專(zhuān)利名稱(chēng)：在腎過(guò)濾和腎通道中顯示出溶酶體降解抗性的抗微生物帶電聚合物、組合物和其使用方法
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及使用硫酸化多糖治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中微生物感染的方法。更特別地，本發(fā)明涉及將治療有效量的具有一定硫酸化百分比范圍的帶電和柔性硫酸化多糖導(dǎo)入病人的血流、淋巴系統(tǒng)和/或細(xì)胞外間隙以治療、預(yù)防或處理微生物感染的方法。具體地，其中該范圍對(duì)硫酸根基團(tuán)和導(dǎo)致感染的微生物之間的最大相互作用是有效的，并且其中該硫酸化的多糖基本上不通過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞受體結(jié)合而被內(nèi)吞或降解，并從而在體內(nèi)保持抗微生物活性。
2.發(fā)明背景帶電的多糖，尤其是硫酸化多糖，已經(jīng)在體外表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗微生物活性(Baba等人，Antiviral Res 9335-343，1988；Ito等人，Antiviral Res.7(36)1-367，1987)。例如，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)在體外硫酸化多糖如硫酸葡聚糖、肝素和多硫酸戊聚糖是HIV、副粘病毒、巨細(xì)胞病毒、流感病毒、semlikiviruses(Liische-Mattti等人，ArchYirol 130317-326，1993)和單純皰疹病毒(Baba等人，Antimicrob.Agents Chemotherapy 321742-45，1988；Pancheva，AntiviralChem Chemotherapy 4189-191，1993)的強(qiáng)力抑制劑。然而，這些已知的化合物在體內(nèi)具有令人失望的弱活性。
Ito.等人，Antiviral Res.7361-367，1987、Deringer等人(US5,153,181)和Ueno和Kuno，Lancet 2796-97，1987首先報(bào)導(dǎo)硫酸葡聚糖和肝素體外抑制HIV的復(fù)制。后來(lái)，一些其他硫酸化的多肽在認(rèn)為是它們各自的毒性閾值下的濃度表現(xiàn)出抑制HIV復(fù)制，例如，硫酸戊聚糖(Baba等人，Antiviral Res 9335-343，1988；Biesert等人，Aids 2(6)449-57，1988)、巖藻依聚糖(Baba等人，Antiviral Res9335-343，1988)、λ-、κ-和ι-角叉藻聚糖(Baba等人，AntiviralRes 9335-343，1988)、硫酸蘑菇多糖(Yoshida等人，Biochem.Pharmacol.37(15)2887-91，1988)、硫酸甘露聚糖(Ito等人，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.8191-193，1989)、硫酸糊精(Ito等人，Antiviral Chem.Chemother.，241-44，1991)、sulfoevernan(Weiler等人，J Gen Virol 711957-1963，1990)、和硫酸環(huán)糊精(Schols等若那，J Acquired Immune Def.Syndr4677-BS，1991.)。然而，已經(jīng)證明這些化合物在體內(nèi)都是無(wú)效的，并且在高濃度導(dǎo)致血小板減少、中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用、脫發(fā)、胃腸道疼痛、抗-凝固，等(Flexner等人，Antimicrob Agents Chemotherapy352544-2550，1991；Abrams等人，Annals of Internal Medicine(1989)110183-188；Hiebert等人，J.Lab & Clin.Med.133161-170(1999))。
一些硫酸化多糖化合物也已經(jīng)表現(xiàn)出抗細(xì)菌活性(Dalton等人，Bur J Biochem 195179-184，1991；Zarcha等人，CurrentMicrobiol.346-11，1997；Pancake等人，J Cell Biol1171251-1257，1992；Clark等人，Glyco J 14473-9，1997)、抗衣原體活性(Herold等人，Antimicrobial Agents andChemotherapy 412776-2780，1997，和Su和Caldwel，Infectionand Immunity 661258，1991)和抗寄生蟲(chóng)活性。再次，在體外觀察到抗微生物活性和抗寄生蟲(chóng)活性，但是證明這些化合物在體內(nèi)是無(wú)效的(Dalton等人，Eur J Biochem 195179-184，1991；Pancake等人，J Cell Bil 1171251-1257，1992；Clark等人，Glyco J14473-9，1997)。
常規(guī)的或者商業(yè)的硫酸葡聚糖的硫酸化百分比為約17-22％。已公認(rèn)增加硫含量就增加該物質(zhì)的活性。例如，增加硫含量增加抗-凝固活性(Hirata等人.，Biosci.Biotech.Biochem.58(2)406-407，1994)。類(lèi)似地，已公認(rèn)增加硫酸化多糖的硫含量增加了它們的體外抗細(xì)菌活性。見(jiàn)，例如，Witvrouw等人.，General Pharmacology 29(4)497-512，1997；Nakashima等人，Jpn. J.CancerRes.(Gann)781164-6，1987；和Baba等人，J AIDS 493-499，1990。這些研究再次證明隨著硫酸化的增加，硫酸化多糖的體外活性的顯著增加，盡管仍然缺乏體內(nèi)效能。實(shí)際上，體內(nèi)效能的缺少和高程度硫酸化化合物的體內(nèi)毒性已經(jīng)是到現(xiàn)在為止無(wú)法解決的問(wèn)題。
盡管對(duì)用于特定用途的低硫酸化百分比的硫酸化多糖的研究已有一定數(shù)量，但是還沒(méi)有對(duì)這些物質(zhì)的分子量和它們的硫酸化百分比進(jìn)行表征。重要的是，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)這些物質(zhì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的活性比用17-22％硫酸化的多糖的活性弱。此外，已經(jīng)在動(dòng)物中研究了未良好表征(如果表征)的低分子量制劑抗皰疹病毒的活性，如BP申請(qǐng)0 066 379A2中，取得了有限的成功。還見(jiàn)，Pancheva SN.Antiviral ChemChemotherapy 4189-191，1993。
硫酸葡聚糖在體內(nèi)無(wú)活性的一個(gè)主要原因是該物質(zhì)是不穩(wěn)定的。以前已經(jīng)公布了該原因的某種跡象。氚標(biāo)記的硫酸葡聚糖mw8,000在大鼠的血液循環(huán)中6-24小時(shí)內(nèi)似乎被解聚(Hartman NR，Johns DG，Mitsuya H.AIDS Res Hum Retroviruses 6805-811，1990)。碘化的肝素和多硫酸戊聚糖從人體循環(huán)被快速清除并返回去硫酸化形式(MacGregor IR，Dawes J，Paton L，Pepper DS，Prowse CV，SmithM.，Thromb Haem 51321-325，1984)。
大量的努力集中在通過(guò)增加硫酸葡聚糖的硫酸化提高其體內(nèi)抗病毒活性或者改變常規(guī)物質(zhì)的用途。在一個(gè)研究中，考慮到所報(bào)導(dǎo)的口服硫酸葡聚糖的差吸收，將硫酸葡聚糖通過(guò)連續(xù)灌輸以最大耐受劑量施用于有HIV感染癥狀的受試者長(zhǎng)達(dá)14天(Flexner等人，AntimicrobAgents Chemotherapy 352544-2550，1991)。發(fā)現(xiàn)硫酸葡聚糖的連續(xù)靜脈內(nèi)灌輸是有毒的。作者斷定由于其毒性和缺乏具有體內(nèi)有益效果的任何證明，硫酸葡聚糖在HIV的治療中不可能具有有益效果。實(shí)際上，作者警告“腸胃外硫酸葡聚糖作為癥狀性HIV感染的治療的進(jìn)一步臨床研究是沒(méi)有正當(dāng)理由的并且可以證明是有害的?；谠撗芯康慕Y(jié)果，建議在其他多硫酸化聚陰離子的臨場(chǎng)評(píng)價(jià)中要小心”(Id.2549)。
在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞處理硫酸葡聚糖的一個(gè)主要研究中，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)硫酸葡聚糖結(jié)合一種細(xì)胞表面受體，該受體將通常識(shí)別高度硫酸化的多糖如類(lèi)-肝素的多糖。結(jié)合時(shí)，硫酸葡聚糖被內(nèi)吞、被溶酶體硫酸酯酶去硫酸化但是不被解聚，并作為去硫酸化的硫酸葡聚糖被胞吐(Vyas等人，Arch Biochem Biophys.332(2)205 12，1996)。發(fā)現(xiàn)硫酸葡聚糖被細(xì)胞吸收和內(nèi)吞嚴(yán)重依賴(lài)于硫含量或者每個(gè)葡萄糖殘基硫酸化置換的程度。被腎小球上皮細(xì)胞高于13％的硫吸收是顯著的而低于13％的硫吸收和內(nèi)吞是最小的。這表示沿著多肽鏈具有尤其臨界硫含量或者臨界硫酸置換電荷密度的帶電多糖可能被循環(huán)所暴露的細(xì)胞不同地加工。如果身體中，尤其是HIV產(chǎn)生占優(yōu)勢(shì)的淋巴管中的任何器官模擬細(xì)胞受體識(shí)別、內(nèi)吞和降解過(guò)程，那么該器官將在體內(nèi)使作為抗病毒藥物的硫酸葡聚糖失活。高度硫酸化物質(zhì)，如含有17-20％硫的商業(yè)硫酸葡聚糖，可被細(xì)胞快速吸收，去硫酸化并使得失去抗病毒活性，而更低的硫酸化物質(zhì)可能不被細(xì)胞吸收并保留它們的抗病毒活性。
總之，盡管商業(yè)化硫酸葡聚糖以前已經(jīng)在日本被用于抗凝固和高脂血癥，但是其已經(jīng)表現(xiàn)出體內(nèi)抗HIV的弱活性或者，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)硫酸葡聚糖在哺乳動(dòng)物和HIV患者中有嚴(yán)重毒性(Mathis等人.，Antimicrobial Agents & Chemotherapy 2147-2150，1991；Flexner等人，Id.2544-2550；Abrams等人，Annals of Internal Medicine110183-188(1989)；Hiebert等人.，J Lab & Clin.Med.133161-170(1999))。從而，仍然需要體內(nèi)激活硫酸葡聚糖抗病毒和其他感染的活性的方法。
雖然過(guò)去廣譜體外活性使得硫酸化多糖有吸引力作為抗微生物候選藥物，但是仍然需要對(duì)治療或預(yù)防病毒感染、細(xì)菌感染和寄生蟲(chóng)感染體內(nèi)有效的硫酸化多糖。
3.發(fā)明概述本申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)降低和控制柔性多糖的硫酸化程度，和任選控制分子量，產(chǎn)生了一種同時(shí)具有體外和體內(nèi)抗微生物活性的組合物。這種組合物可用于方法中以治療、預(yù)防或處理微生物感染而減少或避免不利作用，例如，與常規(guī)硫酸化多糖的口服或腸胃外施用有關(guān)的毒性。更特別地，本申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有受控的硫酸化范圍，例如，％硫高于6％和低于13％的硫酸化α-1，6-多糖的制劑具有體內(nèi)抗微生物感染的活性。
這樣，本發(fā)明包括治療的新方法和利用與常規(guī)硫酸葡聚糖相比具有低硫酸化百分比的這種硫酸化多糖的新藥物組合物。例如，本發(fā)明包括硫酸化多糖，其相對(duì)于簡(jiǎn)單糖殘基的硫百分比大于6％并且小于13％，優(yōu)選大于約7％并且小于13％，更優(yōu)選大于約9％并且小于13％，最優(yōu)選6％、7％、8％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.2％、12.5％、12.8％或12.9％。硫酸化多糖優(yōu)選為具有α-1，6-糖苷鍵的硫酸化葡聚糖。
本發(fā)明還包括分子量為500到1,000,000，優(yōu)選高于5,000；更優(yōu)選高于25,000；最優(yōu)選高于40,000，尤其用于經(jīng)口或腸胃外施用的硫酸化多糖。本發(fā)明還包括5,000到1,000,000、25,000到500,000和40,000到300,000的范圍。然而，對(duì)于局部施用，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，該硫酸化多糖可以具有高于500,000的分子量。在備選的實(shí)施方案中，該組合物的分子量?jī)H有約10％的可變性，優(yōu)選約5％的可變性。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，該硫酸化多糖不是硫酸纖維素、硫酸糊精或環(huán)糊精，而是α-1，6-硫酸化多糖，如具有受控的硫酸化范圍，任選特定分子量范圍的硫酸化葡聚糖。在備選實(shí)施方案中，該硫酸化多糖關(guān)于分子量、硫酸化百分比或兩者是均一的。
在本發(fā)明的一方面提供了將治療有效量的硫酸化多糖或者其鹽導(dǎo)入哺乳動(dòng)物的血流、淋巴系統(tǒng)和/或胞外空間組織的方法，該方法包括對(duì)該哺乳動(dòng)物施用具有體外抗微生物活性并且具有足夠保持體內(nèi)抗微生物活性的硫酸化百分比的至少一種硫酸化多糖或者其藥學(xué)上可接受的鹽或其水合物。優(yōu)選地，該多糖的硫酸化范圍有效使得組成性硫酸根基團(tuán)與導(dǎo)致感染的微生物之間的相互作用最大，并且其中在哺乳動(dòng)物中硫酸化多糖基本上不通過(guò)細(xì)胞受體結(jié)合而被內(nèi)吞或降解，從而在體內(nèi)保持抗微生物活性。
在本發(fā)明的另一方面，提供了治療或預(yù)防微生物感染的方法，該方法包括對(duì)患者施用治療有效量的硫含量大于6％并且低于13％的硫酸化葡聚糖。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，硫酸化葡聚糖的硫酸化百分比高于或者約6％或高于6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.2％、12.5％、12.8％或小于13％。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法用于治療或預(yù)防病毒感染，包括但不限于DNA病毒和RNA病毒，尤其是有包膜的DNA或RNA病毒。在另一優(yōu)選的方法中，所要治療的病毒包括但不限于雙鏈DNA病毒、DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒、RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒、雙鏈RNA病毒、負(fù)義單鏈RNA病毒，和正義單鏈RNA病毒。
在本發(fā)明的另一方面，提供了合成多糖，或者減少或增加硫酸化程度從而硫酸化多糖適于體內(nèi)施用并且體內(nèi)有效抵抗病毒感染的方法。該方法包括提供具有一定硫酸化百分比的硫酸化多糖，該硫酸化百分比足夠消除或減小被高電荷密度的聚陰離子細(xì)胞受體結(jié)合和內(nèi)化，或者體內(nèi)使這些化合物失活，但是足夠提供抗微生物活性；和將該硫酸化多糖施用于哺乳動(dòng)物。換句話(huà)說(shuō)，本發(fā)明包括將天然發(fā)生的或者通過(guò)商業(yè)途徑可得到的硫酸化多糖的硫酸化修飾至使得與微生物的相互作用最大化并且其中該硫酸化多糖基本上不通過(guò)細(xì)胞受體結(jié)合而被內(nèi)吞或降解的硫酸化范圍。
本發(fā)明的單獨(dú)方面包括適于腸胃外施用于患者的藥物組合物，其含有治療上或者藥學(xué)上可接受量的本發(fā)明的硫酸化多糖；還涉及含有治療上或者藥學(xué)上可接受量的本發(fā)明的硫酸化多糖的適于經(jīng)口施用于患者的藥物組合物；和分子量大于500,000含有治療上或者藥學(xué)上可接受量的本發(fā)明的硫酸化多糖的適于局部施用于患者的藥物組合物。
應(yīng)該指出本發(fā)明還包括本發(fā)明的硫酸化多糖作為消毒劑的用途，其可用于醫(yī)院、實(shí)驗(yàn)室、廁所、禮堂、體育場(chǎng)、會(huì)議中心、餐館、健康中心、地鐵終點(diǎn)站、公共汽車(chē)總站、機(jī)場(chǎng)、郵局、辦公室、污水處理設(shè)施、下水道、水處理設(shè)施、泵站、汽車(chē)、飛機(jī)、火車(chē)、家庭、柜和家具中無(wú)生命物體的消毒以防止病毒或疾病的擴(kuò)散。本發(fā)明還包括消毒組合物如含有一種或多種此處描述的硫酸化多糖的溶液劑、噴霧劑、肥皂、泡沫液。
下面詳細(xì)描述本發(fā)明的方法包括的微生物感染，尤其是所要治療的特定病毒和所要使用的特定硫酸化葡聚糖。
3.1定義如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“患者”或“受試者”指動(dòng)物(例如，奶牛、馬、綿羊、豬、雞、火雞、鵪鶉、貓、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠，等)，優(yōu)選哺乳動(dòng)物如非靈長(zhǎng)類(lèi)和靈長(zhǎng)類(lèi)(例如，猴和人)，最優(yōu)選人。在一些實(shí)施方案中，患者是嬰兒、兒童、青少年、成人或老年患者。此外，患者包括無(wú)免疫應(yīng)答的患者如HIV陽(yáng)性患者、癌癥患者和經(jīng)歷免疫治療的患者。
如這里所用的，“治療有效量”指本發(fā)明化合物或其他活性成分的量，該量在疾病的治療或處理中足夠提供益處，以延遲或最小化與該疾病相關(guān)的癥狀，或者治療或改善該感染或疾病或者其原因。具體地，治療有效量指足夠提供體內(nèi)治療益處的量。此外，治療有效量指本發(fā)明化合物單獨(dú)或者與其他治療劑組合的量，該量在疾病的治療或處理中足夠提供益處，以延遲或最小化與該疾病相關(guān)的癥狀，或者治療或改善該感染或疾病或者其原因。另外，治療有效量指在疾病的治療或處理中足夠提供益處而對(duì)患者沒(méi)有毒性的治療劑的量。與本發(fā)明的化合物的量關(guān)聯(lián)使用，該術(shù)語(yǔ)包括改善總的治療，減少或者避免疾病的癥狀或原因，或者增強(qiáng)另一種治療劑的功效或者與該治療劑協(xié)同作用的量。
如此處所用的，“預(yù)防有效量”指足夠?qū)е赂腥净蚣膊〉膹?fù)發(fā)或擴(kuò)散的預(yù)防的本發(fā)明化合物或者其他活性成分的量。預(yù)防有效量可以指足夠防止患者(包括但不限于易患該疾病的那些人)中首次感染或首次疾病或者感染或疾病的復(fù)發(fā)或擴(kuò)散或者該疾病的發(fā)生的量。具體地，關(guān)于本發(fā)明化合物的預(yù)防有效量指在體內(nèi)足夠?qū)е赂腥净蚣膊〉膹?fù)發(fā)或擴(kuò)散的預(yù)防的量。預(yù)防有效量還可以指在感染或疾病的預(yù)防中提供益處而對(duì)患者無(wú)毒的量。此外，關(guān)于本發(fā)明化合物的預(yù)防有效量指在單獨(dú)，或者與其他試劑組合，在感染或疾病的防止中提供預(yù)防益處的量。與根據(jù)本發(fā)明的化合物的量關(guān)聯(lián)使用，該術(shù)語(yǔ)包括改善總的預(yù)防或者增強(qiáng)另一種預(yù)防劑或治療劑的預(yù)防性效能或者與其協(xié)同作用的量。
如此處所用的，“組合”指同時(shí)或順序地使用一種或一種以上的預(yù)防和/或治療劑并且以它們各自的效果是相加的或協(xié)同的方式使用。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“處理”指延緩或防止疾病的發(fā)展或惡化但不治愈該疾病。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“防止”指由于疾病或感染發(fā)生前使用活性組分而導(dǎo)致該疾病的發(fā)作、復(fù)發(fā)、或擴(kuò)散的防止。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“治療”指消滅或改善疾病或感染自身、該疾病的原因，或者與該疾病相關(guān)的癥狀。在一些實(shí)施方案中，該術(shù)語(yǔ)指由于對(duì)患有這種疾病或感染的受試者施用一種或多種預(yù)防劑或治療劑而最小化疾病或感染的擴(kuò)散或惡化。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”指從藥學(xué)上可接受的無(wú)毒酸或堿制備的鹽，這些酸或堿包括無(wú)機(jī)酸和堿與有機(jī)酸和堿。本發(fā)明化合物的適宜的藥學(xué)上可接受的堿加成鹽包括，但不限于，鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉和鋅制備的金屬鹽或者賴(lài)氨酸、N，N’-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、乙二醇胺、乙二胺、甲葡胺(N-甲基葡糖胺)和普魯卡因制備的有機(jī)鹽。
如這里所用的并且除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“光學(xué)純”或者“立體異構(gòu)純”指含有化合物的一種立體異構(gòu)體并且基本沒(méi)有該化合物的其他立體異構(gòu)體的組合物。例如，具有一個(gè)手性中心的立體異構(gòu)純的化合物基本上沒(méi)有該化合物的相反對(duì)映異構(gòu)體。典型的立體異構(gòu)純的化合物含有按重量計(jì)約80％以上的該化合物的一種立體異構(gòu)體和按重量計(jì)約20％以下的該化合物的其他立體異構(gòu)體，更優(yōu)選按重量計(jì)約90％以上的該化合物的一種立體異構(gòu)體和按重量計(jì)約10％以下的該化合物的其他立體異構(gòu)體，甚至更優(yōu)選按重量計(jì)約95％以上的該化合物的一種立體異構(gòu)體和按重量計(jì)約5％以下的該化合物的其他立體異構(gòu)體，最優(yōu)選按重量計(jì)約97％以上的該化合物的一種立體異構(gòu)體和按重量計(jì)約3％以下的該化合物的其他立體異構(gòu)體。由于本發(fā)明的化合物有可以以D或L形式存在的糖制成的多糖，所以本發(fā)明包括D或L糖或者D和L糖。同樣地，例如，立體異構(gòu)純的D糖將基本無(wú)L形式。在備選的實(shí)施方案中，硫酸化葡聚糖的L形式的使用允許使用約6％到約20％的更寬的控制硫酸化范圍。從而，在備選實(shí)施方案中此處公開(kāi)的方法和組合物包括使用這種左旋糖或者從其制成的聚合物。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“硫酸化多糖”指具有10個(gè)單位以上簡(jiǎn)單糖的硫酸化物質(zhì)。優(yōu)選地，硫酸化多糖是α(1，6)連接的多糖。本發(fā)明的硫酸化多糖還優(yōu)選足夠具有體外和體內(nèi)活性而無(wú)顯著毒性的硫百分比。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“葡聚糖”指含有主要通過(guò)α-D(1，6)連接的D-葡萄糖單元的骨架的多糖，其僅由僅僅在分枝程度和鏈長(zhǎng)度上不同的α-D-吡喃葡萄糖基單元組成。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“硫酸葡聚糖鈉”或“硫酸葡聚糖”、“常規(guī)硫酸葡聚糖”或“商業(yè)的硫酸葡聚糖”除非另外限制，指含有每個(gè)葡萄糖分子具有17％硫高達(dá)3個(gè)硫酸根基團(tuán)，具有可變的分子量范圍，例如4,000-500,000Da的α1，6-多聚葡萄糖。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“硫酸化百分比”、“硫酸根取代的百分比”或者“硫酸化”指按分子量計(jì)，相對(duì)于所討論的多糖(任選包括平衡離子)內(nèi)每個(gè)簡(jiǎn)單糖殘基的硫的百分比，任選包括平衡離子，例如，組合物中硫酸化的分子量/總重量。在優(yōu)選實(shí)施方案中，硫的百分比被計(jì)算為關(guān)于以鈉作為平衡離子的所討論多糖內(nèi)硫酸化糖殘基的按分子量計(jì)硫的百分比。通過(guò)物質(zhì)的元素分析可以確定硫酸化的百分比，該物質(zhì)已經(jīng)被透析以除去游離的硫，該物質(zhì)優(yōu)選為在真空中60℃干燥至恒重的無(wú)水分/揮發(fā)物的物質(zhì)。確定硫酸化百分?jǐn)?shù)的其他方法是通過(guò)水分含量分析和滴定。硫酸化將有別于“取代程度”或“當(dāng)量”，“取代程度”或“當(dāng)量”是對(duì)每個(gè)糖部分硫酸根基團(tuán)數(shù)目的量度。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到硫酸化百分比可被轉(zhuǎn)化成取代程度或當(dāng)量并且反之亦然。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“共帶電的葡聚糖聚陰離子”是被羧甲基基團(tuán)、硫酸根基團(tuán)和磺酸根基團(tuán)的任何組合不同程度取代的葡聚糖。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“高碘酸鹽處理的陰離子多糖”指已經(jīng)用高碘酸鹽處理打開(kāi)糖環(huán)而不解聚或者增加多糖的柔性以增加與微生物的相互作用的陰離子多糖。
如此處所用的，術(shù)語(yǔ)“抗微生物的”包括抗病毒的、抗細(xì)菌的，如，例如，抗衣原體、抗寄生蟲(chóng)的，如抗瘧原蟲(chóng)屬或抗真菌的。
4.附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示隨著時(shí)間變化，Sprague-Dawley大鼠血漿(n＝3)中循環(huán)血漿商業(yè)硫酸葡聚糖的脫硫酸化的量。長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)的值是基于在0時(shí)間大丸劑靜脈內(nèi)注射后血漿中存在的硫酸葡聚糖。168小時(shí)處的平均值從皮下植入Sprague-Dawley大鼠中的穩(wěn)定態(tài)滲透泵得到。
圖2顯示了在時(shí)間0處大丸劑靜脈內(nèi)注射(172mg/kg)后對(duì)時(shí)間的多糖物質(zhì)的有效抗病毒活性濃度。組1商業(yè)硫酸葡聚糖，mw＝40,000(n＝1-3)；組2商業(yè)硫酸葡聚糖，mw＝500,000(n＝3)；組3硫酸化葡聚糖12.6％(DES 6 40k)(N＝4-6)；組4硫酸化葡聚糖12.2％(DES6 500k)(N＝6)；組5DES 6 40k以172/kg/天每日注射，持續(xù)6天(n＝4)。
圖3是描述制備具有特定硫酸化百分比和分子量的硫酸化葡聚糖的示意性流程圖。
圖4是用線性氯化鈉梯度從陽(yáng)離子交換樹(shù)脂洗脫的離子交換層析的40,000mw的氚標(biāo)記的硫酸化葡聚糖層析圖譜，其顯示出硫酸鹽取代程度的高度均一性。
圖5是用線性氯化鈉梯度從陽(yáng)離子交換樹(shù)脂洗脫的離子交換層析的500,000mw的氚標(biāo)記的硫酸化葡聚糖層析圖譜，其顯示出硫酸鹽取代程度的高度均一性。
5.發(fā)明詳述在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本申請(qǐng)人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)怎樣顯著增加某些硫酸化多糖抗微生物感染，尤其是病毒感染的體內(nèi)效能，而減少或避免常規(guī)硫酸化多糖的不利的、不需要的或毒性作用。通過(guò)控制多糖的硫酸化百分比從而其處于大于6％但是低于13％的范圍內(nèi)部分完成了該目的。此外，本發(fā)明在備選實(shí)施方案中還包括控制分子量和/或硫酸化百分比以得到具有顯著的體內(nèi)效能而無(wú)顯著毒性的硫酸化多糖。本發(fā)明的最優(yōu)選組合物或方法使用了具有所希望的硫酸化百分比和/或分子量的硫酸化α-1，6-連接的多糖或者硫酸化葡聚糖，它們具有柔性并從而可用于抵抗各種病毒。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，硫酸化百分比的范圍能使得組成性硫酸根基團(tuán)與導(dǎo)致感染的微生物之間能夠最大相互作用，并且其中硫酸化多糖基本上不通過(guò)哺乳動(dòng)物中細(xì)胞受體結(jié)合而被內(nèi)吞或降解，并從而保持體內(nèi)抗微生物活性。
本申請(qǐng)人還發(fā)現(xiàn)合成更低硫酸化多糖或者降低硫酸化多糖如常規(guī)硫酸葡聚糖的電荷密度的程度，消除了或者至少顯著降低了高電荷密度聚陰離子的細(xì)胞受體(例如，腎中)對(duì)硫酸化多糖的結(jié)合和內(nèi)化，并從而消除或顯著減少了這些化合物體內(nèi)脫硫酸化。結(jié)果，具有低電荷密度的這些硫酸化多糖保持它們的體內(nèi)抗微生物活性。這第一次使得能夠在人體中全身性、局部、經(jīng)口或直腸地體內(nèi)使用穩(wěn)定的硫酸化多糖(其具有顯著的體外抗微生物活性)以治療或防止微生物疾病或感染。
從而，本發(fā)明包括使用硫酸化多糖或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或其立體異構(gòu)體體內(nèi)治療、預(yù)防或處理微生物感染，尤其是病毒感染、細(xì)菌感染、寄生蟲(chóng)感染或者真菌感染的方法，與常規(guī)的硫酸葡聚糖相比，該硫酸化多糖或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或其立體異構(gòu)體具有結(jié)構(gòu)柔性、受控的硫酸化程度和任選關(guān)于其分子量的均一性，以及低程度的硫酸化。
本發(fā)明還提供了治療、預(yù)防或處理微生物感染的方法，該方法包括對(duì)需要該治療、預(yù)防或處理的患者施用治療或預(yù)防上有效量的具有大于6％到低于13％硫酸化的硫酸化多糖或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或立體異構(gòu)體。如上面所提到的，這種硫酸化多糖在感染性疾病或病癥的治療中尤其有效，這些感染性疾病或病癥包括，但不限于，病毒感染、細(xì)菌感染、寄生蟲(chóng)感染，或真菌感染。
不被任何理論限制，用于根據(jù)本發(fā)明的方法和組合物中的硫酸化多糖和其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或異構(gòu)體具有足夠產(chǎn)生人體中該化合物的體內(nèi)抗微生物活性的硫酸化百分比，但是該硫酸化百分比被控制而使得化合物能夠在穿過(guò)腎之后逃脫高電荷密度聚陰離子的細(xì)胞受體的結(jié)合和脫硫酸化。這導(dǎo)致保持體內(nèi)抗微生物活性而沒(méi)有毒性或副作用。
不被任何特定理論限制，本申請(qǐng)人相信有一個(gè)硫酸化多糖的電荷密度范圍，在該范圍內(nèi)硫酸化多糖顯示出體外抗微生物活性并保留它們的體內(nèi)抗微生物活性。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的硫酸化多糖具有大于6％并低于13％，優(yōu)選大于約7％并低于13％，更優(yōu)選大于約8％和12.5％，最優(yōu)選9％、9.5％、10％，10.5％、11％、11.5％、12％、12.2％、12.5％或12.8％，±1％以?xún)?nèi)。
用于本發(fā)明方法中的優(yōu)選的硫酸化多糖是硫酸化葡聚糖，或者α-1，6-連接的多糖，其已經(jīng)被修飾而具有適宜的硫酸化百分比。本發(fā)明的硫酸化葡聚糖含有小于13％，并且可含有小于12％、小于11％、小于約10％、小于9％、小于8％、小于7％，但是大于6％的硫。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該硫酸化葡聚糖變體的硫酸化小于13％并大于6％，更優(yōu)選地，從約7.0％到約12.8％，甚至更優(yōu)選從約8.5％到約12.8％，最優(yōu)選地，從約9.5％到小于13％。具有約12.2％和約12.5％的硫酸化的硫酸化葡聚糖對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒感染尤其有效。
本發(fā)明的硫酸化多糖，尤其是硫酸化葡聚糖，可以使用公知的合成技術(shù)和試劑制備?？梢孕薷谋绢I(lǐng)域中公知的一些方法從而實(shí)現(xiàn)適當(dāng)程度的硫酸化。這些方法包括圖3中描述的那些方法。然而，如上面提到的，可以控制分子量以及硫酸化程度。申請(qǐng)人已經(jīng)合成了具有受控的硫含量和受控的硫酸鹽取代程度的硫酸化葡聚糖，從而它們不被針對(duì)高度帶電的多糖的細(xì)胞受體攝取。這些多糖顯示出與體外基本相同的高體內(nèi)抗病毒活性并且在體內(nèi)具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性和更長(zhǎng)的壽命，由于它們不易被細(xì)胞吸收，所以它們的毒性也更小。具有受控的硫含量的硫酸化葡聚糖尤其適于作為病毒細(xì)胞附著抑制劑，因?yàn)樵摿蛩峄暇厶蔷哂歇?dú)特結(jié)構(gòu)(由α-1，6-糖苷鍵組成的基本線性鏈?zhǔn)沟闷涑蔀楦腥嵝缘亩嗵?，其使得組成性硫酸根基團(tuán)與病毒蛋白上的正電荷能夠最大相互作用但是不顯著結(jié)合包括白蛋白的血漿蛋白。
在另一個(gè)備選實(shí)施方案中，本發(fā)明包括使用均一的硫酸化多糖。就是說(shuō)根據(jù)這里描述的方法施用或者用于藥物組合物和劑型中的硫酸化多糖顯示出大體上相同的硫酸化百分比或分子量或兩者。
在分開(kāi)的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中微生物感染的方法，該方法包括對(duì)有這種需要的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的含有硫酸化多糖的組合物，該多糖中每個(gè)葡萄糖殘基的硫酸鹽取代百分比為大于6％到小于13％，其中硫酸化百分比范圍能使得組成性硫酸根基團(tuán)與導(dǎo)致感染的微生物之間能夠最大相互作用，并且其中在哺乳動(dòng)物中硫酸化多糖基本上不通過(guò)細(xì)胞受體結(jié)合而被內(nèi)吞或降解，從而保持體內(nèi)抗微生物活性。優(yōu)選地，硫酸化多糖是硫酸化葡聚糖。
本發(fā)明還包括抗炎性疾病或失調(diào)、間質(zhì)性膀胱炎和抗關(guān)節(jié)炎疾病的治療、預(yù)防或處理。本發(fā)明還包括使用本發(fā)明的硫酸化多糖作為抗蛋白尿劑(在腎病中發(fā)生的蛋白尿)。
本發(fā)明還包括治療或防止哺乳動(dòng)物中微生物感染的方法，該方法包括對(duì)需要這種治療或預(yù)防的哺乳動(dòng)物施用有效量的左旋硫酸化多糖，該左旋硫酸化多糖具有從約6％到約20％；優(yōu)選從約6％到約13％；更優(yōu)選從約9％到約13％的硫酸化百分比。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括治療或防止哺乳動(dòng)物中微生物感染的方法，該方法包括對(duì)需要這種治療或預(yù)防的哺乳動(dòng)物施用有效量的高碘酸鹽-處理的陰離子多糖。優(yōu)選地，高碘酸鹽處理的陰離子多糖是高碘酸鹽處理的硫酸化葡聚糖。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包括本發(fā)明包括治療或防止哺乳動(dòng)物中微生物感染的方法，該方法包括對(duì)需要這種治療或預(yù)防的哺乳動(dòng)物施用有效量的共帶電的陰離子多糖，其硫酸化百分比使得與微生物的相互作用最大，并且其在哺乳動(dòng)物中基本上不通過(guò)細(xì)胞受體結(jié)合而被內(nèi)吞或降解，從而保持體內(nèi)抗微生物活性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，共帶電的陰離子多糖通過(guò)羧甲基、磺酸根基團(tuán)、硫酸根基團(tuán)或它們的組合共帶電；更優(yōu)選地，通過(guò)羧甲基使共帶電的陰離子多糖共帶電。在特定實(shí)施方案中，共帶電的陰離子多糖是羧甲基硫酸葡聚糖或羧甲基纖維素。
5.1治療、預(yù)防和處理微生物感染的方法在一個(gè)實(shí)施方案中，用本發(fā)明的化合物和方法治療、預(yù)防或處理的微生物感染是病毒感染?？梢酝ㄟ^(guò)本發(fā)明的方法治療、預(yù)防或處理的病毒感染包括，但不限于DNA和RNA病毒。在本發(fā)明范圍內(nèi)的DNA和RNA病毒包括，但不限于雙鏈DNA病毒、單鏈DNA病毒、DNA逆轉(zhuǎn)錄病毒、RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒、雙鏈RNA病毒、負(fù)義單鏈RNA病毒、正義單鏈RNA病毒，和雙義RNA病毒。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，該方法和組合物可用于治療、預(yù)防或處理無(wú)包膜病毒的感染，這些無(wú)包膜病毒，包括但不限于，細(xì)小核糖核酸病毒、杯狀病毒、星狀病毒、呼腸孤病毒、雙RNA病毒、圓環(huán)病毒、細(xì)小病毒、乳多空病毒、和腺病毒。
在優(yōu)選的特定實(shí)施方案中，該方法和組合物可用于治療、預(yù)防或處理包膜病毒的感染，這些包膜病毒包括但不限于，披膜病毒、黃病毒、彈狀病毒、線狀病毒、副粘病毒、正粘病毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、嗜肝DNA病毒、皰疹病毒、痘病毒、虹彩病毒、和動(dòng)脈病毒。
通過(guò)本發(fā)明的方法可以治療、預(yù)防或處理的特定包膜雙鏈DNA病毒包括，但不限于，皰疹病毒B病毒(猴皰疹病毒1)、牛痘病毒、Epstein-Barr病毒(人皰疹病毒4)、乙型肝炎病毒、單純皰疹病毒1和2(HSV-1和-2)、人巨細(xì)胞病毒(人皰疹病毒5)、人皰疹病毒6A、6B和7、傳染性軟疣病毒、猴痘病毒、假牛痘病毒、塔納痘病毒、痘苗病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、天花病毒(天花病毒)、非洲豬熱病病毒、牛mamillities病毒、牛丘疹性口炎病毒、蛇頭素皰疹病毒1、牛痘病毒、缺肢病毒(鼠痘病毒)、馬流產(chǎn)病毒(EHV1)、馬性交疹病毒、馬鼻肺炎病毒(EHV4)、纖維瘤病毒(兔、野兔和松鼠的)、蛙病毒1-3、5-24、L2、L4和L5、禽痘病毒、金魚(yú)病毒1-2、傳染性牛鼻氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒(家禽)、淋巴囊腫病病毒(魚(yú))、馬立克氏病病毒(家禽)、Movar皰疹病毒、粘液瘤病毒、口瘡病毒(傳染性小膿皰皮炎病毒)、假牛痘病毒(擠奶者結(jié)節(jié)病毒)、假狂犬病病毒、綿羊痘病毒、豬痘病毒、亞巴痘病毒，和旱獺肝炎病毒。
通過(guò)本發(fā)明的方法可以治療、預(yù)防或處理的特定無(wú)包膜雙鏈DNA病毒包括，但不限于，腺病毒1-49、猿腺病毒1-27、牛腺病毒1-9、豬腺病毒1-4、綿羊腺病毒1-6、馬腺病毒1-2、鼠腺病毒1-2、BK病毒、JC病毒、K病毒(兔)、兔腎空泡病毒、乳多空病毒1-60、猿病毒12(SV12)、猿病毒40(SV40)、牛乳多空病毒1、2和4、犬口乳多空病毒、犬腺病毒2、馬乳多空病毒、綿羊乳多空病毒、馬腺病毒、胎恒河猴腎病毒、傳染性犬肝炎病毒、小鼠多瘤病毒、非洲綠猴B-嗜淋巴細(xì)胞多瘤病毒，和Shope乳多空病毒。
通過(guò)本發(fā)明的方法可以治療、預(yù)防或處理的特定無(wú)包膜單鏈DNA病毒包括，但不限于，細(xì)小病毒B-19、RA-1病毒、阿留申貂病病毒、犬細(xì)小病毒、貂腸炎病毒、小鼠小病毒、雞貧血病毒、鸚鵡喙和羽毛病病毒，和豬圓環(huán)病毒。
通過(guò)本發(fā)明的方法可以治療、預(yù)防或處理的特定無(wú)包膜單鏈正義RNA病毒包括，但不限于，柯薩奇病毒A1-21和A24、柯薩奇病毒B1-6、艾可病毒1-7、9、11-27和29-34、腸道病毒68-71、甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、諾沃可和類(lèi)似病毒(如南安普敦、雪山、夏威夷和Taunton病毒)、脊髓灰質(zhì)炎病毒1-3、鼻病毒1-113、1A和1B、牛腸病毒1-7、腦心肌炎病毒、貓杯狀病毒、口蹄疫病毒、小鼠脊髓灰質(zhì)炎病毒(泰勒病毒)、鼠腦脊髓炎病毒、豬腸道病毒1-8、牛腸道病毒1-7、猿腸道病毒1-18、兔出血病病毒、豬泡狀病病毒、水皰疹病毒1-12(豬)、黑猩猩杯狀病毒(Pan-1)、San Miguel海獅病毒1-8、歐洲棕兔病病毒、貓杯狀病毒、犬杯狀病毒、牛腸杯狀病毒、豬腸杯狀病毒、貂杯狀病毒、爬行動(dòng)物杯狀病毒、海象杯狀病毒、雞杯狀病毒、人星狀病毒1-5、牛星狀病毒1-2、綿羊星狀病毒、豬星狀病毒、犬星狀病毒、和鴨星狀病毒。
通過(guò)本發(fā)明的方法可以治療、預(yù)防或處理的特定包膜單鏈正義RNA病毒包括，但不限于，Barmah森林病毒、中歐腦炎病毒、屈曲病毒、登革病毒1-4、東方馬腦炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒1和2、人T-嗜淋巴細(xì)胞病毒1和2、Igbo Ora病毒、日本腦炎病毒、Kyasanur森林病毒、Mayaro病毒、墨累河谷腦炎病毒、O′nyong-nyong病毒、鄂木斯克出血熱病毒、Rocio病毒、羅斯河病毒、風(fēng)疹病毒、俄國(guó)春夏腦炎病毒、Semliki森林病毒、Sindbis病毒(和變種Ockelbo和Babanki病毒)、圣路易斯腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、西尼羅河病毒、西方馬腦炎病毒、黃熱病病毒、鳥(niǎo)網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生病病毒、鳥(niǎo)肉瘤和白血病病毒、邊緣病病毒(綿羊)、牛免疫缺陷病毒、經(jīng)典豬熱病毒、東部馬腦炎病毒、馬流行性貧血病毒、貓免疫缺陷病毒、貓白血病病毒、貓肉瘤病毒、Getah病毒、豬瘟病毒、日本腦炎病毒、乳酸脫氫酶鼓起病毒(小鼠)、羊/魅敵病病毒(綿羊)、小鼠肝炎病毒、小鼠乳癌病毒、粘膜病病毒(牛)、鼠白血病病毒(包括Abelson、AKR、Friend)、Maloney白血病病毒、綿羊進(jìn)行性肺炎病毒、勞斯肉瘤病毒、Rauscher鼠白血病病毒、猿免疫缺陷病毒(包括非洲綠猴、SootyMangabey、殘尾獼猴、豬尾獼猴、獼猴、黑猩猩，和Mandrill病毒)、猿D型逆轉(zhuǎn)錄病毒、猿T-細(xì)胞嗜淋巴細(xì)胞病毒、蜱傳腦炎病毒(包括歐洲和遠(yuǎn)東蜱傳腦炎病毒、Louping ill病毒，和Powassan病毒)、Venezuelan馬腦炎病毒、Wesselsbron病毒，和西方馬腦炎病毒、卷毛猴肉瘤病毒。
通過(guò)本發(fā)明的方法可以治療、預(yù)防或處理的特定包膜單鏈負(fù)義RNA病毒包括，但不限于，Alagoas病毒、布尼奧羅病毒、Bwamba病毒、加利福尼亞腦炎病毒、克里米亞-剛果出血熱病毒、流感病毒A、B和C、Isfahan病毒、Jamestown峽谷病毒、Junin病毒(阿根廷出血熱病毒)、Lagos蝙蝠病毒、La Crosse病毒、拉沙病毒、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCM病毒)、Machupo病毒、Maraba病毒、馬爾堡病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、Mokola病毒、Muerto峽谷病毒、Oriboca病毒、Oropouche病毒、副流感病毒1(仙臺(tái)病毒)、2、3、4a和4b、Pichinde病毒、Piry病毒、Punto toro病毒、Puumala病毒、狂犬病毒、呼吸道合胞病毒、山谷熱病毒、白蛉熱病毒、Sandfly fever-Sicilian病毒、Seoul病毒、Sin Nombre病毒、Tacaribe病毒、Tahyna病毒、Tamiami病毒、皰疹性口腔炎病毒(包括新澤西合印第安納株系)、Akabane病毒、Aino病毒、鳥(niǎo)副粘病毒2(Yucaipa病毒)、3、4、5(Kunitachi病毒)、6、7、8和9、牛短生熱病毒、牛呼吸合胞病毒、犬瘟病毒、海豚瘟熱病毒、Ebola病毒(包括亞型Zaire、Sudan、和Reston)、馬麻疹病毒、傳染性造血壞死病毒(魚(yú))、豬、馬、海豹和禽流感病毒、Kotonkan病毒、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、Obodhiang病毒、Peste-des-petis-ruminants病毒(綿羊和山羊)、小鼠肺炎病毒、豬rubula病毒(la-Piedad-Michoacan-Mexico病毒)、狂犬病毒、山谷熱病毒、牛瘤病毒、猿副流感病毒10，和水泡性口炎病毒。
通過(guò)本發(fā)明的方法可以治療、預(yù)防或處理的特定雙鏈RNA病毒包括，但不限于，科羅拉多蜱熱病毒、呼腸孤病毒1-3、Orungo病毒、Kemerovo病毒、輪狀病毒組A-F、Eyach病毒、Ibaraki病毒、金色發(fā)光病毒、Chub呼腸孤病毒、非洲馬疾病病毒1-9、動(dòng)物流行性出血熱病病毒(鹿)、傳染性囊病病毒(家禽)、傳染性胰壞死病毒(魚(yú))、人輪狀病毒，和呼腸孤病毒1-3。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括治療、預(yù)防或處理導(dǎo)致癌癥或與癌癥相關(guān)的病毒。此外，本發(fā)明包括抗或者顯示出抗常規(guī)抗病毒療法的病毒株系的治療、預(yù)防或處理。在特定實(shí)施方案中，優(yōu)選方法包括使用硫酸葡聚糖的變體抗乙型肝炎、HIV-1、HIV-2、HCMV、MCMV、VZV、EBV、麻疹病毒、Punto Toro a、VEE、西尼羅河病毒、痘苗、牛痘、腺病毒1型、HPIV、人肺炎后病毒、出血性敗血癥病毒、丙型副流感病毒、pichinde和鼻病毒。
在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，所治療的病毒不是皰疹病毒，或者更特別地，所要治療的病毒不是HSV-1或HSV-2。此外，在另一備選實(shí)施方案中，所要治療的病毒不是逆轉(zhuǎn)錄病毒，或者更特別地，所要治療的病毒不是HIV-1、HIV-2或HTLV。
在另一實(shí)施方案中，被本發(fā)明的化合物和方法治療、預(yù)防或處理的微生物感染是細(xì)菌或寄生蟲(chóng)感染?？梢员淮颂幟枋龅姆椒ㄖ委煛㈩A(yù)防或處理的特定細(xì)菌和寄生蟲(chóng)包括，但不限于，沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)、幽門(mén)螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、乳酸菌(Lactobacilli)、瘧原蟲(chóng)變種(Plasmodium sp.)、大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、Staphylococcushemolyticus、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophlila)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhea)、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、諾氏瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumknowlesi)、和惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodium falciparum)。
本發(fā)明提供了將治療有效量的硫酸化多糖或這種硫酸化多糖的組合導(dǎo)入患者的血液、淋巴系統(tǒng)、和/或組織的細(xì)胞外間隙，以治療和/或預(yù)防微生物感染，如病毒感染、細(xì)菌感染或者寄生蟲(chóng)感染的方法。該方法包括對(duì)哺乳動(dòng)物施用至少硫酸化多糖，其顯示出體外抗微生物活性，該硫酸化多糖具有導(dǎo)致該帶電多糖的抗微生物活性在體內(nèi)保持的硫酸化，例如，最小化被具有高帶電密度細(xì)胞受體的細(xì)胞攝取的硫酸化。
不被理論束縛，本申請(qǐng)人認(rèn)為本發(fā)明的硫酸化多糖具有對(duì)淋巴結(jié)的高親和性從而具有抵抗在淋巴系統(tǒng)中居住或繁殖的病毒的增強(qiáng)的活性。這樣，本發(fā)明包括將本發(fā)明的硫酸化多糖直接施用于或者靶定患者的淋巴系統(tǒng)。
然而，用于疾病的急性或慢性處理的本發(fā)明的硫酸化多糖或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、水合物或立體異構(gòu)體的預(yù)防性或治療性劑量大小將隨著疾病或感染的本質(zhì)或嚴(yán)重性以及活性成分所施用的途徑而變。劑量，和可能地劑量頻率，也將根據(jù)所要治療的疾病或感染、年齡、體重和個(gè)體患者的應(yīng)答而變。本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)考慮這些因素后可以容易地選擇適宜的劑量給藥方案。
本發(fā)明的方法尤其適于人類(lèi)患者。具體地，本發(fā)明的方法和劑量可用于無(wú)免疫應(yīng)答的患者，包括但不限于癌癥患者、HIV感染的患者、患有免疫退行性病的患者。此外，該方法可用于當(dāng)前處于緩解狀態(tài)的免疫受損的患者。本發(fā)明的方法和劑量還用于經(jīng)歷其他抗病毒治療的患者。本發(fā)明的發(fā)明方法尤其用于處于微生物感染危險(xiǎn)之中的患者。這些患者包括，但不限于健康護(hù)理工人，例如，醫(yī)生、護(hù)士、救濟(jì)院照料人員、軍隊(duì)人員、教師、育兒工人、旅行到或者居住在外國(guó)場(chǎng)所的，尤其是第三世界場(chǎng)所的患者，包括社會(huì)援助工人、傳教士和外交官。最后，本發(fā)明方法和組合物包括難治愈患者或者對(duì)治療具有抗性如對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑等具有抗性的患者的治療。
5.1.1劑量通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)方法在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中可以確定本發(fā)明化合物的毒性和效能，例如，確定LD50(對(duì)50％的群體致命的劑量)和ED50(對(duì)50％群體治療有效的劑量)。毒性和療效之間的劑量比例是治療指數(shù)并且其可以表達(dá)為比例LD50/ED50。
從細(xì)胞培養(yǎng)和動(dòng)物研究得到的數(shù)據(jù)可用于制定用于人的化合物的劑量范圍。這種化合物的劑量?jī)?yōu)選位于包括ED50而幾乎沒(méi)有或者無(wú)毒性的循環(huán)濃度范圍。在該范圍內(nèi)劑量可以依賴(lài)于所用劑型和所用施用途徑而變。對(duì)于用于本發(fā)明方法的任何化合物，可以最初從細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定法估計(jì)治療有效劑量?？梢栽趧?dòng)物模型中設(shè)計(jì)劑量以實(shí)現(xiàn)循環(huán)血漿濃度范圍，其包括如在細(xì)胞培養(yǎng)物中確定的IC50(即，實(shí)現(xiàn)癥狀的半數(shù)最大抑制的受試化合物濃度)。這種信息可用于更準(zhǔn)確地確定在人中有用的劑量。通過(guò)例如，高效液相層析可以測(cè)量血漿中的水平。
在人中使用前，優(yōu)選體外然后體內(nèi)試驗(yàn)本發(fā)明的方案和組合物的所希望的治療或預(yù)防活性。例如，可用于確定是否指出特定治療方案的施用的體外測(cè)定法包括體外細(xì)胞培養(yǎng)物測(cè)定法，其中易受所要治療、預(yù)防或處理的微生物感染的細(xì)胞(例如，原代細(xì)胞、被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系、患者組織樣品，等)或者所要治療、預(yù)防或處理的微生物可以在其上生長(zhǎng)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(例如，LB肉湯/瓊脂、YT肉湯/瓊脂、血液瓊脂，等)被暴露于或者被施用本發(fā)明的化合物并且評(píng)定該化合物對(duì)微生物生長(zhǎng)能力的影響。用于本發(fā)明的化合物在人中試驗(yàn)前可以在適宜的動(dòng)物模型系統(tǒng)中試驗(yàn)，這些動(dòng)物模型系統(tǒng)包括但不限于，大鼠、小鼠、雞、奶牛、猴、兔、倉(cāng)鼠等。這些化合物然后可用于適宜的臨床試驗(yàn)中。
用于疾病或狀況的急性或慢性處理的本發(fā)明的硫酸化多糖或者其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、水合物或立體異構(gòu)體的預(yù)防性或治療性劑量大小將隨著疾病或感染的本質(zhì)或嚴(yán)重性以及活性成分所施用的途徑而變。劑量，和可能地劑量頻率，也將根據(jù)所要治療的感染、年齡、體重和個(gè)體患者的應(yīng)答而變。本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)考慮這些因素后可以容易地選擇適宜的劑量給藥方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用的劑量依賴(lài)于所用的特定化合物，和患者的體重和狀況而變。通常，日劑量為從約0.001到500mg/kg，優(yōu)選約0.01到200mg/kg，更優(yōu)選約0.005到100mg/kg。對(duì)于被病毒感染的人的治療，每天施用約0.1mg到約15g，分成每天約1到4次。此外，所推薦的每日的小劑量可以循環(huán)地作為單劑或者與其他治療劑組合施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，以單劑或者均分的劑量施用日劑量。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解的，不同治療有效量可應(yīng)用于不同感染。類(lèi)似地，足夠治療或預(yù)防這些感染，但是不足以導(dǎo)致、或足夠減小與常規(guī)療法相關(guān)的副作用的量也包括在上述劑量和劑量頻率方案中。
5.1.2組合療法本發(fā)明的特定方法還包括施用額外的治療劑(即，不同于本發(fā)明化合物的治療劑)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物可以與至少一種其他治療劑組合。該治療劑包括，但不限于抗生素、抗嘔劑、抗抑郁劑、抗真菌劑、消炎劑、抗病毒劑、抗癌劑、免疫調(diào)節(jié)劑、β-干擾素、烷基化劑、激素或細(xì)胞因子。
本發(fā)明的硫酸化多糖可以與抗生素組合施用或配制。例如，它們可以與大環(huán)內(nèi)酯物(例如，托普霉素(Tobi))、頭孢菌素(例如，頭孢氨芐(Keflex)、芑氨基乙酰去乙酸頭孢菌素(Velosef)、頭孢醋呋肟(Ceftin)，頭孢羅齊(Cefzil)、氯頭孢菌素(Ceclor)、頭孢克肟(Suprax)或頭孢羥氨芐(Duricef))、克拉霉素(例如，克拉霉素(Biaxin))、紅霉素(例如紅霉素(EMycin))、青霉素(例如，青霉素V(V-CillinK或PenVeeK))或喹諾酮(例如，氧氟沙星(Floxin)、卷須霉素(Cipro)或氟哌酸(Noroxin))、氨基糖苷類(lèi)抗生素(例如阿泊拉霉素、阿拜卡霉素、班貝霉素，丁酰苷菌素、雙去氧卡那霉素、新霉素、十一碳烯酸鹽、乙基西梭霉素、巴龍霉素、硫酸核糖霉素、西梭霉素、壯觀素、amphenicol抗生素(例如，疊氮氯霉素、氯霉素、florfenicol、和甲砜氯霉素)、安沙霉素(例如，利福霉素b和利福平)、carbacephems(例如，loracarbef)、carbapenems(例如，biapenem和imipenem)，頭孢菌素類(lèi)(例如，氯頭孢菌素、頭孢羥氨芐、頭孢羥唑、頭孢曲秦、頭孢吡酮、頭孢唑蘭、頭孢咪唑、頭孢吡四唑、和頭孢匹羅)、頭霉素(例如，頭孢拉宗、頭孢氰唑、和頭孢米諾)、單菌霉素(例如，氨曲南、卡盧莫南、和泰格莫南)、oxacephems(例如，flomoxef和羥羧氧酰胺菌素)、青霉素(例如，美西林、匹美西林、阿莫西林、氨芐西林甲戊酯、芐基青霉素酸、芐基青霉素鈉、依匹西林，苯氧芐青霉素、氟氯青霉素、青霉素G雙酯、噴沙西林、青霉素o-苯明西林、青霉素O、青霉素V、芐星青霉素、哈胺青霉素V、青四環(huán)素和兩性霉素鉀)、lincosamide(例如，氯潔霉素、和linocomycin)、兩性霉素、桿菌肽、纏霉素、粘菌素、持久殺菌素、結(jié)核放射菌素-N、四環(huán)素類(lèi)(例如，羥哌二甲胺四環(huán)素、氯四環(huán)素、氯摩四環(huán)素、和脫甲四環(huán)素)、2、4-二氨基嘧啶(例如，嗅莫普林)、硝基呋喃(例如，呋嗎唑酮、和氯化呋噻咪唑)、喹諾酮及其類(lèi)似物(例如，噌惡星、克林沙星、氟甲喹、和grapagloxacin)，磺胺類(lèi)(例如，乙?；前芳籽踹拎骸⑵S基磺酰胺、苯丙磺胺二磺酸鈉，鄰苯二甲酰磺胺噻唑、偶氮磺胺，和磺胺西汀)，砜(例如，百里砜，葡萄糖砜鈉、和苯丙砜)、環(huán)絲氨酸、莫匹羅星和抗結(jié)核菌素。
本發(fā)明的硫酸化多糖可以與抗嘔劑組合施用或配制。適宜的抗嘔劑包括，但不限于，胃復(fù)安、哌雙咪酮、氯拉嗪、異丙嗪、氯丙嗪、曲美芐胺、奧丹西隆、格雷西隆、羥嗪、乙酰亮氨酸單乙醇胺、阿利必利、阿扎西隆、苯喹胺、氨醇醋茶堿、溴必利、氯苯丁嗪、氯波必利、苯甲嗪、氯茶堿苯海拉明、二苯哌啶丁醇、多拉司瓊、美其敏、美沙拉妥、甲磺哌丙嗪、拉必酮、奧昔噴地、嗶哌嗎嗪、莨菪胺、舒必利、四氫大麻酚、硫乙哌丙嗪、硫丙拉嗪、托烷司瓊、和它們的混合物。
本發(fā)明的硫酸化多糖可以與抗抑郁劑組合施用或配制。適宜的抗抑郁劑包括，但不限于，碧來(lái)達(dá)寧、卡羅沙宗、西酞普蘭、二甲氨乙茶堿、苯乙胺甲嘌呤、吲達(dá)平、鹽酸茚氯嗪、鎮(zhèn)痛醚、諾米芬辛、5-羥色氨酸、奧潑定、帕羅西汀、舍曲林、鹽酸硫西新、曲唑酮、苯莫新、異丙氯肼、異丙煙肼、異唑肼、丙酰芐氨、辛肼、苯乙肼、可鐵寧、環(huán)丙胺、麥普替林、metralindole、mianserin、米氮平、阿的那唑侖、阿米替林、氨基噻唑霉素、阿莫沙平、丁替林、鹽酸氯丙米嗪、地美替林、去甲丙咪嗪、二苯氮、二甲丙吖、度硫平、多慮平、fluacizine、丙咪嗪、丙咪嗪N-氧化物、伊普吲哚、lofepramine、美利蒽、甲氨甲咪嗪、去甲替林、肟替林、奧匹哌醇、苯噻啶、丙吡西平、普羅替林奎核氮、噻萘普丁、三甲丙咪嗪、阿屈非尼、苯乃靜、丁氨苯丙酮、丁醋苯胺、二苯噁啶、度洛西汀、依托哌酮、苯甲氨酯、法莫克西汀、氯苯己二醇、氟西汀、氟握肟氨、血卟啉、金絲桃素、苯基六氫吡啶甲醇乙酸酯、甲二苯氧氨、milnacipran、米那普林、摩氯普胺、奈法唑銅、鹽酸奧沙氟生匹帕拉林、prolintane、吡啶琥醇、利坦色林、羅新朵、氯化銣、山嘔靈、坦多吡酮、苯噁唑氨、二苯甲氧氨、托落沙酮、反苯環(huán)丙胺、L-色氨酸、萬(wàn)拉法新溴苯丙啶、乙氧苯氧甲基嗎啉和齊美立啶。
本發(fā)明的硫酸化多糖可以與抗真菌劑組合施用或配制。適宜的抗真菌劑包括但不限于兩性霉素B、伊曲康唑、復(fù)方酮康唑、氟康唑、intrathecal、5-氟胞嘧啶、雙氯苯咪唑、布康唑、克霉唑、制霉菌素、曲康唑、噻康唑、環(huán)己吡酮乙醇胺、益康唑、氯酚醚、奈呋替芬、氯化乙酰膽堿、十一碳烯酸鹽、和griseofuldin。
本發(fā)明的硫酸化多糖可以與消炎劑組合施用或配制。適宜的消炎劑包括但不限于，水楊酸、乙?；畻钏?、水楊酸甲酯、二氟苯水楊酸、雙水楊酯、奧沙拉嗪、柳氮磺胺吡啶、醋氨酚、消炎痛、蘇靈大、依托度酸、甲滅酸、氯滅酸鈉、甲苯酰吡酸、酮咯酸、扶他林、布洛芬、甲氧萘丙酸、甲氧萘丙酸鈉、苯氧苯丙酸鈣、酮丙酸、氟比洛芬、奧沙普嗪、吡氧噻嗪、美洛昔康、安吡昔康、卓喜康、炎痛喜康、替諾昔康、萘普酮、保泰松、羥保泰松、安替比林、氨基比林、阿扎丙酮和尼美舒利；白三烯拮抗劑，包括，但不限于，苯噻羥脲、金硫代葡萄糖、金硫丁二鈉和醋硫葡金；類(lèi)固醇類(lèi)，包括，但不限于，阿氯米松、安西縮松、氯地米松雙丙酸酯、倍他米松、苯甲酸倍他米松、倍他米松雙丙酸酯、磷酸倍他米松鈉、戊酸倍他米松、丙酸氯倍他索、氯可托龍、特戊酸氯可托龍、氫化可的松、氫化可的松衍生物、丙縮羥強(qiáng)龍、去羥米松、地塞米松、氟尼縮松、flucoxinolide、flurandrenolide、halcinocide、甲羥孕酮、甲基強(qiáng)的松龍、乙酸甲基強(qiáng)的松龍、琥珀酸甲基強(qiáng)的松龍鈉、糠酸莫美達(dá)松、乙酸對(duì)氟米松、強(qiáng)的松龍、乙酸強(qiáng)的松龍、磷酸強(qiáng)的松龍鈉、tebuatate強(qiáng)的松龍、強(qiáng)的松、醋酸去炎松、醋酸去炎松丙酮化合物、雙乙酸去炎松和triamcinolone hexacetonide；和其他消炎劑包括，但不限于，氨甲蝶呤、秋水仙素、別嘌呤醇、丙璜舒、苯磺唑酮和苯溴香豆酮。
本發(fā)明的硫酸化多糖可以與另一種抗病毒劑組合施用或配制。有用的抗病毒劑包括但不限于，蛋白酶抑制劑、核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非-核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和核苷類(lèi)似物。抗病毒劑包括但不限于疊氮胸苷、無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷、gangcyclovir、阿糖腺苷、碘苷、三氟尿苷、利巴偉林、以及磷酸膽堿鈣磷甲酸、金剛胺、金剛乙胺、沙奎那韋、吲哚那韋、安潑那韋、lopinavir、利托那韋、α-干擾素、阿德福韋、clevadine、entecavir、pleconaril。
本發(fā)明的硫酸化多糖可以與免疫調(diào)節(jié)劑組合施用或配制。免疫調(diào)節(jié)劑包括，但不限于，methothrexate、來(lái)氟洛米環(huán)磷酰胺、環(huán)孢霉素A、mycophenolatemofetil、瑞帕霉素、咪唑立賓、白瑞夸爾、malononitriloamindes(例如，來(lái)氟洛米)、T細(xì)胞受體調(diào)節(jié)劑、細(xì)胞因子受體調(diào)節(jié)劑、肽模擬物，和抗體(例如，人的、人源化的、嵌合的、單克隆的、多克隆的、Fvs、ScFvs、Fab或F(ab)2片段或表位結(jié)合片段)、核酸分子(例如，反義核酸分子和三螺旋)、小分子、有機(jī)化合物，和無(wú)機(jī)化合物。T細(xì)胞受體調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括，但不限于，抗-T細(xì)胞受體抗體(例如，抗-CD4抗體(例如，cM-T412(Boeringer)、IDEC-CE9(IDEC和SKB)、mAB4162W94、Orthoclone和OKTcdr4a(Janssen-Cilag))、抗-CD3抗體(例如，Nuvion(Product DesignLabs)、OKT3(Johnson & Johnson)、或Rituxan(IDEC))、抗-CD5抗體(例如，抗-CD5蓖麻毒素-連接的免疫綴合物)、抗-CD7抗體(例如，CHH-380(Novartis))、抗-CD8抗體、抗-CD40配體單克隆抗體(例如，IDEC-131(IDEC))、抗-CD52抗體(例如，CAMPATH1H(Ilex))、抗-CD2抗體、抗-CD11a抗體(例如，Xanelim(Genentech))，和抗-B7抗體(例如，IDEC-114(IDEC))和CTLA4-免疫球蛋白。細(xì)胞因子受體調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括，但不限于，可溶的細(xì)胞因子受體(例如，TNF-α受體的胞外結(jié)構(gòu)域或其片段、IL-1β受體的胞外結(jié)構(gòu)域或其片段、和IL-6受體的胞外結(jié)構(gòu)域或其片段)、細(xì)胞因子或其片段(例如，白介素(IL)-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、TNF-α、干擾素(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ，和GM-CSF)、抗細(xì)胞因子受體抗體(例如，抗IFN受體抗體、抗IL-2受體抗體(例如，Zenapax(Protein Design Labs))、抗IL4-受體抗體、抗IL-6受體抗體、抗IL-10-受體抗體、抗IL-12受體抗體)、抗細(xì)胞因子抗體(例如，抗IFN抗體、抗TNF-α抗體、抗IL-1β抗體、抗IL-6抗體、抗IL-8-抗體(例如，ABX-IL-8(Abgenix))、和抗IL-12抗體)。
本發(fā)明的硫酸化多糖可以與細(xì)胞因子組合施用或配制。細(xì)胞因子的實(shí)例包括，但不限于，白介素-2(IL-2)、白介素-3(IL-3)、白介素-4(IL-4)、白介素-5(IL-5)、白介素-6(IL-6)、白介素-7(IL-7)、白介素-9(IL-9)、白介素-10(IL-10)、白介素-12(IL-12)、白介素15(IL-15)、白介素-18(IL-18)、血小板衍生生長(zhǎng)因子、促紅細(xì)胞生成素(Epo)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子(GM-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、促乳素，和干擾素(IFN)，例如，α-IFN、γ-IFN)。
本發(fā)明的硫酸化多糖可以與激素組合施用或配制。激素的實(shí)例包括，但不限于，黃體生成素釋放激素(LHRH)、生長(zhǎng)激素(OH)、生長(zhǎng)激素釋放激素、ACTH、促生長(zhǎng)素抑制素、促生長(zhǎng)素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素、甲狀旁腺激素、下丘腦釋放因子、胰島素、胰高血糖素、腦啡肽、后葉加壓素、降鈣素、肝素、低分子量肝素、類(lèi)肝素、合成的和天然的依托尼唑、胰島素甲狀腺刺激激素，和內(nèi)啡肽。
本發(fā)明的硫酸化多糖可以與β-干擾素組合施用或配制。β-干擾素包括，但不限于，β-1a干擾素和β-1b干擾素。
本發(fā)明的硫酸化多糖可以與吸收增強(qiáng)劑，尤其是靶定淋巴系統(tǒng)的吸收增強(qiáng)劑組合施用或配制。吸收增強(qiáng)劑包括，但不限于，甘膽酸鈉、癸酸鈉、N-月桂基-y-D-吡喃麥芽糖苷、EDTA、混合的微團(tuán)、和Muranishi Crit. Rev.Ther.Drug Carrier Syst.，7-1-33中報(bào)導(dǎo)的那些，該文獻(xiàn)在此處被完整并入作為參考。也可以使用其他公知的吸收增強(qiáng)劑。從而，本發(fā)明還包括含有本發(fā)明的一種或多種硫酸化多糖和一種或多種吸收增強(qiáng)劑的藥物組合物。
本發(fā)明的硫酸化多糖可以與烷基化劑組合施用或配制。烷基化劑的實(shí)例包括，但不限于，氮芥、氮丙啶、甲基蜜胺、磺酸烷基酯、亞硝基脲、三氮烯、氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、美法侖、苯丁酸氮芥、hexamethylmelaine、硫替派、白消安、卡氯芥、鏈脲霉素、氮烯咪胺、和temozolomide。
本發(fā)明的化合物和其他治療劑可以相加地或者，優(yōu)選協(xié)同地作用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，含有本發(fā)明的化合物的組合物與另一種治療劑同時(shí)施用，該另一種治療劑可以是相同組合物的一部分或者處于與含有本發(fā)明化合物的組合物不同的組合物中。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物在另一治療劑施用之前或隨后施用。在單獨(dú)的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物被施用于以前沒(méi)有使用或者當(dāng)前沒(méi)有使用的另一種治療劑，尤其是抗病毒劑的治療的患者。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括施用一種或多種本發(fā)明的硫酸化多糖而無(wú)額外的治療劑。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括施用一種或多種本發(fā)明的硫酸化多糖而無(wú)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑。
5.2 高碘酸鹽處理的和共帶電的陰離子多糖本發(fā)明包括硫酸化多糖，其已經(jīng)被操作而減少被細(xì)胞受體的內(nèi)吞和增加多糖主鏈的柔性而能夠有效呈遞陰離子帶電基團(tuán)以與靶定微生物上的區(qū)域相互作用。
本發(fā)明包括的一種操作是用高碘酸鹽處理硫酸化多糖。高碘酸鹽處理的陰離子多糖由于一些或所有糖殘基的高碘酸鹽氧化而具有增加的柔性。該處理使得聚合物的旋轉(zhuǎn)自由度和構(gòu)象柔性增加并提供了柔性連接以方便生物學(xué)相互作用。本發(fā)明的高碘酸鹽處理的硫酸化多糖可以有平衡離子以確?？扇苄?，該平衡離子包括，但不限于鈉、鈣、季銨、和鉀。
可以被高碘酸鹽處理并用于此處描述的方法和組合物中的物質(zhì)也包括下面的表1中的多糖。
其他變通方案包括摻入非-硫酸根基團(tuán)，如羧甲基基團(tuán)和磺酸根基團(tuán)。通過(guò)用磺酸根或羧甲基基團(tuán)降低多糖上電荷的取代程度，多糖被高電荷受體內(nèi)吞的能力被極大地降低，因此增加了其血漿穩(wěn)定性。使用別人使用的制備方法的改良方法(McLaughlin和Hirbst，Can.J.Res.28B；731-736，1950；Brown等人，Arkiv Kemi 22189-2061964)可以制備羧甲基硫酸葡聚糖。將約20g葡聚糖在異丙醇(350ml)和3.85M NaOH(40ml)的混合物中調(diào)成漿并在攪拌機(jī)中5℃下攪拌5分鐘。加入氯乙酸鈉(18g)，并在氮?dú)庀?℃下攪拌全部混合物5分鐘，從攪拌機(jī)除去混合物并將其保存于25℃3天。通過(guò)將25℃的時(shí)間從1天改變成3天以及ClCH2COONa與無(wú)水葡萄糖的摩爾比從1改為4并使ClCH2COONa與NaOH的摩爾比從1變?yōu)楸３?.4，可以調(diào)節(jié)羧甲基取代的程度。中和后，將樣品用80％乙醇洗滌并干燥。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括哺乳動(dòng)物微生物感染的預(yù)防或治療方法，該方法包括對(duì)需要這種治療或預(yù)防的哺乳動(dòng)物使用有效量的共帶電的陰離子多糖，其硫酸化百分比使得能與微生物最大相互作用并且其基本上不通過(guò)與哺乳動(dòng)物中的細(xì)胞受體結(jié)合而被內(nèi)吞或降解從而保持體內(nèi)抗微生物活性。在特定實(shí)施方案中，用羧甲基基團(tuán)、磺酸根基團(tuán)、硫酸根基團(tuán)或其組合使共帶電的陰離子多糖共帶電；更優(yōu)選地，用羧甲基基團(tuán)使共帶電的陰離子多糖共帶電。在特定實(shí)施方案中，共帶電的陰離子多糖是羧甲基硫酸葡聚糖或羧甲基纖維素。
5.3活化體內(nèi)使用的硫酸多糖的方法在單獨(dú)的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括增加或減少用于體內(nèi)施用的天然發(fā)生的硫酸化多糖的硫酸化的方法，該方法包括提供具有一定硫酸化的多糖，該硫酸化足夠消除或減少高電荷密度聚陰離子細(xì)胞受體對(duì)該硫酸化多糖的結(jié)合和為該硫酸化多糖提供抗微生物活性。通過(guò)制備具有所希望的硫酸化百分比的組合物可以達(dá)到該硫酸化范圍。備選地，可以用化學(xué)或酶的方法改變或控制天然發(fā)生的物質(zhì)到該硫酸化程度范圍，在該范圍內(nèi)硫酸化對(duì)組成性硫酸根基團(tuán)與導(dǎo)致感染的微生物之間的最大相互作用是有效的，并且其中該硫酸化多糖基本不通過(guò)與哺乳動(dòng)物中細(xì)胞受體結(jié)合而被內(nèi)吞或降解，從而保持體內(nèi)抗微生物活性。
下面表1中所列為硫酸化多糖(不包括硫酸葡聚糖)的實(shí)例，這些硫酸化多糖的抗微生物活性已經(jīng)在體外闡明，但是以前還沒(méi)有表明這些硫酸化多糖在低于這些化合物的毒性水平的劑量具有體內(nèi)抗微生物活性。
表1具有體內(nèi)抗病毒或抗細(xì)菌活性的硫酸化多糖
ASFV非洲豬熱病毒；HHV-7人皰疹病毒；HSV單純皰疹病毒；CMV巨細(xì)胞病毒可以修飾上面所列的每種硫酸化多糖，以及具有體外抗微生物活性的任何其他硫酸化多糖，使得它們的硫酸化程度或者離子電荷到達(dá)適于它們用于本發(fā)明的方法和組合物的水平。
本發(fā)明還包括治療或防止哺乳動(dòng)物中微生物感染的方法，該方法包括將選自硫酸纖維素、(14)-2-脫氧-2-硫酰胺-3-O-硫-(14)-β-D-吡喃葡萄糖(殼聚糖的衍生物)、2-乙酰胺基-2-脫氧-3-O-硫(14)-β-D-吡喃葡萄糖(殼聚糖的衍生物)、Achranthese bidentata硫酸多糖、Aurintricarboxylic acid、spirulan鈣、羧甲基幾丁質(zhì)、化學(xué)降解的肝素(Org 31733)、多硫酸軟骨素、磺酸和二苯基二磺酸脲的共聚物(MDL10128)、硫酸Curdlan、Cyanovirin-N(來(lái)自藻氰菌)、巖藻多糖、硫酸半乳聚糖、葡糖胺-6-硫酸(單糖)、硫酸甘草皂甙、肝素、六硫酸肌醇、硫酸蘑菇多糖、硫酸甘露聚糖、N-?；嗡鼐Y合物、N-羧甲基殼聚糖-N，O-硫酸、寡核苷酸-聚(L-賴(lài)氨酸)-肝素復(fù)合物、多硫酸戊聚糖(xylanopolyhydrogen sulfate)、肽聚糖DS-4152、高碘酸鹽降解的肝素、Phosphorothioate寡脫氧核苷酸、多硫酸聚縮醛、聚肌苷酸-聚胞嘧啶核苷酸、來(lái)自Indocalamus tesselatus(竹葉)的多糖、夏枯草皂苷、硫酸Rhamnan、硫酸呋喃核聚糖、十二烷基硫酸鈉、硫酸十二烷基昆布戊糖苷(烷基寡糖)、硫酸化細(xì)菌粘多糖、硫酸化十二烷基昆布寡聚體(烷基寡糖)、硫酸化神經(jīng)節(jié)苷脂、從昆布-丁糖、昆布-戊糖、昆布-己糖合成的硫酸化昆布寡糖葡萄糖苷、硫酸化N-去乙?；鶜ざ嗵恰⒘蛩峄送榛溠考禾擒?烷基寡糖)、硫酸化十八烷基呋喃核糖、硫酸寡木聚糖(肝素模擬物)、硫酸化木半乳聚糖、硫腦苷脂(3′硫酸半乳糖基?；拾贝?、Sulfoevenan、和硫酸化木甘露聚糖，其中所述化合物的硫酸化百分比已經(jīng)被修飾或控制使得組成性硫酸鹽基團(tuán)與導(dǎo)致感染的微生物能最大相互作用，并且其中該化合物基本上不通過(guò)與哺乳動(dòng)物中的細(xì)胞受體結(jié)合而被內(nèi)吞或降解，從而保持體內(nèi)抗微生物活性。
5.4藥物組合物和劑型本發(fā)明還包括含有本發(fā)明的硫酸化多糖，或者其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或其異構(gòu)體的藥物組合物和單個(gè)單位劑型。本發(fā)明的單個(gè)劑型可適于經(jīng)口、粘膜(包括舌下、口、直腸、鼻或陰道)、腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)、彈丸注射、動(dòng)脈內(nèi)或靜脈內(nèi))、透皮，或局部施用。本發(fā)明的藥物組合物和劑型典型地還含有一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。還考慮無(wú)菌劑型。
在備選的實(shí)施方案中，該實(shí)施方案所包括的藥物組合物包括本發(fā)明的硫酸化多糖，或者其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或其異構(gòu)體，和至少一種額外的治療劑。額外的治療劑的實(shí)例包括，但不限于，上面的5.1.2中所列的治療劑。
本發(fā)明的組合物、形狀和劑型的類(lèi)型將通常根據(jù)它們的用途而變。例如，用于疾病或相關(guān)疾病的急性治療的劑型可含有比用于相同疾病的慢性治療中的劑型更大量的一種或多種活性成分。類(lèi)似地，腸胃外劑型可含有比用于相同疾病或失調(diào)的口服劑型更小量的一種或多種活性成分。這些方法和其他方法中，本發(fā)明所包括的特定劑型將互不相同，這些方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。見(jiàn)，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing，Easton PA(1990)。劑型的實(shí)例包括，但不限于片劑、囊片、膠囊，如軟彈性明膠膠囊、扁囊劑、錠劑、糖錠劑、散劑、栓劑、軟膏劑、糊劑(泥敷劑)、膏劑、粉劑、敷料劑、霜?jiǎng)⑹鄤?、溶液劑、貼劑、氣溶膠(例如，鼻噴霧劑或吸入劑)、凝膠劑；適于經(jīng)口或粘膜施用于患者的液體制劑形式，包括懸浮劑(例如，水性或非水性液體懸浮劑、水包油乳劑，或油包水液體乳劑)、溶液劑和酏劑；適于腸胃外施用于患者的液體劑型、和無(wú)菌固體(例如，晶體狀或無(wú)定形固體)，其可以被重構(gòu)而提供適于腸胃外施用于患者的液體劑型。
典型的藥物組合物和劑型包括一種或多種載體、賦形劑或稀釋劑。適宜的賦形劑是藥學(xué)領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知的，并且在此處提供了適宜的賦形劑的非-限制性實(shí)例。特定賦形劑是否適于摻入藥物組合物或劑型依賴(lài)于本領(lǐng)域中熟知的各種因素，這些因素包括，但不限于，劑型將施用于患者的方法。例如，口服劑型如片劑可含有不適于腸胃外劑型的賦形劑。特定賦形劑的適宜性還依賴(lài)于劑型中的特定活性成分。
本發(fā)明還包括無(wú)水藥物組合物和含有活性成分的劑型，因?yàn)樗梢源龠M(jìn)一些化合物的降解。例如，在藥學(xué)領(lǐng)域中水的加入(例如5％)被廣泛接受為模擬長(zhǎng)期保存以確定如貨架期或者制劑隨著時(shí)間的穩(wěn)定性的特征的一種方法。見(jiàn)，例如，Jens T.Carstensen，藥物穩(wěn)定性；原理和實(shí)踐(Drug Stability；Principles & Practice)，第二版，Marcel Dekker，NY，NY，1995，379-80頁(yè)。實(shí)際上，水和熱加速某些化合物的分解。這樣，水對(duì)制劑的影響可以是非常重要的，因?yàn)樵谥苿┑纳a(chǎn)、操作、包裝、保存、運(yùn)輸和使用過(guò)程中通常遇到水分和/或濕氣。
使用無(wú)水或含有低水分的成分和在低水分或低濕度的條件可以制備本發(fā)明的無(wú)水藥物組合物和劑型。
應(yīng)該制備和保存無(wú)水藥物組合物使得其無(wú)水性質(zhì)被保存。因此，優(yōu)選使用公知的材料包裝無(wú)水組合物以防止暴露于水從而它們可以被包括在適宜的配方藥盒中。適宜的包裝的實(shí)例包括，但不限于，密封的箔、塑料、單位劑量容器(例如，小瓶)、泡罩包裝和條形包裝(strippack)。
本發(fā)明還包括含有降低活性成分分解速度的一種和多種化合物的藥物組合物和劑型。這些化合物在這里被稱(chēng)為“穩(wěn)定劑”，它們包括但不限于，抗氧化劑，如抗壞血酸、pH緩沖劑、或者鹽緩沖劑。
如同賦形劑的量和形式，劑型中的活性成分的量和特定類(lèi)型可依賴(lài)于某些因素而不同，這些因素為如，包括，但不限于，其將被施用于患者的途徑。然而，含有本發(fā)明的硫酸化多糖，或者其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或其立體異構(gòu)體的本發(fā)明的典型劑型含有0.1mg到1500mg/單位以提供約0.01到200mg/kg的日劑量。
5.4.1口服劑型適于經(jīng)口施用的本發(fā)明的藥物組合物可以以分散的劑型給出，包括，但不限于，片劑(例如，可咀嚼的片劑)、囊片、膠囊劑和液體(例如，增味糖漿劑)。這些劑型含有預(yù)定量的活性成分，并且可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的藥學(xué)方法制備。一般見(jiàn)，Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing，EastonPA(1990)。
根據(jù)常規(guī)藥物復(fù)合技術(shù)，通過(guò)將充分混合的混合物中的一種或幾種活性成分與至少一種賦形劑組合制備本發(fā)明的典型口服劑型。根據(jù)施用所希望的制劑形式，賦形劑可以采取各種形式。適于用于口服液體或氣溶膠劑型的賦形劑包括但不限于，水、乙二醇、油、醇、增味劑、防腐劑和著色劑。適于用于固體口服劑型(例如，粉劑、片劑、膠囊劑和囊片)中的賦形劑的實(shí)例包括，但不限于，淀粉、糖、微晶纖維素、稀釋劑、?；瘎?、潤(rùn)滑劑、結(jié)合劑，和崩解劑。
片劑和膠囊因?yàn)橐子谑┯?，所以代表最有利的口服劑量單位形式，在這種情況中使用固體賦形劑。如果希望，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)水性或非水性技術(shù)可以將片劑包衣。這種劑型可以通過(guò)任何藥學(xué)方法制備。通常，通過(guò)均一并充分混合活性成分與液態(tài)載體、細(xì)分的固態(tài)載體，或者兩者，然后如果需要使產(chǎn)物形成所希望的外觀，制備藥物組合物和劑型。
例如，通過(guò)壓縮和成型可以制備片劑。通過(guò)在適宜的機(jī)器中壓縮任選與賦形劑混合的自由流動(dòng)形式的活性成分如粉劑或粒劑，可以制備壓縮片劑。通過(guò)在適宜的機(jī)器中將用惰性液態(tài)稀釋劑濕潤(rùn)的粉狀化合物的混合物成型可以制備成型片劑。
可用于本發(fā)明的口服劑型的賦形劑的實(shí)例包括，但不限于，結(jié)合劑、填充劑、崩解劑，和潤(rùn)滑劑。適宜用于藥物組合物和劑型的結(jié)合劑包括，但不限于，玉米淀粉、馬鈴薯淀粉，或其他淀粉、明膠、天然的和合成的樹(shù)膠，如阿拉伯樹(shù)膠、藻酸鈉、藻酸，和其他藻酸鹽、粉狀西黃蓍膠、瓜爾樹(shù)膠、纖維素及其衍生物(例如，乙基纖維素、乙酸纖維素、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、預(yù)明膠化淀粉、羥丙甲基纖維素、(例如，Nos.2208、2906、2910)、微晶纖維素，和它們的混合物。
適宜用于此處公開(kāi)的藥物組合物和劑型的填充劑的實(shí)例包括，但不限于，滑石、碳酸鈣(例如，粒劑或粉劑)、微晶纖維素、粉狀纖維素、dextrates、高嶺土、甘露醇、硅酸、山梨糖醇、淀粉、預(yù)明膠化淀粉，和它們的混合物。本發(fā)明的藥物組合物中的結(jié)合劑和填充劑典型地以藥物組合物或劑型的約50到約99重量百分比存在。
微晶纖維素的適宜形式包括，但不限于，以AVICEL-PH-101、AVICEL-PH-103、AVICEL RC-581、AVICEL-PH-105(可從FMCCorporation，American Viscose Division，Avicel Sales，MarcusHook，PA得到)出售的物質(zhì)，和它們的混合物。特定結(jié)合劑是以AVICELRC-581出售的微晶纖維素和羧甲基纖維素的混合物。適宜的無(wú)水或低水分賦形劑或添加劑包括AVICELPH-103TM和淀粉1500LM。
崩解劑用于本發(fā)明的組合物中以提供當(dāng)暴露于水性環(huán)境時(shí)崩解的片劑。含有太多崩解劑的片劑可以在保存中崩解，而含有太少崩解劑的那些片劑可能不會(huì)以所希望的速度或者在所希望的條件下崩解。這樣，為了形成本發(fā)明的固態(tài)口服劑型，使用的崩解劑的足夠量應(yīng)該既不太多又不太少，從而不會(huì)有害地改變活性成分的釋放。所用的崩解劑的量基于制劑的類(lèi)型而變，并且可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地辨別。典型的藥物組合物含有約0.5到約15重量百分比的崩解劑，特別從約1到約5重量百分比的崩解劑。
可用于本發(fā)明的藥物組合物和劑型的崩解劑包括，但不限于，瓊脂-瓊脂、褐藻酸、碳酸鈣、微晶纖維素、croscarmellose鈉、crospovidone、polacrilin鉀、淀粉glycolate鈉、馬鈴薯或木薯淀粉、預(yù)-明膠化淀粉、其他淀粉、粘土、其他藻膠、其他纖維素、樹(shù)膠，和它們的混合物。
可以用于本發(fā)明的藥物組合物和劑型中的潤(rùn)滑劑包括，但不限于，硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、礦物油、輕礦物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、其他乙二醇、硬脂酸、十二烷基硫酸鈉、滑石、氫化植物油(例如，花生油、棉籽油、向日葵油、芝麻油、橄欖油、玉米油，和大豆油)、硬脂酸鋅、油酸乙酯、月桂酸乙酯、瓊脂，和它們的混合物。其他的潤(rùn)滑劑包括，例如，syloid硅膠(AEROSIL 200，W.Ri GraceCo.，Baltimore，MD生產(chǎn))、合成二氧化硅的凝結(jié)氣溶膠(Degussa Co.of Plano，TX上市)、CAB-O-SIL(Cabot Co.of Boston，MA出售的致熱二氧化硅產(chǎn)品)，和它們的混合物。如果使用，通常潤(rùn)滑劑所使用的量為它們所摻入的藥物組合物或劑型的小于約1的重量百分比。
5.4.2緩釋劑型通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的控釋方法或者遞送設(shè)備施用本發(fā)明的活性成分。實(shí)施例包括，但不限于，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123、和4,008,719、5,674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556和5,733,566中描述的那些，這些專(zhuān)利的每一篇都在此處被并入作為參考。這些劑型可用于提供一種或多種活性成分的緩釋或控釋?zhuān)褂?，例如，氫丙甲基纖維素、其他聚合物基質(zhì)、凝膠、可滲透的膜、滲透系統(tǒng)、多層包衣、微粒、脂質(zhì)體、微球，或者它們組合以提供各種比例的所希望的釋放模式?？扇菀走x擇本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的適宜的控釋制劑(包括此處描述的那些控釋制劑)與本發(fā)明的活性成分使用。從而，本發(fā)明包括適于口服施用的單個(gè)單位劑型，包括，但不限于，適于控釋的片劑、膠囊劑、gelcap和囊片劑。
所有控釋藥物產(chǎn)品的共同目標(biāo)是改善它們的非控釋對(duì)應(yīng)產(chǎn)品所實(shí)現(xiàn)的藥物治療。理想地，醫(yī)學(xué)治療中最佳設(shè)計(jì)的控釋制劑的使用的特征是在最短的時(shí)間內(nèi)最少的藥物被用于治療或控制狀況。控釋制劑的優(yōu)點(diǎn)包括藥物的長(zhǎng)期活性、減小的劑量頻率，和增加的患者依從性。此外，控釋制劑可用于影響作用開(kāi)始的時(shí)間和其他特征，如藥物的血液水平，并從而可影響副(例如，不利的)作用的發(fā)生。
多數(shù)控釋制劑被設(shè)計(jì)成最初釋放快速產(chǎn)生所希望的療效的一定量藥物(活性成分)，并緩慢并持續(xù)地釋放其他量的藥物以長(zhǎng)期保持該治療或預(yù)防效果的水平。為了保持身體中藥物的該恒定水平，藥物必須以一定速度從劑型釋放，所釋放的藥物將代替被代謝和從身體排泄的藥物的量?；钚猿煞值目蒯尶梢员桓鞣N條件刺激，這些條件包括，但不限于，pH、溫度、酶、水或其他生理?xiàng)l件或化合物。
5.4.3腸胃外劑型可通過(guò)各種途徑施用于患者的腸胃外劑型包括，但不限于，皮下、靜脈內(nèi)(包括，彈丸注射)、肌內(nèi)，和動(dòng)脈內(nèi)。因?yàn)樗鼈兊氖褂猛ǔ＠@過(guò)了患者的抗污染物的天然防御，腸胃外劑型優(yōu)選是無(wú)菌的或者能夠在施用于患者前滅菌。腸胃外劑型的實(shí)例包括，但不限于，易于注射的溶液、容易溶解或懸浮在藥學(xué)上可接受的注射賦形劑中的干燥的和/或凍干的產(chǎn)品(可重構(gòu)的粉劑)、易于注射的懸浮劑，和乳劑。
可用于提供本發(fā)明的腸胃外劑型的適宜的媒介物(Vehicle)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。實(shí)例包括，但不限于注射用水USP、水性媒介物(Vehicle)如，但不限于，氯化鈉注射劑、Ringer’s注射劑、右旋糖注射劑、和右旋糖和氯化鈉注射劑，和乳酸鹽Ringer’s注射劑；水混溶的媒介物(Vehicle)如，但不限于，乙醇、聚乙二醇，和聚丙二醇；和非水性媒介物(Vehicle)如，但不限于，玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯，和苯甲酸苯甲酯。
增加此處公開(kāi)的一種或多種活性成分的溶解性的化合物也可以并入本發(fā)明的腸胃外劑型中。
5.4.4透皮劑型透皮劑型包括“儲(chǔ)存型”或“基質(zhì)型”貼劑，其可應(yīng)用于皮膚并攜帶特定時(shí)間段以允許所希望量的活性成分滲透。
可用于提供本發(fā)明包括的透皮和局部劑型的適宜的賦形劑(例如，載體和稀釋劑)和其他材料是藥學(xué)領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知的，并且依賴(lài)于給定藥物組合物或劑型將應(yīng)用的特定組織?？紤]這一事實(shí)，典型的賦形劑包括，但不限于，水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、丁-1，3-二醇、肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、礦物油，和它們的混合物。
根據(jù)所要治療的特定組織，在用本發(fā)明的活性成分治療之前，同時(shí)，或者之后使用額外的組分。例如，可以使用滲透增強(qiáng)劑輔助遞送活性成分到達(dá)組織。適宜的滲透增強(qiáng)劑包括，但不限于丙酮；各種醇如乙醇、油烯基和四氫呋喃基；烷基亞砜如二甲亞砜、二甲乙酰胺、二甲基甲酰胺、聚乙二醇、吡咯烷酮如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮級(jí)(聚烯吡酮，Polyvidone)、尿素、和各種水可溶的或不可溶的糖酯如吐溫80(聚山梨醇酯80)和Span 60(單硬脂酸山梨聚糖)。
也可以調(diào)節(jié)藥物組合物或劑型，或者藥物組合物或劑型所要應(yīng)用的組織的pH以改善一種或多種活性成分的遞送。類(lèi)似地，可以調(diào)節(jié)溶劑載體、其離子強(qiáng)度或張力以改善遞送?；衔锶缬仓猁}可以加到藥物組合物或劑型中以有利地改變一種或多種活性成分的親水性或親脂性從而改善遞送。關(guān)于這一點(diǎn)，硬脂酸鹽可作為制劑的脂類(lèi)媒介物，作為乳化劑或表面活性劑，和作為遞送增強(qiáng)或滲透增強(qiáng)劑?；钚猿煞值牟煌}、水合物或溶劑化物可用于進(jìn)一步調(diào)節(jié)所得組合物的性質(zhì)。
5.4.5局部劑型本發(fā)明的局部劑型包括，但不限于，霜?jiǎng)?、洗劑、軟膏劑、凝膠劑、溶液劑、乳劑、懸浮劑，或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他形式。見(jiàn)，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，MackPublishing，Easton PA(1990)；和Introduction toPharmaceutical Dosage Form，第4版，Lea &Febiger，Philadelphia(1985)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的硫酸化多糖局部施用時(shí)具有大于約500,000的分子量。
可用于提供本發(fā)明包括的透皮和局部劑型的適宜賦形劑(例如，載體和稀釋劑)和其他物質(zhì)是藥學(xué)領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知的，并且依賴(lài)于給定藥物組合物或劑型將要應(yīng)用的特定組織?？紤]到這一事實(shí)，典型的賦形劑包括，但不限于，水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、丁-1，3-二醇、肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、礦物油，和它們的混合物。
依賴(lài)于所要治療的特定組織，在用本發(fā)明的活性成分治療之前、共同，或隨后只用額外的組分。例如，可以使用滲透增強(qiáng)劑輔助遞送活性成分到達(dá)組織。適宜的滲透增強(qiáng)劑包括，但不限于丙酮；各種醇如乙醇、油烯基和四氫呋喃基；烷基亞砜如二甲亞砜、二甲乙酰胺、二甲基甲酰胺、乙二醇、吡咯烷酮如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮級(jí)(聚烯吡酮，Polyvidone)、尿素、和各種水可溶的或不可溶的糖酯如吐溫80(聚山梨醇酯80)和Span 60(單硬脂酸山梨聚糖)。
5.4.6粘膜劑型本發(fā)明的粘膜劑型包括，但不限于，眼科溶液、噴霧劑和氣溶膠，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他形式。見(jiàn)，例如，例如，Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing，EastonPA(1990)；和Introduction to Pharmaceutical Dosage Form，第4版，Lea &Febiger，Philadelphia(1985)。適于治療口腔中粘膜組織的劑型可以制備成漱口水或口凝膠。在一個(gè)實(shí)施方案中，氣溶膠含有載體。在另一實(shí)施方案中，氣溶膠不含載體。
本發(fā)明的硫酸化多糖可以通過(guò)吸入直接施用于肺。為了通過(guò)吸入施用，通過(guò)許多不同設(shè)備可以將適宜多糖方便地遞送到肺。例如，帶刻度的劑量吸入器(“MDT”)，其利用了含有適宜的低沸點(diǎn)推進(jìn)劑的罐，這些低沸點(diǎn)推進(jìn)劑為例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或可用于將硫酸化多糖直接遞送到肺的其他適宜的氣體。MDI設(shè)備可從許多供應(yīng)商，如3M公司、Aventis、BoehringerIngleheim、Forest Laboratories、Glaxo-Wellcome、ScheringPlough和Vectura得到。
備選地，干粉吸入器(DPI)設(shè)備可用于將硫酸化多糖遞送到肺(見(jiàn)，例如，Raleigh等人，Proc.Amer.Assoc.Cancer ResearchAnnual Meeting，1999，40，397，其在此處被并入作為參考)。DPI設(shè)備通常施用如噴氣的機(jī)理在容器中產(chǎn)生一片干粉，其然后可被患者吸入。DPI設(shè)備是本領(lǐng)域中熟知的并且可從許多賣(mài)主購(gòu)買(mǎi)，這些賣(mài)主包括，例如，F(xiàn)isons、Glaxo-Wellcome、Inhale Therapeutic Systems、ML Laboratories、Qdose和Vectura。一種普遍的變通方案是多劑量DPI(“MDDPT”)系統(tǒng)，其允許遞送一個(gè)以上的治療劑量。MDDPI設(shè)備可從如AstraZeneca、Glaxo Wellcome、IVAX、Schering Plough、SkyePharma和Vectura的公司購(gòu)買(mǎi)。例如，所制備的用于吸入器或吹入器中的膠囊和明膠藥筒可以含有化合物和適宜的粉劑基質(zhì)如用于這些系統(tǒng)的乳糖或淀粉的粉劑混合物。
可用于將硫酸化多糖遞送到肺的另一種類(lèi)型的設(shè)備是例如，Aradigm Corporation提供的液體噴霧設(shè)備。液體噴霧系統(tǒng)使用極小的噴嘴孔以霧化液體藥物制劑，其可被直接吸入肺中。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用霧化器設(shè)備將硫酸化多糖遞送到肺中。霧化器通過(guò)使用例如，超聲能量從液體藥物制劑產(chǎn)生氣溶膠以形成容易吸入的細(xì)顆粒(見(jiàn)，例如Verschoyle等人，British J.Cancer，1999，80，Suppl 2，96，其在此處被并入作為參考)。霧化器的實(shí)例包括Sheffield/Systemic Pulmonary Delivery Ltd(見(jiàn)，Armer等人，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,954,047；van der Linden等人，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,950,619；van der Linden等人，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,970,974，它們?cè)诖颂幈徊⑷胱鳛閰⒖?、Aventis和Batelle PulmonaryTherapeutics提供的設(shè)備。
在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，電氫動(dòng)力(“EHD”)氣溶膠設(shè)備被用于將硫酸化多糖遞送到肺。EHD氣溶膠設(shè)備使用電能量以氣溶膠化液體藥物溶液或懸浮液(見(jiàn)，例如，Noakes等人，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,765,539；Coffee，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)，4,962,885；Coffee，PCT申請(qǐng)，WO94/12285；Coffee，PCT申請(qǐng)，WO94/14543；Coffee，PCT申請(qǐng)，WO95/26234，Coffee，PCT申請(qǐng)，WO95/26235，Coffee，PCT申請(qǐng)WO95/32807，它們?cè)诖颂幈徊⑷胱鳛閰⒖?。當(dāng)用EHD氣溶膠設(shè)備遞送硫酸化多糖制劑到肺中并且本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)地進(jìn)行這種優(yōu)化時(shí)，硫酸化多糖制劑的電化學(xué)性質(zhì)可以是重要的優(yōu)化參數(shù)。EHD氣溶膠設(shè)備可以比現(xiàn)有的肺遞送技術(shù)更有效地將藥物遞送到肺。硫酸化多糖的肺內(nèi)遞送的其他方法將是技術(shù)人員公知的并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
適于用霧化器和液體噴霧設(shè)備和EHD氣溶膠設(shè)備使用的液體藥物制劑將通常包括硫酸化多糖與藥學(xué)上可接受的載體。優(yōu)選地，藥學(xué)上可接受的載體為液體如醇、水、聚乙二醇或者全氟碳。任選地，可加入另一種物質(zhì)以改變硫酸化多糖的溶液或懸浮液的氣溶膠性質(zhì)。優(yōu)選地，該物質(zhì)為液體如醇、乙二醇、聚乙二醇或脂肪酸。制備適宜用于氣溶膠設(shè)備的液體藥物溶液或懸浮液的其他方法是本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的(見(jiàn)，例如，Biesalski，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,112,598；Biesalski，5,556,611，它們?cè)诖颂幈徊⑷胱鳛閰⒖?。硫酸化多糖也可以制備成直腸或陰道組合物如栓劑或保留灌腸劑，其例如，含有常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可油或其他甘油酯。
除了以前描述的制劑，還可以將硫酸化多糖制備成儲(chǔ)存制劑。這種長(zhǎng)效制劑可以通過(guò)植入(例如，皮下或肌內(nèi))或通過(guò)肌內(nèi)注射施用。從而，例如，這些化合物可以與適宜的聚合性或疏水材料(例如，作為可接受的油中的乳劑)或者離子交換樹(shù)脂配制，或者作為難溶性衍生物，例如，作為難溶性鹽。
備選地，可以使用其他藥物遞送系統(tǒng)。脂質(zhì)體和乳劑是可用于遞送硫酸化多糖的遞送媒介物的熟知的實(shí)例?？梢允褂媚承┯袡C(jī)溶劑如二甲亞砜，盡管通常產(chǎn)生更大毒性。也可以在控釋系統(tǒng)中遞送硫酸化多糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用泵(Sefton，CRC Crit.Ref BiomedEng.，1987，14，201；Buchwald等人，Surgery，1980，88，507；Saudek等人，N.Engl.J.Med.，1989，321，574)。在另一實(shí)施方案中，可以使用聚合材料(見(jiàn)“控釋的醫(yī)學(xué)應(yīng)用”，Langer和Wise(編者)，CRC Pres.，Boca Raton，F(xiàn)la.(1974)；“控釋藥物生物利用度、藥品設(shè)計(jì)和性能”，Smolen和Ball(eds.)，Wiley，紐約(1984)；Ranger和Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.，1983，23，61；還見(jiàn)Levy等人.，Science，1985，228，190；During等人，Ann.Neurol.，1989，25，351；Howard等人，1989，J.Neurosury.71，105)。在另一實(shí)施方案中，控釋系統(tǒng)可以置于本發(fā)明的化合物靶標(biāo)附近，例如，肺，從而僅僅需要全身性劑量的一小部分(見(jiàn)，例如，Goodson，Medical Applications of ControlledRelease，如前，卷2，115頁(yè)(1984))?？梢允褂闷渌蒯屜到y(tǒng)(見(jiàn)，例如，Langer，Science，1990，249，1527)。
可用于提供本發(fā)明的粘膜劑型的適宜的賦形劑(例如，載體和稀釋劑)和其他物質(zhì)是藥學(xué)領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知的，并且依賴(lài)于給定的藥物組合物或劑型將施用的特定部位或方法?？紤]到之一事實(shí)，典型的賦形劑包括，但不限于，水、乙醇、乙二醇、丙二醇、丁-1，3-二醇、肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、礦物油，和它們的混合物，它們是無(wú)毒并且藥學(xué)上可接受的。這種額外成分的實(shí)例是本領(lǐng)域中熟知的。見(jiàn)，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，MackPublishing，Easton PA(1990)。
也可以調(diào)節(jié)藥物組合物或劑型，或者藥物組合物或劑型所要應(yīng)用的組織的pH以改善一種或多種活性成分的遞送。類(lèi)似地，可以調(diào)節(jié)溶劑載體、其離子強(qiáng)度或張力以改善遞送。化合物如硬脂酸鹽可以加到藥物組合物或劑型中以有利地改變一種或多種活性成分的親水性或親脂性從而改善遞送。關(guān)于這一點(diǎn)，硬脂酸鹽可作為制劑的脂類(lèi)媒介物，作為乳化劑或表面活性劑，和作為遞送增強(qiáng)或滲透增強(qiáng)劑?；钚猿煞值牟煌}、水合物或溶劑化物可用于進(jìn)一步調(diào)節(jié)所得組合物的性質(zhì)。
5.4.7避孕套和預(yù)防性裝置在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的硫酸化多糖可用作避孕套或其他預(yù)防裝置的涂層。類(lèi)似地，硫酸化多糖可用作手術(shù)器械和保護(hù)性裝置的涂層，這些手術(shù)器械和保護(hù)性裝置包括，但不限于，橡膠手套、手術(shù)口罩、CPR助聽(tīng)器、舌壓板、繃帶、紗布、餐巾、牙科設(shè)備和體溫計(jì)探頭蓋。當(dāng)本發(fā)明的硫酸化多糖被用作如此處描述的涂層時(shí)，其優(yōu)選具有高于500,000的分子量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的硫酸化多糖與用于手術(shù)手套的滑石潤(rùn)滑粉劑組合。使用本發(fā)明的硫酸化多糖作為涂層的方法將是技術(shù)人員熟知的。類(lèi)似的方法可以在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,869,270中發(fā)現(xiàn)，該專(zhuān)利在這里被并入作為參考。
5.4.8消毒劑和洗滌劑在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的硫酸化多糖可用于醫(yī)院、實(shí)驗(yàn)室、廁所、禮堂、體育場(chǎng)、會(huì)議中心、餐館、健康中心、地鐵終點(diǎn)站、公共汽車(chē)總站、機(jī)場(chǎng)、郵局、辦公室、污水處理設(shè)施、下水道、水處理設(shè)施、泵站、汽車(chē)、飛機(jī)、火車(chē)、家庭、柜和家具中無(wú)生命物體的消毒以防止病毒或疾病的擴(kuò)散。
消毒組合物含有本發(fā)明的一種或多種硫酸化多糖，其為粉劑、糊劑、濃縮物、溶液劑、噴霧劑、皂、泡沫液、凝膠劑、洗劑、霜?jiǎng)?、洗手劑、漱口水、預(yù)處理的毛巾、預(yù)處理的小毛巾、預(yù)處理的棉簽或者預(yù)處理的襯墊的形式。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的硫酸化多糖可用于消毒生物液體，包括，但不限于，血液、血漿、卵、精液或精子。本發(fā)明的硫酸化多糖可直接加到生物液體中或者偶聯(lián)到固體支持物，其包括，但不限于塑料珠、玻璃珠或者置于與生物液體接觸的濾器。
5.4.9營(yíng)養(yǎng)品和飲食補(bǔ)充品該硫酸多糖可被摻入到包括，但不限于，食品組合物、非處方藥、和飲食補(bǔ)充劑的營(yíng)養(yǎng)品中。硫酸化多糖可加到各種食物中以被同時(shí)消費(fèi)。作為食物添加劑，本發(fā)明的硫酸化多糖可以以與常規(guī)食品添加劑相同的方式使用，從而，僅僅需要與其他組分混合以增強(qiáng)味道。味道增強(qiáng)包括，但不限于，對(duì)食物內(nèi)在味道賦予提神、活力、清潔、精細(xì)或令人振奮的味道。
將認(rèn)識(shí)到飲食補(bǔ)充劑可以不使用與藥物組合物相同的配方成分或者相同的無(wú)菌和其他FDA要求。飲食補(bǔ)充物可以為液體形式，例如，溶液劑、糖漿劑或懸浮劑，或者可以是用于使用前與水或任何其他適宜的液體重構(gòu)的產(chǎn)品。通過(guò)常規(guī)方式如茶、健康飲料、dietary shake、液體濃縮物或者液體可溶的片劑、膠囊劑、丸劑，或者粉劑制備這種液體制劑從而通過(guò)將液體可溶的片劑、膠囊、丸劑、或粉劑溶解在液體中制備飲料并消費(fèi)所得飲料。備選地，飲食補(bǔ)充物可以采取通過(guò)常規(guī)方法制備的片劑或膠囊劑并且任選包括其他飲食補(bǔ)充物，其包括維生素、礦物質(zhì)、其他草藥補(bǔ)充物、結(jié)合劑、填充劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑，或者濕潤(rùn)劑，如上面公開(kāi)的那些。通過(guò)本領(lǐng)域中熟知的方法可以包衣片劑。在優(yōu)選實(shí)施方案中，飲食補(bǔ)充物可以采取可以溶解在經(jīng)口消費(fèi)的液體中的膠囊劑或粉劑。
飲料或者摻入到食品中的硫酸化多糖的量將依賴(lài)于飲料、食品的種類(lèi)和所希望的效果。通常，一份飲料(食物)含有食品組合物的約0.1％到約50％，優(yōu)選約0.5％到約20％的量。更優(yōu)選地，食品含有硫酸化多糖的量為按重量計(jì)食品組合物的約1％到約10％。
食物的實(shí)例包括，但不限于，甜食如糖果(冰糖、果凍、果醬等)、樹(shù)膠、豆醬、烘焙甜食或成型甜食(小甜餅、餅干，等)、蒸煮的甜食、可可或可可產(chǎn)品(巧克力和可可粉)、冰凍的甜食(冰淇淋、冰，等)、飲料(果汁、軟飲、碳酸飲料)、健康飲料、健康棒，和茶(綠茶、紅茶，等)。
5.5測(cè)定法和動(dòng)物模型通過(guò)本領(lǐng)域中公知的各種方法可以體外或體內(nèi)檢測(cè)本發(fā)明的硫酸化多糖、組合物和劑型以試驗(yàn)抗微生物活性。見(jiàn)，例如，下面討論并且在所有實(shí)施例中使用的方法。
為了確定本發(fā)明的混合物的抗微生物活性的程度，根據(jù)本發(fā)明可以使用許多測(cè)定法，如細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物模型，和施用于人受試者。此處描述的測(cè)定法可用于測(cè)定隨著時(shí)間微生物的生長(zhǎng)，以確定存在本發(fā)明化合物時(shí)微生物的生長(zhǎng)特征。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的微生物和化合物被加到允許細(xì)胞系(例如，原代細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、患者組織樣品，等)或者生長(zhǎng)培養(yǎng)基(例如，LB肉湯/瓊脂、YT肉湯/瓊脂，血瓊脂，等)。微生物的生長(zhǎng)/感染可以與不存在本發(fā)明化合物時(shí)微生物的生長(zhǎng)/感染相比較。通過(guò)存在本發(fā)明化合物時(shí)微生物生長(zhǎng)/感染的降低來(lái)證明本發(fā)明化合物的抗微生物活性。本領(lǐng)域的任一方法都可用于確定生長(zhǎng)/感染，包括，但不限于，免疫熒光染色、免疫印跡或微生物特異核酸的檢測(cè)(例如，通過(guò)原位雜交，或者細(xì)胞裂解后通過(guò)DNA印跡或RT-PCR分析)、生長(zhǎng)/感染的致細(xì)胞病變效應(yīng)的視覺(jué)/顯微鏡檢測(cè)(例如，病毒細(xì)胞變圓、細(xì)胞脫落、細(xì)胞裂解、多核體的形成)、微生物效價(jià)(例如，噬菌斑形成單位、菌落形成單位，等)、噬菌斑/菌落的數(shù)目。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的微生物和化合物被同時(shí)加到細(xì)胞或生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在另一特定實(shí)施方案中，微生物被在本發(fā)明的化合物之前加到細(xì)胞或生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在另一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物被在微生物之前加到細(xì)胞或生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的微生物和化合物被施用于易受該微生物感染的動(dòng)物受試者。感染的發(fā)病率、嚴(yán)重性、時(shí)間長(zhǎng)短、微生物負(fù)荷、和死亡率等可以與當(dāng)受試者僅施用該微生物時(shí)(無(wú)本發(fā)明的化合物)所觀察到的感染的發(fā)病率、嚴(yán)重性、時(shí)間長(zhǎng)短、微生物負(fù)荷、和死亡率等比較。通過(guò)存在本發(fā)明化合物時(shí)感染的發(fā)病率、嚴(yán)重性、時(shí)間長(zhǎng)短、微生物負(fù)荷、和死亡率等的降低來(lái)證明本發(fā)明化合物的抗微生物活性。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的微生物和化合物被同時(shí)施用于動(dòng)物受試者。在另一特定實(shí)施方案中，該微生物在本發(fā)明的化合物之前被施用于動(dòng)物受試者。在另一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物在該微生物之前施用于動(dòng)物受試者。
在另一實(shí)施方案中，通過(guò)存在或不存在本發(fā)明的化合物下感染后的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)處采集細(xì)胞培養(yǎng)基或者從人或動(dòng)物受試者采集生物液體/臨床樣品(例如，鼻吸出物、咽棉拭、痰、支氣管-肺泡灌洗、尿、唾液、血，或血清)可以檢驗(yàn)微生物的生長(zhǎng)速度。在特定實(shí)施方案中，通過(guò)施用本領(lǐng)域中熟知的一種方法評(píng)估生長(zhǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)物、生長(zhǎng)在容許生長(zhǎng)培養(yǎng)基、或生長(zhǎng)在受試者中后樣品中微生物的存在來(lái)測(cè)定微生物的生長(zhǎng)速度，該熟知的方法包括，但不限于，免疫測(cè)定法(例如，ELISA；關(guān)于ELISA的討論見(jiàn)，例如，Ausubel等人，編者，1994，CurrentProtocol in Molecular Biology，卷1，John Wiley & Sons，Inc.，紐約11.2.1)、免疫熒光染色，或者免疫印跡分析，其使用免疫特異識(shí)別所要測(cè)定的微生物的抗體或者檢測(cè)微生物特異性核酸(例如，通過(guò)DNA印跡或者RT-PCR分析，等)。
在其他特定實(shí)施方案中，微生物的生長(zhǎng)速度在受試者中生長(zhǎng)后測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，微生物為病毒。體內(nèi)抗病毒活性的標(biāo)準(zhǔn)模型包括，但不限于，primo-感染獼猴模型(Le Grand等人，Symp.NonhumPrimate Models AIDS.1993年9月19-22，11)；和《感染動(dòng)物模型手冊(cè)》(Zak和Sande編者，Academic Press；第一版(1999)，包括，但不限于巨細(xì)胞病毒感染豚鼠模型、巨細(xì)胞病毒感染大鼠CMV模型、人巨細(xì)胞病毒感染SCID-hu(thy/liv)小鼠模型、眼巨細(xì)胞病毒感染SCID-hu小鼠模型、猿水痘模型、T細(xì)胞和皮膚的水痘帶狀皰疹感染的SCID-hu小鼠模型、流感病毒感染的小鼠模型、流感病毒感染的白鼬模型、呼吸道合胞病毒的棉鼠模型、HBV感染的轉(zhuǎn)基因小鼠模型、乙型肝炎感染的鴨模型、乙型肝炎病毒感染的美洲旱獺模型、輪狀病毒的成年小鼠模型、SIV感染的獼猴模型、HIV感染的SCID-huthy-liv小鼠模型、HIV-1感染的黑猩猩模型。
在特定實(shí)施方案中，通過(guò)從受感染的細(xì)胞或受感染的受試者得到細(xì)胞培養(yǎng)基或生物液體/臨床樣品，制備樣品的連續(xù)稀釋液并感染易受該病毒感染的細(xì)胞單層(原代細(xì)胞、轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系、患者組織樣品，等)，該病毒稀釋液使得可以出現(xiàn)單個(gè)噬菌斑。然后計(jì)數(shù)噬菌斑并將病毒效價(jià)表達(dá)為每毫升樣品噬菌斑形成單位。
在另一實(shí)施方案中，微生物為寄生蟲(chóng)。體內(nèi)抗寄生蟲(chóng)活性的標(biāo)準(zhǔn)模型包括，但不限于，《感染動(dòng)物模型手冊(cè)》(Zak和Sande編者，Academic Press；第一版(1999)中描述的那些模型，包括但不限于，陰道滴蟲(chóng)(Trichomonas vaginalis)感染的陰道內(nèi)小鼠模型。
在另一實(shí)施方案中，微生物是真菌。體內(nèi)抗真菌活性的標(biāo)準(zhǔn)模型包括，但不限于，《感染動(dòng)物模型手冊(cè)》(Zak和Sande編者，AcademicPress；第一版(1999)中描述的那些模型，包括但不限于，膿毒癥念珠菌的嚙齒動(dòng)物模型、大鼠的全身性白色念珠菌(candida albicans)感染模型、小鼠中口咽和胃腸道念珠菌感染模型、局部念珠菌病的手爪水腫模型、過(guò)敏性支氣管肺曲霉病的鼠模型、小鼠中肺隱球菌感染模型、大鼠中新型隱球菌感染模型、侵入性肺曲霉病大鼠模型、角膜真菌病念株菌的兔模型、隱球菌腦膜炎的兔模型、白色念珠菌導(dǎo)致的上行性腎盂腎炎的大鼠模型、念珠菌陰道感染的大鼠模型，和念珠菌陰道感染的鼠模型。
在另一實(shí)施方案中，微生物是細(xì)菌。體內(nèi)抗細(xì)菌活性的標(biāo)準(zhǔn)模型包括，但不限于，《感染動(dòng)物模型手冊(cè)》(Zak和Sande編者，AcademicPress；第一版(1999)中描述的那些模型，包括但不限于，小鼠腹膜炎/敗血癥模型、鼠大腿感染模型、小鼠皮下棉線模型、小鼠腹膜炎模型、涉及外來(lái)體的腹膜炎鼠模型、大鼠多微生物腹膜炎感染模型、空腸彎曲桿菌(campylobacter jejun)感染的小鼠模型、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌感染的乳鼠模型、志賀氏菌病的兔模型、腸霍亂弧菌感染的RITARD兔模型、幽門(mén)螺旋桿菌感染的小鼠模型、螺旋桿菌的白鼬模型、梅毒的倉(cāng)鼠模型、獲得性和先天性梅毒的豚鼠模型、軍團(tuán)病的豚鼠模型、肺結(jié)核的鼠模型、發(fā)散性mycobacterium avuim復(fù)合體感染的淺棕色小鼠模型、犰狳麻風(fēng)病模型、麻風(fēng)病小鼠模型、萊姆關(guān)節(jié)炎的倉(cāng)鼠模型、細(xì)菌性結(jié)膜炎的兔模型、細(xì)菌性角膜炎的鼠模型、細(xì)菌性角膜炎的兔間質(zhì)注射模型、急性中耳炎的栗鼠模型、急性中耳炎的豚鼠模型、細(xì)菌性附睪炎的大鼠模型、支原體生殖器感染的小鼠模型、上行性尿道感染的小鼠模型、涉及短期和長(zhǎng)期內(nèi)置導(dǎo)管的上行性UTI的小鼠模型、亞臨床腎盂腎炎的大鼠模型、慢性膀胱炎的大鼠模型、小鼠肺炎球菌性肺炎模型、支原體肺部感染的倉(cāng)鼠模型、脛骨細(xì)菌性骨髓炎的大鼠模型、造血骨髓炎的大鼠模型、脛骨細(xì)菌性骨髓炎的兔模型、關(guān)節(jié)成型術(shù)的大鼠模型、關(guān)節(jié)成型術(shù)的兔模型、streptococcalfasciitis的小鼠模型、細(xì)菌性心內(nèi)膜炎的兔模型、腦膜炎的成年大鼠模型、細(xì)菌性腦膜炎的兔模型。
在一個(gè)特定實(shí)施方案中，通過(guò)抗受試者中微生物的抗體的效價(jià)估計(jì)受試者中微生物的生長(zhǎng)速度。通過(guò)本領(lǐng)域中熟知的一種方法可以確定抗體血清效價(jià)，例如，但不限于，通過(guò)例如，ELISA可以定量血清樣品中抗體或抗體片段的量。此外，通過(guò)將化合物直接施用于受試動(dòng)物，收集生物液體(例如，鼻吸出物、咽棉拭、痰、支氣管-肺泡灌洗液、尿、唾液、血，或血清)并試驗(yàn)該液體的抗微生物活性，可以確定硫酸化多糖的體內(nèi)活性。
在用于測(cè)定微生物水平的樣品是生物液體/臨床樣品(例如，鼻吸出物、咽棉拭、痰、支氣管-肺泡灌洗、尿、唾液、血，或血清)的實(shí)施方案中，樣品可以含有或者不含有完整細(xì)胞。來(lái)自含有完整細(xì)胞的受試者的樣品可被直接處理，而無(wú)完整細(xì)胞的分離物可以或不可以在容許細(xì)胞系(例如，原代細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、患者組織樣品，等)或生長(zhǎng)培養(yǎng)基(例如，LB肉湯/瓊脂、YT肉湯/瓊脂，血瓊脂，等)上首先培養(yǎng)。細(xì)胞懸浮物可以例如，300×g室溫下離心5分鐘，然后在相同條件下用pH7.4的PBS(無(wú)Ca++和Mg++)洗滌。可將細(xì)胞沉淀重懸在小體積PBS中待分析。含有完整細(xì)胞的原代臨床分離物可以與PBS混合并在室溫下以300×g離心5分鐘。以無(wú)菌吸量管頭從界面除去粘液并可以在相同條件下再用PBS洗滌細(xì)胞沉淀一次。沉淀可以重懸在小體積PBS中待分析。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物被施用于感染微生物的人受試者。感染的發(fā)病率、嚴(yán)重性、時(shí)間長(zhǎng)短、病毒負(fù)荷、和死亡率等可以與不存在本發(fā)明化合物或存在安慰劑時(shí)用微生物感染的受試者中所觀察到的感染的發(fā)病率、嚴(yán)重性、時(shí)間長(zhǎng)短、病毒負(fù)荷、和死亡率等比較。通過(guò)存在本發(fā)明化合物時(shí)感染的發(fā)病率、嚴(yán)重性、時(shí)間長(zhǎng)短、病毒負(fù)荷、和死亡率等的降低來(lái)證明本發(fā)明化合物的抗微生物活性?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中公知的一種方法，如前面描述的那些方法，確定受試者中抗微生物活性。
此外，通過(guò)將化合物直接施用于動(dòng)物或人受試者，收集生物液體/臨床樣品(例如，鼻吸出物、咽棉拭、痰、支氣管-肺泡灌洗、尿、唾液、血，或血清)并試驗(yàn)該生物液體/臨床樣品的抗病毒活性(例如，加入存在微生物的培養(yǎng)物中的細(xì)胞)，可以確定硫酸化多糖的體內(nèi)活性。
通常，體內(nèi)穩(wěn)定性可通過(guò)技術(shù)人員公知的各種模型確定。具體地，可通過(guò)腎灌注測(cè)定法確定體內(nèi)穩(wěn)定性。對(duì)于任一種類(lèi)型的分析，可以用例如氚標(biāo)記受試化合物。腎灌注技術(shù)在Tay等人，(Am.J.Physiol.，(1991)，260F549-F554)中詳述。簡(jiǎn)言之，將大鼠腎(例如，來(lái)自雄性Sprague-Dawley大鼠)用含有氨基酸的改良KrebsHenseleit緩沖液中的5％牛血清白蛋白(BSA)灌注并用95％O2-5％CO2連續(xù)通氣。已被灌注的樣品可進(jìn)行離子交換層析，其使用，例如，19×1/cm2sepharose Q柱。將樣品加到6M尿素、0.05MTris、0.005％(w/v)Chaps，pH7.0中的柱子并用相同緩沖液中的0.15-2.5M NaCl的線性梯度以0.5ml/分鐘的流速洗脫。使用該技術(shù)的回收非常好。
前面已經(jīng)闡明了本發(fā)明的相關(guān)的和重要的特征。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白可以設(shè)計(jì)許多修改和實(shí)施方案。因此，考慮所附權(quán)利要求覆蓋所有這些修改和實(shí)施方案。
6.工作實(shí)施例下面的實(shí)施例僅用于闡明的目的并且不打算作為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
6.1實(shí)施例1具有9.5％硫酸化的硫酸化葡聚糖的合成在真空中60℃過(guò)夜干燥葡聚糖T20(平均分子量20,000)。干燥的化合物(100g)溶于640ml甲酰胺(FA)中。將氯磺酸(CSA)80ml加到3-頸燒瓶中最高45℃的FA 200ml中，然后在冰-水中冷卻。CSA的量決定了硫酸化葡聚糖的最終硫酸化(180ml CSA加到200ml FA產(chǎn)生約17％硫)。將CSA/FA混合物緩慢(2小時(shí)內(nèi))加到40℃溫度的葡聚糖。加入所有CSA/FA之后，在45℃攪拌混合物15分鐘。將混合物冷卻到25℃并緩慢加入28％NaOH以得到pH7.5-8.5，最大溫度50℃。對(duì)于第一次沉淀，攪拌下加入3L乙醇。停止攪拌并讓混合物靜置。倒出上清液并將沉淀重溶于1.5L水中。對(duì)于第二次沉淀，攪拌下加入1.5L乙醇并讓混合物靜置2小時(shí)。倒出上清液并將沉淀重溶于900ml水中，向其中加入17g NaCl。對(duì)于第三次沉淀，攪拌下加入800ml乙醇并讓混合物靜置2小時(shí)。測(cè)量最大旋光度。倒出上清液并將沉淀重新溶于500ml水中。加入2.8g Na2HPO4和2.6g NaH2PO4。對(duì)于最后的沉淀，加入5L乙醇并在玻璃過(guò)濾器上過(guò)濾沉淀并將其在真空中50℃下干燥。
6.2實(shí)施例2高碘酸鹽氧化按照Sandy JD.Biochem J.177569-574，1979所用的Smith降解的改良方法，室溫下將硫酸軟骨素(240mg)溶于0.25MNaClO4(47ml)中。加入5ml 0.5M NaIO4并將KOH用于調(diào)節(jié)混合物到pH5。允許反應(yīng)在黑暗中進(jìn)行72小時(shí)。然后在visking tubing中透析混合物以除去高碘酸鹽。
6.3實(shí)施例3將陰離子硫基團(tuán)導(dǎo)入羧甲基葡聚糖具有9.5％硫含量的羧甲基葡聚糖(平均分子量20,000)的硫酸化形式將羧甲基葡聚糖(CMD)在真空中60℃下干燥過(guò)夜。CMD(100g)溶于640ml甲酰胺(FA)中。將氯磺酸(CSA)80ml加到3-頸燒瓶中最大45℃的FA 200ml中，然后在冰-水中冷卻。CSA的量將決定CMD的最終硫含量(180ml CSA加到200ml FA產(chǎn)生約17％硫)。將CSA/FA混合物緩慢(2小時(shí)內(nèi))加到40℃的CMD。加入所有之后，在45℃攪拌混合物15分鐘。將混合物冷卻到25℃并緩慢加入28％NaOH以得到pH7.5-8.5，最大溫度50℃。對(duì)于第一次沉淀，攪拌下加入3L乙醇。倒出上清液并將沉淀重溶于1.5L水中。對(duì)于第二次沉淀，攪拌下加入1.5L乙醇并讓混合物靜置2小時(shí)。倒出上清液并將沉淀重溶于900ml水中，向其中加入17g NaCl。對(duì)于第三次沉淀，攪拌下加入800ml乙醇并讓混合物靜置2小時(shí)。最大旋光度應(yīng)為0.3。倒出上清液并將沉淀重新溶于500ml水中。加入2.8g Na2HPO4和2.6g NaH2PO4。對(duì)于最后的沉淀，加入5L乙醇并在玻璃過(guò)濾器上過(guò)濾沉淀并將其在真空中50℃下干燥。
羧甲基葡聚糖的磺酸化形式(平均分子量20,000)步驟1. 5g葡聚糖溶于水，加入100mg硼氫化物，室溫下攪拌30分鐘。
步驟2.加入氫氧化鈉顆粒(10g)并攪拌直到溶解然后加入磺酸鹽(12g)。
步驟3. 70℃加熱7小時(shí)。3小時(shí)后再加入3g磺酸鹽。繼續(xù)加熱4小時(shí)。
步驟4.以5M HCl中和到pH7.5(總體積(T)＝75ml)并在良好攪拌下緩慢加入200ml乙醇。停止攪拌并靜置1h。
步驟5.倒出上清液；重溶于水(T＝60ml)并在良好攪拌下緩慢加入150ml乙醇。并靜置1h。
步驟6.重復(fù)步驟5。
步驟7.倒出上清液，將殘?jiān)厝苡?0ml水中并將ppte溶于600ml乙醇?？蓪⒁恍饪s的氯化鈉溶液加入混合物中幫助沉淀。
步驟8.過(guò)濾并真空干燥，產(chǎn)量約6g。
6.4實(shí)施例4體內(nèi)抗病毒活性在藥物動(dòng)力學(xué)研究中評(píng)估硫酸葡聚糖和硫酸化葡聚糖變體的體內(nèi)抗微生物活性，該研究包括給予3只雄性大鼠和3只雌性大鼠商業(yè)途徑可得到的(～17％硫)40,000mw的硫酸葡聚糖(DS)(組1)、DS 500,000mw(組2)、硫酸葡聚糖(12.2％硫酸根)(DES6)40,000mw(組3)、DES6500,000mw(組4)的60mg/kg的單次靜脈內(nèi)劑量和給予3只大鼠的額外組(組5)的60mg/kg DES6 500,000mw的多天注射。大鼠為事先在腔靜脈中插入導(dǎo)管的Sprague-Dawley。注射后在各個(gè)時(shí)期抽血并在急性感染細(xì)胞保護(hù)測(cè)定系統(tǒng)中評(píng)估抗-HIV活性，該測(cè)定系統(tǒng)利用HIV-1RF病毒與CEN-SS細(xì)胞使用MTS染色方法確定細(xì)胞生存力(基于Witvrouw等人，J.Acqur.Immun.Def.Syndr.，3343-347，1990)。圖2中的顯示的結(jié)果指出DS，如預(yù)期的，在這些劑量下，具有高毒性，僅有一只大鼠存活超過(guò)24小時(shí)。相反，在DES6處理的大鼠中觀察到注射后長(zhǎng)達(dá)120小時(shí)的良好存活和循環(huán)抗-HIV活性。
圖2代表來(lái)自5組動(dòng)物的總結(jié)性數(shù)據(jù)。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)代表注射后不同時(shí)期的循環(huán)抗病毒活性的濃度。通過(guò)確定血液中化合物的IC50計(jì)算濃度。如可以從原始數(shù)據(jù)計(jì)算的，兩種分子量的DES6表現(xiàn)出血液中更長(zhǎng)的半壽期(12到18小時(shí))，和更長(zhǎng)的抗病毒活性(高于IC50的循環(huán)濃度)(超過(guò)72小時(shí))。對(duì)組5動(dòng)物的3次重復(fù)注射達(dá)到了穩(wěn)定態(tài)濃度。結(jié)果在圖2中表達(dá)。
數(shù)據(jù)指出與DES6相關(guān)的任何死亡可能是由于與導(dǎo)管插入術(shù)相關(guān)的并發(fā)癥，因?yàn)槲床迦雽?dǎo)管的動(dòng)物中MTD為＞850mg/kg。
6.5實(shí)施例5對(duì)凝血酶原/凝血酶和活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間的影響如上面所指出的，凝固抑制已經(jīng)是硫酸化多糖處理，尤其用常規(guī)硫酸化多糖處理的反復(fù)觀察到的副作用。該研究的目的是評(píng)價(jià)與商業(yè)途徑可得到的DS相比，DES6對(duì)凝血酶原時(shí)間(PT)和活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間(aPTT)的影響。在遞交給臨床病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室前所有標(biāo)本都用受試化合物“穿刺”(spike)。將標(biāo)本和重構(gòu)的從Sigma購(gòu)買(mǎi)的人血漿一起遞交。在分析即刻前將600μl Sigma人血漿加到每個(gè)標(biāo)本中。
使用Bio-Merieux Coag-A-Mate MTXII分析儀測(cè)量凝血酶原時(shí)間(PT)和活化的部分促凝血酶原激酶時(shí)間(APTT)。所用的PT試劑為Simplastin L，所用的ATPP試劑為Platelin L；所有試劑都從Bio-Merieux得到。所有樣品一式兩份地進(jìn)行。試驗(yàn)即刻之前分析凝固對(duì)照樣品。
標(biāo)本處置從一些標(biāo)本沒(méi)有得到凝固時(shí)間。PT測(cè)量時(shí)間在第5秒開(kāi)始并在第60秒停止。APTT測(cè)量時(shí)間在第5秒開(kāi)始并在第130秒停止。在這些時(shí)間段中沒(méi)有檢測(cè)到凝固。結(jié)果在下面的表2中給出。
表2數(shù)據(jù)總結(jié)-凝固
血小板減少和凝固進(jìn)行確定所注射的具有各種分子量的DS和DES6對(duì)凝固參數(shù)的影響的實(shí)驗(yàn)。在連續(xù)作業(yè)日給予大鼠5或50mg/kg(i.v.)每種化合物，持續(xù)10天。在第11天，劑量從5mg/kg改為1mg/kg和從50mg/kg改為100mg/kg并繼續(xù)每日連續(xù)靜脈內(nèi)注射。在第0、5、10和15天抽血并評(píng)估aPTT和血小板數(shù)。結(jié)果在下面的表3中提供。
表3
*標(biāo)記血小板聚集的值；評(píng)價(jià)了涂片并且沒(méi)有看見(jiàn)聚集。
最大耐受劑量在一系列實(shí)驗(yàn)中評(píng)估了DES6的多種毒性劑量(MTD)，實(shí)驗(yàn)中，對(duì)每組5只大鼠給以DES6 mw＝500,000的100或200mg/kg劑量。注射后5天內(nèi)確定體重和總的行為評(píng)估。通過(guò)觀察和體重測(cè)量沒(méi)有明顯的中毒跡象。隨后，對(duì)大鼠給予500mg/kg注射并再觀察5天，也沒(méi)有中毒跡象。最后，動(dòng)物被給予850mg/kg劑量。結(jié)果在表4中提供。
表4最大耐受劑量(MTD)
6.6實(shí)施例6硫酸化多糖的體外抗病毒評(píng)估研究包括人外周血單核細(xì)胞(PBMC)中500μg/ml的高試驗(yàn)濃度下5種受試化合物的評(píng)估。
方法將所有受試化合物#3(硫酸葡聚糖17-20％)、#4(硫酸葡聚糖，9.5％硫，分子量30,000)，和#6(硫酸葡聚糖，12.2％硫，分子量36,000)以40mg/ml溶于H2O中。這些化合物在視覺(jué)上完全溶解并且無(wú)色。將化合物避光保護(hù)并以最小化偶然進(jìn)入光線的方式實(shí)施測(cè)定法?；衔锶芙夂笤?20℃保存。
病毒低傳代兒科分離物RoJo來(lái)自南方研究所(Southern ResearchInstitute)的實(shí)驗(yàn)室。RoJo是推測(cè)的B亞型病毒。
PBMC分離和胚化(Blasting)通過(guò)ficoll hypaque梯度分離從正常肝炎和HIV-1陰性供體得到外周血單核細(xì)胞(PBMC)。將這些單核細(xì)胞洗滌以除去殘留的分離介質(zhì)、計(jì)數(shù)、確定生存力并以1×106個(gè)細(xì)胞/mL重懸在補(bǔ)加15％FBS(熱失活的)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/ml鏈霉素、和10μg/ml慶大霉素與2μg/ml植物凝集素(PHA)的RPMI 1640培養(yǎng)基中。在37℃，5％CO2中培養(yǎng)細(xì)胞48到72小時(shí)。孵育后，細(xì)胞通過(guò)離心收集，洗滌并重懸在補(bǔ)加15％FBS(熱失活的)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/ml鏈霉素、和10μg/ml慶大霉素與20U/ml重組IL-2(R&D Systems，Minneapolis，MN)的RPMI 1640培養(yǎng)基中。IL-2被包含在培養(yǎng)基中用以保持PHA促有絲分裂刺激啟動(dòng)的細(xì)胞分裂。通過(guò)每3天用新鮮的含有IL-2的培養(yǎng)基替換1/2培養(yǎng)物體積來(lái)保持培養(yǎng)物，直到使用。
PBMC測(cè)定法將已經(jīng)用PHA和IL-2胚化的來(lái)自最少兩個(gè)供體的人外周血單核細(xì)胞計(jì)數(shù)，通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)染料排斥確定生存力并以等比例混合。使用合并的供體以便使由于HIV感染和原代淋巴細(xì)胞群體對(duì)PHA和IL-2的總體應(yīng)答中的定量和定性差異導(dǎo)致的個(gè)體供體之間所觀察到的變化性最小。將細(xì)胞以1×106個(gè)細(xì)胞/mL重懸在補(bǔ)加15％胎牛血清(熱失活的)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/ml鏈霉素、和10μg/ml慶大霉素與IL-2(20U/ml，R&D Systems，Minneapolis，MN)，而沒(méi)有酚紅的RPMI 1640培養(yǎng)基中。以南方研究所的傳染性疾病研究部(Infectious Disease Research department)開(kāi)發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)格式將50微升細(xì)胞分布于96孔圓底微量滴定培養(yǎng)板的內(nèi)部60個(gè)孔中。每個(gè)板含有細(xì)胞對(duì)照孔(僅細(xì)胞)、病毒對(duì)照孔(細(xì)胞加病毒)，和實(shí)驗(yàn)孔(藥物加細(xì)胞加病毒)。向微量滴定板加入連續(xù)稀釋的化合物，然后加入適當(dāng)?shù)念A(yù)滴定的HIV-1 RoJo稀釋液。所有樣品都一式三份地測(cè)定，無(wú)病毒的復(fù)板用于確定化合物毒性。每孔的終體積為200μL。測(cè)定在濕潤(rùn)空氣中37℃，5％CO2中孵育6天，之后收集上清液，分析RT活性并通過(guò)MTS染料還原分析姐妹板的細(xì)胞生存力。還通過(guò)顯微鏡檢查孔并記錄任何異常。
細(xì)胞生存力的MTS染色測(cè)定結(jié)束時(shí)將測(cè)定板用可溶的基于四唑的染料MTS(CellTiter96試劑，Promega)染色以確定細(xì)胞生存力和定量化合物毒性。MTS被代謝活性細(xì)胞的線粒體酶代謝成可溶的甲產(chǎn)物，使得可以快速定量分析細(xì)胞生存力和化合物細(xì)胞毒性。該試劑是單穩(wěn)定溶液，其不需要使用前制備。在測(cè)定結(jié)束時(shí)每孔加入20μL MTS試劑并在37℃孵育4小時(shí)。用粘性板密封器代替蓋子，將密封的平板倒轉(zhuǎn)幾次以混合可溶性甲產(chǎn)物，并用分子設(shè)備Vmax平板讀出器(Molecular DevicesVmax plate reader)在490nm通過(guò)分光光度法讀數(shù)。
培養(yǎng)上清液的反轉(zhuǎn)錄酶測(cè)定法在無(wú)細(xì)胞的上清液中測(cè)量反轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性。將氚化的三磷酸胸苷(NEN)(TTP)以5Ci/mL重懸在蒸餾水中。制備多聚rA和寡聚dT作為母液，將其在-20℃保存。RT反應(yīng)緩沖液每天新鮮制備并由125μL1.0M EGTA、125μL dH2O、110μL 10％SDS、50μL 1.0M Tris(pH7.4)、50μL 1.0M DTT，和40μL 1.0M MgCl2組成。這三種溶液以?xún)煞軹TP、一份多聚rA寡聚dT、和一份反應(yīng)緩沖液的比例一起混合。將10微升這種反應(yīng)混合物置于圓底微量滴定板中并加入15μL含有病毒的上清液并混合。平板在37℃水浴中孵育，使用固體支持物以防止平板浸沒(méi)并孵育60分鐘。反應(yīng)后，將反應(yīng)體積點(diǎn)到幾片DE81紙上，用5％磷酸鈉緩沖液洗滌5次，每次5分鐘，在蒸餾水中洗滌2次，每次1分鐘，在70％乙醇中洗滌兩次，每次1分鐘，然后干燥。將Opti-Fluor O加入每個(gè)樣品并使用Wallac 1450 Microbetaplus液體閃爍計(jì)數(shù)器定量所摻入的放射性。
數(shù)據(jù)分析提供了IC50(病毒復(fù)制的50％抑制)、TC50(細(xì)胞存活性的50％減少)和治療指數(shù)(TI，TC50/IC50)。
結(jié)果通過(guò)線性回歸計(jì)算IC50和TC50值。TI代表TC50/IC50，并用于確定化合物之間的相對(duì)潛能。圖解表示顯示了抗病毒效能(％VC)和化合物毒性(％CC)之間的關(guān)系，其分別表達(dá)為對(duì)照、病毒無(wú)化合物或細(xì)胞無(wú)化合物的百分比。
用于評(píng)價(jià)受試化合物的所有PBMC測(cè)定法都滿(mǎn)足它們各自的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)和內(nèi)部測(cè)定法生效標(biāo)準(zhǔn)，包括一式三份之間變化和總病毒復(fù)制。對(duì)照化合物AZT(RT抑制劑)和常規(guī)硫酸葡聚糖(病毒進(jìn)入/附著抑制劑)以預(yù)期的效能抑制HIV復(fù)制(AZTIC501到10nM；硫酸葡聚糖IC500.1到2μg/ml)。從而所給出的評(píng)估是有效的并且代表受試化合物的抗病毒活性。
數(shù)據(jù)在表5中概述。
表5抗病毒活性
表5比較了PBMC中以前的和當(dāng)前的抗病毒評(píng)價(jià)。在這些實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了以前鑒定的IC50和DES 17-20％硫酸化的抗病毒效能，其IC50為0.5μg/ml。這處于為PBMC測(cè)定法預(yù)測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)3-倍誤差之內(nèi)。此外，第二個(gè)實(shí)驗(yàn)證明化合物#3在500μg/ml下對(duì)PBMC是無(wú)毒的。
在該評(píng)估設(shè)定下進(jìn)行了DES 9.5％硫酸化和DES 12.5％硫酸化的最初抗病毒評(píng)估。兩種化合物在500μg/ml時(shí)都是無(wú)毒的并且得到50％抑制濃度?；谒?jì)算的IC50，DES 12.5％硫酸化顯示了等于DES 17-20％硫酸化的抗病毒活性，分別為1.6對(duì)0.5μg/ml。此外，抗病毒效能曲線的檢查表明這兩種化合物具有相等的潛能。相反，DES 9.5％硫酸化比DES 17-20％硫酸化的活性小39倍并且比DES 12.5％硫酸化的活性小12倍。
6.7實(shí)施例7硫酸化多糖的體外抗病毒評(píng)估已經(jīng)實(shí)驗(yàn)了下面化合物的體外抗病毒活性樣品3(硫酸葡聚糖，17-20％硫，分子量39,700)、樣品4(硫酸葡聚糖，9.5％硫，分子量30,000)和樣品6(硫酸葡聚糖，12.2％硫，分子量36,000)。所有三種化合物都表現(xiàn)出針對(duì)HIV-1 RoJo病毒的顯著抗病毒活性。
還針對(duì)一系列HIV-1臨床分離物，包括亞型代表性分離物SIV和HIV-2，評(píng)估了DES 9.5％硫酸化和DES 12.5％硫酸化。還評(píng)估了單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中HIV-1 ADA和BaL復(fù)制的抑制。
如上在實(shí)施例4中描述的制備了DES 9.5％硫酸化和DES 12.5％硫酸化。
6.7.1病毒從NIAID AIDS Research和Reference Reagent Program得到1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)株系Ba-L、ADA、SIVmac251、HIV-2(CDC310319)和亞型代表性菌株(表6)。低傳代兒科分離物SLKA、WeJo和TeKi來(lái)自南方研究所的實(shí)驗(yàn)室。多種藥物抗性病毒MDR-769來(lái)自一名有豐富經(jīng)驗(yàn)的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒患者并顯示出表7中概述的抗性譜和基因型。
表6亞型代表性病毒
表7MDR 769病毒的表型和基因型
表7中粗體型突變代表所示基因中的關(guān)鍵抗性突變。
PBMC分離和胚化如實(shí)施例6中描述的得到外周血單核細(xì)胞(PBMC)。
PBMC測(cè)定法如實(shí)施例6中描述的實(shí)施PBMC測(cè)定法。
單核細(xì)胞分離、培養(yǎng)和感染如上面關(guān)于PBMC所描述的，通過(guò)ficoll hypaque純化淡黃色膜，然后通過(guò)塑料粘附從正常HIV-1陰性供體分離外周血單核細(xì)胞。在許多情況中，使用與產(chǎn)生PBMC群體相同的供體產(chǎn)生單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，然而，不像PBMC群體，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞供體永不合并。在補(bǔ)加10％人混合AB血清(熱失活的)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/ml鏈霉素、和10μg/ml慶大霉素且沒(méi)有酚紅的RPMI 1640培養(yǎng)基中附著2小時(shí)后，洗滌培養(yǎng)物以除去未附著的細(xì)胞。通過(guò)用無(wú)Ca2+和Mg2+的PBS劇烈移液(pipetting)，從塑料釋放單核細(xì)胞。附著的細(xì)胞通過(guò)非特異酯酶染色(α-丁酸萘酯特異性酯酶，Sigma ChemicalCo.)評(píng)定純度，和/或通過(guò)錐蟲(chóng)藍(lán)染料排斥確定生存力，計(jì)數(shù)并以1×106個(gè)單核細(xì)胞/ml重懸在補(bǔ)加10％胎牛血清(熱失活的)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/ml鏈霉素、和10μg/ml慶大霉素的RPMI 1640中。然后培養(yǎng)單核細(xì)胞(1×105個(gè)/0.2cm孔)6天，讓細(xì)胞成熟到類(lèi)似巨噬細(xì)胞的表型。在第6天，培養(yǎng)物被洗滌3次以除去任何未附著的細(xì)胞并加入系列稀釋的受試化合物，然后如果孔的顯微觀察表明單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞單層的70％或更大的匯合，那么加入預(yù)-滴定量的HIV-1病毒。感染后24小時(shí)通過(guò)除去培養(yǎng)基最后一次洗滌培養(yǎng)物，加入新鮮化合物并繼續(xù)培養(yǎng)6天。使用標(biāo)準(zhǔn)化的微量滴定板格式進(jìn)行測(cè)定，該格式僅使用96孔板的內(nèi)部60個(gè)孔用于測(cè)定目的。外面的行含有培養(yǎng)基并作為蒸發(fā)屏障。每板含有細(xì)胞對(duì)照孔(僅細(xì)胞)、病毒對(duì)照孔(細(xì)胞加病毒)，和實(shí)驗(yàn)孔(藥物加細(xì)胞加病毒)。測(cè)定結(jié)束時(shí)通過(guò)無(wú)細(xì)胞的上清液的商業(yè)途徑可得到的p24 ELISA測(cè)定法(Coulter)測(cè)量HIV p24抗原含量以評(píng)估病毒復(fù)制，并通過(guò)MTS染料還原測(cè)定化合物細(xì)胞毒性。AZT、HIV-1反核苷轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和硫酸葡聚糖，一種附著抑制劑，用作陽(yáng)性對(duì)照化合物并在每次測(cè)定中平行運(yùn)行。在測(cè)定結(jié)束時(shí)，從培養(yǎng)箱除去培養(yǎng)板并顯微觀察。記錄任何獨(dú)特的發(fā)現(xiàn)。
細(xì)胞生存力的MTS染色如實(shí)施例6中描述的實(shí)施MTS染色。
培養(yǎng)上清液的逆轉(zhuǎn)錄酶測(cè)定法如實(shí)施例6中描述的測(cè)量無(wú)細(xì)胞上清液逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性。
P24抗原ELISAELISA試劑盒購(gòu)買(mǎi)于Coulter Electronics。根據(jù)生產(chǎn)商的教導(dǎo)實(shí)施測(cè)定法。在每個(gè)測(cè)定中產(chǎn)生對(duì)照曲線以準(zhǔn)確定量每個(gè)樣品中的p24抗原的量。使用Molecular Devices Vmax平板讀出器通過(guò)450nm處的分光光度分析得到數(shù)據(jù)。使用Molecular Devices Soft Max軟件包從光密度值計(jì)算終濃度。
結(jié)果計(jì)算IC50(病毒復(fù)制的50％抑制)、TC50(細(xì)胞生存力的50％減少)和治療指數(shù)(TI，TC50/IC50)，結(jié)果在表8中總結(jié)。
每個(gè)試驗(yàn)的抗病毒數(shù)據(jù)包括來(lái)自病毒復(fù)制的一式三份試驗(yàn)(對(duì)于PBMC的RT(cpm)，對(duì)于單核細(xì)胞的p24(pg/ml))和MTS染料還原測(cè)量細(xì)胞生存力(OD490)的相關(guān)原始數(shù)據(jù)值。通過(guò)線性回歸計(jì)算IC50和TC50值。TI代表TC50/IC50的比，并用于確定化合物之間的相對(duì)潛能。圖解表示顯示了抗病毒效能(％VC)和化合物毒性(％CC)之間的關(guān)系，其分別表達(dá)為對(duì)照、病毒無(wú)化合物或細(xì)胞無(wú)化合物的百分比。
表8作用試驗(yàn)范圍的總結(jié)
1硫酸葡聚糖(μg/ml)用作對(duì)照化合物。
表8表明DES 12.5％硫酸化是比DES 9.5％硫酸化更強(qiáng)的HIV-1復(fù)制抑制劑。DES 9.5％硫酸化的IC50為5.1到＞100μg/ml(19倍)，DES12.5％硫酸化的IC50為0.6到11.7μg/ml(19倍范圍)，從而，它們的抗病毒的潛能范圍是相當(dāng)?shù)?。盡管兩種化合物之間的活性存在基本差異，但是兩種化合物通常都具有抗寬范圍的受試HIV-1分離物的活性，以及表現(xiàn)出抗多種藥物抗性病毒SIV和HIV-2的活性。因而這些化合物是廣譜抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的。
DES 12.5％硫酸化具有抗所有受試病毒的活性。其抗C亞型(IC5010.3μg/ml)和G亞型病毒(IC5010.3μg/ml)的活性最小。其還有效抑制HIV-1 ADA的復(fù)制。使用HIV-2的臨床分離物和SIV的SIVmac251分離物，DES 12.5％硫酸化也表現(xiàn)出良好的抗病毒活性。其還表現(xiàn)出針對(duì)多種藥物抗性病毒分離物MDR769的顯著活性。從而，DES 12.5％硫酸化具有抗HIV-1臨床分離物、多種藥物抗性病毒和其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的廣譜活性。
DES 9.5％硫酸化表現(xiàn)出對(duì)各種受試病毒的不同種類(lèi)的應(yīng)答(IC50的變化性)，活性為無(wú)活性到有活性。以前已經(jīng)闡明了在HIV-1 RoJo感染的PBMC中DES 9.5％硫酸化比DES 12.5％硫酸化的活性更小，該差異在這里再次得到證明(活性低37倍)。DES9.5％硫酸化對(duì)一些病毒(ADA和Ba-L和G亞型病毒)無(wú)活性，對(duì)這些病毒的抗病毒曲線的檢查表明在更高的受試濃度將有活性。DES 9.5％硫酸化還具有抗MDR769HIV-1株系(IC5013μg/ml)和HIV-2臨床分離物(IC505.1μg/ml)的活性。從而，盡管低于所有潛能，但是其仍然具有抗多種藥物抗性HIV-1和HIV-2的高潛能。
針對(duì)臨床分離的HIV-1和兩種其他逆轉(zhuǎn)錄病毒(HIV-2和SIV-1)試驗(yàn)了DES 9.5％硫酸化和DES 12.5％硫酸化并發(fā)現(xiàn)它們是廣譜抗逆轉(zhuǎn)錄病毒的。此外，這些結(jié)果表明這些化合物具有抗攜帶對(duì)RT抑制劑的多種藥物抗性的T215Y突變的抗性臨床分離物的活性。該數(shù)據(jù)還表明盡管基于IC50，DES 12.5％硫酸化比DES 9.5％硫酸化更有效，但是針對(duì)所列病毒它們的IC50范圍是相當(dāng)?shù)?。從而，可能兩者通過(guò)類(lèi)似作用機(jī)理抑制病毒復(fù)制。最后，這兩種化合物具有抗HIV-2和SIV-1的活性這一論證表明它們可應(yīng)用于其他逆轉(zhuǎn)錄病毒。
6.8本發(fā)明化合物的生物分布通過(guò)靜脈內(nèi)blus或經(jīng)口管飼法施用對(duì)來(lái)自Charles River實(shí)驗(yàn)室的雄性Sprague-Dawley大鼠(Raleigh，NC；約377-402g)服用[3H]Des6 40K。在給藥后6或12小時(shí)收集的樣品中定量血漿、淋巴和頸部淋巴結(jié)中的氚含量分布。
研究設(shè)計(jì)在表9中概述。大鼠被分成三個(gè)治療施用組。在磷酸緩沖液媒介物(pH＝7.4)中制備劑量以將它們以大約1.8ml/kg(iv)和2.1mL/kg(經(jīng)口管飼法)的適當(dāng)體積遞送。
給藥后在第6或12小時(shí)收集生物樣品的時(shí)間之前，將動(dòng)物用開(kāi)他敏/甲苯噻嗪(7∶1，Ca.120mg/kg)麻醉，并且如Waynforth，H.B.和Flecknell，P.A.(1992)大鼠實(shí)驗(yàn)和手術(shù)技術(shù)(Experimental andSurgical Technique in the Rat)，第二版，Academic Press，NewYork中描述的將導(dǎo)管插入胸淋巴管。樣品分析時(shí)，通過(guò)心臟穿刺收集血液并通過(guò)淋巴管導(dǎo)管收集淋巴。將血液在Ca.1000g離心10分鐘以得到血漿。在表9中指定的時(shí)間從每只動(dòng)物收集頸部淋巴結(jié)。除了另外指出，對(duì)收集的所有生物樣品通過(guò)液體閃爍光譜測(cè)定法一式兩份地定量總放射性。
表9.研究設(shè)計(jì)和給藥
ND-由于受試物品不足量而沒(méi)有給藥的動(dòng)物。
研究結(jié)果在表10中描述。除了列出血漿、淋巴和淋巴結(jié)中總放射標(biāo)記含量，還提供了每只動(dòng)物的淋巴∶血漿和淋巴結(jié)∶血漿比?？傊?，與經(jīng)口施用相比，在靜脈內(nèi)施用處理的動(dòng)物中[3H]Des6 40K相關(guān)的總放射性濃度最高，與12小時(shí)處相比，血漿和淋巴中最高濃度在6小時(shí)處。12小時(shí)處的血漿和淋巴[3H]Des6 40K-eq濃度為6小時(shí)處所得濃度的約1-2％。然而，靜脈內(nèi)施用后，淋巴結(jié)中的總放射性濃度在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)是類(lèi)似的。組2中的動(dòng)物G961在麻醉后和胸管的導(dǎo)管插入術(shù)以收集淋巴之前死亡。不能從該動(dòng)物收集淋巴；然而，收集了血漿和淋巴結(jié)以定量總放射性。發(fā)現(xiàn)在這些收集的生物介質(zhì)中的總放射性比從手術(shù)幸存下來(lái)的其他兩只大鼠的大的多。觀察到該動(dòng)物中的淋巴結(jié)比組2中的其他兩只動(dòng)物的大。
經(jīng)口施用[3H]Des6 40K后，血漿總放射性的濃度與靜脈施用后12小時(shí)處所得的可以相比。經(jīng)口施用后淋巴中的平均總放射性約為靜脈內(nèi)施用后12小時(shí)處所得平均總放射性的約63％；而淋巴結(jié)中總放射性?xún)H為靜脈內(nèi)施用后那些所得的約0.4％。
靜脈內(nèi)施用后6-和12-小時(shí)時(shí)間點(diǎn)之間大鼠中淋巴∶血漿比增加(分別比較6和12-小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的0.14和0.64對(duì)照1.7和1.3)，而血漿總放射性顯著降低了。經(jīng)口施用后淋巴/血漿比約為1，表明在12小時(shí)處這兩種介質(zhì)中總放射性的均等分布。
12-h時(shí)間點(diǎn)的淋巴結(jié)血漿比例與6h處所得比例相比增加很大程度。這種隨著時(shí)間的增加比在相同時(shí)間段內(nèi)在淋巴中所得的大的多。這些數(shù)據(jù)表明[3H]Des6 40K相關(guān)的放射性更大程度地分布到淋巴結(jié)并且從該組織清除的速度緩慢。
相比，經(jīng)口施用后淋巴結(jié)中的分布譜是不同的，其中淋巴結(jié)∶血漿僅為約0.50-0.82，并證明通過(guò)經(jīng)口途徑，較少的總放射性分布到淋巴結(jié)。
表10.生物樣品中總放射標(biāo)記含量
a僅有足夠劑量可對(duì)組1中的兩只大鼠給藥。
b大鼠G961接受麻醉后死亡。沒(méi)有得到淋巴液；然而收集了血漿和淋巴結(jié)。
c僅得到用于分析一個(gè)等分試樣的足夠淋巴。大鼠G958中頸部淋巴結(jié)沒(méi)找到，并且沒(méi)有被收集。
ND-未確定。
前面已經(jīng)闡明了本發(fā)明的相關(guān)和重要的特征。本領(lǐng)域中技術(shù)人員將理解可以設(shè)計(jì)許多修改和實(shí)施方案。因此，所附權(quán)利要求計(jì)劃覆蓋所有這些修改和實(shí)施方案。
權(quán)利要求
1.治療或預(yù)防人微生物感染的方法，該方法包括對(duì)需要該治療或預(yù)防的人施用治療有效量的硫酸化多糖，所述硫酸化多糖的硫含量相對(duì)于簡(jiǎn)單糖殘基高于6％并且低于13％，其中分子量高于5,000g/mol并且感染不是皰疹感染。
2.治療或預(yù)防人微生物感染的方法，該方法包括對(duì)需要該治療或預(yù)防的人施用治療有效量的硫酸化多糖，所述硫酸化多糖的硫含量相對(duì)于簡(jiǎn)單糖殘基高于6％并且低于13％，其中分子量高于40,000g/mol。
3.權(quán)利要求1的方法，其中硫含量高于7％且低于13％。
4.權(quán)利要求3的方法，其中硫含量高于8％且低于13％。
5.權(quán)利要求4的方法，其中硫含量高于9％且低于13％。
6.權(quán)利要求1的方法，其中微生物感染是病毒感染、細(xì)菌感染、寄生蟲(chóng)感染或真菌感染。
7.利要求6的方法，其中病毒感染由DNA病毒導(dǎo)致。
8.權(quán)利要求6的方法，其中病毒感染由RNA病毒導(dǎo)致。
9.權(quán)利要求7的方法，其中DNA病毒是雙鏈DNA病毒或單鏈DNA病毒。
10.權(quán)利要求8的方法，其中RNA病毒是雙鏈RNA病毒、負(fù)義單鏈RNA病毒、正義單鏈RNA病毒，或者雙義RNA病毒。
11.權(quán)利要求9的方法，其中雙鏈DNA病毒是嗜肝DNA病毒、皰疹病毒、痘病毒、虹彩病毒、乳多空病毒，或腺病毒。
12.權(quán)利要求9的方法，其中單鏈DNA病毒是圓環(huán)病毒或細(xì)小病毒。
13.權(quán)利要求10的方法，其中雙鏈RNA病毒是呼腸孤病毒或雙RNA病毒。
14.權(quán)利要求10的方法，其中負(fù)義單鏈RNA病毒是彈狀病毒、線狀病毒、副粘病毒，正粘病毒、布尼亞病毒、或沙粒病毒。
15.權(quán)利要求10的方法，其中正義單鏈RNA病毒是細(xì)小RNA病毒、杯狀病毒、星狀病毒、披膜病毒、黃病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或動(dòng)脈病毒。
16.權(quán)利要求6的方法，其中病毒感染由有包膜的病毒導(dǎo)致。
17.權(quán)利要求6的方法，其中病毒感染不是皰疹病毒感染。
18.權(quán)利要求6的方法，其中病毒感染不是HSV-1或HSV-2感染。
19.權(quán)利要求6的方法，其中病毒感染不是逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。
20.權(quán)利要求6的方法，其中病毒感染不是HIV-1或HIV-2感染。
21.權(quán)利要求6的方法，其中病毒感染是HIV-1或HIV-2感染。
22.權(quán)利要求2的方法，其中病毒感染是逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。
23.權(quán)利要求22的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒感染是HIV-1或HIV-2感染。
24.權(quán)利要求2的方法，其中病毒感染是皰疹病毒感染。
25.權(quán)利要求24的方法，其中皰疹病毒感染是HSV-1或HSV-2感染。
26.權(quán)利要求1的方法，其中硫酸化多糖是共帶電的陰離子多糖。
27.權(quán)利要求26的方法，其中通過(guò)羧甲基基團(tuán)、磺酸根基團(tuán)、硫酸根基團(tuán)或它們的組合使共帶電的陰離子多糖共帶電。
28.權(quán)利要求26的方法，其中病毒感染是逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。
29.權(quán)利要求28的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒感染是HIV-1或HIV-2感染。
30.權(quán)利要求26的方法，其中病毒感染是皰疹病毒感染。
31.權(quán)利要求30的方法，其中皰疹病毒感染是HSV-1或HSV-2感染。
32.權(quán)利要求1的方法，其中硫酸化多糖是左旋的。
33.權(quán)利要求1的方法，其中硫酸化多糖具有約5,000到約1,000,000的分子量。
34.權(quán)利要求1的方法，其中硫酸化多糖具有高于25,000的分子量。
35.權(quán)利要求34的方法，其中硫酸化多糖具有高于40,000的分子量。
36.權(quán)利要求1的方法，其中硫酸化多糖具有高于500,000的分子量并且局部施用。
37.權(quán)利要求1的方法，其中硫酸化多糖含有通過(guò)α-1，6鍵連接的D-吡喃葡萄糖殘基。
38.權(quán)利要求1的方法，其中硫酸化多糖含有L-吡喃葡萄糖殘基。
39.權(quán)利要求1的方法，其中硫酸化多糖是硫酸化葡聚糖。
40.權(quán)利要求1的方法，其中硫酸化多糖不是硫酸糊精、環(huán)糊精或角叉菜膠。
41.治療或預(yù)防人微生物感染的方法，該方法包括對(duì)需要該治療或預(yù)防的人施用治療或預(yù)防可接受量的硫含量高于6％并且低于13％的硫酸化葡聚糖。
42.治療或預(yù)防人微生物感染的方法，該方法包括對(duì)需要該治療或預(yù)防的人施用治療或預(yù)防可接受量的分子量高于40,000并且硫含量高于6％并且低于13％的硫酸化葡聚糖。
43.權(quán)利要求41的方法，其中硫酸化葡聚糖具有高于5,000的分子量。
44.權(quán)利要求43的方法，其中硫酸化葡聚糖具有高于25,000的分子量。
45.權(quán)利要求41的方法，其中硫酸化葡聚糖的硫百分比高于7％并且低于13％。
46.權(quán)利要求41的方法，其中硫酸化葡聚糖的硫百分比高于8％并且低于13％。
47.權(quán)利要求41的方法，其中硫酸化葡聚糖的硫百分比高于9％并且低于13％。
48.權(quán)利要求41的方法，其中通過(guò)羧甲基基團(tuán)、磺酸根基團(tuán)、硫酸根基團(tuán)或它們的組合使硫酸化葡聚糖共帶電。
49.權(quán)利要求41的方法，其中微生物感染是病毒感染、細(xì)菌感染、寄生蟲(chóng)感染或真菌感染。
50.權(quán)利要求49的方法，其中病毒感染由DNA病毒導(dǎo)致。
51.權(quán)利要求49的方法，其中病毒感染由RNA病毒導(dǎo)致。
52.權(quán)利要求49的方法，其中病毒感染由有包膜的病毒導(dǎo)致。
53.權(quán)利要求50的方法，其中DNA病毒是雙鏈DNA病毒或單鏈DNA病毒。
54.權(quán)利要求51的方法，其中RNA病毒是雙鏈RNA病毒、負(fù)義單鏈RNA病毒、正義單鏈RNA病毒，或者雙義RNA病毒。
55.權(quán)利要求53的方法，其中雙鏈DNA病毒是嗜肝DNA病毒、皰疹病毒、痘病毒、虹彩病毒、乳多空病毒，或腺病毒。
56.權(quán)利要求53的方法，其中單鏈DNA病毒是圓環(huán)病毒或細(xì)小病毒。
57.權(quán)利要求54的方法，其中雙鏈RNA病毒是呼腸孤病毒或雙RNA病毒。
58.權(quán)利要求54的方法，其中負(fù)義單鏈RNA病毒是彈狀病毒、線狀病毒、副粘病毒，正粘病毒、布尼亞病毒、或沙粒病毒。
59.權(quán)利要求54的方法，其中正義單鏈RNA病毒是細(xì)小RNA病毒、杯狀病毒、星狀病毒、披膜病毒、黃病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或動(dòng)脈病毒。
60.權(quán)利要求49的方法，其中病毒感染不是皰疹病毒導(dǎo)致。
61.權(quán)利要求60的方法，其中病毒感染不是HSV-1或HSV-2導(dǎo)致。
62.權(quán)利要求49的方法，其中病毒感染不是由逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)致。
63.權(quán)利要求62的方法，其中病毒感染不是由HIV-1或HIV-2導(dǎo)致。
64.權(quán)利要求49的方法，其中病毒感染由HIV-1或HIV-2導(dǎo)致。
65.治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中微生物感染的方法，該方法包括對(duì)需要該治療或預(yù)防的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的組合物，所述組合物包括硫酸化多糖，該多糖中每個(gè)葡萄糖殘基硫取代百分比高于6％并且低于13％，其中硫百分比范圍對(duì)于組成性硫酸根基團(tuán)與導(dǎo)致感染的微生物之間的最大相互作用是有效的，并且其中該硫酸化多糖基本上不通過(guò)哺乳動(dòng)物中細(xì)胞受體結(jié)合而被內(nèi)吞或降解，從而在體內(nèi)保持抗微生物活性。
66.權(quán)利要求65的方法，其中硫酸化多糖是硫酸化葡聚糖。
67.權(quán)利要求65的方法，其中微生物感染是病毒感染、細(xì)菌感染、寄生蟲(chóng)感染或真菌感染。
68.權(quán)利要求65的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
69.權(quán)利要求65的方法，其中所述組合物是無(wú)菌的。
70.治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中微生物感染的方法，該方法包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的高碘酸鹽處理的陰離子多糖。
71.權(quán)利要求70的方法，其中高碘酸鹽處理的多糖是硫酸化多糖。
72.權(quán)利要求70的方法，其中硫酸化多糖是硫酸化葡聚糖。
73.權(quán)利要求70的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
74.權(quán)利要求70的方法，其中微生物感染是逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。
75.權(quán)利要求74的方法，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒感染是HIV-1或HIV-2感染。
76.權(quán)利要求70的方法，其中微生物感染是皰疹病毒感染。
77.權(quán)利要求76的方法，其中皰疹病毒感染是HSV-1或HSV-2感染。
78.權(quán)利要求1、2、41、42、65、或70的方法，其還包括施用額外的治療劑或吸收增強(qiáng)劑。
79.權(quán)利要求1的方法，其中治療或預(yù)防有效量為每天約0.001到200mg/kg。
80.權(quán)利要求79的方法，其中多糖的治療或預(yù)防有效量為每天約0.005到100mg/kg。
81.權(quán)利要求1的方法，其中硫酸化多糖的治療或預(yù)防有效量為約0.1mg/kg/天到約1,500mg/kg/天。
82.權(quán)利要求1的方法，其中人是無(wú)免疫應(yīng)答的人。
83.權(quán)利要求1的方法，其中治療或預(yù)防有效量的硫酸化多糖通過(guò)腸胃外施用。
84.權(quán)利要求1的方法，其中治療或預(yù)防有效量的硫酸化多糖經(jīng)口施用。
85.權(quán)利要求1的方法，其中治療或預(yù)防有效量的硫酸化多糖經(jīng)局部施用。
86.控制將要全身性施用于哺乳動(dòng)物的硫酸化多糖的硫酸化的方法，該方法包括提供硫酸化多糖，該多糖的硫酸化足夠消除或減少該硫酸化多糖被高電荷密度聚陰離子細(xì)胞受體結(jié)合而保持抗微生物活性；和將該硫酸化多糖施用于哺乳動(dòng)物。
87.治療微生物感染的藥物組合物，其含有治療有效量的硫百分比大于6％并且小于13％的硫酸化多糖和適宜的載體。
88.治療微生物感染的藥物組合物，其含有治療有效量的硫百分比大于6％并且小于13％并且分子量大于25,000的硫酸化多糖和適宜的載體。
89.治療微生物感染的藥物組合物，其含有治療有效量的硫百分比大于6％并且小于13％并且分子量大于40,000的硫酸化多糖和適宜的載體。
90.權(quán)利要求87、88或89的藥物組合物，其中硫酸化多糖關(guān)于硫百分比、分子量或者兩者是均一的。
91.預(yù)防性裝置，其涂有硫含量高于6％并且低于13％的硫酸化多糖。
92.消毒組合物，其含有凝膠劑、泡沫液、洗劑、霜?jiǎng)⑷芤簞?、糊劑或粉劑形式的硫含量大?％并且小于13％的硫酸化多糖。
全文摘要
本發(fā)明提供了用硫酸化多糖治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中微生物感染的方法和組合物，其中該多糖的硫酸化程度對(duì)于組成性硫酸根基團(tuán)與導(dǎo)致感染的微生物之間的最大相互作用是有效的，并且其中該硫酸化多糖基本上不通過(guò)哺乳動(dòng)物中細(xì)胞受體結(jié)合而被內(nèi)吞或降解，從而在體內(nèi)保持抗微生物活性。
文檔編號(hào)A61K31/737GK1688320SQ03824188
公開(kāi)日2005年10月26日 申請(qǐng)日期2003年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月13日
發(fā)明者W·D·康珀 申請(qǐng)人:蒙納什大學(xué)