專利名稱：用于調節(jié)i的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抑制IκB激酶的吲哚衍生物或苯并咪唑衍生物、其制備方法及其作為藥物的用途。
專利申請WO 94/12478中特別描述了抑制血小板聚集的吲哚衍生物。專利申請WO 01/00610和WO 01/30774中描述了能夠調節(jié)NFκB的吲哚衍生物和苯并咪唑衍生物。
NFκB為能夠激活大量基因的異二聚化轉錄因子，所述基因特別編碼促炎細胞因子如IL-1、IL-2、TNFα或IL-6。NFκB存在于細胞的細胞溶膠中，在那里它與其天然存在的抑制劑IκB復合。刺激細胞、例如通過細胞因子刺激細胞使IκB磷酸化且隨后以蛋白水解方式被分解。這種蛋白水解分解導致NFκB活化，然后遷移入細胞核，在那里它激活大量促炎基因。
在諸如類風濕性關節(jié)炎(與炎癥相關)、骨關節(jié)炎、哮喘、心肌梗死、阿爾茨海默病、II型糖尿病、“炎性腸病”或動脈粥樣硬化這類疾病中，NFκB被活化至超過了正常的程度。抑制NFκB在治療癌癥方面也具有價值，因為在這種治療中，抑制NFκB被單獨使用或用于加強細胞抑制療法。已經(jīng)證實諸如糖皮質激素、水楊酸鹽或金鹽這類用于風濕癥療法的藥物抑制NFκB活化信號鏈上的各點或直接干擾基因轉錄。
在上述信號級聯(lián)中的第一步是分解IκB。這種磷酸化受到特異性IκB激酶的調節(jié)。迄今為止尚不了解特異性抑制IκB激酶的抑制劑。
已知的IκB激酶抑制劑通常的缺陷是缺乏僅抑制一類激酶的特異性。例如，大部分IκB激酶抑制劑同時抑制幾種不同激酶，因為這些激酶的催化域結構相似。因此，這些抑制劑以不可取的方式對許多酶起作用，包括那些具有重要功能的酶。
專利申請WO 01/30774中已經(jīng)描述了能夠調節(jié)NFκB且對IκB激酶表現(xiàn)出強抑制作用的吲哚衍生物。然而，WO 01/30774中公開且在實施例中描述的化合物還對其它激酶表現(xiàn)出強抑制作用，諸如cAMP-依賴性蛋白激酶、蛋白激酶C和酪蛋白激酶II。不過，當特異性得到改善時，一些該類吲哚衍生物抑制IκB激酶的能力則降低。此外，WO 01/30774中公開的化合物可獲得的血漿濃度不足以用于口服施用這些衍生物。
在努力獲得用于治療類風濕性關節(jié)炎(與炎癥相關)、骨關節(jié)炎、哮喘、心肌梗死、阿爾茨海默病、癌病(用細胞毒性劑強化治療)或動脈粥樣硬化的有效化合物的過程中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的吲哚衍生物和苯并咪唑衍生物沒有上述缺陷。本發(fā)明的吲哚衍生物和苯并咪唑衍生物是強有力的IκdB激酶抑制劑，在這方面對激酶的抑制極具選擇性且在口服施用后具有高血漿濃度。
本發(fā)明由此涉及式I化合物和/或式I化合物的立體異構形式和/或式I化合物的生理上耐受的鹽 其中X和M相同或不同且彼此獨立地為N原子或CH；R1和R11相同或不同且彼此獨立地為1.氫原子，2.F、Cl、I或Br，3. -(C1-C4)-烷基，4.-CN，5.-CF3，6.-OR5，其中R5為氫原子或-(C1-C4)-烷基，7.-N(R5)-R6，其中R5和R6彼此獨立地為氫原子或-(C1-C4)-烷基，
8.-C(O)-R5，其中R5為氫原子或-(C1-C4)-烷基，或9.-S(O)x-R5，其中x為整數(shù)0、1或2且R5為氫原子或-(C1-C4)-烷基；R2為1.選自下列基團的雜芳基3-羥基吡咯-2，4-二酮、咪唑、咪唑烷、咪唑啉吲唑、異噻唑、異噻唑烷、異噁唑、2-異噁唑烷、異噁唑烷、異噁唑酮、嗎啉、噁唑、1，3，4-噁二唑、噁二唑烷二酮、噁二唑酮、1，2，3，5-氧硫雜二唑-2-氧化物、5-氧代-4，5-二氫[1，3，4]-噁二唑、5-氧代-1，2，4-噻二唑、哌嗪、吡嗪、吡唑、吡唑啉、吡唑烷、噠嗪、嘧啶、四唑、噻二唑、噻唑、硫代嗎啉、三唑或三唑酮，且所述雜芳基未被取代或彼此獨立地被下列基團取代一次、二次或三次1.1-C(O)-R5，其中R5為氫原子或-(C1-C4)-烷基，1.2-(C1-C4)-烷基，1.3-O-R5，其中R5為氫原子或-(C1-C4)-烷基，1.4-N(R5)-R6，其中R5和R6彼此獨立地為氫原子或-(C1-C4)-烷基，1.5鹵素，或1.6酮基；2.-C(O)-OR5，其中R5為氫原子或-(C1-C4-烷基)，3.-C(O)-OR5，其中R5為氫原子或-(C1-C4-烷基)，或4.-C(O)-N(R7)-R8，其中R7和R8彼此獨立地為氫原子、-(C1-C4)-烷基-OH、-O-(C1-C4)-烷基或-(C1-C4-烷基)；R3為氫原子或-(C1-C4-烷基)；R4為1.選自下列基團的雜芳基吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、噁唑、異噁唑、噻唑、異噻唑、四唑、1，2，3，5-氧硫雜二唑-2-氧化物、三唑酮、噁二唑酮、異噁唑酮、噁二唑烷二酮、三唑、3-羥基吡咯2，4-二酮、5-氧代-1，2，4-噻二唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、吲哚、異吲哚、吲唑、2，3-二氮雜萘、喹琳、異喹琳、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、β-咔啉和這些雜芳基的苯并稠合、環(huán)戊二烯并衍生物或環(huán)己二烯(cyclohexa)并衍生物，其中所述雜芳基未被取代或彼此獨立地被下列基團取代一次、二次或三次-(C1-C5)-烷基、-(C1-C5)-烷氧基、鹵素、硝基、氨基、三氟甲基、羥基、羥基-(C1-C4)-烷基、亞甲二氧基、亞乙二氧基、甲?；?、乙?；?、氰基、羥基羰基、氨基羰基或-(C1-C4)-烷氧羰基；或2.選自下列基團的芳基苯基、萘基、1-萘基、2-萘基、聯(lián)苯基、2-聯(lián)苯基、3-聯(lián)苯基和4-聯(lián)苯基、蒽基或芴基，且所述雜基未被取代或彼此獨立地被下列基團取代一次、二次或三次-(C1-C5)-烷基、-(C1-C5)-烷氧基、鹵素、硝基、氨基、三氟甲基、羥基、羥基-(C1-C4)-烷基、亞甲二氧基、亞乙二氧基、甲酰基、乙?；⑶杌?、羥基羰基、氨基羰基或-(C1-C4)-烷氧羰基。
此外，本發(fā)明涉及式I化合物，其中X和M相同或不同且彼此獨立地為N原子或CH；R1和R11如上述1.-9.中所定義；R2為1.選自下列基團的雜芳基咪唑、異噻唑、異噁唑、2-異噁唑烷、異噁唑烷、異噁唑酮、1，3，4-噁二唑、噁二唑烷二酮、1，2，3，5-噁二唑酮、噁唑、5-氧代-4，5-二氫[1，3，4]-噁二唑、四唑、噻二唑、噻唑、三唑或三唑酮，且所述雜芳基未被取代或彼此獨立地被下列基團取代一次、二次或三次1.1酮基，1.2鹵素，或1.3-(C1-C2)-烷基；或2.-C(O)-N(R7)-R8，其中R7和R8彼此獨立地為氫原子、-(C1-C4)-烷基-OH、-O-(C1-C4)-烷基或-(C1-C4-烷基)；R3為氫原子、甲基或乙基；
R4為1.選自不飽和、部分飽和或完全飽和環(huán)的雜芳基，所述不飽和、部分飽和或完全飽和環(huán)衍生自吡啶、吡嗪、嘧啶、噠嗪、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、噁唑、異噁唑、噻唑、三唑或異噻唑，其中所述雜芳基未被取代或彼此獨立地被下列基團取代一次、二次或三次-(C1-C4)-烷基、-(C1-C4)-烷氧基、F、Cl、I、Br、硝基、氨基、三氟甲基、羥基、羥基-(C1-C4)-烷基、亞甲二氧基、亞乙二氧基、甲酰基、乙酰基、氰基、羥基羰基、氨基羰基或-(C1-C4)-烷氧羰基；或2.苯基，且苯基未被取代或彼此獨立地被下列基團取代一次、兩次或三次的苯基F、Cl、I、Br、-CF3、-OH、-(C1-C4)-烷基或-(C1-C4)-烷氧基。
此外，本發(fā)明涉及如下化合物N-[(S)-2-二苯基氨基-1-(5-氧代-4，5-二氫[1，3，4]噁二唑-2-基)乙基]-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺；N-{1-氨基甲?；?2-[(4-氟苯基)吡啶-2-基氨基]乙基}-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺；N-[(S)-1-(5-氧代-4，5-二氫-1，3，4-噁二唑-2-基)-2-(苯基吡啶-2-基氨基)乙基]-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺；N-{1-氨基甲?；?2-[(4-氟苯基)吡啶-2-基氨基]乙基}-2-(2-氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺；N-[2-[(4-氟苯基)吡啶-2-基氨基]-1-(4H-[1，2，4]三唑-3-基)-乙基]-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺；N-[1-氨基甲?；?2-(苯基噻唑-2-基氨基)乙基]-(S)-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺；N-[1-甲氧基氨基甲酰基-2-(苯基吡啶-2-基氨基)乙基]-(S)-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺；
N-{1-氨基甲?；?2-[(苯基)吡啶-2-基氨基]乙基}-2-(2-氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺；N-{1-氨基甲酰基-2-[(苯基)嘧啶基-2-基氨基]乙基}-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺；N-[1-(2-羥乙基氨基甲?；?-2-(苯基嘧啶-2-基氨基)乙基]-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺；(S)-2-{[2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-羰基]-氨基}-3-[苯基-(4-三氟甲基嘧啶-2-基)氨基]丙酸；N-{1-氨基甲酰基-2-[(4-氟苯基)-(5-甲基嘧啶-2-基)氨基]-乙基}-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺；N-((S)-1-氨基甲?；?2--二苯基氨基乙基)-2-(2-甲氨基-嘧啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-甲酰胺；N-{1-氨基甲?；?2-[(苯基)嘧啶-2-基氨基]乙基}-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-甲酰胺；或N-{1-氨基甲?；?2-[(苯基)吡啶-2-基氨基]乙基}-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-甲酰胺。
將術語“鹵素”理解為指的是氟、氯、溴或碘。將術語“-(C1-C5)-烷基”或“-(C1-C5)-烷氧基”理解為指的是碳鏈為直鏈或支鏈且含有1-5個碳原子的烴基，諸如甲基、乙基、丙基、正丁基、戊基或叔丁基。將表達方式“選自不飽和、部分飽和或完全飽和環(huán)的雜芳基，所述不飽和、部分飽和或完全飽和環(huán)衍生自吡啶、吡嗪、嘧啶、噠嗪、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、噁唑、異噁唑、噻唑和異噻唑”理解為指的是例如如下化合物諸如哌嗪、吡唑啉、咪唑啉、吡唑烷、咪唑烷、四氫吡啶、異噁唑啉、異噁唑烷、嗎啉、異噻唑啉、異噻唑烷、四氫-1，4-噻嗪或哌啶。
例如，如專利申請WO 01/00610和WO 01/30774中所述制備式I化合物。用于該化學反應的原料化合物是已知的或易于使用從文獻中得知的方法制備。
此外，本發(fā)明涉及式I化合物和/或式I化合物的立體異構形式和/或式I化合物的生理上耐受的鹽的制備方法，包括下列步驟a)在堿或如果合適在脫水劑存在的溶液中使式IV化合物 其中R1、R2和R4如式I中所定義，與式III化合物的酰氯或活化酯反應， 其中D1為-COOH且R11、X、M和R3如式I中所定義，并將產(chǎn)物轉化成式I化合物；b)通過與對映體純的酸或堿成鹽、手性固定相色譜法或使用諸如氨基酸這類手性對映體純化合物衍生將通過方法a)制備且因其化學結構而出現(xiàn)對映體形式的式I化合物分離成純對映體、分離所得非對映體并消去手性輔助基團；或c)分離通過方法a)或b)制備的游離形式的式I化合物或當存在酸性或堿性基團時將其轉化成生理上耐受的鹽。
使用Houben-Weyl在“有機化學方法”第E6-2A或E6-2B卷中所述的方法制備吲哚羧酸衍生物或苯并咪唑羧酸衍生物。因此，為了制備式III的吲哚羧酸衍生物或苯并咪唑羧酸衍生物，優(yōu)選在145℃和多磷酸作為溶劑存在下使肼基苯甲酸和芳基酮或雜芳基酮反應。使用本領域技術人員熟知的方法、例如由相應的苯甲酸苯胺制備必需的肼基苯甲酸；還使用本領域技術人員熟知的方法例如通過使相應的酰氯或腈與有機金屬化合物反應而制備芳基酮或雜芳基酮。
將本身為本領域技術人員眾所周知的肽化學偶聯(lián)方法(例如參見Houben-Weyl，“有機化學方法”第15/1或15/2卷，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，1974)有利地用于使式IV的化合物與式III的那些化合物縮合。化合物如羰基二咪唑、碳二亞胺如二環(huán)己基-碳二亞胺或二異丙基碳二亞胺(DIC)、O-((氰基(乙氧羰基)-亞甲基)-氨基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TOTU)或丙基-膦酸酐(PPA)適合于用作縮合試劑或偶聯(lián)試劑。
可以在標準條件下進行縮合。在縮合反應中，用可逆保護基保護所存在的不反應的氨基通常是必不可少的。這同樣適用于未參與反應的羧基，在縮合反應中，這些基團優(yōu)選以如-(C1-C6)-烷基酯、芐酯或叔丁酯形式存在。如果氨基仍然以前體形式如硝基或氰基存在且僅在縮合后通過氫化形成，則氨基保護并非必需。在縮合后，以合適的方式消去存在的保護基。例如，可以通過氫化消去NO2(氨基酸上的胍基保護)、芐酯中的芐氧羰基和芐基。在酸性條件下消去叔丁基類保護基，同時使用仲胺類除去9-芴基甲氧羰基。
本發(fā)明還涉及藥物，其特征在于包括有效量的至少一種式I化合物和/或式I化合物的生理上耐受的鹽和/或式I化合物的任選立體異構形式與藥學上合適且生理上耐受的載體物質、添加劑和/或其它活性化合物和輔助物質。
本發(fā)明的化合物因其藥理特性而適合于預防和治療所有那些其過程涉及IκB激酶活性增加的疾病。這些疾病例如包括運動器的慢性疾病如炎性、免疫學性或代謝介導的急性和慢性關節(jié)炎、關節(jié)病、類風濕性關節(jié)炎或關節(jié)變性病如骨關節(jié)病、椎關節(jié)強直；II型糖尿病、炎性腸??；關節(jié)創(chuàng)傷后軟骨喪失或半月板或膝蓋骨損傷或韌帶破裂后相對長期的關節(jié)固定；或結締組織疾病如膠原性疾病和牙周??；肌痛和骨代謝障礙；或因腫瘤壞死因子α(TNFα)過表達或TNFα濃度增加導致的疾病如惡病質、多發(fā)性硬化、顱腦創(chuàng)傷、局限性回腸炎和腸潰瘍；或疾病如動脈粥樣硬化、狹窄、潰瘍形成、阿爾茨海默病、肌肉損傷、癌病(用細胞毒性劑強化治療)、心肌梗死、痛風、膿毒癥、敗血癥性休克、內(nèi)毒素性休克；病毒感染如流感、肝炎、HIV感染、AIDS或因腺病毒或皰疹病毒導致的疾病；寄生蟲感染如瘧疾或麻風病；真菌或酵母感染；腦膜炎；慢性炎性肺病如慢性支氣管炎或哮喘、急性呼吸窘迫綜合征；急性滑膜炎；結核??；銀屑病；糖尿??；有關器官接受者對移植器官的急性或慢性排斥反應治療、慢性移植物抗宿主病和炎性血管疾病?？梢杂帽景l(fā)明使用的化合物更特異性地治療上述疾病且副作用范圍較小，因為主要僅IκB激酶受到抑制。
可以通過口服、吸入、直腸或經(jīng)皮施用或通過皮下、關節(jié)內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射施用本發(fā)明的藥物。優(yōu)選口服施用。
本發(fā)明還涉及制備藥物的方法，包括將至少一種式I化合物與藥學上合適且生理上耐受的賦形劑和如果合適與其它適宜的活性化合物、添加劑或輔助物質制成合適的施用形式。
合適的固體或蓋侖劑型的實例為顆粒劑、粉劑、糖衣片劑、片劑、(微)膠囊、栓劑、糖漿劑、汁劑、混懸劑、乳劑、滴劑或可注射溶液劑且還有延緩活性化合物釋放的制劑，在制備所述制劑的過程中使用常用的輔助物質，如載體物質、崩解劑、粘合劑、包衣劑、膨脹劑、助流劑或潤滑劑、調味劑、甜味劑和增溶劑?？梢蕴峒暗某Ｓ幂o助物質為碳酸鎂、二氧化鈦、乳糖、甘露糖醇和其它糖類、滑石、乳蛋白、明膠、淀粉、纖維素及其衍生物、動物和植物油如鱈魚肝油、向日葵油、花生油或芝麻油、聚乙二醇和溶劑如無菌水和一元或多元醇類如甘油。優(yōu)選以劑量單位形式制備藥物制劑并施用，各單位含有特定劑量的本發(fā)明式I化合物作為活性組分。就固體劑量單位如片劑、膠囊、糖衣片劑或栓劑而言，該劑量至多可以為約1000mg、優(yōu)選約50mg-300mg，而就安瓿形式的注射液而言，該劑量至多為約300mg、優(yōu)選約10mg-100mg。隨式I化合物的活性的不同，約20mg-1000mg、優(yōu)選100mg-500mg活性化合物的每日劑量被用于治療約70kg體重的成年患者。然而，較高或較低每日劑量可能也是適合的。可以通過僅施用一次的單次劑量單位或若干較小的劑量單位或通過在預定間隔多次施用分劑量而給予每日劑量。
質譜法(FAB-MS、ESI-MS)通常用于測定終產(chǎn)物。溫度以攝氏度給出；RT表示室溫(22℃-26℃)。所使用的縮寫或加以解釋或相當于通常的規(guī)定。以下借助實施例更詳細地解釋本發(fā)明。
制備實施例A)苯胺的制備A.1.)2-(對氟苯胺基)吡啶(3) 將29.34g(0.264mol)的4-氟苯胺(1)和29.98g(0.264mol)的2-氯吡啶(2)的混合物在150℃下加熱2小時。在冷卻至RT后，使其分配在500ml 1NNaOH與500ml乙酸乙酯之間。各用300ml乙酸乙酯將水相萃取兩次并用硫酸鎂干燥合并的有機相。在蒸發(fā)溶劑后，將殘余物用500ml乙酸乙酯處理并加入約40g活性炭。將該混合物在RT下攪拌10分鐘并通過硅藻土過濾。各用1L乙酸乙酯將活性炭重新洗滌4次。在真空(i.v.)中除去溶劑并使殘余物從120ml乙酸乙酯中沉淀。通過抽吸過濾出固體并在50℃真空下干燥。得到41g的2-(對氟苯胺基)吡啶(3)；產(chǎn)率83％。
實驗式C11H9N2；M.W.＝188.21；MS(M+H)189.1。
1H NMR(CDCl3)6.68-6.75(m，2H)，6.88(s，1H)，7.05(t，2H)，7.24-7.32(m，2H)，7.43-7.49(m，1H)，8.18(d，1H)。
A.2.)2-(苯胺基)嘧啶(6) 按照與A.1.)中所述類似的方式，通過與2-氯嘧啶(5)反應由16.2g苯胺(4)得到9.15g(31％)的苯胺基嘧啶6。
實驗式C10H9N3；M.W.＝171.08；MS(M+H)172.2。
B.)通過Z-絲氨酸內(nèi)酯8合成氨基酸
B.1.)(S)-2-氨基-3-二苯基氨基丙酸甲酯(11) B.1.1.)N-芐氧羰基-L-絲氨酸-β-內(nèi)酯(8)將54.8g(0.209mol)三苯膦懸浮于600ml乙腈中并將該混懸液冷卻至-35℃--45℃，同時除去水分。在該溫度下于50分鐘內(nèi)滴加36.4g(0.209mol)偶氮二甲酸二乙酯。然后將該混合物在-35℃下攪拌15分鐘。隨后向該混合物中緩慢加入50g(0.209mol)N-芐氧羰基-L-絲氨酸(7)在500ml乙腈中的溶液，使溫度不超過-35℃。然后將所得混合物在5℃下攪拌12小時。為了終止反應，在減壓條件下從反應溶液中除去溶劑并通過中壓硅膠色譜法純化粗產(chǎn)物(DCM/AcCN25/1)。在除去溶劑后，得到20.8g N-芐氧羰基-L-絲氨酸-β-內(nèi)酯(8)，產(chǎn)率45％；(另外參見Org.Synth.，1991(70)1ff)，為細針狀物。
實驗式C11H11NO4；M.W.＝221.2；MS(M+H)222.1。
1H NMR(DMSO-d6)4.30(m，1H)，4.45(m，1H)，5.10(s，2H)，5.22(m，2H)，7.45(m，5H)，8.20(d，J＝9.8Hz，1H)。
B.1.2.)(S)-2-芐氧羰基氨基-2-二苯基氨基丙酸(9)將5.0g(22.6mmol)絲氨酸內(nèi)酯(5)與20g(118.2mmol)二苯胺一起攪拌并將該混合物在100℃下加熱2小時。通過中壓硅膠色譜法純化粗產(chǎn)物(DCM/甲醇9/1，然后乙酸乙酯/正庚烷4/1)。在除去溶劑后，得到3.65g(產(chǎn)率42％)的純凈2-芐氧羰基氨基-2-二苯基氨基丙酸(9)。
實驗式C23H22N2O4；M.W.＝390.44；MS(M+H)391.2。
1H NMR(DMSO-d6)3.85(m，1H)，4.18(m，1H)，4.3(m，1H)，4.9(m，2H)，6.9(m，5H)，7.25(m，10H)。
B.1.3.)(S)-2-芐氧羰基氨基-2-二苯基氨基丙酸甲酯(10)在-5℃下向75ml甲醇中滴加6.5ml(89.1mmol)亞硫酰氯并將該混合物攪拌15分鐘。然后加入溶于75ml甲醇的3.6g(9.22mmol)2-芐氧羰基氨基-3-二苯基氨基丙酸(9)并將該混合物在室溫下再攪拌3小時(h)。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物用乙酸乙酯處理并用碳酸鈉溶液萃取整個體系。通過快速色譜法純化(正庚烷/乙酸乙酯7∶3)得到2.76g(50％產(chǎn)率)的2-芐氧羰基氨基-3-二苯基氨基丙酸甲酯(10)。
實驗式C24H24N2O4；M.W.＝404.47；MS(M+H)405.2。
1H NMR(DMSO-d6)3.58(s，3H)，3.95(m，1H)，4.18(m，1H)，4.4(m，1H)，4.95(m，2H)，6.9(m，6H)，7.3(m，9H)，7.85(d，J＝9.8Hz，1H)。
B.1.4.)(S)-2-氨基-3-二苯基氨基丙酸甲酯(11)為了消去Z保護基，將2.7g(6.6.8mmol)Z-保護的衍生物(10)溶于500ml甲醇并在保護性氮氣氣氛下提供100mg催化劑(10％Pd(OH)2-C)。然后用大量過量的氫取代惰性氣體并將該混合物在氫氣氣氛下振搖2小時。為了終止反應，過濾出催化劑并濃縮濾液。得到1.65g(產(chǎn)率91％)的2-氨基-3-二苯基氨基丙酸甲酯(11)。
實驗式C16H18N2O2；M.W.＝270.32；MS(M+H)271.2。
1H NMR(DMSO-d6)3.45(s，3H)，3.58(m，1H)，3.8(m，1H)，3.95(m，1H)，6.9(m，6H)，7.3(m，4H)。
B.2.)通過丙烯酸13合成氨基酸B.2.1)對映體的分離通過制備型HPLC將使用丙烯酸制備的外消旋氨基酸拆分成對映體，其中使用手性相如Chiralpak AD(Daicel)100×380，RT，流速為300ml/分鐘。通過分析型HPLC(如Chiralpak-AD-H(Daicel)4.6×250，RT，30℃，流速1ml/分鐘，室溫)測定對映體純度。
B.2.2.(3-(N-4-氟苯基-N-2-吡啶基)氨基)-2-(二叔丁氧羰基)氨基丙酸甲酯(14) B.2.2.1.)2-(二叔丁氧羰基)氨基丙烯酸甲酯(13)將50g(0.228mol)Boc-絲氨酸(12)溶于300ml乙腈。加入107g(0.493mol)Boc酸酐和2.64g(22mmol)DMAP。將該混合物在RT下攪拌過夜，此后在真空下除去溶劑并將殘余物用500ml乙酸乙酯處理。用500ml 1N HCl洗滌有機相并使用硫酸鎂干燥。通過在-30℃下從200ml庚烷中結晶、然后通過抽吸過濾得到23g丙烯酸13。濃縮母液并將殘余物溶于140ml乙腈。加入31g(0.142mol)Boc酸酐和1.26g(10mmol)DMAP。在50℃下將該混合物加熱8小時后，在真空下除去溶劑并將殘余物用500ml乙酸乙酯處理。用400ml 1N HCl洗滌有機相并用硫酸鎂干燥。在真空下除去溶劑后，通過從庚烷中結晶又得到31.5g丙烯酸酯13。產(chǎn)率54.5g(0.181mol)，79％。實驗式C14H23NO6；M.W.＝301.34；MS((M*2)+Na+)625.7。
1H NMR(DMSO-d6)1.40(s，18H)，3.74(s，3H)，5.85(s，1H)，6.28(S，1H)。
B.2.2.2.)(3-(N-4-氟苯基-N-2-吡啶基)氨基)-2-(二叔丁氧羰基)氨基丙酸甲酯(14)將11.5g(38.2mmol)丙烯酸酯13與7.2g(38.2mmol)苯胺3和37.3g(114mmol)碳酸銫混合。加入100ml乙腈并將該混合物在55℃下攪拌2天。此后將該體系在RT下再攪拌2天。通過使用硅藻土抽吸過濾出固體并各使用100ml乙腈洗滌3次。在真空下從合并的有機相中除去溶劑并對殘余物進行使用庚烷/乙酸乙酯4∶1的硅膠色譜處理。產(chǎn)率14g(75％)14。
實驗式C25H32FN3O6；M.W.＝489.55；MS(M+H)490.6。
1H NMR(CDCl3)1.28(s，18H)，3.72(s，3H)，4.25(dd，1H)，4.75(dd，1H)，5.83(dd，1H)，6.22(d，1H)，6.56-6.61(m，1H)，7.05-7.12(m，2H)，7.19-7.26(m，3H)，8.18(d，1H)。
B.2.3.)(3-(N-苯基-N-2-嘧啶基)氨基)-2-(二叔丁氧羰基)氨基丙酸甲酯(15) 當按照B.2.2.2.)中所述類似的方式進行反應時，由35g 6得到3g(7％)氨基酸15。實驗式C24H32N4O6；M.W.＝472.23；MS(M+H)473.1。
C.)合成雜環(huán)母體物質 C.1.)吲哚母體物質的合成2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酸(20)C.1.1.)1-二甲氨基-4，4-二甲氧基戊-1-烯-3-酮(18)將100g(0.76mol)3，3-二甲氧基-2-丁酮(16)與90.2g N，N-二甲基甲酰胺二甲基縮醛(17)(0.76mol)在120℃下一起攪拌48小時。通過蒸餾從反應溶液中連續(xù)除去反應中形成的甲醇。當冷卻溶液時，結晶自發(fā)發(fā)生，通過添加少量庚烷使結晶完全。得到128.24g粗產(chǎn)物18(產(chǎn)率90％)，不經(jīng)任何進一步純化使其反應。
實驗式C9H17NO3；M.W.＝187.24；MS(M+H)188.2。
1H NMR(DMSO-d6)1.22(s，3H)，2.80(s，3H)，3.10(s，9H)，5.39(d，J＝15Hz，1H)，7.59(d，J＝15Hz，1H)。
C.1.2.)[4-(1，1-二甲氧基乙基)嘧啶-2-基]甲胺(19)將1.22g(53mmol)鈉溶于100ml無水乙醇。向該溶液中加入5.8g(53mmol)鹽酸甲胍和10g(53mmol)1-二甲氨基-4，4-二甲氧基戊-1-烯-3-酮(18)，同時攪拌并將整個體系在沸騰加熱下加熱4小時。為了終止反應，蒸發(fā)乙醇。不經(jīng)任何進一步純化而將所得產(chǎn)物19用于隨后的反應。產(chǎn)量11.5g(58mmol，定量)。
實驗式C9H15N3O2；M.W.＝197.24；MS(M+H)198.2。
1H NMR(DMSO-d6)1.45(s，3H)，2.78(s，3H)，3.10(s，6H)，6.75(d，J＝3 Hz，1H)，7.0-7.1(s(b)，1H)，8.30(d，J＝3Hz，1H)。
C.1.3.)2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酸(20)在室溫下和攪拌的同時向150ml 50％硫酸中加入5g(25mmol)[4-(1，1-二甲氧基乙基)嘧啶-2-基]甲胺(19)和3.85g 4-肼基苯甲酸，并將該混合物在130℃下加熱4小時。通過蒸餾從反應溶液中連續(xù)除去反應中形成的甲醇。在冷卻至10℃后，將該反應混合物傾倒在200ml冰上并用濃氫氧化鈉溶液將pH調節(jié)至約5.5。過濾出該過程中形成的硫酸鈉與產(chǎn)物的混合物沉淀并用甲醇將過濾的殘余物萃取數(shù)次。濃縮合并的甲醇萃取物并通過快速色譜法(DCM/甲醇9∶1)純化產(chǎn)物20。產(chǎn)率0.76g(11％)。
實驗式C14H13N4O2；M.W.＝268.28；MS(M+H)269.1。
1H NMR(DMSO-d6)2.95(s，3H)，6.90-7.10(s(b)，1H)，7.18(d，J＝3Hz，1H)，7.4(s，1H)，7.58(d，J＝4.5Hz，1H)，7.80(d，J＝4.5Hz，1H)，8.30(s，1H)，7.80(d，J＝4.5Hz，1H)，8.38(d，J＝3Hz，1H)，11.85(s，1H)，12.40-12.60(s(b)，1H)。
C.2.)苯并咪唑母體物質的合成2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-甲酸(25) C.2.1.)41-二甲氨基-1，1-二甲氧基丁-3-烯-2-酮(22)將300g(307ml，2.54mol)甲基乙二醛二甲基縮醛(21)與303g(337ml，2.54mol)N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙縮醛(17)在110℃下一起攪拌4小時。通過蒸餾從反應溶液中連續(xù)除去反應中形成的甲醇。在將反應溶液冷卻后，將其用庚烷萃取并蒸發(fā)溶劑。得到303g粗產(chǎn)物22(產(chǎn)率70％)，不經(jīng)任何進一步純化使其反應。
實驗式C8H15NO3；M.W.＝173.21；MS(M+H)174.1。
1H NMR(DMSO-d6)2.10(s，1H)，2.80(s，3H)，3.10(s，3H)，3.25(s，3H)，3.3(s，3H)，4.42(s，1H)，5.19(d(b)，J＝12.8Hz，1H)，7.60(d，J＝15Hz，1H)。
C.2.2.)(4-二甲氧基甲基嘧啶-2-基)甲胺(23)將0.33g(14.4mmol)鈉溶于50ml無水乙醇。向該溶液中加入1.57g(14.4mmol)鹽酸甲胍和2.48g(14.4mmol)4-二甲氨基-1，1-二甲氧基-丁-3-烯-2-酮(22)，同時攪拌，并將整個體系在沸騰加熱下加熱3小時。通過蒸發(fā)乙醇終止反應。不經(jīng)任何進一步純化使用所得產(chǎn)物23。產(chǎn)量2.6g(定量)。
實驗式C8H13N3O2；M.W.＝183.21；MS(M+H)184.1。
1H NMR(DMSO-d6)2.78(s，6H)，3.10(s，3H)，5.02(s，1H)，6.62(d，J＝3Hz，1H)，8.30(d，J＝3Hz，1H)。
C.2.3.)2-甲氨基嘧啶-4-甲醛(24)將10g(54mmol)的(4-二甲氧基甲基嘧啶-2-基)甲胺(23)溶于54ml 2N硫酸并將該溶液在80℃下加熱3小時，同時攪拌。將該反應冷卻后，使用固體Na2CO3將該反應溶液的pH謹慎調節(jié)至約9并用乙醇萃取3次。在蒸發(fā)溶劑后，合并的干燥萃取物生成標題醛24，產(chǎn)率為60％(4.47g)。
實驗式C6H7N3O；M.W.＝137.12；MS(M+H)138.2。
1H NMR(DMSO-d6)2.60-2.80(s(b)，3H)，6.95(d，J＝3Hz，1H)，7.40-7.60(s(b)，1H)，8.55(d，J＝3Hz，1H)。
C.2.4.)2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-甲酸(25)將4.3g(31.3mmol)甲氨基嘧啶-4-甲醛(24)和4.8g(31.1mmol)3，4-二氨基苯甲酸在150℃下于300ml硝基苯中加熱2小時。在將該混合物冷卻至0℃后，通過過濾從硝基苯中分離出苯并咪唑沉淀且通過快速色譜法純化產(chǎn)物25(DCM/甲醇4∶1)。產(chǎn)率2.66g(32％)。
實驗式C13H11N5O2；M.W.＝269.28；MS(M+H)270.2。
1H NMR(DMSO-d6)2.95(s，3H)，7.50(d，J＝3Hz，1H)，7.75(d，J＝4.5Hz，1H)，7.90(d，J＝4.5Hz，1H)，8.35(s，1H)，8.55(d，J＝3Hz，1H)，8.70-9.05(s(b)，1H)。
D.)吲哚終產(chǎn)物D.1.)N-[(S)-2-二苯基氨基-1-(5-氧代-4，5-二氫[1，3]噁二唑-2-基)乙基]-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺(28)
D.1.1.)3-二苯基氨基-2-{[2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-羰基]-(S)-氨基}丙酸甲酯(26)將5.0g(18.64mmol)2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酸(20)溶于1.2L DMF，然后依次加入7.9g(24.08mmol)TOTU和7.9ml(46.45mmol)乙基二異丙胺。將該溶液在5℃下攪拌20分鐘，此后向其中加入0.73g(3.28mmol)(S)-2-氨基-3-二苯基氨基丙酸甲酯(11)。在將該混合物攪拌15小時后，將其在減壓下濃縮并將殘余物用正丁醇處理；然后用飽和碳酸氫鈉溶液萃取有機相以分離出副產(chǎn)物。在用MgSO4干燥有機相并濃縮后，通過硅膠快速色譜法分離標題化合物26的甲酯(DCM∶MeOH＝19∶1)。產(chǎn)率4.3g(98％)。
實驗式C30H28N6O3；M.W.＝520.22；MS(M+H)521.3。
1H NMR(DMSO-d6)2.95(s(b)，3H)，3.60(s，3H)，4.19-4.58(m，2H)，4.85(q，1H)，6.90-7.10(m，7H)，7.18(d，J＝3Hz，1H)，7.25-7.40(m，5H)，7.50(d，J＝4.5Hz，1H)，7.65(d，J-＝4.5Hz，1H)，8.05(s，1H)，8.35(d，J＝3Hz，1H)，8.70(d，J＝3.75Hz，1H)，11.85(s，1H)。
D.1.2.)N-((S)-2-二苯基氨基-1-肼基羰基乙基)-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺(27)將1.0g(1.92mmol)3-二苯基氨基-2-{[2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-羰基]-(S)-氨基}丙酸甲酯(26)溶于10ml甲醇，此后加入0.48g(9.95mmol)水合肼并將該混合物在RT下攪拌15小時。通過過濾從母液中分離出產(chǎn)物沉淀(0.3g)。通過硅膠快速色譜法從濃縮的母液中再分離腙27(0.1g)(DCM∶MeOH＝19∶1)。產(chǎn)率0.4g(40％)。
實驗式C29H28N8O2；M.W.＝520.6；MS(M+H)521.4。
1H NMR-(DMSO-d6)2.95(s(b)，3H)，4.02-4.58(m，2H)，4.4(s，2H)，4.85(q，1H)，6.90-7.10(m，7H)，7.18(d，J＝3Hz，1H)，7.20-7.45(m，5H)，7.50(d，J＝4.5Hz，1H)，7.62(d，J＝4.5Hz，1H)，7.99(s，1H)，8.25(d，J＝3Hz，1H)，8.35(s(b)，1H)，9.30(s，1H)，11.70(s，1H)。
D.1.3.)N-[(S)-2-二苯基氨基-1-(5-氧代-4，5-二氫[1，3，4]噁二唑-2-基)乙基]-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺(28)將200mg(0.384mmol)N-((S)-2-二苯基氨基-1-肼基羰基乙基)-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺(27)懸浮于20ml二氯甲烷中并在0℃下和攪拌的同時滴加光氣在甲苯中的20％溶液(0.398mmol)。將該混合物在室溫下再攪拌15小時并蒸發(fā)溶劑。然后通過硅膠快速色譜法分離噁二唑酮28(DCM∶MeOH＝9∶1)。產(chǎn)率160mg(76％)。
實驗式C30H26N8O3；M.W.＝546.6；MS(M+H)547.3。
1H NMR(DMSO-d6)2.95(s(b)，3H)，4.02-4.58(m，2H)，4.85(q，1H)，6.90-7.10(m，7H)，7.15(d，J＝3Hz，1H)，7.20-7.40(m，6H)，7.52(d，J＝4.5Hz，1H)，7.68(d，J＝4.5Hz，1H)，8.10(s，1H)，8.92(d，J＝3Hz，1H)，11.78(s，1H)，12.15-12.40(s(b)，1H)。
D.2.)N-{1-氨基甲?；?2-[(4-氟苯基)吡啶-2-基氨基]乙基}-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酸(30)
D.2.1.)3-[(4-氟苯基)吡啶-2-基氨基]-2-{[2-(2-甲氨基-嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-羰基]氨基}丙酸甲酯(29)將0.75g(1.53mmol)14溶于10L二噁烷并將該溶液冷卻至0℃。加入10ml 4N HCl/二噁烷并在2小時內(nèi)使該混合物達到RT；然后將該體系攪拌12小時。在真空下除去溶劑。將殘余物用20ml DMF處理(溶液A)。將617mg酸20溶于20ml DMF并將該溶液冷卻至0℃。加入1.05g HATU和1.6ml DIEA。在0℃下將該混合物攪拌40分鐘后，加入溶液A。使該混合物達到RT，然后攪拌4小時。在真空下除去溶劑并使殘余物分配在100ml飽和(sat.)NaHCO3溶液與100ml乙酸乙酯之間。各用50ml乙酸乙酯將水相萃取3次并用100ml飽和NaCl溶液洗滌合并的有機相。使用硫酸鎂干燥有機相。在真空下除去溶劑并對殘余物進行使用庚烷/乙酸乙酯1∶3的硅膠色譜處理。得到560mg(68％)的酯29。
實驗式C29H26FN7O3；M.W.＝539.57；MS(M+H)540.2。
D.2.2.)N-{1-氨基甲?；?2-[(4-氟苯基)吡啶-2-基氨基]乙基}-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺(30)在0℃下將320mg(0.593mmol)酯29溶于50ml氨飽和的甲醇。將該溶液攪拌24小時，然后使其達到RT。在真空下除去溶劑并使殘余物從5ml乙酸乙酯中沉淀。通過抽吸過濾出固體并在50℃真空下干燥。得到270mg(87％)的酰胺30。實驗式C28H25FN8O2；M.W.＝524.56；MS(M+H)525.2。
1H NMR(DMSO-d6)2.45(s，3H)，4.10(d，1H)，4.52-4.66(m，2H)，6.26(d，1H)，6.77(t，1H)，7.02(bs，1H)，7.09-7.17(m，2H)，7.22-7.32(m，5H)，7.38-7.46(m，1H)，7.47-7.58(m，3H)，7.92(s，1H)，8.27-8.36(M，2H)，8.59(d，1H)，11.70(s，1H)。
D.3.)N-[(S)-1-(5-氧代-4，5-二氫-1，3，4-噁二唑-2-基)-2-(苯基吡啶-2-基氨基)乙基]-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺(33) D.3.1.)(3-(N-苯基-N-2-吡啶基)氨基)-2-(二叔丁氧羰基)-氨基丙酸甲酯(31)將4.96g(16.5mmol)丙烯酸酯13與5.6g(32.9mmol)2-苯胺基吡啶和32.16g(98.7mmol)碳酸銫混合。加入50ml乙腈并將該混合物在45℃下攪拌2天。通過使用硅藻土抽吸過濾出固體并各使用100ml乙腈洗滌3次。蒸發(fā)合并的有機相并對殘余物進行使用庚烷/乙醚1∶1的硅膠色譜處理。得到5.66g(73％)的酯31。
實驗式C25H33N3O6；M.W.＝471.56；MS(M+H)472.2。
D.3.2.)如B.2.1.)中所述分離對映體。
D.3.3.)2-{[2-(2-甲氨基-嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-羰基]氨基}-3-(苯基吡啶-2-基氨基)丙酸甲酯(32)將2.9g 31的S對映體溶于30ml二噁烷并將該溶液冷卻至0℃。加入30ml 4N HCl/二噁烷，此后使該混合物達到RT，然后將該體系攪拌12小時。在真空下除去溶劑。將殘余物用30ml DMF處理(溶液A)。將2.47g(9.2mmol)的酸20溶于50ml DMF并冷卻至0℃。加入4.21g HATU和6.4ml DIEA。在0℃下將該混合物攪拌45分鐘后，使其達到RT并加入溶液A。將該混合物在RT下攪拌12小時。在真空下除去溶劑并使殘余物分配在300ml飽和NaHCO3溶液與300ml乙酸乙酯之間。各用100ml乙酸乙酯將水相萃取3次并用400ml飽和NaCl溶液洗滌合并的有機相。使用硫酸鎂干燥有機相。在真空下除去溶劑并對殘余物進行使用庚烷/乙酸乙酯1∶3的硅膠色譜處理。得到1.78g(55％)的酯32。
實驗式C29H27N7O3；M.W.＝521.58；MS(M+H)522.2。
D.3.4.)N-[(S)-1-(5-氧代-4，5-二氫-1，3，4-噁二唑-2-基)-2-(苯基吡啶-2-基氨基)乙基]-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺(33)將1.78g(3.4mmol)酯32溶于30ml MeOH。加入0.83ml水合肼并將該混合物在40℃下攪拌5小時。此后再加入1.6ml水合肼并將該混合物在RT下攪拌15小時。在真空下除去溶劑并將殘余物用80ml二氯甲烷處理。加入3.2ml光氣在甲苯中的20％溶液并將該混合物攪拌3天。此后在真空下除去溶劑并使殘余物分配在80ml水與80ml乙酸乙酯之間。當進行該步驟時，沉淀出固體并通過抽吸將其濾出。蒸發(fā)有機相并將殘余物與所述固體合并，進行使用庚烷/乙酸乙酯1∶5的硅膠色譜。得到390mg(21％)的噁二唑酮33。實驗式C29H25N9O3；M.W.＝547.58；MS(M+H)548.2。
1H NMR(DMSO-d6)2.96(s，3H)，4.30(dd，1H)，4.67(dd，1H)，5.40(dd，1H)，6.32(d，1H)，6.70-6.75(m，1H)，6.98(bs，1H)，7.16(d，1H)，7.22-7.33(m，4H)，7.38-7.46(m，3H)，7.52(d，1H)，7.63(d，1H)，8.08(s，1H)，8.21(d，1H)，8.31-8.35(m，1H)，9.00(d，1H)，11.72(s，1H)，12.15(s，1H)。
D.4.)N-{1-氨基甲?；?2-[(4-氟苯基)吡啶-2-基氨基]乙基}-2-(2-氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺(35) D.4.1.)3-[(4-氟苯基)吡啶-2-基氨基]-2-{[2-(2-氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-羰基]氨基}丙酸甲酯(34)當按照與D.2.1.)中所述類似的方式進行反應時，由750mg 14得到370mg(46％)的甲酯34。
實驗式C28H24FN7O3；M.W.＝525.55；MS(M+H)526.2。
D.4.2.)N-{1-氨基甲酰基-2-[(4-氟苯基)吡啶-2-基氨基]乙基}-2-(2-氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺(35)當按照與D.2.2.)中所述類似的方式進行反應時，由150mg 34得到95mg(65％)的酰胺35。
實驗式C27H23FN8O2；M.W.＝510.54；MS(M+H)511.2。
1H NMR (DMSO-d6)4.08-4.17(m，1H)，4.54-4.65(m，2H)，6.29(d，1H)，6.54(s，2H)，6.74-6.80(m，1H)，7.10(s，1H)，7.18(d，1H)，7.22-7.31(m，4H)，7.38-7.56(m，6H)，7.92(s，1H)，8.29-8.35(m，2H)，8.74(d，1H)，11.80(s，1H)。
D.5.)N-[2-[(4-氟苯基)吡啶-2-基氨基]-1-(4H-[1，2，4]三唑-3-基)乙基]-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺(36)
將130mg(0.25mmol)酰胺35溶于10ml DMF。加入40μl DMF二甲基縮醛并將該混合物在90℃下加熱4小時。在真空下除去溶劑并將殘余物用3.5ml乙酸處理。在加入27μl水合肼后，將該混合物攪拌18小時。在真空下除去溶劑并通過制備型HPLC純化殘余物。得到84mg(50％)三唑26。
實驗式C29H25FN10O；M.W.＝548.59；MS(M+H)549.2。
1H NMR(DMSO-d6)3.04(s，3H)，4.36-4.43(m，1H)，4.49-4.59(m，1H)，5.60-5.67(m，1H)，6.50(d，1H)，6.78(t，1H)，7.17-7.37(m，7H)，7.45-7.65(m，4H)，8.02(s，1H)，8.19(d，1H)，8.35(d，1H)，8.39(d，1H)，11.85(s，1H)。
D.6.)N-[1-氨基甲?；?2-(苯基噻唑-2-基氨基)乙基]-S-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺(42) D.6.1.)苯基噻唑-2-基胺(39)將10g(65.7mmol)苯硫脲37溶于100ml乙酸。加入9.9ml縮醛38并將該混合物在100℃下加熱2小時。在真空下除去溶劑并使殘余物分配在300ml 1N NaOH與300ml乙酸乙酯之間。各用100ml乙酸乙酯將水相萃取兩次并使用硫酸鎂干燥合并的有機相。除去溶劑并使殘余物從50ml二異丙醚中沉淀。通過抽吸過濾出固體并在50℃和真空下干燥。得到2.5g苯胺39。蒸發(fā)二異丙醚母液并對殘余物進行使用庚烷/乙酸乙酯2∶1的硅膠色譜處理。又得到3.5g 39。產(chǎn)率6.0g(52％)。
實驗式C9H8N2S；M.W.＝176.24；MS(M+H)177.1。
D.6.2.)(3-(N-苯基-N-2-噻唑基)氨基)-2-(二叔丁氧羰基)氨基丙酸甲酯(40)當按照與D.3.1.)中所述類似的方式進行反應時，由3.8g(12.5mmol)的丙烯酸酯13、2.2g(12.5mmol)的苯胺39和20g碳酸銫得到4.5g(75％)酯40。
實驗式C23H31N3O6S；M.W.＝477.58；MS(M+H)478.2。
D.6.3.)如B.2.1.)中所述分離對映體。
D.6.4.)S-2-{[2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-羰基]-氨基}-3-(苯基噻唑-2-基氨基)丙酸甲酯(41)當按照與D.3.3.)中所述類似的方式進行反應時，由1.07g(2.2mmol)酯40和901mg(3.3mmol)酸20得到640mg(55％)41。
實驗式C27H25N7O3S；M.W.＝527.61；MS(M+H)528.1。
D.6.4.)N-[1-氨基甲酰基-2-(苯基噻唑-2-基氨基)乙基]-S-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺(42)當按照與D.2.2.)中所述類似的方式進行反應時，由500mg(0.95mmol)41得到340mg(70％)酰胺42。
實驗式C26H24N8O2S；M.W.＝512.60；MS(M+H)513.3。
1H NMR(DMSO-d6)2.97(s，3H)，4.23-4.30(M，1H)，4.39-4.48(M，1H)，4.71-4.78(m，1H)，6.78(d，1H)，7.16(d，1H)，7.28-7.35(m，3H)，7.37-7.60(m，7H)，7.98(s，1H)，8.33(d，1H)，8.62(d，1H)，11.70(s，1H)。
D.7.)N-[1-甲氧基氨基甲?；?2-(苯基吡啶-2-基氨基)乙基]-S-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺(43)
將80mg(0.95mmol)O-甲基鹽酸羥胺溶于10ml THF并冷卻至-40℃。然后滴加0.95ml(1.9mmol)異丙基氯化鎂在THF中的2M溶液。在1小時內(nèi)使該混合物達到-20℃，然后滴加100mg(0.19mmol)酯32在3ml THF中的溶液。在4小時內(nèi)使該混合物達到RT并通過添加5ml水終止反應。在真空下除去THF并使殘余物分配在20ml飽和氯化銨溶液與20ml乙酸乙酯之間。各用20ml乙酸乙酯將水相萃取3次并使用硫酸鎂干燥合并的有機相。在真空下除去溶劑并通過制備型HPLC純化殘余物。得到60mg(61％)的異羥肟酸甲酯43。
實驗式C29H28N8O3；M.W.＝536.60；MS(M+H)537.2。
1H NMR(DMSO-d6)2.95(s，3H)，3.52(s，3H)，4.09-4.18(m，1H)，5.51-4.62(m，2H)，6.33(d，1H)，6.78(t，1H)，7.00(bs，1H)，7.18.(d，1H)，7.25-7.33(m，4H)，7.49-7.61(m，5H)，7.98(s，1H)，8.29-8.36(m，2H)，8.79(d，1H)，11.31(s，1H)，11.75(s，1H)。
D.8.)N-{1-氨基甲?；?2-[(苯基)吡啶-2-基氨基]乙基}-2-(2-氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺(45)
D.8.1.)3-[(苯基)吡啶-2-基氨基]-2-{[2-(2-氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-羰基]氨基}丙酸甲酯(44)當按照與B.1.4.)和D.1.1.)中所述類似的方式進行反應時，由540mgrac-10得到816mg(80％)的甲酯44。
實驗式C29H26N6O3；M.W.＝506.56；MS(M+H)507.37。
D.8.2.)N-{1-氨基甲?；?2-[(苯基)吡啶-2-基氨基]乙基}-2-(2-氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺(45)當按照與D.2.2.)中所述類似的方式進行反應時，由150mg 44得到162mg(67％)酰胺45。
實驗式C28H25N7O2；M.W.＝491.56；MS(M+H)492.32。
1H NMR(DMSO-d6)3.18(s(b)，3H)，4.05-4.13(m，2H)，4.85(q，1H)，6.58(s(b)，2H)，6.88-7.59(m，19H)，7.98(s，1H)，8.25(d，J＝3Hz，1H)，8.35(d，J＝2Hz，1H)，11.78(s，1H)。
D.9.)N-{1-氨基甲?；?2-[(苯基)嘧啶基-2-基氨基]乙基}-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺(47)
D.9.1.)3-[(苯基)嘧啶基-2-基氨基]-2-{[2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-羰基]氨基}丙酸甲酯(46)當按照與D.2.1.)中所述類似的方式進行反應時，由2.36g 15得到1.75g(67％)甲酯46。
實驗式C28H26N8O3；M.W.＝522.57；MS(M+H)523.3。
D.9.2.)N-{1-氨基甲?；?2-[(苯基)嘧啶基-2-基氨基]乙基}-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺(47)當按照與D.2.2.)中所述類似的方式進行反應時，由700mg 46得到440mg(65％)酰胺47。
實驗式C27H25N9O2；M.W.＝507.2 1；MS(M+H)508.4。
1H NMR(DMSO-d6)3.0(s(b)，3H)，4.20-4.32(m，1H)，4.45-4.59(m，2H)，4.75-4.90(m，1H)，6.75(m，1H)，7.10-7.60(m，12H)，7.95(s，1H)，-8.35-8.45(m，4H)，11.85(s(b)，1H)。
D.10.)N-[1-(2-羥乙基氨基甲?；?-2-(苯基嘧啶-2-基氨基)乙基]-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺(49)
D.10.1.)2-{[2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-羰基]氨基}-3-(苯基嘧啶-2-基氨基)丙酸(48)將4.0g甲酯46溶于400ml甲醇。加入40ml 2N NaOH水溶液并將整個體系在室溫下攪拌12小時。蒸發(fā)溶劑后，將殘余物溶于水并使用飽和NaH2PO4溶液將pH調節(jié)至～5。過濾出所得沉淀并用水洗滌。得到1.3g(產(chǎn)率93％)酸48。
實驗式C29H26N6O3；M.W.＝506.21；MS(M+H)507.3。
D.10.2.)N-[1-(2-羥乙基氨基甲?；?-2-(苯基嘧啶-2-基氨基)乙基]-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺(49)將200mg酸48溶于2ml無水DMF。加入94mg HOAt和158μl DIEA。然后滴加56μl乙醇胺并將該混合物冷卻至0℃；然后加入195mg EDC。在室溫下攪拌2天后，蒸發(fā)溶劑并通過MPLC純化粗產(chǎn)物(洗脫劑DCM∶MeOH＝9∶1)。產(chǎn)率108mg(50％)標題酰胺49。
實驗式C31H31N8O2；M.W.＝549.64；MS(M+H)550.4。
1H NMR(DMSO-d6)1，2(t，2H)，3.0(s(b)，3H)，3.35(t，1H)，4.00-4.32(m，2H)，4.80-4.99(m，1H)，6.95(m，1H)，7.00-7.65(m，7H)，7.90(m，1H)，-8.35-8.40(m，1H)，11.90(s(b)，1H)。
D.11.)(S)-2-{[2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-羰基]-氨基}-3-[苯基-(4-三氟甲基嘧啶-2-基)氨基]丙酸(54)
D.11.1.)苯基-(4-三氟甲基嘧啶-2-基)胺(51)當按照與A.1.)中所述類似的方式進行反應時，由5.1g的苯胺(4)和5g氯嘧啶50得到5.1g(78％)的苯胺51。
實驗式C11H8F3N3；M.W.＝239.20；MS(M+H)240.1。
D.11.2.)(3-(N-苯基-N-4-三氟甲基嘧啶-2-基)氨基)-2-二叔丁氧羰基)氨基丙酸甲酯(52)當按照與D.3.1.)中所述類似的方式進行反應時，由2.5g(8.4mmol)丙烯酸酯13、3g(12.5mmol)苯胺51和16g(50mmol)碳酸銫得到3.9g(86％)酯52。
實驗式C25H31F3N4O6；M.W.＝540.54；MS(M+H)541.2。
D.11.3.)如B.2.1.)中所述分離對映體。
D.11.4.)S-2-{[2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-羰基]-氨基}-3-[苯基-(4-三氟甲基嘧啶-2-基)氨基]丙酸甲酯(53)當按照與D.3.3.)中所述類似的方式進行反應時，由743mg(1.375mmol)酯52的S對映體和550mg(1.436mmol)酸20得到467mg(58％)53。
實驗式C29H25F3N8O3；M.W.＝590.57；MS(M+H)591.7。
D.11.5.)(S)-2-{[2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-羰基]-氨基}-3-[苯基-(4-三氟甲基嘧啶-2-基)氨基]丙酸(54)當按照與D.10.1.)中所述類似的方式進行反應時，由97mg(0.164mmol)酯53得到38mg(40％)酸54。
實驗式C28H23F3N8O3；M.W.＝576.54；MS(M+H)577.7。
1H NMR(DMSO-d6)2.95(s，3H)，.4.27-4.34(m，1H)，4.54-4.63(m，1H)，4.83-4.92(m，1H)，6.90(bs，1H)，7.15(d，2H)，7.19-7.23(m，1H)，7.27-7.36(m，5H)，7.45-7.55(m，2H)，7.96(s，1H)，8.32(s，1H)，8.41(bs，1H)，8.66(d，1H)，11.70(s，1H)。
D.12.)N-{1-氨基甲?；?2-[(4-氟苯基)-(5-甲基嘧啶-2-基)氨基]乙基}-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺(61) D.12.1.)2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酸五氟苯酯(55)將6.38g(23.78mmol)酸20懸浮于100ml THF中。然后加入5.25g(28.54mmol)五氟苯酚和5.47g(28.54mmol)1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC*HCl)。將該混合物在RT下攪拌15小時，此后在真空下除去溶劑并使殘余物分配在300ml飽和NaHCO3溶液與300ml乙酸乙酯之間。通過硅藻土過濾出固體并各用100ml乙酸乙酯洗滌殘余物兩次。分離各相并各用100ml乙酸乙酯洗滌水相兩次。用200ml飽和NaCl溶液洗滌合并的有機相，然后用MgSO4干燥。在真空下除去溶劑后，對殘余物進行使用庚烷/乙酸乙酯1∶1的硅膠色譜處理。得到4.7g(46％)的五氟苯酯55。
實驗式C20H11F5N4O2；M.W.＝434.33；MS(M+H)435.4。
D.12.2.)2-氯-5-甲基嘧啶(57)將10.0g(61.35mmol)2，4-二氯-5-甲基嘧啶(56)溶于50ml THF。加入12.93g(184mmol)鋅并將該混合物加熱至回流。然后緩慢滴加3.51ml(61.35mmol)乙酸在10ml THF中的溶液。在添加完成后，再將該混合物加熱至回流1小時。再次滴加在5ml THF中的1.5ml乙酸并將該混合物加熱至回流1小時。然后使該體系冷卻至RT，此后將該體系通過硅藻土過濾；隨后各用20ml THF洗滌兩次。在真空下除去溶劑并對殘余物進行硅膠色譜處理。得到4.7g(60％)的氯嘧啶57。
實驗式C5H5ClN2；M.W.＝128.56；MS(M+H)129.2。
D.12.3.)(4-氟苯基)-(5-甲基嘧啶-2-基)胺(58)當按照與A.1.)中所述類似的方式進行反應時，由2.5g(19.45mmol)2-氯-5-甲基嘧啶(57)和2.7g(24.31mmol)4-氟苯胺(1)得到1.8g(45％)苯胺58。
實驗式C11H10FN3；M.W.＝203.22；MS(M+H)204.2。
D.12.4.)(3-(N-4-氟苯基-N-5-甲基嘧啶-2-基)氨基)-2-二叔丁氧羰基)氨基丙酸甲酯(59)當按照與D.3.1.)中所述類似的方式進行反應時，由2.67g(8.86mmol)丙烯酸酯10、1.8g(8.86mmol)苯胺58和8.86g(26.58mmol)碳酸銫得到2.88g(64％)酯59。
實驗式C25H33FN4O6；M.W.＝504.56；MS(M+H)505.6。
D.12.5.)3-[(4-氟苯基)-(5-甲基嘧啶-2-基)氨基]-2-{[2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-羰基]氨基}丙酸甲酯(60)
將500mg(0.991mmol)酯59溶于10ml二氯甲烷中并將該溶液冷卻至0℃。加入5ml TFA，然后使該混合物達到RT，此后將該體系攪拌1小時。在真空下除去溶劑。將殘余物用10ml DMF處理，此后加入430mg(0.991mmol)55和1.38ml(7.93mmol)DIEA。將該混合物在RT下攪拌15小時，此后在真空下除去溶劑并對殘余物進行使用庚烷/乙酸乙酯1∶3的硅膠色譜處理。得到423mg(77％)60。
實驗式C29H27FN8O3；M.W.＝554.59；MS(M+H)555.2。
D.12.6.)N-{1-氨基甲?；?2-[(4-氟苯基)-(5-甲基嘧啶-2-基)氨基]乙基}-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺(61)當按照與D.2.2.)中所述類似的方式進行反應時，由260mg(0.469mmol)酯60得到250mg(99％)酰胺61。
實驗式C28H26FN9O2；M.W.＝539.58；MS(M+H)540.2。
1H NMR(DMSO-d6)2.11(s，3H)，2.95(s，3H)，4.21(dd，1H)，4.48(dd，1H)，4.75-4.80(m，1H)，7.01(bs，1H)，7.10-7.16(m，4H)，7.22-7.30(m，3H)，7.43(s，1H)，7.47-7.53(m，2H)，7.91(s，1H)，8.26(s，2H)，8.29.8.34(m，2H)，11.70(s，1H)。
F.)苯并咪唑終產(chǎn)物F.1.)N-((S)-1-氨基甲?；?2-二苯基氨基乙基)-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-甲酰胺(63)
F.1.1.)3-二苯基氨基-2-{[2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-羰基]-(S)-氨基}丙酸甲酯(62)將2.6g(9.6mmol)2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-甲酸(25)溶于300ml DMF，然后依次加入3.17g(9.6mmol)TOTU和1.6ml(11.6mmol)乙基二異丙胺。將該混合物在5℃下攪拌20分鐘，然后向該溶液中加入2.6g(9.6mmol)(S)-2-氨基-3-二苯基氨基丙酸甲酯(11)。在將該混合物攪拌16小時后，在減壓下蒸發(fā)并通過硅膠快速色譜法分離甲酯62(DCM∶MeOH＝9∶1)。產(chǎn)率1.61g(32％)。
實驗式C29H27N7O3；M.W.＝521.58；MS(M+H)522.3。
1H NMR(DMSO-d6)2.95(s(b)，3H)，3.60(s，3H)，4.19-4.40(m，2H)，4.90(q，1H)，6.90-7.10(m，6H)，7.25-7.35(m，6H)，7.40(d，J＝4.5Hz，1H)，7.60-7.80(d(b)，1H)，8.05-8.25(d(b)，1H)，8.45(d，J＝3Hz，1H)，8.90(s(b)，1H)，11.85(s(b)，1H)。
F.1.2.)N-((S)-1-氨基甲?；?2-二苯基氨基乙基)-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-甲酰胺(63)在0℃下用氨飽和50ml(無水)甲醇。然后加入0.5g(0.959mmol)3-二苯基氨基-2-{[2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-羰基]-(S)-氨基}丙酸甲酯(62)并將該混合物在室溫下攪拌24小時。在蒸發(fā)溶劑和過量氨后，通過硅膠快速色譜法分離酰胺63(DCM∶MeOH＝19∶1)。產(chǎn)率0.43g(89％)。
實驗式C29H28N8O2；M.W.＝506.57；MS(M+H)507.2。
1H NMR(DMSO-d6)2.95(s(b)，3H)，4.02-4.35(m，2H)，4.85(q，1H)，6.80-7.10(m，6H)，7.15-7.25(m，5H)，7.40(d，J＝4.5Hz，1H)，7.58(s(b)，1H)，7.68(s(b)，1H)，8.06-8.19(d(b)，1H)，8.40-8.58(m，2H)，13.10(s，1H)。
F.2.)N-{1-氨基甲?；?2-[(苯基)嘧啶-2-基氨基]乙基}-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-甲酰胺(65)
F.2.1.)3-[(苯基)嘧啶-2-基氨基]-2-{[2-(2-甲氨基-嘧啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-羰基]氨基}丙酸甲酯(64)當按照與D.2.1.)中所述類似的方式進行反應時，由657mg 15得到210mg(29％)甲酯64。
實驗式C27H25N9O3；M.W.＝523.56；MS(M+H)524.2。
F.2.2.)N-{1-氨基甲?；?2-[(苯基)嘧啶-2-基氨基]乙基}-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-甲酰胺(65)當按照與D.2.2.)中所述類似的方式進行反應時，由200mg 64得到110mg(65％)酰胺65。
實驗式C26H24FN10O2；M.W.＝508.55；MS(M+H)509.3。
1H NMR(DMSO-d6)3.0(s(b)，3H)，4.20-4.32(m，1H)，4.41-4.55(m，2H)，4.80-4.90(m，1H)，6.75(m，1H)，7.10-7.50(m，10H)，7.65(q，2H)，8.10(s，1H)，-8.45(d，2H)，8.50(d，1H)，8.58(d，1H)，12.95(s(b)，1H)。
F.3.)N-{1-氨基甲?；?2-[(苯基)吡啶基-2-基氨基]乙基}-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-甲酰胺(67)
F.3.1.)3-[(苯基)吡啶基-2-基氨基]-2-{[2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-羰基]氨基}丙酸甲酯(66)當按照與D.2.1.)中所述類似的方式進行反應時，由3.44g 31得到0.85(22％)甲酯66。
實驗式C28H26N8O3；M.W.＝522.57；MS(M+H)523.3。
F.3.2.)N-{1-氨基甲?；?2-[(苯基)吡啶基-2-基氨基]乙基}-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-甲酰胺(67)當按照與D.2.2.)中所述類似的方式進行反應時，由200mg 66得到160mg(98％)酰胺67。
實驗式C27H25N9O2；M.W.＝507.56；MS(M+HCOO-)552.3。
1H NMR(DMSO-d6)3.0(s(b)，3H)，4.20-4.32(m，1H)，4.41-4.55(m，2H)，4.70-4.80(m，1H)，6.63(m，1H)，6.85(m，1H)，7.20-7.75(m，14H)，8.10(s，1H)，-8.20(d，2H)，8.50(d，1H)，8.88(d，1H)。
藥理實施例IκB激酶ELISA使用ELISA測定IκB激酶活性，所述ELISA包括含有絲氨酸32-36的IκB蛋白的氨基酸序列的生物素化底物肽和僅結合IκB肽的磷酸化形式的特異性多克隆和單克隆抗體(例如獲自New England Biolabs，Beverly，MA，USA，cat.9240)。將該復合物固定在抗體結合(蛋白質A包被的)平板上并使用由生物素結合蛋白和HRP組成的綴合物(例如鏈霉抗生物素-HRP)檢測。借助于使用底物磷酸肽構建的標準曲線對活性進行定量。
實施為了獲得激酶復合物，用40ml 50mM HEPES pH7.5稀釋10ml HeLaS3細胞萃取物S100、使硫酸銨濃度達到40％并在冰上孵育30分鐘。將沉淀的顆粒溶于5ml SEC緩沖液(50mM HEPES，pH7.5、1mM DTT、0.5mMEDTA、10mM 2-磷酸甘油)、以20000g離心15分鐘并通過0.22μm濾膜過濾。將樣品加載至已經(jīng)用SEC緩沖液平衡并在4℃下以2ml/分鐘的流速操作的320ml Superose-6 FPLC柱上(Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)。合并位于670kDa分子量標準的遷移時間處的級分用于活化。通過在37℃下與100nM MEKK1Δ、250μM MgATP、10mM MgCl2、5mM二硫蘇糖醇(DTT)、10mM 2-磷酸甘油和2.5μM微囊藻素-LR一起溫育45分鐘進行活化。將活化的酶保存在-80℃下。
將溶于DMSO的測試物質(2μl)在25℃下與43μl活化酶(在反應緩沖液50mM HEPES pH7.5、10mM MgCl2、5mM DTT、10mM β-磷酸甘油、2.5μM微囊藻素-LR中按1∶25稀釋)預孵育30分鐘，然后加入5μl底物肽(生物素-(CH2)6-DRHDSGLDSMKD-CONH2)(200μM)，此后將該混合物孵育1小時并用150μl 50mM HEPES，pH7.5、0.1％BSA、50mM EDTA、抗體[1∶200]終止反應。然后將100μl終止的反應混合物或標準磷酸肽稀釋系列(生物素-(CH2)6-DRHDS[PO3]GLDSMKD-CONH2)轉入蛋白質A平板(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL，USA)，此后將平板在振搖下孵育2小時。用PBS進行3次洗滌步驟后，經(jīng)30分鐘加入100μl 0.5μg/ml鏈霉抗生物素-HRP(辣根過氧化物酶)(在50mM HEPES/0.1％BSA中稀釋)。用PBS進行5次洗滌步驟后，加入100μL TMB底物(Kirkegaard & PerryLaboratories，Gaithersburg，MD，USA)并通過添加100μL 0.18M硫酸終止顯色。在450nm處測定吸收。通過線性回歸產(chǎn)生對應于4-參數(shù)劑量作用相關性的標準曲線。該標準曲線用于對酶活性或測試物質對其的抑制作用進行定量。
N-[(S)-2-二苯基氨基-1-(5-氧代-4，5-二氫[1，3，4]噁二唑-2-基)乙基]-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺的IC50為0.050μM。
N-[(S)-2-二苯基氨基-1-(5-氧代-4，5-二氫[1，3，4]噁二唑-2-基)乙基]-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺的血漿濃度。
向雄性C57/BL6小鼠施用化合物N-[(S)-2-二苯基氨基-1-(5-氧代-4，5-二氫[1，3，4]噁二唑-2-基)乙基]-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺，下文稱為化合物28。為此，每次施用約25mg化合物28/kg小鼠體重，將該化合物在0.5％羥乙基纖維素(HEC)中濕磨，以混懸液(通過食管探子)口服施用。0.25、0.5、1、2、4、6和8小時后取血樣(每次在每一提及的時間點從2只動物中抽取供試血液(sacrificial blood))。將血樣轉化成肝素血漿。將血漿樣品儲存在-20℃下直至分析。
分析融化血漿樣品。然后用乙腈沉淀干擾分析的血漿蛋白。
處理將50μl血漿+20μl內(nèi)標(5μg/ml)+50μl緩沖液(2mMol甲酸銨溶液，pH2.6/乙腈，40∶60，v/v)在渦動混合器上混合約10秒。然后加入150μl乙腈并將整個體系再次混合約10秒。然后離心樣品(Hettich，EBA 12，約12000轉/分鐘)。將上清液(每次約200μl)轉入玻璃管。注射70μl上清液。
通過LC-MS/MS、按照下列方法將各上清液用于測定化合物13的血漿含量水平HPLC系統(tǒng)Agilent 1100軟件Analyst柱125×4mm Nucleosil 1205 C18(Machery & Nagel)柱長125mm檢測LC-MS/MSMS儀器PE-Sciex API 365(Triple Quadrupole質譜儀)
軟件MacQuan軟件(PE-Sciex)檢測類型MS/MS(MRM)流速0.5mL/分鐘注射體積70μl內(nèi)標在乙腈中的SK-7流動相乙腈/2mMol甲酸銨溶液，pH2.6(70∶30，v/v)保留時間(Rt)內(nèi)標4.4分鐘化合物283.9分鐘該方法的檢測下限為0.01μg/mL。
結果化合物28的血漿水平至多為4.3μg/mL。測定為AUC＝曲線下面積的暴露值(exposure)為5.4μg/mL×小時。
蛋白酪氨酸激酶作為已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的IκB激酶抑制劑特異性的實例，測定了蛋白酪氨酸激酶的IC50值。
使用來自Upstate Biotechnologie的適宜測試試劑盒、按照制造商的說明并在50μM的ATP濃度下測定蛋白酪氨酸激酶的活性。與制造商方法的差別在于使用了Multi-Screen平板(Millipore；磷酸纖維素MS-PH，cat.MAPHNOB10；或Durapore PVDF.cat.MADVNOB 50)與適宜的排氣系統(tǒng)代替磷酸纖維素濾膜。將多(Glu，Tyr 4∶1)(Sigma cat.P0275)用作測試試劑盒底物，測試濃度為1mg/ml。然后在Wallac MicroBeta閃爍計數(shù)儀上測定平板。每種情況下使用100μM測試物質。
對測試物質進行一式兩份測定。使用GraFit 3.0軟件包進行IC50計算。
N-[(S)-2-二苯基氨基-1-(5-氧代-4，5-二氫[1，3，4]噁二唑-2-基)乙基]-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺(化合物28)在蛋白酪氨酸激酶試驗中的IC50為82.5μM。
比較實驗如WO 01/30774中所述制備如下化合物并在下文中稱作比較化合物 向雄性NMRI小鼠施用該比較化合物。為此，每種情況下以0.5％HEC中的混懸液形式(通過食管探子)口服施用約50mg比較化合物/kg小鼠體重。0.25、0.5、1、2、4、6和8小時后取血樣(每次在每一提及的時間點從2只動物中抽取供試血液)。將血樣轉化成肝素血漿。將血漿樣品儲存在-20℃下直至分析。
分析使用HPLC/UV進行分析。
處理將50μl血漿+20μl內(nèi)標(5μg/ml)+50μl緩沖液(1％甲酸/乙腈，40∶60，v/v)在Whirlmixer上混合約10秒。然后加入150μl乙腈并將整個體系再次混合約10秒。然后離心樣品(Hettich，EBA 12，約12000轉/分鐘)。將上清液(每次約200μl)轉入玻璃管。注射100μl上清液。
通過HPLC/UV、按照下列方法將各上清液用于測定比較化合物的血漿含量水平HPLC系統(tǒng)Gynkoteck P580 HPG泵+Gilson Abimed XL-231自動進樣器軟件Mass-chrom柱125×4mm Protosil 120 3 ODS AQ 3(來自Bischoff)柱長125mm檢測LC-MS/MSMS儀器PE-Sciex API 365(Triple Quadrupole質譜儀)
軟件MacQuan軟件(PE-Sciex)檢測類型MS/MS(MRM)流速0.5mL/分鐘注射體積100μl內(nèi)標在乙腈中的SK-7(Aventis化合物)流動相乙腈/2mMol甲酸銨溶液，pH2.6(70∶30，v/v)保留時間(Rt)內(nèi)標4分鐘比較化合物1.5分鐘檢測下限0.01μg/mL與使用化合物28的實施例中所用LC-MS/MS的檢測下限相同。
結果比較化合物的血漿濃度至多為1.5μg/mL。測定為AUC＝曲線下面積的暴露值為1.7μg/mL×小時。
與使用化合物28的實施例相比，盡管比較化合物的施用劑量50mg/kg是化合物28的劑量的兩倍，但是在比較實驗中的最高血漿濃度仍然約低60％。對比較化合物測定的AUC值也得出了相同的結果。
在上述蛋白酪氨酸激酶試驗中，比較化合物的IC50為46.35μM。因此該IC50顯然優(yōu)于化合物28的IC50。
當將蛋白酪氨酸激酶與IκB激酶的IC50進行比較時，對IκB激酶的特異性改善變得更為明顯。就化合物28而言，該比值為1650(82.5/0.05)，而就比較化合物而言，其為46.35(46.35/1.0；根據(jù)來自WO 01/30774的數(shù)據(jù))。
按照類似方式測定了其它實施例的特異性比值和/或血漿濃度和接觸值。
＞表示優(yōu)于
權利要求
1.式I化合物和/或式I化合物的立體異構形式和/或式I化合物的生理上耐受的鹽 其中X和M相同或不同且彼此獨立地為N原子或CH；R1和R11相同或不同且彼此獨立地為1.氫原子，2.F、Cl、I或Br，3.-(C1-C4)-烷基，4.-CN，5.-CF3，6.-OR5，其中R5為氫原子或-(C1-C4)-烷基，7.-N(R5)-R6，其中R5和R6彼此獨立地為氫原子或-(C1-C4)-烷基，8.-C(O)-R5，其中R5為氫原子或-(C1-C4)-烷基，或9.-S(O)x-R5，其中x為整數(shù)0、1或2且R5為氫原子或-(C1-C4)-烷基；R2為1.選自下列基團的雜芳基3-羥基吡咯-2，4-二酮、咪唑、咪唑烷、咪唑啉、吲唑、異噻唑、異噻唑烷、異噁唑、2-異噁唑烷、異噁唑烷、異噁唑酮、嗎啉、噁唑、1，3，4-噁二唑、噁二唑烷二酮、噁二唑酮、1，2，3，5-氧硫雜二唑-2-氧化物、5-氧代-4，5-二氫[1，3，4]-噁二唑、5-氧代-1，2，4-噻二唑、哌嗪、吡嗪、吡唑、吡唑啉、吡唑烷、噠嗪、嘧啶、四唑、噻二唑、噻唑、硫代嗎啉、三唑或三唑酮，且所述雜芳基未被取代或彼此獨立地被下列基團取代一次、二次或三次1.1-C(O)-R5，其中R5為氫原子或-(C1-C4)-烷基，1.2-(C1-C4)-烷基，1.3-O-R5，其中R5為氫原子或-(C1-C4)-烷基，1.4-N(R5)-R6，其中R5和R6彼此獨立地為氫原子或-(C1-C4)-烷基；1.5鹵素，或1.6酮基，2.-C(O)-OR5，其中R5為氫原子或-(C1-C4-烷基)，3.-C(O)-OR5，其中R5為氫原子或-(C1-C4-烷基)，或4.-C(O)-N(R7)-R8，其中R7和R8彼此獨立地為氫原子、-(C1-C4)-烷基-OH、-O-(C1-C4)-烷基或-(C1-C4-烷基)；R3為氫原子或-(C1-C4-烷基)；R4為1.選自下列基團的雜芳基吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、噁唑、異噁唑、噻唑、異噻唑、四唑、1，2，3，5-氧硫雜二唑-2-氧化物、三唑酮、噁二唑酮、異噁唑酮、噁二唑烷二酮、三唑、3-羥基吡咯-2，4-二酮、5-氧代-1，2，4-噻二唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、吲哚、異吲哚、吲唑、2，3-二氮雜萘、喹琳、異喹琳、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、β-咔啉和這些雜芳基的苯并稠合、環(huán)戊二烯并衍生物或環(huán)己二烯并衍生物，其中所述雜芳基未被取代或彼此獨立地被下列基團取代一次、二次或三次-(C1-C5)-烷基、-(C1-C5)-烷氧基、鹵素、硝基、氨基、三氟甲基、羥基、羥基-(C1-C4)-烷基、亞甲二氧基、亞乙二氧基、甲?；?、乙酰基、氰基、羥基羰基、氨基羰基或-(C1-C4)-烷氧羰基；或2.選自下列基團的芳基苯基、萘基、1-萘基、2-萘基、聯(lián)苯基、2-聯(lián)苯基、3-聯(lián)苯基和4-聯(lián)苯基、蒽基或芴基，且所述雜基未被取代或彼此獨立地被下列基團取代一次、二次或三次-(C1-C5)-烷基、-(C1-C5)-烷氧基、鹵素、硝基、氨基、三氟甲基、羥基、羥基-(C1-C4)-烷基、亞甲二氧基、亞乙二氧基、甲?；?、乙?；?、氰基、羥基羰基、氨基羰基或-(C1-C4)-烷氧羰基。
2.如權利要求1中所述的式I化合物，其中X和M相同或不同且彼此獨立地為N原子或CH；R1和R11相同或不同且彼此獨立地為1.氫原子，2.F、Cl、I或Br，3.-(C1-C4)-烷基，4.-CN，5.-CF3，6.-OR5，其中R5為氫原子或-(C1-C4)-烷基，7.-N(R5)-R6，其中R5和R6彼此獨立地為氫原子或-(C1-C4)-烷基，8.-C(O)-R5，其中R5為氫原子或-(C1-C4)-烷基，或9.-S(O)x-R5，其中x為整數(shù)0、1或2且R5為氫原子或-(C1-C4)-烷基；R2為1.選自下列基團的雜芳基咪唑、異噻唑、異噁唑、2-異噁唑烷、異噁唑烷、異噁唑酮、1，3，4-噁二唑、噁二唑烷二酮、1，2，3，5-噁二唑酮、噁唑、5-氧代-4，5-二氫[1，3，4]-噁二唑、四唑、噻二唑、噻唑、三唑或三唑酮，且所述雜芳基未被取代或彼此獨立地被下列基團取代一次、二次或三次1.1酮基，1.2 F、Cl、I或Br，1.3-(C1-C2)-烷基，或2.-C(O)-N(R7)-R8，其中R7和R8彼此獨立地為氫原子、-(C1-C4)-烷基-OH、-O-(C1-C4)-烷基或-(C1-C4-烷基)；R3為氫原子、甲基或乙基；R4為1.選自不飽和、部分飽和或完全飽和環(huán)的雜芳基，所述不飽和、部分飽和或完全飽和環(huán)衍生自吡啶、吡嗪、嘧啶、噠嗪、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、噁唑、異噁唑、噻唑、三唑或異噻唑，其中所述雜芳基未被取代或彼此獨立地被下列基團取代一次、二次或三次-(C1-C4)-烷基、-(C1-C4)-烷氧基、F、Cl、I、Br、硝基、氨基、三氟甲基、羥基、羥基-(C1-C4)-烷基、亞甲二氧基、亞乙二氧基、甲?；?、乙?；?、氰基、羥基羰基、氨基羰基或-(C1-C4)-烷氧羰基；或2.苯基，且苯基未被取代或彼此獨立地被下列基團取代一次、兩次或三次的苯基F、Cl、I、Br、-CF3、-OH、-(C1-C4)-烷基或-(C1-C4)-烷氧基。
3.如權利要求1或2中所述的式I化合物，其中式I化合物為N-[(S)-2-二苯基氨基-1-(5-氧代-4，5-二氫[1，3，4]噁二唑-2-基)乙基]-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺；N-{1-氨基甲酰基-2-[(4-氟苯基)吡啶-2-基氨基]乙基}-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺；N-[(S)-1-(5-氧代-4，5-二氫-1，3，4-噁二唑-2-基)-2-(苯基吡啶-2-基氨基)乙基]-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺；N-{1-氨基甲?；?2-[(4-氟苯基)吡啶-2-基氨基]乙基}-2-(2-氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺；N-[2-[(4-氟苯基)吡啶-2-基氨基]-1-(4H-[1，2，4]三唑-3-基)-乙基]-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺；N-[1-氨基甲酰基-2-(苯基噻唑-2-基氨基)乙基]-(S)-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺；N-[1-甲氧基氨基甲?；?2-(苯基吡啶-2-基氨基)乙基]-(S)-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺；N-{1-氨基甲酰基-2-[(苯基)吡啶-2-基氨基]乙基}-2-(2-氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺；N-{1-氨基甲?；?2-[(苯基)嘧啶基-2-基氨基]乙基}-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺；N-[1-(2-羥乙基氨基甲酰基)-2-(苯基嘧啶-2-基氨基)乙基]-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺；(S)-2-{[2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-羰基]-氨基}-3-[苯基-(4-三氟甲基嘧啶-2-基)氨基]丙酸；N-{1-氨基甲?；?2-[(4-氟苯基)-(5-甲基嘧啶-2-基)氨基]-乙基}-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-吲哚-5-甲酰胺；N-((S)-1-氨基甲酰基-2-二苯基氨基乙基)-2-(2-甲氨基-嘧啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-甲酰胺；N-{1-氨基甲?；?2-[(苯基)嘧啶基-2-基氨基]乙基}-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-甲酰胺；或N-{1-氨基甲?；?2-[(苯基)吡啶基-2-基氨基]乙基}-2-(2-甲氨基嘧啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-甲酰胺。
4.如權利要求1-3的一項或多項中所述的式I化合物的制備方法，其包括a)在堿或如果合適在脫水劑存在的溶液中使式IV化合物 其中R1、R2和R4如式I中所定義，與式III化合物的酰氯或活化酯反應， 其中D1為-COOH且R11、X、M和R3如式I中所定義，并將產(chǎn)物轉化成式I化合物；b)通過與對映體純的酸或堿成鹽、手性固定相色譜法或使用手性對映體純化合物如氨基酸衍生，將已通過方法a)制備且因其化學結構而出現(xiàn)對映體形式的式I化合物分離成純對映體、分離所得非對映體并消去手性輔助基團，或c)分離通過方法a)或b)已制備的游離形式的式I化合物或當存在酸性或堿性基團時將其轉化成生理上耐受的鹽。
5.藥物，其包含有效量的至少一種式I化合物和/或式I化合物的生理上耐受的鹽和/或式I化合物的任選立體異構形式與藥學上合適且生理上耐受的載體物質、添加劑和/或其它活性化合物和輔助物質。
6.如權利要求1-3的一項或多項中所述的式I化合物在制備用于預防和治療所有那些其過程涉及IκB激酶活性增加的疾病的藥物中的用途。
7.如權利要求6中所述的用途，其中所述疾病為運動器的慢性疾病如炎性、免疫學性或代謝介導的急性和慢性關節(jié)炎、關節(jié)病、類風濕性關節(jié)炎或關節(jié)變性病如骨關節(jié)病、椎關節(jié)強直；II型糖尿病、炎性腸??；關節(jié)創(chuàng)傷后軟骨喪失或半月板或膝蓋骨損傷或韌帶破裂后相對長期的關節(jié)固定；或結締組織疾病如膠原性疾病和牙周?。患⊥春凸谴x障礙；或因腫瘤壞死因子α(TNFα)過表達或TNFα濃度增加導致的疾病如惡病質、多發(fā)性硬化、顱腦創(chuàng)傷、局限性回腸炎和腸潰瘍；或疾病如動脈粥樣硬化、狹窄、潰瘍形成、阿爾茨海默病、肌肉斷裂、癌病、心肌梗死、痛風、膿毒癥、敗血癥性休克、內(nèi)毒素休克；病毒感染如流感、肝炎、HIV感染、AIDS或因腺病毒或皰疹病毒導致的疾?。患纳x感染如瘧疾或麻風??；真菌或酵母感染；腦膜炎；慢性炎性肺病如慢性支氣管炎或哮喘、急性呼吸窘迫綜合征；急性滑膜炎、結核病、銀屑病、糖尿??；有關器官接受者對移植器官的急性或慢性排斥反應的治療；慢性移植物抗宿主病和炎性血管疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及式(I)化合物，所述化合物適合于制備用于預防和治療其發(fā)展涉及IκB激酶活性增加的疾病。
文檔編號A61K31/4439GK1675196SQ03819543
公開日2005年9月28日 申請日期2003年8月5日 優(yōu)先權日2002年8月17日
發(fā)明者O·里策爾埃, G·耶內(nèi) 申請人:安萬特醫(yī)藥德國有限公司