驗(yàn)性治療法。阻斷CD40/CD154 costimulatory通路的生物學(xué)技術(shù)可能是迄今為止評(píng)估的所有實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中最有前景的(Diehl等，2000，J.Molec.Med.78363-366)。用非消除性抗CD154抗體來(lái)延長(zhǎng)恒河猴的全MHC錯(cuò)配移植存活(Kirk等，1999，Nature Medicine 5686-693；Kenyon等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.968132-8136)?？贵w治療明顯利用活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(AICD)作為其對(duì)延長(zhǎng)異源存活療效的重要特征(Markees等，1998，J.Clin.Invest.1012446-2452)。此外，數(shù)據(jù)表明用抗CD 154抗體誘導(dǎo)的耐受性不只包括潛在攻擊性T細(xì)胞的缺失，還抑制新的移植反應(yīng)性T細(xì)胞群(Graca等，2000，J.Immunol.1654783-4786)。然而，大多數(shù)對(duì)抗CD154抗體的研究表明異源移植物由于動(dòng)脈硬化最終被排除。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中發(fā)生的移植物動(dòng)脈硬化顯然源于CD8+細(xì)胞毒T細(xì)胞的侵入(Honey等，1999，J.Immunol.1634805-4810)。目前數(shù)據(jù)表明CD8+T細(xì)胞不能被CD154阻斷有效靶向(Ensminger等，2000，Transplantation692609-2612)。盡管CD8+CTL應(yīng)答可逃脫CD40配基阻斷，但施用抗CD154單克隆抗體的治療效果仍是驚人的，并且似乎并無(wú)任何主要的不利副作用(Kenyon等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 968132-8136)。
單克隆抗體作為新醫(yī)療方法正且將繼續(xù)起到重要作用。這些抗體占目前現(xiàn)有的生物藥物的四分之一，當(dāng)前應(yīng)用或正被研究的藥物約有30種(Breeveld，2000，Lancet 355735-740)。然而，單克隆抗體本身有一些局限性。如任何相關(guān)大分子蛋白一樣，與生產(chǎn)(更為傳統(tǒng)的)小有機(jī)藥物所用成本相比，用于人體治療應(yīng)用的商業(yè)化生產(chǎn)及純化操作成本巨大(Hillegass等，1999，Am.Heart J.138S24-32)。盡管單抗的短期副作用是可接受及可預(yù)測(cè)的，但其長(zhǎng)期安全性還需評(píng)估。盡管體內(nèi)一星期或更長(zhǎng)時(shí)間的半衰期不是不尋常的，單克隆抗體經(jīng)常有組織透過(guò)性的問(wèn)題，如在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中它們不能有效的穿透sinovial組織(Colcher等，1998，Q.J.Nucl.Med.42225-241)。簡(jiǎn)而言之，單克隆抗體可迅速處理一些不能解決的醫(yī)療問(wèn)題，但是不表示可長(zhǎng)期解決這些問(wèn)題。如大型制藥公司所經(jīng)常提及的，最好的藥還是傳統(tǒng)小有機(jī)分子。
有此說(shuō)法“移植研究的圣杯是用過(guò)短期脈沖治療誘導(dǎo)耐受性?！?見(jiàn)Herman Waldmann教授，Sir William Dunn School of Pathology，Oxford，UK)。本文運(yùn)用的原理為利用活化誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，AICD，建造短其脈沖療法的策略。淋巴細(xì)胞5-HT受體多樣性足以對(duì)活化應(yīng)答進(jìn)行正調(diào)控及負(fù)調(diào)控。不希望受任何理論限制，推測(cè)血清素系統(tǒng)代表原始防御系統(tǒng)，而且多種為免疫應(yīng)答提供精細(xì)調(diào)節(jié)元件的細(xì)胞決定簇隨時(shí)間逐漸參入此系統(tǒng)。事實(shí)上，廣泛認(rèn)為免疫應(yīng)答的產(chǎn)生涉及與神經(jīng)連接不同的“免疫聯(lián)合”(Bromley等，2001，Ann.Rev.Immunol.19375-396)。為保證種族增殖，自然界用于防止胎兒排斥的機(jī)制必須是進(jìn)化中的早期事件。如果血清素通路代表原始防御通路，那么可理解自然界選擇經(jīng)由色氨酸缺失來(lái)控制血清素水平，從而保護(hù)懷孕期的胎兒。
靶向血清素能信號(hào)用于控制“多余的”炎癥應(yīng)答，其優(yōu)勢(shì)為可利用關(guān)于血清素受體系統(tǒng)藥理-藥物選擇性拮抗劑的巨大信息數(shù)據(jù)庫(kù)。與單克隆抗體為基礎(chǔ)的治療法不同，此策略為一種可功能性去處所有參與產(chǎn)生免疫應(yīng)答的活化T細(xì)胞(輔助者和細(xì)胞毒性T細(xì)胞)的方法。
使用自然的通路來(lái)控制免疫的顯而易見(jiàn)的好處為單次治療可至少提供數(shù)月的保護(hù)。此保護(hù)的最終期限并不知道。而且，明顯的治療靶點(diǎn)涉及包含致病炎癥應(yīng)答的多種疾病，如多發(fā)性硬化癥及類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。與目前所用的COX-2酶抑制劑(如CelebrexTM)不同，設(shè)計(jì)以血清素為基礎(chǔ)的治療可功能性的去除負(fù)責(zé)產(chǎn)生該疾病的細(xì)胞，而不是僅暫時(shí)緩解應(yīng)答。
綜上所述，血清素受體拮抗劑可用于模擬設(shè)計(jì)的或出于胎兒存活需要而產(chǎn)生的強(qiáng)效、自然、原始免疫保護(hù)機(jī)制。本文所公開(kāi)數(shù)據(jù)為治療自身免疫疾病及移植免疫方法的發(fā)展提供了有用的工具。這些領(lǐng)域治療目的類(lèi)似于試圖抑制多余的免疫應(yīng)答而不傷害將來(lái)感染所需的靜息免疫細(xì)胞群。此治療策略適應(yīng)治療多發(fā)性硬化癥、1型糖尿病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、克羅恩病及潰瘍性結(jié)腸炎、以及許多其他自身免疫疾病。此治療策略也可用于保護(hù)遺傳錯(cuò)配的實(shí)體組織、血液及干細(xì)胞移植物及當(dāng)前用于基因治療的載體。
實(shí)施例25-HT受體亞型mRNA的差異表達(dá)根據(jù)生產(chǎn)商技術(shù)手冊(cè)用Qiagen RNAeasy小批量抽提試劑盒提取總細(xì)胞RNA。RNA樣品用EtBr染的膠定量，各RNA樣品取約1μg用于cDNA合成。根據(jù)生產(chǎn)商技術(shù)手冊(cè)用Qiagen反轉(zhuǎn)錄酶及寡T12-18引物合成cDNA。所得cDNA作為PCR(Taq DNA polymerase，Sigma)模板，用5-HT受體特異性引物擴(kuò)增。PCR條件為95℃ 45秒，61.5℃ 45秒，72℃ 45秒25循環(huán)后于72℃延伸10分鐘。用3％瓊脂糖膠電泳分析PCR產(chǎn)物(TAE緩沖液)。為進(jìn)一步驗(yàn)證，用PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA印記雜交，用放射性標(biāo)記的受體特異性的內(nèi)部寡核苷酸為探針。PCR產(chǎn)物從瓊脂糖膠轉(zhuǎn)移到HyBond膜，雜交反應(yīng)按Current Protocols InMolecular Biology操作。簡(jiǎn)而言之，膜用6XSSC預(yù)封閉，其含10XDenhardt溶液、0.5％SDS、1μg/ml多聚A及100μg/ml of SS DNA。每一雜交反應(yīng)加20pmol放射性標(biāo)記探針，過(guò)夜反應(yīng)(73℃)。第二天洗去過(guò)量探針，膜用Kodak膠片曝光。內(nèi)部寡核苷酸為 1Actgcagaacgtggccaattatcttattggctcttt (SEQ ID NO1)； 1Bgtggagtactcagctaaaaggactcccaagaggg (SEQ ID NO2)； 1Dctctctttttcaaccacgtgaaaatcaagcttgct (SEQ ID NO3)； 1Eatctagatcacccaggagaacgtcagcagatctcta (SEQ ID NO4)； 1Fgagcagcaaagacattataccacaagagacaagcaa (SEQ ID NO5)； 2Atcggctcttttgtgtcatttttcattcccttaacca (SEQ ID NO6)； 2Bctcaacgcctaacatggttgactgtgtctacagttt (SEQ ID NO7)； 2Ctaactgacattttcaatacctccgatggtggacgct (SEQ ID NO8)； 3Agggagttcagcatggaaagcagtaactactatgcag (SEQ ID NO9)； 3Bttcaatctatcagcaactacctccaaactcaggacc (SEQ ID NO10)； 4caccattctttgtcaccaatattgtggatcctttc (SEQ ID NO11)； 5ctttttggctggggagagacgtactctgagg (SEQ ID NO12)； 6atcctcaacctctgcctcatcagcctggac (SEQ ID NO13)； 7tgaaaggaaaaacatctccatctttaagcgagaaca (SEQ ID NO14).
本文公開(kāi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下。
關(guān)于人淋巴細(xì)胞上5-HT受體特異性mRNAs的表達(dá)，本文公開(kāi)數(shù)據(jù)顯示隨活化過(guò)程進(jìn)行受體mRNA水平是否存在動(dòng)力學(xué)調(diào)控，而不是鑒別刺激48小時(shí)的細(xì)胞與靜息細(xì)胞上5-HT受體mRNA的存在與否。為進(jìn)行這些研究，在實(shí)驗(yàn)起始(0時(shí))用5μg/ml ConA處理細(xì)胞。時(shí)間點(diǎn)選擇為0、0.5、2、4、6、12、24及48小時(shí)。在每一時(shí)間點(diǎn)用1μg總細(xì)胞RNA制備寡-dT引發(fā)的文庫(kù)。這些寡-dT引發(fā)的文庫(kù)在擴(kuò)增14個(gè)5-HT受體中的每一個(gè)時(shí)作為模板?？寺〖皽y(cè)序各擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，用RNA印記雜交確認(rèn)產(chǎn)物的真實(shí)性，如本文其他部分所述用受體特異性的內(nèi)部寡核苷酸為探針。用基因組DNA擴(kuò)增作為陽(yáng)性對(duì)照；不經(jīng)反轉(zhuǎn)錄步驟的擴(kuò)增的RNA作為陰性對(duì)照以對(duì)照DNA污染。
圖16顯示此研究數(shù)據(jù)。印記上部及下部標(biāo)示多種樣品的時(shí)間點(diǎn)(刺激后小時(shí)數(shù))，各5-HT受體標(biāo)于印記左側(cè)?！癕”表示分子標(biāo)記帶。應(yīng)注意圖示2C 5-HT受體的數(shù)據(jù)不是DNA印記，而是溴乙錠染色膠，顯示PCR產(chǎn)物及陽(yáng)性對(duì)照都為預(yù)期大小。
圖16所示數(shù)據(jù)表示每一血清素受體特異性的信號(hào)所特有的協(xié)調(diào)的表達(dá)模式。沒(méi)有證據(jù)表明1F或3B 5-HT受體表達(dá)，重新設(shè)計(jì)相關(guān)引物仍是擴(kuò)增不出產(chǎn)物。延長(zhǎng)曝光時(shí)間會(huì)看到與3A受體相符的很弱但可重復(fù)性條帶。
關(guān)于1A及2A受體的數(shù)據(jù)，用取自不同個(gè)體的血及更長(zhǎng)的時(shí)間框架重復(fù)。1A型5-HT在受刺激54小時(shí)后出現(xiàn)。此時(shí)間點(diǎn)與試驗(yàn)峰值及活性開(kāi)始衰退的時(shí)間相符。用2輪PCR(每次25循環(huán))擴(kuò)增2A受體，檢測(cè)到預(yù)期大小的RT-PCR產(chǎn)物，而只作一次PCR(25循環(huán))時(shí)無(wú)法用DNA印記檢測(cè)到產(chǎn)物。其他試驗(yàn)數(shù)據(jù)中2A型5-HT表現(xiàn)為受調(diào)控帶(一受刺激后立即上調(diào)，且在細(xì)胞分裂前立即重現(xiàn))。這些數(shù)據(jù)表明2A型5-HT mRNA存在于淋巴細(xì)胞中。用DNA印記雜交驗(yàn)證2A 5-HT產(chǎn)物的身份。
進(jìn)一步，本文所公開(kāi)數(shù)據(jù)顯示了血清素能受體激動(dòng)劑及拮抗劑在人及鼠淋巴細(xì)胞中的藥理學(xué)行為。圖17顯示了系列1級(jí)特異性藥物對(duì)人淋巴細(xì)胞促細(xì)胞分裂刺激的結(jié)果，在鼠中觀察到相同結(jié)果?？傊?，觀測(cè)到相對(duì)1B型5-HT受體信號(hào)選擇性消減的驚人的應(yīng)答抑制。然而對(duì)1B及1D信號(hào)的同時(shí)抑制并不產(chǎn)生相同的抑制曲線(xiàn)，盡管兩種藥物對(duì)1B受體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)是相同的(5-HTR藥物詳見(jiàn)www.tocris.com)。
圖17數(shù)據(jù)表明多種藥物對(duì)攝取3H-胸腺嘧啶的效用。這應(yīng)該反映CD4+亞組細(xì)胞中DNA合成。因此，這些數(shù)據(jù)表示藥物在體外對(duì)輔助T細(xì)胞的效用。
最終，用CD8-依賴(lài)型異源抑制排斥模型進(jìn)行體內(nèi)研究，其中P815細(xì)胞(源于DBA小鼠肥大細(xì)胞瘤的快速生長(zhǎng)的細(xì)胞系)擴(kuò)增并用于在C57BL6小鼠中引起正常排斥應(yīng)答。在研究的第0天向小鼠腹腔注入5×106P815細(xì)胞。第一組為不處理對(duì)照組(首次用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物)，用于獲得小鼠抗異源刺激的基線(xiàn)應(yīng)答。陽(yáng)性對(duì)照為施以異源細(xì)胞但不作進(jìn)一步處理的小鼠。這些動(dòng)物用于評(píng)定對(duì)P815細(xì)胞產(chǎn)生的異源排斥應(yīng)答。
所有處理組在研究第14天處死，其脾細(xì)胞用于測(cè)定對(duì)P815細(xì)胞的靶特異性的殺滅(當(dāng)效應(yīng)器與靶的比率為100∶1時(shí)陽(yáng)性對(duì)照組的總體平均殺亡率為45％)。在研究第5及7天，用尾靜脈注射施用血清素特異性化合物(300μg/注射)。選擇給藥時(shí)間以確保藥物處理前T細(xì)胞已活化。
圖18A所示數(shù)據(jù)表示用單組處理鼠的代表性研究。試驗(yàn)讀數(shù)為靶細(xì)胞的氚標(biāo)記的脫氧胸腺嘧啶核苷的CPM滯留。換而言之，用脫氧胸腺嘧啶核苷放射性標(biāo)記細(xì)胞，并與效應(yīng)細(xì)胞一起孵育。如果這些細(xì)胞被活化的CTL裂解，則其CPM相應(yīng)減少。如本文公開(kāi)數(shù)據(jù)證明(圖18A)用美西麥角處理消除異源殺傷應(yīng)答。
圖18B顯示此種完全處理研究。第一個(gè)對(duì)照組用環(huán)孢菌素A(n＝3)慢性處理。以100μg/注射的劑量在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前2天通過(guò)靜脈注射施用環(huán)孢菌素A(CsA)，即從-2天起，并在實(shí)驗(yàn)期間每天都持續(xù)注射。環(huán)孢菌素A可有效地阻止T細(xì)胞引發(fā)活化應(yīng)答，它是目前用于治療移植過(guò)程中并發(fā)癥的可選用藥物之一。載體對(duì)照是用與血清素能藥物處理完全相同的方法處理的緩沖液。表中每一條形柱表示從一個(gè)動(dòng)物個(gè)體所得的數(shù)據(jù)。因此，可明顯看出環(huán)孢菌素A處理可阻止異源應(yīng)答，而載體處理沒(méi)有效用(如所預(yù)期)。如2B/2C型選擇性抑制劑(SB206553)的特性，美西麥角(部分1型激動(dòng)劑/2型拮抗劑)的抑制特性是驚人的。
基于用輔助性T細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)的驚人結(jié)果是從選擇性1B/1D抑制劑及選擇性的6型5-HT抑制劑所得的數(shù)據(jù)。1B/1D抑制劑是目前體外輔助性T細(xì)胞最有效的抑制劑，然而在體內(nèi)卻沒(méi)觀察到對(duì)CD8-依賴(lài)性應(yīng)答的明顯效用。還不清楚這是否因?yàn)?B/1D拮抗劑的生物利用度。此外，其他數(shù)據(jù)表明選擇性1B拮抗劑是CD8-依賴(lài)性異源移植應(yīng)答的有效抑制劑，這與本文所公開(kāi)體外數(shù)據(jù)相符。另一方面，6型抑制劑增強(qiáng)輔助性T細(xì)胞的體外增殖，但卻不能消除體內(nèi)CD8-依賴(lài)性異源移植應(yīng)答。
實(shí)施例3血清素在阻塞性氣道病(包括哮喘)中的作用本文所公開(kāi)數(shù)據(jù)首次充分證明過(guò)敏性哮喘應(yīng)答的免疫成份受一種已知神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)--血清素。以前并不知道血清素對(duì)免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用。本文所公開(kāi)數(shù)據(jù)表明血清素在免疫應(yīng)答中的作用為治療人哮喘病患者提供了一種新的治療方法。
神經(jīng)學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域的最新發(fā)展為神經(jīng)及免疫系統(tǒng)是在進(jìn)化歷史早期彼此分歧的這一觀點(diǎn)提供了有力的基礎(chǔ)。而且，本文其他部分所公開(kāi)數(shù)據(jù)表明血清素在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中起到關(guān)鍵的作用。這些數(shù)據(jù)表明血清素介導(dǎo)的信號(hào)為過(guò)敏性哮喘的免疫組分形成過(guò)程中的限速物。這一發(fā)現(xiàn)為治療人哮喘及其他多種阻塞性氣道病提供了新的治療方法。
一方面，本文公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了對(duì)樹(shù)突細(xì)胞及CD4+輔助性T5細(xì)胞亞群上的血清素特異性受體模式的識(shí)別。這些是參與發(fā)動(dòng)過(guò)敏性免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞。用RT-PCR鑒定細(xì)胞上有14種已知藥理不同的血清素能受體中的哪些。因?yàn)檠逅卦谝恍┚裾系K中起主要作用，如控制嘔吐、情感障礙的產(chǎn)生、控制偏頭痛相關(guān)的疼痛，所以在本領(lǐng)域以前已經(jīng)進(jìn)行了大量藥學(xué)研究，以期獲得可選擇性調(diào)節(jié)各5-HT受體的藥物群。因此，可用這些性質(zhì)明確的血清素受體特異性藥物來(lái)分析個(gè)別受體在樹(shù)突細(xì)胞介導(dǎo)的CD4+輔助性T細(xì)胞活化中起的作用，進(jìn)而鑒定在活化應(yīng)答產(chǎn)生過(guò)程中限速的特異性血清素能信號(hào)。此外，實(shí)驗(yàn)闡述了用體內(nèi)氣道高反應(yīng)性模型來(lái)檢驗(yàn)以前試驗(yàn)所鑒別的潛在治療藥物的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)有助于我們理解參與啟動(dòng)過(guò)敏性應(yīng)答的調(diào)節(jié)性過(guò)程，并為治療阻塞性氣道病患者提供了新的治療策略。本文所公開(kāi)策略可用于鑒別治療其他疾病或狀況的藥物，其中介導(dǎo)病理過(guò)程或應(yīng)答的細(xì)胞需要血清素介導(dǎo)的信號(hào)，因此可通過(guò)抑制信號(hào)治療。
本文公開(kāi)數(shù)據(jù)表明血清素為哮喘肺抗原遞呈中的潛在介質(zhì)。此外，免疫學(xué)近期發(fā)展使本領(lǐng)域人員意識(shí)到T細(xì)胞及抗原遞呈細(xì)胞的基本相互作用/通訊類(lèi)似于神經(jīng)突觸連接(近期綜述見(jiàn)Bromley等，2001，Annu.Rev.Immunol.19375-96.)。事實(shí)上，免疫系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)共有許多特性。例如最近已證實(shí)焦聚蛋白，一個(gè)在神經(jīng)肌肉連接中發(fā)現(xiàn)并已明確定性的糖蛋白，在免疫系統(tǒng)中是關(guān)鍵調(diào)節(jié)物(Khan等，2001，Science 2921681-1686)。Khan等認(rèn)為聚焦蛋白參與T細(xì)胞抗原受體復(fù)合物的聚集。
另一方面，最近證明I級(jí)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)，免疫應(yīng)答生成中已知的重要糖蛋白，在神經(jīng)聯(lián)合中起關(guān)鍵作用(Huh等，2000，Science 2902155-2159)。Huh等證明I級(jí)MHC在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及成熟過(guò)程中參與連接的活性依賴(lài)性重塑及可塑性。此外，現(xiàn)在知道L1神經(jīng)粘附蛋白是T細(xì)胞活化應(yīng)答中的重要蛋白(Balaian等，2000，Eur.J.Immunol.30938-43)。因其在“對(duì)抗及逃脫”(應(yīng)答中的貢獻(xiàn)而早被識(shí)別的主要神經(jīng)遞質(zhì)，如多巴胺及去甲腎上腺素，也通過(guò)在淋巴細(xì)胞中表達(dá)同源受體而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答(Santambrogio等，1993，J.Neuroimmunol.45113-119；Kohm和Sanders，2000，ImmunologyToday 21539-542；Saha等，2001，Neuroimmunomodulation923-33)。綜上所述，數(shù)據(jù)表明免疫及神經(jīng)系統(tǒng)在進(jìn)化時(shí)間線(xiàn)的早期點(diǎn)上相互分開(kāi)。此外，本文所公開(kāi)數(shù)據(jù)表明在啟動(dòng)免疫應(yīng)答過(guò)程中血清素起到限速的作用，表明肺樹(shù)突細(xì)胞表面血清素應(yīng)答受體的存在，并顯示了血清素在引發(fā)肺哮喘應(yīng)答中的重要調(diào)節(jié)作用。
當(dāng)遇到吸入抗原時(shí)，氣道的樹(shù)突細(xì)胞(DC)移動(dòng)到肺的引流淋巴結(jié)，上調(diào)共同刺激性配體，與原初CD4+淋巴細(xì)胞相互作用，引發(fā)原初免疫應(yīng)答(Wills-Karp，1999，Annu.Rev.Immunol.17255-81)。數(shù)據(jù)表明響應(yīng)于血清素能信號(hào)樹(shù)突細(xì)胞/淋巴細(xì)胞的相互作用被調(diào)節(jié)。盡管對(duì)樹(shù)突細(xì)胞上5-HT受體的存在與否所知甚少，本文公開(kāi)數(shù)據(jù)充分證明它們的存在。因此，用RT-PCR檢驗(yàn)樹(shù)突細(xì)胞血清素能受體的表達(dá)。本文公開(kāi)數(shù)據(jù)闡述未成熟小鼠髓樣樹(shù)突細(xì)胞在初始研究中的應(yīng)用。將不成熟細(xì)胞及在LPS及IL-4條件下成熟的樹(shù)突群中多種5-HT受體的mRNA水平進(jìn)行比較。此外，檢測(cè)了存在于靜息/原初及活化的CD4+輔助性T細(xì)胞群中的受體分布。本文前面其他部分公開(kāi)的人外周血淋巴細(xì)胞相關(guān)數(shù)據(jù)表明存在多種對(duì)活化信號(hào)(如Con A)應(yīng)答的不同的上調(diào)或下調(diào)的5-HT受體。
鑒別細(xì)胞上5-HT受體(們)，然后用合適的血清素能受體調(diào)節(jié)劑選擇性地靶向樹(shù)突細(xì)胞及CD4輔助性T細(xì)胞亞類(lèi)中的5-HT受體?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)(MLR)中用DC作為抗原遞呈細(xì)胞。除通過(guò)整合的3H-脫氧胸腺嘧啶核苷監(jiān)控DNA合成，也監(jiān)控1型及2型標(biāo)記的生成(分別為IL-12及IL-4)。
本文使用了卵白蛋白誘導(dǎo)的氣管高反應(yīng)性(AHR)體內(nèi)鼠模型。試驗(yàn)描述了在哮喘整體動(dòng)物模型中阻斷血清素能信號(hào)的效用。最終用關(guān)鍵5HT受體同類(lèi)系，在不同的AHR模式中也檢測(cè)了攜帶5HTR不同等位基因的小鼠。
本文前面其他部分公開(kāi)數(shù)據(jù)表明多種不同的血清素特異性受體存在于靜息淋巴細(xì)胞，并且其表達(dá)模式隨活化而改變。2C型5-HT受體產(chǎn)生的信號(hào)顯示為鼠及人CD4+輔助性T細(xì)胞及CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞活化的限速物。選擇性抑制1B/1D受體對(duì)人及鼠輔助性T細(xì)胞增殖有很強(qiáng)的效用，但對(duì)細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性無(wú)影響。另一方面，選擇性抑制6型5-HT受體有相反效用。
在哮喘應(yīng)答方面，樹(shù)突細(xì)胞是變態(tài)反應(yīng)最可能的抗原遞呈細(xì)胞。進(jìn)而，該細(xì)胞活化CD4+輔助性T細(xì)胞，誘導(dǎo)Th2-型應(yīng)答。本文其他部分公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)描述了DC及CD4+輔助性T細(xì)胞中血清素能受體的表達(dá)模式?；诒疚钠渌糠炙_(kāi)的數(shù)據(jù)，1B及1D型5-HT受體存在于CD4+T細(xì)胞，而不存在于CD8+T細(xì)胞亞群。數(shù)據(jù)表明活化和維持T細(xì)胞介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)必須有一種特異性5-HT信號(hào)。本文其他部分公開(kāi)數(shù)據(jù)表明通過(guò)選擇性撤消適當(dāng)?shù)氖荏w信號(hào)可誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞群中的凋亡，導(dǎo)致來(lái)自該貯庫(kù)的這些細(xì)胞的功能性缺失。這會(huì)打亂引發(fā)嗜曙紅細(xì)胞及肥大細(xì)胞脫粒的反饋通路，并導(dǎo)致哮喘應(yīng)答的“短路”。
5-HT受體在不成熟及成熟DC及CD4+輔助性T細(xì)胞亞類(lèi)中的分布，其負(fù)責(zé)在哮喘應(yīng)答中驅(qū)動(dòng)IL-4及IgE產(chǎn)生，這都已被詳細(xì)說(shuō)明。目前，還未見(jiàn)關(guān)于血清素特異性受體在上述類(lèi)型細(xì)胞中分布的數(shù)據(jù)。這是本文其他部分公開(kāi)數(shù)據(jù)的直接延伸，且為理解分別地引發(fā)CD4-依賴(lài)性或是CD8-依賴(lài)性的免疫應(yīng)答的信號(hào)過(guò)程提供了基礎(chǔ)。
如上所述，鑒定了在不成熟髓樣樹(shù)突細(xì)胞及在LPS及IL-4存在下或是在LPS及IL-12存在下成熟的樹(shù)突細(xì)胞中所表達(dá)的5HT受體，也鑒定了在CD4+輔助性T細(xì)胞中表達(dá)的受體。這些研究在BALBc小鼠中用陰性篩選技術(shù)富集樹(shù)突細(xì)胞集輔助性T細(xì)胞，所用試劑盒來(lái)自StemCell Technologies Inc(Vancouver，British Columbia)。對(duì)于樹(shù)突細(xì)胞群，從骨髓收集物中分離出鼠造血祖細(xì)胞(用股骨及脛骨)，用含5％FBS及1mM EDTA的PBS沖出。離心后，用含5％正常大鼠血清的沖洗培養(yǎng)基以5×107細(xì)胞/ml的濃度重懸成核細(xì)胞。4℃孵育15分鐘后，根據(jù)制造商操作手冊(cè)處理細(xì)胞懸浮液來(lái)富集樹(shù)突細(xì)胞前體(用StemSepTM試劑盒)。根據(jù)Pulendran等(1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 961036-1041)所述方法，將樹(shù)突前體細(xì)胞在1000單位/ml鼠重組GM-CSF中孵育5天。根據(jù)Pulendran等，1999年描述的方法使這些細(xì)胞成熟。
為CD4+T細(xì)胞富集，也用StemSepTM細(xì)胞分離系統(tǒng)根據(jù)廠商提供指導(dǎo)步驟操作。簡(jiǎn)而言之，處理過(guò)程中使用全鼠脾細(xì)胞懸浮液。鼠細(xì)胞制備時(shí)，用正常大鼠血清阻止與Fc受體的非特異性結(jié)合。原初T細(xì)胞純化時(shí)，先加入特異性生物素化的抗體。樣品在冰上孵育10-30分后，加入適當(dāng)?shù)牧馨图?xì)胞富集混合物(如CD8+，CD19+等)(冰上放置30分)，而后加入磁性膠體懸浮液(冰上放置30分)。孵育過(guò)程中，與四聚抗體結(jié)合的多余細(xì)胞偶聯(lián)到磁性珠上。而后將細(xì)胞-抗體復(fù)合物加到預(yù)處理過(guò)的分離柱上(內(nèi)部放有廠商提供的磁石)。用3X柱容積液洗脫，收集含目的細(xì)胞群的洗脫液。對(duì)多數(shù)細(xì)胞亞型來(lái)說(shuō)富集細(xì)胞的一般純度為90-99％。如必要，回收的富集細(xì)胞的純度在MCPHahnemann大學(xué)的核心流式細(xì)胞儀做FACS分析檢驗(yàn)。StemSepTM純化系統(tǒng)用于處理1.5×1010總細(xì)胞，因此可為構(gòu)建亞型特異性cDNA文庫(kù)提供足夠量的細(xì)胞。
用Qiagen RNAeasy小量抽提系統(tǒng)按廠商指導(dǎo)手冊(cè)提取總細(xì)胞RNA。用EtBr染色膠定RNA樣品量，且大約1微克RNA樣品用于cDNA合成。用Qiagen Reverse Transcriptase及寡T12-18引物按廠商指導(dǎo)手冊(cè)進(jìn)行cDNA合成。所得cDNA作為PCR反應(yīng)模板(用Sigma的Taq DNA聚合酶)，使用5-HT受體特異性的引物。PCR條件為95℃進(jìn)行45秒，61.5℃進(jìn)行45秒，72℃進(jìn)行45秒。35 PCR循環(huán)后在72℃延伸10分鐘。最終PCR產(chǎn)物用3％瓊脂糖膠電泳(TAE緩沖)。為進(jìn)一步鑒定，可用PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA印記雜交，用放射性標(biāo)記的受體特異性?xún)?nèi)部寡核苷酸為探針。
從瓊脂糖膠中將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)到HyBond膜上，按Current ProtocolsIn Molecular Biology所述進(jìn)行雜交反應(yīng)。簡(jiǎn)而言之，膜用6XSSC預(yù)封閉，含10X Denhardt溶液、0.5％SDS、1μg/ml多聚A、及100μg/ml的SS DNA。每一雜交反應(yīng)加20pmol放射性標(biāo)記探針，溫育過(guò)夜(73℃)。第二天洗去過(guò)量探針，且膜用Kodak膠片曝光。
對(duì)于一般cDNA文庫(kù)，一般需要0.5到2微克總細(xì)胞RNA。從鼠脾細(xì)胞回收的RNA從1×106細(xì)胞得約3.5微克(每350微克脾)。一只鼠的脾足以制成一種亞群細(xì)胞的cDNA文庫(kù)(因此完成本實(shí)驗(yàn)至少需7-10只鼠)。
在CD4+輔助性T細(xì)胞的體外活化中測(cè)定選擇性5-HT受體信號(hào)的功能依賴(lài)性。按上述方法純化來(lái)自C57BL/6J小鼠的成熟樹(shù)突細(xì)胞，并用于對(duì)BALBc鼠衍生的淋巴細(xì)胞進(jìn)行異源刺激。用3H-脫氧胸腺嘧啶核苷摻入新合成DNA鏈的多少來(lái)測(cè)定細(xì)胞活化。用ELISA檢測(cè)無(wú)細(xì)胞組織培養(yǎng)液上清中的IL-4及IL-12水平(R&D Systems，按廠商指導(dǎo)手冊(cè)操作)。
血清素能的激動(dòng)劑及抑制劑選自制造商(Tocris Cookson Inc.，Ellisville，MI)。在0時(shí)(試驗(yàn)開(kāi)始時(shí))或48小時(shí)時(shí)加入受體特異性的調(diào)節(jié)物。一般來(lái)說(shuō)，在起始活化信號(hào)傳遞及第一輪細(xì)胞分裂之間有2天的延遲。本文前面其他部分公開(kāi)數(shù)據(jù)表明是在試驗(yàn)t＝0或t＝48小時(shí)時(shí)加入藥物，其對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有本質(zhì)上不同的影響。測(cè)定的藥物加入的其他變量為在0時(shí)加入再在t＝2小時(shí)后洗去的藥物的效用。這對(duì)測(cè)試許多5-HT特異性激動(dòng)劑是尤為重要的。當(dāng)延遲接觸時(shí)大多數(shù)激動(dòng)劑使受體脫敏(導(dǎo)致明顯的抑制)。最初檢測(cè)的藥物濃度范圍為0.1、1、10及100微克。
收集BALBc小鼠(Jackson Laboratories)脾以獲得BALBc淋巴細(xì)胞。在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)液中搗碎脾(RPMI 1640培養(yǎng)基(GibcoBRL)，含2％胎牛血清(Sigma)、1％青霉素-鏈霉素(Sigma)及1％L-Glu(BioWhittaker))以獲得單個(gè)細(xì)胞懸浮液。細(xì)胞在1200RPM離心10分鐘，去除上清液。用ACK緩沖液(如Colligan等所述，1999，InCurrent Protocols in Immunology，3.1.3-3.1.5節(jié))裂解紅細(xì)胞(RBC)。在旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)基中重懸剩余細(xì)胞，并加載于尼龍毛柱以去除粘附細(xì)胞。細(xì)胞在柱上(5％ CO2，37℃)大約孵育2小時(shí)。用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)液洗脫非粘附細(xì)胞，離心，并在致敏(Sensitization)培養(yǎng)液(RPMI 1640培養(yǎng)液，含10％牛血清、1％青霉素-鏈霉素及1％L-Glu，□-MKE)中重懸。
基本按照Current Protocols in Immunology(3.12.6-3.12.7節(jié)，1999)所述進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)。也即，用來(lái)自C57/B6J鼠的富集的成熟的樹(shù)突細(xì)胞作刺激物。用來(lái)自BalbC/BYJ的原代淋巴細(xì)胞作效應(yīng)器。藥物預(yù)鋪于96孔U底板。所有實(shí)驗(yàn)條件至少測(cè)定3次。將培養(yǎng)于含10％FBS的RPMI培養(yǎng)液中的C57/B6細(xì)胞每孔鋪100,000個(gè)。200,000個(gè)BalbC/BYJ細(xì)胞鋪于刺激細(xì)胞之上，使終體積為200微升/孔。不含BalbC細(xì)胞或不含C57/B6細(xì)胞的做為背景對(duì)照。4天后每孔加入1microCi的氚標(biāo)記脫氧胸腺嘧啶核苷，并于12小時(shí)后收集。
試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)點(diǎn)用Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析，每對(duì)數(shù)據(jù)用Wilcoxon signed-rank檢驗(yàn)分析，用JMP Statistics Guide(SASInstitute Inc.，Cary，NC)進(jìn)行Student t檢驗(yàn)及Spearman rho校正。
最終，本文所述試驗(yàn)為體外異源刺激試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)提供了一種驗(yàn)證方法。BALBc鼠氣道高反應(yīng)性(AHR)模型用于檢測(cè)我們的藥物活性。一般來(lái)說(shuō)，用含卵白蛋白(OVA)的明礬免疫鼠兩個(gè)多星期來(lái)構(gòu)建此模型。這樣引發(fā)原發(fā)免疫應(yīng)答。在應(yīng)答高峰，用OVA噴霧驅(qū)動(dòng)肺中DC呈遞抗原并將應(yīng)答轉(zhuǎn)向Th2-型應(yīng)答。鼠一旦被致敏，用乙酰甲膽堿引發(fā)類(lèi)哮喘應(yīng)答。
Ro 04-6790，一種6型5HT受體選擇性拮抗劑。通過(guò)受體介導(dǎo)的信號(hào)可正偶聯(lián)到腺嘌呤環(huán)化酶上。因而，刺激6型5HT受體導(dǎo)致細(xì)胞cAMP增加，cAMP可阻斷T細(xì)胞活化途徑。拮抗此信號(hào)可緩解該阻斷并促進(jìn)免疫應(yīng)答。
1-(1-萘基)哌嗪為1類(lèi)5HT受體的選擇性激動(dòng)劑。這些受體可負(fù)偶聯(lián)到腺嘌呤環(huán)化酶上。刺激這些受體可引起細(xì)胞中cAMP水平的減低，從而輔助免疫應(yīng)答。
托泊西隆為3型5HT受體選擇性拮抗劑。刺激此受體輔助Ca2+流入細(xì)胞，從而推動(dòng)免疫應(yīng)答。拮抗此信號(hào)能阻礙活化應(yīng)答。
WAY 100635為1A型5HT受體選擇性拮抗劑。如前所述，1型受體負(fù)偶聯(lián)于腺嘌呤環(huán)化酶。體外，此藥可明顯抑制活化應(yīng)答。此藥的抑制作用在活化應(yīng)答前給藥時(shí)效果最顯著。
SB 206553為2B/2C型5HT選擇性拮抗劑。2型5HT受體與蛋白激酶C正偶聯(lián)。本文其他部分公開(kāi)的體外資料表明在活化應(yīng)答的任何時(shí)刻撤消2B/2C型5HT信號(hào)可引起增殖的即刻停止(不希望受任何理論限制，其顯而易見(jiàn)地是通過(guò)誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的途徑起作用)。
SB 242084為2C型5HT受體選擇性拮抗劑。選擇此化合物來(lái)確定阻斷2B及2C型受體而非只阻斷2C受體是否有任何優(yōu)勢(shì)。
PBS中的藥物以300微克/劑量的濃度通過(guò)尾靜脈注射給藥，該劑量和給藥途徑基于本文前面其他部分所公開(kāi)數(shù)據(jù)而定。一組鼠在給藥乙酰甲膽堿前3天施用該藥，另一組在給藥乙酰甲膽堿3小時(shí)后施用該藥。選擇給藥時(shí)間點(diǎn)以確保給藥時(shí)T細(xì)胞已完全活化。理想的是，去除活化的T細(xì)胞群會(huì)使免疫成分出現(xiàn)功能性缺口。研究主要分為4組。前2組各由3只鼠組成，作為載體對(duì)照。對(duì)于藥物處理組，每種藥用5只鼠，所以每組各包括30只鼠。每組的鼠數(shù)目用Mann-WhitneyU檢測(cè)分析，用Wilcoxon′s signed-rank檢測(cè)分析每對(duì)數(shù)據(jù)，用JMPStatistics Guide(SAS Institute Inc.，Cary，NC)進(jìn)行Student′st檢測(cè)及Spearman′s rho校正，以確保數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)顯著性。
按Brewer等(1999，Am.J.Respir.Crit.Care Med.1601150-1156)所述免疫BALBc小鼠，在兩周療程中兩次靜脈注射含OVA(10微克，Sigma Grade III，St.Louis，MO)及1mg Al(OH)3的0.2ml生理鹽水。第二次免疫7-10天后，將鼠暴露于6％wt/vol的氣霧OVA(用超聲霧化器傳輸)中。將鼠每天在氣霧變態(tài)反應(yīng)原中每天暴露60分鐘以形成氣管致敏。
用于檢測(cè)多種血清素受體亞型的RT-PCR引物在本文其他部分有述，按本文其他部分所述進(jìn)行RT PCR反應(yīng)。
在未成年孩子中哮喘的發(fā)病率及死亡率異常的高。不完全知道哮喘發(fā)病的遺傳及環(huán)境因素。已知ETS(吸煙環(huán)境)可引起哮喘的早期發(fā)病，是導(dǎo)致哮喘加重的危險(xiǎn)因子(Malveaux和Fletcher-Vincent，Environmental Health Perspectives，1995)。本文公開(kāi)數(shù)據(jù)有助與在本領(lǐng)域認(rèn)可的人類(lèi)哮喘的鼠模型中研究遺傳因素，此模型與人類(lèi)哮喘有許多共性，可用其了解已知的重要基因產(chǎn)物在轉(zhuǎn)導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)性信號(hào)到淋巴細(xì)胞過(guò)程中所起的作用，以及其轉(zhuǎn)導(dǎo)支氣管收縮信號(hào)到肺平滑肌中所起作用。此哮喘鼠模型系統(tǒng)受小鼠遺傳背景影響很大，并因此可說(shuō)明此病不論在鼠還是最終在人中的發(fā)生都必需的遺傳成份。
用鼠作為模型系統(tǒng)，可在數(shù)種遺傳處理的動(dòng)物中測(cè)定暴露于變應(yīng)原中的變應(yīng)性及妨礙性后果。所得數(shù)據(jù)可揭示組胺在變應(yīng)原敏感最初階段中的作用，也可揭示組胺在長(zhǎng)期二級(jí)應(yīng)答中的作用?？紤]到哮喘在兒童中的發(fā)病率，例如哮喘現(xiàn)在是貧困城市鄰近地區(qū)有色人種孩童缺課的主要原因(Kinney等，2002，Am.J.Public Health9224-26)，更好的理解變應(yīng)原致敏初始階段及后續(xù)氣管疾病可為藥品研制提供新的靶點(diǎn)，或是至少可改進(jìn)對(duì)這類(lèi)疾病的治療時(shí)機(jī)。因?yàn)榕c其他藥相比抗組胺藥對(duì)改性晚期哮喘癥狀的效用較弱，所以它們對(duì)疾病初始期可能比較敏感；最好在可控制遺傳操作及誘導(dǎo)攝入的動(dòng)物模型中研究這些效用。
實(shí)施例4多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中與血清素受體相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤(MM)是美國(guó)第二大常見(jiàn)惡性血液病，每年會(huì)診斷出15,000新病例。此病為漸進(jìn)性的并通常致死，占惡性白細(xì)胞疾病死亡的15％，占西方國(guó)家所有癌癥死亡的2％。盡管多發(fā)性骨髓瘤病理生理取得了顯著的進(jìn)展，但此病的分子機(jī)制仍不清楚。
臨床上，多發(fā)性骨髓瘤表示為B-細(xì)胞腫瘤，以惡性漿細(xì)胞的骨髓浸潤(rùn)為特征，惡性漿細(xì)胞分泌單克隆免疫球蛋白碎片。患者通常表現(xiàn)為多位點(diǎn)溶骨損傷，其后伴有高血鈣，因?yàn)楣撬枇黾?xì)胞既可刺激破骨細(xì)胞的骨重吸收又可抑制其重塑。該疾病本身發(fā)展分為三個(gè)不同階段惰性階段，其中主要為成熟、不增殖的惡性細(xì)胞；活性階段，其中出現(xiàn)少量較少分化的、增生的的漿母細(xì)胞；和暴發(fā)期，其中不成熟漿母細(xì)胞的髓外大量增殖。這些不同疾病期的存在支持近期關(guān)于多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病機(jī)理為逐步惡性轉(zhuǎn)化的理論。
事實(shí)上幾乎所有MM病例都可檢測(cè)到核型改變，易位最常涉及免疫球蛋白重鏈位點(diǎn)與多種伴侶基因的違規(guī)開(kāi)關(guān)重整。此病也涉及癌基因(c-myc，ras)、腫瘤抑制基因(p16，p15)及細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)物(BCL-2，F(xiàn)as)異常表達(dá)，因其參與事件的復(fù)雜級(jí)聯(lián)過(guò)程，所以認(rèn)為對(duì)濾泡中心B-細(xì)胞向惡性漿母細(xì)胞克隆的轉(zhuǎn)化起作用。
認(rèn)為生成骨髓瘤細(xì)胞的原初克隆為后發(fā)育中心B-細(xì)胞(post-germinal center B-cell)。大量高突變重排免疫球蛋白基因的表達(dá)表明初始至癌事件的發(fā)生在長(zhǎng)生漿細(xì)胞分化之后或是不干涉正常長(zhǎng)生漿細(xì)胞分化。多發(fā)性骨髓瘤的驚人特性為在疾病的主要病程期內(nèi)轉(zhuǎn)化的漿母細(xì)胞傾向于居留于骨髓中，其中微環(huán)境可提供適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子(也即IL-6及IL-10)及緩慢分裂的腫瘤細(xì)胞群的生長(zhǎng)及存活所需的粘附分子。然而，在疾病的暴發(fā)期，骨髓瘤細(xì)胞變?yōu)榛|(zhì)非依賴(lài)性的，并且其后接著發(fā)生漿母細(xì)胞的大量髓外增殖。
MM是異質(zhì)性疾病，在生物學(xué)、預(yù)后、臨床過(guò)程及個(gè)體患者對(duì)治療介入的反應(yīng)方面都不同。理解導(dǎo)致穩(wěn)定惡性漿細(xì)胞群生成的事件，以及理解驅(qū)使細(xì)胞群克隆擴(kuò)增的信號(hào)和細(xì)胞擺脫基質(zhì)依賴(lài)性成為髓外疾病所需的因素對(duì)理解疾病進(jìn)程的主要機(jī)制都是至關(guān)重要的。
如果MM細(xì)胞可擺脫基質(zhì)依賴(lài)性且向骨髓外克隆擴(kuò)增，那么這些細(xì)胞必定自身生成生存及擴(kuò)增所需所有元素。此外，如果這些細(xì)胞仍依賴(lài)血清素能信號(hào)通路，那么MM細(xì)胞很可能已有能力合成及釋放它們自身的血清素。本文公開(kāi)數(shù)據(jù)為治療MM患者提供了新的療法，其中用5HT拮抗劑突然性消減MM細(xì)胞組成型活化所需的重要信號(hào)(血清素能信號(hào))，從而誘導(dǎo)凋亡。
總而言之，MM是成熟(終末分化的)B細(xì)胞的癌性狀況。此類(lèi)B細(xì)胞正常情況下應(yīng)存在于循環(huán)系統(tǒng)。MM的特點(diǎn)之一為這些(癌性)B細(xì)胞回到骨髓，并在那里導(dǎo)致實(shí)質(zhì)性損害。不希望受任何理論的限制，形成“發(fā)育完全的”癌細(xì)胞的過(guò)程是以斷續(xù)步驟發(fā)生的。當(dāng)B細(xì)胞癌在受害個(gè)體中形成時(shí)，癌性B細(xì)胞發(fā)育成不依賴(lài)其局部環(huán)境的存活模式。目前，除骨髓移植外沒(méi)有有效治療MM患者的方法。多數(shù)患者開(kāi)始都對(duì)皮質(zhì)類(lèi)固醇類(lèi)治療物(如氟美松)有反應(yīng)，但幾乎所有案例中，該病對(duì)這些藥物形成完全耐藥性。多數(shù)情況下，診斷為多發(fā)性骨髓瘤就等同于死亡宣言。本文公開(kāi)的方法研究了該種細(xì)胞的生長(zhǎng)非依賴(lài)性，并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期應(yīng)答需要經(jīng)由血清素受體的信號(hào)，因此抑制此信號(hào)可使細(xì)胞死亡。
也即是說(shuō)，結(jié)合本領(lǐng)域近期進(jìn)展，本文其他部分公開(kāi)數(shù)據(jù)充分表明免疫及神經(jīng)系統(tǒng)在進(jìn)化發(fā)育早期相互分開(kāi)。此外，免疫相關(guān)細(xì)胞的活化通路表現(xiàn)為依賴(lài)血清素誘導(dǎo)的信號(hào)。因此，這些資料表明，不希望受任何理論限制，既然癌細(xì)胞不能依賴(lài)外源血清素，那么它們必定會(huì)啟動(dòng)合成其自身血清素的機(jī)制。已知所有活化和增殖細(xì)胞為維持其完整性需依賴(lài)生長(zhǎng)/活化相關(guān)信號(hào)的精確性及時(shí)限性。突然撤消限速信號(hào)，尤其是癌細(xì)胞中的信號(hào)，會(huì)引起程序細(xì)胞死亡通路(凋亡)的活化?；诒疚墓_(kāi)數(shù)據(jù)，且不希望受任何理論限制，三種最可能的限速信號(hào)源(因此為三個(gè)最可能的靶點(diǎn))為5HT1、5HT2和/或5HT4受體。通過(guò)使用這些受體信號(hào)的選擇性、非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑(或拮抗劑的混合劑)來(lái)撤消這些信號(hào)，從而可檢測(cè)對(duì)MM細(xì)胞的效用。
以下實(shí)驗(yàn)證明多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞(惡性漿細(xì)胞)在體外系統(tǒng)中對(duì)血清素(5-HT)誘導(dǎo)的信號(hào)的依賴(lài)性。人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系，RPMI8226，是所用的體外系統(tǒng)。起初，用評(píng)估細(xì)胞存活及增殖來(lái)監(jiān)控多種5-HT受體調(diào)節(jié)劑對(duì)培養(yǎng)基中RPMI 8226細(xì)胞的效用。一旦鑒別出影響骨髓瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)及存活的化合物，即設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究其機(jī)制，由此一些受體調(diào)節(jié)劑會(huì)誘導(dǎo)RPMI 8266細(xì)胞死亡。具體來(lái)說(shuō)，分析受影響的細(xì)胞的凋亡特性(形態(tài)學(xué)、DNA碎片及細(xì)胞外磷脂酰絲氨酸表達(dá))。
如本文公開(kāi)數(shù)據(jù)表明，已明白骨髓瘤細(xì)胞依賴(lài)于經(jīng)由血清素受體的信號(hào)。最引人注意的是撤消1B型5-HT受體信號(hào)的功效。當(dāng)缺少來(lái)自1B型5HT受體信號(hào)時(shí)，骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生劇烈的細(xì)胞死亡。形態(tài)學(xué)上，細(xì)胞死亡與傳統(tǒng)的凋亡不同，凋亡時(shí)細(xì)胞固縮、核凝聚且形成膜泡。反之，撤消1B型5-HT信號(hào)，細(xì)胞劇烈膨脹、破裂且3小時(shí)內(nèi)培養(yǎng)物100％死亡。然而，進(jìn)一步分析后，這些細(xì)胞顯示典型的和/或與凋亡相關(guān)的特性(如，核小體間(internucleosomal)DNA斷裂和細(xì)胞表面磷脂酰絲氨酸表達(dá))。因而這些數(shù)據(jù)表明撤消血清素信號(hào)經(jīng)由凋亡和/或凋亡樣過(guò)程介導(dǎo)細(xì)胞死亡。
細(xì)胞系人漿細(xì)胞瘤(多發(fā)性骨髓瘤)細(xì)胞系，RPMI 8226(American TypeCulture Collection，Manassas，VA)在RPMI 1640培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)基含10mM HEPES、1mM丙酮酸鈉、4.5g/L葡萄糖、1.5g/L碳酸氫鹽及20％FBS(非熱失活的)。
細(xì)胞增殖測(cè)定用三種方法檢測(cè)細(xì)胞增殖——用錐蟲(chóng)藍(lán)排除術(shù)定量培養(yǎng)基中存活的細(xì)胞數(shù)；用3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴(MTT)測(cè)定線(xiàn)粒體活性(從而測(cè)定細(xì)胞生存力)；用3H-脫氧胸腺嘧啶核苷的攝入測(cè)定活性DNA合成。
5-HT受體調(diào)節(jié)體外試驗(yàn)測(cè)試以下5-HT受體調(diào)節(jié)化合物在指定濃度范圍內(nèi)對(duì)體外培養(yǎng)的、具有所述密度并跨所述濃度范圍的RPMI 8226細(xì)胞的效用。
表2
DNA斷裂實(shí)驗(yàn)處理后用冰冷過(guò)的PBS洗滌細(xì)胞(8×105)，離心沉淀(500×g，5min)。細(xì)胞沉淀在冰上用裂解緩沖液(1％ IGEPAL-CA630、20mM EDTA、50mM Tris-HCL、pH7.5)孵育5分。裂解物在1,600×g離心5分鐘。上清加50μL裂解緩沖液。提取物加1％SDS并用5μg/μLRnase A(57℃)處理2小時(shí)之后用2.5μg/μL蛋白酶K處理2小時(shí)(37℃)。RNA及蛋白消化后，加入一半體積的10M醋酸銨并用2.5體積的乙醇沉淀DNA，用70％乙醇洗，空氣干燥，并在TE緩沖液中溶解。用1.5％瓊脂糖膠電泳分離DNA片段，按Siegel等(1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95162-166)所述步驟進(jìn)行。
流式細(xì)胞分析通過(guò)共染先前暴露于每一實(shí)驗(yàn)條件的細(xì)胞檢測(cè)早期凋亡的細(xì)胞。簡(jiǎn)而言之，按本文其他部分詳述的，將細(xì)胞在每種試驗(yàn)的或?qū)φ盏牡蛲稣T導(dǎo)劑的不同濃度下孵育一段時(shí)間。孵育后，用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞、用膜聯(lián)蛋白V-Alexa粉488和PI(Molecular Probes，Eugene，OR)染色、用雙色流式細(xì)胞分析儀分析。認(rèn)為膜聯(lián)蛋白V+及PI-細(xì)胞被認(rèn)為是早期凋亡細(xì)胞。已知骨髓瘤細(xì)胞終末分化劑，HMBA(環(huán)六亞甲基-雙-乙酰胺)及拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，camtothecin，為凋亡的陽(yáng)性對(duì)照，分別為5mM及2μM。
用三個(gè)獨(dú)立指標(biāo)研究5-HT受體調(diào)節(jié)劑對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系(RPMI 8266)的效用。以4種不同密度鋪板細(xì)胞，且再用不同濃度的LY53587(2A/2B/2C型5-HT受體的拮抗劑)處理。用錐蟲(chóng)藍(lán)染料排除術(shù)作為鑒定細(xì)胞生存力的指標(biāo)。對(duì)應(yīng)所加藥物濃度繪細(xì)胞數(shù)曲線(xiàn)。
MTT還原也是檢測(cè)細(xì)胞生存力的指標(biāo)(具體來(lái)說(shuō)為線(xiàn)粒體活性)。而后對(duì)應(yīng)藥物濃度繪OD570吸收值曲線(xiàn)。最終用測(cè)定3H-脫氧胸腺嘧啶核苷攝入量評(píng)測(cè)DNA合成，并對(duì)應(yīng)藥物濃度繪每分計(jì)數(shù)(CPM)曲線(xiàn)。所有三種分析方法都產(chǎn)生清晰的量效曲線(xiàn)。此外，曲線(xiàn)形狀不依賴(lài)于所用測(cè)定方法(也即，在測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞群效用的試驗(yàn)中沒(méi)有一種方法優(yōu)于其他方法)(見(jiàn)圖19A、19B及20A-D)。
用3H-脫氧胸腺嘧啶核苷攝入測(cè)定DNA合成來(lái)檢測(cè)拮抗劑對(duì)不同2型5-HT受體亞型的效用(圖21)。
也分析了其他多種5-HT受體調(diào)節(jié)化合物對(duì)RPMI-8226細(xì)胞的效用。用脫氧胸腺嘧啶核苷攝入作為DNA合成標(biāo)記，再次測(cè)定細(xì)胞增殖。圖22表示每種5-HT受體拮抗劑或激動(dòng)劑的效果，用相對(duì)載體處理的對(duì)照的增殖百分比表示。1B型5-HT受體拮抗作用在很寬的濃度范圍內(nèi)對(duì)骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生顯著的抑制作用。與單獨(dú)的1B型5-HT拮抗劑相比，用1B/1D型5-HT特異性拮抗劑處理細(xì)胞，其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效率較低。
檢測(cè)了多種5-HT受體激動(dòng)劑及拮抗劑對(duì)人多發(fā)性骨髓瘤RPMI8266細(xì)胞的低劑量滴定(圖23、24及25)。如數(shù)據(jù)所示，低劑量高選擇性的1B型5-HT拮抗劑(SB216641)可完全抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，用美賽西平(通用的1、2、6及7型5-HTR拮抗劑)或高選擇性2C 5-HT拮抗劑(SB 242084)可觀察到對(duì)生長(zhǎng)的強(qiáng)效抑制作用。因此，本文公開(kāi)數(shù)據(jù)清楚表明可通過(guò)選擇性撤消1B型5-HT受體信號(hào)或2C型5-HT受體信號(hào)來(lái)抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
進(jìn)一步探討了撤消5-HT受體信號(hào)如何誘導(dǎo)RPMI 8266細(xì)胞死亡的機(jī)制。具體來(lái)說(shuō)，檢測(cè)了當(dāng)1B/D型5-HT信號(hào)撤消時(shí)發(fā)生的細(xì)胞死亡過(guò)程中是否存在凋亡的任何特征事件。如錐蟲(chóng)藍(lán)排除細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)所示，測(cè)定了已知誘導(dǎo)RPMI 8266細(xì)胞系死亡的5-HT受體拮抗劑對(duì)引起死亡細(xì)胞核小體間斷裂的能力。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于圖26中。本文公開(kāi)數(shù)據(jù)表明終末分化物，HMBA(環(huán)六亞甲基-雙-乙酰胺)(已知誘導(dǎo)約30％的骨髓瘤細(xì)胞凋亡)只顯示很弱的DNA梯。然而，用對(duì)1B/D、2A/B/C及2B/C受體特異性的藥物撤消5-HT受體信號(hào)可產(chǎn)生清晰的DNA梯，且用某些化合物在僅24小時(shí)就可出現(xiàn)。
用5-HT(1A)、5-HT(1B)及5-HT(1B/D)拮抗劑處理后再用膜聯(lián)蛋白V及PI共染色的細(xì)胞也用來(lái)鑒定撤消信號(hào)引起的細(xì)胞死亡。膜聯(lián)蛋白V與磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合，磷脂酰絲氨酸為只在存活的細(xì)胞內(nèi)膜小葉表達(dá)的膜脂。然而，凋亡時(shí)，磷脂酰絲氨酸不再存在于內(nèi)膜小葉處，因而可作為凋亡早期事件之一的指標(biāo)。另一方面，PI染料只有在膜損傷時(shí)才進(jìn)入胞漿及核，這是細(xì)胞凋亡晚期或壞死時(shí)才發(fā)生的事件。因此，可用雙標(biāo)流式細(xì)胞分析來(lái)鑒定膜聯(lián)蛋白+但PI-的細(xì)胞群，表明此類(lèi)細(xì)胞是由于凋亡至死。
本文公開(kāi)流式細(xì)胞分析數(shù)據(jù)清楚表明在試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)當(dāng)用(1B)5-HT拮抗劑處理RPMI-8266細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞以劑量和時(shí)間依賴(lài)的方式發(fā)生凋亡，而當(dāng)使用(1A)5-HT或(1B/D)5-HT特異性拮抗劑處理時(shí)卻沒(méi)有此類(lèi)現(xiàn)象(圖27)。也即，用1B/D型拮抗劑對(duì)細(xì)胞的處理引起膜聯(lián)蛋白染色細(xì)胞的變換。進(jìn)一步處理表明PI染色細(xì)胞增加，說(shuō)明細(xì)胞不僅死亡而且還溶解或壞死。
本文公開(kāi)數(shù)據(jù)(如圖28及29)結(jié)論性表明撤消多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中1B型5-HT受體信號(hào)(圖28)或2C型5-HT受體信號(hào)(圖29)可導(dǎo)致典型細(xì)胞凋亡，如顯微照片中所示的濃縮及斷裂的核染質(zhì)結(jié)構(gòu)所證明的。結(jié)果表明RPMI-8266細(xì)胞的生長(zhǎng)需要通過(guò)5HT(1B)及5HT(2C)兩個(gè)受體的信號(hào)，用特異性5HT受體拮抗劑，即SB 242084(2C)或SB 216641(1B)撤消這兩受體中任何一種受體信號(hào)都誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡，其效果可與拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑喜樹(shù)堿的誘導(dǎo)效果相當(dāng)。然而，這兩種化合物所誘導(dǎo)凋亡的程度及時(shí)間進(jìn)程都不同。數(shù)據(jù)表明，不希望受任何理論限制，可能這兩種血清素受體亞型誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制不同。
本文公開(kāi)數(shù)據(jù)充分表明惡性漿細(xì)胞依賴(lài)于5-HT受體傳導(dǎo)的信號(hào)，撤消不同受體的信號(hào)可產(chǎn)生明顯不同的應(yīng)答。此外，抑制單一受體的信號(hào)與抑制多個(gè)受體組合的信號(hào)的反應(yīng)不同。抑制經(jīng)由惡性漿細(xì)胞5-HT受體轉(zhuǎn)導(dǎo)的必須信號(hào)可作為治療多發(fā)性骨髓瘤的有效方法，在本發(fā)明前本領(lǐng)域還未有對(duì)此疾病的有效療法。
此外，本文其他部分公開(kāi)數(shù)據(jù)清楚表明血清素能信號(hào)參與或介導(dǎo)多種細(xì)胞進(jìn)程。更具體的，數(shù)據(jù)表明阻斷5-HTR1B或1B/1D受體介導(dǎo)細(xì)胞系(RPMI 8226)的凋亡，RPMI 8226為本領(lǐng)域認(rèn)可的多發(fā)性骨髓瘤模型。因此，本發(fā)明包括影響細(xì)胞進(jìn)程的方法，如(但不限于)細(xì)胞增殖及凋亡。因?yàn)槿绫疚乃?，多種非神經(jīng)細(xì)胞在其表面都有血清素受體，當(dāng)從信號(hào)傳遞中阻斷對(duì)細(xì)胞生存關(guān)鍵的血清素能信號(hào)時(shí)，細(xì)胞受到影響，最終，5HTR信號(hào)的減少會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
因此，本發(fā)明提供通過(guò)抑制血清素信號(hào)傳遞(這些信號(hào)正常情況下是由細(xì)胞表面血清素受體傳遞的)介導(dǎo)目的靶細(xì)胞死亡或抑制其生長(zhǎng)的有效方法。相應(yīng)的，可用本領(lǐng)域熟知方法和/或本文所授方法來(lái)鑒定目的細(xì)胞上血清素受體的存在。此外，如本文在RPMI8266細(xì)胞中所示，可檢測(cè)是否撤消對(duì)細(xì)胞的血清素信號(hào)會(huì)對(duì)細(xì)胞有害，而且可用多種血清素信號(hào)抑制劑特異性抑制信號(hào)，從而殺死細(xì)胞或抑制其功能、生長(zhǎng)和/或分裂，但卻不影響其他不表達(dá)血清素受體或表達(dá)與靶細(xì)胞不同的血清素受體的細(xì)胞。
本文其他部分公開(kāi)的驚人結(jié)果在以前的研究中未曾有提及，這可能是因?yàn)?，不希望受任何理論限制，以前相關(guān)于血清素能信號(hào)的研究是在神經(jīng)及/肌肉細(xì)胞中進(jìn)行的，這些細(xì)胞不生長(zhǎng)或分裂也不進(jìn)行細(xì)胞周期。盡管用5-HTR拮抗劑接觸肌肉及神經(jīng)細(xì)胞會(huì)介導(dǎo)細(xì)胞去極化，而抑制血清素能信號(hào)對(duì)細(xì)胞周期過(guò)程的影響，包括其影響免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，是完全沒(méi)有預(yù)料、沒(méi)有先例且從未觀察到的。因此，細(xì)胞增殖和/或生存需要經(jīng)由細(xì)胞表面血清素受體的信號(hào)的此發(fā)現(xiàn)為其中抑制含血清素受體的細(xì)胞的生長(zhǎng)可有助于治療的疾病或狀況的治療劑開(kāi)發(fā)提供了一個(gè)重要的新工具。
實(shí)施例5抑制經(jīng)血清素受體的血清素信號(hào)傳遞所介導(dǎo)的細(xì)胞改變的相關(guān)試驗(yàn)本文其他部分公開(kāi)數(shù)據(jù)首次表明抑制經(jīng)血清素受體的血清素信號(hào)傳遞可誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)或與細(xì)胞可測(cè)變化相關(guān)。具體來(lái)說(shuō)，用某些血清素拮抗劑接觸細(xì)胞可改變細(xì)胞形態(tài)和/或引起其他物理特性變化，這可用多種本領(lǐng)域已知方法檢測(cè)，包括光學(xué)顯微鏡術(shù)。
簡(jiǎn)而言之，用5-HTR拮抗劑(如，選擇性的1B型抑制劑，SD 216641)孵育細(xì)胞，24小時(shí)后檢測(cè)處理效果?？蓹z測(cè)到細(xì)胞形態(tài)變化，如細(xì)胞大小增加(圖30)。這些數(shù)據(jù)表明可用本領(lǐng)域已知方法或?qū)?lái)出現(xiàn)的方法通過(guò)測(cè)定細(xì)胞形狀、形態(tài)之類(lèi)的變化來(lái)評(píng)定血清素信號(hào)的抑制效果。例如，可用光學(xué)設(shè)備(電及光學(xué)顯微鏡及熒光活化的細(xì)胞分選等)評(píng)定對(duì)細(xì)胞變化的檢測(cè)，或是用任何其他設(shè)備檢測(cè)及評(píng)定細(xì)胞大小、密度、形態(tài)之類(lèi)的改變。這些儀器為本領(lǐng)域所熟知的，所以不在此處詳述。
實(shí)施例6血清素受體拮抗劑氟奮乃靜對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡等的效用如本文其他部分公開(kāi)數(shù)據(jù)所示，抑制經(jīng)由血清素受體的信號(hào)傳遞可在可檢測(cè)水平改變細(xì)胞功能及活性。也即，用血清素受體信號(hào)抑制劑接觸細(xì)胞可改變其生理進(jìn)程如(但不限于)增殖及凋亡。這些細(xì)胞生理進(jìn)程的變化可用本領(lǐng)域接受的方法識(shí)別及測(cè)定，如本文公開(kāi)方法，包括(但不限于)細(xì)胞增殖試驗(yàn)、膜聯(lián)蛋白V及PI染色、熒光活化的細(xì)胞分選、DNA梯等。
如本文其他部分所述，多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種致命疾病，目前許多療法，如皮質(zhì)類(lèi)固醇療法，都無(wú)法治愈。骨髓移植是唯一的可存活治療方法，但象其他所有移植術(shù)一樣，捐贈(zèng)者骨髓的可用性及適宜性是其限制因素。如本文公開(kāi)數(shù)據(jù)所證明的，用血清素受體拮抗劑氟奮乃靜(其為5-HT(1B/1D)、5-HT(2C)及D2血清素受體特異性拮抗劑)處理MM細(xì)胞可顯著的減少M(fèi)M細(xì)胞增殖能力，且與不用該化合物接觸的對(duì)照細(xì)胞相比其凋亡率增加。因此，數(shù)據(jù)證實(shí)了一種新方法，可用來(lái)抑制含5-HT(1B/1D)、5-HT(2C)及D2型血清素受體細(xì)胞的增殖及啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，此類(lèi)細(xì)胞包括MM細(xì)胞。另外，此效用有助于調(diào)節(jié)動(dòng)物的免疫應(yīng)答以及治療瘤形成、移植排斥和自身免疫疾病(如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及多發(fā)性硬化癥)及其他由含5HT1B/1C受體的細(xì)胞(如B和T細(xì)胞)介導(dǎo)的疾病。
氟奮乃靜也叫做Proloxin或鹽酸氟奮乃靜，可從Schering-Plough(Kenilworth，NJ)及Mylan Laboratories(Pittsburgh，PA)等廠商獲得。氟奮乃靜最初是做為抗精神病藥及拮抗5-HT(1B/1D)、5-HT(2C)及D2血清素受體藥銷(xiāo)售。
RPMI-8226細(xì)胞為源于多發(fā)性骨髓瘤(MM)患者的細(xì)胞系。所有RPMI-8226細(xì)胞按本文其他部分所述獲得并在細(xì)胞培養(yǎng)基中增殖。
為檢測(cè)氟奮乃靜及其他藥物對(duì)RPMI-8266細(xì)胞的抗增殖效用，在多種藥物存在或不存在的條件下通測(cè)定過(guò)氚標(biāo)記脫氧胸腺嘧啶核苷的攝入來(lái)評(píng)定細(xì)胞增殖。簡(jiǎn)而言之，將RPMI-8226細(xì)胞鋪板并用氟西汀、溴隱亭、丁螺環(huán)酮、氯丙嗪、氯氮平、二氫麥角堿甲磺酸鹽、非諾多泮甲磺酸鹽、氟奮乃靜、氟哌啶醇和馬來(lái)酸甲基麥角新堿在0.1、1、5、10、25及50μM的濃度中處理。細(xì)胞培養(yǎng)和藥及3H-脫氧胸苷的施用如本文其它部分所述實(shí)驗(yàn)都重復(fù)三次，各數(shù)據(jù)點(diǎn)取平均值用每分計(jì)數(shù)(CPM)測(cè)定DNA合成，而后根據(jù)藥物濃度繪曲線(xiàn)。如本文公開(kāi)數(shù)據(jù)所示，氟奮乃靜形成清晰的量效曲線(xiàn)，且EC50為5-10μM時(shí)抑制RPMI-8226細(xì)胞增殖(圖31和32)。
如下實(shí)驗(yàn)證明氟奮乃靜對(duì)RPMI-8266細(xì)胞的體外凋亡作用。如本文其他部分所述，可用膜聯(lián)蛋白V和PI染色及DNA梯分析來(lái)鑒定是否血清素受體拮抗劑誘導(dǎo)凋亡。凋亡的兩個(gè)特征為細(xì)胞DNA核小體間斷裂及細(xì)胞表面磷脂酰絲氨酸外化。
用本文其他部分所述方法，在所述的用氟奮乃靜、SB216641(5HT-1BR拮抗劑)、喜樹(shù)堿(拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑；凋亡對(duì)照)處理細(xì)胞后，從RPMI-8226細(xì)胞中抽提基因組DNA。如本文其他部分所述，用本領(lǐng)域熟知凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)DNA梯程度。與對(duì)照細(xì)胞提取物相比用SB216641及氟奮乃靜處理的RPMI-8226細(xì)胞的DNA梯增多(圖35)。
如本領(lǐng)域所熟知和如本文其他部分所述，可用膜聯(lián)蛋白-V與細(xì)胞表明磷脂的結(jié)合來(lái)測(cè)定凋亡細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸的外化。因此，可用測(cè)定膜聯(lián)蛋白-V陽(yáng)性及PI染色(壞死細(xì)胞)陰性細(xì)胞來(lái)評(píng)估細(xì)胞群凋亡程度。細(xì)胞如本文其他部分所詳述培養(yǎng)及染色，用氟奮乃靜在所示濃度及時(shí)間處理。凋亡程度通過(guò)分析流式細(xì)胞數(shù)據(jù)及生成FACS圖檢測(cè)，通過(guò)控制使其只包括PI陰性細(xì)胞(非壞死細(xì)胞)。而后測(cè)定PI陰性細(xì)胞中的膜聯(lián)蛋白-V陽(yáng)性細(xì)胞水平來(lái)測(cè)量凋亡(圖34)。數(shù)據(jù)證明氟奮乃靜處理的細(xì)胞比其他任何對(duì)照細(xì)胞群的凋亡程度都明顯加大，因而可得結(jié)論為用氟奮乃靜處理多發(fā)性骨髓瘤患者衍生的細(xì)胞系(RPMI-8266)可通過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)物中程序性細(xì)胞死亡來(lái)減低細(xì)胞增殖能力。
如本文公開(kāi)數(shù)據(jù)所示，5-HT受體拮抗劑抑制促細(xì)胞分裂劑活化的T細(xì)胞的增殖。簡(jiǎn)而言之，按本文其他部分所述方法分離T細(xì)胞并用ConA刺激。用5μg/ml ConA及多種5-HT受體拮抗劑和激動(dòng)劑在指示濃度處理細(xì)胞。如本文其他部分所述用氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷的整合測(cè)定細(xì)胞增殖。如數(shù)據(jù)所示，與用其他5-HT拮抗劑和激動(dòng)劑處理相比，用氟奮乃靜處理促細(xì)胞分裂劑活化的T細(xì)胞可導(dǎo)致劇烈的且劑量依賴(lài)性的增殖減低(圖33)。
如本文公開(kāi)數(shù)據(jù)所證實(shí)的，1B型5-HT受體對(duì)T細(xì)胞活化及瘤性B細(xì)胞的周期過(guò)程都是非常關(guān)鍵的。此外，1B型5-HT受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)特性與Akt(也做蛋白激酶B)活性相關(guān)。1B型5-HT受體活化導(dǎo)致Akt蛋白的磷酸化。此蛋白的磷酸化形式再磷酸化半胱天冬酶9并抑制凋亡應(yīng)答，也即使誘導(dǎo)細(xì)胞存活。撤消5-HT 1B信號(hào)會(huì)關(guān)閉AKT，而允許半胱天冬酶系統(tǒng)導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡(圖36)。
為證明1型5-HT選擇性拮抗劑(SB 216641)對(duì)AKT磷酸化的作用，檢測(cè)AKT的劑量依賴(lài)性抑制作用。用0、6.25、12.5及25μM的SB216641處理5×106RPMI-8226細(xì)胞3小時(shí)。用裂解緩沖液(1％IGEPAL CA-635、150mM NaCl、20mM Tris-Cl pH 7.4、1mM PMSF、1mM EGTA、1mM NaF、1μg/mL抑肽酶、10μg/mL亮肽酶素、1mMNa2OVa、5mM BGP)在冰上裂解細(xì)胞15分鐘，然后離心10分鐘去除膜碎片。收集上清并用BioRad Detergent Compatible Kit(Hercules，CA)測(cè)定蛋白濃度。
每泳道加100mg蛋白，用4％SDS-PAGE成層膠及12％SDS-PAGE分離膠分離。在轉(zhuǎn)移緩沖液(25mM Tris、192mM甘氨酸、20％甲醇、0.1％SDS)中將蛋白電轉(zhuǎn)到硝化纖維膜上。用抗磷酸化Akt抗體(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)免疫印記此膜以檢測(cè)AKT活化所需的絲氨酸-473磷酸化殘基并且用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯現(xiàn)任何結(jié)合的抗體?？蓽y(cè)到磷酸化-(ser473)-AKT的劑量依賴(lài)性降低(圖37)。
本文公開(kāi)數(shù)據(jù)表明在活化T細(xì)胞或癌性B細(xì)胞(如多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞)中，撤消1B型5-HT信號(hào)就下調(diào)AKT活性，從而誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡。氟奮乃靜，因其對(duì)1B型5-HT受體的效用，可用來(lái)啟動(dòng)半胱天冬酶介導(dǎo)的凋亡。
數(shù)據(jù)表明氟奮乃靜有多種重要的治療用途，包括氟奮乃靜可有效地抑制促細(xì)胞分裂劑活化的T細(xì)胞，因而可用于治療自身免疫疾病，如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化癥；同時(shí)它也可用于調(diào)節(jié)異源移植過(guò)程產(chǎn)生的排斥反應(yīng)。另外，本文公開(kāi)數(shù)據(jù)表明多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞依賴(lài)于血清素誘導(dǎo)的信號(hào)，并且突然撤消這些信號(hào)會(huì)誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡。此處所示數(shù)據(jù)表明氟奮乃靜可用于治療B細(xì)胞瘤形成，如多發(fā)性骨髓瘤。
實(shí)施例7血清素拮抗劑和血腦屏障前面已證明血清素能通路在免疫應(yīng)答中起到重要作用，且可用抑制多種血清素受體的信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)此免疫應(yīng)答。參見(jiàn)國(guó)際公開(kāi)文本W(wǎng)O02/078643及美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US2003/0100570A1，其公開(kāi)內(nèi)容在此全文引用。
本文公開(kāi)數(shù)據(jù)表明血清素能通路存在于淋巴細(xì)胞、T及B細(xì)胞上，并完全參與其活化途徑。此外，與5-HT受體選擇性或非選擇性作用的藥物可用于治療性調(diào)節(jié)活化的B及T細(xì)胞，并且也可用于控制血液惡性病，如多發(fā)性骨髓瘤(MM)及慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)。
基于本文公開(kāi)數(shù)據(jù)，技術(shù)人員應(yīng)理解用于經(jīng)血清素信號(hào)調(diào)節(jié)T和B細(xì)胞的藥物可(但不必)穿透血腦屏障來(lái)發(fā)揮其療效。此外，可通過(guò)阻止藥物穿透血腦屏障來(lái)減低或消除由于藥物與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中血清素能通路相互作用而引起的潛在副作用。因此，本發(fā)明包括生產(chǎn)及鑒定化合物的方法，其抑制血清素受體信號(hào)從而影響本文所述多種細(xì)胞過(guò)程，其中化合物實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障，或是與其他除穿透血腦屏障外相同的化合物相比穿透量要小的多。因此，本發(fā)明包括使用抑制血清素受體信號(hào)但不穿透血腦屏障或穿透量很小的化合物來(lái)影響本文其他部分更詳細(xì)論述的多種細(xì)胞進(jìn)程。
傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)化學(xué)結(jié)構(gòu)活性相關(guān)性研究可用于改造穿透血腦屏障的“親本”化合物，從而使改造后的化合物不再穿透屏障，但仍保留所期望的與相關(guān)5-HT受體相互作用的能力，進(jìn)而產(chǎn)生預(yù)期效應(yīng)。篩選此類(lèi)新化合物的一種方法為使用平行實(shí)驗(yàn)，包括相關(guān)的體外細(xì)胞分析(如(但不限于)人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系增殖/凋亡讀數(shù))同時(shí)包括簡(jiǎn)單的體內(nèi)研究以篩選不利CNS影響的消除。這些分析及研究在后面詳細(xì)敘述。
為維持和執(zhí)行其生理功能腦神經(jīng)元需要一個(gè)嚴(yán)格控制的環(huán)境。血腦屏障保護(hù)大腦組織遠(yuǎn)離血液中的有害物質(zhì)，腦毛細(xì)管內(nèi)皮的傳輸過(guò)程幫助大腦提供適當(dāng)?shù)囊后w環(huán)境?！把X屏障”是一術(shù)語(yǔ)，用來(lái)描述腦內(nèi)毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接使得僅允許很小的分子或活性轉(zhuǎn)運(yùn)的分子通過(guò)此“屏障”。通常，血腦屏障對(duì)水、二氧化碳、氧及多數(shù)脂溶物，如乙醇，是高通透性的。該屏障對(duì)電解質(zhì)，如鈉、氯化物及鉀可微量透過(guò)，而對(duì)血漿蛋白和多數(shù)帶電的有機(jī)分子幾乎不可穿透。因此，血腦屏障常使腦脊液和/或腦薄壁組織中的蛋白抗體或帶電的藥物不可能達(dá)到有效濃度。
從事藥物開(kāi)發(fā)致力于發(fā)展血清素能激動(dòng)劑和拮抗劑的制藥公司常屏棄可在CNS中不發(fā)揮效用的前導(dǎo)化合物，也即，它們不穿透血腦屏障。最近一篇SmithKline Beecham Pharmaceuticals(Bromidge等，2000，Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 101863-1866)發(fā)表的醫(yī)學(xué)化學(xué)論文闡述了此點(diǎn)。此研究的目的是開(kāi)發(fā)雙丙烯醚高選擇性5-HT2C抑制劑。此研究開(kāi)發(fā)的數(shù)種化合物對(duì)2C受體的親和力及選擇性比還需進(jìn)一步發(fā)展的最新化合物明顯更好。然而，那些屏棄的化合物對(duì)CNS無(wú)效用。盡管這些化合物可能沒(méi)有抗抑郁或抗焦慮活性，但他們可作為治療血液學(xué)惡性病的高效免疫調(diào)節(jié)劑或化療試劑。也即，這些“被屏棄”的化合物是潛在的治療物，因?yàn)樗麄兛梢种?-HT2C且更具有不傳透血腦屏障的優(yōu)勢(shì)，因此，不會(huì)引起多余的和/或不利的神經(jīng)精神效用。
基于本文公開(kāi)數(shù)據(jù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，有很多調(diào)節(jié)化合物以影響其穿透血腦屏障能力的方法。例如，有意減少化合物親油性是顯著降低化合物透過(guò)血腦屏障可能性的方法。因此，人們可對(duì)既可在CNS發(fā)揮效用又對(duì)淋巴細(xì)胞有抗增值效用的化合物進(jìn)行改造，使其CSN影響減低而抗增值效用不變或增加。如果治療目標(biāo)為對(duì)血液學(xué)惡性病的免疫調(diào)節(jié)和生長(zhǎng)抑制，那么減少化合物親油性可用于選擇性減弱或消除(多余和/或不必要的)CNS影響，同時(shí)選擇性地增強(qiáng)期望的療效。
如本文例證，本文公開(kāi)數(shù)據(jù)顯示了對(duì)氟奮氖靜的成功改造。氟奮氖靜為FDA批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)抗精神病藥(多余/不必要的CNS影響)，近來(lái)本文顯示它可作為2C型5-HT受體有效的抑制劑(反向激動(dòng)劑)，所需的效用)(圖38)。本文其他部發(fā)公開(kāi)數(shù)據(jù)表明氟奮氖靜抑制T細(xì)胞應(yīng)答，也抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)，并減少?gòu)穆粤馨图?xì)胞白血病(CLL)患者的外植骨髓吸取物中的腫瘤細(xì)胞負(fù)荷。此外，氟奮氖靜為強(qiáng)效鎮(zhèn)靜劑，注射針從血管抽出前就可誘使動(dòng)物睡眠。
為測(cè)試降低氟奮乃靜(也做ProlixinTM及PermitilTM)親脂性的功效，用本領(lǐng)域熟知標(biāo)準(zhǔn)方法合成圖39所示化合物，即名為QSS5及QSS12的化合物。這些化合物用原發(fā)異源細(xì)胞毒性T細(xì)胞試驗(yàn)(圖40)及在兩種不同的人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系(圖41A，41B)測(cè)定分析，相互比較。也即，在異源細(xì)胞毒性T細(xì)胞試驗(yàn)起始時(shí)施用所述化合物。試驗(yàn)中，按本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法用代表完全MHC錯(cuò)配的P815刺激BALB/c鼠脾細(xì)胞。根據(jù)本領(lǐng)域熟知標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)⒓?xì)胞一起孵育7天，并用細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)測(cè)試其裂解P815靶細(xì)胞的能力。公開(kāi)數(shù)據(jù)以相對(duì)于未處理細(xì)胞群的殺傷率表示。
本文公開(kāi)數(shù)據(jù)表明與其他類(lèi)似物相比QSS12類(lèi)似物活性特征明顯提高。將每種化合物，氟奮氖靜、QSS5及QSS12以15mg/kg的量靜脈內(nèi)注射(尾靜脈注射)到BALB/c鼠中。注射氟奮氖靜的鼠立即安靜下來(lái)(如所預(yù)期的)一直睡大約10小時(shí)。而QSS5和QSS12注射的鼠在72小時(shí)間內(nèi)觀測(cè)都沒(méi)顯示任何鎮(zhèn)靜信號(hào)和任何異常行為。
僅提高親本化合物(氟奮氖靜)親脂性不足以提高類(lèi)似物活性。例如，本文公開(kāi)數(shù)據(jù)顯示了多種氟奮氖靜衍生物降低細(xì)胞增值的功效，這些細(xì)胞源于人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系。具體來(lái)說(shuō)，如圖41A所述，測(cè)定了QSS-5、QSS-12、氟奮氖靜、SB216641及WAY100635抑制RPMI-8226細(xì)胞增值的功效。圖表描述了各化合物在所示劑量對(duì)氚標(biāo)記脫氧胸腺嘧啶核苷的攝入，來(lái)測(cè)定DNA合成，進(jìn)而表示其增值功效。
同樣，圖41B表示相同的這些化合物通過(guò)測(cè)定整合氚標(biāo)記脫氧胸腺嘧啶核苷量(用來(lái)測(cè)定DNA合成)來(lái)檢測(cè)其對(duì)U266細(xì)胞增值的功效。圖表顯示多種劑量(以μM為單位)。
此外，圖43表示具有不同修飾的系列氟奮氖靜類(lèi)似物對(duì)細(xì)胞增值的效用。圖42描述了多種酚噻嗪QSS系列化合物的結(jié)構(gòu)。在ARH細(xì)胞(也是衍生于人多發(fā)性骨髓瘤的細(xì)胞系)中檢測(cè)這些類(lèi)似物。數(shù)據(jù)顯示氟奮氖靜的磺酸衍生物(QSS1)及乙醇鹽衍生物(QSS3)活性喪失，也即與氟奮氖靜相比失去抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。盡管磺酸鹽衍生物(QSS6)保留一些活性，但QSS5不僅保留活性而且與氟奮氖靜相比活性明顯增強(qiáng)。
通過(guò)增強(qiáng)化合物相對(duì)于親本化合物的極性來(lái)合成QSS系列化合物以緩和或消除氟奮氖靜的體內(nèi)主要副作用。也即，在親本氟奮氖靜的基礎(chǔ)上改造這些類(lèi)似物，減低對(duì)血腦屏障的通透性，但仍保留氟奮氖靜對(duì)血清素受體的抑制活性。分析QSS5及QSS6兩者在體內(nèi)的即刻“睡眠”效應(yīng)。兩者都不誘導(dǎo)即刻睡眠，并且施用15mg/kg劑量后24小時(shí)內(nèi)也無(wú)其他明顯反應(yīng)。QSS6對(duì)鼠的普通協(xié)調(diào)有輕微效應(yīng)。
盡管氟奮氖靜與血清素能受體有交叉反應(yīng)性，但它最初開(kāi)發(fā)為多巴胺拮抗劑。用計(jì)算化學(xué)/分子模擬技術(shù)將QSS系列化合物與血清素與多巴胺相比較，發(fā)現(xiàn)QSS5化合物因其加入的氨基(模擬血清素所含氨基)與血清素最相似。即，圖44為血清素、多巴胺及QSS5的分子模型圖。CPK模型表示分子，展示多種分子范德化半徑的相應(yīng)大小和位置。計(jì)算機(jī)模型表明QSS5更類(lèi)似血清素而不是多巴胺。本文其他部發(fā)公開(kāi)體外數(shù)據(jù)與此模型一致。
因此，本文公開(kāi)數(shù)據(jù)說(shuō)明了成功改性血清素抑制劑(如氟奮氖靜)以降低其對(duì)血腦屏障的通透性而同時(shí)該改性的化合物還保留了抑制通過(guò)特異性血清素受體(如5HT2C受體)信號(hào)的能力。技術(shù)人員應(yīng)理解可用不論是本領(lǐng)域熟知方法還是將來(lái)出現(xiàn)的方法來(lái)改性其他目的血清素抑制劑以類(lèi)似地降低其穿透血腦屏障的能力而保留或提高其抑制受體血清素信號(hào)傳遞的功能。
在此所引用的各專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、和公開(kāi)文本在此都全文作為參考引用。
盡管本文參考具體實(shí)施方案進(jìn)行公開(kāi)，但很明顯本領(lǐng)域技術(shù)人員可不偏離本發(fā)明的精神及范圍而構(gòu)建其他的實(shí)施方案或本發(fā)明方案的變體。附加的權(quán)利要求書(shū)包括所有這些實(shí)施方案及等效變體。
權(quán)利要求
1.調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給所述哺乳動(dòng)物施用有效量的抑制劑，該抑制劑抑制血清素與血清素受體間的相互作用，從而調(diào)節(jié)該哺乳動(dòng)物中的所述免疫應(yīng)答。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述血清素受體選自1B型血清素受體、2A型血清素受體、2B型血清素受體、2C型血清素受體、4型血清素受體和6型血清素受體。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述抑制劑選自選擇性的1B型血清素受體拮抗劑、選擇性的2A型血清素受體拮抗劑、選擇性的2B型血清素受體拮抗劑、選擇性的2C型血清素受體拮抗劑、選擇性的4型血清素受體拮抗劑和選擇性的6型血清素受體拮抗劑。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述抑制劑為血清素受體拮抗劑，其選自利哌酮、氟奮乃靜、酮色林、米安色林、LY 53857、SB 206553、SB 242084、MDL 11939、SB 216641和美賽西平。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述抑制劑為氟奮乃靜。
6.權(quán)利要求3的方法，其中所述抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
7.權(quán)利要求2的方法，其中所述抑制劑經(jīng)改性使之實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述改性的抑制劑為該抑制劑的酚噻嗪衍生物。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述抑制劑為氟奮乃靜且所述氟奮乃靜的所述酚噻嗪衍生物選自QSS-5和QSS-12。
10.抑制哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給哺乳動(dòng)物施用免疫應(yīng)答抑制量的抑制劑，該抑制劑抑制血清素與血清素受體的相互作用，從而抑制該哺乳動(dòng)物中的所述免疫應(yīng)答。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述血清素受體選自1B型血清素受體、2A型血清素受體、2B型血清素受體、2C型血清素受體、4型血清素受體和6型血清素受體。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述抑制劑選自選擇性的1B型血清素受體拮抗劑、選擇性的2A型血清素受體拮抗劑、選擇性的2B型血清素受體拮抗劑、選擇性的2C型血清素受體拮抗劑、選擇性的4型血清素受體拮抗劑和選擇性的6型血清素受體拮抗劑。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述抑制劑為血清素受體拮抗劑，其選自利哌酮、氟奮乃靜、酮色林、米安色林、LY 53857、SB 206553、SB 242084、MDL 11939、SB 216641和美賽西平。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述抑制劑為氟奮乃靜。
15.權(quán)利要求10的方法，其中所述抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
16.權(quán)利要求12的方法，其中所述抑制劑經(jīng)改性而使之實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述改性的抑制劑為該抑制劑的酚噻嗪衍生物。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述抑制劑為氟奮乃靜且所述氟奮乃靜的所述酚噻嗪衍生物選自QSS-5和QSS-12。
19.抑制免疫細(xì)胞的免疫反應(yīng)的方法，該方法包括抑制由所述細(xì)胞上的血清素受體傳遞的血清素信號(hào)，其中抑制該信號(hào)就抑制所述細(xì)胞活化，而且其中所述抑制血清素信號(hào)包括用有效量的抑制血清素與血清素受體相互作用的抑制劑接觸免疫細(xì)胞，從而抑制該細(xì)胞的所述免疫反應(yīng)。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述免疫細(xì)胞選自T細(xì)胞和B細(xì)胞。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述血清素受體選自1B型血清素受體、2A型血清素受體、2B型血清素受體、2C型血清素受體、4型血清素受體和6型血清素受體。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述抑制劑選自選擇性的1B型血清素受體拮抗劑、選擇性的2A型血清素受體拮抗劑、選擇性的2B型血清素受體拮抗劑、選擇性的2C型血清素受體拮抗劑、選擇性的4型血清素受體拮抗劑和選擇性的6型血清素受體拮抗劑。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述抑制劑為血清素受體拮抗劑，其選自利哌酮、氟奮乃靜、酮色林、米安色林、LY 53857、SB 206553、SB 242084、MDL 11939、SB 216641和美賽西平。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述抑制劑為氟奮乃靜。
25.權(quán)利要求19的方法，其中所述抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
26.權(quán)利要求22的方法，其中所述抑制劑經(jīng)改性而使之實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述改性后的抑制劑為該抑制劑的酚噻嗪衍生物。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述抑制劑為氟奮乃靜且所述氟奮乃靜的所述酚噻嗪衍生物選自QSS-5和QSS-12。
29.在患有自身免疫疾病的哺乳動(dòng)物中調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法，所述疾病由被血清素信號(hào)活化的免疫細(xì)胞所介導(dǎo)，該方法包括給所述哺乳動(dòng)物施用有效量的抑制劑，該抑制劑抑制血清素與血清素受體的相互作用，從而調(diào)節(jié)該哺乳動(dòng)物中的所述免疫應(yīng)答。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述抑制劑選自選擇性的1B型血清素受體拮抗劑、選擇性的2A型血清素受體拮抗劑、選擇性的2B型血清素受體拮抗劑和選擇性的2C型血清素受體拮抗劑。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述抑制劑為血清素受體拮抗劑，其選自利哌酮、氟奮乃靜、酮色林、米安色林、LY 53857、SB 206553、SB 242084和MDL 11939。
33.權(quán)利要求29的方法，其中所述自身免疫疾病選自重癥肌無(wú)力、特發(fā)性炎癥肌病、慢性嗜中性白血球減少癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、自身免疫性溶血綜合癥、抗磷脂抗體綜合癥、炎性腸病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、心肌炎、Gillian-Barre綜合癥、血管炎、多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)脊髓炎(Devic綜合癥)、淋巴細(xì)胞性垂體炎、格雷夫斯病、愛(ài)迪生病、甲狀旁腺功能減退癥、一型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、尋常性天皰瘡、大皰性類(lèi)天皰瘡、牛皮癬、銀屑病關(guān)節(jié)炎、子宮內(nèi)膜異位、自身免疫性睪丸炎、自身免疫性勃起障礙、結(jié)節(jié)病、韋格納肉芽腫病、自身免疫性耳聾、斯耶格倫病、自身免疫性色素層視網(wǎng)膜炎、間質(zhì)性膀胱炎、肺出血腎炎綜合癥及纖維肌痛。
34.權(quán)利要求29的方法，其中所述調(diào)節(jié)作用為抑制作用。
35.抑制哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的方法，其中所述免疫應(yīng)答是由T細(xì)胞上的血清素受體活化所介導(dǎo)的，該方法包括用有效量的抑制劑接觸所述的T細(xì)胞，該抑制劑抑制血清素與血清素受體的相互作用，從而抑制所述哺乳動(dòng)物中的所述免疫應(yīng)答。
36.權(quán)利要求35的方法，該方法進(jìn)一步包括以快速注射施用該抑制劑。
37.權(quán)利要求35的方法，其中所述血清素受體選自1B型血清素受體、2A型血清素受體、2B型血清素受體和2C型血清素受體。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述抑制劑選自選擇性的1B型血清素受體拮抗劑、選擇性的2A型血清素受體拮抗劑、選擇性的2B型血清素受體拮抗劑和選擇性的2C型血清素受體拮抗劑。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述抑制劑為血清素受體拮抗劑，其選自利哌酮、氟奮乃靜、酮色林、米安色林、LY 53857、SB 206553、SB 242084和MDL 11939。
40.權(quán)利要求38的方法，其中所述抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
41.抑制哺乳動(dòng)物免疫細(xì)胞活化的方法，其中所述活化是指由該免疫細(xì)胞上血清素受體活化所介導(dǎo)的，該方法包括給所述哺乳動(dòng)物施用有效量的抑制劑，該抑制劑抑制血清素與血清素受體的相互作用，從而抑制所述免疫細(xì)胞的活化。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述血清素受體選自1B型血清素受體、2A型血清素受體、2B型血清素受體和2C型血清素受體。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述抑制劑選自選擇性的1B型血清素受體拮抗劑、選擇性的2A型血清素受體拮抗劑、選擇性的2B型血清素受體拮抗劑和選擇性的2C型血清素受體拮抗劑。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述抑制劑為血清素受體拮抗劑，其選自利哌酮、氟奮乃靜、酮色林、米安色林、LY 53857、SB 206553、SB 242084和MDL 11939。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
46.抑制哺乳動(dòng)物二級(jí)免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給所述哺乳動(dòng)物施用有效量的抑制劑，該抑制劑抑制血清素與血清素受體間的相互作用，從而抑制該哺乳動(dòng)物中的所述二級(jí)免疫應(yīng)答。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述血清素受體選自1B型血清素受體、2A型血清素受體、2B型血清素受體和2C型血清素受體。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述抑制劑選自選擇性的1B型血清素受體拮抗劑、選擇性的2A型血清素受體拮抗劑、選擇性的2B型血清素受體拮抗劑和選擇性的2C型血清素受體拮抗劑。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述抑制劑為血清素受體拮抗劑，其選自利哌酮、氟奮乃靜、酮色林、米安色林、LY 5385 、SB 206553、SB 242084和MDL 11939。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
51.治療哺乳動(dòng)物由細(xì)胞介導(dǎo)的疾病的方法，其中所述細(xì)胞需要經(jīng)由血清素受體的血清素信號(hào)傳遞，該方法包括抑制所述細(xì)胞中的血清素與血清素受體的相互作用，其中該抑制對(duì)此細(xì)胞是有害的使得該細(xì)胞不介導(dǎo)所述疾病。
52.權(quán)利要求51的方法，其中用抑制血清素與血清素受體相互作用的抑制劑接觸細(xì)胞來(lái)介導(dǎo)所述對(duì)血清素相互作用的抑制。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述血清素受體選自1型血清素受體、2型血清素受體、4型血清素受體和6型血清素受體。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述自身免疫疾病選自多發(fā)性骨髓瘤、重癥肌無(wú)力、特發(fā)性炎癥肌病、慢性嗜中性白血球減少癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、自身免疫性溶血綜合癥、抗磷脂抗體綜合癥、炎性腸病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、心肌炎、Gillian-Barre綜合癥、血管炎、多發(fā)性硬化癥、視神經(jīng)脊髓炎(Devic綜合癥)、淋巴細(xì)胞性垂體炎、格雷夫斯病、愛(ài)迪生病、甲狀旁腺功能減退癥、一型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、尋常性天皰瘡、大皰性類(lèi)天皰瘡、牛皮癬、銀屑病關(guān)節(jié)炎、子宮內(nèi)膜異位、自身免疫性睪丸炎、自身免疫性勃起障礙、結(jié)節(jié)病、韋格納肉芽腫病、自身免疫性耳聾、斯耶格倫病、自身免疫性色素層視網(wǎng)膜炎、間質(zhì)性膀胱炎、肺出血腎炎綜合癥及纖維肌痛。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述血清素受體為1B型血清素受體而且所述疾病為多發(fā)性骨髓瘤。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
57.誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法，該方法包括抑制所述細(xì)胞中經(jīng)由血清素受體的血清素信號(hào)傳遞，其中所述抑制誘導(dǎo)凋亡，而且其中所述抑制該細(xì)胞上血清素與血清素受體的相互作用包括用有效量的抑制劑接觸該細(xì)胞，該抑制劑抑制血清素與血清素受體的相互作用，從而誘導(dǎo)所述細(xì)胞的凋亡。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
59.誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法，該方法包括抑制所述細(xì)胞上經(jīng)由血清素受體的血清素信號(hào)傳遞，其中該抑制誘導(dǎo)該細(xì)胞死亡，而且其中所述抑制包括用有效量的抑制劑接觸該細(xì)胞，該抑制劑抑制血清素與所述血清素受體的相互作用，從而誘導(dǎo)所述細(xì)胞的死亡。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
61.鑒別用于治療哺乳動(dòng)物自身免疫疾病的化合物的方法，該方法包括用待側(cè)化合物接觸血清素受體，并將同該化合物接觸的所述血清素受體與血清素的結(jié)合水平與其他方面相同只是不與此化合物接觸的血清素受體與血清素的結(jié)合水平相比較，其中同該化合物接觸的所述血清素受體與血清素的結(jié)合水平低于其他方面相同只是不與此化合物接觸的血清素受體與血清素的結(jié)合水平表示此化合物可用于治療該哺乳動(dòng)物中所述自身免疫疾病。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述血清素受體選自1B型血清素受體、2A型血清素受體、2B型血清素受體、2C型血清素受體、4型血清素受體和6型血清素受體。
63.用權(quán)利要求61的方法鑒定出的化合物。
64.權(quán)利要求62的方法，該方法進(jìn)一步包括評(píng)估所述化合物穿透血腦屏障的能力并選擇實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障的化合物。
65.用權(quán)利要求64的方法鑒定出的化合物。
66.權(quán)利要求65的化合物，其中所述化合物選自QSS-5和QSS-12。
67.鑒別用于治療哺乳動(dòng)物異源移植應(yīng)答的化合物的方法，該方法包括用待側(cè)化合物接觸血清素受體，并將同該化合物接觸的所述血清素受體與血清素的結(jié)合水平與其他方面相同只是不與此化合物接觸的血清素受體與血清素的結(jié)合水平相比較，其中同該化合物接觸的所述血清素受體與血清素的結(jié)合水平低于其他方面相同只是不與此化合物接觸的血清素受體與血清素的結(jié)合水平表示此化合物可用于治療該哺乳動(dòng)物的所述異源移植應(yīng)答。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述血清素受體選自1B型血清素受體、2A型血清素受體、2B型血清素受體、2C型血清素受體、4型血清素受體和6型血清素受體。
69.用權(quán)利要求67的方法鑒定出的化合物。
70.權(quán)利要求67的方法，該方法進(jìn)一步包括評(píng)估該化合物穿透血腦屏障的能力且選用實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障的化合物。
71.用權(quán)利要求70的方法鑒定出的化合物。
72.權(quán)利要求67的方法，該方法包括改性所鑒定的化合物使之實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
73.鑒定用于抑制T細(xì)胞活化的化合物的方法，其中所述活化是由血清素與該T細(xì)胞上血清素受體結(jié)合介導(dǎo)的，該方法包括用待側(cè)化合物接觸T細(xì)胞，并將同該化合物接觸的所述血清素受體與血清素的結(jié)合水平與其他方面相同只是不與此化合物接觸的血清素受體與血清素的結(jié)合水平相比較，其中同該化合物接觸的所述血清素受體與血清素的結(jié)合水平低于其他方面相同只是不與此化合物接觸的血清素受體與血清素的結(jié)合水平表示此化合物可用于抑制T細(xì)胞活化，其上所述活化是由血清素與此T細(xì)胞中2型血清素受體結(jié)合所介導(dǎo)的。
74.權(quán)利要求73的方法，該方法進(jìn)一步包括評(píng)估該化合物穿透血腦屏障的能力且選用實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障的化合物。
75.用權(quán)利要求73的方法鑒定出的化合物。
76.權(quán)利要求73的方法，該方法包括改性所鑒定的化合物使之實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
77.鑒定影響經(jīng)由細(xì)胞上血清素受體的信號(hào)傳遞的化合物的方法，該方法包括用化合物接觸細(xì)胞，并將該細(xì)胞形態(tài)與接觸此化合物前的形態(tài)相比較，評(píng)估任何變化，其中與接觸該化合物前的所述細(xì)胞的所述形態(tài)相比接觸所述化合物的所述細(xì)胞在所述形態(tài)上的改變表示該化合物影響經(jīng)由該細(xì)胞上血清素受體的信號(hào)傳遞，從而鑒定出影響經(jīng)由細(xì)胞上血清素受體信號(hào)傳遞的化合物。
78.用權(quán)利要求77的方法鑒定出的化合物。
79.權(quán)利要求77的方法，該方法包括改性所鑒定的化合物使之實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
80.用權(quán)利要求79的方法鑒定出的化合物。
81.影響細(xì)胞中細(xì)胞周期過(guò)程的方法，該方法包括抑制經(jīng)由所述細(xì)胞上血清素受體的信號(hào)傳遞，而且其中所述抑制經(jīng)由所述細(xì)胞上血清素受體的信號(hào)傳遞包括用有效量的抑制劑接觸該細(xì)胞，該抑制劑抑制血清素與血清素受體的相互作用，從而影響細(xì)胞周期過(guò)程。
82.權(quán)利要求81的方法，其中所述抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
83.影響表達(dá)血清素受體的細(xì)胞凋亡的方法，該方法包括抑制經(jīng)由所述受體的信號(hào)傳遞，而且其中所述抑制包括用有效量的抑制劑接觸該細(xì)胞，該抑制劑抑制血清素與血清素受體的相互作用，從而影響該細(xì)胞的凋亡。
84.權(quán)利要求83的方法，其中所述抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
85.誘導(dǎo)表達(dá)血清素受體的細(xì)胞凋亡的方法，該方法包括抑制經(jīng)由該受體的信號(hào)傳遞，從而誘導(dǎo)該細(xì)胞的凋亡。
86.用于調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的試劑盒，該試劑盒包括有效量的抑制血清素與血清素受體相互作用的抑制劑，該試劑盒進(jìn)一步包括用藥器及其使用說(shuō)明材料。
87.權(quán)利要求86的試劑盒，其中所述血清素受體選自1B型血清素受體、2A型血清素受體、2B型血清素受體、2C型血清素受體、4型血清素受體和6型血清素受體。
88.權(quán)利要求87的試劑盒，其中所述抑制劑選自選擇性的1B型血清素受體拮抗劑、選擇性的2A型血清素受體拮抗劑、選擇性的2B型血清素受體拮抗劑和選擇性的2C型血清素受體拮抗劑。
89.權(quán)利要求88的試劑盒，其中所述抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
90.影響表達(dá)血清素受體的細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程的試劑盒，該試劑盒包括有效量的抑制血清素與血清素受體相互作用的抑制劑，該試劑盒進(jìn)一步包括用藥器及其使用說(shuō)明材料。
91.權(quán)利要求90的試劑盒，其中所述抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
92.誘導(dǎo)表達(dá)血清素受體的細(xì)胞凋亡的試劑盒，該試劑盒包括有效量的抑制血清素與血清素受體相互作用的抑制劑，該試劑盒進(jìn)一步包括用藥器及其使用說(shuō)明材料。
93.權(quán)利要求92的試劑盒，其中所述抑制劑實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障。
全文摘要
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了經(jīng)由1B、2、4和6型血清素受體的信號(hào)傳遞對(duì)T細(xì)胞活化的重要性，因此抑制這些信號(hào)傳遞，如用氟奮乃靜抑制，可用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖、和凋亡、及其他細(xì)胞進(jìn)程。此免疫調(diào)節(jié)用于治療免疫疾病或病癥，且用于這些疾病或病癥的潛在療法的發(fā)展。本發(fā)明進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在發(fā)生細(xì)胞周期進(jìn)程的細(xì)胞中，抑制血清素信號(hào)傳遞可抑制細(xì)胞的該進(jìn)程并誘導(dǎo)凋亡和形態(tài)學(xué)變化。這些抑制血清素能信號(hào)傳遞的效用可用于實(shí)施選擇性的細(xì)胞殺傷和用于鑒定抑制該信號(hào)傳遞的化合物。此外，提供了使用方法，也提供了鑒別及生產(chǎn)實(shí)質(zhì)上不穿透血腦屏障的抑制劑的方法。
文檔編號(hào)A61P25/00GK1674879SQ03819529
公開(kāi)日2005年9月28日 申請(qǐng)日期2003年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月17日
發(fā)明者B·A·詹姆森, A·A·特雷蒂亞科瓦, H·C·戴維森 申請(qǐng)人:費(fèi)城健康與教育公司