專利名稱：一種治療自身免疫病的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般地涉及一種方法，用于治療或緩解自身免疫病(例如，但是不限于自身免疫性糖尿病)的癥狀，或者降低或最小化發(fā)展為該疾病的危險。更具體而言，本發(fā)明涉及遺傳修飾的造血干細胞和/或造血祖細胞的用途，它們表達編碼一種或多種自身抗原的遺傳物質(zhì)，產(chǎn)生可誘導(dǎo)免疫耐受和/或保護性免疫的抗原呈遞細胞。因此本發(fā)明提供一種治療和/或預(yù)防自身免疫病如I型糖尿病的方法。
現(xiàn)有技術(shù)描述本說明書中提到的參考文獻的詳細目錄在本說明書結(jié)尾處列出。
本說明書中對任何現(xiàn)有技術(shù)的提及不是，也不應(yīng)被視為承認或者以任何形式提示該現(xiàn)有技術(shù)是任一國家的公知常識的一部分。
胰島素依賴型或I型糖尿病是由于自身免疫介導(dǎo)的胰島β細胞破壞導(dǎo)致胰島素缺乏而引起的。I型糖尿病個體需要定期注射胰島素來控制血糖水平。如果這樣不能治療個體，則可能導(dǎo)致死亡。
以預(yù)防自身免疫病作為主要目標(biāo)，需要一個更長期的治療策略。
胰臟移植是目前唯一的可治愈I型糖尿病的療法，但是需要可能有毒的、終生使用的免疫抑制劑以及捐贈人的死亡都阻礙了該療法的應(yīng)用。
最近，在臨床上已經(jīng)利用骨髓(BM)或造血干細胞(HSC)移植治療重度自身免疫病(Burt等人，Blood 99768-784，2002)。在臨床前動物模型上，對自發(fā)性自身免疫病的有效治療需要從抗病株移植BM或HSC。迄今為止，這已經(jīng)通過同種異體BM移植(BMT)實現(xiàn)(Ikehara等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 827743-7747，1985；LaFace和Peck，Diabetes38894-901，1989；EI-Badri等人，Transplantation 70870-877，2000；Himeno和Good，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852235-2239，1998；Kirzner等人，Biol.Blood Marrow Transplant.6513-522，2000)，產(chǎn)生全部或混合的嵌合性(Li等人，J.Immunol.156380-388，1996；Kaufman等人，J.Immunol.1582435-2442，1997)。然而，對宿主細胞毒性條件形成(conditioning)的要求和移植物排斥(Castro-Malaspina等人，Blood991943-1951，2002)或移植物抗宿主病的危險(Ratanatharathorn等人，Bone Marrow Transplant 28121-129，2001)使得該方法不適合廣泛臨床應(yīng)用。
因此，需要發(fā)展防止自身免疫性糖尿病以及其它自身免疫病進展的其它策略和方法。
發(fā)明概述在本說明書中，除非上下文需要，否則單詞“包含(comprise)”或其變化形式(如“comprises”或“comprising”)可以被理解為包括所述組分或整體或一組組分或整體，但是不排除其它任何組分或整體或一組組分或整體。
使抗原靶向靜止的抗原呈遞細胞(APC)，如B細胞、樹突細胞、上皮細胞或巨噬細胞，被認為是誘導(dǎo)免疫無應(yīng)答性(耐受)和/或保護性免疫的一種方法。由于所有免疫細胞都來源于造血干細胞(HSC)和造血祖細胞(HPC)，根據(jù)本發(fā)明，提出編碼自身抗原的HSC和/或HPC將會發(fā)育為表達該自身抗原的APC。它們?nèi)缓笞鳛轭A(yù)防自身免疫病的抗原特異性治療。同系HSC和/或HPC移植使宿主不需要條件形成方案(conditioning regimens)，是預(yù)防或治療自身免疫病的一種新的安全、有效的策略。
對于自身免疫性糖尿病，胰島素原被認為是關(guān)鍵的自身抗原。
因此，根據(jù)本發(fā)明，編碼胰島素原的HSC和/或HPC的同系移植使得胰島素原能夠在靜止APC中表達，這可防止自身免疫性糖尿病的發(fā)展。這是一種安全、有效的抗原特異的策略，適用于自身免疫性糖尿病以及其它一些自身免疫病。
因此，本發(fā)明涉及一種方法，用于防止或者降低動物或鳥類種中發(fā)展自身免疫介導(dǎo)的疾病的危險，和/或降低疾病的嚴(yán)重程度。該方法包括從將要治療的動物或鳥類種中或者從相容的供體中采集HSC和/或HPC，遺傳修飾某些或全部HSC和/或HPC，使其表達編碼一種或多種與特定自身免疫病有關(guān)的自身抗原的遺傳物質(zhì)，并將它們導(dǎo)入將要治療的動物或鳥類種中。APC呈遞自身抗原被認為可誘導(dǎo)T細胞無應(yīng)答性或耐受和/或保護性免疫。HSC和/或HPC可以從骨髓中采集，或者從外周血、臍帶血或其它合適的部位如肝臟中分離。一旦遺傳修飾，通常即將這些細胞輸入實驗對象中，使得它們進入外周血。這種施用途徑包括輸注或者例如通過門靜脈導(dǎo)入肝臟中。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生抗原呈遞細胞(APC)的方法，該APC呈遞與自身免疫病有關(guān)的自身抗原，該方法包括從實驗對象中采集造血干細胞(HSC)和/或造血祖細胞(HPC)樣品，在一定條件下向一種或多種HSC和/或HPC內(nèi)導(dǎo)入編碼該自身抗原的遺傳物質(zhì)，在該條件下該遺傳物質(zhì)得到表達，致使HSC和/或HPC產(chǎn)生該自身抗原。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述自身免疫病是I型糖尿病。然而本發(fā)明也涉及許多自身免疫病。對于自身免疫性糖尿病，優(yōu)選的自身抗原是胰島素原或其抗原片段或部分。
最優(yōu)選的動物是人，但是本發(fā)明也涉及其它靈長類動物以及家畜、實驗動物、寵物(companion animals)、捕獲的野生動物和鳥類種，如籠養(yǎng)的(鳥舍)鳥類、家禽和獵鳥。
本發(fā)明提供多區(qū)室形式的試劑盒，該試劑盒包含適合接受來自實驗對象的HSC和/或HPC來源的第一個區(qū)室；適合包含編碼自身抗原的遺傳物質(zhì)的第二個區(qū)室；任選的適合包含試劑的第三個或更多的區(qū)室，其中該試劑盒包含方法使用說明書，該方法包括從實驗對象中采集造血干細胞(HSC)和/或造血祖細胞(HPC)樣品，在一定條件下向一種或多種HSC和/或HPC內(nèi)導(dǎo)入編碼該自身抗原的遺傳物質(zhì)，在該條件下該遺傳物質(zhì)得到表達，致使HSC和/或HPC產(chǎn)生該自身抗原。
表1提供了此處使用的縮寫列表。
表1縮寫
附圖簡述

圖1是一張圖示，顯示NOD-PI BM移植抑制糖尿病的發(fā)展。(A)與NOD BM(▲)(P＝0.003)或未處理的NOD小鼠(■)(P＝0.001)相比，NOD-PI BM()受者的糖尿病發(fā)病率顯著下降。NOD BM受者與未處理的對照沒有不同。數(shù)據(jù)來自兩個實驗，其中來自NOD-PI或NOD小鼠的BMT平行進行。(B)與T細胞消耗的NOD BM(▲)(P＝0.003)或未處理的NOD小鼠(■)(P＝0.036)相比，T細胞消耗的NOD-PI BM()受者的糖尿病發(fā)病率顯著下降。NOD BM受者與未處理的對照沒有不同。數(shù)據(jù)來自三個實驗，其中來自NOD-PI或NOD小鼠的BMT平行進行。
圖2是顯微照片和圖解表示，顯示移植T細胞消耗的NOD-PI BM預(yù)防胰島炎而不預(yù)防涎腺炎。(A)沒有炎癥浸潤的胰島(胰島炎)在NOD-PI BM受者中常見，而當(dāng)存在浸潤時，只局限于胰島周圍(箭頭)。(B)廣泛浸潤的胰島(*)在NOD BM受者中常見。(C)與NOD BM()細胞相比，T細胞消耗的NOD-PI BM(▲)的受者胰島炎顯著減少(P＝0.008)。包括年齡匹配的NOD(■)和NOD-PI(◆)小鼠的數(shù)據(jù)進行比較。(D)舌下腺炎癥病灶數(shù)量(涎腺炎得分)在BMT與未處理的小鼠之間沒有不同。各個小鼠的得分均來自兩個實驗，其中來自NOD和NOD-PI小鼠的BMT平行進行(水平線條表示平均值)。
圖3圖解顯示NOD-PI造血干細胞(HSC)或造血祖細胞(HPC)的轉(zhuǎn)移防止糖尿病的發(fā)展。(A)與NOD HSC受者(▲)(P＝0.019)或未處理的NOD小鼠(■)(P＝0.029)相比，NOD-PI HSC受者()的糖尿病發(fā)病率顯著降低。NOD HSC受者和未處理的NOD小鼠沒有顯著不同。(B)與NOD HPC受者(▲)(P＝0.035)或未處理的NOD小鼠(■)(P＝0.021)相比，NOD-PI HPC受者()的糖尿病發(fā)病率顯著降低。NOD HPC受者和未處理的NOD小鼠沒有顯著不同。數(shù)據(jù)來自一個(A)或者兩個(B)實驗，其中來自NOD-PI和NOD小鼠的BMT平行進行。
圖4提供圖示和列表數(shù)據(jù)，顯示T細胞消耗的NOD或NOD-PI BM的受者中外周血白細胞(PBL)的重建。(A)與未處理的年齡匹配的NOD小鼠(■)相比，NOD()和NOD-PI(▲)T細胞消耗的BM受者在照射和BMT后10-14天PBL明顯消耗，到第8周時重建。(B)在來自NOD或NOD-PI供者的T細胞消耗的BM的受者中，PBL亞群類似地重建，與年齡匹配的NOD對照相似。數(shù)據(jù)是兩個實驗的平均值±SD，其中來自NOD和NOD-PI小鼠的BMT平行進行。
圖5是顯示對卵清蛋白(OVA)免疫的T細胞回憶應(yīng)答的圖示。在BMT后100天，用OVA皮下免疫小鼠，14天后測定對脾T細胞的回憶應(yīng)答。在OVA存在下的T細胞增殖類似于年齡匹配的對照NOD小鼠(■)和T細胞消耗的NOD()或NOD-PI(▲)BM的受者?？招姆柋硎驹跊]有OVA的情況下的增殖。數(shù)據(jù)來自三個不同實驗中的個體小鼠，其中NOD和NOD-PI BMT平行進行。
圖6是在GM-CSF/IL-4或GM-CSF/TGF-β1中培養(yǎng)的BM的圖示，細胞在第5天收集，細胞表面標(biāo)志通過流式細胞術(shù)分析。數(shù)字表示屬于這四分之一的細胞的百分數(shù)(A)。GM-CSF/IL-4或GM-CSF/TGF-β1培養(yǎng)的BM在第5天收集，胞吞活性通過FITC-葡聚糖攝取法測定。曲線顯示來自GM-CSF/IL-4培養(yǎng)的BM的CD11c-門控細胞的FITC-葡聚糖攝取對CD86表達，或者大量GM-CSF/TGF-β1培養(yǎng)的BM的FITC-葡聚糖對CD11c表達(B)。BM在GM-CSF/TGF-β1中培養(yǎng)，在第5天收集細胞。在Gr-1+和CD11c+細胞上表達的細胞表面標(biāo)志用4色流式細胞術(shù)分析。左上點線圖顯示用于分析Gr-1+-門控和CD11c+-門控細胞的門控。直方圖覆蓋圖顯示Gr-1-門控的(陰影)和CD11c-門控的(空心)細胞(C)。來自G+T BM的iDC表達低水平的MHC II類和共刺激分子，在混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)中是弱刺激劑。
圖7是一張圖示，顯示當(dāng)靜脈內(nèi)轉(zhuǎn)移給4周齡雌性NOD小鼠時，來自NOD-PI而非對照NOD小鼠的G+T BM顯著抑制(β＜0.01)糖尿病的發(fā)展。
圖8是一系列流式細胞分析斑點印跡，顯示G+T BM除了CD11c+/CD11b+/Gr-1-iDC之外還含有大量未分化的CD11c-/CD11b+/Gr-1+骨髓細胞。
圖9是一張圖示，顯示編碼胰島素原的Gr-1+細胞抑制在4周時治療的糖尿病。
圖10是一張圖示，顯示編碼胰島素原的Gr-1+細胞抑制在4周時治療的糖尿病(1.8×106CD11c-消耗的，靜脈內(nèi))。
圖11是在體內(nèi)分化為CD11c+/MHC II類+DC的Gr-1+骨髓細胞的照片圖示。通過消耗CFSE-標(biāo)記的、直接注射到脾臟內(nèi)的CD11c+細胞，從GM-CSF/TGF-β1-培養(yǎng)的胰島素原-NOD BM中純化Gr-1+細胞。染色脾臟的冷凍切片，進行免疫熒光分析。CFSE標(biāo)記和抗體標(biāo)記的細胞的定位通過免疫熒光顯微鏡檢查進行。系列圖顯示CFSE標(biāo)記的細胞(左圖)、用德克薩斯紅偶聯(lián)的mAb顯示的細胞(中圖)和合并的圖像(右圖)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種安全、有效的治療和/或預(yù)防自身免疫病的方案。
該方案通常包括下列步驟(i)從實驗對象中采集HSC和/或HPC樣品；(ii)遺傳修飾所有或某些HSC和/或HPC，使得HSC和/或HPC產(chǎn)生一種或多種與自身免疫病有關(guān)的自身抗原；和(iii)將遺傳修飾的HSC和/或HPC導(dǎo)入同一實驗對象中或相容的實驗對象中，它們最終成為表達該自身抗原的APC。
上述步驟可以組合和/或改變順序。也可以包括其它步驟。
“實驗對象”如人類實驗對象，以及動物或鳥類實驗對象。用于所處理的動物時，術(shù)語“個體”和“實驗對象”可以互換使用?！皠游铩卑ㄈ?、靈長類動物、家畜(例如綿羊、馬、牛、馬、驢、山羊、豬)、實驗動物(例如兔、小鼠、大鼠、豚鼠)、寵物(例如狗、貓)或捕獲的野生動物。“鳥類種”包括籠養(yǎng)或鳥舍飼養(yǎng)的鳥類、家禽(例如雞、矮腳雞、鵝、火雞)和獵鳥。
在醫(yī)學(xué)上最優(yōu)選的動物是人。然而，本發(fā)明也涉及該方案減少非人類動物的自身免疫病的獸醫(yī)用途。
HSC和/或HPC通常從骨髓標(biāo)本中獲得，例如向髖骨內(nèi)鉆孔。然而，本發(fā)明進一步涉及從外周血(包括臍帶血和肝臟血液)中分離以及必要時分選HSC和HPC。通常將這些細胞導(dǎo)入受者中，例如，通過向外周血系統(tǒng)中注射或輸注，或者經(jīng)門靜脈注射或輸注到肝臟中。然而，直接導(dǎo)入受者的骨髓中雖然不是優(yōu)選的，但是本發(fā)明也包括。
對于從中分離HSC和/或HPC的動物種的實驗對象和接受這些細胞的實驗對象而言，本發(fā)明的方法可以是“同基因的”、“異基因的”或是“異種的”?！巴颉狈椒ㄊ侵缸鳛镠SC和/或HPC來源的實驗對象與經(jīng)遺傳修飾的HSC和/或HPC的受者有相同的MHC基因型?！爱惢颉狈椒ㄊ荋SC和/或HPC來自與將要導(dǎo)入HSC和/或HPC的實驗對象MHC-不相容的實驗對象?！爱惙N”方法是HSC和/或HPC來自與導(dǎo)入HSC和/或HPC的實驗對象不同的種。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法以同基因方法進行。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)使用異基因或異種方法時，可能必須修改此方案，使得可能由于外源免疫活性細胞混合引起的所有免疫應(yīng)答最小化。
因此，本發(fā)明涉及一種方法，用于防止或最小化實驗對象發(fā)展自身免疫病的危險，或者減少其嚴(yán)重程度，該方法包括向該實驗對象中導(dǎo)入遺傳修飾的HSC和/或HPC，使得它們產(chǎn)生一種或多種與該自身免疫病有關(guān)的自身抗原。
更具體而言，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生抗原呈遞細胞(APC)的方法，該APC呈遞與自身免疫病有關(guān)的自身抗原，該方法包括從實驗對象中采集造血干細胞(HSC)和/或造血祖細胞(HPC)樣品，在一定條件下向一種或多種HSC和/或HPC內(nèi)導(dǎo)入編碼該自身抗原的遺傳物質(zhì)，在該條件下該遺傳物質(zhì)得到表達，致使HSC和/或HPC產(chǎn)生該自身抗原。
HSC和/或HPC發(fā)育為表達特定自身抗原的APC。APC的例子包括但不限于樹突細胞、B淋巴細胞、上皮細胞或巨噬細胞。
如上所述，實驗對象包括人、非人類動物和鳥類實驗對象。優(yōu)選地，實驗對象是人。實驗對象(例如人)可能患有臨床前糖尿病，或者可能具有發(fā)展為糖尿病的危險，或者可能患有臨床糖尿病。
同樣如上所述，該方法可能包括對實驗對象同基因地、異基因地或異種地施用HSC和/或HPC。然而，同基因方案是優(yōu)選的。
因此，在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種方法，用于防止或最小化實驗對象發(fā)展自身免疫病的危險，或者減少其嚴(yán)重程度，該方法包括向該實驗對象中導(dǎo)入遺傳修飾的同基因HSC和/或HPC，它們產(chǎn)生一種或多種與該自身免疫病有關(guān)的自身抗原。
優(yōu)選的自身免疫病是自身免疫性糖尿病，也被稱為I型糖尿病或胰島素依賴型糖尿病。然而，本發(fā)明也涉及所述方案在治療多種自身免疫病中的用途。唯一的標(biāo)準(zhǔn)是知道與該疾病有關(guān)的自身抗原。此處涉及的自身免疫病的例子尤其包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、局限性腸炎、心肌病、溶血性貧血、纖維肌痛、格雷夫斯氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、血管炎、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、肌炎、中性粒細胞減少癥、銀屑病、慢性疲乏綜合征、幼年型關(guān)節(jié)炎、青少年糖尿病、硬皮病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、口腔干燥-風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎綜合征、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、橋本氏病、混合性結(jié)締組織病、間質(zhì)性膀胱炎、惡性貧血、白質(zhì)腦炎、斑禿、強直性脊柱炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、抗GBM腎炎、抗TBM腎炎、抗磷脂綜合征、風(fēng)濕性多肌痛、多肌炎、自身免疫性阿狄森氏病、慢性活動性肝炎、白癜風(fēng)、自身免疫性高脂血癥、自身免疫性心肌炎、顳動脈炎、自身免疫性甲狀腺病、軸突和神經(jīng)元神經(jīng)病、貝切特氏病、大皰性類天皰瘡、變應(yīng)性哮喘、骨關(guān)節(jié)炎、恰加斯氏病、葡萄膜炎、慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病(CIDP)、疤痕性類天皰瘡/良性黏膜類天皰瘡、寇甘氏綜合征、先天性心臟傳導(dǎo)阻滯、柯薩奇病毒性心肌炎、脫髓鞘性神經(jīng)病、皮肌炎、盤狀狼瘡、晶狀體抗原性色素層炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎、德雷斯勒氏綜合征、特發(fā)性混合型冷沉淀球蛋白血癥、埃文斯綜合征、肺出血腎炎綜合征、變應(yīng)性鼻炎、傳染性神經(jīng)元炎、低丙球蛋白血癥、包涵體肌炎、水泡大皰疹(vesiculobullous)皮膚病、韋格納肉芽腫、梅尼爾氏病、蘭伯特-伊頓綜合征、莫倫氏潰瘍、非典型乳糜瀉、眼疤痕性類天皰瘡、尋常型天皰瘡、靜脈周腦脊髓炎、心包切開術(shù)后綜合征、鞏膜炎、精子睪丸自身免疫、僵人綜合征、亞急性細菌心內(nèi)膜炎(SBE)、交感性眼炎、橫貫性脊髓炎和壞死性脊髓病、I型自身免疫性多腺性綜合征、II型自身免疫性多腺性綜合征、惡性貧血和子宮內(nèi)膜異位癥。
根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，本發(fā)明涉及一種方法，用于防止、最小化人類實驗對象發(fā)展自身免疫性糖尿病的危險，或者減少其嚴(yán)重程度，該方法包括對該人類實驗對象施用從該人類實驗對象或同基因?qū)嶒瀸ο笾蟹蛛x的有效量的HSC和/或HPC，這些HSC和/或HPC被遺傳修飾，使得它們表達與自身免疫性糖尿病有關(guān)的自身抗原。
優(yōu)選的自身抗原是胰島素原或其免疫原性同系物或抗原衍生物、局部、片段或部分。胰島素原通常來源于人，但是也涉及例如來自豬、綿羊、馬、山羊、小鼠或大鼠的人源化胰島素原分子。
根據(jù)一個最優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明提供一種方法，用于防止、最小化人類實驗對象發(fā)展自身免疫性糖尿病的危險，或者減少其嚴(yán)重程度，該方法包括對該人類實驗對象施用從該人類實驗對象或同基因?qū)嶒瀸ο笾蟹蛛x的有效量的HSC和/或HPC，這些HSC和/或HPC被遺傳修飾，使得它們產(chǎn)生胰島素原。
在此提出，同基因移植基因修飾的HSC和/或HPC是一種新的抗原特異的免疫治療方法，它發(fā)展了從造血區(qū)室內(nèi)調(diào)節(jié)自身免疫病的原理。
優(yōu)選地，所述自身免疫病是糖尿病，所述自身抗原是胰島素原，因為胰島素原含有與人類(Rudy等人，Mol.Med.1625-633，1995)和小鼠(Chen等人，J.Immunol.1674926-4935，2001)I型糖尿病有關(guān)的T細胞表位。在導(dǎo)致本發(fā)明的研究中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因表達通過MHC II類啟動子靶向APC的胰島素原的NOD小鼠(French等人，1997，同上)所含的骨髓能夠在對野生型NOD小鼠骨髓移植后過繼轉(zhuǎn)移針對自身免疫性糖尿病的保護。針對糖尿病的保護在接受NOD-PI小鼠骨髓的受者中強烈。通過轉(zhuǎn)移高度純化的HSC或HPC，保護可能是由移植的HSC/HPC的APC后代引起的，而不是在完整的或T細胞消耗的骨髓中轉(zhuǎn)移的其它潛在免疫調(diào)節(jié)細胞引起的。最重要的是，轉(zhuǎn)移少量遺傳修飾的HSC可完全預(yù)防糖尿病。HSC移植也證明野生型NOD HSC轉(zhuǎn)移的糖尿病是由于致糖尿病T細胞的從頭產(chǎn)生，而不是致糖尿病T細胞的轉(zhuǎn)移。但是，在預(yù)計APC表達胰島素原的小鼠中，致糖尿病T細胞顯然不會發(fā)育或者不能獲得效應(yīng)功能。這些結(jié)果證實了遺傳修飾的HSC作為自身免疫病預(yù)防的一種治療工具的原理。
發(fā)生抗原呈遞的背景控制T細胞免疫的平衡(Garza等人，J.Exp.Med.1912021-2027，2000；Frazer等人，J.Immunool 1676180-6187，2001)。靜止APC呈遞的抗原誘導(dǎo)T細胞的失活(Niimi等人，1998，同上；Finkelman等人，1996，同上；Hawiger等人，2001，同上)，并且抑制抗原特異性抗體的產(chǎn)生(Finkelman等人，1996，同上)。通過轉(zhuǎn)基因靶向的抗原表達，顯示樹突細胞(DC)在抗原特異性T細胞的胸腺消耗中起重要作用(Brocker等人，J.Exp.Med.185541-550，1997)。重要的是，也描述了在施用DC靶向抗原后周圍T細胞應(yīng)答的抑制(Finkelman等人1996，同上；Hawiger等人，2001，同上)?？刂?harness)外周免疫耐受機制的能力可能是用自身反應(yīng)性T細胞對實驗對象進行自身抗原特異性免疫治療的關(guān)鍵。
發(fā)明人利用放射對原粒細胞的調(diào)節(jié)順應(yīng)(conditioning)幫助供者HSC的最大移植，但是對于患有臨床前自身免疫性糖尿病的無癥狀者，這將不能接受。然而，由于不存在MHC障礙，該方法適合不需要毒性骨髓移植前調(diào)節(jié)順應(yīng)(conditioning)的方案。使用來源于轉(zhuǎn)基因小鼠的HSC，避免了對離體的遺傳工程HSC的需要，后者是HSC治療的一個主要障礙。為了人用，需要能夠有效轉(zhuǎn)導(dǎo)HSC的載體，以在移植后長期基因表達。通過人HSC的慢病毒-載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，基因表達能夠有效地針對體內(nèi)的MHC II類+APC(Cui等人，Blood 99399-408，2002)。因此，任選地在細胞因子誘導(dǎo)的活動化后，從外周血中采集HSC和/或HPC，遺傳修飾并且再輸注的策略是治療自身免疫病的優(yōu)選方法。
因此，本發(fā)明的另一方面涉及一種方法，用于治療人類糖尿病或者降低發(fā)展為該病的危險或者降低其嚴(yán)重程度，該方法包括(i)從外周血或骨髓中分離HSC和/或HPC，任選地包括細胞因子介導(dǎo)的HSC和/或HPC活動化的步驟；(ii)遺傳修飾該HSC和/或HPC，使得這些細胞產(chǎn)生胰島素原或其免疫原性同源物、抗原衍生物、局部、片段或部分，并且繼續(xù)作為APC；和(iii)將遺傳修飾的細胞輸注或?qū)肴祟悓嶒瀸ο笾小?br> 遺傳修飾HSC和/或HPC包括將編碼胰島素原或其它自身抗原的核酸分子導(dǎo)入細胞基因組內(nèi)。核酸分子通常是DNA。該DNA可以編碼一種全長自身抗原、多種全長自身抗原或者一種或多種攜帶抗原表位的自身抗原的一個或多個片段。
本發(fā)明的再另一方面提供一種載體，該載體可用于導(dǎo)入編碼一種自身抗原如胰島素原的遺傳物質(zhì)，該載體含有編碼該自身抗原或其抗原片段的核苷酸序列和一種選擇性標(biāo)記。
載體中的選擇性標(biāo)記允許篩選已經(jīng)穩(wěn)定摻有編碼自身抗原的DNA的靶細胞。當(dāng)使用相對低效的轉(zhuǎn)化技術(shù)如電穿孔、磷酸鈣沉淀和脂質(zhì)體融合時(1000個細胞中一般只有不到1個穩(wěn)定摻有外源DNA)，這是特別有用的。利用高效方法，如病毒載體和向核內(nèi)顯微注射，一般5-25％的細胞摻有DNA；因此，直接篩選靶細胞是可行的，而不需要首先根據(jù)選擇性標(biāo)記的穩(wěn)定整合篩選?？梢允褂玫然蚧蚍堑然駾NA。
選擇性標(biāo)記的例子包括提供對化合物如抗生素抗性的基因，提供在選擇的底物上生長的能力的基因，編碼產(chǎn)生可檢測信號如發(fā)光的蛋白質(zhì)的基因。已經(jīng)知道并且可以使用許多這樣的標(biāo)記，包括，例如抗生素抗性基因，如新霉素抗性基因(neo)和潮霉素抗性基因(hyg)。選擇性標(biāo)記也包括提供在某些介質(zhì)底物上生長的能力的基因，如tk基因(胸苷激酶)或hprt基因(次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶)，它們提供在HAT培養(yǎng)基(次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷)上生長的能力；和細菌gpt基因(鳥嘌呤/黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶)，它允許在MAX培養(yǎng)基(霉酚酸、腺嘌呤和黃嘌呤)上生長。供哺乳動物細胞使用的其它一些選擇性標(biāo)記和攜帶多種選擇性標(biāo)記的質(zhì)粒在Sambrook等人，Molecular Cloning-A LaboratoryManual，Cold Spring Harbour，New York，USA，1990中描述。
選擇性標(biāo)記可能依賴其自身的啟動子進行表達，標(biāo)記基因可能來源于與目標(biāo)生物非常不同的生物(例如在目標(biāo)哺乳動物細胞中使用的原核標(biāo)記基因)。然而，優(yōu)選地將原來的啟動子替換為已知在受者細胞中起作用的轉(zhuǎn)錄機器。有大量轉(zhuǎn)錄起始區(qū)可用于這些目的，包括，例如金屬硫蛋白啟動子、胸苷激酶啟動子、β-肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、SV40啟動子和人巨細胞病毒啟動子。一個廣泛使用的例子是pSV2-neo質(zhì)粒，它含有在SV40早期啟動子控制下的細菌新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，賦予哺乳動物細胞對G418(與新霉素有關(guān)的一種抗生素)的抗性。可以利用其它大量變異來提高選擇性標(biāo)記基因在動物細胞中的表達，如添加poly(A)序列，添加合成翻譯起始序列。組成型和誘導(dǎo)型啟動子都可以使用。
該DNA優(yōu)選地通過同源重組修飾。靶DNA可能位于HSC或HPC的任何細胞器中，包括核和線粒體，可以是完整的基因、外顯子或內(nèi)含子、調(diào)節(jié)序列或基因之間的任何區(qū)域。
同源DNA是與參照DNA序列至少70％相同的DNA序列。兩個序列同源的一個標(biāo)志是它們在嚴(yán)格條件下可彼此雜交(Sambrook等人，1990，同上)。
本發(fā)明也提供一種多區(qū)室形式的試劑盒，該試劑盒包含適合接受來自實驗對象的HSC和/或HPC來源的第一個區(qū)室；適合包含編碼一種自身抗原的遺傳物質(zhì)的第二個區(qū)室；任選的適合包含試劑的第三個或更多的區(qū)室，其中該試劑盒包含一種方法的使用說明書，該方法包括從實驗對象中采集造血干細胞(HSC)和/或造血祖細胞(HPC)樣品，在一定條件下向一種或多種HSC和/或HPC內(nèi)導(dǎo)入編碼該自身抗原的遺傳物質(zhì)，在該條件下該遺傳物質(zhì)得到表達，致使HSC和/或HPC產(chǎn)生該自身抗原。
在一個有關(guān)方面，本發(fā)明進一步提供一種藥物試劑盒，其含有適用于從外周血或骨髓中分離HSC和/或HPC的試劑和/或區(qū)室；為了表達編碼胰島素原或其抗原部分或另外一種與自身免疫性糖尿病有關(guān)的自身抗原的DNA，對它們的遺傳操作；和/或?qū)⑦z傳修飾的細胞再導(dǎo)入實驗對象的外周血系統(tǒng)或骨髓中的單元。
本發(fā)明通過下列非限制性實施例進一步描述。
實施例1一般方法小鼠NOD(非肥胖糖尿病)和NOD.scid小鼠在無特定病原體條件下飼養(yǎng)。在MHC II類(I-Eα)啟動子控制下的小鼠胰島素原II的轉(zhuǎn)基因NOD小鼠(NOD-PI)(French等人，Diabetes 4634-39，1997)在培育為純合子后使用。由于自發(fā)性糖尿病的發(fā)病率在野生型NOD雌性中最高，因此只使用雌性作為受者和骨髓(BM)供者。
抗體和流式細胞術(shù)流式細胞分析如(Steptoe等人，J.Immunol.1685032-5041，2002)所述進行。下列單克隆抗體從組織培養(yǎng)上清液中純化，然后在偶聯(lián)反應(yīng)中使用抗Gr-1抗體(Ly-6G；RB6-8C5)、F4/80(F4/80)、CD11b(5C6或M1/70)、CD11c(N418)、MHC II類(10.2.16[I-Ak，g7，r，f，s])、MHC I類(M1/42)、M-CSF R(AFS-98)、CD40(FGK-45)、B220(RA3-6B2)和CD86(GL-1)鏈霉抗生物素(SA)-熒光染料偶聯(lián)物(SA-FITC、SA-藻紅蛋白、SA-別藻藍蛋白、SA-得克薩斯紅)、抗CD4(CT-CD4)、CD8α(CT-CD8α)的單克隆抗體，F(xiàn)ITC、PE和Tricolor鏈霉抗生物素偶聯(lián)物來自Caltag(Burlingame，CA)。抗-CD3(145-2C11)，SCA-1(E13-161.7)、CD40(3/23)、MAC-3(M3/84)、CD13(R3-242)、CD62-L(MEL-14)、CD31(MEC13.3)、CD43(S7)、CD11a(2D7)、CD49d(R1-2)的單克隆抗體購自PharMingen(San Diego，CA)。另外也使用抗小鼠FIRE、抗-CD3(KT3)、c-kit(ACK-2)。
為了分析PBL，用細玻璃毛細管對小鼠眼眶后靜脈竇穿刺進行采血。將血液收集在Alsever′s抗凝血劑中，裂解紅細胞，染色白細胞，通過流式細胞術(shù)進行分析。根據(jù)獲得的血容量校正用血細胞計數(shù)器測定的白細胞數(shù)。為了控制實驗間變異，每次分析包括三只年齡匹配的雌性NOD。將脾臟壓過不銹鋼網(wǎng)，細胞懸浮在含有10％v/v FCS的RPMI中。
BM制備和轉(zhuǎn)移小鼠(8-12周齡)施行安樂死，股骨和脛骨收集到小鼠滲壓冷磷酸緩沖鹽液(PBS)中。BM用冰冷的含有2.5％v/v FCS(F2.5)(TraceScientific，Melbourne Australia)的PBS沖洗，通過NH4Cl/TRIS緩沖液裂解除去紅細胞。BM在F2.5中洗滌，離心收集。為了消耗T細胞，BM重懸浮于F2.5中，在4℃下與抗-CD3 mAb(KT3，5μg/ml)溫育30分鐘，然后用F2.5洗滌?？贵w標(biāo)記的細胞用抗大鼠IgG免疫磁珠(Dynabeads，Dynal Biotech，Carlton South，Victoria，Australia)消耗。對于分選的HSC或HPC，譜系標(biāo)記陽性的細胞用預(yù)定最佳濃度的FITC-偶聯(lián)的譜系特異性mAb(KT3、M1/70、RA3.6B2、RB6-8C5、TER-119)混合物通過免疫磁珠消耗。其余的細胞用抗-c-kit-藻紅蛋白標(biāo)記。為了分離HSC，譜系消耗的細胞也用抗-SCA-1-生物素共染色，洗滌，用鏈霉抗生物素-Tricolor染色。Lin-/c-kit+/SCA-1+(HSC)或iin-/c-kit+(HPC)細胞通過無菌分選收集(FACSII，Becton Dickinson，San Diego，CA)。照射的小鼠間隔2-3小時分兩次相等劑量，接受總共950cGy(Theratron60Co，Theratronics，Kanata，ON，Canada)。細胞(107BM或T細胞消耗的BM，除非另外說明)懸浮于PBS中，對于照射的小鼠，在照射1-3小時后，腹膜內(nèi)注射250μl或者靜脈內(nèi)注射100μl HSC(103)和HPC(2.5×104)。照射的小鼠在BMT后保持添加新霉素的飲用水3周。在BMT后緊接階段顯示身體應(yīng)激指征的所有小鼠都施以安樂死，并從分析中排除。
T細胞回憶應(yīng)答用完全弗氏佐劑(Difco，Detroit，MI)中的100μg卵清蛋白(OVA)(Grade V，Sigma St Louis，MO)在脅部皮下免疫小鼠。14天后從安樂死的小鼠中收集的脾臟壓過不銹鋼網(wǎng)，將細胞懸浮于含有10％v/v FCS(Trace Scientific，Melbourne Australia)、10-3M丙酮酸鈉、10-4M非必需氨基酸(GIBCO)、2×10-3M谷氨酰胺、5×10-5M 2-巰基乙醇(Sigma)的RPMI培養(yǎng)基(GIBCO，Rockville，MA)中。在存在或不存在OVA(100μg/ml)的情況下一式三份平板接種脾細胞(2.5×105細胞/孔，200μl，96孔平底板)。第4天將細胞收集到玻璃濾器墊上。在最后18小時培養(yǎng)過程中加入3H-胸苷(1μCi/孔)。用閃爍計數(shù)器(Topcount，Packard，Groningen，The Netherlands)測量反映細胞增殖的摻入的放射性，結(jié)果表示為平均刺激指數(shù)(SI)±標(biāo)準(zhǔn)差。
糖尿病的監(jiān)測每周用Diastix檢驗條(Bayer，Pymble，NSW Australia)尿檢小鼠的葡萄糖。對于糖尿病小鼠，用一種儀器(Accu-Chek，Roche，Castle Hill，NSW，Australia)測量血糖。當(dāng)連續(xù)兩次血糖讀數(shù)均＞12.0mM時，認為小鼠患有糖尿病。當(dāng)小鼠患糖尿病或者顯示身體應(yīng)激指征時，對其施行安樂死。
胰島炎和涎腺炎的評價從安樂死的小鼠中取出胰腺，置于Bouin′s固定劑中24小時，然后轉(zhuǎn)移到70％v/v乙醇中。固定的組織包埋于石蠟中，制備間隔250-300μm的H&E染色的切片。胰島炎如(Leiter，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79630-634，1982)所述以隱蔽方式(masked fashion)打分。取出舌下腺，如胰腺所述制備。計數(shù)存在的炎癥病灶的數(shù)量，表示為每個切片的平均數(shù)。
統(tǒng)計學(xué)分析卡普蘭-邁耶存活曲線的比較用時序檢驗進行(GraphPad Prism，GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)。BMT組之間的胰島炎得分通過Student-t-檢驗比較。
實施例2NOD-PI骨髓移植防止糖尿病將來自NOD或NOD-PI小鼠的全BM移植給照射的4周齡雌性NOD受者。發(fā)病略微延遲，而NOD BM受者的糖尿病總發(fā)病率(7/12)類似于未處理的對照(15/23)(圖1A)。相反，對于NOD-PI BM受者，糖尿病幾乎被完全防止(1/16，P＝0.0032)(圖1A)。NOD小鼠具有固有的發(fā)展胸腺瘤的高危險，可因免疫監(jiān)視受損或者暴露于致電離輻射而加重(Prochazka等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 893290-3294，1992；Shultz等人，J.Immunol.1642496-2507，2000)。排除尸檢診斷為胸腺瘤的小鼠提高了這兩組中糖尿病小鼠的比例(NOD 7/10，NOD-PI 1/5)，但是這兩組之間糖尿病發(fā)病率的差異仍然顯著(P＝0.041)。由于它們的無糖尿病存活期較長，NOD-PI BM受者的胸腺瘤比例(11/16)高于NOD BM受者(2/12)。
實施例3T細胞消耗不改變移植的NOD-PI BM的保護作用不同的研究發(fā)現(xiàn)，NOD BM中的成熟T細胞能夠?qū)⑻悄虿∞D(zhuǎn)移給免疫缺陷的NOD.scid小鼠。因此，在轉(zhuǎn)移整個BM之后，糖尿病的發(fā)展可能反映轉(zhuǎn)移的成熟T細胞的致糖尿病能力。但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，完整NOD BM將糖尿病轉(zhuǎn)移給至少50％的未照射的T細胞缺陷NOD.scid小鼠，而接受來自NOD-PI小鼠的BM的小鼠均未發(fā)展為糖尿病。
由于NOD BM中的成熟T細胞能夠轉(zhuǎn)移糖尿病，而NOD-PI中的成熟T細胞不能，檢測了將T細胞消耗的BM移植給照射的4周齡小鼠的作用。T細胞消耗的NOD BM的受者發(fā)展為糖尿病的比率和發(fā)病率(10/15)類似于未處理的對照(7/12)(圖1B)。相反，T細胞消耗的NOD-PI BM受者的糖尿病發(fā)展顯著較低(3/17，P＝0.003)(圖1B)。當(dāng)從分析中除去尸檢確定為胸腺瘤的小鼠時，組間差異仍然在統(tǒng)計學(xué)上顯著(P＝0.012)。
BMT(1×107T細胞消耗的BM)后100天評價胰島的細胞免疫浸潤(胰島炎)。在NOD-PI T細胞消耗的BM的受者中，54％的胰島沒有胰島炎(圖2A)，單核細胞浸潤只局限于胰島周圍(胰周炎)。相反，在NODT細胞消耗的BM的受者中，只有28％的胰島沒有胰島炎，向胰島內(nèi)廣泛浸潤(圖2B)。如下事實反映了這些發(fā)現(xiàn)與NOD受者相比，NOD-PI的平均胰島炎得分顯著降低(P＝0.008)(圖2C)。在移植5×106T細胞消耗的BM后觀察到類似的結(jié)果。與胰島炎不同，在NOD-PI或NOD T細胞消耗的BM的受者和年齡匹配的未處理對照中，舌下腺的單核細胞浸潤(涎腺炎)相似(圖2D)。這表明NOD-PI BM轉(zhuǎn)移特異地保護胰島的自身免疫性。
實施例4編碼PI的造血干細胞和祖細胞轉(zhuǎn)移糖尿病預(yù)防從NOD和NOD-PI BM中無菌純化造血干細胞(lin-/c-kit+/SCA-1+)或祖細胞(HPC)(lin-/c-kit+)。為了測定它們對糖尿病發(fā)展的影響，將少量HSC或HPC移植到照射的4周齡受者中。造血重建迅速，PBL群體到BMT后8周恢復(fù)。在NOD-PI HSC受者中糖尿病被完全預(yù)防，在NOD-PI HPC受者中，其發(fā)病率顯著下降(圖3)。
實施例5NOD-PI BM預(yù)防糖尿病不是由于免疫重建受損為了排除NOD-PI BMT的保護作用是免疫重建受損的結(jié)果的可能性，首先分析了外周血白細胞(PBL)群體。T細胞消耗的BMT后10-14天，NOD和NOD-PI受者的循環(huán)白細胞數(shù)量大大減少(圖4A)。相對于年齡匹配的對照，T淋巴細胞(CD4+，CD8+)與B淋巴細胞(B220+)的比例下降(分別為50-75％、25％和80-85％)，而骨髓(CD11b+)細胞的比例提高約2.5倍。在BMT后8周和16周，總PBL計數(shù)(圖4A)和PBL亞群的相對比例(圖4B)正常，表明這些組之間的重建相似。然后研究了BMT受者產(chǎn)生T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力。年齡匹配的正常NOD小鼠和NOD或NOD-PI T細胞消耗的BM的受者在BMT后100天用卵清蛋白(OVA)免疫。兩周后，未處理的小鼠和任一BMT組對OVA的體外回憶應(yīng)答類似(圖5)。因此，NOD-PI BMT與免疫重建受損的證據(jù)無關(guān)。
實施例6細胞因子刺激的骨髓細胞含有未分化的DC前體作為“未成熟”DC(iDC)的一個來源，在GM-CSF和TGF-beta(G+T)中培養(yǎng)BM。這些培養(yǎng)物含有細胞型混合物，主要是具有環(huán)形或破碎的核的小圓細胞，它們表達骨髓分化標(biāo)記Gr-1，具有未分化的骨髓前體特有的特征。少部分細胞具有單核細胞樣或未成熟DC樣外觀，表達低水平的MHC II類，主要限于細胞內(nèi)顆粒。為了進一步確定這些細胞亞群，在GM-CSF/TGF-β1與GM-CSF/IL-4之間進行培養(yǎng)的BM的比較，因為后者含有表型成熟的和未成熟的DC的混合物以及少量未分化的骨髓細胞。與在GM-CSF/IL-4中培養(yǎng)的BM細胞不同，在GM-CSF/TGF-β1中培養(yǎng)的BM只含有低頻率的表達DC特異性標(biāo)志CD11c的細胞(見圖6A)，其余的幾乎含有全部Gr-1+細胞。在GM-CSF/TGF-β1-培養(yǎng)的BM中在CD11c+DC上表達的抗原呈遞(MHC II類)和共刺激分子(CD86和CD40)的水平較低，類似于在GM-CSF/IL-4中產(chǎn)生的表型未成熟的DC(見圖6A)。功能未成熟的(CD11c+/CD86lo)DC的一個特點——內(nèi)吞活性，通過FITC葡聚糖攝取法測定。在添加GM-CSF/IL-4的培養(yǎng)物中，只有CD11c+/CD86lo未成熟DC具有內(nèi)吞活性；在添加GM-CSF/TGF-β1的培養(yǎng)物中，只有CD11c+細胞具有內(nèi)吞活性。
來自G+T BM的iDC表達低水平的MHC II類和共刺激分子(圖6)，在混合淋巴細胞反應(yīng)中是弱刺激劑。來自NOD-PI小鼠的G+T BM在靜脈內(nèi)轉(zhuǎn)移給4周齡雌性NOD小鼠時顯著抑制(p＜0.01)糖尿病發(fā)展，而來自非對照NOD小鼠的G+T BM不能(圖7)。進一步的研究表明，G+TBM除了CD11c+/CD11b+/Gr-1-iDC之外還含有大量未分化的CD11c-/CD11b+/Gr-1+骨髓細胞(圖8)。
實施例7前體DCGr-1+細胞的消耗削弱了G+T BM抑制糖尿病的能力，而CD11c+iDC的消耗則不然(圖9)。從NOD-PI中(p＜0.01)而不是從對照NOD小鼠中轉(zhuǎn)移純化的Gr-1+骨髓細胞在受者小鼠中抑制糖尿病的發(fā)展，證實這些細胞的保護作用(圖10)。
與iDC不同，CD11c-/CD11b+/Gr-1+骨髓細胞不會響應(yīng)激活刺激(LPS、抗-CD40)快速獲得成熟CD11c+/CD86hi表型。相反，它們在GM-CSF/IL-4/TNF-α中培養(yǎng)5-7天中逐漸獲得成熟DC特征。因此，G+T BM培養(yǎng)物中存在的CD11c-/CD11b+/Gr-1+細胞代表DC前體。因此，上述數(shù)據(jù)表明，編碼一種疾病特異性自身抗原(胰島素原)的骨髓DC前體能夠預(yù)防自身免疫病。
實施例8骨髓細胞在體內(nèi)分化為CD11c+/MHC II類+DC為了測定轉(zhuǎn)移的細胞的體內(nèi)分化和存活率，通過消耗CD11c+細胞，從GM-CSF/TGF-β1-培養(yǎng)的胰島素原-NOD BM中純化Gr1+細胞。然后用CFSE標(biāo)記這些細胞，直接注射到脾臟內(nèi)。染色脾臟冷凍切片進行免疫熒光分析。CFSE-和抗體標(biāo)記的細胞(MHC II類、CD11c、CD11b或GR-1)的定位用免疫熒光顯微術(shù)進行。圖11證明了CFSE和檢測的所有4種標(biāo)記染色陽性的細胞的鑒定。左圖顯示CFSE標(biāo)記的細胞，中圖顯示用德克薩斯紅偶聯(lián)的單克隆抗體顯示的細胞，右圖顯示合并的圖像。右圖中存在亮白斑點表明雙染色(Dual stating)。
免疫組織學(xué)從冷凍的OCT包埋的(Tissue-Tek，Miles Inc.Elkhart，IN)組織上切割冷凍切片(5μm)，風(fēng)干，在免疫染色或封固(mounting)之前用100％冷乙醇固定?？股锼氐鞍?生物素結(jié)合部位用抗生物素蛋白/生物素阻斷劑封閉(Vector，Burlingame，CA)，非特異性蛋白質(zhì)相互作用用1％BSA阻斷。生物素化的第一抗體以預(yù)定的最佳濃度在室溫下使用1小時。洗滌后，再使用鏈霉抗生物素-HRP(vector ABC-Elite，Vector，Burlingame，CA)或鏈霉抗生物素-德克薩斯紅1小時。洗滌免疫過氧化物酶載玻片，用酶底物(VectorRed，Vector，Burlingame，CA)顯色。漂洗免疫熒光載玻片，在抗褪色劑(DAKO Corp.，Carpinteria，CA)中封固。
細胞離心涂片(Cytospin)用cytofuge(Shandon，Pittsburgh，PA)制備細胞離心涂片。細胞離心涂片用Diff Quik(Lab Aids Pty Ltd，Narrabeen，NSW Australia)染色，或者如上所述通過免疫組化染色。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，此處所述的本發(fā)明容易進行除具體描述之外的變化和修改。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明包括所有這些變化和修改。本發(fā)明也單個地或者集體地包括本說明書中提到的或者指出的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及任何兩個或兩個以上所述步驟或特征的任意和全部組合。
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權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生抗原呈遞細胞(APC)的方法，該APC呈遞與自身免疫病有關(guān)的自身抗原，該方法包括從實驗對象中采集造血干細胞(HSC)和/或造血祖細胞(HPC)樣品，在一定條件下向一種或多種HSC和/或HPC內(nèi)導(dǎo)入編碼該自身抗原的遺傳物質(zhì)，在所述條件下該遺傳物質(zhì)得到表達，致使HSC和/或HPC產(chǎn)生該自身抗原。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述APC選自樹突細胞、B淋巴細胞、上皮細胞、單核細胞和巨噬細胞。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述APC是樹突細胞。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述實驗對象選自人、靈長類動物、綿羊、馬、牛、驢、豬、山羊、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、貓、鳥、雞、矮腳雞、鵝和火雞。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述實驗對象是人。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述HSC和/或HPC的來源選自髖骨骨髓、骨髓、臍帶血、來自肝臟的血液、來自組織的血液和PBMC。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述HSC和HPC來源于髖骨骨髓。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述自身抗原與如下疾病有關(guān)，所述疾病選自胰島素依賴型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、局限性腸炎、心肌病、溶血性貧血、纖維肌痛、格雷夫斯氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、血管炎、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、肌炎、中性粒細胞減少癥、銀屑病、慢性疲乏綜合征、幼年型關(guān)節(jié)炎、青少年糖尿病、硬皮病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、口腔干燥-風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎綜合征、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、橋本氏病、混合性結(jié)締組織病、間質(zhì)性膀胱炎、惡性貧血、白質(zhì)腦炎、斑禿、強直性脊柱炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、抗GBM腎炎、抗TBM腎炎、抗磷脂綜合征、風(fēng)濕性多肌痛、多肌炎、自身免疫性阿狄森氏病、慢性活動性肝炎、白癜風(fēng)、自身免疫性高脂血癥、自身免疫性心肌炎、顳動脈炎、自身免疫性甲狀腺病、軸突和神經(jīng)元神經(jīng)病、貝切特氏病、大皰性類天皰瘡、變應(yīng)性哮喘、骨關(guān)節(jié)炎、恰加斯氏病、葡萄膜炎、慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病(CIDP)、疤痕性類天皰瘡/良性黏膜類天皰瘡、寇甘氏綜合征、先天性心臟傳導(dǎo)阻滯、柯薩奇病毒性心肌炎、脫髓鞘性神經(jīng)病、皮肌炎、盤狀狼瘡、晶狀體抗原性色素層炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎、德雷斯勒氏綜合征、特發(fā)性混合型冷沉淀球蛋白血癥、埃文斯綜合征、肺出血腎炎綜合征、變應(yīng)性鼻炎、傳染性神經(jīng)元炎、低丙球蛋白血癥、包涵體肌炎、水泡大皰疹皮膚病、韋格納肉芽腫、梅尼爾氏病、蘭伯特-伊頓綜合征、莫倫氏潰瘍、非典型乳糜瀉、眼疤痕性類天皰瘡、尋常型天皰瘡、靜脈周腦脊髓炎、心包切開術(shù)后綜合征、鞏膜炎、精子睪丸自身免疫、僵人綜合征、亞急性細菌心內(nèi)膜炎(SBE)、交感性眼炎、橫貫性脊髓炎和壞死性脊髓病、I型自身免疫性多腺性綜合征、II型自身免疫性多腺性綜合征、惡性貧血和子宮內(nèi)膜異位癥。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述自身免疫病是胰島素依賴型糖尿病。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述自身抗原是胰島素原或其免疫原性同源物、局部、片段或部分。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述胰島素原是人源的。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述胰島素原是人源化胰島素原，其中該胰島素原的來源選自牛、豬、綿羊、馬、山羊、小鼠和大鼠。
13.一種預(yù)防或治療實驗對象的自身免疫病的方法，包括向該實驗對象中引入呈遞與自身免疫病有關(guān)的自身抗原的APC，該方法包括從該實驗對象中采集造血干細胞(HSC)和/或造血祖細胞(HPC)樣品，在一定條件下向一種或多種HSC和/或HPC內(nèi)導(dǎo)入編碼該自身抗原的遺傳物質(zhì)，在該條件下該遺傳物質(zhì)得到表達，致使HSC和/或HPC產(chǎn)生該自身抗原。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述APC選自樹突細胞、B淋巴細胞、上皮細胞、單核細胞和巨噬細胞。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述APC是樹突細胞。
16.權(quán)利要求13的方法，其中所述實驗對象選自人、靈長類動物、綿羊、馬、牛、驢、豬、山羊、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、貓、鳥、雞、矮腳雞、鵝和火雞。
17.權(quán)利要求13的方法，其中所述實驗對象是人。
18.權(quán)利要求13的方法，其中所述細胞的來源選自髖骨骨髓、骨髓、臍帶血、來自肝臟的血液、來自組織的血液和PBMC。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述細胞來源于髖骨骨髓。
20.權(quán)利要求13的方法，其中所述自身抗原與如下疾病有關(guān)，所述疾病選自I型糖尿病或胰島素依賴型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、局限性腸炎、心肌病、溶血性貧血、纖維肌痛、格雷夫斯氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、血管炎、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、肌炎、中性粒細胞減少癥、銀屑病、慢性疲乏綜合征、幼年型關(guān)節(jié)炎、青少年糖尿病、硬皮病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、口腔干燥-風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎綜合征、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、橋本氏病、混合性結(jié)締組織病、間質(zhì)性膀胱炎、惡性貧血、白質(zhì)腦炎、斑禿、強直性脊柱炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、抗GBM腎炎、抗TBM腎炎、抗磷脂綜合征、風(fēng)濕性多肌痛、多肌炎、自身免疫性阿狄森氏病、慢性活動性肝炎、白癜風(fēng)、自身免疫性高脂血癥、自身免疫性心肌炎、顳動脈炎、自身免疫性甲狀腺病、軸突和神經(jīng)元神經(jīng)病、貝切特氏病、大皰性類天皰瘡、變應(yīng)性哮喘、骨關(guān)節(jié)炎、恰加斯氏病、葡萄膜炎、慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病(CIDP)、疤痕性類天皰瘡/良性黏膜類天皰瘡、寇甘氏綜合征、先天性心臟傳導(dǎo)阻滯、柯薩奇病毒性心肌炎、脫髓鞘性神經(jīng)病、皮肌炎、盤狀狼瘡、晶狀體抗原性色素層炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎、德雷斯勒氏綜合征、特發(fā)性混合型冷沉淀球蛋白血癥、埃文斯綜合征、肺出血腎炎綜合征、變應(yīng)性鼻炎、傳染性神經(jīng)元炎、低丙球蛋白血癥、包涵體肌炎、水泡大皰疹皮膚病、韋格納肉芽腫、梅尼爾氏病、蘭伯特-伊頓綜合征、莫倫氏潰瘍、非典型乳糜瀉、眼疤痕性類天皰瘡、尋常型天皰瘡、靜脈周腦脊髓炎、心包切開術(shù)后綜合征、鞏膜炎、精子睪丸自身免疫、僵人綜合征、亞急性細菌心內(nèi)膜炎(SBE)、交感性眼炎、橫貫性脊髓炎和壞死性脊髓病、I型自身免疫性多腺性綜合征、II型自身免疫性多腺性綜合征、惡性貧血和子宮內(nèi)膜異位癥。
21.權(quán)利要求13的方法，其中所述自身免疫病是胰島素依賴型糖尿病。
22.權(quán)利要求13的方法，其中所述自身抗原是胰島素原或其免疫原性同源物、局部、片段或部分。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述胰島素原是人源的。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所述胰島素原是人源化胰島素原，其中該胰島素原的來源選自豬、牛、綿羊、馬、山羊、小鼠和大鼠。
25.一種治療或預(yù)防實驗對象的自身免疫病的方法，包括(a)從實驗對象中采集造血干細胞(HSC)和/或造血祖細胞(HPC)樣品；(b)在一定條件下向一種或多種HSC和/或HPC內(nèi)導(dǎo)入編碼所述自身抗原的遺傳物質(zhì)，在該條件下該遺傳物質(zhì)得到表達，致使HSC和/或HPC產(chǎn)生該自身抗原；和(c)將所述遺傳修飾的細胞輸注或者導(dǎo)入該實驗對象內(nèi)。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述HSC和/或HPC經(jīng)歷細胞因子介導(dǎo)的活動化。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述實驗對象選自人、靈長類動物、綿羊、馬、牛、驢、豬、山羊、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、貓、鳥、雞、矮腳雞、鵝和火雞。
28.權(quán)利要求25的方法，其中所述實驗對象是人。
29.權(quán)利要求25的方法，其中所述HSC和/或HPC的來源選自髖骨骨髓、骨髓、臍帶血、來自肝臟的血液、來自組織的血液和PBMC。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述HSC和/或HPC來源于髖骨骨髓。
31.權(quán)利要求25的方法，其中所述自身抗原與如下疾病有關(guān)，所述疾病選自I型糖尿病或胰島素依賴型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、局限性腸炎、心肌病、溶血性貧血、纖維肌痛、格雷夫斯氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、血管炎、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、肌炎、中性粒細胞減少癥、銀屑病、慢性疲乏綜合征、幼年型關(guān)節(jié)炎、青少年糖尿病、硬皮病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、口腔干燥-風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎綜合征、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、橋本氏病、混合性結(jié)締組織病、間質(zhì)性膀胱炎、惡性貧血、白質(zhì)腦炎、斑禿、強直性脊柱炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、抗GBM腎炎、抗TBM腎炎、抗磷脂綜合征、風(fēng)濕性多肌痛、多肌炎、自身免疫性阿狄森氏病、慢性活動性肝炎、白癜風(fēng)、自身免疫性高脂血癥、自身免疫性心肌炎、顳動脈炎、自身免疫性甲狀腺病、軸突和神經(jīng)元神經(jīng)病、貝切特氏病、大皰性類天皰瘡、變應(yīng)性哮喘、骨關(guān)節(jié)炎、恰加斯氏病、葡萄膜炎、慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病(CIDP)、疤痕性類天皰瘡/良性黏膜類天皰瘡、寇甘氏綜合征、先天性心臟傳導(dǎo)阻滯、柯薩奇病毒性心肌炎、脫髓鞘性神經(jīng)病、皮肌炎、盤狀狼瘡、晶狀體抗原性色素層炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎、德雷斯勒氏綜合征、特發(fā)性混合型冷沉淀球蛋白血癥、埃文斯綜合征、肺出血腎炎綜合征、變應(yīng)性鼻炎、傳染性神經(jīng)元炎、低丙球蛋白血癥、包涵體肌炎、水泡大皰疹皮膚病、韋格納肉芽腫、梅尼爾氏病、蘭伯特-伊頓綜合征、莫倫氏潰瘍、非典型乳糜瀉、眼疤痕性類天皰瘡、尋常型天皰瘡、靜脈周腦脊髓炎、心包切開術(shù)后綜合征、鞏膜炎、精子睪丸自身免疫、僵人綜合征、亞急性細菌心內(nèi)膜炎(SBE)、交感性眼炎、橫貫性脊髓炎和壞死性脊髓病、I型自身免疫性多腺性綜合征、II型自身免疫性多腺性綜合征、惡性貧血和子宮內(nèi)膜異位癥。
32.權(quán)利要求25的方法，其中所述自身免疫病是胰島素依賴型糖尿病。
33.權(quán)利要求25的方法，其中所述自身抗原是胰島素原或其免疫原性同源物、局部、片段或部分。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述胰島素原是人源的。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述胰島素原是人源化胰島素原，其中該胰島素原的來源選自豬、牛、綿羊、馬、山羊、小鼠和大鼠。
36.一種多區(qū)室形式的試劑盒，該試劑盒包含適合接受來自實驗對象的HSC和/或HPC來源的第一個區(qū)室；適合包含編碼一種自身抗原的遺傳物質(zhì)的第二個區(qū)室；任選的適合包含試劑的第三個或更多的區(qū)室，其中該試劑盒包含一種方法的使用說明書，該方法包括從實驗對象中采集造血干細胞(HSC)和/或造血祖細胞(HPC)樣品，在一定條件下向一種或多種HSC和/或HPC內(nèi)導(dǎo)入編碼該自身抗原的遺傳物質(zhì)，在該條件下該遺傳物質(zhì)得到表達，致使HSC和/或HPC產(chǎn)生該自身抗原。
37.一種含有導(dǎo)入的APC的實驗對象，其中使用包括下列步驟的方法產(chǎn)生該APC從實驗對象中采集造血干細胞(HSC)和/或造血祖細胞(HPC)樣品，在一定條件下向一種或多種HSC和/或HPC內(nèi)導(dǎo)入編碼該自身抗原的遺傳物質(zhì)，在該條件下該遺傳物質(zhì)得到表達，致使HSC和/或HPC產(chǎn)生該自身抗原。
38.一種APC在生產(chǎn)用于治療自身免疫病的藥物中的用途，該APC已經(jīng)被遺傳修飾，呈遞與一種疾病有關(guān)的自身抗原，其中該APC由HSC和/或HPC產(chǎn)生。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的用途，其中所述APC選自樹突細胞、B淋巴細胞、上皮細胞、單核細胞和巨噬細胞。
40.權(quán)利要求2的用途，其中所述APC是樹突細胞。
41.權(quán)利要求38的用途，其中所述HSC和/或HPC的來源選自人、靈長類動物、綿羊、馬、牛、驢、豬、山羊、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、貓、鳥、雞、矮腳雞、鵝和火雞。
42.權(quán)利要求41的用途，其中所述HSC和/或HPC來源于人。
43.權(quán)利要求38的用途，其中所述HSC和/或HPC的來源選自髖骨骨髓、骨髓、臍帶血、來自肝臟的血液、來自組織的血液和PBMC。
44.權(quán)利要求38的用途，其中所述自身抗原與如下疾病有關(guān)，所述疾病選自I型糖尿病或胰島素依賴型糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、局限性腸炎、心肌病、溶血性貧血、纖維肌痛、格雷夫斯氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、血管炎、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、肌炎、中性粒細胞減少癥、銀屑病、慢性疲乏綜合征、幼年型關(guān)節(jié)炎、青少年糖尿病、硬皮病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、口腔干燥-風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎綜合征、風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、橋本氏病、混合性結(jié)締組織病、間質(zhì)性膀胱炎、惡性貧血、白質(zhì)腦炎、斑禿、強直性脊柱炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、抗GBM腎炎、抗TBM腎炎、抗磷脂綜合征、風(fēng)濕性多肌痛、多肌炎、自身免疫性阿狄森氏病、慢性活動性肝炎、白癜風(fēng)、自身免疫性高脂血癥、自身免疫性心肌炎、顳動脈炎、自身免疫性甲狀腺病、軸突和神經(jīng)元神經(jīng)病、貝切特氏病、大皰性類天皰瘡、變應(yīng)性哮喘、骨關(guān)節(jié)炎、恰加斯氏病、葡萄膜炎、慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病(CIDP)、疤痕性類天皰瘡/良性黏膜類天皰瘡、寇甘氏綜合征、先天性心臟傳導(dǎo)阻滯、柯薩奇病毒性心肌炎、脫髓鞘性神經(jīng)病、皮肌炎、盤狀狼瘡、晶狀體抗原性色素層炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎、德雷斯勒氏綜合征、特發(fā)性混合型冷沉淀球蛋白血癥、埃文斯綜合征、肺出血腎炎綜合征、變應(yīng)性鼻炎、傳染性神經(jīng)元炎、低丙球蛋白血癥、包涵體肌炎、水泡大皰疹皮膚病、韋格納肉芽腫、梅尼爾氏病、蘭伯特-伊頓綜合征、莫倫氏潰瘍、非典型乳糜瀉、眼疤痕性類天皰瘡、尋常型天皰瘡、靜脈周腦脊髓炎、心包切開術(shù)后綜合征、鞏膜炎、精子睪丸自身免疫、僵人綜合征、亞急性細菌心內(nèi)膜炎(SBE)、交感性眼炎、橫貫性脊髓炎和壞死性脊髓病、I型自身免疫性多腺性綜合征、II型自身免疫性多腺性綜合征、惡性貧血和子宮內(nèi)膜異位癥。
45.權(quán)利要求38的用途，其中所述自身免疫病是胰島素依賴型糖尿病。
46.權(quán)利要求38的用途，其中所述自身抗原是胰島素原或其免疫原性同源物、局部、片段或部分。
47.權(quán)利要求46的用途，其中所述胰島素原是人源的。
48.權(quán)利要求38的用途，其中所述胰島素原是一種人源化胰島素原，其中該胰島素原的來源選自豬、牛、綿羊、馬、山羊、小鼠和大鼠。
全文摘要
本發(fā)明一般地涉及一種方法，用于治療或緩解自身免疫病(例如，但是不限于自身免疫性糖尿病)的癥狀，或者降低或最小化發(fā)展為該疾病的危險。更具體而言，本發(fā)明涉及遺傳修飾的造血干細胞和/或造血祖細胞的用途，它們表達編碼一種或多種自身抗原的遺傳物質(zhì)，產(chǎn)生可誘導(dǎo)免疫耐受和/或保護性免疫的抗原呈遞細胞。因此本發(fā)明提供一種治療和/或預(yù)防自身免疫病如I型糖尿病的方法。
文檔編號A61K39/00GK1703505SQ03824822
公開日2005年11月30日 申請日期2003年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月16日
發(fā)明者R·J·斯特普托, L·C·哈里森 申請人:沃爾特及伊萊薩霍爾醫(yī)學(xué)研究院