專利名稱：治療缺血性心臟病及充血性心衰竭的人類g蛋白偶聯(lián)受體及其調(diào)節(jié)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒別候選化合物是否為孤兒G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)調(diào)節(jié)物的方法。優(yōu)選人類GPCR。在一些實(shí)施方案中，GPCR由心肌細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，GPCR與Gi偶聯(lián)，且降低細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度。在一些實(shí)施方案中，GPCR的過度表達(dá)會(huì)促進(jìn)心肌細(xì)胞的存活。在一些實(shí)施方案中，GPCR的過度表達(dá)可挽救心肌細(xì)胞免于缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在一些實(shí)施方案方案中，具有充血性心衰竭的個(gè)體體內(nèi)的GPCR被下調(diào)。本發(fā)明的激動(dòng)劑可有效作為治療缺血性心臟病，包含心肌梗塞、心肌梗塞后重造，以及充血性心衰竭的治療劑。
背景技術(shù)：
A.缺血性心臟病及充血性心衰竭充血性心衰竭(CHF)影響約5百萬(wàn)美國(guó)人，且每年有50萬(wàn)個(gè)新病例被診斷出來(lái)。CHF的臨床癥狀為心臟病使心臟輸出量降低，靜脈壓升高，且伴隨著分子異常進(jìn)而導(dǎo)致心臟衰竭持續(xù)惡化以及未成熟心肌細(xì)胞(肌細(xì)胞)的死亡(源于；心衰竭病理生理學(xué)，分子生物，及臨床管理(Heart FailurePathophysiology，Molecular Biology，andClinical Management)，Katz，AM，Lippincott Williams and Wilkins，2000)。由于成人心臟中已喪失的細(xì)胞無(wú)法更替，因此肌細(xì)胞(心肌細(xì)胞)死亡為心衰竭自然史中的關(guān)鍵因素。因?yàn)橐坏┏霈F(xiàn)心衰竭癥狀，5年存活率低于50％，所以任何未考慮加速心肌死亡的分子過程的心衰竭定義皆忽略了這種癥狀的主要臨床特征。因此，許多研究小組近來(lái)的研究著重于調(diào)節(jié)心肌死亡與存活的分子機(jī)制及信號(hào)路徑。細(xì)胞培養(yǎng)及小動(dòng)物已經(jīng)實(shí)驗(yàn)清楚的證實(shí)心肌細(xì)胞上的G蛋白偶聯(lián)受體為心臟收縮功能的重要調(diào)節(jié)物，并且也參與心肌細(xì)胞死亡與存活的調(diào)節(jié)[參見，Adams及Brown的，Oncogene(2001)201626-1634]。然而，目前臨床上并沒有可用來(lái)抑制心肌細(xì)胞死亡或直接活化存活路徑的藥物。最近所公開的小鼠及大鼠的試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，存活路徑的活化[Lee等人，Endocrinology(1999)1404831-40]或心肌細(xì)胞死亡路徑的抑制劑[Laugwitz等人，Hum Gene Ther(2001)122051-63]可顯著提高心臟功能及動(dòng)物的存活率。因此其清楚顯示，相似的治療策略極可能用于治療人類的心衰竭。
B.G蛋白偶聯(lián)受體雖然人體內(nèi)存在多種受體，但是最多且與治療有關(guān)的受體就是以G偶聯(lián)受體(GPCR)為代表。據(jù)估計(jì)存于人類基因組中的3萬(wàn)至4萬(wàn)個(gè)基因中，估計(jì)約有2％用來(lái)編碼GPCRs。其內(nèi)源性配體已被確定的受體，包含GPCRs被稱為“已知”受體，然而其內(nèi)源性配體尚未確定的受體，則被稱為“孤兒”受體。
GPCRs是藥品開發(fā)的重要領(lǐng)域100種已知GPCRs中約有20種，將近60％已開發(fā)成處方藥劑。例如，在1999年，前100品牌的處方藥劑中有下列藥物與GPCRs有關(guān)(括號(hào)內(nèi)表示該藥劑主要治療的疾病和/或失調(diào)癥)Claritin(過敏) Prozac(憂郁) Vasotec(高血壓)Paxil(憂郁)Zoloft(憂郁) Zyprexa(精神失常)Cozaar(高血壓) Imitrex(偏頭痛) Zantac(逆流癥)Propulsid(逆流癥) Risperdal(精神分裂癥)Serevent(哮喘)Pepcid(逆流癥) Gaster(潰瘍) Atrovent(支氣管痙攣)Effexor(憂郁) Depakote(癲癇) Cardura(前列腺增生)Allegra(過敏) Lupron(前列腺癌) Zoladex(前列腺癌)
Diprivan(麻木) BuSpar(焦慮) Ventolin(支氣管痙攣)Hytrin(高血壓) Wellbutrin(憂郁) Zyrtec(鼻炎)Plavix(心肌梗塞/中風(fēng)) Toprol-XL(高血壓)Tenormin(心絞痛)Xalatan(青光眼)Singulair(哮喘) Diovan(高血壓)Harnal(前列腺增生)(Med Ad News 1999 Data)GPCRs共享一共同的結(jié)構(gòu)基元，其具有7個(gè)介于22至24個(gè)疏水性氨基酸的序列，形成7個(gè)α螺旋，其中每一螺旋都跨膜(每一跨膜螺旋由編號(hào)定義，即跨膜螺旋-1(TM-1)，跨膜螺旋-2(TM-2)等)。跨膜螺旋由細(xì)胞膜外部或“胞外”側(cè)上的跨膜螺旋-2與跨膜螺旋-3，跨膜螺旋-4與跨膜螺旋-5，以及跨膜螺旋-6與跨膜螺旋-7之間的氨基酸鏈連接[其分別稱為“胞外”區(qū)域1、2和3(EC-1、EC-2與EC-3)]。跨膜螺旋由位于細(xì)胞膜內(nèi)部或“胞內(nèi)”側(cè)的跨膜螺旋-1與跨膜螺旋-2，跨膜螺旋-3與跨膜螺旋-4，跨膜螺旋-5與跨膜螺旋-6之間的氨基酸鏈連接(其分別稱為“胞內(nèi)”區(qū)域1、2和3(IC-1、IC-2與IC-3))。受體的“羧基”(“C”)末端位于細(xì)胞內(nèi)的胞內(nèi)空間，而受體的“氨基”(“N”)末端位于細(xì)胞外的胞外空間。
一般而言，當(dāng)配體與受體結(jié)合(一般稱為受體的“活化”)時(shí)，受體的構(gòu)造會(huì)改變，進(jìn)而促進(jìn)胞內(nèi)區(qū)與胞內(nèi)“G蛋白”間的偶聯(lián)。已有報(bào)告GPCRs對(duì)G蛋白而言是“混雜的”，亦即GPCR可與一個(gè)以上的G蛋白相互作用。參見Kenakin，T.，43生命科學(xué)(Life Science)1095(1988)。雖然目前存在其它的G蛋白，Gq，Gs，Gi，Gz及Go是已經(jīng)得到鑒定的G蛋白。配體活化的GPCR與G蛋白的偶聯(lián)，啟始一信號(hào)級(jí)聯(lián)過程(即所謂的“信號(hào)傳導(dǎo)“)。在正常情況下，信號(hào)傳導(dǎo)最后將導(dǎo)致細(xì)胞活化或細(xì)胞抑制。雖然不希望被理論束縛，但是IC-3環(huán)與受體羧基末端被認(rèn)為會(huì)與G蛋白相互作用。
在生理?xiàng)l件下，GPCRs以介于兩種不同構(gòu)造“不活化”狀態(tài)及“活化”狀態(tài)的平衡形式存在于細(xì)胞膜中。不活化狀態(tài)下的受體無(wú)法連接胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)路徑激活導(dǎo)致生物反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)。將受體的構(gòu)造改變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，可使其與傳導(dǎo)路徑連接(通過G蛋白)并產(chǎn)生生物反應(yīng)。
受體可由配體或如藥劑的化合物穩(wěn)定在活化狀態(tài)。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，包含但不限于受體氨基酸序列的修飾可提供有別于配體或藥物的手段來(lái)促進(jìn)并穩(wěn)定受體于活化狀態(tài)。通過刺激配體與受體的結(jié)合效果，這些方法可有效地將受體穩(wěn)定于活化狀態(tài)。這種不依賴于配體的穩(wěn)定方式被稱作“組成型受體活化”。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及孤兒GPCR，此處命名為RUP41。RUP41與GPR22(GenBankAccession No.U66581)有關(guān)。
RUP41由心肌細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)。人類RUP41的表達(dá)譜可由Affmetrix基因芯片進(jìn)行確定并通過多組織點(diǎn)印跡及Northern印跡加以驗(yàn)證。由基因組DNA擴(kuò)增的大鼠同源RUP41的部分編碼序列已被鑒定并且公開。大鼠RUP41聚核苷酸序列的這個(gè)片段與所公開的小鼠RUP41聚核苷酸序列(XM_137998)具有97％的同一性。本發(fā)明公開的RUP41與Gi偶聯(lián)，引起腺苷酸環(huán)化酶的抑制且抑制cAMP的產(chǎn)生。本發(fā)明進(jìn)一步公開了在局部缺血及肥大性心臟的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，?nèi)源性RUP41含量的降低。本發(fā)明還公開了RUP41的過量表達(dá)可促進(jìn)心肌細(xì)胞的存活。本發(fā)明公開的RUP41的特性顯示RUP41的激動(dòng)劑可用于治療與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)的心臟病。
本發(fā)明的一部分為鑒定候選化合物是否為RUP41的調(diào)節(jié)物的方法。在其它一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)RUP41活性的方法，包含RUP41與RUP41的調(diào)節(jié)物接觸的步驟。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物降低了細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)物為激動(dòng)劑。
在一些實(shí)施方案中，上述接觸發(fā)生于體外。在一些實(shí)施方案中，RUP41調(diào)節(jié)物在確定調(diào)節(jié)物是否有效抑制心肌細(xì)胞凋亡的方法中，被導(dǎo)入心肌細(xì)胞凋亡的細(xì)胞培養(yǎng)模型中。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物降低了細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)物為激動(dòng)劑。
在一些實(shí)施方案中，上述接觸發(fā)生于體內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，RUP41調(diào)節(jié)物在確定上述調(diào)節(jié)物是否有效降低與上述缺血性心臟病及心衰竭相關(guān)的病理學(xué)特征的方法中被施用給小鼠及大鼠缺血性心臟病及心衰竭的手術(shù)模型。在其它實(shí)施方案中，RUP41調(diào)節(jié)物在確定上述調(diào)節(jié)物是否有利于心肌重建或功能的方法中被施用給心肌梗塞試驗(yàn)動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物降低了細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)物為激動(dòng)劑。
RUP41的調(diào)節(jié)物可用作治療缺血性心臟病，包含心肌梗塞，心肌梗塞后重建，及充血性心衰竭的治療劑。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物降低了細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)物為激動(dòng)劑。
人RUP41第一對(duì)等位基因的聚核苷酸序列及編碼的多肽序列提供于序列表中分別為SEQ ID NO1及SEQ ID NO2(SEQ ID NO2多肽編碼區(qū)對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸237至1538)。人RUP41多肽第二對(duì)等位基因的氨基酸序列(GenBankAccession No.AAB63815)，包含在SEQ ID NO2氨基酸425位半胱氨酸取代賴氨酸的單一取代，為SEQ ID NO3(對(duì)應(yīng)的編碼序列為GenBankAccession No.AC002381的79,559至80,860核苷酸)。小鼠RUP41的聚核苷酸序列及編碼的多肽序列分別為SEQ ID NO4及SEQ ID NO5。包含部分大鼠RUP41編碼序列的聚核苷酸序列公開為SEQ ID NO6。
在第一方面，本發(fā)明描述了一種鑒定候選化合物是否為RUP41GPCR的調(diào)節(jié)物的方法，上述受體包含選自下列的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其片段或變體，其中受體偶聯(lián)G蛋白，包含步驟如下(a’)將候選化合物與受體接觸；(b’)確定受體功能是否被調(diào)控，其中受體功能的改變顯示候選化合物為上述GPCR的調(diào)節(jié)物。
本發(fā)明也涉及鑒定候選化合物是否為保護(hù)心臟的調(diào)節(jié)物的方法，包含下列步驟(a)將候選化合物與GPCR接觸，上述受體包含一種選自下列的多肽(i)SEQ ID NO2的多肽；(ii)SEQ ID NO3的多肽；以及(iii)SEQ ID NO5的多肽；或其片段或變體，其中受體偶聯(lián)G蛋白；以及(b)確定受體功能是否被調(diào)控；其中受體功能的改變表示候選化合物為保護(hù)心臟的調(diào)節(jié)物。
在一些實(shí)施方案中，上述受體包含選自SEQ ID NO2的氨基酸2至433及SEQ ID NO3的氨基酸2至433的多肽序列。
在一些實(shí)施方案中，RUP41 GPCR為內(nèi)源性的。
RUP41 GPCR的等位基因變體也在本發(fā)明的范圍中。
SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41多肽的哺乳動(dòng)物直向同源物也在本發(fā)明的范圍中。在一些實(shí)施方案中，上述哺乳動(dòng)物同源基因包含小鼠RUP41，大鼠RUP41，豬RUP41及非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物RUP41。
與SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的RUP41多肽具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的變體多肽也在本發(fā)明的范圍中。尤其是在一些實(shí)施方案中，利用局部比對(duì)基本查詢工具(“BLAST”)評(píng)價(jià)多肽序列的同源性，上述BLAST在本領(lǐng)域是公知的的技術(shù)[參見，如Karlin及Altschul，Proc Natl Acad Sci USA(1990)872264-8；Altschul等人，J MolBiol(1990)215403-410；Altschul等人，Nature Genetics(1993)3266-272；及Altschul等人，Nucleic Acids Res(1997)253389-3402；其公開在此處引入作為參考]。上述變體多肽可包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失，插入，及取代。選自SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的RUP41多肽的組成性活化形式的變體多肽也在本發(fā)明的范圍中。在一些實(shí)施方案中，上述RUP41多肽的組成性活化形式為SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的多肽，其中在SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的312位的氨基酸苯丙氨酸被賴氨酸取代。
在一些實(shí)施方案中，上述RUP41 GPCR是重組體。
在一些實(shí)施方案中，上述RUP41 GPCR包括一個(gè)或者多個(gè)附加表位。在一些實(shí)施方案中，上述附加表位為血凝素(HA)附加表位。在一些實(shí)施方案中，上述附加表位為FLAG附加表位。在一些實(shí)施方案中，上述附加表位為V5附加表位。提供上述HA，F(xiàn)LAG或者V5附加表位的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(例如，Clontech，Palo Alto，CA和Invitrogen，Carlsbad，CA)。
在一些實(shí)施方案中，上述G蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。在一些實(shí)施方案中，上述G蛋白為Gi。
在一些實(shí)施方案中，通過利用黑色素細(xì)胞分析進(jìn)行上述測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，色素聚集增加。在一些實(shí)施方案中，色素?cái)U(kuò)散減少。
在一些實(shí)施方案中，通過測(cè)定選自環(huán)AMP(cAMP)，環(huán)GMP(cGMP)，肌醇三磷酸(IP3)，二酰甘油(DAG)和Ca2+的第二信使的含量進(jìn)行上述測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，上述第二信使為cAMP。在一些實(shí)施方案中，cAMP的含量減少。在一些實(shí)施方案中，在用CART-TSH共轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞中進(jìn)行上述測(cè)定。
在一些實(shí)施方案中，用含有上述GPCR的膜進(jìn)行上述測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，上述膜通過用Brinkman PolytronTM勻漿化處理細(xì)胞進(jìn)行制備。在一些實(shí)施方案中，上述膜制備物通過用上述組織勻漿器(polytron)每次10-20秒勻漿化3次進(jìn)行制備。
在一些實(shí)施方案中，通過測(cè)定由減少細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量介導(dǎo)的活性進(jìn)行上述測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，上述活性是促進(jìn)細(xì)胞存活。在一些實(shí)施方案中，上述細(xì)胞是新生大鼠心室肌細(xì)胞(NRVM)。在一些實(shí)施方案中，上述活性是從低氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡拯救細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中上述細(xì)胞為NRVM。
在一些實(shí)施方案中，上述G蛋白是嵌合Gq(del)Giα亞基并且通過測(cè)定IP3或者Ca2+進(jìn)行上述測(cè)定。
在一些實(shí)施方案中，通過測(cè)定與包含上述GPCR的膜結(jié)合的GTPγS進(jìn)行上述測(cè)定。在另外一些實(shí)施方案中，上述GTPγS用[35S]標(biāo)記。
在一些實(shí)施方案中，在GPCR的已知配體存在的條件下進(jìn)行上述接觸。在一些實(shí)施方案中，上述已知配體是GPCR的激動(dòng)劑。
在一些實(shí)施方案中，上述方法還包括將由候選化合物對(duì)受體的調(diào)節(jié)與由受體與受體的已知調(diào)節(jié)物接觸對(duì)受體的第二種調(diào)節(jié)相比較。
第二方面，本發(fā)明描述了RUP41 GPCR的調(diào)節(jié)物或者根據(jù)本發(fā)明的第一方面的方法鑒定的保護(hù)心臟的調(diào)節(jié)物。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物選自激動(dòng)劑，部分激動(dòng)劑，反激動(dòng)劑及拮抗劑。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至100μM之間值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至10μM之間值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM，及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物降低了細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為激動(dòng)劑。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為選擇性的。
在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)物是口服可生物利用的。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物是抗體或者包含至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域的其衍生物。
在第三方面，本發(fā)明描述了調(diào)節(jié)RUP41 GPCR活性的方法，上述受體包括選自下列的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其片段或變體，其中受體偶聯(lián)G蛋白，包含將受體與本發(fā)明第二方面的調(diào)節(jié)物接觸的步驟。
在一些實(shí)施方案中，上述受體包含選自SEQ ID NO2的2-433位氨基酸以及SEQ ID NO3的2-433位氨基酸的上述多肽片段。
RUP41 GPCR的等位基因變體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41多肽的哺乳動(dòng)物直向同源物也在本發(fā)明的范圍中。在一些實(shí)施方案中，上述哺乳動(dòng)物直向同源物包含小鼠RUP41，大鼠RUP41，豬RUP41及非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物RUP41。
與SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的RUP41多肽具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的變體多肽也在本發(fā)明的范圍中。尤其是在一些實(shí)施方案中，利用局部比對(duì)基本查詢工具(“BLAST”)評(píng)價(jià)多肽序列的同源性，上述BLAST在本領(lǐng)域是公知的的技術(shù)[參見，如Karlin及Altschul，Proc Natl Acad Sci USA(1990)872264-8；Altschul等人，J MolBiol(1990)215403-410；Altschul等人，Nature Genetics(1993)3266-272；及Altschul等人，Nucleic Acids Res(1997)253389-3402；其公開在此處全部引入作為參考]。上述變體多肽可包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失，插入，及取代。SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的RUP41多肽的組成性活化形式的變體多肽也在本發(fā)明的范圍中。在一些實(shí)施方案中，上述RUP41多肽的組成性活化形式為SEQ ID NO2或SEQ IDNO3的多肽，其中在SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的312位氨基酸的苯丙氨酸被賴氨酸取代。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物選自激動(dòng)劑，部分激動(dòng)劑，反激動(dòng)劑及拮抗劑。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至100μM之間值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至10μM之間值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物降低了細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為選擇性的。
在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)物是口服可生物利用的。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為激動(dòng)劑。
在一些實(shí)施方案中，上述接觸包含將調(diào)節(jié)物施用于包含受體的膜。
在一些實(shí)施方案中，上述接觸包含將調(diào)節(jié)物施用于包含受體的細(xì)胞或者組織。
在一些實(shí)施方案中，上述接觸包含將調(diào)節(jié)物施用于包含受體的個(gè)體。
在一些實(shí)施方案中，上述個(gè)體為哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，上述哺乳動(dòng)物為馬，牛，羊，豬，貓，狗，兔子，小鼠，大鼠，非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物或人。最好是小鼠，大鼠或人。最優(yōu)選是人。
在一些實(shí)施方案中，上述方法被用于鑒定調(diào)節(jié)物是否具有預(yù)防或治療心血管失調(diào)的療效，上述心血管失調(diào)包含(a)心臟輸出減少；以及(b)靜脈壓增加；包含下列步驟(a’)將調(diào)節(jié)物施用于心肌細(xì)胞凋亡的細(xì)胞培養(yǎng)模型中；以及(b’)確定上述凋亡是否被抑制，其中上述確定通過選自如下的測(cè)定進(jìn)行(i)測(cè)量細(xì)胞數(shù)目；(ii)測(cè)量DNA片段；以及(iii)測(cè)量核染色體凝聚；其中對(duì)抑制凋亡的確定顯示調(diào)節(jié)物具有上述療效。
在一些實(shí)施方案中，利用DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)染色劑進(jìn)行核染色體凝聚的測(cè)量。
在一些實(shí)施方案中，上述方法被用來(lái)鑒定調(diào)節(jié)物是否具有預(yù)防或治療缺血性心臟病的療效，上述缺血性心臟病包含(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭；包含如下步驟(a’)將上述調(diào)節(jié)物施用于心肌細(xì)胞凋亡的細(xì)胞培養(yǎng)模型中；以及(b’)確定上述凋亡是否被抑制，其中上述確定通過如下測(cè)定進(jìn)行(i)測(cè)量細(xì)胞數(shù)目；(ii)測(cè)量DNA分裂；以及(iii)測(cè)量核染色體凝聚。
在一些實(shí)施方案中，用DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)染料測(cè)量核染色體凝聚。
在一些實(shí)施方案中，上述方法被用來(lái)鑒定調(diào)節(jié)物是否具有預(yù)防或治療心血管失調(diào)的療效，上述心血管失調(diào)包含(a)心臟輸出減少；以及(b)靜脈壓增加；包含如下步驟(a’)將調(diào)節(jié)物施用于或者不施用于心血管失調(diào)的小鼠或大鼠模型；以及(b’)確定施用調(diào)節(jié)物是否具有下列效果(i)降低心臟肥大；(ii)增加心臟射血量；(iii)降低心室體積；以及(iv)減少心肌細(xì)胞凋亡；其中上述效果的確定顯示上述調(diào)節(jié)物具有上述療效。
在一些實(shí)施方案中，上述方法被用來(lái)鑒定調(diào)節(jié)物是否具有預(yù)防或治療缺血性心臟病的療效，上述缺血性心臟病包含(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭；包含如下步驟
(a’)將調(diào)節(jié)物施用或者不施用于缺血性心臟病的小鼠或大鼠模型；以及(b’)確定施用調(diào)節(jié)物是否具有選自如下的效果(i)降低心臟肥大；(ii)增加心臟射血量；(iii)降低心室體積；以及(iv)減少心肌細(xì)胞凋亡。
其中上述效果的確定顯示上述調(diào)節(jié)物具有上述療效。
在一些實(shí)施方案中，上述個(gè)體需要預(yù)防或治療心血管失調(diào)，上述心血管失調(diào)選自(a)心臟輸出減少；以及(b)靜脈壓增加。
在一些實(shí)施方案中，上述個(gè)體需要預(yù)防或治療缺血性心臟病，選自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。
在一些實(shí)施方案中，上述個(gè)體需要改變心血管功能，選自(a)減小心臟肥大；(b)增加心臟射血量；(c)降低心室體積；以及(d)減少心肌細(xì)胞凋亡。
在一些實(shí)施方案中，上述個(gè)體為遺傳傾向有心血管失調(diào)的小鼠或大鼠，上述心血管失調(diào)選自(a)心臟輸出降低；以及(b)靜脈壓增加；
在一些實(shí)施方案中，上述方法被用來(lái)鑒定調(diào)節(jié)物是否具有預(yù)防或治療心血管失調(diào)的療效，上述心血管失調(diào)包含(a)降低心臟輸出；以及(b)增加靜脈壓；包含如下步驟(a’)將調(diào)節(jié)物施用或者不施用于遺傳傾向有心血管失調(diào)的小鼠或大鼠模型；以及(b’)確定施用調(diào)節(jié)物是否具有選自如下的效果(i)降低心臟肥大；(ii)增加心臟射血量；(iii)降低心室體積；以及(iv)降低心肌細(xì)胞凋亡；其中上述效果的確定顯示上述調(diào)節(jié)物具有上述療效。
在一些實(shí)施方案中，上述個(gè)體為遺傳傾向有缺血性心臟病的小鼠或大鼠，上述缺血性心臟病選自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。
在一些實(shí)施方案中，上述方法被用來(lái)鑒定調(diào)節(jié)物是否具有預(yù)防或治療缺血性心臟病的療效，上述缺血性心臟病包含(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭；包含如下步驟(a’)將調(diào)節(jié)物施用或者不施用于遺傳傾向有缺血性心臟病的上述小鼠或大鼠；以及(b’)確定施用調(diào)節(jié)物是否具有選自如下的效果(i)降低心臟肥大；
(ii)增加心臟射血量；(iii)降低心室體積；以及(iv)降低心肌細(xì)胞凋亡；其中上述效果的確定顯示上述調(diào)節(jié)物具有上述療效。
第四方面，本發(fā)明描述了需要改變心血管功能的個(gè)體體內(nèi)改變上述功能的方法，包含將第二方面上述的治療有效量調(diào)節(jié)物與RUP41GPCR接觸，上述受體包含選自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其等位基因變體。
在一些實(shí)施方案中，上述心肌功能的改變選自(a)降低心臟肥大；(b)增加心臟射血量；(c)降低心室體積；以及(d)減少心肌細(xì)胞凋亡；在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物選自激動(dòng)劑，部分激動(dòng)劑，反激動(dòng)劑及拮抗劑。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至100μM之間值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至10μM之間值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物降低了細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為選擇性的。
在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)物是口服可生物利用的。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為激動(dòng)劑。
在一些實(shí)施方案中，上述接觸通過口服施用上述調(diào)節(jié)物進(jìn)行。
在一些實(shí)施方案中，上述個(gè)體為哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，上述哺乳動(dòng)物為馬，牛，羊，豬，貓，狗，兔子，小鼠，大鼠，非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物或人。最好是小鼠，大鼠或人。最優(yōu)選是人。
第五方面，本發(fā)明描述了需要預(yù)防或者治療心血管失調(diào)的個(gè)體預(yù)防或者治療心血管失調(diào)的方法，包含將第二方面上述的治療有效量調(diào)節(jié)物與RUP41GPCR接觸，上述受體包含選自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其等位基因變體。
在一些實(shí)施方案中，上述心血管失調(diào)選自(a)心臟輸出降低；以及(b)靜脈壓增加。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物選自激動(dòng)劑，部分激動(dòng)劑，反激動(dòng)劑及拮抗劑。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至100μM之間值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至10μM之間值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物降低了細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為選擇性的。
在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)物是口服可生物利用的。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為激動(dòng)劑。
在一些實(shí)施方案中，上述接觸通過口服施用上述調(diào)節(jié)物進(jìn)行。
在一些實(shí)施方案中，上述個(gè)體為哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，上述哺乳動(dòng)物為馬，牛，羊，豬，貓，狗，兔子，小鼠，大鼠，非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物或人。最好是小鼠，大鼠或人。最優(yōu)選是人。
第六方面，本發(fā)明描述了需要預(yù)防或者治療缺血性心臟病的個(gè)體預(yù)防或者治療缺血性心臟病的方法，包含將第二方面上述的治療有效量調(diào)節(jié)物與RUP41GPCR接觸，上述受體包含選自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；
(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其等位基因變體。
在一些實(shí)施方案中，上述缺血性心臟病選自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物選自激動(dòng)劑，部分激動(dòng)劑，反激動(dòng)劑及拮抗劑。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至100μM之間值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至10μM之間值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物降低了細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為選擇性的。
在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)物是口服可生物利用的。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為激動(dòng)劑。
在一些實(shí)施方案中，上述接觸通過口服施用上述調(diào)節(jié)物進(jìn)行。
在一些實(shí)施方案中，上述個(gè)體為哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，上述哺乳動(dòng)物為馬，牛，羊，豬，貓，狗，兔子，小鼠，大鼠，非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物或人。最好是小鼠，大鼠或人。最優(yōu)選是人。
第七方面，本發(fā)明描述了制備組合物的方法，包含鑒定RUP41GPCR的調(diào)節(jié)物，然后將載體與調(diào)節(jié)物混合，其中調(diào)節(jié)物可由第一方面的方法鑒定。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物選自激動(dòng)劑，部分激動(dòng)劑，反激動(dòng)劑及拮抗劑。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至100μM之間值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至10μM之間值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物降低了細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為選擇性的。
在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)物是口服可生物利用的。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為激動(dòng)劑。
在一些實(shí)施方案中，可由第一方面的方法鑒定的上述調(diào)節(jié)物由第一方面的方法鑒定。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為第二方面的調(diào)節(jié)物。
第八方面，本發(fā)明描述了一種藥學(xué)及生理學(xué)用的組合物，主要由第二方面的調(diào)節(jié)物組成或者包括第二方面的調(diào)節(jié)物。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物選自激動(dòng)劑，部分激動(dòng)劑，反激動(dòng)劑及拮抗劑。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至100μM之間值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至10μM之間值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物降低了細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為選擇性的。
在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)物是口服可生物利用的。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為激動(dòng)劑。
第九方面，本發(fā)明描述了一種改變心血管功能的方法，包含給需要上述改變心血管功能的個(gè)體提供或者施用第八方面的上述藥學(xué)或者生理學(xué)可接受的組合物，上述心血管功能的改變選自(a)降低心臟肥大；(b)增加心臟射血量；(c)降低心室體積；以及(d)減少心肌細(xì)胞凋亡。
在一些實(shí)施方案中，上述個(gè)體為哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，上述哺乳動(dòng)物為馬，牛，羊，豬，貓，狗，兔子，小鼠，大鼠，非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物或人。最好是小鼠，大鼠或人。最優(yōu)選是人。
第十方面，本發(fā)明描述了一種治療心血管失調(diào)的方法，包含給需要上述治療的個(gè)體提供或者施用第八方面的上述藥學(xué)或者生理學(xué)可接受的組合物，上述心血管失調(diào)選自(a)心臟輸出降低；以及(b)靜脈壓增加。
在一些實(shí)施方案中，上述個(gè)體為哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，上述哺乳動(dòng)物為馬，牛，羊，豬，貓，狗，兔子，小鼠，大鼠，非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物或人。最好是小鼠，大鼠或人。最優(yōu)選是人。
第十一方面，本發(fā)明描述了一種治療缺血性心臟病的方法，包含給需要上述治療的個(gè)體提供或者施用第八方面的上述藥學(xué)或者生理學(xué)可接受的組合物，上述缺血性心臟病選自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭；在一些實(shí)施方案中，上述個(gè)體為哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，上述哺乳動(dòng)物為馬，牛，羊，豬，貓，狗，兔子，小鼠，大鼠，非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物或人。最好是小鼠，大鼠或人。最優(yōu)選是人。
第十二方面，本發(fā)明描述了利用第二方面的調(diào)節(jié)物制備用于治療個(gè)體心血管失調(diào)的藥物的方法。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物選自激動(dòng)劑，部分激動(dòng)劑，反激動(dòng)劑及拮抗劑。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至100μM之間值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至10μM之間值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物降低了細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為選擇性的。
在一些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)物是口服可生物利用的。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為激動(dòng)劑。
在一些實(shí)施方案中，上述接觸通過口服施用上述調(diào)節(jié)物進(jìn)行。
在一些實(shí)施方案中，上述心血管失調(diào)選自(a)心臟輸出降低；以及(b)靜脈壓增加。
在一些實(shí)施方案中，上述個(gè)體為哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，上述哺乳動(dòng)物為馬，牛，羊，豬，貓，狗，兔子，小鼠，大鼠，非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物或人。最好是小鼠，大鼠或人。最優(yōu)選是人。
第十三方面，本發(fā)明描述了利用第二方面的調(diào)節(jié)物制備用于治療個(gè)體缺血性心臟病的藥物的方法。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物選自激動(dòng)劑，部分激動(dòng)劑，反激動(dòng)劑及拮抗劑。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至100μM之間值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至10μM之間值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物降低了細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為選擇性的。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物是口服可生物利用的。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為激動(dòng)劑。
在一些實(shí)施方案中，上述接觸通過口服施用上述調(diào)節(jié)物進(jìn)行。
在一些實(shí)施方案中，上述缺血性心臟病選自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。
在一些實(shí)施方案中，上述個(gè)體為哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，上述哺乳動(dòng)物為馬，牛，羊，豬，貓，狗，兔子，小鼠，大鼠，非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物或人。最好是小鼠，大鼠或人。最優(yōu)選是人。
第十四方面，本發(fā)明描述了制備基因敲除小鼠的方法，其中上述基因敲除小鼠有患心血管失調(diào)的傾向，上述心血管失調(diào)選自(a)降低心臟輸出；以及(b)增加靜脈壓；包含基因敲除編碼SEQ ID NO5多肽的基因的步驟。
在一些實(shí)施方案中，上述基因敲除為心肌選擇性的。
第十五方面，本發(fā)明描述了制備基因敲除小鼠的方法，其中上述基因敲除小鼠有患缺血性心臟病的傾向，上述缺血性心臟病選自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；及(c)充血性心衰竭；包含基因敲除編碼SEQ ID NO5多肽的基因的步驟。
在一些實(shí)施方案中，上述基因敲除為心肌選擇性的。
第十六方面，本發(fā)明描述了第十四或者第十五方面的基因敲除小鼠。
第十七方面，本發(fā)明描述了利用第十六方面的基因敲除小鼠鑒定候選化合物是否具有預(yù)防或治療心血管失調(diào)的療效，上述心血管失調(diào)包含(a)降低心臟輸出；以及(b)增加靜脈壓；包含如下步驟(a’)將化合物施用或者不施用小鼠；以及(b’)確定施用調(diào)節(jié)物是否具有選自如下的效果(i)降低心臟肥大；(ii)增加心臟射血量；(iii)降低心室體積；以及(iv)減少心肌細(xì)胞凋亡；其中上述效果的確定顯示上述調(diào)節(jié)物具有上述療效。
第十八方面，本發(fā)明描述了利用第十六方面的基因敲除小鼠鑒定候選化合物是否具有預(yù)防或者治療缺血性心臟病的療效，上述缺血性心臟病選自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。
包含如下步驟(a’)將化合物施用或者不施用于小鼠；以及(b’)確定施用調(diào)節(jié)物是否具有選自如下的效果(i)降低心臟肥大；(ii)增加心臟射血量；(iii)降低心室體積；以及
(iv)降低心肌細(xì)胞凋亡；其中上述效果的確定顯示上述調(diào)節(jié)物具有上述療效。第十九方面，本發(fā)明描述了制備基因敲除大鼠的方法，其中上述基因敲除大鼠傾向有心臟失調(diào)，選自(a)降低心臟輸出；以及(b)增加靜脈壓；包含基因敲除在高度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO6的多核苷酸雜交的基因的步驟。
在一些實(shí)施方案中，上述基因敲除為心肌選擇性的。
第二十方面，本發(fā)明描述了制備基因敲除大鼠的方法，其中上述基因敲除大鼠有患缺血性心臟病的傾向，上述缺血性心臟病選自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；及(c)充血性心衰竭；包含基因敲除在高度嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO6的多核苷酸雜交的基因的步驟。
在一些實(shí)施方案中，上述基因敲除為心肌選擇性的。
第二十一方面，本發(fā)明描述了第十九或者第二十方面的基因敲除大鼠。
第二十二方面，本發(fā)明描述了利用第二十一方面的基因敲除大鼠鑒定候選化合物是否具有預(yù)防或治療心血管失調(diào)的療效，上述心血管失調(diào)包含(a)降低心臟輸出；以及(b)增加靜脈壓；包含如下步驟
(a’)將化合物施用或者不施用于大鼠；以及(b’)確定施用調(diào)節(jié)物是否具有選自如下的效果(i)降低心臟肥大；(ii)增加心臟射血量；(iii)降低心室體積；以及(iv)減少心肌細(xì)胞凋亡；其中上述效果的確定顯示上述調(diào)節(jié)物具有上述療效。
第二十三方面，本發(fā)明描述了利用第二十一方面的基因敲除大鼠鑒定候選化合物是否具有預(yù)防或者治療缺血性心臟病的療效，上述缺血性心臟病選自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。
包含如下步驟(a’)將化合物施用或者不施用于大鼠；以及(b’)確定施用調(diào)節(jié)物是否具有選自如下的效果(i)降低心臟肥大；(ii)增加心臟射血量；(iii)降低心室體積；以及(iv)降低心肌細(xì)胞凋亡；其中上述效果的確定顯示上述調(diào)節(jié)物具有上述療效。
第二十四方面，本發(fā)明描述了分離的大鼠RUP41多核苷酸，選自(a)包含緊鄰跨越SEQ ID NO6的至少75核苷酸的多核苷酸；(b)包含緊鄰跨越SEQ ID NO6的至少150核苷酸的多核苷酸；(c)包含緊鄰跨越SEQ ID NO6的至少250核苷酸的多核苷酸；(d)包含緊鄰跨越SEQ ID NO6的至少350核苷酸的多核苷酸；及
(e)包含緊鄰跨越SEQ ID NO6的至少500核苷酸的多核苷酸；在一些實(shí)施方案中，緊鄰跨越不包含SEQ ID NO6的第514位核苷酸。
在一些實(shí)施方案中，上述分離的大鼠RUP41多核苷酸包含，編碼與人類SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的RUP41 GPCR直向同源的內(nèi)源性大鼠RUP41 GPCR的核苷酸序列，主要由其組成，或者由其組成。
與上述(a)到(e)任一項(xiàng)的RUP41多核苷酸具有至少60％，70％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的變體多核苷酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，利用局部比對(duì)基本查詢工具(“BLAST”)評(píng)價(jià)多核苷酸序列的同源性，上述BLAST在本領(lǐng)域是公知的的技術(shù)[參見，如Karlin及Altschul，Proc Natl Acad Sci USA(1990)872264-8；Altschul等人，J Mol Biol(1990)215403-410；Altschul等人，Nature Genetics(1993)3266-272；及Altschul等人，Nucleic Acids Res(1997)253389-3402；其公開在此處全部引入作為參考]。上述變體多核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失，插入，及取代。一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明描述了上述分離的多核苷酸的互補(bǔ)多核苷酸。
第二十五方面，發(fā)明描述了一種重組載體，上述載體包含第二十四方面的分離的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，上述重組載體為表達(dá)載體。在一些實(shí)施方案中，上述表達(dá)載體是真核表達(dá)載體。適合的表達(dá)載體對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是很顯而易見的。
在一些實(shí)施方案中，上述重組載體被用于瞬間或者穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方法中。在一些實(shí)施方案中，上述重組載體被用于感染方法中。
在一些實(shí)施方案中，上述重組載體是用于使RUP41基因失活方法中的靶載體。
在一些實(shí)施方案中，上述重組載體是被分離的載體。
第二十六方面，發(fā)明描述了包含第二十五方面的重組載體的原核或者真核宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為原核的，且用上述重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為真核的，且用上述重組載體瞬間轉(zhuǎn)化。在其它一些實(shí)施方案中，上述宿主細(xì)胞為真核的，且用上述重組載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)移。
在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞，優(yōu)選為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，且更優(yōu)選地選自293，293T，CHO及COS-7細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞，更優(yōu)選地為黑色素細(xì)胞。其它適合的宿主細(xì)胞對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞，或胚胎干細(xì)胞細(xì)胞，且上述重組載體被用于使RUP41基因失活的方法中。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為哺乳動(dòng)物胚胎體細(xì)胞，且上述重組載體被用于使RUP41基因失活的方法中。
其它實(shí)施方案包含一種原核或真核宿主細(xì)胞與第二十四觀點(diǎn)多肽再結(jié)合。
在一些實(shí)施方案中，重組載體為被分離的。
第二十七方面，本發(fā)明描述了包含組成性活性G蛋白偶聯(lián)受體和G蛋白的GPCR融合蛋白構(gòu)建物，上述受體包含選自如下的RUP40多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；
或其片段或者變體。
在一些實(shí)施方案中，上述受體包含選自SEQ ID NO2的氨基酸2至433及SEQ ID NO3的氨基酸2至433的多肽序列。
RUP41 GPCR的等位基因變體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41多肽的哺乳直向同源物也在本發(fā)明考慮的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，上述哺乳動(dòng)物直向同源物包含小鼠RUP41，大鼠RUP41，豬RUP41及非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物RUP41。
與SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的RUP41多肽具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的變體多肽也在本發(fā)明考慮的范圍內(nèi)。尤其是在一些實(shí)施方案中，利用局部比對(duì)基本查詢工具(“BLAST”)評(píng)價(jià)多肽序列的同源性，上述BLAST在本領(lǐng)域是公知的技術(shù)[參見，如Karlin及Altschul，Proc Natl Acad Sci USA(1990)872264-8；Altschul等人，J MolBiol(1990)215403-410；Altschul等人，Nature Genetics(1993)3266-272；及Altschul等人，Nucleic Acids Res(1997)253389-3402；其公開在此處全部引入作為參考]。上述變體多肽可包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失，插入，及取代。SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的RUP41多肽的組成性活化形式的變體多肽也在本發(fā)明考慮的范圍內(nèi)。第二十八方面，本發(fā)明描述了鑒定候選化合物是否為RUP 41 GPCR配體的方法，上述受體包含選自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其片段或者變體，包含如下步驟(a’)在上述候選化合物存在或不存在下將上述受體與任選標(biāo)記的已知接觸；(b’)確定已知上述已知配體與受體間的復(fù)合物；以及(c’)確定在候選化合物存在的條件下上述復(fù)合物是否比不存在候選化合物的條件下形成的少；其中確定顯示候選化合物為上述受體的配體。
在一些實(shí)施方案中，上述受體包含選自SEQ ID NO2的氨基酸2至433及SEQ ID NO3的氨基酸2至433的上述多肽片段。
RUP41 GPCR的等位基因變體也在本發(fā)明考慮的范圍中。
SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41多肽的哺乳動(dòng)物直向同源物也在本發(fā)明考慮的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，上述哺乳動(dòng)物直向同源物包含小鼠RUP41，大鼠RUP41，豬RUP41及非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物RUP41。
與SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的RUP41多肽具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的變體多肽也在本發(fā)明考慮的范圍內(nèi)。尤其是在一些實(shí)施方案中，利用局部比對(duì)基本查詢工具(“BLAST”)評(píng)價(jià)多肽序列的同源性，上述BLAST在本領(lǐng)域是公知的技術(shù)[參見，如Karlin及Altschul，Proc Natl Acad Sci USA(1990)872264-8；Altschul等人，J MolBiol(1990)215403-410；Altschul等人，Nature Genetics(1993)3266-272；及Altschul等人，Nucleic Acids Res(1997)253389-3402；其公開在此處全部引入作為參考]。上述變體多肽可包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失，插入，及取代。SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的RUP41多肽的組成性活化形式的變體多肽也在本發(fā)明考慮的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，RUP41多肽的組成性活化形式為SEQ ID NO2或SEQ IDNO3的多肽，其中在SEQ ID NO2或SEQ ID NO3氨基酸312位的苯丙氨酸被賴氨酸取代。
在一些實(shí)施方案中，受體的上述已知配體為第二方面的調(diào)節(jié)物。
在一些實(shí)施方案中，上述已知的配體包含選自如下的標(biāo)記(a)放射性同位素；(b)酶；以及(c)螢光物質(zhì)。
在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述標(biāo)記為放射性同位素。在一些實(shí)施方案中，上述放射性同位素為3H。
第二十九方面，本發(fā)明描述了放射顯影的方法，包含給需要上述放射顯影的個(gè)體提供或施用放射性標(biāo)記的化合物，其中上述化合物選自第二方面的調(diào)節(jié)物以及第二十八方面的配體。
在一些實(shí)施方案中，上述個(gè)體為哺乳類動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，上述哺乳動(dòng)物為馬，牛，羊，豬，貓，狗，兔子，小鼠，大鼠，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物或人。更優(yōu)選是小鼠，大鼠或人。最優(yōu)選是人。
第三十方面，本發(fā)明描述了人類RUP41 GPCR的非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，上述非人類哺乳動(dòng)物為小鼠，大鼠或豬。
在一些實(shí)施方案中，上述人類RUP41 GPCR包含選自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO2的多肽，其中在SEQ ID NO2的312位的苯丙氨酸被賴氨酸取代；(c)SEQ ID NO3的多肽；以及(d)SEQ ID NO3的多肽，其中在SEQ ID NO3的312位上的苯丙氨酸被賴氨酸取代。
RUP41 GPCR的等位基因變體也在本發(fā)明考慮的范圍內(nèi)。
在一些實(shí)施方案中，上述人類RUP41的轉(zhuǎn)基因表達(dá)是心肌細(xì)胞選擇性的。
第三十一方面，本發(fā)明使用第三十方面的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動(dòng)物鑒定本發(fā)明的化合物是否具有保護(hù)心臟的療效。
在一些實(shí)施方案中，上述非人類哺乳動(dòng)物為小鼠，大鼠或豬。
上述化合物可通過下述方法評(píng)價(jià)保護(hù)心臟的療效將上述化合物施用于上述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動(dòng)物并確定上述施用是否引起實(shí)施例18的體內(nèi)大鼠模型或者其小鼠或者豬類似物的體內(nèi)模型相對(duì)于只施用介質(zhì)的上述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動(dòng)物IS/AAR的降低。
在一些實(shí)施方案中，上述化合物可以通過將上述化合物施用于上述轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動(dòng)物并且確定上述施用是否引起下述效果評(píng)價(jià)保護(hù)心臟的療效(a)降低心臟肥大；(b)增加心臟射血量；(c)降低心室體積；以及(d)減少心肌細(xì)胞凋亡；其中上述效果的確定顯示化合物具有上述療效。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的上述化合物為第二方面的調(diào)節(jié)物。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物選自激動(dòng)劑，部分激動(dòng)劑，反激動(dòng)劑及拮抗劑。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至100μM之間值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至10μM之間值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物降低了細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為選擇性的。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物是口服可生物利用的。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為激動(dòng)劑。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的上述化合物是第三十方面的配體。
第三十二方面，本發(fā)明描述了制備RUP41 GPCR的調(diào)節(jié)物的方法，包含如下步驟(a)鑒定權(quán)利要求1或2的方法的上述調(diào)節(jié)物；以及(b)合成(a)中鑒定的調(diào)節(jié)物。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物選自激動(dòng)劑，部分激動(dòng)劑，反激動(dòng)劑及拮抗劑。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至100μM之間值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至10μM之間值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物降低了細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為選擇性的。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物是口服可生物利用的。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為激動(dòng)劑。
第三十三方面，本發(fā)明描述了用于改變心血管功能的第二方面的調(diào)節(jié)物。
在一些實(shí)施方案中，心血管功能的上述改變選自(a)降低心臟肥大；(b)增加心臟射血量；(c)降低心室體積；以及(d)減少心肌細(xì)胞凋亡。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物選自激動(dòng)劑，部分激動(dòng)劑，反激動(dòng)劑及拮抗劑。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至100μM之間值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至10μM之間值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物降低了細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為選擇性的。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物是口服可生物利用的。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為激動(dòng)劑。
第三十四方面，本發(fā)明描述了第二方面的調(diào)節(jié)物用于預(yù)防或治療心血管失調(diào)。
在一些實(shí)施方案中，上述心血管失調(diào)選自(a)降低心臟輸出；以及(b)增加靜脈壓。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物選自激動(dòng)劑，部分激動(dòng)劑，反激動(dòng)劑及拮抗劑。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至100μM之間值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至10μM之間值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物降低了細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為選擇性的。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物是口服可生物利用的。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為激動(dòng)劑。
第三十五方面，本發(fā)明描述了第二方面的調(diào)節(jié)物用于預(yù)防或治療缺血性心臟病。
在一些實(shí)施方案中，上述缺血性心臟病選自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物選自激動(dòng)劑，部分激動(dòng)劑，反激動(dòng)劑及拮抗劑。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至100μM之間值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM至10μM之間值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人類RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物降低了細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為選擇性的。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物是口服可生物利用的。
在一些實(shí)施方案中，上述調(diào)節(jié)物為激動(dòng)劑。
申請(qǐng)人保留排除本發(fā)明任一實(shí)施方案的任一一種或者多種候選化合物的權(quán)利。申請(qǐng)人也保留排除本發(fā)明任一實(shí)施方案的任一一種或者多種調(diào)節(jié)物的權(quán)利。申請(qǐng)人還保留排除本發(fā)明任一實(shí)施方案的任一多核苷酸或者多肽的權(quán)利。申請(qǐng)人另外保留排除本發(fā)明任一實(shí)施方案的任一缺血性心臟病或任一心血管失調(diào)或心肌細(xì)胞凋亡失調(diào)的權(quán)利。


圖1僅為說明性而非限制性的，圖1顯示了針對(duì)“靶受體”的候選化合物的初級(jí)掃描結(jié)果，所述“靶受體”為內(nèi)源性組成性活化Gs偶聯(lián)的GPCR的Gsα融合蛋白?！盎衔顰”的結(jié)果提供于A2道?！盎衔顱”的結(jié)果提供于G9道。
2A至C圖.A.使用常規(guī)高密度寡核苷酸微陣列在人組織樣品上進(jìn)行微陣列分析，所述常規(guī)高密度寡核苷酸微陣列包含監(jiān)控RUP41基因表達(dá)水平的探針。柱狀圖顯示了二次測(cè)量的每一個(gè)組織圖譜中RUP41的相對(duì)表達(dá)水平(平均差分)及標(biāo)準(zhǔn)誤差。每一組織名以垂直文字排列的方式顯示在每個(gè)柱上。
柱狀圖的檢查顯示人大腦和心臟中RUP41的表達(dá)。
B.人類多組織點(diǎn)印跡顯示在成人及胎兒心臟組織中RUP41 mRNA的高水平表達(dá)。RUP41 mRNA表達(dá)也可以在不同局部大腦組織中檢測(cè)出。
C.人類多組織Northern印跡顯示在心臟及大腦中RUP41 mRNA的高水平表達(dá)。
圖3.原位雜交顯示RUP41在成年大鼠心臟中的廣泛心肌表達(dá)。反義RUP41放射性標(biāo)記的探針檢測(cè)到RUP41在所有心室中的表達(dá)。反義對(duì)照(GAPDH)及心房特異性(心鈉素，ANF)探針被用于其它部分以顯示心臟部分探針標(biāo)記的特異性。
圖4A至B。A.RT-PCR顯示了RUP41轉(zhuǎn)錄本在不含血清的條件下保持24小時(shí)的新生大鼠心室心肌(NRVMs)中的表達(dá)。在向培養(yǎng)基中加入脫羥腎上腺素(PE)或小牛血清(NCS)后RUP41轉(zhuǎn)錄本水平顯著下降并且與肥大表現(xiàn)型相關(guān)。G3PDH PCR產(chǎn)物顯示用作PCR反應(yīng)的相同模板水平以及凝膠上樣量的一致性。
B.用包括脫羥腎上腺素(PE)，佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)，前列腺素F2α(PGF2α)的肥大劑以及小牛血清(NCS)處理24小時(shí)后Northern印跡顯示NRVMs中RUP41 mRNA表達(dá)水平的降低。相應(yīng)于所有肥大刺激物心肌肥大的遺傳標(biāo)志心鈉素(ANF)被上調(diào)。28S rRNA亞甲基藍(lán)染色顯示RNA的完整性以及相等的上樣量。
圖5.上圖.在超負(fù)荷壓力誘導(dǎo)的心臟肥大的體內(nèi)小鼠模型中RUP41mRNA被下調(diào)。對(duì)從進(jìn)行橫向主動(dòng)脈縮窄(TAC)或者假手術(shù)(SHAM)7天的小鼠分離的總RNA進(jìn)行Northern印跡分析。ANF的增加表達(dá)顯示TAC心臟中形成天然肥大應(yīng)答。28S rRNA亞甲基藍(lán)染色顯示RNA的完整性以及相等的上樣量。
底部.經(jīng)密度測(cè)量法分析RUP41信號(hào)并且標(biāo)準(zhǔn)化到28S rRNA信號(hào)。
*6個(gè)假手術(shù)以及6個(gè)TAC樣品的方差統(tǒng)計(jì)分析顯示RUP41mRNA的明顯減少，P＜0.00005。
圖6.Northern印跡顯示從經(jīng)受缺氧6小時(shí)的NRVMs分離的總RNA中RUP41 mRNA的水平降低。缺氧后(H6/R24)復(fù)氧24小時(shí)后RUP41 mRNA水平恢復(fù)到對(duì)照(正常氧)水平。c-fos表達(dá)(缺氧-6)水平的增加顯示肌細(xì)胞對(duì)低含氧環(huán)境的脅迫應(yīng)答。28S rRNA亞甲基藍(lán)染色顯示RNA的完整性以及相等的上樣量。
圖7A-B.A.對(duì)從人心臟分離的總RNA進(jìn)行RT-PCR。充血性心力衰竭(CHF)的病人RNA與正常心臟功能(正常的)的病人RNA相比RUP41轉(zhuǎn)錄水平下降。向每一PCR反應(yīng)中添加人GAPDH引物作為模板濃度以及上樣量一致性的內(nèi)部對(duì)照。
B.*方差統(tǒng)計(jì)分析顯示CHF病人與正常人相比RUP41轉(zhuǎn)錄本明顯減少，p＜0.05。心肌梗塞(MI)病人RUP41轉(zhuǎn)錄本水平與正常心臟沒有差別。
圖8.上圖.COS-7細(xì)胞用pCMV-HARUP41(HA-RUP41)或pCMV-HA主鏈(CMV)以及組成型活性的Gs-偶聯(lián)的促甲狀腺激素受體(pCMV-CART-TSHR)共-轉(zhuǎn)染。[HARUP41相應(yīng)于血球凝集素(HA)-標(biāo)記的RUP41。]此外，共-轉(zhuǎn)染CRE-熒光素酶報(bào)告基因構(gòu)建體以確定在百日咳毒素(PTX)存在或者不存在的條件下cAMP活化途徑的活性。共-表達(dá)CART-TSHR以及HARUP41的細(xì)胞中熒光素酶報(bào)道基因的活性比共-表達(dá)CART-TSHR以及pCMV-HA對(duì)照的細(xì)胞中的活性小，顯示RUP41與Gi的偶聯(lián)。用PTX處理由RUP41抑制cAMP的減少證明Gi與這種受體的偶聯(lián)。
底部.在百日咳毒素(PTX)存在或者缺乏的條件下用pCMV-HA(CMV)or pCMV-HARUP41(RUP41)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。毛喉素(1μM)刺激的cAMP水平的增加由RUP41的表達(dá)抑制。用PTX處理由RUP41抑制cAMP的減少證明Gi與這種受體的偶聯(lián)。
圖9A-B.A.用各種感染復(fù)數(shù)的編碼RUP41的重組腺病毒(AdRUP41)處理NRVMs，所述感染復(fù)數(shù)由每細(xì)胞噬斑形成單位(PFU)中的病毒效價(jià)定義。腺病毒感染后24小時(shí)，分離總RNA并且使用Northern印跡分析確定病毒表達(dá)RUP41的水平。在50PFU/細(xì)胞，就可檢測(cè)到RUP41的表達(dá)，但是高水平表達(dá)顯示在100PFU/細(xì)胞。
B.100PFU/細(xì)胞感染AdRUP41 48小時(shí)的NRVMs顯示無(wú)血清培養(yǎng)基中細(xì)胞存活率的增加。用結(jié)合鬼筆環(huán)肽以及Hoechst 33342的德克薩斯紅共-染色NRVMs。
圖10.寡核小體DNA斷裂(也稱為形成序列梯)顯示缺氧(8小時(shí))后復(fù)氧(24小時(shí))刺激了感染100PFU/細(xì)胞對(duì)照(AdGFP)腺病毒的NRVMs(H8/N24)細(xì)胞凋亡的增加。然而，腺病毒介導(dǎo)的RUP41(100PFU/細(xì)胞)的超量表達(dá)降低了由除去血清(normox)以及缺氧后復(fù)氧(H8/N24)誘導(dǎo)的DNA斷裂的水平。
發(fā)明詳述關(guān)于受體的科學(xué)文獻(xiàn)已經(jīng)采用了大量涉及對(duì)受體具有各種作用的配體。為了清楚和一致的目的，下列定義將貫穿本專利文獻(xiàn)使用。當(dāng)這些術(shù)語(yǔ)的定義與其它定義沖突時(shí)，應(yīng)參照下列定義激動(dòng)劑是指當(dāng)其結(jié)合于受體時(shí)激活胞內(nèi)應(yīng)答的物質(zhì)(例如，配體，候選化合物)。在一些實(shí)施方案中，激動(dòng)劑是之前不知當(dāng)其與受體結(jié)合時(shí)激活胞內(nèi)應(yīng)答(例如，增強(qiáng)GTPγS結(jié)合于薄膜或降低胞內(nèi)cAMP的水平)的物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，激動(dòng)劑是之前不知當(dāng)其與受體結(jié)合時(shí)抑制分解的那些物質(zhì)。
別構(gòu)調(diào)節(jié)物是指影響受體的功能活性但不抑制內(nèi)源配體與受體結(jié)合的物質(zhì)(例如，配體，侯選化合物)。別構(gòu)調(diào)節(jié)物包括反激動(dòng)劑，部分激動(dòng)劑以及拮抗劑。
本發(fā)明使用的氨基酸縮寫列舉在表格A中表格A


拮抗劑是指與激動(dòng)劑競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合于受體相同的位點(diǎn)但不激活胞內(nèi)應(yīng)答，并且可以因此抑制由激動(dòng)劑引起的胞內(nèi)應(yīng)答的物質(zhì)(例如，配體，候選化合物)。在激動(dòng)劑存在的條件下拮抗劑不減少基線胞內(nèi)應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，拮抗劑是之前不知當(dāng)結(jié)合于受體時(shí)能與拮抗劑競(jìng)爭(zhēng)抑制細(xì)胞應(yīng)答的那些物質(zhì)，例如其中的細(xì)胞應(yīng)答是指GTPγS結(jié)合于膜或降低胞內(nèi)cAMP的水平。
這里的抗體是指包括單克隆抗體以及多克隆抗體?？贵w進(jìn)一步包括IgG，IgA，IgD，IgE以及IgM?？贵w包括含有單鏈整個(gè)抗體的整個(gè)抗體，以及其抗原結(jié)合片段，包括Fab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab)2以及F(ab′)2?？贵w可以是任何動(dòng)物來(lái)源的抗體。優(yōu)選地抗體是人，鼠科動(dòng)物，兔，山羊，豚鼠，倉(cāng)鼠，駱駝，驢，綿羊，馬或小雞。優(yōu)選地，抗體具有解離常數(shù)或者Kd值小于5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M以及10-15的結(jié)合親和性。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域已知的任一合適方法進(jìn)行制備。
細(xì)胞凋亡(又名細(xì)胞程序死亡)是指一種細(xì)胞死亡形式，其中細(xì)胞通過細(xì)胞內(nèi)操縱的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡。相反，壞死是指細(xì)胞被外源因素殺死。
候選化合物是指掃描技術(shù)可使用的分子(例如而非限制性的為一種化合物)。優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)“候選化合物”不包括公眾已知作為受體的反激動(dòng)劑，激動(dòng)劑或拮抗劑的化合物；更優(yōu)選地，不包括先前已被確定對(duì)至少一種哺乳動(dòng)物具有療效的化合物；并且最優(yōu)選地，不包括先前已被確定對(duì)人類具有治療效用的化合物。
心臟射血部分是指單次收縮從左心室排射出的血液部分。例如，如果100ml血液存在于左心室中并且收縮后噴出90ml，那么心臟射血部分是90％。
心臟肥大是指心肌增大。心臟肥大通常而不是總是對(duì)增加施加于心肌上的血液動(dòng)力學(xué)負(fù)載的適應(yīng)反應(yīng)。
密碼子是指一組三個(gè)核苷酸(或核苷酸的等效物)通常包括與磷酸基結(jié)合的核苷(腺嘌呤核苷(A)，鳥嘌呤核苷(G)，胞嘧啶核苷(C)，尿嘧啶核苷(U)以及胸腺嘧啶(T)，并且當(dāng)其被翻譯時(shí)編碼氨基酸。
組合物是指包括至少一個(gè)組分的物質(zhì)；“藥用組合物”是組合物的實(shí)例。
化合物的效果是指測(cè)定的化合物抑制或刺激受體功能的能力；即，激活/抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和受體結(jié)合親合性對(duì)比。檢測(cè)化合物效果的示范性方式公開于本專利文獻(xiàn)的實(shí)施例部分。
這里的包括，基本上由...組成以及由...組成根據(jù)它們的標(biāo)準(zhǔn)含義進(jìn)行定義。M.P.E.P.中顯示的定義控制本領(lǐng)域的定義并且統(tǒng)制FederalCircuit判例法顯示的定義控制M.P.E.P中的顯示的含義。
充血性心衰竭(CHF)是指心臟失去其有效泵出血液能力的失調(diào)。隨著年齡的增長(zhǎng)充血性心衰竭會(huì)更普通。缺血性心臟病是充血性心衰竭最普遍的原因，占所有病例的60-70％。增加大于12mmHg靜脈壓是充血性心衰竭的一個(gè)主要的Framingham原則，相當(dāng)于大于25秒循環(huán)時(shí)間的心輸出量的減少。
組成型活性受體是指通過除了通過受體結(jié)合其配體或其化學(xué)等同物的方式穩(wěn)定在活性態(tài)的受體。組成型活性型受體可以是內(nèi)源或非-內(nèi)源的。
組成型激活的受體是指已被修飾從而組成型活化的內(nèi)源性受體。CART是組成型激活的受體技術(shù)的縮寫并且在這里當(dāng)在GPCR前加上前綴時(shí)應(yīng)該被理解為鑒定所述帶前綴的GPCR為組成型激活的受體。
組成性受體活化是指在不將受體與其配體或其化學(xué)等同物結(jié)合的條件下激活受體。
接觸或接觸是指無(wú)論是在體外系統(tǒng)或者體內(nèi)系統(tǒng)中將至少兩部分結(jié)合在一起。
降低被用來(lái)指可測(cè)量量的減少并且使用時(shí)與術(shù)語(yǔ)“減少”，“減小”，“降低”以及“變少”同義。
超聲波心動(dòng)描記法是指利用聲波測(cè)定心臟結(jié)構(gòu)以及活動(dòng)物功能的方法。
內(nèi)源性是指哺乳動(dòng)物天然產(chǎn)生的物質(zhì)。
內(nèi)源性應(yīng)被理解為包括所述哺乳動(dòng)物基因組內(nèi)表示的基因的變體以及其編碼的等位基因多肽變體。相比之下，這里的術(shù)語(yǔ)非內(nèi)源性應(yīng)該指不是由哺乳動(dòng)物(例如但不限于人)天然產(chǎn)生的。例如但不限于，不是內(nèi)源形式組成型活化但是當(dāng)進(jìn)行操縱時(shí)變成組成型活化形式的受體在這里最優(yōu)選地是指“非-內(nèi)源性組成型活化的受體”。這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)均可用于描述“體內(nèi)”以及“體外”系統(tǒng)。例如但不限于在篩選方法中內(nèi)源或非-內(nèi)源性受體可以指體外篩選系統(tǒng)。例如但不限于，當(dāng)哺乳動(dòng)物的基因組被操作包括非-內(nèi)源性組成型活化受體時(shí)可以通過體內(nèi)系統(tǒng)篩選侯選化合物。
表達(dá)載體在這里被定義為在表達(dá)載體的合適宿主細(xì)胞重組體中，轉(zhuǎn)錄克隆的DNA以及轉(zhuǎn)錄的mRNA翻譯所需的DNA序列。適當(dāng)構(gòu)建的表達(dá)載體應(yīng)該含有宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)，選擇性標(biāo)記，有限的限制性酶切位點(diǎn)，可以具有高拷貝數(shù)的潛能以及活化的啟動(dòng)子。所述待轉(zhuǎn)錄的克隆的DNA可操作的連接于所述表達(dá)載體內(nèi)的組成型或條件活化的啟動(dòng)子。例如但不限于，pCMV是表達(dá)載體。
本發(fā)明上下文公開的G蛋白偶聯(lián)受體融合蛋白以及GPCR融合蛋白是指包括融合到至少一個(gè)G蛋白，最優(yōu)選地，這種G蛋白的α亞基的內(nèi)源組成型活化GPCR或非-內(nèi)源組成型活化GPCR的非-內(nèi)原性蛋白，G蛋白優(yōu)選地與和內(nèi)源孤兒GPCR天然偶聯(lián)的G蛋白類型相同。例如但不限于，在內(nèi)源狀態(tài)，如果G蛋白“Gs蛋白質(zhì)α”是與GPCR偶聯(lián)的主要G蛋白，基于特異性GPCR的GPCR融合蛋白將是包括融合Gsα的GPCR的非-內(nèi)原性蛋白；在一些情況下，如下所列舉，非-主要的G蛋白可以融合至GPCR。G蛋白可以直接融合至組成型活化GPCR的C-末端或在二者之間可能有間距。
宿主細(xì)胞是指其中能夠包含載體的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，優(yōu)選地哺乳動(dòng)物細(xì)胞，且更優(yōu)選地選自293，293T，CHO以及COS-7細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，更優(yōu)選為黑色素細(xì)胞。
在這里使用的需要治療是指由護(hù)理者(就人來(lái)說例如為醫(yī)生，護(hù)士，護(hù)士從業(yè)者等；就動(dòng)物來(lái)說為獸醫(yī)，包括非-人哺乳動(dòng)物)判斷個(gè)體或需要或?qū)⑹芤嬗谥委?。這種判斷是基于多種護(hù)理者專業(yè)知識(shí)的范圍內(nèi)的因素，但包括個(gè)體或動(dòng)物生病或者將生病的知識(shí)，作為可由本發(fā)明的化合物治療的病癥。
靜脈壓增加應(yīng)該是指由于循環(huán)系統(tǒng)變?nèi)跛鸬难挫o脈系(靜脈)中發(fā)展的血壓增加。
在這里使用的個(gè)體是指任一種動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物，優(yōu)選小鼠，大鼠，其它嚙齒類動(dòng)物，兔子，狗，貓，豬，牛，綿羊，馬或靈長(zhǎng)類動(dòng)物，最優(yōu)選人。
與術(shù)語(yǔ)“應(yīng)答”相關(guān)的抑制是指與缺乏化合物的情況下相反在存在化合物的條件下應(yīng)答減少或受到阻止。
反激動(dòng)劑是指與內(nèi)源形式或者組成型活化型受體結(jié)合從而降低所觀察到的受體基線胞內(nèi)的應(yīng)答的物質(zhì)(例如，配體候選化合物)。
缺血性心臟病應(yīng)該是指由心組織缺氧引起的失調(diào)，其中心臟的肌肉受到影響并且心臟不能適當(dāng)泵血。缺血性心臟病是美國(guó)最常見的心肌病。
分離的是指從原始環(huán)境(例如，如果是天然存在的自然環(huán)境)取出的物質(zhì)。例如存在于活動(dòng)物體內(nèi)的天然存在的多核苷酸或多肽未經(jīng)分離但是從自然系統(tǒng)的一些或所有共存物質(zhì)分離的相同的多核苷酸或DNA或多肽是經(jīng)分離的。這種多核苷酸可以是載體的一部分和/或這種多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分并且仍然是被分離的因?yàn)檩d體或組合物不是自然環(huán)境的一部分。
這里的基因敲除小鼠/RAT包括已經(jīng)重組體方法操作的小鼠或大鼠因此精選的單個(gè)基因已被滅活或以使所有其它的未受影響的基因保留的方式敲除基因。
已知的受體是指特異于該受體的內(nèi)源性配體已被鑒定的內(nèi)源性受體。
配體是指特異于天然存在的受體的分子。
在這里使用的術(shù)語(yǔ)調(diào)節(jié)或修飾是指特定活性功能或分子的量，質(zhì)量或效果的增減。
心肌梗塞是指由于不充分供氧的心肌區(qū)域的損傷或壞死。心肌梗塞通常由阻塞一個(gè)冠狀動(dòng)脈(給心肌帶來(lái)血液和氧氣的血管)的凝塊所引起。凝結(jié)阻止血液和氧氣到達(dá)心臟的那個(gè)區(qū)域?qū)е履莻€(gè)區(qū)域心臟細(xì)胞的死亡。非-孤兒受體是指特異于鑒定的配體的內(nèi)源性天然存在的分子，其中配體與受體的結(jié)合激活胞內(nèi)信號(hào)途徑。孤兒受體是指該受體的特異性配體尚未被鑒定的或未知的內(nèi)源性受體。部分激動(dòng)劑是指當(dāng)結(jié)合于受體時(shí)比完整激動(dòng)劑更小程度/幅度活化胞內(nèi)應(yīng)答的物質(zhì)(例如，配體，候選化合物)。
藥物組合物是指包括至少一種活性成分的組合物，其中所述組合物可用于研究哺乳動(dòng)物(例如但不限于人)的指定效果。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解和認(rèn)識(shí)到上述技術(shù)適于確定活性成分是否具有基于技術(shù)人員需要的所希望的效果。
多核苷酸是指以單鏈或者雙鏈體形式超過一個(gè)核苷酸的RNA，DNA，或RNA/DNA雜交體序列。本發(fā)明的多核苷酸可以通過任一已知的方法制備，包括合成的，重組體，離體繁殖或其組合，以及利用本領(lǐng)域已知的任一提純法。
多肽是指不考慮聚合物長(zhǎng)度的氨基酸的聚合物。因此，肽，寡肽和蛋白包括在本發(fā)明定義的多肽的范圍內(nèi)。這個(gè)術(shù)語(yǔ)不特指或排除的表達(dá)后修飾。例如，包括共價(jià)連接的葡糖基基團(tuán)，乙?；?，磷酸基脂基等等的多肽清楚地由術(shù)語(yǔ)多肽包括。
心肌梗塞后重建.心肌梗塞損失的心肌組織引起心室上持續(xù)的過量血液動(dòng)力學(xué)負(fù)載。心室肥大建立了一種據(jù)此心臟補(bǔ)償負(fù)載增加的原理機(jī)制。然而，在血液動(dòng)力學(xué)超負(fù)荷面前這種適應(yīng)于持續(xù)心臟性能的能力是有限的并且當(dāng)長(zhǎng)期維持時(shí)就變成病態(tài)適應(yīng)。逐漸地，因?yàn)閿U(kuò)大的心室逐漸增大并且收縮功能變?nèi)?，所以適應(yīng)的肥大表現(xiàn)型轉(zhuǎn)變?yōu)樾乃ソ摺?duì)心臟中心肌梗塞的適應(yīng)性以及不適應(yīng)性應(yīng)答的自然史被稱作“重建”。
關(guān)于心肌梗塞后重建，有大量關(guān)于病理學(xué)進(jìn)展的信息參數(shù)(a)如果心臟肥大增加，是有害的；(b)如果心臟肌細(xì)胞程序死亡增加，是有害的；(c)如果心臟射血部分減少，是有害的；以及(d)如果心室容積增加，是有害的。
用超聲波心動(dòng)描記法可以進(jìn)行活動(dòng)物包括大鼠以及小鼠射血部分，心室擴(kuò)張的測(cè)定。這些參數(shù)通常在最初檢查。為了正確地確定涉及的致病機(jī)制，然而，一般進(jìn)一步需要處死動(dòng)物以測(cè)定心肌細(xì)胞的程序死亡。
引物在這里是指特異性寡核苷酸序列，其互補(bǔ)于靶核苷酸序列并且被用于雜交至靶核苷酸序列。引物用作DNA聚合酶，RNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶摧化的核苷酸聚合的起點(diǎn)。
受體功能是指受體的正常操作以接收刺激物并且調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的功能，包括但不限于通過G-蛋白調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)離子的流入或流出，作用催化反應(yīng)，和/或調(diào)節(jié)活性。
減少心輸出量是指減少衰竭心臟的泵排量由此減少心室每次收縮注入循環(huán)系統(tǒng)(動(dòng)脈)的血液。
第二信使是指受體活化產(chǎn)生的胞內(nèi)應(yīng)答。第二信使可以包括例如肌醇三磷酸(IP3)，甘油二酯(DAG)，環(huán)化AMP(cAMP)，環(huán)鳥苷酸(cGMP)以及Ca2+?？梢詼y(cè)定第二信使來(lái)確定受體活化。此外，可以測(cè)定第二信使應(yīng)答以直接鑒定候選化合物，包括例如反激動(dòng)劑，部分激動(dòng)劑，激動(dòng)劑以及拮抗劑。
信噪比是指響應(yīng)活化，擴(kuò)增或刺激產(chǎn)生的信號(hào)，其中信號(hào)超出響應(yīng)非-活化，非-擴(kuò)增或非-刺激的背景噪聲或基態(tài)水平。
跨距是指位于基因，例如目標(biāo)GPCR的最后一個(gè)密碼子或者最后一個(gè)氨基酸后，但是起始密碼子或者目標(biāo)G蛋白的開始區(qū)域之前的翻譯的氨基酸的數(shù)目。翻譯的氨基酸的數(shù)目可以是一個(gè)，兩個(gè)，三個(gè)，四個(gè)等等以及高達(dá)十二個(gè)。
與術(shù)語(yǔ)“應(yīng)答”相關(guān)的刺激是指在存在化合物的條件下與缺乏化合物條件相比應(yīng)答加強(qiáng)。
受試者是指靈長(zhǎng)類動(dòng)物，包括但不限于人類和狒狒以及寵物諸如狗和貓，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物諸如大鼠和小鼠以及家畜諸如馬，綿羊以及牛。
本發(fā)明使用的治療有效量是指引起組織，系統(tǒng)，動(dòng)物，個(gè)體或者人生物學(xué)或者藥物應(yīng)答的活性化合物或者藥劑的量，所述組織，系統(tǒng)，動(dòng)物，個(gè)體或者人正在被研究人員，獸醫(yī)，醫(yī)生或者其它臨床醫(yī)生研究，所述生物學(xué)或者藥物應(yīng)答包括下列的一種或者多種活性(1)預(yù)防疾?。焕珙A(yù)防可能易患疾病，體況或者失調(diào)但是還沒有經(jīng)歷或者顯示所述疾病的病理或者癥狀的個(gè)體的疾病，體況或者失調(diào)，(2)抑制疾?。焕缫种普诮?jīng)歷或顯示疾病，體況或者失調(diào)的病理和/或癥狀的個(gè)體的疾病，體況或失調(diào)(即，阻止病理和/或癥狀的進(jìn)一步發(fā)展)，以及(3)改善疾??；例如改善正在經(jīng)歷或顯示疾病，體況或者失調(diào)的病理和/或癥狀的個(gè)體的疾病，體況或失調(diào)(即，逆轉(zhuǎn)病理和/或癥狀)。
這里的轉(zhuǎn)基因小鼠/大鼠應(yīng)該包括通過重組體手段被工程改造攜帶異體基因，或者轉(zhuǎn)基因，選擇作為其自身的部分遺傳物質(zhì)的小鼠或者大鼠。
心室體積是指測(cè)量的心臟的左或者右心室內(nèi)部尺寸。在衰竭的心臟中，心室增大。
A.介紹下列部分的順序是為了闡述效率而非也不應(yīng)該被理解為是對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容或者附屬權(quán)利要求的限制。
B.篩選候選化合物1.一般的GPCR篩選分析技術(shù)當(dāng)G蛋白受體活化時(shí)，其結(jié)合G蛋白(例如，Gq，Gs，Gi，Gz，Go)并且激發(fā)GTP與G蛋白的結(jié)合。然后G蛋白起GTP酶的作用并且緩慢水解GTP到GDP，借此在正常情況下受體失活。然而，活化的受體繼續(xù)將GDP轉(zhuǎn)化為GTP。不可水解的GTP類似物，[35S]GTPγS，可用于監(jiān)控與表達(dá)活化受體的膜的加強(qiáng)結(jié)合。據(jù)報(bào)道[35S]GTPγS可用于監(jiān)控在配體缺乏或者存在的條件下G蛋白與膜的偶聯(lián)。這種監(jiān)控的一個(gè)實(shí)例，以及其他公知的以及本領(lǐng)域可獲得的實(shí)例由Traynor和Nahorski于1995年發(fā)表。這種分析系統(tǒng)的一種優(yōu)選應(yīng)用是候選化合物的最初初篩，因?yàn)樗鱿到y(tǒng)一般可用于所有G蛋白偶聯(lián)受體而不管是否是與受體的胞內(nèi)區(qū)域互作的特定G蛋白。
2.具體的GPCR篩選分析技術(shù)一旦利用“一般的”G蛋白偶聯(lián)受體分析(即，選擇作為激動(dòng)劑或者反激動(dòng)劑的化合物的分析)鑒定了候選化合物，在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選進(jìn)行進(jìn)一步的篩選以證實(shí)所述化合物作用于受體位點(diǎn)。例如，通過“一般的”分析鑒定的化合物可能不與受體結(jié)合，但是但是可能緊緊“不偶聯(lián)”于細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的G蛋白。
a.Gs，Gz以及Gi.
Gs激活腺苷酸環(huán)化酶。另一方面Gi(以及Gz和Go)抑制腺苷酸環(huán)化酶。腺苷酸環(huán)化酶催化ATP轉(zhuǎn)化到cAMP；因此，偶聯(lián)Gs蛋白的活化GPCRs與cAMP細(xì)胞含量的增加相關(guān)。另一方面，偶聯(lián)Gi(或者Gz，Go)蛋白的活化GPCRs與cAMP細(xì)胞內(nèi)含量的減少相關(guān)。通常參見“突觸傳遞的間接機(jī)制(Mechanisms of Transmission Synaptic)”，第8章，從神經(jīng)元到大腦(From Neuron To Brain)(第三版)Nichols，J.G.等編輯，Sinauer Associates，Inc.(1992)。因此，檢測(cè)cAMP的分析可被用于確定候選化合物是否為例如受體的反激動(dòng)劑(即，這種化合物將減少cAMP的含量)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域測(cè)定cAMP的多種方法；在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選的方法依賴于使用基于ELISA形式的抗cAMP抗體?？梢允褂玫牧硪环N分析是全細(xì)胞第二信使報(bào)告物系統(tǒng)分析?；虻膯?dòng)子啟動(dòng)特定基因編碼的蛋白的表達(dá)。cAMP通過促進(jìn)cAMP-應(yīng)答的DNA結(jié)合蛋白或者轉(zhuǎn)錄因子(CREB)的結(jié)合驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)，然后所述cAMP-應(yīng)答DNA結(jié)合蛋白或者轉(zhuǎn)錄因子(CREB)與啟動(dòng)子在被稱作cAMP效應(yīng)元件的特異性位點(diǎn)結(jié)合并且驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)。報(bào)告系統(tǒng)可被構(gòu)建為在報(bào)告基因前具有包含多個(gè)cAMP效應(yīng)元件的啟動(dòng)子，例如，β-半乳糖苷酶或者熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)。因此，活化的Gs-結(jié)合的受體引起cAMP的聚集然后活化基因以及報(bào)告蛋白的表達(dá)。然后可以利用標(biāo)準(zhǔn)生物化學(xué)分析檢測(cè)報(bào)告蛋白諸如β-半乳糖苷酶或者熒光素酶(Chen等人1995)。
b.Go以及Gq.
Gq以及Go與磷脂酶C的激活有關(guān)，其依次水解磷脂PIP2，釋放兩種胞內(nèi)信使二酰甘油(DAG)以及肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)。IP3的增加積累與Gq-以及Go-相關(guān)受體的激活有關(guān)。通常參見“突觸傳遞的間接機(jī)制(Mechanisms of Transmission Synaptic)”，第8章，從神經(jīng)元到大腦(From Neuron To Brain)(第三版)Nichols，J.G.等編輯，Sinauer Associates，Inc.(1992)。檢測(cè)IP3積累的分析可被用于確定候選化合物是否為例如Gq-或Go-相關(guān)受體的反激動(dòng)劑(即，這種化合物將減少IP3的含量)。Gq-相關(guān)受體可以利用AP1報(bào)告分析檢驗(yàn)，因?yàn)镚q-依賴的磷脂酶C引起包含AP1成分的基因的活化；因此，活化的Gq-相關(guān)受體將證明這種基因表達(dá)的增加，借此其反激動(dòng)劑將證明這種表達(dá)的減少以及激動(dòng)劑將證明這種表達(dá)的增加?？梢垣@得這種檢測(cè)的市售分析。
3.GPCR融合蛋白通過利用內(nèi)源，組成性活化的GPCR或者非內(nèi)源性組成性活化的GPCR用于篩選直接鑒定反激動(dòng)劑或者激動(dòng)劑的候選化合物提供了一種有價(jià)值的篩選方法，通過定義，受體即使在缺乏結(jié)合其上的內(nèi)源性配體時(shí)也是活化的。因此，為了區(qū)分，例如在存在候選化合物的條件下非內(nèi)源性受體以及在缺乏化合物條件下的非內(nèi)源性受體，為了使這種區(qū)分顆粒被理解為這種化合物是反激動(dòng)劑或者激動(dòng)劑或者對(duì)這種受體沒有作用，在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選使用可以加強(qiáng)這種分化的方法。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選采用GPCR融合蛋白的方法。
通常，利用上述分析技術(shù)一旦確定非內(nèi)源性GPCR已經(jīng)被組成性活化，就可以確定與內(nèi)源性GPCR偶聯(lián)的主要G蛋白。G蛋白與GPCR的偶聯(lián)提供了可被評(píng)價(jià)的信號(hào)途徑。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選利用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行篩選，因而期待其中具有內(nèi)源性G蛋白的系統(tǒng)。因此，根據(jù)定義，在這種系統(tǒng)中，非內(nèi)源性組成性活化的GPCR將連續(xù)地發(fā)信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選地加強(qiáng)這種信號(hào)是的在例如受體的反激動(dòng)劑存在的條件下，當(dāng)與反激動(dòng)劑接觸時(shí)，更可能更容易地，尤其是在篩選過程中區(qū)分受體。
GPCR融合蛋白是用來(lái)加強(qiáng)與非內(nèi)源性GPCR偶聯(lián)的G蛋白的效力。在一些實(shí)施方案中，GPCR融合蛋白優(yōu)選用內(nèi)源性組成性活性GPCR或者非內(nèi)源性組成性活化GPCR進(jìn)行篩選，因?yàn)檫@種方法加強(qiáng)了在這種篩選技術(shù)中產(chǎn)生的信號(hào)。這對(duì)促進(jìn)顯著的“信噪比”是很重要的；這種顯著的比值對(duì)于篩選本發(fā)明公開的候選化合物是優(yōu)選的。
用于表達(dá)GPCR融合蛋白的構(gòu)建物的構(gòu)建是在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的范圍內(nèi)。市售的表達(dá)載體以及系統(tǒng)提供了各種可以滿足研究者特定需求的方法。構(gòu)建這種GPCR融合蛋白構(gòu)建物的重要標(biāo)準(zhǔn)包括但不限于GPCR序列以及G蛋白序列都在框架內(nèi)(優(yōu)選地，內(nèi)源GPCR的序列在G蛋白序列的上游)，而且GPCR的終止密碼子被缺失或者替換使得GPCR表達(dá)后，也可以表達(dá)G蛋白。GPCR可以直接連接到G蛋白，或者可以在二者之間具有間隔物殘基(優(yōu)選地，僅僅約12個(gè)殘基，雖然這個(gè)數(shù)目可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易地確定)。為方便起見，優(yōu)選使用間隔物。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選地偶聯(lián)至非內(nèi)源性GPCR的G蛋白在構(gòu)建GPCR融合蛋白構(gòu)建物前即被鑒定。因?yàn)橹挥猩贁?shù)G蛋白被鑒定，優(yōu)選地包括G蛋白序列的構(gòu)建物(即，通用G蛋白構(gòu)建物，參見以下的實(shí)施例5(a))可用于在其中插入內(nèi)源GPCR序列；這就給大規(guī)模篩選各種具有不同序列的不同內(nèi)源性GPCRs提供了更高的效率。
如上所述，偶聯(lián)至Gi，Gz以及Go的活化的GPCRs可以抑制cAMP的形成，使得基于這些類型的GPCRs的分析具有挑戰(zhàn)性[即，活化后cAMP信號(hào)減弱，使得直接鑒定例如激動(dòng)劑(將進(jìn)一步減弱這種信號(hào))具有挑戰(zhàn)性]。如本發(fā)明下面所公開，已經(jīng)確定對(duì)于這些類型的受體而言，可能建立不是基于GPCR內(nèi)源性G蛋白的GPCR融合蛋白，以建立基于活環(huán)化酶的分析。因此，例如內(nèi)源性Gi偶聯(lián)受體可以融合到Gs蛋白，使得融合構(gòu)建物在表達(dá)后，可以“驅(qū)動(dòng)”或者“啟動(dòng)”內(nèi)源性GPCR與例如Gs偶聯(lián)而非與“天然的”Gi蛋白偶聯(lián)，從而建立基于環(huán)化酶的分析。因此，對(duì)于Gi，Gz以及Go偶聯(lián)受體而言，在一些實(shí)施方案中，當(dāng)使用GPCR融合蛋白以及所述分析是基于檢測(cè)腺苷酸環(huán)化酶的活性時(shí)，優(yōu)選用Gs(或者激發(fā)腺苷酸環(huán)化酶形成的同等物G蛋白)構(gòu)建融合構(gòu)建物。
表B

相同效果為利用Gq蛋白與Gs，Gi，Gz，或Go蛋白融合的G蛋白融合構(gòu)建體。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選的融合構(gòu)建體可以是其中的G蛋白α亞基(“Gαq”)的前六個(gè)氨基酸被刪除，且在Gαq的C末端后5個(gè)氨基酸被目的G蛋白的Gα的相應(yīng)氨基酸取代。例如，融合構(gòu)建體可以具有與Gi蛋白融合的Gq(6氨基酸)，產(chǎn)生“Gq/Gi融合構(gòu)建體”。此融合構(gòu)建體將促進(jìn)內(nèi)源性Gi偶聯(lián)受體偶聯(lián)至其非內(nèi)源性G蛋白，Gq，使得第二信使，例如，三磷酸肌醇或二酰甘油，可以代替cAMP的產(chǎn)生被測(cè)量到。
4.靶Gi偶聯(lián)的GPCR與信號(hào)增強(qiáng)劑Gs偶聯(lián)的GPCR的共轉(zhuǎn)染(基于cAMP的分析)Gi偶聯(lián)受體已知抑制腺苷酸環(huán)化酶，因此，降低cAMP的產(chǎn)量，其使得cAMP水平的評(píng)定具有挑戰(zhàn)性。在一些實(shí)施方案中，測(cè)量活化后顯示主要偶聯(lián)Gi的受體活化的cAMP產(chǎn)量降低的有效技術(shù)可以通過共轉(zhuǎn)染增強(qiáng)子與連接GPCR的Gi，所述增強(qiáng)子為例如活化后主要與Gs偶聯(lián)的非內(nèi)源性組成性活化的受體(如TSHR-A6231；參見以下)。顯而易見，活化的Gs偶聯(lián)受體可基于cAMP產(chǎn)量的增加進(jìn)行確定。Gi偶聯(lián)受體的活化引起cAMP產(chǎn)量的降低。因此，共轉(zhuǎn)染技術(shù)目的在于方便地利用這些“相對(duì)”作用。例如，非內(nèi)源性組成性活化的Gs偶聯(lián)受體(“信號(hào)增強(qiáng)子”)與單獨(dú)的表達(dá)載體的共轉(zhuǎn)染提供了基線的cAMP信號(hào)(即，雖然Gi偶聯(lián)受體將降低cAMP的量，但是這種“減少”將與由組成性活化的Gs偶聯(lián)的信號(hào)增強(qiáng)子引起的cAMP含量的顯著增加相關(guān))。接著帶有“靶受體”的信號(hào)增強(qiáng)劑與Gi偶聯(lián)的靶受體的反激動(dòng)劑的共轉(zhuǎn)染將增加測(cè)出的cAMP信號(hào)，同時(shí)Gi偶聯(lián)的靶受體的激動(dòng)劑將減少這種信號(hào)。
直接利用這種方法鑒定的候選化合物應(yīng)該獨(dú)立地進(jìn)行評(píng)價(jià)從而保證這些候選化合物并不靶向信號(hào)增強(qiáng)受體(其可以在篩選針對(duì)共轉(zhuǎn)移受體之前或之后進(jìn)行)。
C.藥物化學(xué)候選化合物本領(lǐng)域已知的任一分子可用來(lái)測(cè)試其調(diào)節(jié)(增加或減少)本發(fā)明GPCR活性的能力。為了鑒定節(jié)活性的化合物，候選化合物可直接提供給表達(dá)所述GPCR的細(xì)胞。
本發(fā)明的實(shí)施方案非常適合于篩選調(diào)節(jié)，例如，抑制、拮抗或刺激受體產(chǎn)量或者活性的化學(xué)分子文庫(kù)。化學(xué)文庫(kù)可以為肽文庫(kù)，肽模擬物文庫(kù)文庫(kù)，化學(xué)合成文庫(kù)，重組體，例如，噬菌體表達(dá)文庫(kù)，以及體外基于翻譯的文庫(kù)，其它非肽合成有機(jī)文庫(kù)等。本發(fā)明的實(shí)施方案非常適合于篩選含有生物材料的內(nèi)源性候選化合物，包含但不限制血漿及組織提取物，以及篩選已知具有生化活性的內(nèi)源性化合物文庫(kù)。
在一些實(shí)施方案中，與通過組合化學(xué)技術(shù)產(chǎn)生的化合物一起進(jìn)行候選化合物的直接鑒定，通過組合化學(xué)技術(shù)制備了用于這種分析的數(shù)以千計(jì)的化合物。候選化合物可為化學(xué)文庫(kù)的一個(gè)成員。所述化學(xué)文庫(kù)可包含任一數(shù)目的單獨(dú)成員，例如幾十至幾百至幾千至幾百萬(wàn)合適的化合物，例如，肽，類肽及其它寡化合物(環(huán)狀或直線)，及基于模板的小分子，例如苯并二氮雜，乙內(nèi)酰脲，雙芳香基，碳環(huán)及多環(huán)化合物(例如，萘，吩噻嗪，吖啶，類固醇等)，碳水化合物及氨基酸衍生物，二氫吡啶，二苯甲基以及雜環(huán)化合物(例如，trizine，吲哚，噻唑烷等)。引用的數(shù)目以及列舉的化合物類型是說明性的而非限制性的。優(yōu)選的化合物文庫(kù)包括低分子量的化合物以及可能的治療劑。
示范性的化學(xué)文庫(kù)可以從幾個(gè)來(lái)源市售獲得(ArQule，Tripos/PanLabs，ChemDesign，Pharmacopoeia)。在一些情況下，利用組合的策略產(chǎn)生這些化學(xué)文庫(kù)，所述組合策略將文庫(kù)每一成員的同一性編碼在附著了成員化合物的基質(zhì)上，從而可以直接以及間接鑒定作為有效調(diào)節(jié)物的分子。因此，在許多組合方法中，化合物平面上的位置具體指明化合物的成份。而且，在一個(gè)實(shí)施例中，一個(gè)單獨(dú)的平面位置可有1至20個(gè)化學(xué)物質(zhì)，其可通過施用于含有目標(biāo)相互作用的小孔篩選得到。因此，如果檢測(cè)到調(diào)節(jié)，可以分析反應(yīng)對(duì)的較小集合的調(diào)節(jié)活性。通過這種方法，可以篩選很多候選化合物。
許多適合使用的文庫(kù)是本領(lǐng)域已知的并且可用于提供根據(jù)本發(fā)明試驗(yàn)的化合物。或者，可以利用常規(guī)方法構(gòu)建文庫(kù)。此外，更一般地，也可以使用結(jié)構(gòu)性限制的有機(jī)多樣性(例如，非肽)文庫(kù)。例如，可以使用苯并二氮雜文庫(kù)(參見例如，Bunin等的，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 914708-4712)。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，組合化學(xué)可被用于鑒定本發(fā)明的GPCR調(diào)節(jié)物。組合化學(xué)能夠建立包含幾十萬(wàn)化合物的文庫(kù)，其中的很多可以結(jié)構(gòu)相似。同時(shí)，高通量篩選程序能夠篩選這些大量的文庫(kù)對(duì)已知靶的親合性，已經(jīng)開發(fā)了新的方法從而獲得較小尺寸但是最大化學(xué)多樣性的文庫(kù)。(參見例如，Matter，1997，Journal of MedicinalChemistry 401219-1229)。
一種組合化學(xué)方法，親和指紋分析，先前已被用來(lái)測(cè)試小分子的分散文庫(kù)對(duì)給定蛋白質(zhì)組的結(jié)合親合性。由掃描獲得的指紋被用于預(yù)測(cè)單獨(dú)的文庫(kù)成員對(duì)其它目的蛋白或者受體的親合性(在本發(fā)明中，本發(fā)明的受體)。所述指紋與從已知與目的蛋白反應(yīng)的其它化合物獲得的指紋比較以預(yù)測(cè)文庫(kù)化合物是否可以進(jìn)行類似的反應(yīng)。例如，不是測(cè)試大文庫(kù)中與復(fù)合物或蛋白質(zhì)成分相互作用的每一個(gè)配體，僅測(cè)試與已知具有所述活性的其它化合物具有指紋相似性的那些配體。(參見，Kauvar等人，1995，Chemistry and Biology 2107-118；Kauvar，1995，Affinity fingerprinting，Pharmaceutical Manufacturing International.825-28；及Kauvar，Toxic-Chemical Detection by Pattern Recognition inNew Frontiers in Agrochemical Immunoassay，D.Kurtz.L.Stanker及J.H.Skerritt.Editors，1995，AOACWashington，D.C.，305-312)。
被鑒定為調(diào)節(jié)物的候選化合物一般，這種掃描的結(jié)果將為有一致核結(jié)構(gòu)的化合物；因此這些化合物可圍繞優(yōu)選的核結(jié)構(gòu)進(jìn)行其它化學(xué)修飾從而進(jìn)一步加強(qiáng)其藥學(xué)特性。這種技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的，并且在本申請(qǐng)中將不再詳細(xì)描述。
在一些實(shí)施方案中，上述鑒定的調(diào)節(jié)物是可生物利用的。已經(jīng)開發(fā)了大量本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以使用的計(jì)算方法用于預(yù)測(cè)可口服生物利用的藥物[Ooms等人，Biochem Biophys Acta(2002)1587118-25；Claek & Grootenhuis，Cirr OpinDrug Discov Devel(2002)5382-90；Cheng等人，J Comput Chem(2002)23172-83；Norinder & Haeberein，Adv Drug Deliv Rev(2002)54291-313；Matter等人，Comb Chem HighThroughput Screen(2001)4453-75；Podlogar & Muegge，Curr Top MedChem(2001)1257-75；其中每一個(gè)公開物都在此處全部引入作為參考]。此外，陽(yáng)離子發(fā)射層析成像(PET)已被很多小組成功用于在口服施用藥物后的哺乳動(dòng)物體內(nèi)獲得藥物分布的直接測(cè)定，所述哺乳動(dòng)物包含非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物及人體[Noda等人，J.Nucl Med(2003)44105-8；Gulyas等人，Eur J Nucl Med Mol Imaging(2002)291031-8；Kanerva等人，Psychopharmacology(1999)14576-81；其中每一個(gè)公開物都在此處全部引入作為參考]。頁(yè)參見下面的實(shí)施例19。
D.藥物組合物本發(fā)明提供了通過給需要治療(或預(yù)防)的個(gè)體施用治療有效量的本發(fā)明調(diào)節(jié)物進(jìn)行治療(或預(yù)防)的方法[也參見，見PCT申請(qǐng)PCT/IB02/01461，國(guó)際公開號(hào)WO 02/066505，公開于2002年8月29日；其中每一個(gè)公開物都在此處全部引入作為參考]。在一個(gè)優(yōu)選的方面，調(diào)節(jié)物是純化的形式。個(gè)體優(yōu)選為動(dòng)物，包含但不限于諸如牛，豬，馬，雞，貓，狗，兔子，大鼠，小鼠，等，且優(yōu)選為哺乳動(dòng)物，且最優(yōu)選為人。
本發(fā)明的調(diào)節(jié)物可施用于非人類動(dòng)物[參見下面的實(shí)施例]及/或人，單獨(dú)的或藥用組合物的形式，在藥用組合物的情況下本發(fā)明的調(diào)節(jié)物與合適的載體或賦型劑利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)進(jìn)行混合。合適的藥用載體本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得；例如，參見Remington’sPharmacetical Sciences，16thEdition，1980，Marking Publishing Co.，(Oslo等人編)。
然后藥學(xué)或生理可接受的組合物以治療有效量提供。治療有效量是指調(diào)節(jié)物的量足以預(yù)防或者緩解缺血性心臟病癥狀或生理狀態(tài)，所述缺血性心臟病包含心肌梗塞，心肌梗塞后重建，及充血性心衰竭，所述劑量由本發(fā)明描述的方法說明性而非限制性的確定。在一些實(shí)施方案中，治療有效量是指調(diào)節(jié)物的量足以預(yù)防或者緩解心血管失調(diào)的癥狀或生理狀態(tài)，所述心血管失調(diào)包含降低心臟輸出，增加靜脈壓，所述劑量由本發(fā)明描述的方法說明性而非限制性的確定。在一些實(shí)施方案中，治療有效量是指調(diào)節(jié)物的量足以影響心血管功能的所需改變，所述心血管功能的改變包含減小心臟肥大，增加心臟射血量，降低心室容積，降低心肌細(xì)胞凋亡，所述劑量由本發(fā)明描述的方法說明性而非限制性的確定。很清楚，本發(fā)明的調(diào)節(jié)物可以單獨(dú)或者與其它藥用或者生理用化合物組合提供。其它用以治療本發(fā)明失調(diào)的化合物是本領(lǐng)域公知的。本發(fā)明的一個(gè)方面包含本發(fā)明公開的實(shí)施方案的應(yīng)用，進(jìn)一步包括一種或者多種選自如下的藥劑卡托普利(captopril)，馬來(lái)酸依那普利片(Enalapril Maleate)，lininopril，雷米普利(Ramipril)，perindopril，呋塞米(Furosemide)，托拉塞米(torasemide)，chlorothiazide，hydrochlorothiazide，amiloride hydrochloride，螺內(nèi)酯(spironolactone)，阿替洛爾(atenolol)，比索洛爾(bisoprolol)，carvedilol，metoprololtartrate，及地高辛(digoxin)。
在一些實(shí)施方案中，缺血性心臟病選自心肌梗塞，心肌梗塞后重建，及充血性心衰竭。在一些實(shí)施方案中，心肌失調(diào)選自降低心臟輸出及增加靜脈壓。在一些實(shí)施方案中，心血管功能的需要改變選自心臟肥大，心臟射血量增加，心室體積降低，及心肌細(xì)胞凋亡降低。
施用途徑合適的施用途徑包含利用本領(lǐng)域已知的方法口服，鼻，直腸，跨粘膜，或腸施用，非腸道輸送，包含肌內(nèi)，皮下，脊椎內(nèi)注射，以及鞘內(nèi)，直接心室內(nèi)，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，鼻內(nèi)，肺內(nèi)(吸入)或眼內(nèi)注射。其它尤其優(yōu)選的施用途徑為氣霧劑以及貯存制劑。本發(fā)明的藥劑的持續(xù)釋放劑型，尤其是貯存制劑很清楚被考慮在內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，施用途徑為口服。
成份/配方用于本發(fā)明的藥用或者生理用組合物核藥劑可以常規(guī)方式利用一種或者多種生理上可接受的載體包括賦型劑核助劑進(jìn)行配制。合適的制劑依賴于所選擇的施用途徑。
某些描述于此的藥劑將包含藥用或者生理用載體以及至少一種本發(fā)明的調(diào)節(jié)物。用以注射時(shí)，本發(fā)明的藥劑可制配置在水溶液中，優(yōu)選為生理用緩沖液中，諸如Hanks溶液，Ringer溶液，或生理鹽水緩沖液諸如磷酸或雙碳酸溶液。經(jīng)粘膜施用時(shí)，制劑中使用使用適合滲透屏障的滲透劑。這種滲透劑一般來(lái)說是本領(lǐng)域已知的。
可以口服的藥用或者生理用制劑包含由凝膠制成的推動(dòng)配合膠囊，由凝膠和諸如甘油或者山梨糖醇的增塑劑制成的軟的，密封膠囊。推動(dòng)配合膠囊可包含與填充劑如乳糖，粘合劑如淀粉，和/或潤(rùn)滑劑諸如滑石或硬脂酸鎂及任選的穩(wěn)定劑混合的活性成份。在軟膠囊中，活性成份可溶于或懸浮于合適的液體中，諸如脂肪油，液體石蠟，或液體聚乙二醇。另外，可添加穩(wěn)定劑。所有的口服制劑都應(yīng)該在適于口服的劑量。
口腔施用時(shí)，組合物可以采用傳統(tǒng)方式配制的片劑或者錠劑的劑型。
吸入施用時(shí)，本發(fā)明使用的化合物以從噴霧器中的壓縮團(tuán)氣霧劑噴射遞送的方式方便地遞送，所述噴霧器使用例如二氧化碳的氣體推進(jìn)劑。在壓縮氣霧劑的情況下，可以通過提供閥門遞送特定量確定劑量單位。用于吸入器或者吹藥器的膠囊及例如凝膠的藥筒可以配制成含有化合物以及諸如乳糖或者淀粉的合適粉末基體的粉末混合物。
化合物可被配制成通過注射，例如通過彈丸注射或者連續(xù)注射用于非腸道給藥。注射制劑可以單位劑量存在，例如在安瓿瓶或者多劑量的容器中，通式向其中添加防腐劑。組合物可以為水介質(zhì)的懸浮，溶液或乳化液的形式，并且可以含有諸如懸浮，穩(wěn)定和/或分散劑的制劑試劑。
非腸道給藥的藥用或者生理用制劑包括以水溶形式的活性化合物的水溶液。水溶懸浮液可包含增加懸浮液粘度的物質(zhì)，諸如羧甲基纖維素鈉，山梨糖醇或葡聚糖。任選地，懸浮液也可以含有合適的穩(wěn)定劑或者提高化合物溶解性從而制備高度濃縮溶液的試劑。
或者，活性成份可為粉末或凍干形式的成份以在使用前與合適的介質(zhì)，諸如無(wú)菌無(wú)熱原水混合。
除了上述的制劑外，化合物也可以配制成長(zhǎng)效制劑。這種長(zhǎng)效制劑可以通過植入(例如，皮下或肌內(nèi))或通過肌內(nèi)注射。因此，例如，化合物可以與合適的聚合物或疏水性材料(例如可接受油的乳化劑)或離子交換樹脂一起配制，或?yàn)槲⑷苎苌?，例如為微溶鹽。
在一個(gè)特別的實(shí)施方案中，化合物可經(jīng)由控制釋放系統(tǒng)遞送。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用泵(Langer，supra；Sefton，1987，CRCCrit.Ref.Biom.Eng.14201-240；Buchwald等，1980，Surgery 88507-516；Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321574-579)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可使用聚合材料(Medical Applications of Controlled Release，Langer andWise，eds.，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)lorida，1974；Controlled DrugBioavailability，Drug Product Design and Performance，S，molen和Ball編輯，Wiley，New York，1984；Ranger and Peppas，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361；Levy等，1985，J.Neurosurg.71858-863)。其它控制釋放系統(tǒng)由Langer論述在綜述中(1990，Science2491527-1533)。
另外，可以使用持續(xù)釋放系統(tǒng)遞送化合物，諸如包含治療劑的固體疏水聚合物的半滲透基質(zhì)。多種持續(xù)釋放材料已被建立并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。持續(xù)釋放膠囊可以，依賴于其化學(xué)性質(zhì)，釋放化合物幾周到超過100天。
依靠治療劑的化學(xué)性質(zhì)及生物穩(wěn)定性，可以使用穩(wěn)定調(diào)節(jié)物的其它策略。
藥學(xué)及生理學(xué)組合物也可以包含合適的固體或膠體相的載體或賦形劑。這種載體或賦形劑的例子包括，但不限于碳酸鈣，磷酸鈣，多種糖類，淀粉，纖維素衍生物，凝膠，以及諸如聚乙二醇的聚合物。
有效劑量適合本發(fā)明使用的藥學(xué)及生理學(xué)化合物包括其中含有可以實(shí)現(xiàn)治療目的的有效量活性成分的組合物。更具體的，治療有效量是指預(yù)防接受治療的受試者出現(xiàn)的癥狀發(fā)展或者緩解所述癥狀的有效量。有效量的確定是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，尤其是根據(jù)本發(fā)明提供的詳細(xì)公開。
對(duì)于用于本發(fā)明的任一化合物而言，治療有效劑量可最初由細(xì)胞培養(yǎng)分析進(jìn)行估計(jì)。例如，可以在動(dòng)物模型中配制劑量，以達(dá)到循環(huán)濃度范圍，其包含或含有顯示體外系統(tǒng)中保護(hù)細(xì)胞免于死亡的濃度點(diǎn)或范圍。[參見，下面的實(shí)施例的體外分析及體內(nèi)動(dòng)物模型。]這種信息可被用于更精準(zhǔn)地確定用于人體的劑量。
治療有效量是指使得患者的癥狀緩解的化合物的量。這種化合物的毒性及療效可由細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)藥理方法進(jìn)行確定，用于確定LD50(50％試驗(yàn)群的致死劑量)及ED50(50％試驗(yàn)群的治療有效劑量)確定。毒性與療效的劑量比為治療指數(shù)，且其可表示為L(zhǎng)D50與ED50的比。表現(xiàn)出高治療指數(shù)的化合物是優(yōu)選的。
從細(xì)胞培養(yǎng)物分析及動(dòng)物試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)可被用于配制用在人體的劑量范圍。這種化合物的劑量?jī)?yōu)選落在循環(huán)濃度范圍內(nèi)，所述循環(huán)濃度范圍包含少量或無(wú)毒性的ED50。劑量可以根據(jù)采用的劑型以及使用的給藥途徑在這個(gè)范圍內(nèi)改變。每個(gè)醫(yī)生可以根據(jù)病人的狀況選擇準(zhǔn)確的制劑，給藥途徑以及劑量。(見，F(xiàn)ingl等人，1975，“治療的藥學(xué)基礎(chǔ)(The Pharmacological Basis of Therapeutics)”第一章)。
劑量及間隔可以單獨(dú)調(diào)節(jié)從而使得提供的活性化合物的血漿濃度根據(jù)特定的狀態(tài)足以預(yù)防或者治療本發(fā)明所述的失調(diào)。需要獲得這些效果的劑量取決于個(gè)體特性及給藥途徑。
劑量間隔也可以利用最低有效濃度的值進(jìn)行確定?；衔飸?yīng)該利用保持血漿水平高于最低有效濃度10-90％倍，優(yōu)選30-99％之間，最優(yōu)選50-90％之間的給藥方案進(jìn)行施用。在局部給藥或者選擇性攝入的情況下，藥物的有效局部濃度可能不與血漿濃度相關(guān)。
組合物的施用量當(dāng)然取決于進(jìn)行治療的受試體，受試體的體重，病痛的嚴(yán)重性，給藥方式以及處方大夫大判斷。
本發(fā)明調(diào)節(jié)物量的優(yōu)選劑量范圍為0.1至100mg/kg體重，所述本發(fā)明調(diào)節(jié)物可以每日或者規(guī)律性施用達(dá)到需要的效果，包括但不限于預(yù)防或治療本發(fā)明所述的缺血性心臟病，預(yù)防或治療本發(fā)明所述的心血管失調(diào)，或者影響本發(fā)明所述的心血管功能所需的改變。其它優(yōu)選的劑量范圍為0.1至30mg/kg體重。其它優(yōu)選的劑量范圍為0.1至10mg/kg體重。其它優(yōu)選的劑量范圍為0.1至3.0mg/kg體重。當(dāng)然，這些每日劑量可以在一天的時(shí)間內(nèi)周期性小劑量的遞送或者施用。應(yīng)該注意這些劑量范圍僅僅是指優(yōu)選的范圍并且并不意味著是對(duì)本發(fā)明的限制。
E.治療方法本發(fā)明尤其涉及預(yù)防或治療缺血性心臟病，包含心肌梗塞，心肌梗塞后重建，以及充血性心衰竭的方法，包含給需要這種治療的個(gè)體提供本發(fā)明的調(diào)節(jié)物。本發(fā)明尤其涉及預(yù)防或治療心血管失調(diào)，包含降低心臟輸出及增加靜脈壓的方法，包含給需要這種治療的個(gè)體提供本發(fā)明的調(diào)節(jié)物。本發(fā)明還涉及影響心血管功能需要的改變，包含降低心臟肥大，增加心臟射血體積，降低心室提及，以及減少心肌細(xì)胞凋亡的方法，包含給需要這種治療的個(gè)體提供本發(fā)明的調(diào)節(jié)物。在一些實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)物為口服可生物利用的。在些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)物在藥用組合物中通過口服提供給個(gè)體。優(yōu)選地，個(gè)體為哺乳動(dòng)物，并且最優(yōu)選為人類。
F.其它應(yīng)用調(diào)節(jié)(增加，降低，或阻斷)心肌細(xì)胞保護(hù)的RUP41受體功能的試劑可通過將候選化合物與RUP41受體接觸并且確定候選化合物對(duì)RUP41受體功能的影響進(jìn)行鑒定。調(diào)節(jié)RUP41受體功能的化合物的選擇可以通過將其對(duì)RUP41受體的影響與其對(duì)其它受體的影響的比較進(jìn)行評(píng)價(jià)。在鑒定了調(diào)節(jié)RUP41受體功能的化合物后，這些候選化合物可以在其它分析中進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)，所述其它分析包括但不限于體內(nèi)模型，用以對(duì)它們活性進(jìn)行證實(shí)以及定量分析。RUP41受體功能的調(diào)節(jié)物可用于治療涉及正?；虍惓UP41受體功能的疾病及生理狀況。
調(diào)節(jié)(增加，降低，或阻斷)心臟保護(hù)的試劑可通過將候選化合物與RUP41受體接觸以及確定候選化合物對(duì)RUP41受體功能的影響進(jìn)行鑒定。在一些實(shí)施方案中，上述心臟保護(hù)包含預(yù)防或降低心肌細(xì)胞死亡。在一些實(shí)施方案中，所述心肌細(xì)胞死亡包含心肌細(xì)胞凋亡。在一些實(shí)施方案中，所述心臟保護(hù)包含保護(hù)心肌防止缺血。在一些實(shí)施方案中，所述心臟保護(hù)包含降低梗塞面積。在一些實(shí)施方案中，在一些實(shí)施方案中，所述心臟保護(hù)包含改善缺血后收縮性的恢復(fù)。在一些實(shí)施方案中，所述心臟保護(hù)包含抑制惡性缺血誘導(dǎo)的心律不齊。調(diào)節(jié)RUP41受體功能的化合物的選擇可以通過將其對(duì)RUP41受體的影響與其對(duì)其它受體的影響的比較進(jìn)行評(píng)價(jià)。在鑒定了調(diào)節(jié)RUP41受體功能的化合物后，這些候選化合物可以在其它分析中進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)，所述其它分析包括但不限于體內(nèi)模型，用以對(duì)它們活性進(jìn)行證實(shí)以及定量分析。RUP41受體功能的調(diào)節(jié)物可用于治療涉及正常或異常RUP41受體功能的疾病及生理狀況。
本發(fā)明還涉及被鑒定為RUP41的調(diào)節(jié)物或者配體的本發(fā)明化合物的同位素標(biāo)記形式，其不僅可用于放射性顯影[見Lemstra等人，Gerontology(2003)4955-60；Myers等人，JPsychopharmacol(1999)13352-7；其公開物在此處全部引入作為參考]，而且還可以用于體外核體內(nèi)分析中，用于將RUP41在組織樣品中，包括人類的組織樣品中定位以及定量分析，并且用以通過抑制同位素標(biāo)記的化合物的結(jié)合鑒定RUP41配體。本發(fā)明進(jìn)一步的目的是開發(fā)包含這種同位素標(biāo)記化合物的新的RUP41分析方法。通過舉例而非限制的方式，可以想象通過放射性顯影觀察到的RUP41可以鑒定一個(gè)個(gè)體具有發(fā)展成缺血性心臟病的危險(xiǎn)，所述缺血性心臟病包含心肌梗塞，心肌梗塞后重建以及充血性心衰竭。
本發(fā)明包含被鑒定為RUP41調(diào)節(jié)物或配體的本發(fā)明化合物的放射性同位素的形式。
在一些實(shí)施方案中，放射線同位素標(biāo)記形式的化合物與所述化合物相同，但是實(shí)際上一個(gè)或者多個(gè)原子被原子質(zhì)量或者質(zhì)量數(shù)與通常天然發(fā)現(xiàn)(即，天然存在)的原子的原子質(zhì)量或者質(zhì)量數(shù)不同的原子替換或者取代?？蓳饺氡景l(fā)明化合物的合適的放射性核素包括但不限于2H(氘)，3H(氚)，11C，13C，14C，13N，15N，15O，17O，18O，18F，35S，36Cl，82Br，75Br，76Br，77Br，123I，124I，125I，及131I。摻入本發(fā)明的放射性標(biāo)記的化合物的放射性核素將依賴于放射性標(biāo)記的化合物的具體應(yīng)用。例如，對(duì)于體外RUP41標(biāo)記及競(jìng)爭(zhēng)分析而言，摻入3H，14C，82Br，125I，131I，35S的化合物通常是最有用的。對(duì)于放射性顯影應(yīng)用而言，11C，18F，125I，123I，124I，131I，75Br，76Br，或77Br通常是最有用的。在一些實(shí)施方案中，放射性核素選自3H，11C，18F，14C，125I，124I，131I，35S及82Br。
將放射同位素?fù)饺胗袡C(jī)化合物的合成方法可應(yīng)用于本發(fā)明的化合物并且為本領(lǐng)域所公知。這些合成方法，例如，將將活性水平的氚摻入靶分子，如下所述A.用氚氣催化還原-此過程一般產(chǎn)生特異性活性產(chǎn)品并且需要鹵化或不飽和前體。
B.用硼氫化鈉[3H]還原-此過程非常便宜并且需要含有可還原官能團(tuán)的前體，諸如醛，酮，內(nèi)酯，酯類等。
C.用氫化鋰鋁[3H]還原-此過程提供理論上特異性活性的產(chǎn)品。其也需要含有可還原官能團(tuán)的前體，諸如醛，酮，內(nèi)酯，酯類等。
D.氚氣暴露標(biāo)記-此過程包含在存在合適催化劑的條件下將含有可交換質(zhì)子的前體暴露于氚氣。
E.使用甲基碘[3H]進(jìn)行N-甲基化-此過程一般被用來(lái)通過用高特異性活化的甲基碘(3H)處理合適的前體制備O-甲基或N-甲基(3H)產(chǎn)物。此方法一般允許較高特異性的活性，如例如，約70至90Ci/mmol。
將活性水平的125I摻入靶分子的合成方法包括A.Sandmeyer及相似反應(yīng)-此過程將芳基或雜芳基胺轉(zhuǎn)化成重氮鹽，諸如四氟硼酸鹽，且隨后利用Na125I轉(zhuǎn)化成125I標(biāo)記的化合物。一種典型的過程由Zhu，D，-G.及其合作者公開于J.Org.Chem.2002，67，943-948中。
B.酚的鄰位125I化作用-此過程允許125I摻入酚的鄰位，如Collier，T.L.及其合作者公開于J.Labeled Compd Radiopharm.1999，42，S264-S266中。
C.芳基或雜芳基溴化物的125I交換-此方法一般為2個(gè)步驟。第一步驟為利用例如，Pd催化的反應(yīng)[即，Pd(Ph3P)4]或通過芳基或雜芳基鋰，在鹵化三烷基錫或六烷基二錫[如(CH3)3SnSn(CH3)3]存在下將芳基或雜芳基溴化物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的三烷基錫中間物。代表性過程由Bas，M.-D.及其合作者報(bào)道于J.Labeled Compd Radiopharm.2001，44，S280-S282中。
在一些實(shí)施方案中，放射性同位素標(biāo)記的化合物與所述化合物相同，除了添加一個(gè)或者多個(gè)含有放射性核素的取代基。在一些進(jìn)一步的實(shí)施方案中，化合物為多肽。在一些更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，化合物為抗體或其抗原結(jié)合片段。在一些更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述抗體為單克隆抗體。上述合適的放射性核素包括但不限于2H(氘)，3H(氚)，11C，13C，14C，13N，15N，15O，17O，18O，18F，35S，36Cl，82Br，75Br，76Br，77Br，123I，124I，125I，及131I。摻入本發(fā)明列舉的放射性標(biāo)記的化合物的放射性核素將依賴于放射性標(biāo)記的化合物的具體應(yīng)用。例如，對(duì)于RUP41標(biāo)記以及競(jìng)爭(zhēng)分析而言，摻入3H，14C，82Br，125I，131I，35S的化合物通常最有用。對(duì)于放射性顯影應(yīng)用而言，11C，18F，125I，123I，124I，131I，75Br，76Br，或77Br通常是最有用的。在一些實(shí)施方案中，放射性核素選自3H，11C，18F，14C，125I，124I，131I，35S及82Br。
添加一種或多種包含放射性核素的取代基的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并且包括但不限于通過酶促法[Marchalonic JJ，BiochemicalJournal(1969)113299-305；Thorell JI and Jahansson BG，Biochimica etBiophysica Acta(1969)251363-9；每個(gè)公開物全部在此處引入作為參考]，以及或者通過氯胺-T/Iodogen/Iodobead法[Hunter WM andGreenwood FC，Nature(1962)194495-6；Greenwood FC等，BiochemicalJournal(1963)89114-23；每個(gè)公開物全部在此處引入作為參考]添加放射性同位素碘。
所公開的受體和方法的其它應(yīng)用尤其是基于本專利文獻(xiàn)的綜述對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
實(shí)施例下列實(shí)施例為說明目的，并且并不限制本發(fā)明。雖然本發(fā)明公開了具體的核酸及氨基酸序列，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該有能力對(duì)這些序列進(jìn)行微小的修飾同時(shí)達(dá)到與下面報(bào)道的相同或大致上相同的結(jié)果。本發(fā)明公開的突變方法不依賴于這種方法而是基于一種算法以及與位于人類GPCRS的TM6區(qū)內(nèi)的保守脯氨酸殘基的位置距離。一旦這種方法是安全的，本領(lǐng)域技術(shù)人員就應(yīng)該有能力對(duì)其進(jìn)行微小修飾達(dá)到與本發(fā)明公開的大致上相同的結(jié)果(即，組成性活性)。這種修飾方法在本發(fā)明公開的范圍內(nèi)。
下列的提供是為了說明的目的并且并不意味著是一種限制。本領(lǐng)域的一個(gè)普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所公開的內(nèi)容可以設(shè)計(jì)同樣的分析和方法，所有構(gòu)成了本發(fā)明的一部分。雖然對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言可以采用多種表達(dá)載體，但是為了利用內(nèi)源性和非內(nèi)源性GPCRs利用的目的，在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選采用的載體為pCMV。這種載體在1998年10月13日保藏在用于專利目的的布達(dá)佩斯條約承認(rèn)的生物材料樣品國(guó)際保藏單位美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(10801 UniversityBlvd.，Manassas，VA 20110-2209 USA)。由ATCC測(cè)試DNA并且確定且可執(zhí)行確定。ATCC指定了下列的保藏編號(hào)pCMVATCC#203351。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選采用腺病毒表達(dá)載體。
與本發(fā)明主題相關(guān)并且是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的重組DNA技術(shù)參見Maniatis等人的，Molcular CloningA Laboratiry Manual(1989)Cold Spring Harbor Laboratory；美國(guó)專利6,399,373；以及PCT申請(qǐng)PCT/IB02/01464，公開于2002年8月29日，公開號(hào)WO/02/066506；其中每個(gè)的公開內(nèi)容在此處全部引入作為參考。
實(shí)施例1內(nèi)源性人類RUP41的全長(zhǎng)克隆本發(fā)明公開的RUP41是基于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的信息進(jìn)行鑒定的。當(dāng)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，登錄號(hào)為U66581的cDMA克隆被鑒定為7號(hào)染色體的人基因組序列。全長(zhǎng)RUP4通過使用下列引物以及人基因組DNA作為模板的PCR進(jìn)行克隆5’-TCCCCCGGGAAAAAAACCAACTGCTCCAAA-3’(SEQ IDNO7；正義)5’-TAGGATCCATTTGAATGTGGATTTGGTGAAA-3’(SEQ IDNO8；反以，包含BamHI位點(diǎn))。
使用帶有由廠商提供的緩沖系統(tǒng)的rTth聚合酶(Perkin Elmer)，0.25mM的每種引物以及0.2mM的每一種的4種核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增。循環(huán)條件為94℃，1分鐘，50℃，1分鐘，及72℃，1.5分鐘，共30個(gè)循環(huán)。5’PCR引物用激酶作用并且用BamHI酶解1.38kb的PCR片段并克隆到pCMV表達(dá)載體的EcoRV-BamHI位點(diǎn)。參見核酸序列SEQ IDNO1推測(cè)的氨基酸序列SEQ ID NO2。
實(shí)施例二制備非內(nèi)源性，組成性活化的人類RUP41本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該能夠選擇突變核酸序列的技術(shù)。下面顯示的是用于產(chǎn)生人GPCRs非內(nèi)源性形式的技術(shù)。下面顯示的RUP41的突變是基于一種算法，通過該方法從保守脯氨酸(或其內(nèi)源性的保守取代物)殘基(位于GPCR的TM6區(qū)，接近TM6/IC3的界面)的第16個(gè)氨基酸(位于GPCR的IC3區(qū))突變，優(yōu)選突變?yōu)楸彼幔M氨酸，精氨酸或賴氨酸殘基，最優(yōu)選突變?yōu)橘嚢彼釟埢?br> 非內(nèi)源性組成性活化的全長(zhǎng)人RUP41位于SEQ ID NO2或SEQID NO3的312位的苯丙氨酸殘基突變?yōu)橘嚢彼?F312K)實(shí)現(xiàn)。
1.轉(zhuǎn)化位點(diǎn)-DirectedTM誘變制備非內(nèi)源性人GPCRs可以通過根據(jù)說明書使用轉(zhuǎn)化位點(diǎn)-DirectedTM誘變?cè)噭┖?Clontech)在人CPGRs的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)。使用兩種誘變引物，最優(yōu)選為產(chǎn)生賴氨酸突變的賴氨酸誘變寡核苷酸，以及選擇標(biāo)記寡核苷酸。為了方便起見，以常規(guī)的形式將密碼子突變引入人GPCR。
2.QuikChangeTM位點(diǎn)-DirectedTM誘變也可以通過使用QuikChangeTMSite-DirectedTM誘變?cè)噭┖?Stratagene，根據(jù)說明書)實(shí)現(xiàn)非內(nèi)源性人GPCRs的制備。優(yōu)選內(nèi)源性GPCR作為模板并且采用兩個(gè)誘變引物，以及最優(yōu)選的賴氨酸誘變寡核苷酸以及選擇性標(biāo)記寡核苷酸(包含于試劑盒中)。為了方便起見，以常規(guī)的形式摻入新的人GPCR的密碼子突變以及單獨(dú)的寡核苷酸。實(shí)施例3
受體表達(dá)雖然本領(lǐng)域有多種細(xì)胞可用于表達(dá)蛋白，但是最優(yōu)選采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞或者黑色素細(xì)胞。主要原因是根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行的預(yù)測(cè)，即，利用例如酵母細(xì)胞表達(dá)GPCR，雖然可以向所述試驗(yàn)流程中引入可能不(實(shí)際上在酵母中不)包括哺乳動(dòng)物系統(tǒng)演化的受體偶聯(lián)，遺傳機(jī)制以及分泌途徑的非哺乳動(dòng)物細(xì)胞，而且從非哺乳動(dòng)物細(xì)胞獲得的結(jié)果，雖然可能有用，但是不如從哺乳動(dòng)物細(xì)胞或者黑色素細(xì)胞獲得的優(yōu)選。雖然所使用的具體哺乳動(dòng)物細(xì)胞的預(yù)測(cè)依賴于技術(shù)人員的具體需要，但是哺乳動(dòng)物細(xì)胞CHO，COS-7，293，及293T尤其優(yōu)選。參見下列有關(guān)黑色素細(xì)胞，包含實(shí)施例8。
a.瞬間轉(zhuǎn)染在第一天，以6×106/10cm平皿將293細(xì)胞鋪板。第二天，制備兩個(gè)反應(yīng)試管(每個(gè)試管后的比例為每個(gè)平板)試管A由將4μg DNA(例如，pCMV載體；帶有受體cDNA的pCMV載體，等)混合在0.5ml的無(wú)血清DMEM(Gibco BRL)中進(jìn)行制備；試管B由將24μg脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(Gibco BRL)混合于0.5ml的無(wú)血清DMEM中進(jìn)行制備。試管A及B通過倒置(數(shù)次)進(jìn)行混合，隨后在室溫下培養(yǎng)30至45分鐘。混合物被稱作“轉(zhuǎn)染混合物”。鋪板的293細(xì)胞用1×PBS清洗，隨后添加5ml的無(wú)血清DMEM。將1ml的轉(zhuǎn)染混合物添加至細(xì)胞，然后在37℃/5％CO2下培養(yǎng)4小時(shí)。轉(zhuǎn)染混合物通過抽吸除去，隨后添加10ml的DMEM/10％胎牛血清。細(xì)胞在37℃/5％CO2下培養(yǎng)。在培養(yǎng)48小時(shí)后，收集細(xì)胞并用于分析。
b.穩(wěn)定的細(xì)胞系約12×106的293細(xì)胞在15cm的組織培養(yǎng)皿上鋪板。在韓10％胎牛血清和1％丙酮酸鈉，L-谷氨酰胺和抗生素的DME高葡萄糖培養(yǎng)基。293細(xì)胞鋪板后24小時(shí)(或～80％的鋪滿率)，利用12μg的DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。12μg的DNA與60μl的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑和2的無(wú)血清DME高葡萄糖培養(yǎng)基混合。從平皿抽吸培養(yǎng)基，且用無(wú)血清的培養(yǎng)基清洗細(xì)胞一次。將DNA，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑和培養(yǎng)基混合物連同10ml無(wú)血清培養(yǎng)基添加平皿中。隨后在37℃培養(yǎng)4至5小時(shí)，抽吸培養(yǎng)基并且添加25ml的含血清培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，再次抽吸培養(yǎng)基，并且添加帶有血清的新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，抽吸培養(yǎng)基并且添加含有終濃度為500μm/ml的遺傳霉素(G418藥物)的含血清培養(yǎng)基。選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中含有G418抗性基因的陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞。進(jìn)行選擇時(shí)，每4到5天更換一次培養(yǎng)基。在選擇期間，細(xì)胞生長(zhǎng)形成穩(wěn)定的集合，或者分裂用于穩(wěn)定的克隆選擇。
實(shí)施例4用于確定GPCR活化的分析多種方法用于評(píng)估人GPCRs的活化。下面列舉的是說明性的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該能夠優(yōu)選地對(duì)于技術(shù)人員的需要有益的那些技術(shù)。
1.細(xì)胞膜結(jié)合分析[35S]GTPγS分析當(dāng)G蛋白偶聯(lián)受體在其活化狀態(tài)，如由于配體結(jié)合或組成性活化，受體偶聯(lián)G蛋白并且刺激GDP的釋放以及隨后GTP與G蛋白的結(jié)合。G蛋白受體復(fù)合物的α亞基起GTPase的作用并且緩慢水解GTP至GDP，在這點(diǎn)時(shí)通常受體失活。活化的受體繼續(xù)將GDP轉(zhuǎn)換成GTP。非水解的GTP類似物，[35S]GTPγS，可被用來(lái)證實(shí)[35S]GTPγS與表達(dá)活性受體的膜的增強(qiáng)結(jié)合。使用[35S]GTPγS結(jié)合來(lái)測(cè)量活化的優(yōu)點(diǎn)在于(a)其一般可應(yīng)用與全部G蛋白偶聯(lián)受體；(b)其靠近膜表面使其不可能挑選影響細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)的分子。
此分析利用G蛋白偶聯(lián)受體刺激[35S]GTPγS結(jié)合表達(dá)相關(guān)受體的膜。因此，此分析可用于直接鑒定方法從而篩選內(nèi)源性GPCRs及非內(nèi)源性，組成性活化的GPCRs的候選化合物。此分析是通用的，并且可用于所有G蛋白偶聯(lián)受體的藥物發(fā)現(xiàn)。
GTPγS分析為培養(yǎng)于20mM HEPES及1至20mM氯化鎂中(可調(diào)節(jié)此量?jī)?yōu)化結(jié)果，雖然20mM是優(yōu)選的)pH7.4，約0.3至約1.2nM[35S]GTPγS之間的結(jié)合緩沖液(可調(diào)節(jié)此量?jī)?yōu)化結(jié)果，雖然1.2是優(yōu)選的)，及12.5至75μg的膜蛋白(可調(diào)節(jié)此量?jī)?yōu)化結(jié)果)及10μMGDP(可調(diào)節(jié)此量?jī)?yōu)化結(jié)果)1小時(shí)。然后加入麥芽凝集素粒(25μl；Amersham)且在室溫培養(yǎng)混合物30分鐘。然后將試管1500×g，室溫下離心5分鐘，且在閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。
2.腺甘酸環(huán)化酶設(shè)計(jì)用于基于細(xì)胞分析的Flash PlateTM腺甘酸環(huán)化酶試劑盒(NewEngland Nuclear；Cat.NO.SMP004A)可以進(jìn)行修飾用于粗原生質(zhì)膜的分析。Flash Plate微孔中可包含一閃爍覆蓋層其亦包含特異性抗體識(shí)別的cAMP。微孔中產(chǎn)生的cAMP可通過直接競(jìng)爭(zhēng)放射性cAMP指示劑與cAMP抗體的結(jié)合進(jìn)行定量。隨后提供的是測(cè)定表達(dá)受體的全細(xì)胞中cAMP水平改變的簡(jiǎn)要方案。
在瞬間轉(zhuǎn)染后24小時(shí)收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。小心抽移培養(yǎng)基且丟棄。10毫升PBS緩慢添加至細(xì)胞的每一平皿中，然后小心抽吸。向每一微孔板中添加1ml的Sigma細(xì)胞裂解緩沖液及3毫升的PBS。從微孔板移出細(xì)胞并將細(xì)胞懸浮液收集于50毫升的圓錐形離心管中。接著細(xì)胞在室溫下以1,100rpm離心5分鐘。將細(xì)胞沉淀小心再懸浮于合適體積的PBS中(約3毫升/板)。然后利用血球計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，并且添加另外的PBS得到合適數(shù)量的細(xì)胞(最終體積為約50μl/孔)。
制備cAMP標(biāo)準(zhǔn)以及檢測(cè)緩沖液[含有1μCi指示劑125I cAMP(50μl)到11ml檢測(cè)緩沖液]并且根據(jù)廠家的說明書進(jìn)行保存。制備新鮮的分析緩沖液用于篩選并且含有50μl激化緩沖液，3μl試驗(yàn)化合物(12μM終分析濃度)以及50μl的細(xì)胞，將分析緩沖液儲(chǔ)藏在冰上直至使用。通過向適當(dāng)?shù)奈⒖字刑砑?0μl的cAMP標(biāo)準(zhǔn)，然后向微孔H-11以及H12中添加50μl的PBSA起始分析。將50μl的激化緩沖液添加到所有的微孔中。利用能夠分配3μl化合物溶液的針型工具將DMSO(或選擇的候選者化合物)添加到適當(dāng)?shù)奈⒖字校K分析濃度為12μM試驗(yàn)化合物以及100μl的總分析體積。然后將細(xì)胞添加至微孔且在室溫下溫育60分鐘。然后將含有指示劑cAMP的100μl的檢測(cè)混合物添加至微孔。然后另外溫育板2小時(shí)然后在Wallac MicroBeta閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。然后從標(biāo)準(zhǔn)cAMP曲線推斷每微孔cAMP的值，所述標(biāo)準(zhǔn)cAMP包含在每個(gè)分析板中。
3.基于細(xì)胞的cAMP用于Gi偶聯(lián)的靶GPCRsTSHR為Gs偶聯(lián)GPCR，其引起cAMP在激活后的累積。通過突變氨基酸殘基623(即，將丙氨酸殘基改變?yōu)楫惲涟彼釟埢?組成型激活TSHR。預(yù)計(jì)Gi偶聯(lián)的受體抑制腺苷酸環(huán)化酶，并且因此減少cAMP的產(chǎn)生水平，從而可以進(jìn)行cAMP水平攻擊的估計(jì)。用于測(cè)定作為Gi偶聯(lián)的受體組成性激活指示的cAMP產(chǎn)生減少的有效技術(shù)可以通過共-轉(zhuǎn)染，最優(yōu)選地非-內(nèi)源性組成型活化的TSHR(TSHR-A623I)(或內(nèi)源性的組成型活化的Gs偶聯(lián)的受體)作為“信號(hào)增強(qiáng)劑”，用Gi連接的靶GPCR建立cAMP的基線水平進(jìn)行。在產(chǎn)生Gi偶聯(lián)受體的非-內(nèi)源性形式后，然后與信號(hào)增強(qiáng)劑共轉(zhuǎn)染靶GPCR的非-內(nèi)源性形式，并且它為可用于篩選的物質(zhì)。當(dāng)使用cAMP分析時(shí)，我們將利用這種方法有效地產(chǎn)生信號(hào)；這種方法優(yōu)選用于抗Gi偶聯(lián)受體的候選化合物的直接鑒定。人們注意到當(dāng)使用這種方法時(shí)，靶GPCR的反激動(dòng)劑，Gi偶聯(lián)的GPCR將增加cAMP信號(hào)并且激動(dòng)劑將減少cAMP信號(hào)。
在第一天，將293細(xì)胞以2×104/微孔進(jìn)行鋪板。第二天，制備兩個(gè)反應(yīng)試管(每個(gè)試管后的比例為每個(gè)平板)試管A由將2μg的轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞的每種受體的DNA，總共4μg的DNA[例如，pCMV載體；帶有突變的THSR(THSR-A623I)的pCMV載體；THSR-A623I和GPCR等受體cDNA的pCMV載體，等]混合在1.2ml的無(wú)血清DMEM(Gibco BRL)中進(jìn)行制備；試管B由將120μg脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(GibcoBRL)混合于1.2ml的無(wú)血清DMEM中進(jìn)行制備。然后試管A及B通過倒置(數(shù)次)進(jìn)行混合，隨后在室溫下培養(yǎng)30至45分鐘?；旌衔锉环Q作“轉(zhuǎn)染混合物”。鋪板的293細(xì)胞用1XPBS清洗，隨后添加10ml的無(wú)血清DMEM。然后將2.4ml的轉(zhuǎn)染混合物添加至細(xì)胞，然后在37℃/5％CO2下培養(yǎng)4小時(shí)。轉(zhuǎn)染混合物通過抽吸除去，隨后添加25ml的DMEM/10％胎牛血清。細(xì)胞在37℃/5％CO2下培養(yǎng)。在培養(yǎng)24小時(shí)后，收集細(xì)胞并用于分析。
設(shè)計(jì)用于基于細(xì)胞分析的Flash PlateTM腺甘酸環(huán)化酶試劑盒(NewEngland Nuclear；Cat.NO.SMP004A)卻可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的需要進(jìn)行修飾用于粗原生質(zhì)膜的分析。FlashPlate微孔中可包含一閃爍覆蓋層其亦包含特異性抗體識(shí)別的cAMP。微孔中產(chǎn)生的cAMP可通過直接競(jìng)爭(zhēng)放射性cAMP指示劑與cAMP抗體的結(jié)合進(jìn)行定量。隨后提供的是測(cè)定表達(dá)受體的全細(xì)胞中cAMP水平改變的簡(jiǎn)要方案。
在瞬間轉(zhuǎn)染后24小時(shí)收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。小心抽移培養(yǎng)基且丟棄。10毫升PBS緩慢添加至細(xì)胞的每一平皿中，然后小心抽吸。向每一微孔板中添加1ml的Sigma細(xì)胞裂解緩沖液及3毫升的PBS。從微孔板移出細(xì)胞并將細(xì)胞懸浮液收集于50毫升的圓錐形離心管中。接著細(xì)胞在室溫下以1,100rpm離心5分鐘。將細(xì)胞沉淀小心再懸浮于合適體積的PBS中(約3毫升/板)。然后利用血球計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，并且添加另外的PBS得到合適數(shù)量的細(xì)胞(最終體積為約50μl/孔)。
制備cAMP標(biāo)準(zhǔn)以及檢測(cè)緩沖液[含有1μCi指示劑125I cAMP(50μl)到11ml檢測(cè)緩沖液]并且根據(jù)廠家的說明書進(jìn)行保存。制備新鮮的分析緩沖液用于掃描并且含有50μl激化緩沖液，3μl試驗(yàn)化合物(12μM終分析濃度)以及50μl的細(xì)胞，將分析緩沖液儲(chǔ)藏在冰上直至使用。通過向適當(dāng)?shù)奈⒖字刑砑?0μl的cAMP標(biāo)準(zhǔn)，然后向微孔H-11以及H12中添加50μl的PBSA起始分析。將50μl的激化緩沖液添加到所有的微孔中。利用能夠分配3μl化合物溶液的針型工具將DMSO(或選擇的候選者化合物)添加適當(dāng)?shù)奈⒖字?，終分析濃度為12μM試驗(yàn)化合物以及100μl的總分析體積。然后將細(xì)胞添加至微孔且在室溫下溫育60分鐘。然后將含有指示劑cAMP的100μl的檢測(cè)混合物添加至微孔。然后另外溫育板2小時(shí)然后在Wallac MicroBeta閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)。然后從標(biāo)準(zhǔn)cAMP曲線推斷每微孔cAMP的值，所述標(biāo)準(zhǔn)cAMP包含在每個(gè)分析板中。
4.基于報(bào)告基因的分析Reporter-Based Assaysa.CRE-LUC報(bào)告基因的分析分析(Gs-相關(guān)受體)293和293T細(xì)胞以2×104個(gè)細(xì)胞/微孔的密度在96孔板上鋪板，并且在第二天利用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑(BRL)根據(jù)廠家的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。如下所述為每個(gè)6-孔轉(zhuǎn)染制備DNA/脂質(zhì)混合物260ng的質(zhì)粒DNA的100μl DMEM溶液與2μl的脂質(zhì)的100μl DMEM溶液(由200ng的8xCRE-Luc報(bào)告質(zhì)粒，50ng含有內(nèi)源性受體或者非內(nèi)源性受體或者單獨(dú)的pCMV的pCMV，以及10ng的GPRS表達(dá)質(zhì)粒(GPRS于pcDNA3中(Invitrogen)構(gòu)成的260ng的質(zhì)粒DNA)混合。8XCRE-Luc報(bào)告質(zhì)粒制備如下通過將大鼠抑生長(zhǎng)素啟動(dòng)子(-71/+51)克隆在pβgal-Basic載體(Clontech)的BglV-HindIII位點(diǎn)獲得載體SRIF-β-gal。通過從腺病毒模板AdpCF126CCRE8(參見，7 Human Gene Therapy1883(1996))進(jìn)行PCR獲得8個(gè)拷貝的cAMP應(yīng)答元件，并且克隆到SRIF-β-gal載體的Kpn-BglV位點(diǎn)，產(chǎn)生8xCRE-β-gal報(bào)告載體。通過用從pGL3-basic載體(Promega)獲得的熒光素酶基因在HindIII-BamHI位點(diǎn)替換8xCRE-β-gal報(bào)告載體的β-半乳糖苷酶基因產(chǎn)生8xCRE-Luc報(bào)告質(zhì)粒。30分鐘后，在室溫下溫育，用400μl的DMEM稀釋DNA/脂質(zhì)混合物，并且將100μl的稀釋的混合物添加至每個(gè)微孔中。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)后，將帶有10％FCS的100μl的DMEM添加至每個(gè)微孔中。第二天，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞更換帶有10％FCS的200μl/微孔的DMEM。8小時(shí)后，用PBS沖洗后，微孔轉(zhuǎn)變?yōu)椴粠Х蛹t的100μl/微孔的DMEM。利用LucLiteTM報(bào)告基因分析試劑盒(Packard)根據(jù)廠家的說明書在第二天測(cè)定熒光素酶的活性，并且在1450 MicroBetaTM閃爍和熒光計(jì)數(shù)器上讀數(shù)(Wallac)。
b.AP1報(bào)告基因分析(Gq-相關(guān)受體)檢測(cè)Gq激活的方法取決于Gq-依賴的磷脂酶C引起在其啟動(dòng)中含有AP1元件基因的激活的已知特性。PathdetectTMAP-1順式-報(bào)告系統(tǒng)(Stratagene，Catalogue#219073)可根據(jù)上述方案參考CREB報(bào)告基因分析進(jìn)行利用，除了磷酸鈣沉淀的成分為410ng的pAP1-Luc，80ngpCMV-受體表達(dá)質(zhì)粒以及20ng的CMV-SEAP。
c.SRF-LUC報(bào)告基因分析(Gq-相關(guān)受體)檢測(cè)Gq激活的方法取決于Gq-依賴的磷脂酶C引起在其啟動(dòng)中含有血清效應(yīng)因子基因的激活的已知特性。PathdetectTMSRF-Luc報(bào)告系統(tǒng)(Stratagene)可用于分析例如COS7細(xì)胞中Gq偶聯(lián)活性。利用哺乳動(dòng)物TransfectionTM試劑盒(Stratagene，目錄#_200285)根據(jù)廠家的說明書，用系統(tǒng)的質(zhì)粒組分以及顯示的編碼內(nèi)源性或非-內(nèi)源性GPCR的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。B簡(jiǎn)言之，根據(jù)每個(gè)廠家的說明書，將410ng的SRF-Luc，80ng的pCMV-受體表達(dá)質(zhì)粒以及20ng的CMV-SEAP(分泌的堿性磷酸酶表達(dá)質(zhì)粒；在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中測(cè)定堿性磷酸酶活性以調(diào)節(jié)樣品之間轉(zhuǎn)染率的變化)組合在磷酸鈣沉淀中。一半的沉淀均等分配在96-微孔板中的3個(gè)微孔上，將細(xì)胞保存在不含血漿的培養(yǎng)基中24小時(shí)。最后5小時(shí)，細(xì)胞用1μM的血管緊張素溫育，如圖所示。然后溶解細(xì)胞并且根據(jù)廠家的說明書，利用LucliteTM試劑盒(Packard，Cat.#6016911)以及“Trilux 1450 Microbeta液體閃爍以及發(fā)光計(jì)數(shù)器(Wallac)”分析熒光素酶活性?？衫肎raphPad PrismTM2.0a(GraphPad Software公司)分析數(shù)據(jù)。
細(xì)胞內(nèi)IP3累積分析(Gq-相關(guān)的受體)在第一天，含有受體(內(nèi)源性的和/或非-內(nèi)源性的)的細(xì)胞可以鋪板在24微孔板上，通常密度為1×105個(gè)細(xì)胞/微孔(盡管紅棕色可以最佳化。第二天，可以通過首先將0.25μg的DNA混合在50μl的不含血漿的DMEM/微孔以及2μl脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑的50μl不含血清的DMEM/微孔中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。輕輕地混合溶液并且在室溫下溫育15-30分鐘。用0.5ml的細(xì)胞PBS清洗并且將400μl不含血漿的培養(yǎng)基與轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基混合并添加至細(xì)胞。然后將細(xì)胞在37℃/5％CO2溫育3-4小時(shí)然后除去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基并用1ml/微孔的正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基替換。第三天用3H-肌醇標(biāo)記細(xì)胞。簡(jiǎn)要地，除去培養(yǎng)基并且用0.5ml的PBS清洗細(xì)胞。接著將0.5毫升不含肌醇/不含血清的培養(yǎng)基(GIBCO BRL)添加至含有0.25μCi的3H-myo-肌醇/孔的每個(gè)微孔中，且細(xì)胞在37℃/5％CO2下培養(yǎng)16至18小時(shí)。第四天，細(xì)胞以0.5毫升的PBS清洗并且添加0.45毫升包含無(wú)肌醇/不含血清培養(yǎng)基，10μM pargyline，10mM氯化鋰分析培養(yǎng)基或0.4毫升分析培養(yǎng)基及50μl 10×ketanserin(ket)至最終濃度10μM。細(xì)胞接著在37℃培養(yǎng)30分鐘。接著以0.5毫升PBS清洗細(xì)胞并且添加200μl新鮮/冰過的冷終止溶液(1M氫氧化鉀；18mM硼酸鈉；3.8mMEDTA)至孔中。溶液保持在冰中5至10分鐘或直到細(xì)胞溶解，接著以200μl的新鮮/冰過的冷中和溶液中和(7.5％鹽酸)。然后將溶解物轉(zhuǎn)入1.5毫升微量試管并且向每個(gè)試管中1毫升氯仿/甲醇(1∶2)。溶液渦旋15秒且將上層液相應(yīng)用于Bioead AG1-X8TM陰離子交換樹酯(100至200孔徑)。首先，樹酯以1∶1.25W/V的水清洗，且將0.9毫升上層液相上樣到管柱中。管柱以10毫升的5mM肌醇及10毫升的5mM硼酸鈉/60mM甲酸鈉清洗。三磷酸肌醇洗脫進(jìn)入包含10毫升有2毫升的0.1M甲酸/1M的甲酸銨的閃爍混合物的發(fā)光瓶。管柱用10毫升的0.1M甲酸/3M甲酸銨清洗且用ddH2O沖洗2次并且儲(chǔ)存于4℃的水中。
實(shí)施例5融合蛋白制備a.GPCRGs融合構(gòu)建體設(shè)計(jì)組成性活化的GPCR-G蛋白融合構(gòu)建體如下大鼠G蛋白GSα的5’及3’末末端(長(zhǎng)結(jié)構(gòu)；Itoh，H等人，83 PNAS 3776(1986))被操作其中包含HindIII(5’-AAGCTT-3’)序列。確認(rèn)正確序列后(包含側(cè)接HindIII序列)，通過使用該載體的HindIII限制性位點(diǎn)，通過亞克隆將全序列穿梭進(jìn)入pcDNA3.1(-)(Invitrogen，cat.No.V795-20)。Gsα序列的正確的起點(diǎn)在亞克隆進(jìn)入pcDNA3.1(-)后確定。然后驗(yàn)證在HindIII序列包含大鼠Gsα基因的修飾的pcDNA3.1(-)；此載體可用作“通用”Gsα蛋白載體。PcDNA3.1(-)載體包含多種在HindIII上游的已知限制性位點(diǎn)，因此有益于在Gs蛋白的上游插入內(nèi)源性組成性活性GPCR的編碼序列。相同的方法可利用來(lái)形成其它“通用”的G蛋白受體，及當(dāng)然，其它市售的或者本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的載體可被利用-重要的標(biāo)準(zhǔn)為GPCR序列為上游并且在G蛋白的讀碼框內(nèi)。
b.Gq(6氨基酸缺失)/Gi融合構(gòu)建體Gq(del)/Gi融合構(gòu)建體設(shè)計(jì)可完成于下N末端6個(gè)氨基酸(氨基酸2至7，TLESIM Gαq-亞基的序列將缺失且C末端5個(gè)氨基酸，EYNLV序列將用具有DCGLF序列的Gαi蛋白的相應(yīng)氨基酸取代。這個(gè)融合構(gòu)建體將通過使用下列引物的PCR獲得5’-gatcAAGCTTCCATGGCGTGCTGCCTGAGCGAGGAG-3’(SEQID NO9)以及5’-gatcGGATCCTTAGAACAGGCCGCAGTCCTTCAGGTTCAGCTGCAGGATGGTG-3’(SEQ ID NO10)及包含小鼠Gαq野生形式的質(zhì)粒63313，紅血球凝集素尾作為模板。包含低程度加帽的核苷酸作為間隔區(qū)。
TaqPlus Precision DNA聚合酶(Stratagene)將在隨后循環(huán)中被用來(lái)復(fù)制，其中步驟2至4重復(fù)35次95℃ 2分鐘；95℃ 20秒；56℃20秒；72℃ 2分鐘；及72℃ 7分鐘。PCR產(chǎn)品將克隆于pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中，并且使用ABI Big Dye Terminator試劑盒(P.E.Biosystems)進(jìn)行測(cè)序。從包含融合構(gòu)建體序列的TOPO克隆嵌入物將由2步驟的克隆過程穿梭進(jìn)入表達(dá)載體pcDNA3.1(+)的HindII/BamHI位點(diǎn)。也參見，PCT申請(qǐng)編號(hào)PCT/US02/05625，公開號(hào)WO02068600，公開于2002年9月6日，其公開內(nèi)容全不在此處引入作為參考。
實(shí)施例6規(guī)約反激動(dòng)劑與激動(dòng)劑的直接鑒定A.[35S]GTPγS分析在一些實(shí)施方案中，內(nèi)源性GPCR被用以直接鑒定作為例如激動(dòng)劑或拮抗劑的候選化合物。在一些實(shí)施方案中，內(nèi)源性組成性活化的GPCR或非內(nèi)源性組成性活化的GPCR被利用來(lái)直接鑒定作為例如反激動(dòng)劑或激動(dòng)劑的候選化合物。在一些實(shí)施方案中，包含內(nèi)源性，組成性活化的GPCR或非內(nèi)源性組成性活化的GPCR的GPCR融合蛋白被用來(lái)直接鑒定作為例如反激動(dòng)劑或激動(dòng)劑的候選化合物。在所述實(shí)施方案中，提供隨后的分析方案用于所述直接鑒定。
膜制備在一些實(shí)施方案中，包含目的GPCR/融合蛋白且用以直接鑒定作為反激動(dòng)劑，激動(dòng)劑或拮抗劑的候選化合物優(yōu)選制備如下a.材料“膜刮除緩沖液”包含20mM HEPES及10mM EDTA，pH7.4；“膜清洗緩沖液”包含20mM HEPES及0.1mM EDTA，pH7.4；“結(jié)合緩沖液”包含20mM HEPES，100mM氯化鈉及10mM氯化鎂，pH7.4。
b.過程全部的材料在整個(gè)過程中，都保存在冰上。首先，將從細(xì)胞鋪滿的單層抽吸培養(yǎng)基，隨后用10毫升冷PBS清洗，隨后吸出。此后，5毫升的膜刮除緩沖液將添加至刮除細(xì)胞；然后將細(xì)胞提取物轉(zhuǎn)入50毫升離心管中(在4℃，20,000rpm離心17分鐘)。隨后，上層液將被吸出，且在4℃，20000rpm離心17分鐘后顆粒將會(huì)再次懸浮于30毫升膜清洗緩沖液中。上層液將被吸出，且顆粒將再次懸浮于緩沖液中。然后使用Binkman PolytronTM勻漿機(jī)勻漿(15至20秒破裂，直到全部材料于懸浮液中)。在此提及為“膜蛋白”。
Bradford蛋白質(zhì)分析在勻漿后，膜的蛋白質(zhì)濃度將利用Bradford蛋白質(zhì)分析測(cè)(蛋白質(zhì)稀釋至約1.5毫克/毫升，分份并進(jìn)行冷凍(-80℃)待用；當(dāng)冷凍時(shí)，將使用下列試驗(yàn)方案在分析當(dāng)天，冷凍的膜蛋白在室溫下融化，隨后進(jìn)行渦旋，然后用Polytron在約12×1,000rpm勻漿約5至10分鐘；值得注意，為了多重制備，在勻漿不同的制備物時(shí)，要對(duì)勻漿機(jī)徹底清洗。
a.材料結(jié)合緩沖液(如上)；Bradford染劑；Bradfore蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)亦將被使用，參照說明書(Biorad，cat.No.500-0006)。
b.過程準(zhǔn)備復(fù)制管，一個(gè)包含膜，且一個(gè)作為“空白“。每一個(gè)包含800μl結(jié)合緩沖液。然后，將10μl的Bradford蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液(1毫克/毫升)添加至每一個(gè)試管，且將10μl膜蛋白添加至一個(gè)管(不是空白管)。此后，將200μl的Bradford染劑添加至每一管中，隨后渦旋。5分鐘后，試管將再渦旋，且將其中的物質(zhì)轉(zhuǎn)入小玻璃管。小玻璃管將使用CECIL3041分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)595下讀數(shù)。
直接鑒定分析a.材料包含37.5毫升結(jié)合緩沖液及2mg的GDP(Sigma，cat.No.G-7127)的GDP緩沖液，隨后在結(jié)合緩沖液中連續(xù)稀釋以含有0.2μM的GDP(每孔的最終GDP濃度為0.1μM的GDP)；每一個(gè)孔包含一種候選化合物，包含100μl GDP緩沖液(最終濃度，0.1μM GDP)，50μl于結(jié)合緩沖液中的膜蛋白及50μl于結(jié)合緩沖液中的[35S]GTPγS(0.6nM)(2.5μl[35S]GTPγS/10毫升結(jié)合緩沖液)的200μl體積。
b.過程候選化合物最好使用96孔板形式掃描(其可以冷凍至-80℃)。膜蛋白(或包含排除了GPCR融合蛋白表達(dá)載體的膜，作為對(duì)照)，將簡(jiǎn)單地勻漿直到懸浮。然后使用上述列舉的Bradford蛋白質(zhì)分析確定蛋白濃度確定。膜蛋白(及對(duì)照)將接著稀釋至0.25毫克/毫升結(jié)合緩沖液中(最終分析濃度為12.5μg/孔)。隨后，將100μl的GDP緩沖液添加至Wallac ScintistripTM(Wallac)的每個(gè)微孔中。然后使用5μl的針狀工具用來(lái)轉(zhuǎn)移5μl的候選化合物至每一孔(即，5μl于200μl總分析體積為1∶40，因此最終候選化合物的掃描濃度為10μM)。再次，為了避開污染物，在每一個(gè)轉(zhuǎn)移步驟后，針狀工具將用三種包含水(1X)，乙醇(1X)及水(2X)儲(chǔ)液器清洗-多余液體的在每次清洗后將多余液體從工具上甩掉并用紙或紙巾干燥。此后，將50μl的膜蛋白添加至每一孔中(包含沒有GPCR融合蛋白的膜的對(duì)照孔亦被使用)，且在室溫下預(yù)先培養(yǎng)5至10分鐘。此后，結(jié)合緩沖液中50μl的[35S]GTPγS(0.6nM)將添加至每一孔中，隨后在室溫下以震蕩培養(yǎng)60分鐘(再次，在此實(shí)施例中，板用金箔覆蓋)。分析將通過在22℃，4000rpm轉(zhuǎn)動(dòng)板15分鐘停止。薄板用8歧管吸出且用板面密封。薄板用設(shè)定在“Prot.#37”(如操作說明書)的Wallac1450上讀數(shù)。
B.cAMP分析另一個(gè)直接鑒別作為反激動(dòng)劑，激動(dòng)劑，及拮抗劑的候選化合物的方法通過利用基于環(huán)化酶的分析完成。除了直接鑒定，這種分法可用作獨(dú)立的方法提供上述[35S]GTPγS方法結(jié)果的確認(rèn)。
修飾的Flash PlateTM腺甘酸環(huán)化酶試劑盒(New England Nuclear；Cat.No.SMP004A)根據(jù)下列方案優(yōu)選用于直接鑒定用作內(nèi)源性或者組成性GPCRs的反激動(dòng)劑及激動(dòng)劑的候選化合物直接鑒定。
轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后3天收集。膜通過將包含20mM HEPES，pH7.4，及10mM氯化鎂的緩沖液中懸浮細(xì)胞的勻漿制備。勻漿最好在冰上使用Brinkman PolytronTM約10秒進(jìn)行。產(chǎn)生的勻漿物在4℃，49，000X克下離心15分鐘。產(chǎn)生的顆粒接著再次懸浮于含有20mM HEPE，pH7.4及0.1mM EDTA的緩沖溶液中，勻漿10秒，隨后在4℃，49，000X克下離心15分鐘。產(chǎn)生的顆粒接著儲(chǔ)存于-80℃直到使用。直接鑒定掃描當(dāng)天，膜顆粒在室溫下緩慢融化，再次懸浮于含20mMHEPES，pH7.4，及10mM氯化鎂的緩沖溶液中以產(chǎn)生最終蛋白質(zhì)濃度0.60毫克/毫升(懸浮的膜至于冰中直到使用)。
cAMP標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)緩沖液[包含2μCi示蹤劑125IcAMP(100μl)至11毫升檢測(cè)緩沖溶液]根據(jù)操作說明書進(jìn)行制備及保存。分析緩沖溶液新鮮制備用以掃描且包含20mM HEPES，pH7.4，10mM氯化鎂，20mM磷酸肌酸(Sigma)，0.1單位/毫升的肌酸磷酸激酶(Sigma)，50μM GTP(Sigma)，及0.2mM ATP(Sigma)。分析緩沖溶液接著儲(chǔ)存于冰中直到使用。
將候選化合物(若冷凍，在室溫下融化)與40μl膜蛋白(30μg/孔)及50μl分析緩沖溶液一起優(yōu)選添加至96孔板(3μl/孔；12μM最終分析濃度)。混合物在室溫下伴隨輕微震動(dòng)培養(yǎng)30分鐘。
培養(yǎng)后，將100μl的檢測(cè)緩沖溶液添加至每一個(gè)孔中，隨后培養(yǎng)2至24小時(shí)。然后使用“Prot.#31“(如操作說明)由Wallac MicroBetaTM薄板進(jìn)行計(jì)數(shù)。
舉例而非限制的方式，典型掃描分析薄板(96孔)結(jié)果如圖1所示。每一個(gè)條狀柱代表不同孔化合物的結(jié)果，“靶受體”為內(nèi)源性，組成性活化的Gs偶聯(lián)蛋白GPCR的Gsα融合蛋白構(gòu)建體。在第圖1中的代表性結(jié)果也提供了基于每一薄板(“m”)結(jié)果平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，并且平均值乘以2個(gè)反向激動(dòng)劑的隨機(jī)選擇偏愛作為最初掃描的“指引”包括選擇降低平均板應(yīng)答的應(yīng)答百分比的候選化合物，除以兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。相反的，選擇的激動(dòng)劑作為最初掃描的“指引”的激動(dòng)劑選擇的隨機(jī)偏愛包括選擇選擇增加平均板應(yīng)答的應(yīng)答百分比的候選化合物，乘以兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。以這些選擇過程為基礎(chǔ)，在隨后孔中的候選化合物直接鑒定為分別在孔A2及G9中所述內(nèi)源性GPCR推斷的反激動(dòng)劑(化合物A)及激動(dòng)劑(化合物B)至。參見圖1。清楚顯示這些化合物不用這種GPCR內(nèi)源性配體的任何知識(shí)就可直接鑒定。通過關(guān)注于基于受體功能的分析技術(shù)我們能夠確定能降低此受體(化合物A)功能活性和增加受體(化合物B)功能活性的化合物。
實(shí)施例7測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的螢光顯影板讀取機(jī)(FLIPR)從各自克隆系的靶受體(實(shí)驗(yàn)性)及pCMV(陰性對(duì)照)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以5.5×104細(xì)胞/孔接種在聚-D-賴氨酸預(yù)先處理的帶有完全培養(yǎng)基(10％FBS，2mM L-麩氨酸，1mM丙酮酸鈉的DMEM)的96孔板中(Becton-Dickinson，#356640)隔天分析用。為了制備Fluo4-AM(Molecular Probe，#F14202)培養(yǎng)緩沖液儲(chǔ)液，將1毫克Fluo4-AM溶解于467μl DMSO及467μl Pluoronic酸(Molecular Probe，#P3000)中以產(chǎn)生1mM儲(chǔ)液，其可以儲(chǔ)存于-20℃一個(gè)月。Fluo4-AM為螢光鈣指示染劑。
候選化合物制備于清洗緩沖液中(1XHBSS/2.5mMProbenicid/20mM HEPES，pH7.4)。
在分析時(shí)，培養(yǎng)基從孔移除并且向細(xì)胞加入100μl的4μMFluo4-AM/2.5mM的Probenicid(Sigma，#P8761)/20mM HEPES/完全培養(yǎng)基，pH7.4。培養(yǎng)于37℃/5％CO260分鐘。
在培養(yǎng)1小時(shí)后，移除Fluo4-AM培養(yǎng)緩沖液且細(xì)胞以2倍100μl清洗緩沖溶液清洗。每一孔中剩余100μl清洗液。薄板再次培養(yǎng)于37℃/5％CO260分鐘。
FLIPR(螢光顯影板讀取機(jī)；分子設(shè)備)被設(shè)置在30秒添加50μl的候選化合物，且記錄由候選化合物在另一個(gè)150秒中引起細(xì)胞內(nèi)鈣濃度([Ca2+])的瞬時(shí)改變。使用FLIPR軟件，總螢光改變計(jì)數(shù)被用來(lái)確定激動(dòng)劑活性。設(shè)備軟件將熒光讀書較準(zhǔn)在0點(diǎn)給出相同的最初的讀數(shù)。
在一些實(shí)施方案中，包含靶受體的細(xì)胞進(jìn)一步包含混棲Gα15/16或嵌合Gq/Giα單位。
雖然先前提供了使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的進(jìn)行激動(dòng)劑活性FLIPR分析，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)分析進(jìn)行修改以鑒定拮抗劑的活性。上述本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以容易地認(rèn)識(shí)到，或者可以使用瞬間轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
實(shí)施例8黑色素細(xì)胞技術(shù)黑色素細(xì)胞為發(fā)現(xiàn)于低等脊椎動(dòng)物的皮膚細(xì)胞。其包含稱作黑色素體的有色素的細(xì)胞器。黑色素細(xì)胞能夠在G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)活化后將這些黑色素體沿著微管網(wǎng)再分配。這些色素移動(dòng)的結(jié)果是發(fā)現(xiàn)細(xì)胞明顯變亮或者變暗。在黑色素細(xì)胞中，從Gi偶聯(lián)受體活化引起細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度降低造成黑色素細(xì)胞移動(dòng)至細(xì)胞中央，產(chǎn)生引人注意的顏色變亮。若cAMP量接著升高，隨著Gs偶聯(lián)受體的活化，黑色素細(xì)胞再分配且細(xì)胞再次變暗。Gq偶聯(lián)受體活化產(chǎn)生的二酰甘油含量的增加也可誘導(dǎo)這種再分配。另外，此技術(shù)也適用于研究某些受體酪氨酸激酶。黑色素細(xì)胞反應(yīng)發(fā)生于受體活化的幾分鐘內(nèi)，且產(chǎn)生簡(jiǎn)單，較濃的顏色改變。此反應(yīng)可簡(jiǎn)單使用常見吸收微板讀取器或中度顯影系統(tǒng)測(cè)定確定。不像其它皮膚細(xì)胞，黑色素細(xì)胞從神經(jīng)嵴衍生并且表達(dá)全組分的信號(hào)蛋白。尤其是，細(xì)胞表達(dá)非常廣的G蛋白范圍，且?guī)缀蹩梢怨δ苄员磉_(dá)所有的GPCRs。
黑色素細(xì)胞可用來(lái)鑒別化合物，包含天然配體，GPCRs激動(dòng)劑。此方法可由引導(dǎo)能分配或聚集色素的色素細(xì)胞系的測(cè)試細(xì)胞對(duì)特殊刺激應(yīng)答并且表達(dá)編碼GCPR的內(nèi)源性克隆實(shí)施。如果GPCR的活化誘導(dǎo)色素分散，活化刺激劑，例如黑色素，將色素沉積設(shè)定在試驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)色素最初分配的狀態(tài)。如果GPCR的活化誘導(dǎo)色素聚集，用活化刺激劑細(xì)胞將最初的色素沉積設(shè)定在色素分散的位置。將測(cè)試細(xì)胞接著與化學(xué)化合物接觸，并且確定細(xì)胞中的色素沉積是否從色素沉積的最初狀態(tài)改變。由于候選化合物，包含但不限制偶聯(lián)至GPCR的配體，引起的色素細(xì)胞的分配培養(yǎng)皿中變暗，同時(shí)色素細(xì)胞的聚集將變亮。
材料與方法隨后參考美國(guó)專利5462856及美國(guó)專利6051387。這些專利的公開內(nèi)容在此處全部引入作為參考。
細(xì)胞在96孔板(一種受體/板)中鋪板。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，對(duì)每一板的一半的細(xì)胞用10nM黑色素處理。黑色素活化黑色素細(xì)胞內(nèi)源性Gi結(jié)合受體，并造成其色素聚集。剩下一半的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無(wú)血清培養(yǎng)基0.7X L-15(Gobco)。一小時(shí)后，在無(wú)血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞保持在色素分配狀態(tài)，同時(shí)黑色素處理的細(xì)胞在色素聚集狀態(tài)。在這一點(diǎn)上，細(xì)胞用反應(yīng)劑量的候選化合物處理。若平板的GPCRs與候選化合物結(jié)合，黑色素細(xì)胞將經(jīng)歷對(duì)化合物反應(yīng)的顏色改變。若受體為Gs或Gq偶聯(lián)受體，且若候選化合物為激動(dòng)劑，接著黑色素聚集的黑色素細(xì)胞將經(jīng)歷色素分配。相反，若受體為Gi偶聯(lián)受體，且若候選化合物為激動(dòng)劑，那么色素分散的細(xì)胞將經(jīng)歷取決劑量的色素聚集。
實(shí)施例9人類RUP41的組織分布A.AFFYMETRIX GENECHIP技術(shù)氨基酸序列提供給Affymetrix使用GeneChip技術(shù)用于設(shè)計(jì)及制造包含寡核苷酸的微陣列從而監(jiān)控G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)的表達(dá)水平。同時(shí)微陣列上存在源于Harvard Brain Band或市售獲得的特定人腦組織探針。根據(jù)廠商的說明書對(duì)RNA樣品擴(kuò)增，標(biāo)記，雜交至微陣列，并雜交至微陣列，并且進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
使用GeneChip，研究人類RUP41的表達(dá)譜。參見圖2A圖。圖2A為表示在各種組織中人RUP41的表達(dá)水平的圖。對(duì)這些圖的檢查顯示RUP41表達(dá)于大腦及心臟中。在遠(yuǎn)離大腦的組織中，RUP41由心臟選擇性表達(dá)。選擇性表達(dá)的RUP41給由RUP41的調(diào)節(jié)物可能的副作用提供較少的機(jī)會(huì)。
點(diǎn)狀圖(圖2B)及Northern印跡(圖2C)結(jié)果符合GeneChip的結(jié)果。
B.RT-PCRRT-PCR應(yīng)用至人RUP41表達(dá)的研究。使用的寡核苷酸為RUP41特異性的，并且使用cDNA作為模板。Taq DNA聚合酶(Stratagene)被用來(lái)根據(jù)說明書在40μl的反應(yīng)物中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR條件為96℃ 2分鐘，隨后96℃ 30秒，55℃ 30秒及72℃ 2分鐘30循環(huán)，隨后72℃10分鐘。20μl的反應(yīng)物裝載于1.5％瓊脂膠以分析RT-PCR產(chǎn)物。
5’PCR引物序列5’-GTAATAATTGCCCTCCGGCGAGC-3’(SEQ ID NO11)。
3’PCR引物序列5’-CTAGTCTGTGACAACCTGAGG-3’(SEQ ID NO12)。
擴(kuò)增的DNA片段為390個(gè)堿基對(duì)大小。
通過說明的方式，人RUP41的RT-PCR顯示于圖7，之后，充血性心衰竭病人心臟組織的RUP41表達(dá)與正常心臟功能病人的心臟組織的RUP41表達(dá)進(jìn)行比較。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以類似地對(duì)小鼠RUP41及大鼠RUP41進(jìn)行RT-PCR形成。
C.Northern印跡人類RUP41表達(dá)的Northern印跡分析由本領(lǐng)域技術(shù)人員的步驟產(chǎn)生。對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸1,104-1,538的人RUP41編碼區(qū)片段用作探針。
實(shí)施例10原位雜交成年大鼠心臟的RUP41表達(dá)原位雜交證實(shí)成年大鼠心臟中心肌的廣泛表達(dá)(見圖3)。反義RUP41放射性標(biāo)記的探針檢測(cè)到所有心室中RUP41的表達(dá)。反義對(duì)照(GAPDH)及心房特異性(心鈉素，ANF)探針被用于其它部分從而證實(shí)了心臟部分探針標(biāo)記的特異性。
原位雜交固定的心臟組織包埋入50∶50的OCT∶Aqua Mount(VWR，#41799-008，West Chester，PA)混合物中并且冷凍于干冰/乙醇中。塊狀物保持在-80℃直到冷凍切片，這時(shí)制備10微米的連續(xù)切片。在冷凍切片后，將組織切片在密封盒中儲(chǔ)存在-20C。
SEQ ID NO6的大鼠RUP41的多核苷酸亞克隆于PCRII-TOPO載體中(Invitrogen，Carlsbad，CA)SP6及T7啟動(dòng)子側(cè)接的位點(diǎn)。與Seq ID NO6的多核苷酸互補(bǔ)的[35S]-放射性標(biāo)記的反義大鼠RUP41mRNA探針使用Promega RiboProbe轉(zhuǎn)錄試劑盒(#P1460；Madison，WI)的SP6 RNA聚合酶制備，最好如操作說明。對(duì)照放射性標(biāo)記的有義探針類似使用T7 RNA聚合酶制備。
固定的組織切片解凍并在室溫下進(jìn)行一系列的固定后溫育PBS 3分鐘；10％福爾馬林10分鐘；PBS 10分鐘；及PBS 10分鐘。
組織切片接著進(jìn)行滲透作用及?；饔谩Ｖ?，組織切片用K蛋白酶(0.001％K蛋白酶的0.5M Tris，0.25M EDTA溶液，pH8.0)在37℃下溫育10分鐘，隨后在室溫下用水清洗5分鐘。組織切片接著在室溫下用三乙醇胺緩沖溶液(0.1M TEA，pH8.0)培養(yǎng)5分鐘，隨后在0.1M TEA pH8.0中的2.5％醋酸酐中培養(yǎng)5分鐘。組織切片接著在室溫下以2X SSC；50％乙醇；95％乙醇；及100％乙醇各溫育2分鐘。組織切片接著風(fēng)干并保持干燥直到后幾天的雜交。
組織切片在60℃，0.47M氯化鈉，54％甲酰胺以每切片80至100μl的體積雜交20小時(shí)。放射性標(biāo)記的探針使用濃度為1×107cpm/毫升。組織切片接著以4X SSC在室溫下清洗4次，每次10分鐘。未雜交探針用RNAse A(20μg/毫升于0.5M氯化鈉，10mM Tris，1mM EDTA，pH8)在37℃培養(yǎng)30分鐘進(jìn)行降解。組織切片接著以2X SSC在室溫下清洗2次，每次5分鐘，隨后以1X SSC在室溫下清洗10分鐘，隨后以0.5X SSC在室溫下清洗10鐘。組織切片以0.1X SSC在65℃下清洗30鐘，隨后以0.1X SSC在室溫下清洗5鐘，隨后以酒精脫水。
經(jīng)過雜交的組織切片接著暴露于X射線膜且通過放射性自顯影觀察RUP41雜交信號(hào)。之后，組織切片暴露于Biomax MR膜1天，4天，然后1星期。在放射性自顯影后，組織切片使用NTB-2液體感光乳化劑浸泡。乳化劑浸泡的組織切片暴露在乳化劑1星期并且顯影。在顯影后，組織切片用bisbenzimide(0.001％于PBS)進(jìn)行反染色并且加蓋。組織切片使用超聚光鏡(銀顆粒顯現(xiàn)白色)及DAPI過濾體(觀察bisbenzimide反染色)成象。
相同的方法使用放射性標(biāo)記并且雜交于由部分大鼠GAPDH及心鈉素(ANF)序列產(chǎn)生的探針。
實(shí)施例11肥大的新生鼠心室心肌的RUP41下調(diào)控新生鼠心室心肌(NRVMs)如前所述進(jìn)行制備[Adams，JW等人，J Biol Chem(1996)2711179-86；其內(nèi)容全部在此處引入作為參考其內(nèi)容全部在此處引入作為參考]。簡(jiǎn)言之，心臟從1至2天齡SD出初生大鼠獲得且以膠原酶消化，心肌通過Percoll梯度進(jìn)行純化。細(xì)胞置于用0.1％明膠預(yù)先覆蓋以及添加了10％馬血清，5％新生牛血清，及抗體(100單位/毫升青霉素及100μg/毫升鏈霉素)的4∶1DMEM/培養(yǎng)基-199中保持過夜的組織培養(yǎng)盤上。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)18小時(shí)后，心肌用維持培養(yǎng)基(DMEM/培養(yǎng)基-199加抗菌素)清洗以除去死掉細(xì)胞及碎片且在實(shí)驗(yàn)期間用維持培養(yǎng)基再次更換。
圖4A RT-PCR證實(shí)的新生鼠心室心肌(NRVMs)中RUP41轉(zhuǎn)錄本的維持在無(wú)血清情況下24小時(shí)。隨后添加脫羥腎上腺素(PE)或新生牛血清(NCS)至培養(yǎng)基后24小時(shí)，RUP41轉(zhuǎn)錄本的含顯著下降，且與顯型肥大有關(guān)。脫羥腎上腺素使用濃度為100μM(加2μM阻斷β腎上腺受體，且因此可以選擇活化α腎上腺受體)。新生牛血清使用濃度為10％。G3PDH PCR產(chǎn)物證實(shí)相當(dāng)于用于PCR反應(yīng)的模板量及膠負(fù)載量。
RT-PCR從如上描述于NRVMs分離的總RNA被用作根據(jù)說明書，利用RTPCR試劑盒(Becton Dickenson)產(chǎn)生反轉(zhuǎn)錄DNA(RT-DNA)的模板。由PCR測(cè)定RT-DNA樣品中RUP41表達(dá)。PCR條件為96℃ 2分鐘，隨后96℃ 30秒，55℃ 30秒及72℃ 2分鐘30循環(huán)，隨后72℃ 10分鐘。20μl的反應(yīng)物負(fù)載于1.5％瓊脂糖膠以分析RT-PCR產(chǎn)物。
5’PCR引物序列5’-GTAATAATTGCCCTCCGGCGAGC-3’(SEQ ID NO11)。
3’PCR引物序列5’-CTAGTCTGTGACAACCTGAGG-3’(SEQ ID NO12)。
擴(kuò)增的DNA序列為390堿基對(duì)。
圖4B.Northern印跡證實(shí)以增肥劑處理，包含脫羥腎上腺素(PE)，佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)，前列腺素F2α(PGF2α)的肥大劑以及小牛血清(NCS)處理24小時(shí)后NRVMs中RUP41 mRNA表達(dá)水平的降低。脫羥腎上腺素使用100μM(加2μM至阻斷β腎上腺受體，且因此允許α腎上腺受體的選擇性。佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯使用100nM。前列腺素F2α使用1μM。新生牛血清使用10％。心房利鈉因子(ANF)，一種心肌肥大基因標(biāo)志相應(yīng)所有肥大刺激上調(diào)。28S rRNA的亞甲基藍(lán)染色證實(shí)完整性及相同的RNA負(fù)載。
Northern印跡分析分離1-2天齡的大鼠(SD)心房心肌(NRVMs)且如先前所述放置于培養(yǎng)盤上。多種處理后，根據(jù)廠商的說明書利用Trizol試劑(Invitrogen)分離總RNA。15毫克的總RNA在含瓊脂糖凝膠的甲醛上通過電泳方式分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Amersham)。對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO6的核苷酸53-488的大鼠RUP41編碼區(qū)片段被用作Northern印跡分析的探針。使用標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生32P標(biāo)記的探針且在55℃雜交至膜上。膜在高嚴(yán)格條件下清洗且在-80℃暴露至X射線膜2-4天。
實(shí)施例12過度肥大壓迫的小鼠心臟實(shí)驗(yàn)種RUP41的下調(diào)圖5上。RUP41 mRNA在過度心臟肥大壓迫的體內(nèi)小鼠模型中的下調(diào)。Northern印跡分析在從橫向主動(dòng)脈收縮(TAC)或雙盲操作7天的小鼠(SHAM)左心室分離的總RNA上進(jìn)行。增加的ANF表達(dá)證實(shí)TAC心臟確實(shí)發(fā)生肥大反應(yīng)。28S rRNA的亞甲基藍(lán)染色證實(shí)了RNA的完整性及相等的負(fù)載。對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO4核苷酸775-1269的小鼠RUP41編碼區(qū)片段被用作Northern印跡分析的探針。使用標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生32P標(biāo)記的探針且在55℃雜交至膜上。膜在高嚴(yán)格條件下清洗且在-80℃暴露至X射線膜2-4天。
5圖下。RUP41信號(hào)用光密度分析并標(biāo)準(zhǔn)化至28S rRNA信號(hào)。*Anova統(tǒng)計(jì)分析的6個(gè)雙盲及6個(gè)TAC樣品證實(shí)RUP41 mRNA顯著降低，P＜0.00005。
橫向主動(dòng)脈收縮(TAC)小鼠橫向主動(dòng)脈手術(shù)收縮完成如前述(Rockman等人，Proc NatlAcad Sci.1991 9月15日；88(18)8277-81)。簡(jiǎn)言之，8周齡小鼠(C57/BL6)以氯胺酮及甲苯噻嗪混合麻醉。在顯微解剖下，切開中線頸由顯微術(shù)使導(dǎo)管及頸動(dòng)脈管呈現(xiàn)。在成功氣管內(nèi)插管后，插管連接至一定體積的cuylced嚙齒類換氣裝置(Harvard Apparatus)，以0.2毫升氧供應(yīng)且呼吸率為110/分鐘。穿過一個(gè)小切口胸腔進(jìn)入左上胸骨邊緣的第二肋間，且當(dāng)針移動(dòng)時(shí)，由系上一個(gè)以27標(biāo)準(zhǔn)針的7-0耐龍縫合線產(chǎn)生一個(gè)窄0.4cm直徑并且產(chǎn)生65至70％的可回復(fù)橫向主動(dòng)脈壓縮(TAC)完成主動(dòng)脈壓縮。綁住氣胸的主動(dòng)脈后進(jìn)行排空，并且將動(dòng)物的插管移開且使其恢復(fù)。
實(shí)施例13組織缺氧的NRVMs中RUP41的下調(diào)Northern印跡證實(shí)在組織缺氧6小時(shí)的NRVMs分離的總RNA中RUP41 mRNA量的降低(圖6)。在缺氧后復(fù)氧24小時(shí)(H6/R24)后RUP41 mRNA恢復(fù)至對(duì)照(正常)水平。c-fos表達(dá)(缺氧-6)增加證實(shí)心肌對(duì)缺氧條件的脅迫應(yīng)答。28S rRNA的亞甲基藍(lán)染色證實(shí)了RNA的完整性及相等的負(fù)載。對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO6核苷酸53-488的大鼠RUP41編碼區(qū)片段被用作Northern印跡分析的探針。使用標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生32P標(biāo)記的探針且在55℃雜交至膜上。膜在高嚴(yán)格條件下清洗且在-80℃暴露至X射線膜2-4天。
NRVMs的缺氧處理描述于Van Heugten等人，J Mol CellCardiol(1994)261513-24，其內(nèi)容全部在此處引入作為參考。簡(jiǎn)言之，使用灌注了95％N2及5％CO2的密閉培養(yǎng)箱實(shí)現(xiàn)組織缺氧。在缺氧處理一段時(shí)間后，細(xì)胞從腔室移出至周遭空氣且用無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。見下列的實(shí)施例17。
實(shí)施例14充血性心衰竭人類的RUP41下調(diào)圖7A。在人心臟分離的總RNA上進(jìn)行RT-PCR。RUP41轉(zhuǎn)錄量在充血性心衰竭(CHF)病人較正常心臟功能(正常)病人的RNA中降低。將人類GAPDH引物添加至每一個(gè)PCR反應(yīng)作為模板濃度及負(fù)載量的內(nèi)部對(duì)照。
圖7B。*Anova統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)CHF病人的RUP41轉(zhuǎn)錄本水平較正常人顯著下降，p＜0.05。心肌梗塞(MI)病人的RUP41轉(zhuǎn)錄本水平與正常心臟不同。
人類心臟疾病樣品對(duì)市售獲得的(Clinomics)診斷具有正常心臟功能的人，充血性心衰竭(CHF)，及心肌梗塞(MI)的病人解剖的心臟提取的總RNA進(jìn)行RT-PCR(如上)。RUP41表達(dá)的相對(duì)量在GAPDH校準(zhǔn)至內(nèi)部對(duì)照后每一群體中進(jìn)行確定。
實(shí)施例15COS-7細(xì)胞中Gi偶聯(lián)至RUP418圖上。COS-7細(xì)胞用pCMV-HARUP41(HA-RUP41)或pCMV-HA骨架(CMV)以及組成性活化的Gs偶聯(lián)的甲狀腺刺激激素受體(pCMV-TSHR-A6231)共轉(zhuǎn)染。[HARUP41對(duì)應(yīng)于紅血球凝集素(HA)-標(biāo)記的RUP41]。另外，CRE-螢光酶受體構(gòu)建體在百日咳毒素(PTX)存在或不存在的條件下共轉(zhuǎn)染以確定cAMP活化途徑的活性。細(xì)胞中共表達(dá)CART-TSHR及HARUP41的螢光素酶報(bào)告活性較共表達(dá)CART-TSHR及pCMV-HA對(duì)照的細(xì)胞低，顯示RUP41與Gi偶聯(lián)。用PTX處理抑制由RUP41引起的cAMP降低證實(shí)了Gi與此受體的偶聯(lián)。
8圖下。在百日咳毒素(PTX)存在或不存在下COS-7細(xì)胞與pCMV-HA(CMV)或pCMV-HARUP41(HA-RUP41)構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染。Forskolin(uM)刺激的增加cAMP量由RUP41表達(dá)抑制。用PTX處理抑制由RUP41引起的cAMP降低證實(shí)了Gi與此受體的偶聯(lián)。
RUP41受體構(gòu)建體編碼SEQ ID NO3的人RUP41多肽的氨基酸2-433的多核苷酸連接入pCMV-HA用于瞬間轉(zhuǎn)染表達(dá)的研究。
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染使用5’-HA標(biāo)記的RUP41表達(dá)構(gòu)建體(HA-pCMVRUP41)進(jìn)行DNA的轉(zhuǎn)染。簡(jiǎn)言之，使用廠家說明書(Roche)所述的Fugene-6轉(zhuǎn)染劑將HA-pCMVRUP41轉(zhuǎn)染入在室斜面上鋪板的COS-7或HEK細(xì)胞中。5’-HA標(biāo)記的GPR(孤兒GPCR；GenBank登錄號(hào)NM_007223)及HA-pCMV載體轉(zhuǎn)染至COS-7及HEK細(xì)胞作為對(duì)照。
cAMP測(cè)定在用RUP41表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞24小時(shí)后，以PBS清洗，且在收獲細(xì)胞前培養(yǎng)于無(wú)血清有或無(wú)100ng/毫升PTX的培養(yǎng)基中37℃下18小時(shí)用于FlashPlate分析(PerkinElmer)，cAMP的量根據(jù)廠家的說明書進(jìn)行檢測(cè)。
CRE-螢光酶報(bào)告分析在用pCMVRUP41及TSHR-A6231COS-7表達(dá)質(zhì)粒(TSHR-A6231RUP41(或CNV)DNA比＝1∶7(w/w)共轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，以PBS清洗細(xì)胞，并在根據(jù)廠家的說明書使用LucLite螢光酶報(bào)告分析試劑盒(Parkard)進(jìn)行CRE報(bào)告分析前培養(yǎng)于無(wú)血清有或無(wú)100ng/毫升PTX的培養(yǎng)基中37℃下18小時(shí)用于FlashPlate分析(PerkinElmer)，cAMP的量根據(jù)廠家的說明書進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)施例16腺病毒介導(dǎo)的RUP41的過量表達(dá)促進(jìn)NRVMs的存活圖9A。NRVMs用由每細(xì)胞噬斑形成單位(PFU)的病毒滴度限定的多重感染的編碼RUP41(AdRUP41)的重組腺病毒處理。腺病毒感染后24小時(shí)，分離總RNA且將Northern印跡分析用來(lái)確定病毒表達(dá)RUP41的水平。在50PFU/細(xì)胞RUP41時(shí)可以檢測(cè)到表達(dá)，但高水平表達(dá)顯示在100PFU/細(xì)胞。
圖9B。感染AdRUP41以100PFU/細(xì)胞48小時(shí)的NRVMs證實(shí)在無(wú)血清培養(yǎng)基中細(xì)胞存活率的增加。NRVMs用與德州紅結(jié)合的phalloidin及Hoechst33342共染色。
RUP41載體構(gòu)建體為了腺病毒實(shí)驗(yàn)，在腺病毒RUP41(AdRUP41)重組體產(chǎn)生前將編碼SEQ ID NO3的人RUP41多肽的多核苷酸亞克隆到pShuttleCMV(Qbiogene)中。
腺病毒感染帶有腺病毒載體的NRVMs的感染如先前所述[Adams JW等人，Circ Res(2000)871180-7；其內(nèi)容全部在此處引入作為參考]。簡(jiǎn)言之，在存在血清的條件下將NRVMs培養(yǎng)于薄覆蓋(3.5毫克/cm2)腔室斜面上(Nunc)過夜，在腺病毒感染前在不含血清的培養(yǎng)基中清洗及培養(yǎng)額外的8小時(shí)。在0.1至500PFU/細(xì)胞的劑量范圍中，最理想的多重感染(MOI)被確定為50至100的噬斑形成單位(PFU)/細(xì)胞。在AdRUP41或?qū)φ站幋aGFP(AdGFP)的腺病毒感染后的最初48小時(shí)，50PFU/細(xì)胞的MOI產(chǎn)生大于95％的感染效應(yīng)(如由感染這種對(duì)照病毒的NRVMs中確定GFP表達(dá))通式?jīng)]有任何細(xì)胞毒作用。
實(shí)施例17過量表達(dá)RUP41挽救NRVMs免于組織缺氧/復(fù)氧引起的細(xì)胞凋亡寡核小體DNA斷裂分析(又稱途徑)證實(shí)在缺氧(8小時(shí))后復(fù)氧(24小時(shí))刺激用對(duì)照(AdGFP)腺病毒以100PFU/細(xì)胞濃度感染的NRVMs(H8/N24)細(xì)胞凋亡的增加。然而，腺病毒介導(dǎo)的SEQ ID NO3的人RUP41多肽(100PFU/細(xì)胞)的過量表達(dá)降低了由血清損失(正常含氧量)及缺氧后復(fù)氧(H8/N24)誘導(dǎo)的DNA的斷裂水平(圖10)。
組織缺氧/復(fù)氧分離的NRVMs在有血清(10％FBS，5％HS)的條件下過夜培養(yǎng)，接著在缺氧處理前24小時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM-F12(Sigma)更換培養(yǎng)基。利用密閉的灌入95％N2及5％CO2的培養(yǎng)箱實(shí)現(xiàn)缺氧[VanHeugten等人，J Mol Cell Cardiol(1994)261513-24，結(jié)合于此]。在缺氧處理一段時(shí)間后，從腔室移出細(xì)胞到環(huán)境中并且更換無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基。
DNA斷裂根據(jù)廠家的說明書(Gentra)利用PUREGENE DNA分離試劑盒從NRVMs分離DNA。等量DNA在2％瓊脂糖凝膠上分離通過用溴化乙碇染色在紫外光下進(jìn)行檢測(cè)。
實(shí)施例18保護(hù)心臟本發(fā)明的調(diào)節(jié)物可以利用Fryer等人的體內(nèi)大鼠模型顯示出保護(hù)心臟作用[Circ Res(1999)84846-51；其內(nèi)容全部在此處引入作為參考]。所述調(diào)節(jié)物由腹膜內(nèi)注射施用。優(yōu)選劑量為0.1至100mg/kg。其它優(yōu)選劑量選自0.1mg/kg；0.3mg/kg；1.0mg/kg；3.0mg/kg；30mg/kg；及100mg/kg。安慰劑組只施用介質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)物為激動(dòng)劑。
350至450克的雄性Wistar大鼠被用于該研究的所有階段。手術(shù)之前1，12，24，48，或72小時(shí)經(jīng)腹膜內(nèi)注射給大鼠施用上述調(diào)節(jié)物或生理鹽水。隨后，大鼠經(jīng)由腹膜內(nèi)施用thiobutababital sodium(Inaction，Research Biochemical International；100毫克/公斤)進(jìn)行麻醉。實(shí)施氣管切開術(shù)，且氣管用連接嚙齒類呼吸機(jī)(CIV-101型，Columbus Instruments，或683型，Harvard Apparatus)的插管插入。大鼠在室溫下以60至65次呼吸/分鐘提供氧氣。通過維持正末呼氣壓在5至10毫米水預(yù)防肺不張。對(duì)動(dòng)脈pH，PCO2，及PO2通過控制在15分鐘吸留氣體，以及60分鐘和120分鐘的血液氣體系統(tǒng)再灌注(AVL995pH/血液氣體分析儀，AVL Medical Instruments)進(jìn)行監(jiān)控，且通過校正呼吸頻率及/或潮流氣維持在正常生理范圍(pH7.35至7.45；PCO2為25至44毫米汞柱；及PO2為80至110毫米汞柱)。體溫通過使用加熱墊維持在38℃，根據(jù)需要靜脈內(nèi)施用重碳酸鹽從而維持動(dòng)脈血液pH在正常生理范圍內(nèi)。
右側(cè)頸動(dòng)脈被插管經(jīng)由連結(jié)至Grass(模型7)多波掃描器的GouldPE 50或GOULD PE 23壓力轉(zhuǎn)換器測(cè)量血壓及心率。右側(cè)頸靜脈插管被灌入生理鹽水，重碳酸鹽及藥物。再第五肋間進(jìn)行左側(cè)開胸術(shù)，然后進(jìn)行心包切開術(shù)，并且調(diào)節(jié)左側(cè)二尖瓣附件顯示出左側(cè)冠狀動(dòng)脈的位置。結(jié)扎線(6-0丙烯)從左側(cè)二尖瓣附件下的緊鄰區(qū)域穿過冠狀動(dòng)脈以下進(jìn)入左心室的右部分。縫合末端穿過丙烯管形成勒除器。冠狀動(dòng)脈由拉緊縫合末端阻斷并用止血鉗在心外膜表面上強(qiáng)壓勒除器。冠狀動(dòng)脈阻斷通過心外膜發(fā)紺證實(shí)，且隨后血壓降低。心臟再灌注經(jīng)由放開止血鉗以及松開勒除器啟始，并且通過肉眼觀察心外膜充血反應(yīng)證實(shí)。在實(shí)驗(yàn)方案開始前穩(wěn)定心率及血壓。
大鼠隨機(jī)分配于設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)組中。對(duì)照大鼠局部缺血前30分鐘及再灌注2小時(shí)前施用生理鹽水24小時(shí)(I/R)。為了顯示由上述調(diào)節(jié)物誘導(dǎo)的急性心血管保護(hù)，所述調(diào)節(jié)物在延長(zhǎng)缺血損傷施用1小時(shí)。為了顯示針對(duì)急性缺血損傷的延遲心血管保護(hù)，所述調(diào)節(jié)物在I/R前以給定的劑量施用12或24小時(shí)。所述調(diào)節(jié)物在I/R前以給定的劑量施用48或72小時(shí)。
在完成上述方案的過程中，阻斷冠狀動(dòng)脈，經(jīng)頸靜脈施用專利藍(lán)色染劑陰性染色確定危險(xiǎn)區(qū)(AAR)。大鼠以15％氯化鉀實(shí)施安樂死。取出心臟，左心室從剩余組織解剖出來(lái)，隨后切成6片薄-橫切片。從而可以描繪出正常區(qū)，染色藍(lán)色，與AAR，其隨后保持粉紅色。從非缺血區(qū)取出危險(xiǎn)區(qū)，組織置于分離的小藥瓶中并用1.0％2，3，5-三苯基四唑化氯(TTC)染色劑的100mmol/L磷酸緩沖溶液(pH7.4)于37℃溫育15分鐘。TTC為活以及非活性組織的指示劑。TTC由存在于活心肌中的脫氫酶還原，且產(chǎn)生甲臘(formazan)沉淀，其誘導(dǎo)深紅色，反之梗塞區(qū)保持灰色{Klein等人，Virchows Arch[Pathol Anat](1981)393287-97}。組織儲(chǔ)存于10％甲醛藥瓶中過夜，且梗塞心肌在解剖顯微鏡下從AAR解剖出(Cambridge Instruments)。梗塞大小(IS)，AAR，及左心室重(LV)由重量分析確定。AAR被表達(dá)為L(zhǎng)V(AAR/LV)％，并且IS被表達(dá)為AAR(IS/AAR)％。
如果大鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的低血壓(＜30毫米汞柱收縮壓)或者如果由于新陳代謝的酸中毒或堿中毒不能將充分的血液氣體值保持在正常生理范圍，就將這些大鼠從數(shù)據(jù)分析中排除。
全部數(shù)值表現(xiàn)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。單向ANOVA的Bonferroni檢驗(yàn)被用來(lái)確定是否在血液動(dòng)力力學(xué)，IS及AAR小組中存在任一顯著的差異。顯著差異在P＜0.05下確定。IS/AAR減少表示新血管的保護(hù)。
實(shí)施例19口服生物可利用率直接估計(jì)口服生物可利用率的內(nèi)科分析方法為已知技術(shù)且可被使用[參見例如但不限于Wang PC等人，Cardiovase Drug Rev(2002)20137-52；及Buchan P等人，Headache(2002)Suppl2S54-62；其內(nèi)容全部在此處引入作為參考]。進(jìn)一步說明性但非限制性的方式，所述其它分析方法可包含液相層析-串聯(lián)質(zhì)譜分析儀[Chavez-Eng CM等人，J ChromatogrB Analyt Technol Biomed Life Sci(2002)767117-29；Jetter A等人，Clin Pharmacol Ther(2002)7121-9；Zimmerman JJ等人，J Clin Pharmacol(1999)391155-61；及Barrish A等人，Rapid CommunMass Spectrom(1996)101033-7；其內(nèi)容全部在此處引入作為參考]。
正電子發(fā)射斷層掃描已經(jīng)被成功用于(PET)直接獲得口服藥物后哺乳動(dòng)物體內(nèi)藥物分布，包括生物可利用率的測(cè)定結(jié)果[Gulyas等人，Eur J Nucl Med Mol Imaging(2002)291031-8；其內(nèi)容全部在此處引入作為參考]。
或者，本發(fā)明調(diào)節(jié)物的口服生物可利用率可在體內(nèi)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上確定，例如但不限于通過實(shí)施例18的老鼠模型。調(diào)節(jié)物由口服喂入的劑量范圍為0.1mg kg-1至100mg kg-1。調(diào)節(jié)物口服施用顯示出對(duì)心血管的保護(hù)作用。調(diào)節(jié)物的效果顯示出是劑量依賴性的并且可與腹膜內(nèi)施用后的效果相媲美。通過口服達(dá)到IS/AAR的一半最大減少的調(diào)節(jié)物劑量可與通過腹膜內(nèi)施用達(dá)到IS/AAR的一半最大減少的調(diào)節(jié)物劑量相媲美。通過說明的方式，若所述口服劑量為腹膜內(nèi)劑量的2倍，那么調(diào)節(jié)物的口服生物利用率為50％。更一般地，若所述口服劑量為θmg kg-1且腹膜內(nèi)劑量為ρmg kg-1，則調(diào)節(jié)物的口服生物利用率為[(ρ/θ)×100]。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地明白，本發(fā)明調(diào)節(jié)物的口服生物利用率的確定除了本發(fā)明說明而非限制性列舉的方法外，可使用體內(nèi)動(dòng)物細(xì)胞模型實(shí)現(xiàn)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地明白所述口服生物利用率的生物活性的讀數(shù)除了是IS/AAR還可以是參數(shù)。很容易想象施用的參考途徑可以是腹膜內(nèi)施用以外的途徑。在一些實(shí)施方案中，所述施用參考路徑可為靜脈內(nèi)注射施用。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明調(diào)節(jié)物的口服生物利用率為腹膜內(nèi)注射的至少1％，至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，或至少45％。
實(shí)施例20表達(dá)人RUP41 GPCR構(gòu)成的轉(zhuǎn)基因小鼠/大鼠/豬本發(fā)明也提供了與表達(dá)人RUP41 GPCR的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物的方法及組合物，所述RUP41 GPCR包含的多肽選自(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO2的多肽；其中在SEQ ID NO2的312位的苯丙氨酸被賴氨酸取代；(c)SEQ ID NO3的多肽；以及(d)SEQ ID NO3的多肽；其中在SEQ ID NO2的312位的苯丙氨酸被賴氨酸取代。
在一些實(shí)施方案中，所述非人哺乳動(dòng)物為小鼠，大鼠或豬。
制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物諸如小鼠、大鼠以及豬的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的，并且任何這樣的方法可被用于本發(fā)明。簡(jiǎn)要地，轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物可通過例如，用具有編碼人RUP41 GPCR的多核苷酸(“轉(zhuǎn)基因”)轉(zhuǎn)染多能干細(xì)胞諸如ES細(xì)胞進(jìn)行制備。成功轉(zhuǎn)化的ES細(xì)胞然后被導(dǎo)入到早期胚胎中，然后植入到同種哺乳動(dòng)物的子宮中。在某些情況下，轉(zhuǎn)化的(“轉(zhuǎn)基因的”)細(xì)胞將包括所產(chǎn)生動(dòng)物胚系的一部分且含有胚系轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的成年家畜然后與其它動(dòng)物交配，由此最后生產(chǎn)出具有它們細(xì)胞中的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的種群，而且可以將轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定地遺傳給它們的任意一個(gè)后代。其它導(dǎo)入多核苷酸的方法可被使用，例如通過顯微注射導(dǎo)入編碼人RUP41 GPCR的多核苷酸到受精卵或早期胚胎中?；蛘?，可通過用含有轉(zhuǎn)基因的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒傳染受精卵將轉(zhuǎn)基因?qū)氲絼?dòng)物中[Jaenisch，R，Proc Natl Acad Sci USA(1976)731260-4]。轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的制造方法描述在，例如，Wall等，J CellBiochem(1992)49113-20；Hogan等，Manipulating the Mouse Embryo.ALaboratory Manual.(1986)Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.；Costa等，F(xiàn)ASEB J(1999)131762-73；WO91/08216；美國(guó)專利4,736,866；以及美國(guó)專利6,504,080；每個(gè)的內(nèi)容全部引入作為參考。
在一些實(shí)施方案中，所述人RUP41 GPCR的表達(dá)是心肌細(xì)胞-選擇性的。在特定實(shí)施方案中，所述所述人RUP41 GPCR的心肌細(xì)胞-選擇性表達(dá)被通過α肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子啟動(dòng)[Subramaniam A等，JBiol Chem(1991)26624613-20；其內(nèi)容在這里全部引入作為參考]。
實(shí)施例21心臟保護(hù)的體內(nèi)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型本發(fā)明化合物可以顯示出具有利用實(shí)施例20中描述的體內(nèi)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型進(jìn)行心臟保護(hù)的作用。在特定實(shí)施方案中，所述動(dòng)物為小鼠、大鼠或豬。
所述化合物可以通過，施用所述化合物給所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，以及測(cè)定是否所述施用導(dǎo)致實(shí)施例18的體內(nèi)大鼠模型或小鼠體內(nèi)模型或類似的豬的IS/AAR相對(duì)于所述單獨(dú)施用載體的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的IS/AAR有所減少進(jìn)行評(píng)價(jià)。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述化合物為本發(fā)明的調(diào)節(jié)物。在一些實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)物降低cAMP的胞內(nèi)水平。在一些實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)物為激動(dòng)劑。在一些實(shí)施方案中，所述化合物被通過腹膜內(nèi)注射施用。優(yōu)選的劑量為0.1-100mg/kg。其它優(yōu)選的劑量選自0.1mg/kg，0.3mg/kg；1.0mg/kg；3.0mg/kg；10mg/kg；30mg/kg and 100mg/kg。安慰劑為單獨(dú)施用的介質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述劑量每天施用。在一些實(shí)施方案中，所述劑量被施用持續(xù)下述的時(shí)間段一周、兩周、三周以及四周。應(yīng)指出這些給藥途徑、劑量范圍、施藥頻率以及給藥持續(xù)時(shí)間是例證性的且不是對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例22RUP41基因敲除的小鼠/大鼠/豬小鼠優(yōu)選的DNA構(gòu)建體將包括，從5′-末端到3′-末端(a)包含在小鼠RUP41基因組序列中的第一核苷酸序列；(b)含有陽(yáng)性選擇標(biāo)記諸如新霉素抗性(neo)標(biāo)記的核苷酸序列；以及(c)包含在小鼠RUP41基因組序列中且位于第一小鼠RUP41核苷酸序列(a)的基因組下游的第二核苷酸序列通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法分離小鼠RUP41基因組序列(Maniatis T等，Molecular CloningA Laboratory Manual(1989)ColdSpring Harbor Laboratory；其全部?jī)?nèi)容引入作為參考)。用于分離小鼠RUP41基因組的探針來(lái)自編碼小鼠RUP41多肽的cDNA，其中所述的cDNA可利用來(lái)自小鼠心臟、肺或脂肪組織的模板mRNA獲得。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些DNA構(gòu)建體也含有位于核苷酸序列(a)上游或核苷酸序列(c)下游的陰性選擇標(biāo)記。優(yōu)選地，陰性選擇標(biāo)記包括胸苷激酶(tk)基因[Thomas等，Cell(1986)44419-28]，潮霉素β基因[Te Riele等，Nature(1990)348649-51]，hprt基因[Van der Lugt等，Gene(1991)105263-7；Reid等，Proc Natl Acad Sci USA(1990)874299-4303]或Diptheria毒素A片段(Dt-A)基因[Nada等，Cell(1993)731125-35；Yagi等，Proc Natl Acad Sci USA(1990)879918-9922]，其內(nèi)容整體引入作為參考。優(yōu)選地，陽(yáng)性選擇標(biāo)記位于小鼠RUP41外顯子序列內(nèi)，中斷了編碼小鼠RUP41多肽的序列。這些置換型載體被描述在，例如，Thomas等，Cell(1986)44419-28；Thomas等，Cell(1987)51503-12；Mansour等，Nature(1988)336348-52；Koller等，Annu Rev Immunol(1992)10705-30；以及美國(guó)專利5,631,153；其內(nèi)容整體引入作為參考。
第一和第二核苷酸序列(a)和(c)可隨意地位于小鼠RUP41調(diào)節(jié)序列，內(nèi)含子序列，外顯子序列或含有調(diào)控和/或內(nèi)含子和/或外顯子序列的序列的中間。核苷酸序列(a)和(c)核苷酸序列的大小為1到50kb，優(yōu)選地從1到10kb，更優(yōu)選地2到6kb，且最優(yōu)選地2到4kb。
制備含有選擇性基因敲除的小鼠的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的，且已經(jīng)成功地使各種基因失活。
大鼠對(duì)于大鼠的基因靶向技術(shù)為比用于小鼠的更為不實(shí)用且是很有積極興趣的研究區(qū)域。一種方法是使大鼠胚胎干細(xì)胞(ESC)類細(xì)胞中的大鼠RUP41基因失活，則然后在兩個(gè)細(xì)胞晶胚融合后將具有失活的大鼠RUP41基因的細(xì)胞注射到大鼠胚囊中[Krivokharchenko等，MolReprod Dev(2002)61460-5]。
在嚴(yán)格雜交條件下利用大鼠RUP41多核苷酸SEQ ID NO6篩選大鼠基因組文庫(kù)來(lái)鑒定大鼠基因。通過在類似條件下篩選大鼠心臟或腦cDNA文庫(kù)來(lái)鑒定全長(zhǎng)的或大體上全長(zhǎng)的大鼠RUP41 cDNA。嚴(yán)格核酸雜交的條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的[Maniatis T，等(1982)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NewYork]。
另一種可選的方法是將大鼠ESC類細(xì)胞中的大鼠RUP41基因失活，然后將具有失活的大鼠RUP41基因的大鼠ESC類細(xì)胞的核轉(zhuǎn)移到去核的卵母細(xì)胞中[Sato K等，Hum Cell(2001)14301-4；Wakayama andYanagimachi，Semin Cell Dev Biol(1999)10253-8；Hochedlinger andJaenisch，Nature(2002)4151035-8；Yanagimachi；Mol Cell Endocrinol(2002)187241-8；其內(nèi)容在這里全部引入作為參考]。
中描述的類似或可選的用于小鼠的方法可用來(lái)制備RUP41的基因敲除大鼠。
豬類似的或可選擇的方法可用來(lái)制備RUP41的基因敲除豬[參見，例如，Lai等，Science(2002)2951089-1092；其內(nèi)容在這里全部引入作為參考]。
CRE-LoxP系統(tǒng)含有選擇性RUP41基因敲除心肌細(xì)胞的小鼠/大鼠/豬小鼠這些新的DNA構(gòu)建體利用P1噬菌體的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)。P1噬菌體具有稱為Cre的重組酶，其與34堿基對(duì)loxP位點(diǎn)相互作用。loxP位點(diǎn)含有兩個(gè)通過8bp保守序列分離的13bp回文序列[Hoess RH等，Nucleic Acids Res(1986)142287-300；其內(nèi)容在這里全部引入作為參考]。具有相同取向的兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間通過Cre酶進(jìn)行的重組導(dǎo)致DNA片段的缺失。
與同源重組技術(shù)聯(lián)合使用的Cre-loxP系統(tǒng)首先被Gu等人所描述[Gu H等，Cell(1993)731155-64；Gu H等，Science(1994)265103-6；其內(nèi)容整體引入作為參考]。簡(jiǎn)而言之，待插入基因組目標(biāo)位置的目的核苷酸序列具有至少兩個(gè)在相同方向上的loxP位點(diǎn)，且位于待由重組體基因組切除的核苷酸序列的相應(yīng)末端。切除作用需要重組細(xì)胞宿主的核內(nèi)重組酶(Cre)的存在。重組酶可在期望的時(shí)間產(chǎn)生通過(a)在含有這些酶的培養(yǎng)基中溫育重組細(xì)胞，通過直接注射Cre酶到目的細(xì)胞中，諸如通過酶脂轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，諸如Baubonis等描述的[Baubonis W和Sauer B，Nucleic Acids Res(1993)212025-9；其內(nèi)容在這里全部引入作為參考；(b)用含有與重組細(xì)胞中功能性啟動(dòng)子可操作地連接的Cre編碼序列的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞宿主，其中啟動(dòng)子任選地是可誘導(dǎo)的，所述載體被導(dǎo)入到重組細(xì)胞宿主中，諸如描述在[Gu H等，Cell(1993)731155-64；其內(nèi)容在這里全部引入作為參考]以及Sauer等[Sauer Band Henderson N，Proc Natl Acad Sci USA(1988)855166-70；其內(nèi)容在這里全部引入作為參考]；(c)將含有與重組細(xì)胞中功能性啟動(dòng)子可操作地連接的Cre編碼序列的多核苷酸導(dǎo)入到細(xì)胞宿主中，其中啟動(dòng)子是任選可誘導(dǎo)的，且所述多核苷酸被導(dǎo)入到細(xì)胞宿主的基因組中通過隨機(jī)插入或者同源重組，諸如Gu等[Gu H等，Science(1994)265103-6；其內(nèi)容在這里全部引入作為參考]描述的。
利用Cre-loxP系統(tǒng)的載體和方法被描述在，例如，Zou等(1994)；Minamisawa S等，J Biol Chem(1999)27410066-70；Chen等，J BiolChem(1998)2731252-6；Chen等，Development(1998)1251943-9；每一個(gè)的內(nèi)容在這里整體引入作為參考]。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，Cre被引入細(xì)胞宿主的基因組通過上述的策略(c)，其中所述的啟動(dòng)子是心肌細(xì)胞選擇性的并導(dǎo)致小鼠RUP41基因組序列的心肌細(xì)胞-選擇性斷裂(loxP側(cè)接的；“floxed”)。在一些實(shí)施方案中，所述心肌細(xì)胞-選擇性啟動(dòng)子是肌球蛋白輕鏈2(mlc-2v)的心室特異性同種型的[Minamisawa S等，J Biol Chem(1999)27410066-70；Chen等，J Biol Chem(1998)2731252-6；每一個(gè)的內(nèi)容在這里整體引入作為參考]。含有插入Cre重組酶編碼序列到內(nèi)源性mlc-2v位點(diǎn)中的轉(zhuǎn)基因小鼠(“mlc-2v cre敲除小鼠”)已被描述在[Chen等，Development(1998)1251943-9；其內(nèi)容在這里全部引入作為參考]。插入選擇性基因的方法在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)[參見，例如，Chen等，Development(1998)1251943-9]。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明描述了一種制備含有RUP41基因的心肌細(xì)胞-選擇性敲除的小鼠的方法，包括將floxed RUP41基因與上述的mlc-2 cre等位基因雜交。
其它制備含有RUP41基因心肌細(xì)胞-選擇性敲除的小鼠的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的；參見，例如，Kuhn R和Torres RM，Methods Mol Biol(2002)180175-204；Sauer B，Methods(1998)14381-92；Gutstein DE等，Circulation Research(2001)88333；Minamino T等，Circulation Research(2001)88587；和Bex A等，J Urol(2002)1682641-2644；其內(nèi)容在這里全部引入作為參考。
大鼠類似的或可選擇的方法[參見，例如，Zan等，Nature Biotechnology(2003)21645-51；其內(nèi)容在這里全部引入作為參考]可用來(lái)制備含有RUP41基因敲除的大鼠。
豬類似的或可選擇的方法可用來(lái)制備含有RUP41基因心肌細(xì)胞-選擇性基因敲除的豬[參見，例如，Lai等，Science(2002)2951089-1092；其內(nèi)容在這里全部引入作為參考]。
本申請(qǐng)通篇引用了各種出版物、專利以及公開的專利申請(qǐng)。本申請(qǐng)中引用的這些出版物、專利以及公開的專利申請(qǐng)的內(nèi)容被在這里整體引入作為參考。本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的改進(jìn)和延伸被包括在上述的發(fā)明內(nèi)容以及權(quán)利要求的范圍之中。
序列表<110>阿瑞那制藥公司(Arena Pharmaceuticals，Inc.)<120>治療缺血性心臟病及充血性心衰竭的人類G蛋白偶聯(lián)受體及其調(diào)節(jié)物(HUMAN G PROTEIN-COUPLED RECEPTOR AND MODULATORS THEREOF FOR THETREATMENT OF ISCHEMIC HEART DISEASE AND CONGESTIVE HEART FAILURE)<130>SCT050074-47<150>US 60/400,774<151>2002-08-01<160>12<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1881<212>DNA<213>Homo sapien<400>1gttatttctt caaaaggaaa acacaatttt cttttatatc aaaacaatgc aaacttgatg 60gttcttaatt ctacattttc tattaatagt ttacaaactt aaaaattaaa ctaagtacac 120aattgaaaga tttttttttc ttacaaagaa cacgttatac gtcatttaaa ttgccaaata 180tcaaatagtt tattctattt cactttctag ggaaaaaaac caactgctcc aaaagaatgt 240gtttttctcc cattctggaa atcaacatgc agtctgaatc taacattaca gtgcgagatg 300acattgatga catcaacacc aatatgtacc aaccactatc atatccgtta agctttcaag 360tgtctctcac cggatttctt atgttagaaa ttgtgttggg acttggcagc aacctcactg 420tattggtact ttactgcatg aaatccaact taatcaactc tgtcagtaac attattacaa 480tgaatcttca tgtacttgat gtaataattt gtgtgggatg tattcctcta actatagtta 540tccttctgct ttcactggag agtaacactg ctctcatttg ctgtttccat gaggcttgtg 600tatcttttgc aagtgtctca acagcaatca acgtttttgc tatcactttg gacagatatg 660acatctctgt aaaacctgca aaccgaattc tgacaatggg cagagctgta atgttaatga 720tatccatttg gattttttct tttttctctt tcctgattcc ttttattgag gtaaattttt 780
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20 25 30Pro Leu Ser Tyr Pro Leu Ser Phe Gln Val Ser Leu Thr Gly Phe Leu35 40 45Met Leu Glu Ile Val Leu Gly Leu Gly Ser Asn Leu Thr Val Leu Val50 55 60Leu Tyr Cys Met Lys Ser Asn Leu Ile Asn Ser Val Ser Asn Ile Ile65 70 75 80Thr Met Asn Leu His Val Leu Asp Val Ile Ile Cys Val Gly Cys Ile85 90 95Pro Leu Thr Ile Val Ile Leu Leu Leu Ser Leu Glu Ser Asn Thr Ala100 105 110Leu Ile Cys Cys Phe His Glu Ala Cys Val Ser Phe Ala Ser Val Ser115 120 125Thr Ala Ile Asn Val Phe Ala Ile Thr Leu Asp Arg Tyr Asp Ile Ser130 135 140Val Lys Pro Ala Asn Arg Ile Leu Thr Met Gly Arg Ala Val Met Leu145 150 155 160Met Ile Ser Ile Trp Ile Phe Ser Phe Phe Ser Phe Leu Ile Pro Phe165 170 175Ile Glu Val Asn Phe Phe Ser Leu Gln Ser Gly Asn Thr Trp Glu Asn180 185 190Lys Thr Leu Leu Cys Val Ser Thr Asn Glu Tyr Tyr Thr Glu Leu Gly195 200 205Met Tyr Tyr His Leu Leu Val Gln Ile Pro Ile Phe Phe Phe Thr Val210 215 220
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Asp<210>3<211>433<212>PRT<213>Homo sapien<400>3Met Cys Phe Ser Pro Ile Leu Glu Ile Asn Met Gln Ser Glu Ser Asn1 5 10 15Ile Thr Val Arg Asp Asp Ile Asp Asp Ile Asn Thr Asn Met Tyr Gln20 25 30Pro Leu Ser Tyr Pro Leu Ser Phe Gln Val Ser Leu Thr Gly Phe Leu35 40 45Met Leu Glu Ile Val Leu Gly Leu Gly Ser Asn Leu Thr Val Leu Val50 55 60Leu Tyr Cys Met Lys Ser Asn Leu Ile Asn Ser Val Ser Asn Ile Ile65 70 75 80Thr Met Asn Leu His Val Leu Asp Val Ile Ile Cys Val Gly Cys Ile85 90 95Pro Leu Thr Ile Val Ile Leu Leu Leu Ser Leu Glu Ser Asn Thr Ala100 105 110Leu Ile Cys Cys Phe His Glu Ala Cys Val Ser Phe Ala Ser Val Ser115 120 125Thr Ala Ile Asn Val Phe Ala Ile Thr Leu Asp Arg Tyr Asp Ile Ser130 135 140Val Lys Pro Ala Asn Arg Ile Leu Thr Met Gly Arg Ala Val Met Leu145 150 155 160
Met Ile Ser Ile Trp Ile Phe Ser Phe Phe Ser Phe Leu Ile Pro Phe165 170 175Ile Glu Val Asn Phe Phe Ser Leu Gln Ser Gly Asn Thr Trp Glu Asn180 185 190Lys Thr Leu Leu Cys Val Ser Thr Asn Glu Tyr Tyr Thr Glu Leu Gly195 200 205Met Tyr Tyr His Leu Leu Val Gln Ile Pro Ile Phe Phe Phe Thr Val210 215 220Val Val Met Leu Ile Thr Tyr Thr Lys Ile Leu Gln Ala Leu Asn Ile225 230 235 240Arg Ile Gly Thr Arg Phe Ser Thr Gly Gln Lys Lys Lys Ala Arg Lys245 250 255Lys Lys Thr Ile Ser Leu Thr Thr Gln His Glu Ala Thr Asp Met Ser260 265 270Gln Ser Ser Gly Gly Arg Asn Val Val Phe Gly Val Arg Thr Ser Val275 280 285Ser Val Ile Ile Ala Leu Arg Arg Ala Val Lys Arg His Arg Glu Arg290 295 300Arg Glu Arg Gln Lys Arg Val Phe Arg Met Ser Leu Leu Ile Ile Ser305 310 315 320Thr Phe Leu Leu Cys Trp Thr Pro Ile Ser Val Leu Asn Thr Thr Ile325 330 335Leu Cys Leu Gly Pro Ser Asp Leu Leu Val Lys Leu Arg Leu Cys Phe340 345 350Leu Val Met Ala Tyr Gly Thr Thr Ile Phe His Pro Leu Leu Tyr Ala355 360 365
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<221>misc_feature<222>(514)..(514)<223>n is a，c，g，or t<400>6atgcatgctc gagcggccgc cagtgtgatg gatatctgca gaattcgccc ttgtaataat 60tgccctccgg cgagccgtga aacgacaccg ggaacgacga gagaggcaga aaagagtctt120
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<223>Novel Sequence<400>7tcccccggga aaaaaaccaa ctgctccaaa 30<210>8<211>31<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Novel Sequence<400>8taggatccat ttgaatgtgg atttggtgaa a31<210>9<211>36<212>DNA<213>Artificial<220>
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<223>Novel Sequence<400>12ctagtctgtg acaacctgag g2權(quán)利要求
1.一種鑒定候選化合物是否為RUP41 GPCR調(diào)節(jié)物的方法，所述GPCR包含一種選自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其片段或變體，其中受體偶聯(lián)至G蛋白，所述方法包含下列步驟(a’)將候選化合物與受體接觸；(b’)確定受體功能是否已被調(diào)節(jié)，其中受體功能的改變表示該候選化合物為所述GPCR的調(diào)節(jié)物。
2.一種鑒定候選化合物是否為心臟保護(hù)的調(diào)節(jié)物的方法，包含下列步驟(a)將候選化合物與GPCR接觸，所述GPCR包含一種選自如下的多肽(i)SEQ ID NO2的多肽；(ii)SEQ ID NO3的多肽；以及(iii)SEQ ID NO5的多肽；或其片段，其中該受體偶聯(lián)至G蛋白；以及(b)確定受體功能是否已被調(diào)節(jié)；其中該受體功能的改變表示該候選化合物為該心臟保護(hù)的調(diào)節(jié)物。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述GPCR為重組體。
4.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述確定是通過測(cè)量第二信使的含量進(jìn)行的，所述第二信使選自環(huán)AMP(cAMP)，環(huán)GMP(cGMP)，三磷酸肌醇(IP3)，二酰甘油(DAG)及Ca2+。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述第二信使為cAMP。
6.權(quán)利要求5的方法，其中細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量降低。
7.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述確定通過使用黑色素分析進(jìn)行。
8.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述確定是通過測(cè)量結(jié)合至含有所述GPCR的膜的GTPγS進(jìn)行。
9.權(quán)利要求1或2的方法，進(jìn)一步包含將候選化合物對(duì)受體的調(diào)節(jié)與通過受體與受體的已知調(diào)節(jié)物接觸對(duì)受體的第二調(diào)節(jié)相比較的步驟。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法鑒定的調(diào)節(jié)物。
11.權(quán)利要求10的調(diào)節(jié)物，選自激動(dòng)劑，部分激動(dòng)劑，反激動(dòng)劑以及拮抗劑。
12.權(quán)利要求11的調(diào)節(jié)物，其中所述調(diào)節(jié)物降低細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。
13.權(quán)利要求11或12的調(diào)節(jié)物，其中所述調(diào)節(jié)物為激動(dòng)劑。
14.一種調(diào)節(jié)RUP41 GPCR活性的方法，所述GPCR包含一種選自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其片段或變體，其中所述GPCR偶聯(lián)至G蛋白，所述方法包含將該受體與權(quán)利要求10至13任一項(xiàng)的調(diào)節(jié)物接觸的步驟。
15.權(quán)利要求14項(xiàng)的方法，其中所述接觸包含將調(diào)節(jié)物施用于含有所述受體的膜。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述接觸包含將調(diào)節(jié)物施用于含有所述受體的細(xì)胞或組織。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述接觸包含將調(diào)節(jié)物施用于含有所述受體的個(gè)體。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述個(gè)體需要預(yù)防或治療選自如下的心血管失調(diào)(a)心輸出量降低；以及(b)靜脈壓升高。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述個(gè)體需要預(yù)防或治療選自如下的缺血性心臟病(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。
20.權(quán)利要求17的方法，其中所述個(gè)體需要改變選自如下的心血管功能(a)降低心臟肥大；(b)增加心臟射血量；(c)降低心室腔體積；以及(d)降低心肌細(xì)胞凋亡。
21.一種改變需要所述改變的個(gè)體心血管功能的方法，包含將治療有效量的第二方面調(diào)節(jié)物與RUP41 GPCR接觸，所述GPCR包含一種選自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其等位基因變體。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述心血管功能的改變選自如下(a)降低心臟肥大；(b)增加心臟射血量；(c)降低心室腔體積；以及(d)降低心肌細(xì)胞凋亡。
23.一種預(yù)防或治療需要所述改變的個(gè)體心血管失調(diào)的方法，其包含將治療有效量的第二方面調(diào)節(jié)物與RUP41 GPCR接觸，所述GPCR包含一種選自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其等位基因變體。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述心血管失調(diào)選自如下(a)心輸出量降低；以及(b)靜脈壓升高。
25.一種預(yù)防或治療需要所述改變的個(gè)體缺血性心臟病的方法，其包含將治療有效量的第二方面調(diào)節(jié)物與RUP41 GPCR接觸，所述GPCR包含一種選自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其等位基因變體。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述缺血性心臟病選自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。
27.一種制備組合物的方法，包含鑒定RUP41 GPCR的調(diào)節(jié)物，然后將載體與調(diào)節(jié)物混合，其中的調(diào)節(jié)物可通過權(quán)利要求1或2的方法進(jìn)行鑒定。
28.一種藥學(xué)或者生理學(xué)可接受的組合物，包含權(quán)利要求10至13任一項(xiàng)的調(diào)節(jié)物，主要由其組成或者由其組成。
29.一種改變心血管功能的方法，包含給需要所述改變的個(gè)體提供或施用權(quán)利要求28所述的藥學(xué)或者生理學(xué)可接受的組合物，其中所述心血管功能的改變選自(a)降低心臟肥大；(b)增加心臟射血量；(c)降低心室腔體積；以及(d)降低心肌細(xì)胞凋亡。
30.一種預(yù)防或治療心血管失調(diào)的方法，其包含給需要所述治療的個(gè)體提供或者施用權(quán)利要求28所述的藥學(xué)或生理學(xué)可接受的組合物，其中所述心血管失調(diào)選自(a)心輸出量降低；以及(b)靜脈壓升高。
31.一種預(yù)防或治療缺血性心臟病的方法，其包含給需要所述治療的個(gè)體提供或施用權(quán)利要求28所述的藥學(xué)或生理學(xué)可接受的組合物，其中所述缺血性心臟病選自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。
32.一種利用權(quán)利要求10至13任一項(xiàng)的調(diào)節(jié)物制備用于預(yù)防或者治療個(gè)體心血管失調(diào)的藥物的方法，其中所述心血管失調(diào)選自(a)心輸出量降低；以及(b)靜脈壓升高。
33.一種利用權(quán)利要求10至13項(xiàng)任一項(xiàng)的調(diào)節(jié)物制備用于預(yù)防或治療個(gè)體缺血性心臟病的方法，其中所述缺血性心臟病選自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。
34.權(quán)利要求17至26以及29至33任一項(xiàng)的方法，其中所述個(gè)體為哺乳動(dòng)物。
35.一種制造基因敲除小鼠的方法，其中所述基因敲除小鼠易患選自如下的心血管失調(diào)(a)心輸出量降低；以及(b)靜脈壓升高；包含敲除編碼SEQ ID NO5的多肽的基因的步驟。
36.一種制造基因敲除小鼠的方法，其中所述基因敲除小鼠易患選自如下的缺血性心臟病(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭；包含敲除編碼SEQ ID NO5的多肽的基因的步驟。
37.權(quán)利要求35或36的基因敲除小鼠。
38.一種利用權(quán)利要求37的基因敲除小鼠鑒定候選化合物是否對(duì)預(yù)防或治療心血管失調(diào)或缺血性心臟病具有療效的方法。
39.一種制造基因敲除大鼠的方法，其中所述基因敲除大鼠易患選自如下的心血管失調(diào)(a)心輸出量降低；以及(b)靜脈壓升高；所述方法包含敲除在高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO6的多核苷酸雜交的基因的步驟。
40.一種制造基因敲除大鼠的方法，其中所述基因敲除大鼠易患選自如下的缺血性心臟病(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭；所述方法包含敲除在高嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO6的多核苷酸雜交的基因的步驟。
41.權(quán)利要求39或40的基因敲除大鼠。
42.一種利用權(quán)利要求41的基因敲除大鼠鑒定候選化合物是否對(duì)預(yù)防或治療心血管失調(diào)或缺血性心臟病具有療效的方法。
43.一種分離的大鼠RUP41多核苷酸，選自(a)包含SEQ ID NO6的連續(xù)至少75個(gè)核苷酸的多核苷酸；(b)包含SEQ ID NO6的連續(xù)至少150個(gè)核苷酸的多核苷酸；(c)包含SEQ ID NO6的連續(xù)至少250個(gè)核苷酸的多核苷酸；(d)包含SEQ ID NO6的連續(xù)至少350個(gè)核苷酸的多核苷酸；及(e)包含SEQ ID NO6的連續(xù)至少500個(gè)核苷酸的多核苷酸；或其互補(bǔ)多核苷酸。
44.一種重組載體，所述重組載體包含權(quán)利要求43的分離的多核苷酸。
45.一種宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求44的重組載體。
46.一種含有組成性活化G蛋白偶聯(lián)受體與G蛋白的GPCR融合蛋白構(gòu)建體，所述GPCR包含選自如下的RUP41多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其片段或變體。
47.一種鑒定候選化合物是否為RUP41 GPCR配體的方法，所述GPCR包含選自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其片段或變體，包含如下步驟(a’)在存在或不存在所述候選化合物的條件下，將所述多肽與已知調(diào)節(jié)物(任選標(biāo)記的)接觸；(b’)檢測(cè)所述已知調(diào)節(jié)物與所述多肽的復(fù)合物；以及(c’)確定在化合物存在的情況下是否比不存在的情況形成更少的所述復(fù)合物；其中所述確定表示該候選化合物為所述GPCR的配體。
48.一種放射顯影的方法，包含給需要所述放射顯影的給體提供或者施用放射性標(biāo)記的化合物，所述化合物選自權(quán)利要求2的調(diào)節(jié)物以及權(quán)利要求47的配體。
49.一種人類RUP41 GPCR的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動(dòng)物，所述GPCR包含選自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO2的多肽，其中在SEQ ID NO2的312位的苯丙氨酸被賴氨酸取代；(c)SEQ ID NO3的多肽；以及(d)SEQ ID NO3的多肽，其中在SEQ ID NO3的312位的苯丙氨酸用賴氨酸取代。
50.一種利用權(quán)利要求49的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動(dòng)物鑒定化合物是否具有保護(hù)心臟的效果的方法，其中所述化合物選自權(quán)利要求2的調(diào)節(jié)物以及權(quán)利要求47的配體。
51.一種制造RUP41 GPCR的調(diào)節(jié)物的方法，包含如下步驟(a)根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法鑒定所述調(diào)節(jié)物；以及(b)合成(a)中鑒定的調(diào)節(jié)物。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述調(diào)節(jié)物選自激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑、反激動(dòng)劑以及拮抗劑。
53.權(quán)利要求51的方法，其中所述調(diào)節(jié)物降低細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。
54.權(quán)利要求52或53的方法，其中所述調(diào)節(jié)物為激動(dòng)劑。
55.根據(jù)權(quán)利要求10至13任一項(xiàng)的調(diào)節(jié)物在改變心血管功能中的應(yīng)用。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述心血管功能的改變選自(a)降低心臟肥大；(b)增加心臟射血量；(c)降低心室腔體積；以及(d)減少心肌細(xì)胞凋亡。
57.根據(jù)權(quán)利要求10至13任一項(xiàng)的調(diào)節(jié)物在預(yù)防或治療心血管失調(diào)中的應(yīng)用。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述心血管失調(diào)選自(a)心輸出量降低；以及(b)靜脈壓升高。
59.根據(jù)權(quán)利要求10至13任一項(xiàng)的調(diào)節(jié)物在預(yù)防或治療缺血性心臟病中的應(yīng)用。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述缺血性心臟病選自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒別候選化合物是否為孤兒G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)調(diào)節(jié)物的方法。優(yōu)選為人類GPCR。在一些實(shí)施方案中，GPCR由心肌細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，GPCR與Gi偶聯(lián)并降低細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。在一些實(shí)施方案中，GPCR的過量表達(dá)會(huì)促進(jìn)心肌細(xì)胞的存活。在一些實(shí)施方案中，GPCR的過量表達(dá)可挽救心肌細(xì)胞免于缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞淍亡。在一些實(shí)施方案中，患有充血性心衰竭個(gè)體體內(nèi)的GPCR被下調(diào)。本發(fā)明的激動(dòng)劑可有效用作治療包含心肌梗塞、心肌梗塞后重造，以及充血性心衰竭等缺血性心臟病的治療劑。
文檔編號(hào)A61K51/08GK1684975SQ03823488
公開日2005年10月19日 申請(qǐng)日期2003年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月1日
發(fā)明者約翰·W·亞當(dāng)姆斯, 丹尼爾·T·康諾利 申請(qǐng)人:阿瑞那制藥公司