專利名稱：結(jié)合白細胞的化合物以及含有標記狀態(tài)的該化合物作為有效成分的藥用組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種結(jié)合白細胞的化合物，以及含有該標記的化合物作為有效成份的藥用組合物，當要診斷和/或治療與免疫反應(yīng)相關(guān)的患病個體的疾病時，其用于靶向異常部位和精確把握疾病的活性狀態(tài)。更具體而言，本發(fā)明涉及一種新的化合物，其具有在體內(nèi)和體外均特異的白細胞結(jié)合活性，并可用放射性金屬或順磁性金屬標記，其用于哺乳動物體內(nèi)包括感染性疾病、炎癥、腫瘤和動脈粥樣硬化的病灶的病理學成像。本發(fā)明還涉及含有標記狀態(tài)的該化合物作為有效成份的藥用組合物，其可用于放射性同位素診斷，SPECT成像診斷，PET成像診斷，MRI成像診斷或放射治療。
現(xiàn)有技術(shù)包括人在內(nèi)的動物經(jīng)常受到周圍環(huán)境中可能影響個體生命維持體系的因素的影響。它們包括，例如，具有正效應(yīng)的因素，例如空氣、陽光和食物，和負效應(yīng)的因素，如微生物侵襲，危險的化學物質(zhì)、熱和放射。為對抗這些負效應(yīng)因素，個體采取多種防御體系來維持其生命。
這種自我防御體系在生物學上定義為免疫，與免疫相關(guān)的生物反應(yīng)稱為免疫反應(yīng)。已知引起這些反應(yīng)的因素，例如微生物諸如細菌、支原體、病毒、組織或器官的異種移植物，有害的化學物質(zhì)、高溫加熱，過度冷卻、高能核輻射，以及組織的電或物理損傷。包括炎癥反應(yīng)在內(nèi)的免疫反應(yīng)，是一種個體應(yīng)答 “自我”或“非我”識別的生物反應(yīng)，是一種廣義上的防御體系反應(yīng)，如發(fā)熱、白細胞激活和遷移，以及對“自我”以外所有因素的清除。炎癥反應(yīng)是免疫反應(yīng)的部分表現(xiàn)結(jié)果，如清除滲入個體的外來物質(zhì)、破壞侵襲組織和修復受損組織。
白細胞是免疫反應(yīng)包含的重要因素之一。組織產(chǎn)生多種介質(zhì)，指定浸潤白細胞的種類，控制其水平和持續(xù)時間，而且，在細胞膜表面上有多種受體，可通過與存在于體液包括血液中的介質(zhì)及其它的分子相結(jié)合而產(chǎn)生應(yīng)答。通過與相應(yīng)的介質(zhì)結(jié)合，受體激活白細胞，不同類型受體的特異性表達取決于白細胞的種類。所以浸潤組織的白細胞種類取決于存在的介質(zhì)。
通常，在局部的免疫反應(yīng)如炎癥中，當受到某些破壞組織的刺激后，與免疫相關(guān)的蛋白質(zhì)例如補體，出現(xiàn)數(shù)小時以除去刺激物。然后，像分解的補體和/或細胞因子類的介質(zhì)由破壞的組織釋放到體液例如血液中，主要由嗜中性粒細胞組成的粒性白細胞通過受體被激活，因此組織中的白細胞浸潤按照介質(zhì)的濃度梯度出現(xiàn)。在此情況下介質(zhì)通常稱為趨化因子。通常，粒性白細胞的組織浸潤在刺激開始十幾個小時后達到峰值。同時，主要由單核細胞組成的巨噬細胞逐漸增加，與粒性白細胞共同除去引起刺激的物質(zhì)。細胞因子等由激活的粒性白細胞和巨噬細胞以及受損組織釋放出來，從而促進由T細胞和B細胞組成的淋巴細胞的組織浸潤，淋巴細胞可有效地執(zhí)行免疫反應(yīng)例如產(chǎn)生抗體、修復破壞組織或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)。淋巴細胞浸潤在刺激開始數(shù)十小時后達到峰值。
免疫反應(yīng)是維持個體生命相當重要的行為。然而，出于維持其生命的目的，由于對個體反應(yīng)的調(diào)節(jié)不完善，反應(yīng)有時可能會導致嚴重的負效應(yīng)。這種負效應(yīng)的典型表現(xiàn)是出現(xiàn)被稱為自身免疫性疾病病癥。已知一類這種病癥，例如特應(yīng)性皮炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、白塞氏綜合征、全身性紅斑狼瘡、潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、慢性甲狀腺炎及已知的其它膠原疾病。在導致炎癥的情況下，例如由外來物質(zhì)侵入，如感染，或由于組織破壞如燒傷，導致炎癥的原因是可以確定的。然而，就自身免疫性疾病而言，沒有特定的引發(fā)因素，或其因素尚未確定。因此自身免疫性疾病是一種病因未知的難治疾病。然而眾所周知，在這類病癥中普遍觀察到白細胞，特別是由淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞對組織的疾病-特異性浸潤現(xiàn)象。
因此，在自身免疫性疾病和慢性炎癥和感染中，通過白細胞浸潤，淋巴細胞和單核細胞在免疫反應(yīng)中通常發(fā)揮重要的作用。所以，查找或檢測淋巴細胞、單核細胞和嗜中性粒細胞的白細胞浸潤，并確定它們的精確水平，對施行有效的治療非常重要，可以使病人避免不當?shù)乃幬镏委?，減少精神痛苦和治療費用，并可能有助于降低健康保險的成本。
因此，由于診斷成像是查找和檢測白細胞浸潤并測定其精確水平的有用工具，在核醫(yī)學領(lǐng)域已開展了多種放射活性試劑及其應(yīng)用的研究。
長期以來鎵-67(67Ga)的檸檬酸鹽被用作炎癥閃爍試劑(參見例如Ebright，Jr等人，Arch.Int.Med.，142，246-254(1982))。然而，該試劑對感染部位或炎癥部位沒有特異性。而且，67Ga的γ射線輻射能不足，不適于用普通γ射線照相儀獲取良好的圖像。而且從注射試劑到完成成像大約需要72小時的等待時間。
后來，作為核醫(yī)學感染部位成像方法，開始使用銦-111標記的白細胞(以下指定為111In-白細胞)(參考例如Peters，AM.等人，J.Nucl.Med.，33，65-67(1992))。Thakur等人報導了在體外用放射性核素標記嗜中性粒細胞，廣泛分析并論述了其應(yīng)用(Thakur等人，Sem.Nucl.Med.，14，10-17(1984))。在該方法中，個體的嗜中性粒細胞在體外用銦-111(以下指定為In-111)標記，標記的嗜中性粒細胞用于體外動力學研究。同時，標記的嗜中性粒細胞可用于個體急性期的炎癥性病灶成像。
然而，使用111In-白細胞時，放射性標記的化合物的制備需要經(jīng)過多個步驟自體血液的無菌分離、從血液中無菌分離白細胞、白細胞的無菌標記、放射性核素標記的白細胞回注給患者，并需要2小時以上的可觀時間。同樣，認為從標記白細胞回輸?shù)降玫阶罴褕D像成像需要12-48小時的等候時間。另外使用In-111時，由于其高輻射能，通常用于成像研究的每1×107白細胞200μCi的放射活性，對白細胞是危險的。在上述條件下，主要由白細胞中的嗜中性粒細胞組成的粒性白細胞，經(jīng)標記后可存活，而淋巴細胞等在標記后立即死亡(Chianelli，M.等人，Nucl.Med.Comm.18，437-455(1997))。所以，利用In-111標記的白細胞很難監(jiān)控淋巴細胞和單核細胞的動態(tài)。此外，從輻射劑量安全性出發(fā)，要限制給予的放射性劑量，大多數(shù)情況下會導致圖像質(zhì)量的損壞。
后來發(fā)展的用锝-99m(Tc-99m)標記白細胞，可縮短成像的等待時間——使用111In-白細胞時就存在的難題，并可監(jiān)控淋巴細胞和單核細胞的動態(tài)，而且可給予比In-111大得多的放射性劑量(見，例如vorne，M.等人，J.Nucl.Med.，30，1332-1336(1989))。然而，由于Tc-99m的標記穩(wěn)定性不夠好，因而在非-靶向代謝器官的累積成為難題。至于制備時間長和血樣處理問題，該方法與111In-白細胞相似(Chianelli，M.等人，Nucl.Med.Comm.，18，437-455(1997))。
已經(jīng)進行用放射性核素標記、可與人白細胞包括單核細胞、嗜中性粒細胞、粒性白細胞等結(jié)合的單克隆和多克隆抗體的研制試驗。例如已研制了99mTc-標記的抗-粒性白細胞單克隆抗體(參考例如LindP.等人，J.Nucl.Med.31，417-473(1990))及111In-標記的非特異性人免疫球蛋白(111In-HIG，參考例如LaMuraglia，GM.等人，J.Vasc.Surg.，10，20-28(1989))，用于檢測由感染所引起的炎癥部位。然而，要得到最佳圖像造影，就其給藥開始24-48小時的等候時間而言，111In-HIG有相似的缺陷。
此外，認為111In-HIG累積于炎癥部位并能描繪該部位(參考例如，Rubin，R.等人，J.Nucl.Med.，29，651-656(1988))，但在這點上存在兩種累積機制的假設(shè)。一種觀念是111In-HIG在炎癥部位的累積通過與浸潤炎癥部位的白細胞表面的Fc-受體結(jié)合來進行(Fischman，A.等人，J，Nucl.Med.，31，1199-1205)1990))，而另一種觀念是，除白細胞浸潤外，還通過提高血管通透性，發(fā)生111In-HIG白細胞局部的血管滲出，類似于像白蛋白那樣的蛋白質(zhì)中所觀察到的(Morrel，E.等人，J.Nucl.Med.，30，1538-1545(1989))。
迄今，有關(guān)使用其它蛋白質(zhì)對具有白細胞結(jié)合活性的生物分子的研究已有報導。
Van der Laken，CJ.等人報導了用放射性碘標記炎性細胞因子白細胞介素1的研究(van der Laken，CJ.等人，European J.Nucl.Med.，22，1249-1255(1995))。
Signore等人報導了使用放射性碘標記的炎性細胞因子白細胞介素2進行的慢性炎性疾病研究(Signore等人，Nucl.Med.Comm.，13，713-722(1992))。
Hay，RV.等人報導了使用放射性碘標記的炎性細胞因子白細胞介素8進行的化學誘發(fā)炎癥的研究(Hay，RV.等人，Nucl.Med.Comm.，18，367-378(1997))。
這些放射性標記的化合物已成功地描繪了急性炎癥例如感染，或慢性炎癥例如自身免疫性疾病的圖像。
然而，考慮這些蛋白質(zhì)包括抗體的分子量較大，在血管通透性增加的急性炎癥中，這些蛋白質(zhì)與血液組分的血細胞滲出可能會導致問題(RoittI.等人，Essential Immunology，8thOxford，BlackwellScientific(1994))。分子量2000左右的分子即使?jié)B出，也不會在血細胞滲出的同一部位停留很長時間，但蛋白質(zhì)如白蛋白(分子量大約64000)由于分子較大，與分子量較低的化合物相比，傾向于停留在同一部位。因而很難判斷累積是否是炎癥特異性的(Morrel E.等人，J.Nucl.Med.，30，1538-1545(1989))。
放射醫(yī)學試劑通常首選易合成的小分子。用放射性核素標記的肽，被認為適宜作為合成的低分子量化合物，其可選擇性地與全血中的白細胞結(jié)合，并可直接給患者注射，使通過確定白細胞累積的部位對感染和炎癥的病灶部位進行成像成為可能。
例如，Moyer等人報導了Tc-99m標記的，來源于血小板因子4(PF-4)C-末端序列的肽化合物的累積特征，其具有與硫酸多聚糖例如肝素的結(jié)合活性(Moyer，BR.等人，J.Nucl.Med.，37，673-679(1996))。該復合物(PF-4肽-肝素)為包含Tc-99m螯合的氨基酸序列的23個氨基酸殘基的肽(分子量大約2600)和肝素(分子量大約7000到25000)的復合物，構(gòu)成一個分子量約10000到30000的單一分子。
由于像蛋白質(zhì)一樣分子量較大，肝素結(jié)合的PF-4肽單獨不能作為指示白細胞浸潤累積部位的試劑。因此，需要指示真正的白細胞浸潤的試劑，其由很少顯示毛細血管通透性增強導致的非特異性累積的低分子量化合物組成。此外，由于其生理活性，肝素的使用有時會受到限制。
Dahlman T.等人和Ringe，JD.等人報導了肝素副作用的危險性，給予肝素可能引起骨密度的降低，長期給藥可能導致骨質(zhì)疏松癥(Dahlman，T.等人，Br.J.Obsted GynaeGol.，Mar，97，3，221-228(1990)；Ringe JD.等人，Geburtshilfe Frauenheilkd.，52，7，426-429(1992))。除此以外，由于肝素的生理功能導致的副作用可能存在危險性，包括例如抗凝血酶活性，抑制促凝血酶原激酶的產(chǎn)生，抑制血小板凝聚，或當患者有出血性疾病或可能發(fā)生出血性疾病或嚴重的肝病和腎病時，需要慎重處理。綜上所述，使用肝素有許多需要審慎之處。
至于其它用放射性核素標記的肽，現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報導了含甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酰(fMLF)的肽。
Day等人報導了125I標記的趨化性甲?；?fMLF)(Day，AR.等人，F(xiàn)EBS Lett.，77，291-294(1977))。
Jiang等人報導了用125I-標記的趨化性甲?；?fMLF)在體內(nèi)炎癥部位的累積情況(見，例如Jiang，MS.等人，Nuklearmedizin，21，110-113(1982))。
Fisherman等人公開了111In標記的通過DTPA連接的趨化性甲?；?fMLF)(見JP 2931097)。
Verbeke等人報導了Tc-99m標記的通過巰基乙酰-甘氨酰-甘氨酸連接的趨化性甲?；?fMLF)(見，例如Verbeke K.等人，NuclearMedicine & Biology，27，769-779(2000))。
Baidoo等人報導了Tc-99m標記的通過二氨基二硫基(diaminodithiol)化合物連接的趨化性甲酰化肽(fMLF)(參見Baidoo，K.E.等人，Bioconjugate Chemistry，9，208-217(1998))。
另外，還有關(guān)于通過其光親合性，使用放射性核素標記的趨化性甲?；?fMLF)進行體外白細胞放射性核素標記的報導(見，例如，USP4,986,979)。
同樣也有關(guān)于趨化性甲酰化肽(fMLF)能夠用放射性核素標記的報導(參考例如USP5,792,444)。
認為趨化性甲?；?fMLF)通過甲酰化肽受體(以下指定為受體FPR)與白細胞結(jié)合(Niedel J.E.等人，Science，205，4413，1412-1414(1979))，表達受體FPR的白細胞為嗜中性粒細胞和單核細胞(Lewi s，SL.等人，炎癥，4，363-375(1983))。
人血液中的白細胞正常組成為含有約50％的嗜中性粒細胞和10％的單核細胞。有報導大多數(shù)結(jié)合某些已知趨化性甲酰化肽類似物的白細胞為嗜中性粒細胞，因為血液中的單核細胞群只有嗜中性粒細胞的五分之一或更少，而且肽與淋巴細胞和單核細胞的結(jié)合不牢固(Verbeke，K.等人，Nucl.Med.Biol.，27，769-779(2000))。
同樣，在急性炎癥例如伴有嗜中性粒細胞浸潤的細菌感染性疾病中，觀察到放射性核素標記的甲?；牡睦鄯e(見Babich，JW.等人，J.Nucl.Med.，34，2176-2181(1993))，但沒有關(guān)于該肽在診斷為慢性炎癥疾病中累積的報導。
另外，在臨床診斷中，疾病需要的成像診斷包括核醫(yī)學檢驗或MRI(核磁共振成像)檢驗，通常用于初步診斷如體外試驗識別病區(qū)有困難的疾病或是慢性疾病。在此情況下，經(jīng)常采用通過給予固醇類藥物抑制免疫反應(yīng)和白細胞浸潤的治療以及白細胞減少的治療。因此，為使免疫反應(yīng)和白細胞浸潤能夠顯像，對伴有免疫反應(yīng)性炎癥包括慢性炎癥的疾病進行成像診斷，需要有不會增強血管通透性的低分子量試劑。
用Tc-99m標記肽和多肽的方法本領(lǐng)域眾所周知(參考例如JP-A-8-231587)。
發(fā)明概述鑒于現(xiàn)有技術(shù)環(huán)境，本發(fā)明的一個目的在于提供一種化合物，其體內(nèi)和體外均具有特異性結(jié)合白細胞即嗜中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞的性質(zhì)，可用放射性金屬或順磁性金屬標記，提供含有標記狀態(tài)的該化合物作為有效成份的藥用組合物，其可用于SPECT成像診斷、PET成像診斷、MRI成像診斷、放射治療等等，其中成像在個體中伴有免疫反應(yīng)的劇烈白細胞浸潤部位進行。
即，本發(fā)明涉及一種結(jié)合白細胞的化合物，其以下列通式(1)代表Z-Y-Leu-Phe-(X)n-Lys(NH2)m-ε(-R-(T)1-U) (1)其中，在通式(1)中，Z代表氨基基團的保護基團；Y代表Met或Nle；在(X)n中，X代表由一個或多個氨基酸和/或合成有機化合物組成的間隔物，n代表1或0；在(NH2)m中，NH2代表酰胺基，作為Lysα位的羧基保護基團，m代表1或0；在ε(-R-(T)l-U)中，R代表通過酰胺鍵與Lys的ε-氨基結(jié)合的Ser或Thr，T代表由一個或多個氨基酸和/或合成有機化合物組成的間隔物，l代表1或0，U代表可用金屬標記的基團；條件是所述的X和T可能彼此相同或不同。
此外，本發(fā)明涉及一種藥用組合物，其含有以上述通式(1)代表的，以放射性金屬或順磁性金屬標記的結(jié)合白細胞的化合物作為其有效成份。
附圖簡述

圖1顯示Tc-99m-肽4的HPLC色譜圖。
圖2顯示Tc-99m-肽6的HPLC色譜圖。
圖3顯示Tc-99m-肽在兔血液中的分布。
圖4顯示Tc-99m-肽3在兔感染性疾病模型中的成像。左側(cè)為給藥2小時后成像；右側(cè)為給藥22小時后成像。
圖5顯示Tc-99m-肽4在兔感染性疾病模型中的成像。左側(cè)為給藥2小時后成像；右側(cè)為給藥22小時后成像。
圖6顯示Tc-99m-肽6在兔感染性疾病模型中的成像。左側(cè)為給藥2小時后成像；右側(cè)為給藥22小時后成像。
圖7顯示Tc-99m-肽8在兔感染性疾病模型中的成像。左側(cè)為給藥2小時后成像；右側(cè)為給藥5小時后成像。
圖8顯示Tc-99m-肽9在兔感染性疾病模型中的成像。左側(cè)為給藥2小時后成像；右側(cè)為給藥5小時后成像。
圖9顯示Tc-99m-肽12在兔感染性疾病模型中的成像。左側(cè)為給藥2小時后成像；右側(cè)為給藥22小時后成像。
圖10顯示Tc-99m-肽13在兔感染性疾病模型中的成像。左側(cè)為給藥2小時后成像；右側(cè)為給藥5小時后成像。
圖11顯示Tc-99m-肽14在兔感染性疾病模型中的成像。左側(cè)為給藥2小時后成像；右側(cè)為給藥5小時后成像。
圖12顯示Tc-99m-肽15在兔感染性疾病模型中的成像。左側(cè)為給藥2小時后成像；右側(cè)為給藥5小時后成像。
圖13顯示Tc-99m-肽16在兔感染性疾病模型中的成像。左側(cè)為給藥2小時后成像；右側(cè)為給藥5小時后成像。
圖14顯示Tc-99m-肽17在兔感染性疾病模型中的成像。左側(cè)為給藥2小時后成像；右側(cè)為給藥5小時后成像。
圖15顯示Tc-99m-肽18在兔感染性的疾病模型中的成像。左側(cè)為給藥2小時后成像；右側(cè)為給藥5小時后成像。
圖16顯示Tc-99m-肽在正常大鼠中，尿排泄物的時程變化。
圖17顯示Tc-99m-肽在正常大鼠小腸中累積的時程變化。
圖18顯示Tc-99m-肽在人血液中的分布。
圖19顯示Tc-99m-標記肽在結(jié)腸炎大鼠模型中的分布。
圖20顯示Tc-99m-肽3在結(jié)腸炎大鼠模型中的成像。左側(cè)為給藥30分鐘后的成像；右側(cè)為給藥120分鐘后的成像。
圖21顯示Tc-99m-肽6在結(jié)腸炎大鼠模型中的成像。左側(cè)為給藥30分鐘后的成像；右側(cè)為給藥120分鐘后的成像。
圖22顯示Tc-99m-標記的白細胞在結(jié)腸炎大鼠模型中的成像。左側(cè)為給藥30分鐘后成像；右邊為給藥120分鐘后成像。
圖23顯示Tc-99m-標記肽在結(jié)腸炎大鼠模型中的炎癥/器官的比。
圖24顯示肽6在結(jié)腸炎大鼠中的放射自顯影和免疫染色。左側(cè)為放射自顯影；中間為用抗-粒性白細胞抗體進行的免疫染色；右側(cè)為用抗-單核細胞抗體進行的免疫染色。
圖25顯示肽14在結(jié)腸炎大鼠中的放射自顯影和免疫染色。左側(cè)為放射自顯影；中間為用抗-粒性白細胞抗體進行的免疫染色；右側(cè)為用抗-單核細胞抗體進行的免疫染色。
圖26顯示Tc-99m-標記的白細胞在結(jié)腸炎大鼠中的放射自顯影和免疫染色。左側(cè)為放射自顯影；中間為用抗-粒性白細胞抗體進行的免疫染色；右邊為用抗-單核細胞抗體進行的免疫染色。
圖27顯示在結(jié)腸炎大鼠中，使用Tc-99m-標記肽和Tc-99m-標記白細胞進行放射自顯影的炎癥/正常組織的比。
圖28顯示肽對于重組人受體和[3H]-FMLP之間的結(jié)合的抑制率。
圖29顯示在兔感染性疾病模型中，沒有FMLP抑制時Tc-99m-標記肽6的成像。左側(cè)為給藥2小時后成像；右側(cè)為給藥5小時后成像。
圖30顯示在兔感染性疾病模型中，有FMLP抑制時Tc-99m-標記肽6的成像。
執(zhí)行本發(fā)明的最佳方式在下文中，將描述執(zhí)行本發(fā)明的方式。用于本說明書的氨基酸均以單字符或三字符表示，且除非另作說明，左手顯示N-末端一側(cè)，右手顯示C末端一側(cè)。除非另作說明，括號內(nèi)的氨基酸表示與側(cè)鏈結(jié)合的肽或有機化合物。同樣，括號內(nèi)的氨基酸序列用右手方式表示N-末端一側(cè)，左手為C-末端一側(cè)，以便使整個結(jié)構(gòu)易懂。另外，本說明書中D-構(gòu)型氨基酸指定為D-氨基酸。
本發(fā)明與白細胞結(jié)合的化合物以下列通式(1)代表Z-Y-Leu-Phe-(X)n-Lys(NH2)m-ε(-R-(T)1-U) (1)即，所述通式(1)包含白細胞受體FPR的結(jié)合部位Z-Y-Leu-Phe-；結(jié)合部分-R-，由Ser或Thr組成，可提高與全體白細胞中單核細胞和淋巴細胞的結(jié)合率；結(jié)構(gòu)-U-，可用放射性金屬或順磁性金屬標記；間隔物-(X)n-、-Lys(NH2)m-和-(T)1-，使這些基團結(jié)合在一起。
更具體而言，下列白細胞結(jié)合化合物作為優(yōu)選實施方案的示范。
甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-Cys-Gly-Asn)；甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-Cys-Asp-Asp)；甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-Cys-Gly-Asp)；甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)；甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷(tetraazacyclotetradecane)-1，4，8，11-四乙酸(tetraaceticacid))；甲酰-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Ser-Asn-D-Arg-Cys-Asp-Asp)；甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-二亞乙基三胺五乙酸(diethylenetriamine pentaacetic acid))；甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷-丁酸(teraazacyclotetradecane-butyrica cid))；甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷丁酸)；甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Ser-Asn-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷丁酸)；乙酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)；氨基甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)；和甲基-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)。
就通式(1)代表的結(jié)合白細胞的化合物而言，在受體FPR的結(jié)合部位Z-Y-Leu-Phe-中，Z為氨基酸保護基團，包括例如有1-9個碳原子的酰基基團，例如甲?；鸵阴；?，有2-9個碳原子的酰氧基基團，例如t-Boc基團，有1-6個碳原子的低級烷基基團，例如甲基、乙基和丙基基團，以及氨甲酰基基團。當Y中Met或Nle的N-末端為甲?；鶗r，復合物顯示與識別甲?；牡陌准毎荏wFPR的結(jié)合活性，為乙?；蛅-Boc基團時同樣也顯示受體結(jié)合活性。
在上述通式(1)Z-Y-Leu-Phe-中，作為氨基酸Y代表Met或Nle。FPR受體為通常表達于白細胞中的嗜中性粒細胞和單核細胞細胞膜上的受體之一，具有很強的甲?；慕Y(jié)合特性，并因此顯示與Met的結(jié)合活性。受體對同Met具有類似空間結(jié)構(gòu)的Nle也顯示結(jié)合活性。
Leu和Phe對嗜中性粒細胞和單核細胞具有很高的結(jié)合活性。與甲?；木哂休^強結(jié)合活性的FPR受體，與肽，例如甲?；?Met、甲酰-Met-Met、甲酰-Met-Met-Leu和甲?；?Met-Leu-Leu，也具有結(jié)合活性，與甲酰-Met-Leu-Phe的結(jié)合活性最強。
本發(fā)明最顯著的特征在于R，其通過間隔物X和-Lys(NH2)-m的ε-氨基基團與上述通式(1)中的Z-Y-Leu-Phe-相結(jié)合。
R選自Ser和Thr，為側(cè)鏈具有羥基的氨基酸。通過利用具有Ser或Thr這種可被金屬標記的結(jié)構(gòu)，獲得了與淋巴細胞和單核細胞的顯著結(jié)合活性，這在傳統(tǒng)的低分子量白細胞結(jié)合化合物中沒有出現(xiàn)過。傳統(tǒng)的僅由受體FPR的結(jié)合部位Z-Y-Leu-Phe-組成的肽，顯示與嗜中性粒細胞和單核細胞結(jié)合活性，但幾乎不顯示與淋巴細胞的結(jié)合活性。將可通過Lys的ε-氨基結(jié)合的Ser或Thr進行金屬標記的結(jié)構(gòu)，與受體FPR的結(jié)合部位Z-Y-Leu-Phe-聯(lián)結(jié)，使肽對單核細胞和淋巴細胞的結(jié)合率顯著提高。因此，使得本發(fā)明以通式(1)代表的結(jié)合白細胞的化合物，具有與所有種類的白細胞，即嗜中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞的結(jié)合能力。例如，在傳統(tǒng)的血細胞結(jié)合復合物中，結(jié)合淋巴細胞和單核細胞的化合物與結(jié)合全體白細胞的化合物的比率，約為12％-35％，而在本發(fā)明的血細胞結(jié)合化合物中，結(jié)合淋巴細胞和單核細胞的化合物與結(jié)合全體白細胞的化合物的比率提高至約18％-65％。這表明有強烈白細胞浸潤的病區(qū)可以被靶向，本發(fā)明化合物可用作診斷或治療伴有白細胞浸潤的疾病的試劑。
本發(fā)明的結(jié)合白細胞的化合物中，在FPR受體結(jié)合部位Z-Y-Leu-Phe-，具體而言，淋巴細胞和單核細胞的受體結(jié)合部位R的Ser或Thr，與可用放射性金屬或順磁性金屬標記的結(jié)構(gòu)U之間的距離，均可由連接這些部位的間隔物X、-Lys(NH2)m-的ε-氨基和間隔物T充分進行調(diào)整。因此，當需要保持顯著受空間結(jié)構(gòu)影響的受體結(jié)合活性時，這些部分可彼此相連接。換言之，為使R的Ser或Thr的C末端與Z-Y-Leu-Phe-的C末端相結(jié)合，優(yōu)選在Z-Y-Leu-Phe-的C末端基團上加上具有4個碳原子側(cè)鏈和一個氨基的Lys，然后Ser或Thr與Lys的ε-氨基相連。當需要更多的空間距離時，可增加間隔物X。
X和T都是由一個或多個氨基酸和/或合成有機化合物組成的間隔物，必要時可作為本發(fā)明白細胞結(jié)合復合物的一個組成部分。X和Y彼此可能相同或不同。然而，Cys殘基不宜用作組成X或T的氨基酸，因為巰基基團可能形成分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，導致形成多聚體例如二聚體，這種結(jié)構(gòu)改變可能顯著影響與受體的結(jié)合活性。Pro也較不適宜與受體結(jié)合，因為如果X或T含有Pro，其空間結(jié)構(gòu)將受到限制從而限制其空間自由度。因此，最好從構(gòu)成X或T的氨基酸序列中排除Cys和Pro。
更具體而言，要用作X的氨基酸對受體結(jié)合活性沒有影響，包括例如，無電荷的氨基酸如Gly、Ala、Val、Leu和Ile，Nle、Tyr和Nle-Tyr。對T的氨基酸而言，為提供受體結(jié)合部位與被放射性金屬或順磁性金屬標記的結(jié)構(gòu)間的距離，或控制生物體的體內(nèi)動態(tài)，或提供體內(nèi)對新陳代謝的抵抗性，與上述相同的氨基酸，非氨基酸化合物或其組合均可使用。除上述氨基酸外，還可使用L-和D-形式的氨基酸、疏水性氨基酸如Gly、極性和帶電荷的氨基酸(酸或堿性的)如Arg、Asp、Glu和Lys。
構(gòu)成間隔物的合成有機化合物包括，例如，化合物如1，5-己二烯、反式-2-甲基-1，3-戊二烯和4-甲基-3-硝基乙酰苯，各具有疏水性官能團如甲基、乙基和芐基；化合物如(±)-2-甲基-2，4-戊二醇(己二醇)和3-甲基-1，3，5-戊硫醇具有極性官能團如羥基和氨基基團；化合物如亞甲基丁二酸、4-順丁烯二酰亞胺丁酸和6-順丁烯二酰亞胺己酸，具有帶電荷官能團如羧基，氨基和亞氨基。
就可用金屬標記的基團U而言，可使用由一個或多個氨基酸組成的基團，或由非氨基酸化合物組成的基團。對于由一個或多個氨基酸組成的基團，可使用以-Cys-A1-A2代表的肽(條件是A1和A2為Cys和Pro以外的氨基酸)。這些肽包括，例如，-Cys-Gly-Asp，-Cys-Asp-Asp，-Cys-Asp-Gly，-Cys-Gly-Glu，-Cys-Glu-Glu，-Cys-Glu-Gly，-Cys-Gly-Asn，-Cys-Asn-Asn，-Cys-Asn-Gly，-Cys-Gly-Gln，-Cys-Gln-Gln，-Cys-Gln-Gly，-Cys-Gly-Lys，-Cys-Lys-Lys，-Cys-Lys-Gly，-Cys-Gly-Arg，-Cys-Arg-Arg和-Cys-Arg-Gly。
由非氨基酸化合物組成的可用金屬標記的基團包括，例如，有8-20個碳原子的含氮環(huán)狀化合物如1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(1，4，7，10-tetraazacyclododecane)(Cyclen)、1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷(1，4，8，11-tetraazacyclotetradecane)(Cyclam)、1，4，8，12-四氮雜環(huán)十五烷(1，4，8，12-tetraazacyclopentadecane和1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷-5，7-二酮(1，4，8，11-tetraazacyclotetradecane-5，7-dione)(Dioxocycam)；有8-20個碳原子的含氮環(huán)狀羧酸化合物如1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷1，4，8，11-四乙酸(1，4，8，11-tetraazacyclotetradecane-1，4，8，11-tetraaceticacid)(TETA)、1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-N，N′，N″，N四乙酸(1，4，7，10-tetraazacyclododecane-N，N′，N″，N-tetraaceticacid)(DOTA)、1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷5，7-二酮-N，N′，N″，N四乙酸(1，4，8，11-tetraazacyclotetradecane-5，7-dione-N，N′，N″，N-tetraaceticacid)、1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-丁酸(1，4，7，10-tetraazacyclododecane-butyric acid)和1，4，8，10-四氮雜環(huán)十二烷-丁酸(1，4，8，10-tetraazacyclododecane-butyric acid)；有8-20個碳原子的含氮環(huán)狀羧酸化合物衍生物如1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-氨乙基-甲氨酰甲基-4，7，10-三(R，S)-甲基乙酸(1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1-aminoethyl carbamoylmethyl-4，7，10-tris[R，S]-methylaceticacid)(DO3MA)和1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-α，α′，α″，α-四甲基乙酸(1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7，10-α，α′，α″，α，-tetramethylacetic acid)(DOTMA)；和有4-10個碳原子的亞烷基氨羧酸(alkyleneamine carboxylic acid)例如乙二胺四乙酸(EDTA)，二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)，三亞乙基四胺六乙酸(triethylenetetraaminehexaaceticacid)和乙二醇-(2-氨基乙基)-N，N，N′，N′-四乙酸(ethyleneglycol-(2-aminoethyl)-N，N，N′，N′-tetraaceti cacid)(EGTA)。
本發(fā)明結(jié)合白細胞的化合物作為藥用組合物用于診斷成像時，取決于診斷目的或治療病區(qū)，對診斷區(qū)域的成像可在短時間內(nèi)完成，利用通過控制運動狀態(tài)使體內(nèi)非必要代謝物順利排出，減少對生物體不必要的輻射和減低診斷成像的背景效應(yīng)。例如，就用于構(gòu)成間隔物X和T的氨基酸等等而言，可通過使用脂肪族氨基酸如Gly、Ala、Ile、Leu和Val，芳香族胺基酸如Phe、Trp和Tyr，含硫氨基酸如Met，或含疏水性官能團如甲基，乙基和苯甲基的化合物，調(diào)節(jié)間隔物的代謝轉(zhuǎn)向胃腸道。要調(diào)節(jié)間隔物的代謝轉(zhuǎn)向尿和腎，可使用具有電荷官能基的帶電荷的氨基酸或化合物，選擇羥基氨基酸如Ser和Thr，酸性的氨基酰胺如Asn和Gln，帶電荷的(酸和堿性的)氨基酸如Arg、Asp、Glu和Lys，或含極性官能團的如羥基和酰胺基合成有機化合物，含帶電荷官能團如羧基，氨基和亞氨基的化合物。此外，當需要在受體結(jié)合部位與用金屬標記的結(jié)構(gòu)之間存在間隔時，可使用一個或多個氨基酸或含有直鏈例如烷基的合成有機化合物。
就包含在可用金屬標記的基團U內(nèi)的氨基酸而言，可按同上所述考慮。例如，選擇Asp或Lys，或選擇含羧基或氨基的化合物時，給予放射性金屬標記的化合物后，可控制最終代謝物的主要排出途徑轉(zhuǎn)向腎。同樣，選擇疏水性氨基酸如Gly，可控制最終代謝物的主要排出途徑轉(zhuǎn)至胃腸道。
另外，就用作組成X和T間隔物的氨基酸等等而言，為提供對體內(nèi)新陳代謝的抵抗力，可使用D-氨基酸或人工氨基酸和非氨基酸。更具體而言，組成間隔物的D-氨基酸，包括例如，氨基酸序列如D-Arg-Asp，Arg-D-Asp，D-Arg-D-Asp，D-Asp-Arg，Asp-D-Arg，D-Asp-D-Arg，Ser-D-Arg，D-Ser-Arg，D-Ser-D-Arg，D-Arg-Ser，Arg-D-Ser，D-Arg-D-Ser，Ser-D-Asp，D-Ser-Asp，D-Ser-D-Asp，D-Asp-Ser，Asp-D-Ser和D-Asp-D-Ser。
本發(fā)明的結(jié)合白細胞的化合物可按照如下所述方法合成。
(1)當所述化合物僅由氨基酸組成時，可使用常見的肽自動合成儀如Applied Biosystems(USA)制造的肽自動合成儀，按照例如Boc-方法和Fmoc-方法合成該化合物。合成的復合物，可通過同時進行脫保護和從固相樹脂載體上結(jié)合狀態(tài)切離，繼而使用反相柱，經(jīng)高效液相色譜法(以下指定為HPLC)進行純化?；蛘?，所述化合物可通過液相肽合成，或從動物來源等等得到。
(2)當所述化合物包含非氨基酸時，大多數(shù)情況下，可用與上述相同的方法合成該化合物。例如所述復合物可按如下合成。即，賴氨酸殘基或其保護性衍生物與固相樹脂載體結(jié)合，其N-末端依次結(jié)合X氨基酸殘基或其保護衍生物，或充當間隔物的化合物或其保護衍生物，Phe或其保護衍生物、Leu或其保護衍生物，以及Y氨基酸及其保護衍生物。然后，與固相樹脂載體結(jié)合的Lys側(cè)鏈的ε-氨基被激活，R中的Ser或Thr或其保護衍生物與之結(jié)合，隨后再結(jié)合間隔物T的氨基酸或其保護衍生物，或充當間隔物的化合物或其保護衍生物，以及可作為金屬標記基團的化合物U或其保護衍生物，然后將上述通式(1)中的合成化合物從樹脂載體上切離。
藥用組合物包含標記的化合物作為其有效成份，通過用放射性金屬或順磁性金屬標記本發(fā)明的結(jié)合白細胞的化合物制備，其可能用于，例如，作為放射性同位素診斷試劑或放射治療試劑，特別用于伴有個體免疫反應(yīng)的白細胞劇烈浸潤病變部位的成像診斷和治療。即，當疾病有嗜中性粒細胞、單核細胞或淋巴細胞或兩種以上的白細胞浸潤劇烈的活躍病區(qū)時，可使用特定的檢測物測定白細胞的累積部位和累積水平。
伴有個體免疫反應(yīng)的疾病包括哺乳動物體內(nèi)的感染、炎癥和aterosclerosis組成的一類病癥。即該類病癥包括病毒感染、細菌傳染、真菌感染、原生蟲疾病、線蟲病、膠原性疾病和除膠原性疾病之外的自身免疫性疾病。在日本，約80％的肝炎患者為病毒感染所致的病毒性肝炎，其它的大多是自身免疫性肝炎，因此，與嗜中性粒細胞侵潤相比，大部分肝臟炎性疾病為具有淋巴細胞和單核細胞浸潤的疾病。就像這種具有相對低水平嗜中性粒細胞浸潤的疾病而言，有人指出，如果使用傳統(tǒng)的fMLF類似物，因其與淋巴細胞和單核細胞的結(jié)合比嗜中性粒細胞弱，病區(qū)的白細胞浸潤可能被低估。然而，本發(fā)明的結(jié)合白細胞的化合物能夠恰當?shù)刈R別嗜中性粒細胞浸潤較少的疾病，例如大部分自身免疫性疾病和利什曼病(leishmaniasis)中的白細胞浸潤，因為該化合物與嗜中性粒細胞和淋巴細胞和單核細胞都具有較高的結(jié)合活性。
與嗜中性粒細胞相比，呈現(xiàn)大量淋巴細胞和單核細胞浸潤的病癥，或浸潤白細胞中呈現(xiàn)大量淋巴細胞和單核細胞群的病癥，包括病毒感染、原生動物疾病、線蟲病、膠原性疾病和除膠原性疾病之外的自身免疫性疾病。認為本發(fā)明對伴有免疫反應(yīng)如白細胞浸潤的病癥有效；對于與嗜中性粒細胞相比呈現(xiàn)大量淋巴細胞和單核細胞浸潤的病癥，或浸潤白細胞中呈現(xiàn)大量淋巴細胞和單核細胞群的病癥特別有效。
此外，由于本發(fā)明化合物同樣具有現(xiàn)有技術(shù)描述的特異的嗜中性粒細胞結(jié)合活性，與淋巴細胞和單核細胞浸潤相比，對呈現(xiàn)大量嗜中性粒細胞浸潤的病癥，或浸潤白細胞中呈現(xiàn)大量嗜中性粒細胞的病癥，本發(fā)明化合物同樣有效。這類病癥包括，例如，細菌性心內(nèi)膜炎、心肌梗塞、支氣管性肺炎、大葉性肺炎、滲透性的肺結(jié)核、急性胃炎、假膜性結(jié)腸炎、耶爾森氏菌屬感染、潰瘍性結(jié)腸炎、急性闌尾炎、急性膽管炎、膽囊炎、小管增生性腎小球腎炎、滲透性的腎小球腎炎、急性腎盂腎炎、急性輸卵管炎、急性子宮頸炎、急性乳腺炎、急性睪丸炎、急性前列腺炎、變應(yīng)性脈管炎、急性化膿性炎、結(jié)核性megingitis、急性化膿性骨髓炎、急性淋巴結(jié)炎和結(jié)核性動脈周炎。
當本發(fā)明的結(jié)合白細胞的化合物被用作放射性同位素診斷試劑時，所述化合物的優(yōu)選實施方案為用適于SPECT成像診斷的放射性金屬如Tc-99m、In-111、Ga-67，Sn-117m，Sm-153和Re-186，或用適于PET成像診斷的放射性金屬如Cu-64或Ga-68進行標記的化合物。
本發(fā)明的結(jié)合白細胞的化合物用作放射治療試劑時，所述化合物的優(yōu)選實施方案為用放射性金屬如Y-90，Re-186或Re-188標記的一種化合物。本發(fā)明的化合物用作MRI成像診斷的造影劑時，所述化合物的優(yōu)選實施方案為用配位狀態(tài)的順磁性金屬如Cu、Fe或Gd標記的復合物。
用Tc-99m、Re-186和Re-188標記本發(fā)明的結(jié)合白細胞的化合物，可按普通方法進行。換言之，將該化合物溶解于鹽或緩沖溶液等中，隨后加入還原劑如氯化亞錫，然后與高锝酸鈉溶液或高錸酸鈉溶液混合以制備標記化合物。對于用Cu、Cu-64、Fe、Mn、Gd或In-111進行標記，可將化合物與含Cu、Cu-64、Fe、Mn、Gd或In-111離子的弱酸性水溶液混合，以制備標記的本發(fā)明結(jié)合白細胞的化合物。用Ga-67、Ga-68或Y-90標記時，可將該化合物與含有Ga-67、Ga-68或Y-90離子的弱酸或弱堿性水溶液混合，以制備標記的結(jié)合白細胞的化合物。
當用放射性金屬標記的化合物用作放射性同位素診斷或放射治療試劑，或用順磁性金屬標記的化合物用作MRI造影劑時，標記化合物可按上述方法制備，經(jīng)HPLC純化除去雜質(zhì)和未反應(yīng)的過锝酸鹽離子、高錸酸鹽離子、In-111離子、Cu離子、Cu-64離子、Ga-67離子、Ga-68離子、Fe離子、Mn離子、Gd離子和Y-90離子后使用。
用放射性金屬或順磁性金屬標記的化合物，可與藥物可接受的添加劑混合，以制備放射性同位素診斷試劑、放射治療試劑或MRI造影劑。這些添加劑包括，例如，藥物可接受的穩(wěn)定劑，如抗壞血酸和p-氨基苯甲酸，pH調(diào)節(jié)劑如緩沖溶液，賦形劑如D-甘露醇，用于改善放射化學純度的試劑如檸檬酸、酒石酸、丙二酸、葡萄糖酸鈉和葡庚糖酸鈉。此外，藥用組合物可以試劑盒的形式提供，以便使特別用于本發(fā)明放射性同位素診斷試劑的凍干干粉與添加劑混合而現(xiàn)場制備。
含有放射性金屬標記的本發(fā)明結(jié)合白細胞的化合物的放射性同位素診斷試劑、放射治療試劑或MRI造影劑，可通過常用的腸胃外途徑給藥如靜脈內(nèi)給藥。認為能夠成像和治療的組合物，衡量多種條件，如體重和患者的年齡、適當?shù)姆派涑上髢x、MRI測量儀和疾病的狀態(tài)來確定其劑量和放射活性。
對于人類使用，含有Tc-99m標記的化合物的診斷試劑劑量為Tc-99m放射活性37-1110MBq，優(yōu)選185-1110MBq。治療試劑含Re-186或Re-188標記的化合物時，其劑量為放射活性37-18500MBq，優(yōu)選放射活性370-7400MBq。治療試劑含Y-90標記的化合物時，其劑量為放射活性37-3700MBq，優(yōu)選放射活性37-1110MBq。其它放射性金屬標記的化合物劑量基本相同。診斷試劑含順磁性金屬，如Gd、Fe、Mn和Cu標記的化合物時，其劑量相應(yīng)于處理的對象、MR成像儀器的敏感性、成像實驗的靶組織、給藥的特定方式及預(yù)定使用目的療效而不同。然而，對于特定患者的特定藥物治療，取決于多種因素包括所用特定試劑的活性(誘導釋放(induced relaxation))、年齡、體重、一般的健康狀況、性別、膳食、給藥時間、排出速度，試劑聯(lián)用以及出診醫(yī)生所作的判斷。
標記復合物劑量的有效水平大約為每日0.1-1000μmol/kg體重，優(yōu)選每日約0.5-300μmol/kg體重。典型的制備物中含有標記化合物約為1-1000mM，優(yōu)選約10-500mM。
下文實施例用于更詳細地描述本發(fā)明，但并不因此限定本發(fā)明的范圍。
所得化合物的測定方法及實施例中使用的試劑描述如下。
(1)γ粒子計數(shù)器使用Auto-Well Gamma Counter(ALOKA公司制造，日本)對血液中標記化合物的分布進行測定，使用NaISingle Channel Analyzer(OHYO KOKEN KOGYO CO.，LTD.制造，日本)對標記化合物在全身的分布進行測定。
(2)γ射線照相儀使用GMS-550U(TOSHIBA MEDICAL SYSTEMSCORPORATION制造，日本)。
(3)反相高效液相層析使用反相Millipore Puresil 5μmC18柱(4.6×150毫米)(Millipore Corporation制造，美國)。
(4)所有肽化合物通過固相肽合成法合成。
(5)99mTcO4-使用來自99Mo/99mTc發(fā)生器的洗脫液的鹽溶液(NIHON MEDI-PHYSICS CO.，LTD.，日本)。
(6)使用的所有試劑均為超級純。
(7)在使用前，所有實驗動物均在間隔12小時的明-暗條件下飼養(yǎng)一周。在此期間，飼料和水的攝取保持自由。
實施例實施例1肽的合成采用固相肽合成法合成下列肽，并用于下文實施例中。
本發(fā)明的結(jié)合白細胞的化合物肽3甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-Cys-Gly-Asn)；肽4甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-Cys-Asp-Asp)；肽5甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-Cys-Gly-Asp)；肽6甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)；肽7甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-cyclam四羧酸)；肽8甲酰-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Ser-Asn-D-Arg-Cys-Asp-Asp)；肽9甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-DTPA)；肽13甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-Cyclam丁酸)；肽14甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-cyclam丁酸)；肽15甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Ser-Asn-cyclam丁酸)；
肽16乙酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)；肽17氨基甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)；和肽18甲基-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)。
上述肽中，cyclam四羧酸，DTPA和cyclam丁酸分別指1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，8，11-四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸和1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷丁酸。
對照肽肽1甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys-Glu-Cys；肽2甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Cys-Asn-Asp)；肽10甲酰-Met-Leu-Phe-Lys-ε-(-Gly-Gly-Cys)；肽11甲酰-Met-Leu-Phe-Lys-ε-(-Gly-Gly-Ac-S-Bzl)；和肽12甲酰-Met-Leu-Phe-Lys-ε-(-Gly-Asp-Ac-S-Bzl)。
肽3的合成肽的合成，采用Boc方法，MBHA樹脂(鹽酸p-甲氧基-二苯甲基胺樹脂，1％二乙烯基苯-聚苯乙烯共聚物)，使用肽合成儀(430A型，AppliedBiosystems)，在0.5mM規(guī)模條件下進行。C末端的Lys殘基的側(cè)鏈用Fmoc基團保護。經(jīng)肽鏈延伸和N-末端氨基甲?；?，Lys殘基側(cè)鏈的Fmoc基團用20％的哌啶/DMF裂解，以使肽鏈向側(cè)鏈方向延伸。于-2至-5℃，在反應(yīng)混合物氟氫酸酐p-甲酚(80∶20)中處理1.0小時以截取肽。
使用層析柱YMC-Pack ODS-A SH-365-5(30×250mm)在液相色譜(HPLC)上進行純化，洗脫液A0.1％TFA/純水，洗脫液B0.1％TFA/乙腈，按從A到B的梯度條件洗脫，洗脫速度20ml/min。收集主要峰的級分并凍干以得到目的肽。采用反相高效液相層析法測定由此得到的肽的純度。
也可使用預(yù)裝樹脂代替MBHA樹脂進行合成。
肽在6M鹽酸中，于110℃水解22小時后，測定與所得主峰相應(yīng)的氨基酸組成并確認其為目標肽3，然后將與氨基酸組成相符的峰凍干，以得到目標肽3。通過質(zhì)譜分析法(以下指定為ESI-MS)測定分子量以確認肽的分子量與理論值相同。所得肽3的氨基酸組成(分子中每種氨基酸的數(shù)目)分析結(jié)果如下文所示。括號內(nèi)顯示目標肽的氨基酸組成(分子中每種氨基酸的數(shù)目)的理論值。
肽3Asp(1)1.02； Ser(1)0.93；Gly(1)1.03；Tyr(1)1.00；Phe(1)1.01；Lys(1)1.00，NH3(2)2.10；Cys(1)0.86；Leu(1)+Nle(2)2.88此外，通過ESI-MS得到的肽3分子量如下文所示。括號內(nèi)數(shù)值表明目標肽的分子量理論值。ESI-MSMW＝1183.9(1184.4)。
其它的肽的合成用相似方法合成和鑒定其它的肽。因為肽1、肽10、肽11和肽12為C末端沒有氨基化的肽，這些肽的合成，通過用HMP樹脂(4-羥甲基-苯氧基甲基-聚苯乙烯-1％二乙烯基苯-共聚物樹脂)代替MBHA樹脂，采用與合成肽3相似的方法進行。氨基酸組成的分析值和用于鑒定各種肽的ESI-MS如下文所示。對于肽1和肽10，只顯示了氨基酸組成。
肽1＝Glu(1)1.04，Leu(1)0.99，Tyr(1)0.98，Phe(1)0.99，Lys(1)1.00，Cys(1)0.97，Nle(2)2.03.
肽2＝Asp(2)2.00，Leu(1)0.86，Tyr(1)1.00，Phe(1)1.01，Lys(1)1.00，NH3(2)1.94，Cys(1)0.88，Nle(2)2.10，ESI-MSMW＝1，155.0(1，155.4).
肽4＝Asp(2)2.00，Ser(1)0.90，Tyr(1)0.99，Phe(1)1.01，Lys(1)1.00，NH3(1)1.10，Leu(1)+Nle(2)2.84，Cys(1)0.92，ESI-MSMW＝1，243.0(1，243.4).
肽5＝Asp(1)1.00，Ser(1)0.90，Gly(1)1.01，Tyr(1)0.97，Phe(1)1.00，Lys(1)1.03，NH3(1)1.18，Leu(1)+Nle(2)2.86，Cys(1)0.91，ESI-MSMW＝1，185.1(1，185.4).
肽6＝Asp(3)3.19，Ser(1)0.97，Tyr(1)0.97，Phe(1)0.98，Lys(1)1.00，NH3(1)1.20，Leu(1)+Nle(2)2.80，Arg(1)1.06，Cys(1)0.92，ESI-MSMW＝1，514.4(1，514.7).
肽7＝Ser(1)0.92，Tyr(1)1.00，Phe(1)1.02，Lys(1)1.00，NH3(1)1.15，Leu(1)+Nle(2)2.89，ESI-MSMW＝1，324.3(1，324.6).
肽8＝Asp(3)2.94，Ser(2)1.80，Leu(1)1.01，Phe(1)1.00，Lys(1)1.01，NH3(2)2.10，Nle(1)0.95，Cys(1)1.01 ESI-MSMW＝1，324.1(1，324.5).
肽9＝Ser(1)0.91，Tyr(1)1.00，Phe(1)0.99，Lys(1)1.00，NH3(1)1.23，Leu(1)+Nle(2)2.87，Arg(1)1.00，ESI-MSMW＝1，441.4(1，441.6).
肽10＝Gly(2)1.88，Met(1)0.98，Phe(1)1.00，Lys(1)1.02，Leu(1)1.04.
肽11＝Gly(2)1.94，Met(1)0.91，Phe(1)1.00，Lys(1)1.02，Leu(1)1.01，ESI-MSMW＝842.5(842.4).
肽12＝Asp(1)0.94，Gly(1)0.92，Met(1)0.96，Phe(1)1.00，Lys(1)1.01，Leu(1)1.00，ESI-MSMW＝901.5(902.1).
肽13＝Ser(1)0.92，Tyr(1)1.00，Phe(1)1.01，Lys(1)1.01，NH3(1)1.11，Leu(1)+Nle(2)2.88，ESI-MSMW＝1，178.3(1，178.5).
肽14＝Asp(1)1.01，Ser(1)0.91，Tyr(1)1.00，Phe(1)1.00，Lys(1)1.01，NH3(1)1.06，Leu(1)+Nle(2)2.89，Arg(1)1.00，ESI-MSMW＝1，449.6(1，449.8).
肽15＝Asp(1)1.01，Ser(2)1.77，Tyr(1)0.98，Phe(1)1.00，Lys(1)1.01，NH3(2)2.09，Leu(1)+Nle(2)2.87，ESI-MSMW＝1，379.5(1，379.7).
肽16＝Asp(3)3.02，Ser(1)0.93，Tyr(1)1.00，Phe(1)1.00，Lys(1)1.00，NH3(1)1.10，Leu(1)+Nle(2)2.86，Arg(1)1.01，Cys(1)1.07，ESI-MSMW＝1，528.3(1，528.7).
肽17＝Asp(3)2.95，Ser(1)0.91，Tyr(1)1.00，Phe(1)1.00，Lys(1)1.00，NH3(1)1.79，Leu(1)+Nle(2)2.58，Arg(1)1.00，Cys(1)1.00 ESI-MSMW＝1，529.4(1，529.7).
肽18＝Asp(3)2.99，Ser(1)0.92，Tyr(1)0.88，Phe(1)0.97，Lys(1)0.97，NH3(1)1.12，Leu(1)+Nle(1)1.85，Arg(1)1.00，Cys(1)1.03，MeNle(1)0.95ESI-MSMW＝1，500.5(1，500.7).
實施例2Tc-99m標記肽1、肽2、肽3、肽4、肽5、肽6、肽7、肽8、肽9、肽10、肽13、肽14、肽15、肽16、肽17和肽18(1)方法Tc-99m-高锝酸鈉溶液(以下指定為99mTcO4-)，1.1-3.0GBq，加至含40.3μmol/300μl葡庚糖酸和130nmol/50μl氯化亞錫溶液混合物的試管中，至總體積為1.35毫升。攪拌并不時顛倒混合物，于室溫下反應(yīng)30分鐘。收集其部分，以確認Tc-99m葡庚糖酸中的Tc-99m標記率95％或更高。
實施例1中得到的十六種肽的每一種均溶于二甲基甲酰胺(DMF)中，用超純水、含0.9％NaCl的10mM，pH7.4的磷酸鹽緩沖液(以下指定為PBS)或10mM，pH8.0的碳酸鹽緩沖液(以下指定為CB)，調(diào)整各溶液濃度至0.25-12.5nmol/200μl。向各溶液中加入Tc-99m葡庚糖酸溶液200μl，攪拌混勻并于100℃-120℃反應(yīng)10分鐘。標記完成后，收集部分反應(yīng)混合物，使用HPLC測定Tc-99m標記率。HPLC條件如下。層析柱Millipore puresil 5μm C18(4.6×150毫米)；流速1ml/min.；檢測波長220nm；放射活性檢測儀NaI單信道分析儀；洗脫液A0.1％三氟乙酸(以下指定為TFA)/純水；洗脫液B0.1％TFA/乙腈；濃度梯度0分鐘(20％B)→20分鐘(50％B)(2)結(jié)果表1顯示16種Tc-99m標記肽的標記率。肽4和肽6代表的所得標記化合物的HPLC分析色譜圖分別如圖1和圖2所示。每一肽中可見單一的標記產(chǎn)物。表1所示標記率的結(jié)果表明，Tc-99m的標記可以80％或更高。
表1.Tc-99m標記肽的標記率

實施例3兔血液中的分布(1)在實施例2中Tc-99m標記肽(肽3、肽4、肽6、肽8、肽9、肽12、肽13、肽14、肽15、肽16、肽17和肽18)通過反相HPLC，在與實施例2相同的HPLC條件下將未標記的肽和標記的肽分離而純化。梯度洗脫在20％→50％(0.1％TFA乙腈/0.1％TFA水)條件下進行0→20分鐘。隨后制備Percoll密度-梯度溶液。向90毫升未稀釋的Percoll溶液(Pharmacia Biotech Inc.)(比重1.130g/ml)中加入10ml 1.5M NaCl，制備等同于生理鹽水的等滲溶液。加入生理鹽水稀釋該溶液，制備1.096、1.077和1.063g/ml的Percoll溶液。如此制備的1.096、1.077和1.063g/ml的Percoll溶液各1毫升，在15ml的試管中分層。使用密度標記珠(紅1.062；藍色1.075；橙色1.087；綠色1.098)確認其具有目的密度。雄性，體重約2kg，無特定病原體(SPF)的健康的新西蘭白(NZW)品系兔，耳靜脈采集血液用于本試驗。
為檢測在作為急性炎癥模型的感染的兔血液中的分布，使用由金黃葡萄球菌引起發(fā)炎的兔血液代替健康的兔血液。約108活菌計數(shù)的金黃葡萄球菌懸浮于1毫升生理鹽水中，100μl細菌懸液肌肉注射給雄性、體重約2kg的新西蘭白(NZW)品系兔的右側(cè)腓腸中。約24小時后耳靜脈采集兔血液用于檢測。
為檢測在作為慢性炎癥模型的潰瘍性結(jié)腸炎兔血液中的分布，使用由2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)引起發(fā)炎的兔血液代替健康的兔血液。潰瘍性結(jié)腸炎兔模型按照Anthony等的方法制備(Anthony等Int.J.Exp.Path.，76，215-224，1995)。360mg TNBS溶于4ml超純水中，向其中加入3.2ml乙醇，制備50.0mg/ml，46％的乙醇/生理鹽水。向7周齡，重1.3-1.4kg，雄性，1天前禁食，戊巴比妥麻醉的新西蘭白(NZW)品系兔，將管子經(jīng)肛門插入腸約15cm深，注入3ml空氣。接著注入0.8ml TNBS/46％乙醇/生理鹽水溶液，按摩并傾側(cè)其體位2分鐘。4-5天后，耳靜脈采集兔血液用于檢測。
兔血液各2ml，在37℃溫水浴中溫育5分鐘。向其中加入經(jīng)HPLC純化的四種Tc-99m-肽，各3μl(111MBq/ml，Tc-99m-肽，1.8×10-11mol/ml)，孵育30分鐘。小心地將血樣在預(yù)先制備的Percoll密度梯度溶液中分層。分層樣品以2000rpm(800×g)離心15分鐘。離心后，冰凍試管，用切刀切下每一級分，然后使用Auto-Wellγ粒子計數(shù)器測量每一級分的放射活性，以測定每一血液組分中4種Tc-99m-肽的放射活性分布。
(2)結(jié)果根據(jù)兔血液學參數(shù)中，白細胞計數(shù)1000-8000個細胞/μl，受體FPR數(shù)目100,000-120,000/細胞，計算兔血液中FPR受體的估計數(shù)目為0.17-1.6×10-12mol/ml，兔肽/受體的比率為0.01-0.11。顯示各血液組分放射活性在全血放射活性中所占百分比的結(jié)果如圖3所示。顯示粒性白細胞級分放射活性占白細胞總數(shù)，以及淋巴細胞和單核細胞級分放射活性占白細胞總數(shù)的百分比的結(jié)果如表2和表3所示。
在健康的SPF兔血液中，Tc-99m-肽3和Tc-99m-肽12在粒性白細胞級分和淋巴細胞與單核細胞級分中的分布為全血放射活性的5％或更少，且未觀察到較強的結(jié)合。
由金黃葡萄球菌所致患感染性疾病的兔血液，孵育30分鐘后，Tc-99m-肽4在粒性白細胞級分的放射活性分布為全血放射活性的10.78％，Tc-99m-肽4在淋巴細胞和單核細胞級分的放射活性分布為全血放射活性的10.22％。粒性白細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的50.22％，淋巴細胞和單核細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的49.78％。孵育30分鐘后，Tc-99m-肽6在粒性白細胞級分中的放射活性分布為全血放射活性的18.27％，Tc-99m-肽6在淋巴細胞與單核細胞級分中的放射活性分布為全血放射活性的20.21％。粒性白細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的47.65％，淋巴細胞與單核細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的52.35％。Tc-99m標記的化合物肽8、肽9、肽13、肽14、肽15、肽16、肽17與肽18中，10％或更多的全血放射活性分布于白細胞中，約27％-77％的全血放射活性分布于淋巴細胞與單核細胞級分中。
孵育30分鐘后，對照Tc-99m-肽12在粒性白細胞級分的放射活性分布為全血放射活性的39.73％，Tc-99m-肽12在淋巴細胞與單核細胞級分的放射活性分布為全血放射活性的8.89％。粒性白細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的81.58％，淋巴細胞與單核細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的18.42％。根據(jù)這些結(jié)果，在金黃葡萄球菌所致感染性疾病的兔血液中，作為本發(fā)明一部分的肽4、肽6、肽8、肽9、肽13、肽14、肽15、肽16、肽17與肽18Tc-99m標記的化合物，在淋巴細胞與單核細胞級分的分布顯然比傳統(tǒng)肽Tc-99m-肽12多。
如圖3所示，用TNBS制備的潰瘍性結(jié)腸炎模型的兔血液孵育30分鐘后，Tc-99m-肽3在粒性白細胞級分的放射活性分布為全血放射活性的18.44％，Tc-99m-肽3在淋巴細胞和單核細胞級分的放射活性分布為全血放射活性的15.94％。如表3所示，粒性白細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的53.72％，淋巴細胞和單核細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的46.28％。孵育30分鐘后，Tc-99m-肽6在粒性白細胞級分中的放射活性分布為全血放射活性的45.44％，Tc-99m-肽6在淋巴細胞和單核細胞級分中的放射活性分布為全血放射活性的12.60％。粒性白細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的78.27％，淋巴細胞和單核細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的21.73％。孵育30分鐘后，對照Tc-99m-肽12在粒性白細胞級分中的放射活性分布為全血放射活性的15.10％，Tc-99m-肽12在淋巴細胞和單核細胞級分中的放射活性分布為全血放射活性的8.34％。粒性白細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的64.66％，淋巴細胞和單核細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的35.34％。
根據(jù)這些結(jié)果，很明顯，在潰瘍性結(jié)腸炎模型的兔血液中，作為本發(fā)明一部分的Tc-99m肽3、Tc-99m-肽6在淋巴細胞和單核細胞級分的分布比傳統(tǒng)肽Tc-99m-肽12多。
從上可知，同傳統(tǒng)的Tc-99m-肽12相比，本發(fā)明的肽與淋巴細胞和單核細胞的結(jié)合比粒性白細胞更強，且證實了本發(fā)明的肽對于治療經(jīng)常被淋巴細胞和單核細胞浸潤的慢性炎癥有效。
表2.Tc-99m標記的肽與兔白細胞的結(jié)合率(對全體白細胞的結(jié)合率(％)，n＝3，平均值±SD)

表3.Tc-99m標記的肽與兔白細胞的結(jié)合率(對全體白細胞的結(jié)合率(％)，n＝3，平均值±SD)

實施例4Tc-99m標記的化合物肽3、肽4、肽5和肽12在感染性疾病模型兔中的成像，以及時急性期和亞急性期炎癥的有效性(1)方法約108計數(shù)的活金黃葡萄球菌，懸浮于1ml生理鹽水中，取懸浮液100μl肌肉注射入約2kg的新西蘭白(NZW)品系兔的右側(cè)腓腸。24小時后，呈現(xiàn)明顯炎癥的模型兔用戊巴比妥麻醉，每種37-74MBq的Tc-99m標記肽3、肽4、肽5、肽6、肽7、肽8、肽9、肽12、肽13、肽14、肽15、肽16、肽17和肽18，耳靜脈給藥。給藥5分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時和22小時后，使用γ射線照相儀記錄影像。給藥5分鐘-5小時后的時間點為炎癥開始24-29小時的時期，對應(yīng)于急性期炎癥。22小時后的時間點為炎癥開始約46小時的時期，對應(yīng)于亞急性期炎癥。
(2)結(jié)果所得結(jié)果的示意圖如圖4、圖5、圖6、圖7、圖8、圖9、圖10、圖11、圖12、圖13、圖14和圖15所示。在圖像中定位目標區(qū)域，1000像素目標區(qū)域計數(shù)與整體計數(shù)的比率(％注射劑量(ID)/千像素)如表4所示。根據(jù)上述比值確定的，表示[炎癥]/[正常肌肉]的比值([A]/[M]的比值)如表5所示。
在現(xiàn)今已知的Tc-99m-肽12中，給藥2小時后(炎癥開始26小時后，急性期炎癥)[A]/[M]的比值為10.34±3.34(平均數(shù)±標準誤差)(n＝3)，22小時后(炎癥開始46小時后，亞急性期炎癥)[A]/[M]的比值為33.94±20.76(n＝3)，炎性區(qū)域的累積從給藥2小時后(炎癥開始26小時后)的1.66±0.63％ID/千像素減少到給藥22小時后(炎癥開始46小時后)的0.90±0.29％ID/千像素。
在本發(fā)明的Tc-99m-肽3中，給藥2小時后(炎癥開始26小時后)[A]/[M]的比值為6.55±2.06(n＝5)，給藥22小時后(炎癥開始46小時后)[A]/[M]的比值為54.16±32.86(n＝5)，炎性區(qū)域的累積從給藥2小時后(炎癥開始26小時后)的0.93±0.31％ID/千像素增加到給藥22小時后(炎癥開始46小時后)的3.70±2.67％ID/千像素。在本發(fā)明的Tc-99m-肽4中，給藥2小時后(炎癥開始26小時后)[A]/[M]的比值為6.75±2.71(n＝3)，22小時后(炎癥開始46小時后)[A]/[M]的比值為29.07±19.97(n＝3)，其值低于現(xiàn)在已知的Tc-99m-肽12的值，炎性區(qū)域的累積從給藥2小時后(炎癥開始26小時后)的1.09±0.22％ID/千像素增加到給藥22小時后(炎癥開始46小時后)的1.85±0.34％ID/千像素。在本發(fā)明的Tc-99m-肽6中，給藥2小時后(炎癥開始26小時后)[A]/[M]的比值為14.25±0.31(n＝3)，22小時后(炎癥開始46小時后)[A]/[M]的比值為43.84±12.58(n＝3)，炎性區(qū)域的累積從給藥2小時后(炎癥開始26小時后)的1.22±0.05％ID/千像素增加到給藥22小時后(炎癥開始46小時后)的1.77±0.07％ID/千像素。
通常，感染24小時后大部分炎性區(qū)域的浸潤白細胞主要由嗜中性粒細胞(占粒性白細胞大部分)組成，其后嗜中性粒細胞逐漸減少，大多數(shù)浸潤白細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘ň奘杉毎土馨图毎趦?nèi)的單核細胞。從臨床觀點出發(fā)，需要核醫(yī)學檢測的大部分炎癥，為亞急性期炎癥，呈現(xiàn)顯著的單核細胞和淋巴細胞浸潤。以上結(jié)果可以表明，本發(fā)明的肽，對診斷炎癥開始26小時后的急性期炎癥(給藥2小時后)和炎癥開始46小時后的亞急性期炎癥(給藥22小時后)，都非常有用。
表4.Tc-99m標記的肽在兔傳染病模型炎癥中的累積(％ID/千像素)(n＝3，Tc-99m-肽3n＝5，平均值±標準誤差)

表5.Tc-99m標記的肽在兔傳染病模型中的炎癥/肌肉的比值(n＝3，Tc-99m-肽3n＝5，平均值±標準誤差)

實施例5。
Tc-99m標記的肽3、肽4、肽6和肽12的藥物動力學(1)方法在正常大鼠中，檢測了實施例2中得到的4種Tc-99m標記化合物Tc-99m-肽3、Tc-99m-肽4、Tc-99m-肽6和Tc-99m-肽12的生物分布。生物分布試驗按照本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)方法進行。未禁食的SD(Sprague-Dawley)系大鼠(體重140-200g)用ravonal麻醉，尾靜脈給予各為3.0-3.7MBq的樣品。給藥5分鐘、30分鐘、60分鐘和180分鐘后，從大鼠腹主動脈放血。用NaI單信道分析儀測定各摘除器官與注射劑量的放射活性計數(shù)。測量各器官的重量以計算生物分布。各器官放射活性與注射劑量的比率，以每器官值(％ID/器官)或每克器官值(％ID/g器官)表示。
(2)結(jié)果結(jié)果如表6、表7、表8和表9所示。在尿和小腸中的時程變化如來自表6，表7，表8和表9結(jié)果的圖16和圖17所示。
根據(jù)表6、表7、表8、表9、圖16和圖17的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Tc-99m標記肽在正常大鼠中的生物分布彼此非常不同，取決于權(quán)利要求1描述的通式中的氨基酸殘基Z和W。即，常規(guī)的Tc-99m-肽12的代謝途徑可能主要通過肝膽途徑排出，因為同其它的肽相比，給藥5分鐘后其在肝臟有高累積，各時間點上在胃內(nèi)有高累積，各時間點上在小腸內(nèi)有高累積，180分鐘時高累積從腸轉(zhuǎn)至闌尾(圖17)。此外，由于在小腸內(nèi)的高累積，很難對腹部炎癥如炎癥性腸病進行顯像。
與之相反，本發(fā)明的肽中，Tc-99m標記的化合物肽3、肽4和肽6，其在權(quán)力要求1描述的通式中，T和U變?yōu)榛蚣尤胗H水性氨基酸，如帶電荷的氨基酸和酸性氨基酸，其生物分布不同于Tc-99m-肽12，并被促使由尿排出(圖16)。特別地，Tc-99m-肽6的趨向性非常顯著。這些特征對于腹部炎癥如炎癥性腸病的顯像相當重要。因此，這表明本發(fā)明的肽可有效地用于觀察腹部的白細胞浸潤區(qū)域，因為同傳統(tǒng)的已知肽12相比，其在腹部區(qū)域特別是小腸內(nèi)的分布較低。
表6.Tc-99m-肽3在正常大鼠中的生物分布上行％ID/器官；下行％ID/g(n＝3，平均值±標準誤差)

表7.Tc-99m-肽4在正常大鼠中的生物分布上行％ID/器官；下行％ID/g(n＝3，平均值±標準誤差)

表8.Tc-99m-肽6在正常大鼠中的生物分布上行％ID/器官；下行％ID/g(n＝3，平均值±標準誤差)

表9.Tc-99m-肽12在正常大鼠中的生物分布上行％ID/器官；下行％ID/g(n＝3，平均值±標準誤差)

實施例6在大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型中的生物分布及在慢性炎癥中的有效性
(1)方法炎癥模型的制備按照Anthony等的方法制備潰瘍性結(jié)腸炎的大鼠模型(Anthony等Int.J.Exp.Path.，76，215-224，1995)。2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)360mg溶于4ml超純水中，向其中加入3.2ml乙醇制備50.0mg/ml 46％的乙醇/生理鹽溶液。體重164-177g，雌性，7周齡，24小時前禁食，乙醚麻醉的SD品系大鼠(SpragueDawley，無特定病原體)，將管子經(jīng)肛門插入腸約7-8cm深，注入0.1ml空氣。接著注入0.2ml TNBS/46％乙醇/生理鹽水溶液，按摩并傾側(cè)體位2分鐘。5天后大鼠用于檢測。
Tc-99m-肽3、Tc-99m-肽4、Tc-99m-肽6和作為對照的現(xiàn)今已知的傳統(tǒng)Tc-99m-肽12，每只大鼠約7.4MBq，經(jīng)尾靜脈給藥。給藥5分鐘、30分鐘、60分鐘和180分鐘后，大鼠放血，使用NaI單信道分析儀測定每種器官的放射活性分布，以獲得％ID/每器官和％ID/克器官的值。有炎癥區(qū)域的直腸定為炎癥區(qū)域，根據(jù)％ID/克器官的值，得到[直腸(炎癥)]/[肌肉]的比值([A]/[M]的比值)和[直腸(炎癥)]/[血液]的比值([A]/[B]的比值)。
(2)結(jié)果結(jié)果如表10、表11、表12和表13所示。
Tc-99m-肽3顯示[A]/[M]的比值給藥5分鐘后為3.36±0.58，給藥180分鐘后為7.91±1.16。同非炎癥區(qū)域的肌肉相比，炎癥區(qū)域呈現(xiàn)高水平的放射活性以及時程依賴性的[A]/[M]比值增加趨勢。此外，給藥60分鐘及其后，[A]/[B]的比值超過1，給藥180分鐘后呈現(xiàn)為2.00±1.50，顯示出增加趨勢。這不可能由反映血流增加的非特異性累積所致，而被認為是由特異性的炎癥累積所致。
Tc-99m-肽4顯示給藥5分鐘后的[A]/[M]比值為4.37±0.68，給藥180分鐘后為9.29±2.82。同非炎癥區(qū)域肌肉相比，炎癥區(qū)域呈現(xiàn)高水平的放射活性和時程依賴性的[A]/[M]比值增加趨勢。此外，給藥60分鐘及其后，[A]/[B]的比值超過1，給藥180分鐘后呈現(xiàn)為1.51±0.41，顯示出增加趨勢。這不可能由反映血流增加的非特異性累積所致，而被認為是由特異性的炎癥累積所致。
Tc-99m-肽6顯示給藥5分鐘后[A]/[M]比值為4.41±0.97，給藥180分鐘后為16.50±11.08。同非炎癥區(qū)域肌肉相比，炎癥區(qū)域呈現(xiàn)高水平的放射活性和時程依賴性的[A]/[M]比值增加趨勢。此外，給藥30分鐘及其后，[A]/[B]的比值超過1，給藥180分鐘后呈現(xiàn)為2.74±1.72，顯示出增加趨勢。這不可能由反映血流增加的非特異性累積所致，而被認為是由特異性的炎癥累積所致。
Tc-99m-肽12顯示給藥5分鐘后[A]/[M]的比值為4.66±3.13，給藥180分鐘后為6.22±4.61。這顯示同本發(fā)明的肽相比，[A]/[M]的比值偏低。
雖然給藥60分鐘后[A]/[M]的比值呈現(xiàn)最大值為11.10±12.33，但其后降低。雖然給藥60分鐘后[A]/[B]的比值呈現(xiàn)為1.89±2.39，但其后降低，給藥180分鐘后為1.00±0.89。
根據(jù)本試驗，對于淋巴細胞和單核細胞高度浸潤的慢性炎性區(qū)域，本發(fā)明的肽在累積和保持方面優(yōu)于現(xiàn)今已知的肽12，并被證明對慢性炎癥如潰瘍性結(jié)腸炎有效。
表10.Tc-99m-肽3在大鼠IBD模型中的生物分布上行％ID/器官；下行％ID/g(n＝3，平均值±標準誤差)

表11.Tc-99m-肽4在大鼠IBD模型中的生物分布下行％ID/器官；下行％ID/g(n＝3，平均值±標準誤差)

表12.Tc-99m-肽6在大鼠IBD模型中的生物分布上行％ID/器官；下行％ID/g(n＝3，平均值±標準誤差)

表13.Tc-99m-肽12在大鼠IBD模型中的生物分布上行％ID/器官；下行％ID/g(n＝3，平均值±標準誤差)

實施例7Tc-99m標記的肽3和肽6在人血液中的分布(1)方法為確認本發(fā)明的肽在人體內(nèi)的臨床效果，使用人血液研究了本發(fā)明的兩種肽對白細胞的親合力。將實施例2中Tc-99m標記的肽3和肽6分離成未標記的肽和標記的肽，按與實施例2相同的HPLC條件，通過反相HPLC進行純化。按下列條件進行梯度洗脫20％→80％(0.1％TFA乙腈/0.1％TFA水)；0→20分鐘(純化后肽6的放射活性為111MBq/ml)。
制備傳統(tǒng)已知的肽Tc-99m-肽11和Tc-99m-肽12。肽11和肽12各溶于二甲基甲酰胺中，制備濃度為0.1mg/500μl的溶液。50μl的SnCl2/10mM鹽酸(5mg/10ml)溶液加入酒石酸/PBS溶液(5mg/200μl)中，向其中加入肽溶液。其后立即注入0.25μl99mTcO4-溶液(2738MBq/ml)，搖動數(shù)秒，于120℃反應(yīng)10分鐘進行標記。最終濃度約855.6MBq/125mg/ml。使用制備型HPLC純化和測定放射化學純度。在與實施例2相同的條件下進行分析，即梯度20％→50％(0.1％TFA乙腈/0.1％TFA水；0→20分鐘。純化后放射活性濃度為287-311MBq/ml。
隨后，根據(jù)實施例3描述方法制備Percoll密度梯度溶液。
從40歲或低于40歲的成年志愿者中采集20-30毫升血液。向其中加入Tc-99m標記的肽各30μl(111MBq/ml，1.8×10-11mol/mlTc-肽)，孵育30分鐘。小心地將2-3ml血樣在制備好的Percoll密度梯度溶液中分層。經(jīng)2000rpm(800×g)離心15分鐘后，冰凍試管，用切刀切下每一級分，然后使用Auto-Wellγ粒子計數(shù)器測定每一級分的放射活性，以確定Tc-99m標記的肽在血液組分中的放射活性分布。
(2)結(jié)果根據(jù)人血液學參數(shù)中，白細胞計數(shù)4100-6100個細胞/μl，參考文獻中認為受體FPR數(shù)目100,000-120,000/細胞，計算人血液中受體FPR的估計數(shù)目為0.68-1.2×10-12mol/ml，人血液中肽/受體的比率為0.03-0.01。顯示4種Tc-99m-肽和陰性對照(Tc-99m-葡庚糖酸)在人血液中分布的結(jié)果如圖18所示。顯示粒性白細胞級分放射活性占總白細胞數(shù)的放射活性的百分比，以及淋巴細胞和單核細胞級分放射活性占總白細胞數(shù)的放射活性的百分比的結(jié)果如表14所示。在Tc-99m-肽3、Tc-99m-肽11、Tc-99m-肽12中，n為1，在Tc-99m-肽6中，n為3。
孵育30分鐘后，Tc-99m-肽3在粒性白細胞級分中的放射活性分布為全血放射活性的21.91％，在淋巴細胞和單核細胞級分中的放射活性分布為全血放射活性的39.98％。粒性白細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的35.41％，淋巴細胞和單核細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的64.59％。此結(jié)果表明，在健康人血液中，本發(fā)明的Tc-99m-肽3在淋巴細胞和單核細胞中的分布遠遠超過傳統(tǒng)已知的Tc-99m-肽11和Tc-99m-肽12。
孵育30分鐘后，Tc-99m-肽6在粒性白細胞級分中的分布為全血放射活性的29.45％，在淋巴細胞和單核細胞級分中的分布為全血放射活性的6.59％。粒性白細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的81.94±8.67％，淋巴細胞和單核細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的18.07±8.67％。此結(jié)果表明，在健康人血液中，本發(fā)明的Tc-99m-肽6在淋巴細胞和單核細胞中的分布遠遠超過傳統(tǒng)已知的Tc-99m-肽11。
孵育30分鐘后，Tc-99m-葡庚糖酸在粒性白細胞級分中的放射活性分布為全血放射活性的1.11％，在淋巴細胞與單核細胞級分中的放射活性分布為全血放射活性的2.52％。在血漿級分中，其分布為95.39％。由于陰性對照不能結(jié)合白細胞，沒有計算其粒性白細胞級分占白細胞總數(shù)百分比，以及淋巴細胞和單核細胞級分占白細胞總數(shù)百分比。
在人血中，孵育30分鐘后，對照Tc-99m-肽11在粒性白細胞級分中的放射活性分布為全血放射活性的58.70％，Tc-99m-肽11在淋巴細胞和單核細胞級分中的放射活性分布為全血放射活性的8.02％。粒性白細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的87.98％，淋巴細胞和單核細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的12.03％。
在人血液中孵育30分鐘后，對照Tc-99m-肽12在粒性白細胞級分中的放射活性分布為全血放射活性的25.09％，Tc-99m-肽12在淋巴細胞和單核細胞級分中的放射活性分布為全血放射活性的13.77％。粒性白細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的64.57％，淋巴細胞和單核細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的35.43％。
以上結(jié)果表明，本發(fā)明的肽與陰性對照Tc-99m-葡庚糖酸和傳統(tǒng)已知的Tc-99m-肽11或Tc-99m-肽12相比，與淋巴細胞和單核細胞的結(jié)合比粒性白細胞更強。鑒于實施例4和實施例6的結(jié)果，同時證明本發(fā)明的肽對于淋巴細胞和單核細胞浸潤的慢性炎癥有效。
表14.Tc-99m標記的肽與人白細胞的結(jié)合率(n＝3，平均值±標準誤差)

實施例8Tc-99m標記的肽3和肽6在大鼠血液中的分布(1)方法炎癥模型的制備按照Anthony等的方法制備潰瘍性結(jié)腸炎的大鼠模型(Anthony等Int.J.Exp.Path.，76，215-224，1995)。2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)360mg溶于4ml超純水中，向其中加入3.2ml乙醇制備50.0mg/ml 46％的乙醇/生理鹽溶液。體重164-184g，雄性，7周齡，24小時前禁食，乙醚麻醉的SD大鼠(Sprague Dawley，無特定病原體)，將管子經(jīng)肛門插入腸約7-8cm深，注入0.1ml空氣。接著注入0.2ml TNBS/46％乙醇/生理鹽水溶液，按摩并傾側(cè)體位2分鐘。這些步驟重復3天。最終給藥4天后，大鼠供給實驗使用，采集其血液。2ml采集的血液于37℃溫水浴中溫育5分鐘。向每份樣品中加入經(jīng)HPLC純化的Tc-99m-肽3和Tc-99m-肽6(111MBq/ml，Tc-99-m肽1.8×10-11mol/ml)各3μl，孵育30分鐘。小心地將血樣在預(yù)先制備的Percoll密度梯度溶液中分層。分層的樣品在2000rpm(800×g)離心15分鐘。離心后冰凍試管，用切刀切下每一級分，然后使用Auto-Wellγ粒子計數(shù)器測定每一級分的放射活性，以確定Tc-99m-肽3和Tc-99m-肽6在每種血液組分中的放射活性分布。
(2)結(jié)果根據(jù)雌性大鼠的血液學參數(shù)，白細胞計數(shù)6600-12600細胞/μl，參考文獻報導的受體FPR數(shù)目為100,000-120,000/細胞，計算大鼠血液中受體FPR的估計數(shù)目為1.1-2.5×10-12mol/ml，大鼠肽/受體的比率為0.02-0.05。顯示每種血液組分放射活性在全血放射活性中所占百分比的結(jié)果如圖19所示。顯示粒性白細胞級分放射活性占白細胞總數(shù)放射活性的百分比，以及淋巴細胞和單核細胞級分放射活性占白細胞總數(shù)的放射活性的百分比的結(jié)果如表15所示。
孵育30分鐘后，由TNBS所致患潰瘍性結(jié)腸炎的大鼠血液中Tc-99m-肽3在粒性白細胞級分的放射活性分布為全血放射活性的7.82％，Tc-99m-肽3在淋巴細胞和單核細胞級分的放射活性分布為全血放射活性的10.00％。粒性白細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的43.69％，淋巴細胞和單核細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的56.31％。孵育30分鐘后，Tc-99m-肽6在粒性白細胞級分中的放射活性分布為全血放射活性的18.34％，Tc-99m-肽6在淋巴細胞和單核細胞級分中的放射活性分布為全血放射活性的6.57％。粒性白細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的74.08％，淋巴細胞和單核細胞級分放射活性為全體白細胞放射活性的25.92％。
根據(jù)這些結(jié)果，很明顯在潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠血液中，作為本發(fā)明一部分的Tc-99m-肽3和Tc-99m-肽6，大量分布在淋巴細胞和單核細胞級分內(nèi)。
以上可證明本發(fā)明的肽，對診斷經(jīng)常有淋巴細胞和單核細胞浸潤的慢性炎癥有效。
表15.Tc-99m標記的肽與大鼠白細胞的結(jié)合率(對總白細胞的結(jié)合率(％)n＝2，平均值±標準差

實施例9Tc-99m標記的化合物肽3和肽6在大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型中的成像，及其對慢性期炎癥的有效性(1)方法炎癥模型的制備按照Anthony等的方法制備潰瘍性結(jié)腸炎的大鼠模型(Anthony等Int.J.Exp.Path.，76，215-224，1995)。2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)360mg溶于4ml超純水中，向其中加入3.2ml乙醇制備50.0mg/ml 46％的乙醇/生理鹽溶液。體重164-184g，雌性，7周齡，24小時前禁食，乙醚麻醉的SD大鼠(Sprague Dawley，無特定病原體的)，將管子經(jīng)肛門插入腸約7-8cm深，注入0.1ml空氣。接著注入0.2ml TNBS/46％乙醇/生理鹽水溶液，按摩并傾側(cè)其體位2分鐘。這些步驟重復3天。最后給藥4天后，大鼠供給實驗使用。實施例2中獲得的Tc-99m-肽3或Tc-99m-肽6，每只大鼠約37MBq放射活性，經(jīng)尾靜脈給藥。5分鐘、30分鐘、60分鐘和120分鐘后，用γ射線照相儀記錄影像。作為對照，用于診斷人潰瘍性結(jié)腸炎的Tc-99m標記的白細胞，按照Roca等的方法制備(M.Roca等。Eur.J.Nucl.Med.25，797-799，1998)，并經(jīng)大鼠尾靜脈給予每只大鼠約37MBq的放射活性，5分鐘、30分鐘、60分鐘和120分鐘以后，用γ射線照相儀記錄圖像。Tc-99m標記的白細胞制備成含所有種類的白細胞，如粒性白細胞、淋巴細胞和單核細胞。成像結(jié)束后，即給藥130分鐘后，將大鼠從腹主動脈放血，摘除各個器官。測量摘除器官的重量和放射活性，以計算每克組織放射活性(％ID/g)。再使用算出的數(shù)值，確定[炎癥]/[肌肉]的比值([A]/[M]的比值)、[炎癥]/[血液]的比值([A]/[BL]的比值)、[炎癥]/[骨]的比值([A]/[BO]的比值)、[炎癥]/[闌尾]的比值([A]/[AP]的比值)、[炎癥]/[結(jié)腸]的比值([A]/[C]的比值)及[炎癥]/[直腸]的比值([A]/[R]的比值)。
(2)結(jié)果所得結(jié)果的示意圖如圖20，圖21和圖22所示。目標區(qū)域定位于圖像中，1像素目標區(qū)域的計數(shù)與整體計數(shù)的比率(％注射劑量(ID)/像素)如表16所示。根據(jù)上述比值確定的，表明[炎癥]/[腹背部]的比值([A]/[BG]的比值)如表17所示。此外，從摘除物的結(jié)果獲得的炎癥％ID/g值、[A]/[M]的比值、[A]/[BL]的比值、[A]/[BO]的比值、[A]/[AP]的比值、[A]/[C]的比值和[A]/[R]的比值如表18和圖23所示。結(jié)果，在對照Tc-99m標記的白細胞中，30分鐘后的％ID/像素為0.11±0.025(平均數(shù)±標準偏差)(n＝5)，[A]/[BG]的比值為3.21±1.96(n＝5)。另外，給藥130分鐘后，放血和摘除得到的每克炎癥組織的放射活性(％ID/g)為0.71±0.33，[A]/[BO]的比值為2.08±1.37，[A]/[BL]的比值為0.25±0.17。這些結(jié)果表明其在炎癥中的分布比在血液中多。
與之相反，本發(fā)明的Tc-99m-肽3，30分鐘后的給藥劑量％/像素的值為0.043±0.015(n＝5)，[A]/[BG]的比值為2.23±0.77(n＝5)。另外，給藥130分鐘后放血和摘除得到的每克炎癥組織的放射活性(％ID/g)為0.13±0.12，[A]/BO]的比值為3.40±2.78，[A]/[BL]的比值為2.33±2.22。這些結(jié)果表明其在炎癥中的放射活性分布比在血液中多。而且，在Tc-99m肽6中，30分鐘后的％ID/像素為0.093±0.048(n＝5)，[A]/[BG]的比值為2.15±0.53(n＝5)。另外，給藥130分鐘后，放血和摘除得到的每克炎癥組織的放射活性(％ID/g)為0.55±0.51。[A]/[BO]的比值為4.44±2.74，[A]/[BL]的比值為2.88±1.61。這些結(jié)果顯示與肽3一樣，其在炎癥中的放射活性分布比在血液中多。以上結(jié)果可表明，本發(fā)明Tc-99m標記的肽，對于描繪血流量大、易受血液影響的器官，如肝臟、脾臟、心臟、腎臟、腦和骨中的炎癥具有優(yōu)越性。更具體而言，在[A]/[M]比值、[A]/[BL]比值、[A]/[BO]比值、[A/[AP]比值、[A]/[C]比值和[A]/[R]比值中，肽6的數(shù)值優(yōu)于對照Tc-99m標記的白細胞，結(jié)果，可證明本發(fā)明的肽對于描繪慢性炎癥，潰瘍性結(jié)腸炎是極好的。
表16.有或沒有FMLP抑制時，Tc-99m標記的肽在大鼠結(jié)腸炎模型炎癥中的累積(％ID/像素)(n＝5，平均值±標準誤差)

表17.有或沒有FMLP抑制時，Tc-99m標記的肽和Tc-99m-白細胞在大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型中 炎癥/腹背部的比值(n＝5，平均值±標準誤差)

表18.Tc-99m標記的肽和Tc-99m-白細胞在大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型摘除物中的分析結(jié)果(n＝5，平均值±標準誤差)

實施例10Tc-99m-肽6和Tc-99m-肽14在大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型中的放射自顯影，及其對慢性炎癥上的有效性(1)方法按照Anthony等的方法制備潰瘍性結(jié)腸炎的大鼠模型(Anthony等Int.J.Exp.Path.，76，215-224，1995)。2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)360mg溶于4ml超純水中，向其中加入3.2ml乙醇制備50.0mg/ml 46％的乙醇/生理鹽溶液。體重164-184g，雌性，7周齡，雄性，24小時前禁食，乙醚麻醉的SD大鼠(SpragueDawley，無特定病原體)，將管子經(jīng)肛門插入腸約7-8cm深，注入0.1ml空氣。接著注入0.2ml TNBS/46％乙醇/生理鹽水溶液，按摩并并傾側(cè)體位2分鐘。這些步驟重復3天。最后給藥4天后，大鼠供給實驗使用。實施例2中獲得的Tc-99m-肽6或Tc-99m-肽14，每只大鼠約74MBq放射活性，經(jīng)尾靜脈給藥，120分鐘后放血并處死大鼠。立即摘除大腸并除去腸內(nèi)容物后，經(jīng)肉眼觀測判斷為炎癥區(qū)域的部位，包埋于介質(zhì)中以制備冰凍切片。其后立即將包埋樣品與載玻片一起浸入液氮中數(shù)十秒，冰凍含有大腸切除部位的介質(zhì)。使樣品在冰箱中于-20℃直立數(shù)十秒后，使用恒冷切片機制備冰凍切片。制備好切片后，將切片與顯像底片接觸，放射自顯影(Fuji Photo Film Co.Ltd.)12小時-19小時。隨后，使用圖像分析儀BAS 2500(Fuji Photo Film Co.Ltd.)對放射活性分布進行造影。另外，以同樣方式制備的冰凍切片，經(jīng)抗粒性白細胞抗體和抗單核細胞抗體免疫組織化學染色，以確認組織中的粒性白細胞和單核細胞浸潤。
(2)結(jié)果所得結(jié)果的典型圖如圖24、圖25和圖26所示。在放射自顯影所得圖像上定位目標區(qū)域，計算目標區(qū)域的每像素計數(shù)，并確定[炎癥]/[正常組織]的比值([A]/[N]的比值)。結(jié)果如圖27所示。
在感染大鼠的直腸區(qū)，在整個腸道環(huán)形面積形成2-4厘米的炎癥區(qū)，觀測了所有大鼠的炎癥性區(qū)域。作為免疫組織化學染色結(jié)果，在炎癥性區(qū)域觀察到顯著的粒性白細胞和單核細胞浸潤，且觀察到粒性白細胞和單核細胞被分配在相應(yīng)于炎癥的區(qū)域。
免疫染色顯示，與Tc-99m-標記白細胞相似，Tc-99m-肽6和Tc-99m-肽14的放射活性分布，均與粒性白細胞和單核細胞分布一致。比較來自相同切片的對照Tc-99m-標記白細胞、Tc-99m-肽6和Tc-99m-肽14的[A]/[N]的比值，Tc-99m-肽6和Tc-99m-肽14顯示高于Tc-99m-標記白細胞的[A]/[N]比值。結(jié)果同時證實本發(fā)明的肽在慢性炎癥如潰瘍性結(jié)腸炎中具有優(yōu)勢。
實施例11結(jié)合重組人受體的肽3、肽4、肽6、肽8、肽9、肽16、肽17和肽18的活性抑制試驗(1)方法使用來源于CHO細胞的重組受體FPR(6.24pmol/ml，50mM Tris-HCl，pH7.4，10％甘油，1％牛血清白蛋白，BioSignal Packard Inc.，Amersham Bioscience s)和[3H]-FMLP(fMLF，9.25MBq/2.88-6.25nmol，Dailchi Pure Chemicals Co.Ltd.)進行實驗。向一定量的受體FPR(0.05nM，200μl/孔)中加入各肽，濃度為10-4M-10-14M后，加入一定量的[3H]-FMLP(0.3nM，25μl/孔)。反應(yīng)完成后，使用GF/C過濾器分離未結(jié)合受體FPR的[3H]-FMLP與結(jié)合受體FPR的[3H]-FMLP。通過測定結(jié)合受體FPR的[3H]-FMLP放射活性，確定結(jié)合受體FPR的[3H]-FMLP的數(shù)量。使用分析軟件″Xlfit ver3.0.3(CTC Laboratory Systems K.K.)″確定抑制50％[3H]-FMLP(IC50)結(jié)合的各肽的濃度，再由[3H]-FMLP的Kd值確定抑制常數(shù)(Ki)。重復試驗三次，每次試驗重復分析三次以確定平均值。
(2)結(jié)果結(jié)果如圖28所示。計算出的IC50值和Ki值如表19所示。計算出對照FMLP的Ki值為(2.33±0.45)×10e-10M。每種肽的Ki值計算如下肽3Ki＝(6.50±1.84)×10e-9M； 肽4Ki＝(8.36±3.74)×10e-10M；肽6Ki＝(2.83±1.07)×10e-10M；肽8Ki＝(2.33±0.91)×10e-9M；和肽9Ki＝(1.28±0.69)×10e-10M。肽16，其甲?；梢阴；?，肽17，其甲酰基由氨基甲?；?，肽18，其甲酰基由甲基代替，Ki值分別為(3.74±3.53)×10e-6M，(4.24±3.60)×10e-7M和(3.83±1.12)×10e-5M。結(jié)果可證明本發(fā)明的肽與受體FPR具有親合性，且可用于診斷表達該受體FPR的白細胞所介導的炎癥。
表19.各肽的50％抑制濃度(IC50)和抑制常數(shù)(Ki)(n＝9，平均值±標準誤差)

實施例12在兔感染性疾病模型中Tc-99m-肽6的抑制及結(jié)合白細胞的成像確認(1)方法活菌計數(shù)大約108金黃葡萄球菌懸浮于1ml生理鹽水中。100μl懸液經(jīng)肌肉注射入體重約2kg的新西蘭白(NZW)品系兔的右側(cè)腓腸內(nèi)。24小時后，呈現(xiàn)明顯炎癥的兔模型用戊巴比妥麻醉。實施例2得到的Tc-99m-肽6，耳靜脈給藥，給予約74MBq的放射活性。5分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、和5小時后，通過使用γ射線照相儀記錄圖像。通過溶解1毫克的FMLP于5％DMSO/生理鹽中制備FMLP溶液，其大約相當于估計的受體最大量0.1nmol/kg的10,000倍。在為確認FMLP抑制而建立的FMLP預(yù)給藥組中，耳靜脈給予FMLP溶液，5分鐘后給予Tc-99m-肽6。與未給予FMLP組相似，在5分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時和5小時后，使用γ射線照相儀記錄圖像。
(2)結(jié)果所得結(jié)果的典型圖如圖29和圖30所示。在圖像上定位目標區(qū)域，1000像素目標區(qū)域的計數(shù)與整體計數(shù)的比率(％ID/千像素)如表20所示。根據(jù)上述比值確定的、表明[炎癥]/[正常肌肉]的比值([A]/[M]比值)如表21所示。結(jié)果，在沒有FMLP抑制的Tc-99m-肽6中，給藥2小時后炎癥區(qū)域的累積為1.77±0.25％ID/千像素(平均數(shù)±標準誤差)(n＝3)，給藥5小時后增加到2.62±0.25％ID/千像素。[A]/[M]的比值從給藥2小時后的12.78±6.14增加到給藥5小時后的21.39±5.39。與之相反，在用FMLP抑制的Tc-99m-肽6中，給藥2小時后，[A]/[M]的比值為3.93±0.60，低于沒有FMLP抑制的情況，給藥5小時后[A]/[M]的比值增加至9.05±3.10。然而，炎癥區(qū)域的累積從給藥2小時后的0.41±0.10％ID/千像素減少到給藥5小時后的0.30±0.04％ID/千像素。
這些結(jié)果表明，證明本發(fā)明的肽6，可通過與存在于白細胞中的受體FPR結(jié)合來描繪炎癥區(qū)域。認為本發(fā)明的肽的累積，可指示有白細胞浸潤的炎癥的發(fā)生。
表 20.有或沒有FMLP抑制時，Tc-99m-肽6在兔感染性疾病模型炎癥中的累積(％ID/千像素)(n＝3，平均值±標準誤差)

表21.有或沒有FMLP抑制時，Tc-99m-肽6在兔感染性疾病模型中炎癥/肌肉的比值(n＝3，平均值±標準誤差)

產(chǎn)業(yè)實用性根據(jù)本發(fā)明可提供，在體內(nèi)和體外均呈現(xiàn)與所有種類的白細胞，即嗜中性白細胞、單核細胞和淋巴細胞特異性結(jié)合活性，可用放射性金屬或順磁性金屬標記的化合物，以及含有該標記化合物作為有效成份，可用于SPECT成像診斷、PET成像診斷、MRI成像診斷的藥用組合物，而且通過對伴有個體免疫反應(yīng)的劇烈白細胞浸潤部位的成像可進行成像診斷。
序列表<110>Nihon Medi-Physics Corporation Limited<120>白細胞結(jié)合化合物和含有標記的白細胞結(jié)合化合物的藥用組合物<130>W1229-00<160>13<210>1<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>甲?；?amp;lt;222>1<200>
<221>酰胺化<222>6<223>白細胞結(jié)合肽<400>1Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Cys Gly Asn1 5 10<210>2<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>甲?；?amp;lt;222>1<200>
<221>酰胺化<222>6<223>白細胞結(jié)合肽<400>2Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Cys Asp Asp15 10<210>3<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>甲?；?amp;lt;222>1<200>
<221>酰胺化<222>6<223>白細胞結(jié)合肽<400>3Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Cys Gly Asp1 5 10<210>4<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>甲?；?amp;lt;222>1<200>
<221>酰胺化
<222>6<223>白細胞結(jié)合肽<400>4Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Arg Asp Cys Asp Asp1 5 10<210>5<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>甲?；?amp;lt;222>1<200>
<221>酰胺化<222>6<200>
<221>阻斷的<222>7<223>白細胞結(jié)合肽<400>5Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser1 5<210>6<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>甲?；?amp;lt;222>1<200>
<221>酰胺化<222>6<220>
<221>阻斷的<222>11<223>白細胞結(jié)合肽<400>6Nle Leu Phe Lys Ser Ser Asn Arg Cys Asp Asp1 5 10<210>7<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>甲?；?amp;lt;222>1<200>
<221>酰胺化<222>6<220>
<221>阻斷的<222>8<223>白細胞結(jié)合肽<400>7Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Arg1 5<210>8<211>7<212>PRT
<213>人工序列<220>
<221>甲?；?amp;lt;222>1<200>
<221>酰胺化<222>6<220>
<221>阻斷的<222>7<223>白細胞結(jié)合肽<400>8Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser1 5<210>9<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>甲?；?amp;lt;222>1<200>
<221>酰胺化<222>6<200>
<221>阻斷的<222>9<223>白細胞結(jié)合肽<400>9Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Arg Asp1 5<210>10<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>甲?；?amp;lt;222>1<200>
<221>酰胺化<222>6<220>
<221>阻斷的<222>9<223>白細胞結(jié)合肽<400>10Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Ser Asn1 5<210>11<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>乙?；?amp;lt;222>1<200>
<221>酰胺化<222>6<223>白細胞結(jié)合肽
<400>11Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Arg Asp Cys Asp Asp1 5 10<210>12<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>阻斷的<222>1<200>
<221>酰胺化<222>6<223>白細胞結(jié)合肽<400>12Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Arg Asp Cys Asp Asp1 5 10<210>13<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>甲基化<222>1<200>
<221>酰胺化<222>6<223>白細胞結(jié)合肽<400>13Nle Leu Phe Nle Tyr Lys Ser Arg Asp Cys Asp Asp1 5 10
權(quán)利要求
1.結(jié)合白細胞的化合物，以通式(1)代表Z-Y-Leu-Phe-(X)n-Lys(NH2)m-ε(-R-(T)1-U) (1)(其中，在通式(1)中，Z代表氨基基團的保護基團；Y代表Met或Nle；在(X)n中，X代表由一個或多個氨基酸和/或合成有機化合物組成的間隔物，n代表1或0；在(NH2)m中，NH2代表酰胺基，作為Lys α位羧基的保護基團，m代表1或0；在ε(-R-(T)1-U)中，R代表通過酰胺鍵與Lys的ε-氨基結(jié)合的Ser或Thr，T代表由一個或多個氨基酸和/或合成有機化合物組成的間隔物，l代表1或0，U代表能用金屬標記的基團；條件是所述的X和T可能彼此相同或不同。)
2.根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)合白細胞的化合物，其中通式(1)中的U是由-Cys-A1-A2(A1和A2分別為除Cys和Pro以外的氨基酸)代表的肽組成，能用金屬標記的基團。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的結(jié)合白細胞的化合物，其中通式(1)中的U為選自能用金屬標記的，有8-20個碳原子的含氮環(huán)狀化合物、有8-20個碳原子的含氮環(huán)狀羧酸化合物、有8-20個碳原子的含氮環(huán)狀羧酸化合物的衍生物和有4-10個碳原子的亞烷基胺羧酸的基團。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的結(jié)合白細胞的化合物，其中以通式(1)代表的所述化合物選自甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-Cys-Gly-Asn)；甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-Cys-Asp-Asp)；甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-Cys-Gly-Asp)；甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)；甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷-1，4，8，11-四乙酸)；甲酰-Nle-Leu-Phe-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Ser-Asn-D-Arg-Cys-Asp-Asp)；甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-二亞乙基三胺五乙酸)；甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷丁酸)；甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷丁酸)；甲酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Ser-Asn-1，4，8，11-四氮雜環(huán)十四烷丁酸)；乙酰-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)；氨甲?；?Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)；及甲基-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys(NH2)-ε-(-Ser-D-Arg-Asp-Cys-Asp-Asp)。
5.一種藥用組合物，其含有用放射性金屬或順磁性金屬標記的權(quán)利要求1-4的任一項所述的結(jié)合白細胞化合物作為有效成份。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的藥用組合物，其中該放射性金屬是Tc-99m，In-111或Ga-67。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的藥用組合物，其中所述組合物用于SPECT成像診斷，用于伴有個體免疫反應(yīng)的劇烈白細胞浸潤部位的成像。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的藥用組合物，其中放射性金屬為Cu-64或Ga-68。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的藥用組合物，其中所述組合物用于PET成像診斷，用于伴有個體免疫反應(yīng)的劇烈白細胞浸潤部位的成像。
10.根據(jù)權(quán)利要求5的藥用組合物，其中順磁性金屬為Gd、Fe、Mn或Cu。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的藥用組合物，其中所述組合物用于MRI成像診斷，用于伴有個體免疫反應(yīng)的劇烈白細胞浸潤部位的成像。
12.根據(jù)權(quán)利要求5的藥用組合物，其中放射性金屬為Y-90、Sn-117m、Sm-153、Re-186或Re-188。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的藥用組合物，其中組合物用于放射治療。
全文摘要
一種結(jié)合白細胞的化合物，包含Met或Nle－Leu－Phe作為白細胞甲?；氖荏w(FPR)結(jié)合位點、結(jié)合部分包含Ser或Thr，可提高與全體白細胞中的單核細胞和淋巴細胞的結(jié)合率、可用放射性金屬或順磁性金屬標記的基團、以及聯(lián)結(jié)它們的間隔物，其在體內(nèi)和體外均呈現(xiàn)與所有白細胞即嗜中性白細胞，單核細胞和淋巴細胞特異性結(jié)合的性質(zhì)，可用放射性金屬或順磁性金屬標記。由于這些特點，該化合物對于SPECT成像診斷，PET成像診斷，MRI成像診斷等等非常有用，其中成像在伴有個體免疫反應(yīng)的劇烈白細胞浸潤部位進行。
文檔編號A61K38/08GK1684973SQ0382290
公開日2005年10月19日 申請日期2003年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月27日
發(fā)明者關(guān)育也, 川口敬義, 白神宜史 申請人:日本醫(yī)事物理股份有限公司