專利名稱：與形成新血管有關的疾病的治療方法及合成物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及藥學領域，特別是有關抗血管新生的藥品用以預防和治療疾病。
背景技術：
血管生成作用是在原先已有的微血管上在長出新的血管構造的過程。在此過程中，內(nèi)皮細胞由于蛋白質(zhì)分解酶的降解作用得以從作為基質(zhì)的基底膜上脫離出來。然后這些細胞從母體血管上遷移出來，再分裂并形成新分化的血管構造(Risau，(1997)Nature386671-674；Wilting et al.，(1995)Cell.Mol.Biol.Res.41(4)219-232)?，F(xiàn)以發(fā)現(xiàn)許多不同的生物因子具有控制血管形成的功能(Bussolino et al.，(1997)Trends in Biochem sci22(7)251-256；Folkman and D’Amore，(1996)，Cell 871153-1155)。這些因子包括各種功能的蛋白質(zhì)，例如生長因子、細胞表面受體、蛋白酶、蛋白酶抑制劑以及細胞外的基質(zhì)蛋白質(zhì)(Achen and Stacker，(1998)Int.J.Exp.Pathol.79255-265；Devalaraja andRichmond，(1999)Trends in Pharmacol.Sci.20(4)151-156；Hanahan，(1997)Science 27748-50；Maisonpierre et al.，(1997)Science 27755-60；Suri et al，(1996)Cell871171-1180；Sato et al，(1995)Nature 37670-74；Mignatti and Rifkin，(1996)EnzymeProtein 49117-137；Pintucci et al.，(1996)Semin thromb Hemost 22(6)517-524；Vernonand Sage，(1995)Am.J.Pathol.147(4)873-883；Brooks et al.，(1994)Science264569-571；Koch et al.，(1995)Nature 376517-519)。血管生成過程的復雜性以及控制其進展的因子的多樣性，提供許多適用于治療的介入點以控制活體內(nèi)血管的形成。
血管生成作用通常發(fā)生在胚胎發(fā)生期間、生長期間及特殊情況，例如創(chuàng)傷愈合以及女性生殖周期，且需要受到小心的控制(Wilting and Christ，(1996)Naturewissenschaften83153-164；Goodger and Rogers，(1995)Microcirulation 2329-343；Augustin etal.，(1995)Am.J.Pathol.147(2)339-351)。在血管生成過程中的一些重要步驟在許多人類疾病中起到關鍵作用，這些病包括腫瘤生長以及遷移性的癌癥、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、風濕性關節(jié)炎以及其它發(fā)炎性的疾病，例如牛皮癬(Folkman，(1995)NatureMed.I(1)27-31；Polverini，(1995)Rheumatology 38(2)103-112；Healy et al.，(1998)Hum.Repord.Update 4(5)736-396).在這些病例中，疾病進展受到未受調(diào)控的持續(xù)性血管生成作用所驅使。例如，在風濕性關節(jié)炎中，新的微血管入侵關節(jié)并破壞軟骨。在糖尿病性視網(wǎng)膜病變中，視網(wǎng)膜微血管入侵玻璃狀體，造成出血致盲。重要的是，腫瘤生長及轉移與血管生成作用息息相關。大部分初始腫塊要度過一段漫長的無血管的生長階段，在此期間他的生長被限制在1-2mm直徑。在此大小下，腫瘤細胞可經(jīng)被動式擴散取得必須的氧及營養(yǎng)供應。此類微小的腫塊最終會啟動血管生成作用并征募周圍的血管，很快的生長出微血管并使腫塊血管化，提供腫瘤持續(xù)擴張以及惡性細胞遷徙至遠方的潛力。雖然我們對于在病理性血管生成期間所發(fā)生的生物活動的了解已經(jīng)有了長足的進展，但仍未開發(fā)出有效的藥用化合物來控制活體內(nèi)的血管生成。因此，能控制血管生成的有效治療對于緩解許多人類疾病具有潛力。
傳統(tǒng)上，研究藥用化合物主要是篩選具有令人滿意的藥物性質(zhì)的化學合成物，然后在活體內(nèi)測試它的毒性及療效。用這種方法選擇的化合物往往在活體內(nèi)具有毒副作用，此法在研發(fā)對治療疾病有效的血管生成抑制劑時并不成功。最近，已應用分子生物學技術發(fā)展出血管生成抑制劑?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)血管生成的蛋白質(zhì)抑制劑有安史達丁(angiostatin)(O’Reilly etal.，(1994)Cell 79(2)315-328)以及內(nèi)史達丁(endostatin)(O’Reilly et al.，(1997)Cell88(2)227-285)，它們可在實驗模式中控制血管的形成。然而，該蛋白質(zhì)治療劑的生產(chǎn)價格昂貴。還發(fā)現(xiàn)它難以配制及對患者給藥。目前，蛋白質(zhì)血管生成抑制劑并未發(fā)展成治療的藥物。因此，人們需要一種可安全的投用給病人且可有效抑制血管內(nèi)皮細胞病理性生長的治療化合物。本發(fā)明提供適于此目的及具有相關優(yōu)點的組成物(化合物)和方法。

發(fā)明內(nèi)容
申請人發(fā)現(xiàn)菜菔硫烷及其衍生物可抑制內(nèi)皮細胞的生長和增生以及血管生成的過程。因此，本發(fā)明提供一些抑制內(nèi)皮細胞增生的方法，特別是對于那些到達病理分化程度或在組織內(nèi)的特定細胞。本發(fā)明亦提供抑制組織中新血管形成的方法。各種方法均需將有效量的菜菔硫烷(sulforaphane)、或其在藥學上可被接受的鹽類、衍生物、或前驅藥提供到細胞或組織。從一個方面來講該法可與其它化合物、其它配方、或者其它能抑制血管生長新血管形成或過度的細胞增長如發(fā)生于癌癥的療程聯(lián)用，此等療程包括但卻不限于化療，放療以及使用抗新生血管生成的化合物。
本發(fā)明亦提供一種治療與內(nèi)皮細胞增生和/或新血管形成相關疾病的方法，它是通過給患者使用有效量的菜菔硫烷，或其在藥學上可以接受的鹽類、衍生物或前驅藥。從一個方面來講該法可與其他化合物、其他配方或與其他能抑制血管生長新血管形成或過度的細胞增長，如發(fā)生于癌癥的療程聯(lián)用，此等療程包括但卻不限于化療，放療以及使用抗新生血管生成的化合物。本發(fā)明亦提供治療病人的成套組分。
本發(fā)明進一步提供一種篩選新的治療藥劑的方法以確認其治療效果與菜菔硫烷，或其在藥學上可以接受的鹽類、衍生物或前驅藥相同、相似或更佳。篩選時需要比較菜菔硫烷，或其在藥學上可以接受的鹽類、衍生物或前驅藥與藥劑之間的抗增值效果。
本發(fā)明還進一步提供一種提高某一化合物、配方或可用于治療及預防新血管形成、血管生長、瘤形成或癌癥的療程的療效和降低治療費用的方法。此等治療包括但不限于化療、放療及使用抗新生血管生成的化合物。


圖1顯示通過內(nèi)皮細胞化驗，L-菜菔硫烷、D-菜菔硫烷以及D，L-菜菔硫烷在不同濃度下對內(nèi)皮細胞增生的抑制作用。
具體實施例方式
本文通篇引用各種出版物、專利以及已發(fā)表的專利說明作為參考文獻。特此將這些出版物、專利以及已發(fā)表的專利說明的內(nèi)容并入本文參考文獻，以便在本文中更完整的描述關于本發(fā)明的最新技術。
本發(fā)明中除特別說明外，使用到分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生化學以及免疫學均為熟知的技術，該技術在文獻中有完整的說明。
定義本文中某些術語的定義如下在說明書以及專利申請范圍中使用的單數(shù)形式“a”、“an”以及“the”除非文中有明確的指明，否則也包括大多數(shù)的含義。例如，本文之“一種細胞”包括一種大多數(shù)的細胞，并包括其混合物。
本文中“包含”是指組成物以及方法包括列舉的要素，并不排除其他要素。當用以定義組成物以及方法時，“本質(zhì)上由……組成”應排除組合內(nèi)重要要素之外的任何其他要素。因此，本質(zhì)上由定義之要素組成的組合物將不排除源自分離及純化方法和藥學上可被接受載體之微量污染物，例如，磷酸鹽緩沖的生理食鹽水、防腐劑等?！捌涫怯伞M成”則應排除在應用本發(fā)明組成物時的其他成分及實質(zhì)方法步驟以外的微量元素。有各個暫定義術語定義的具體實施例均屬于本發(fā)明的范圍。
本文的“分離”是指分離自組成、細胞以及其他部分，其中的化合物通常與天然物相關。
“患者”或“宿主”是指脊椎動物，較佳者為動物或者哺乳動物，更佳者為人類病患。哺乳動物包括(但非限于)鼠科動物、猴子、人類、家畜、競技動物及寵物。
本文中的“癌癥”、“贅生物”及“腫瘤”可交互使用，并可為單數(shù)或者多數(shù)形式，意指具有進行惡性變形作用對宿主機體造成病變的細胞。初級癌細胞(即取自接近惡性變形位點的細胞)可以用已為大家接受的技藝(尤其是組織學的檢驗)與非癌細胞加以區(qū)別。本文中癌細胞的定義不僅包括初級癌細胞，也包括任何源自癌細胞祖先的細胞。此包括轉移化的細胞，以及活體外的培養(yǎng)物，以及源自癌細胞的細胞株。當提到此類型的癌癥時通常是指固體腫瘤，“臨床上可偵測的”腫瘤是指可用；例如計算機斷層掃描、磁共振掃描(MRI)、X射線、超聲波或觸診偵測的腫瘤塊。單獨之生化和免疫上的發(fā)現(xiàn)不符合此定義。
本文之“抑制”是指停止、延遲或減緩組織中的內(nèi)皮細胞生長、增生或細胞分裂或血管形成。監(jiān)視抑制的方法包括(但不限于)內(nèi)皮細胞增生測定、通過測定血液含量來測量血管床的體積以及定量的測定血管構造的密度。當培養(yǎng)物為混合的細胞時，新血管形成可用定量測定表現(xiàn)內(nèi)皮細胞專一標識的細胞，例如血管生成因子、蛋白質(zhì)分解酶以及內(nèi)皮細胞專一的細胞黏著分子來加以監(jiān)測。
“組合物”是指活性劑與惰性(例如一種可偵測的藥劑或標記)或活性(如一種輔藥)的化合物或組合物的組合。
“組合藥物”意指包括活性劑與活性載體的組合，使組合物適合于活體外、活體內(nèi)或離體使用來診斷或治療。
本文中的“藥學上可接受的載體”包含任何標準藥學上的載體，例如磷酸鹽緩沖的生理食鹽水溶液、水、及乳狀液，例如油/水或水/油乳劑、及各種類型的潤濕劑。組成物亦可包括穩(wěn)定劑以及防腐劑。例如載體、穩(wěn)定劑以及輔藥，參閱MartinREMINGTON’SPHARM.SD.，15thED.(MackPubl.Co.，Easton(1975))。
“有效量”是指足以達成有利的作用或所需的結果的量。例如可達成所需的治療效果的治療量。此量可與預防有效的量(預防疾病或疾病癥狀丌始作用的量)相同或不同。有效量可與一種或多種用藥、應用或劑量共同施用。
正如在此所用的，以及除非另外描述，“菜菔硫烷”是菜菔硫烷葡萄糖苷(sulforaphane glucosinate)(SGS)分解的糖苷配基產(chǎn)品，這些成分通常是存在于十字花科蔬菜(例如卷心菜、硬花甘藍、硬花甘藍芽、布魯塞爾菜芽、花椰菜、花椰菜芽、白菜、甘藍、羽衣甘藍、ARUGULA、大頭菜、芥菜、蘿卜、紅甜菜及水田芥)。除非另外描述，這個名詞包括菜菔硫烷的衍生物及其藥學上可以接受的鹽類或前驅藥。新生的西花芽和椰菜花芽，有特別豐富的菜菔硫烷葡萄糖苷衍生物。菜菔硫烷葡萄糖苷又名葡萄糖苷葡萄糖硫烷。菜菔硫烷的分子方程式是C6H11NOS2，它的分了量是177.29，它又名“4-甲基亞硫酸丁烷等硫氰”，及(-)-1-等硫氰-4(R)-“甲基亞硫酰丁烷”。有認為菜菔硫烷可能具有抗癌性質(zhì)由于它能誘導第II期解毒酶，例如谷胱苷肽，S-轉換酶及P-苯醌還原酶。這些抗癌性質(zhì)可抵抗致癌物及具有毒性的親電子性物質(zhì)。
本發(fā)明申請人發(fā)現(xiàn)菜菔硫烷可抑制內(nèi)皮細胞生長并具有抗血管生成的性質(zhì)。依據(jù)此類發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明通過提供具生長抑制量的菜菔硫烷、或其藥學上可以接受的衍生物、鹽類或前驅藥至細胞來提供抑制內(nèi)皮細胞生長的方法。本發(fā)明亦通過提供抗血管生成作用量的菜菔硫烷、或其藥學上可以接受的鹽類、衍生物或前驅藥至組織來提供抑制組織血管生成的方法。
此方法可在活體外或活體內(nèi)施行。當在活體外施行時，內(nèi)皮細胞或血管化的組織可在熟悉此技藝的專業(yè)人士熟知的條件下(例如舉例于下)進行培養(yǎng)。細胞及/或組織可取自己建立的細胞株或用取自患者活組織切片檢查的樣本培養(yǎng)。然后可將菜菔硫烷、或其藥學上可以接受的衍生物、鹽類或前驅藥直接加入培養(yǎng)液或以組合藥物的成分投送。
其中有一種菜菔硫烷衍生物為菜菔亞硝酸鹽。本文中的“菜菔硫烷”除非特殊說明，包含各種單獨的具體實施例。該名稱包含外消旋物、以及其純化的鏡像異構的形式(D-，L-)以及(D-，L)，衍生物，例如，菜菔硫烷亞硝酸鹽(sulforaphane nitrile)、其藥學上可被接受的鹽類以及前驅藥物。外消旋菜菔硫烷的純化方法如下述。其特色之一是純化的菜菔硫烷僅為(D-)形式。在另一特色中則僅為(L-)形式。外消旋(D-)或(L-)形式都各自可從市售得到，而且可用熟知的技藝加以分離。例如，可使用HPLC對掌柱(chiral columns)，象對掌性的-AGP、對掌性的-CBH、以及對掌性的-HAS，它們可購自Chrom TechInternational AB.Perkins-Elmer也有銷售對掌性的成套的分離裝置，其名稱為Sulfadex對掌性分離裝置。
鹽類的例子包括乙酸鹽、乙二酸鹽、藻膠酸鹽、天門冬氨酸鹽、重硫酸鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環(huán)戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡萄糖庚酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫氯化物、氫溴化物、氫碘化物、2-烊基乙烷磺酸鹽、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、甲磺酸鹽、2-奈磺酸鹽、菸堿酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、果膠質(zhì)酸鹽、高硫酸鹽、苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、叔戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽以及十一烷酸鹽。其它鹽類的實施例包括本發(fā)明化合物的陰離子，例如Na+、NH+，及NW4+(其中W是C1-4烷基)。
用于治療時，本發(fā)明化合物種的鹽類是藥學上可被接受的鹽類。然而，非藥學上可被接受的酸及堿的鹽類亦可使用，例如來制備或純化成約學上可被接受的化合物。
并非每次治療均對各個病人都會有效，因此在活體外測定用藥劑量對每個人的功效將會是有利的。本法提供這些手段用來測定菜菔硫烷是否能治療各個病患相關于內(nèi)皮細胞病理性增生有關的各個病人的特殊疾病。例如，將分離自病忠的組織活體與有效量的組合藥物接觸或者在細胞有效的生長以及增生的條件下按此定義進行治療。用常規(guī)的方法(例如描述于此的CPAE測定)測定病理細胞生長受到的抑制，顯示本發(fā)明的組成物及/或療法可有效地治療病患者。
血管生長或新血管化是新血管形成的基本過程。它涉及基本的生理現(xiàn)象，例如生殖發(fā)生以及創(chuàng)傷愈合。在正常的情況下，血管生長受到高度調(diào)控。然而，許多疾病受到持續(xù)性未調(diào)控的血管生長所驅動。在風濕性關節(jié)炎中，新的微血管入侵關節(jié)并破壞軟骨。在糖尿病視網(wǎng)膜病變中，視網(wǎng)膜中新的微血管入侵玻璃狀體，造成出血，以致失明。腫瘤生長以及腫瘤轉移亦與血管生長作用相互依存。大多數(shù)初級固體腫瘤經(jīng)過長期無血管的狀態(tài)(明顯的潛伏期)，此時生長的最大限度約1-2毫米直徑。至此大小，腫瘤細胞可以通過簡單的被動擴散取得必須的氧以及營養(yǎng)素。此類微小的腫瘤塊經(jīng)由征集周圍的成熟宿主血管，最終可丌始長出新的微血管，并繼續(xù)生長，最后滲入腫瘤塊，這樣就促使腫瘤塊無情的擴張，也促使其產(chǎn)生生血性遷移性的擴散。血管的開始生成最初被假設為是由于受到腫瘤細胞產(chǎn)生異位和精確制作所觸發(fā)的這些腫瘤細胞是一種生長因子，被稱為“腫瘤血管生成因子”(TAF)。
本發(fā)明也向患有與病理性新血管形成有關病癥的病人提供一個治療，該法對患者投用有效量的菜菔硫烷(外消旋物D-或L-)，或內(nèi)含一種或多種此類物質(zhì)的藥物組成。本文中“治療”是指緩和與病理性新血管生成作用和/或內(nèi)皮細胞生長有關的癥狀以及降低新血管生成作用或內(nèi)皮細胞生長。該癥狀包括(但非限于)關節(jié)炎癥狀、新血管性皮膚癥狀、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、卡波濟氏(Kaposi’s)肉瘤、老化性視網(wǎng)膜黃斑變性、再狹窄癥、毛細血管擴張、青光眼、瘢瘤、角膜移植排斥、創(chuàng)傷顆粒化癥、血管纖維瘤、Osler-Webber癥候群、心肌血管生成作用及硬皮病。例舉的關節(jié)炎癥狀選自風濕性關節(jié)炎及骨關節(jié)炎。治療癌癥以及固體腫瘤時，其“治療”包括抑制血管生長，造成腫瘤和/或癌細胞缺少其生長所需要的營養(yǎng)物。因此腫瘤及生長物將會降低尺寸并可能消失。投藥治療關節(jié)炎癥狀，將會導致軟骨(特別是關節(jié))血管形成減低，使這些區(qū)域移動性及撓曲性增加。治療牛皮癬時，投藥將可降低皮膚上的癥狀，例如痂、薄片以及皮膚表面下可見的血管。在糖尿病性的視網(wǎng)膜病變中，投用活性成份將可降低視網(wǎng)膜中外來血管的形成，造成無阻礙的視覺。治療卡波濟氏(Kaposi’s)肉瘤時，投用活性成分可抑制血管生長和/或血管進一步形成，從而抑制損害的形成和/或腫瘤的產(chǎn)生。
對患者投用活性成分，例如老鼠、大鼠或病人，藥劑中可添加藥學上可被接受的載體以供患者全身、口服、經(jīng)皮或局部投用。治療量可按經(jīng)驗確定并隨被治療的病癥、治療的病人以及治療方法中所使用的成分的形式所具的毒性有很大的變化?；钚猿煞挚山?jīng)口服、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)或經(jīng)皮投加。當投加至動物時，本方法用于進一步證實活性成分的功效。
在動物模式的實施例中，將一群裸鼠(Balb/cNCRnu/雌性，Simonsen，Gilroy，CA)各自以皮下接種約105至約109如本文所定義的過度增值的細胞。當移植完成后，投用化合物，例如在移植處附近皮下注射。每周兩次使用venier卡尺從兩個方向測定移植尺寸是否降低。
使用MRL/Ipr老鼠[(MRL/Mpj-FasIpr)來自Jackson Labs(Maine)]測試或監(jiān)視關節(jié)炎癥狀的功效。治療的正面利益包括降低關節(jié)及動物后腳的腫脹以及降低軟骨降解(可用X射線監(jiān)測)。
將路易斯大老鼠群(8星期年齡，130-150克重，JACKSON LABS，MAINE，USA)接受牛II型膠原蛋白(BII)的免疫反應注射，從而產(chǎn)生關節(jié)炎病狀。RII可溶解于0.1M乙酸至400微克/毫升(ug/ml)。用相同體積的BII及ICFA(不完全的佛羅因德佐劑)混合成的乳液在20微克/100微升的濃度下以真皮內(nèi)的方式注射于大老鼠的尾巴基部，當關節(jié)炎癥狀出現(xiàn)時，在四點標度上觀察身體產(chǎn)生的種種病癥達28天以上。其它的動物模型也可適用。
在整個治療過程中可用單一劑量連續(xù)地或間歇地于活體內(nèi)投藥。確定最有效的投藥方式以及投藥劑量的方法已為熟悉此技藝的專業(yè)人士所掌握，并將視治療的組合物、治療的目的、治療的標的細胞、以及治療的患者而變化?？蛇M行單一和多重投藥，劑量水準以及模式需經(jīng)治療醫(yī)師加以選擇。適宜劑量的制劑以及投用藥劑的方法可在下面找到。
本發(fā)明的組成物及藥學調(diào)配物可用于制作藥劑及健康食品補充劑，依據(jù)常見的程序投藥(例如含有效成分的組合藥物)，用于治療人類及其他動物。
組合藥物可口服、鼻內(nèi)、非經(jīng)腸道或經(jīng)吸氣治療，其形式可為藥片、錠劑、顆粒、膠囊、藥丸、安瓶、栓劑或氣溶膠形式。內(nèi)含有效成分的水溶性或非水溶性稀釋劑、糖漿、顆粒或粉末也可為懸浮液、溶液以及乳液形式。除了本發(fā)明化合物之外，組合藥物也可含有其它藥學上的有效成分。
更明確的說，本文中的活性成分，在治療時可經(jīng)任何適當?shù)穆窂酵队?，包括口服的、直腸的、鼻腔的、局部的(包括經(jīng)皮的、氣溶膠、口頰的以及舌下的)、陰道的、非經(jīng)腸道的(包括皮下的、肌肉內(nèi)的、靜脈內(nèi)的以及皮膚內(nèi)的)、以及肺部的投用路徑。較佳的路徑將視癥狀以及接受者的年齡、以及治療的疾病而變化。
當進行活體內(nèi)治療時，患者的病理性內(nèi)皮細胞生長或新血管形成會受到抑制。將能有效達到預期結果的一個有效治療量的菜菔硫烷，(外消旋物、D-，L-)、或其藥學上可以接受的衍生物、鹽類或前驅藥投送至患者。本發(fā)明亦經(jīng)由投用有效治療量或生長抑制量的菜菔硫烷，(外消旋物、D-，L-)、或其藥學上可以接受的衍生物、鹽類或前驅藥，對患者提供治療與病理性新血管形成病癥有關的方法。該癥狀包括(但非限于)關節(jié)炎癥狀、新血管性皮膚癥狀、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、卡波濟氏(Kaposi’s)肉瘤、老化性視網(wǎng)膜黃斑變性、再狹窄癥、毛細血管擴張、青光眼、瘢瘤、角膜移植排斥、創(chuàng)傷顆粒化癥、血管纖維瘤、Osler-Webber癥候群、心肌血管生成作用及硬皮病。例舉的關節(jié)炎癥狀選自風濕性關節(jié)炎及骨關節(jié)炎。
當對患者，例如老鼠、大鼠或者病人投用菜菔硫烷時藥劑中可添加藥學上可被接受的載體并可向患者全身、口服、經(jīng)皮地或局部投用。治療量可按經(jīng)驗決定，并將視治療的病理狀況，治療的患者以及治療的癥狀而變化。
藥物成分雖可單獨應用，但最好以包含至少一個活性成份的配方藥(定義如上)與一種或多種藥學上可被接受的載體，有時還包含其它治療投用。各載體必須是“可接受的”并與配方中其它成分相容以及對病患無害。
配方包括適用于口服的、直腸的、鼻腔的、局部的(包含經(jīng)皮的、口頰的及舌下的)、陰道的、非經(jīng)腸的(含皮下的、肌肉內(nèi)的、靜脈內(nèi)的以及皮膚內(nèi)的)以及肺部的形式。配置方法可方便地為單位劑量形式以及可用任何制藥技藝上已知的方法制備。該方法包括活性成份與載體結合以構成一種或多種附加成份的步驟。一般而言，配制制劑需均勻及緊密地將有效成份與液體載體或細分的固體載體或以上二者結合起米，然后視需要將產(chǎn)物定形。
適用于口服投藥的本發(fā)明制劑可表現(xiàn)為各自內(nèi)含預定量有效成份的離散單元(例如膠囊、扁囊劑或藥片)；其可為粉末或顆粒；水溶性或非水溶性液體溶液或懸浮液；或水包油液體乳劑或油包水液體乳劑。有效成份亦可為大丸藥、藥糖劑或糊狀醬料。
藥片可經(jīng)壓縮或模制加以制作，有時可包含一種或多種附加成分。制備壓縮藥片時，可用適當?shù)臋C器壓縮松散形式(例如粉末或顆粒)的有效成份，亦可視需要混合結合劑(例如聚乙烯吡咯烷酮、明膠、羥內(nèi)基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如淀粉乙醇酸鈉、交聯(lián)的聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)的羧甲基纖維素鈉)表面活性劑或分散劑。模制藥片可用適當?shù)臋C器將粉末狀的化合物的混合物用惰性液體稀釋劑濕化后經(jīng)模具加以制作。藥片可視需要涂層或刻痕，并可將有效成分調(diào)制成提供緩釋或控制釋放的形成，例如使用各種比例之羥丙基甲基纖維素提供所期望的釋放形式，藥片可視需要提供腸內(nèi)釋放而非在胃部釋放。
適用于口腔局部投藥的制劑包括錠劑，包含通常用的蔗糖以及阿拉伯膠或特拉加康斯膠風味化了的有效成分；該制劑可包含有效成分與惰性物，例如明膠以及甘油、或蔗糖以及阿拉伯膠的錠劑；以及該制劑可包含有效成分與適當液體的漱口水。
依據(jù)本發(fā)明進行局部投藥的組合藥物可調(diào)制成藥膏、乳油、懸浮液、涂劑、粉末溶液、糊劑、噴霧劑、氣溶膠或油狀物。此外，制劑可包含膏藥或調(diào)料，例如含有浸漬有效成分以及視需要含一種或多種賦形劑或稀釋劑的繃帶或黏合劑膏藥。
治療眼睛或其它外部組織，例如口以及皮膚疾病時，較佳者是施用含有效成分的局部藥膏或乳油制劑。當調(diào)制成藥膏時，藥物可使用石蠟或可與水混合的軟膏基質(zhì)調(diào)制成藥膏。此外，藥物成分可與水包油基質(zhì)調(diào)制成乳油。
視需要，乳油基質(zhì)的水相包括至少約30％w/w的多元醇，即具有兩個或多個羥基的醇，例如丙二醇、丁烷-1，3二醇、甘露糖醇、山梨糖醇、甘油以及聚乙二醇及其混合物。局部涂覆制劑可視需要包括可促進藥物有效成分經(jīng)由皮膚或其它感染區(qū)域吸收或穿透的化合物。該真皮穿透增強劑的例子包括二甲(基)亞砜以及相關的類似物。
本發(fā)明乳狀液之油相可用熟知的成分以任何熟知的方法構成。此油相可僅包含乳化劑(即為熟知的乳化劑)視需要它可包含至少一種乳化劑與脂肪或油，也可以脂肪與油的混合物。較佳的親水性乳化劑可包括親脂的乳化劑作為穩(wěn)定劑。較佳者也可包括油及脂肪。乳化劑可包含或不含穩(wěn)定劑可制作成所謂的乳化蠟，蠟與油和/或脂肪可制作成所謂的乳化藥膏，其可形成乳油制劑的油性分散相。
適用于調(diào)制本發(fā)明的乳化劑及乳化穩(wěn)定劑，包括Tween60、Span80、鯨硬脂醇、肉豆蔻醇、硬脂酸單甘油脂以及月桂基硫酸鈉。
由于活性化合物在大多數(shù)用于藥乳制劑的油中溶解度非常低，所以可根據(jù)所需值得的化妝品性質(zhì)選擇適當?shù)挠突蛑緛磉M行調(diào)制。因此較佳的乳油應是具有適當稠度的非油膩的、非染色的以及可清洗的產(chǎn)物，以避免從管道或其它容器中漏出來?？墒褂弥辨湹幕蛑ф湹囊辉蚨岬耐轷?，例如二-異己二酸酯、硬脂酸異鯨蠟酯、椰子脂肪酸丙二醇二酯、肉豆蔻酸異丙酯、油酸癸酯、棕櫚酸異丙酯、硬脂酸丁酯、棕櫚酸2-乙基己酯、或帶支鏈酯類的混合物Crodamol CAP，后三者為較佳的酯類。此類酯類可單獨使用或配合使用，這取決于需要的性質(zhì)。此外，可使用高熔點類脂物，例如白色軟石蠟和/或液體石蠟或其他礦物油。
適用于眼睛局部給藥的制劑也包括眼藥水，其中的有效成分可溶解于或懸浮于適當?shù)妮d體，尤其是它的含水溶劑中。直腸給藥的制劑可為含有適當?shù)幕|(zhì)，包括如可可脂或水楊酸鹽(酯)的栓劑。
適用于陰道給藥的制劑可為陰道藥栓、填塞物、乳油、凝膠、糊類、泡沫或者噴霧劑，其中除了內(nèi)含前驅藥成分之外還可含有技藝成熟的載體。
適用于鼻腔給藥的制劑，其載體可為包括粗粉末的固體，具有一個粒度例如，在約20至500微米的范圍內(nèi)，可用鼻子吸入的方法給藥，即在靠近鼻子的地方將含有粉末容器經(jīng)由鼻腔快速吸入。以液體作為載體的用作為鼻腔噴霧劑、鼻腔滴劑以及使用噴霧器的氣溶膠的合適配方包括前驅藥有效成份的水性或油性溶液。
適用于不經(jīng)腸道給藥的制劑包括水溶性以及非水溶性的等滲滅菌注射液，它可含有抗氧化劑、緩沖溶液、抑菌劑以及賦予配方與其接受者血液等滲的溶質(zhì)；還有水性的以及非水性的滅菌懸浮液，它可包括懸浮劑以及增稠劑、和微脂?；蚱渌⒘Ｏ到y(tǒng)，后者被設計來將化合物進入血液組成部分或者一個或更多個器官中。制劑可存在于單個劑量或者多個劑量的密封容器中，例如在安瓶和管形瓶中，也可儲存于冷凍干燥的狀況，在使用之前只要立即加入滅菌液體作載體，例如水，即可作為注射劑。即用的注射溶液以及懸浮液可制備自先前所描述的各種滅菌粉末、顆粒以及藥片。
較佳的單個劑量的形式是那些內(nèi)含藥物成分為每日劑量或單位，不足每日劑量(列舉如上)、或其適當?shù)牟糠帧?br> 還應了解，除了以上特別提到的成分之外，本發(fā)明制劑還可包括在技藝中常見的各類配方有關的其他試劑，例如適合于口服的制劑中，可進一步包括甜劑、粘稠劑和調(diào)味劑。
菜菔硫烷(外消旋物或光學上純的成分)其前驅藥，鹽類或衍生物以及相同成份亦可作為獸醫(yī)制劑的形式使用，其可如用技藝中習常的方法來制備。
本發(fā)明還進一步提供篩選用于抑制新血管形成或內(nèi)皮細胞生長的治療劑方法。篩選要求(a)將藥物與適當?shù)募毎蚪M織樣品接觸；(b)將適當?shù)募毎蛛x樣品或組織樣品與有效治療量的菜菔硫烷或其藥學上可被接受的衍生物、鹽類或前驅藥接觸，以及(c)比較步驟(a)與步驟(b)中樣品的生長情況，如果步驟(a)中任何藥劑對生長的抑制效果與步驟(b)樣品中的程度相同或相似，它即為抑制新血管形成或內(nèi)皮細胞生長的治療劑。
本發(fā)明也提供了用于治療患者與病理性新血管形成相關病癥的成套的組分。該成套組分包括有效治療量的菜菔硫烷(外消旋物、(D-)或(L-))、或其藥學上可被接受的衍生物、鹽類或前驅藥以及使用說明。適用于該成套組分治療的病癥選自關節(jié)炎癥狀、新血管性皮膚癥狀、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、再狹窄癥狀、卡波濟氏(Kaposi’s)肉瘤、老化性視網(wǎng)膜黃斑變性、毛細管擴張、青光眼、瘢瘤、角膜移植排斥、創(chuàng)傷顆?；Y、血管纖維瘤、Osler-Webber癥候群、心肌血管生成作用，硬皮病、牛皮癬、風濕性關節(jié)炎以及骨關節(jié)炎。
下列實施例用以說明本發(fā)明但并非受此限制。
實施例實施例一菜菔硫烷的提煉及純化菜菔硫烷及菜菔硫烷腈是從十字花科植物種子提煉及純化，這些方法是根據(jù)MATUSHESKI以及同僚(2001 J.Agric，F(xiàn)oodchem.，49，1867-1872)提出的(D，L)-菜菔硫烷能合成而得((KimS.及Yi，1986).J.Org.Chem.51，2613-2615)D-菜菔硫烷是由其外消旋混合物，(D，L)-菜菔硫烷使用對掌性管柱分離而得。所有菜菔硫烷皆可以從LKT Laboratories購到。
實施例二菜菔硫烷抑制內(nèi)皮細胞檢定內(nèi)皮細胞的檢定本檢定根據(jù)Conally et al.(1986)，Anal.Biochem，152，136-4提出的程序進行，該法已經(jīng)修改(LANG AND WONG 2000)ANGIOGENESISFROM THE MOLECULAR TOINTEGRATIVE PHARMACOLOGY，edited by Maradoudakis，Kluwe Academic/PlenmPublishers，D.T.Connolly et al.(1986)Anal Biochem 152136-140.NEW YORK)，牛的CAPE(心肺動脈內(nèi)皮)細胞是購自American Type Culture Collection(ATCC)，在MEM-10E中生長至接近百分之九十五的匯合狀態(tài)。此細胞可用0.25％胰蛋白酶溶液由組織的培養(yǎng)瓶中放出，然后鋪平于24井的組織培養(yǎng)板中用的是同樣的培養(yǎng)介質(zhì)，其密度是10000個細胞/井。這些板在孵化器中培養(yǎng)8小時，條件是37℃及在5％二氧化碳中，之后，加上檢定樣品及對照物每一只樣品都被放到二個不同的井內(nèi)其量為100μl/井，可保證有重現(xiàn)性。這些樣品在孵化60小時后，介質(zhì)被抽吸掉，然后細胞數(shù)目可用細胞酸性磷酸酶的比色法去檢定。
結果以及討論表I.L-菜菔硫烷抑制內(nèi)皮細胞的檢定

表II.D菜菔硫烷抑制內(nèi)皮細胞的檢定

表III D，L-菜菔硫烷抑制內(nèi)皮細胞的檢定

菜菔硫烷的每一對影體都能抑制內(nèi)皮細胞的生長。內(nèi)皮細胞檢定的結果顯示菜菔硫烷加入內(nèi)皮細胞中可有效地抑制內(nèi)皮細胞的生長，在檢定中，L-菜菔硫烷、D-菜菔硫烷以及D，L菜菔硫烷在6.25微克/毫升的濃度時都顯示出可抑制92％以上的內(nèi)皮細胞增長。這些結果表明菜菔硫烷是一個十分有效的內(nèi)皮細胞抑制劑。
L-菜菔硫烷、D-菜菔硫烷以及D，L-菜菔硫烷在不同濃度下對血管增生抑制的檢定已列于圖1。菜菔硫烷甚至在十分低的濃度下也是很強烈的內(nèi)皮細胞生長抑制劑。
實施例三菜菔硫烷對各種不同癌細胞系的抑制作用。
這些癌細胞系檢定是依據(jù)下列步驟操作的所用的癌細胞系包括Lncap(前列腺)，SW480(直腸)與HTB72(黑色素癌)，都從AMERUCAN TYPE CUTURE COLLECTION(ATTC)購得，癌細胞放于25平方厘米的培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)每種細胞的相應培養(yǎng)基至90％匯合狀態(tài)，這些細胞使用胰蛋白酶處理，計數(shù)，并稀釋至每立方毫米有10000細胞，將一毫升的細胞放于24-井培養(yǎng)板的每一孔中。讓細胞附著過夜。不同濃度的測定樣品加上50微升(μl)水，PBS(磷酸鹽緩沖劑生理食鹽水)，或1×培養(yǎng)基。含對比樣品的井中也放入同樣容積的溶液，細胞可生長60小時，條件是37℃溫度及在5％二氧化碳中，每一孔的培養(yǎng)基液被吸掉，然后細胞用1毫升PBS洗凈后開始檢定。500微升的基底溶液(100毫克分子乙酸鈉，pH5.5，0.2％Triton X-100，1毫克/毫升對硝基苯磷酸鹽)加入細胞孔內(nèi)，細胞板孵化兩小時，溫度為37℃，然后加上1毫升0.1M(0.1克分子)氫氧化鈉，這些樣品在410nm(微米)下的光密度可用微量板片器檢定。
結果及討論L-菜菔硫烷對各種癌細胞系的抑制已列于如下表IV-VI表IV，L-菜菔硫烷抑制HTB72細胞生長的測定

表V，L-菜菔硫烷抑制Lncap細胞生長的測定

表VI，L-菜菔硫烷抑制SW480細胞生長的測定

我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)L-菜菔硫烷能抑制許多癌細胞系的增生，包括Lncap(前列腺癌細胞系)及SW480(直腸癌細胞系)及HTB72(黑色素癌細胞系)，L-菜菔硫烷于極低濃度(6.25微克/毫升)對這些癌細胞表現(xiàn)有強烈的抑制，這抑制作用尤其在對付Lncap(前列腺癌細胞系)特別有效。
雖然為了便于了解起見，前述的發(fā)明已用一些詳細說明以及實施例加以描述，因此熟悉此技術的專業(yè)人士可據(jù)此對本發(fā)明加以改變和修飾。例如對那些熟悉此技術的專業(yè)人士而言，本發(fā)明方法可同一種或多種熟知的抗腫瘤、抗血管生成劑或免疫提高治療劑及配方合用，例如鯊魚軟骨、tyrosphingosine或神經(jīng)鞘氨醇。因此，上述的描述以及實施例不用來限制本發(fā)明申請專利范圍的真正范圍。
權利要求
1.一種用于抑制內(nèi)皮細胞生長的方法，其特征在于，包含給細胞提供抑制其生長量的菜菔硫烷、或其在藥學上可以接受的衍生物、鹽類或前驅藥。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的菜菔硫烷為D-菜菔硫烷、L-菜菔硫烷或D，L-菜菔硫烷外消旋物。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的菜菔硫烷衍生物為菜菔硫烷腈。
4.一種用于抑制組織血管生成作用的方法，其特征在于，包含給組織提供抑制血管生成有效量的菜菔硫烷、或其在藥學上可以接受的衍生物、鹽類或前驅藥。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的菜菔硫烷為D-菜菔硫烷、L-菜菔硫烷或D，L-菜菔硫烷外消旋物。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的菜菔硫烷衍生物為菜菔硫烷腈。
7.一種用于抑制主要器官血管生成作用的方法，其特征在于包含給組織提供抗血管生成有效量的D-菜菔硫烷、L-菜菔硫烷、菜菔硫烷外消旋物或菜菔硫烷在藥學上可以接受的衍生物、鹽類或前驅藥。
8.如權利要求1、4或7中任一所述的方法，其特征在于，提供方法為活體外、活體內(nèi)或體外方式。
9.一種用于治療宿主中與病理學新血管生成有關病癥的方法，其特征在于，包含給受治療者提供抑制血管生成有效量的菜菔硫烷、或其在藥學上可以接受的衍生物、鹽類或前驅藥。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述的菜菔硫烷為D-菜菔硫烷、L-菜菔硫烷或D，L-菜菔硫烷外消旋物所構成的一組物質(zhì)中選擇。
11.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述病癥可從腫瘤、關節(jié)炎癥狀、新血管性皮膚癥狀、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、卡波濟氏(Kaposi’s)肉瘤、老化性視網(wǎng)膜黃斑變性、再狹窄癥、毛細血管擴張、青光眼、瘢瘤、角膜移植排斥、創(chuàng)傷顆粒化癥、血管纖維瘤、Osler-Webber癥候群、心肌血管生成作用、牛皮癬關節(jié)炎及硬皮病所構成的一組病中加以選擇。
12.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述病癥可從前列腺癌、直腸癌及黑色素癌所構成的一組癌癥中加以選擇。
13.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述病癥可從風濕性關節(jié)炎及骨關節(jié)炎組成的一組關節(jié)炎癥狀中選擇。
14.如權利要求9所述的方法中，所述的菜菔硫烷衍生物為菜菔硫烷腈。
15.一種用于治療患者主要器官病理性新血管形成有關病癥的方法，其特征在于，包含有效治療量的D-菜菔硫烷、L-菜菔硫烷、及D，L-菜菔硫烷，或其菜菔硫烷在藥學上可以接受的衍生物、鹽類或前驅藥。
16.如權利要求9所述的方法，其特征在于，以經(jīng)口服、靜脈內(nèi)的、腹腔內(nèi)的或經(jīng)皮下的投藥方式投用。
17.如權利要求9所述的方法，其特征在于，進一步包括投予有效量的抗血管生成劑。
18.如權利要求16所述的方法，其特征在于，所述患者是動物。
19.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述動物為寵物、家畜或人類病患者。
20.一種改進患者一般健康狀況和福利的方法，其特征在于，包含投予患者有效量的菜菔硫烷。
21.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述有效量以健康食品補充劑的方式投加。
22.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述宿主或患者是動物。
23.如權利要求21所述的方法，其特征在于，所述動物為寵物、家畜或人類病患。
24.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述的菜菔硫烷為D-菜菔硫烷、L-菜菔硫烷或D，L-菜菔硫烷外消旋物。
25.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述的菜菔硫烷衍生物為菜菔硫烷腈。
26.一種用于篩選供抑制新血管形成和內(nèi)皮細胞生長的治療劑的方法，其特征在于，包含以下步驟(a)將藥劑與適當?shù)募毎蚪M織樣本接觸；(b)將適當細胞的分離樣本或組織樣本與有效治療量的菜菔硫烷、或其在藥學上可以接受的衍生物、鹽類或前驅藥接觸(c)比較步驟(a)與步驟(b)中樣本的生長，如果其中步驟(a)中的任何藥劑對生長抑制效果與步驟(b)樣本中的程度相同和相似，那么它就是抑制新血管形成或內(nèi)皮細胞生長的治療劑。
27.如權利要求26所述的方法，其特征在于，所述接觸在活體外或活體內(nèi)進行。
28.如權利要求26所述的方法，其特征在于，所述的菜菔硫烷為D-菜菔硫烷、L-菜菔硫烷或D，L-菜菔硫烷外消旋物。
29.如權利要求24所述的方法，其特征在于，所述的菜菔硫烷衍生物為菜菔硫烷腈。
30.如權利要求25所述的方法，其特征在于，進一步包含將步驟(a)和步驟(b)的樣品與有效量的抗血管生成劑進行接觸。
31.一種治療與病理性新血管形成有關的病癥的成套組份，其特征在于，包含有效治療量的D-菜菔硫烷、L-菜菔硫烷、菜菔硫烷外消旋物或菜菔硫烷在藥學上可以接受的衍生物、鹽類或前驅藥及其使用說明。
32.如權利要求31所述的成套組分，其特征在于，所述病癥可從腫瘤、關節(jié)炎癥狀、新血管性皮膚癥狀、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、卡波濟氏(Kaposi’s)肉瘤、老化性視網(wǎng)膜黃斑變性、再狹窄癥、毛細血管擴張、青光眼、瘢瘤、角膜移植排斥、創(chuàng)傷顆粒化癥、血管纖維瘤、Osler-Webber癥候群、心肌血管生成作用及硬皮病所構成的一組病中加以選擇。
33.如權利要求31所述的成套組份，其特征在于，所述病癥可從前列腺癌、直腸癌及黑色素癌所構成的一組癌癥中加以選擇。
34.如權利要求31所述的成套組份，其特征在于，所述病癥可從風濕性關節(jié)炎及骨關節(jié)炎組成的一組關節(jié)炎癥狀中選擇。
35.如權利要求31所述的成套組份，其特征在于，所述的菜菔硫烷為D-菜菔硫烷、L-菜菔硫烷或D，L-菜菔硫烷外消旋物。
36.如權利要求31所述的的成套組份，其特征在于，所述的菜菔硫烷衍生物為菜菔硫烷腈。
全文摘要
本發(fā)明提供一種通過供給有效量的菜菔硫烷或其在藥學上可接受的鹽類、衍生物或前驅藥至細胞或組織以抑制新血管形成的方法。本發(fā)明還提供通過對患者投用有效量的菜菔硫烷或其在藥學上可接受的鹽類、衍生物或前驅藥治療內(nèi)皮細胞增生和/或新血管形成有關的疾病的方法。本發(fā)明還提供治療病人的成套組份。
文檔編號A61K31/26GK1723017SQ03823747
公開日2006年1月18日 申請日期2003年8月5日 優(yōu)先權日2002年8月5日
發(fā)明者汪建平, 汪明中, 任岱 申請人:偉克沃公司