專利名稱：一種防護(hù)和/或修復(fù)dna氧化損傷的組合物(rcud)及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種對(duì)于保護(hù)和/或修復(fù)DNA免于氧化損傷有用的組合物，所述組合物包含重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)，其中RCUD含有苯甲酸和己酸成分，組合物中氨的含量范圍是5-15mg/L，并選擇性含有抗氧化劑；以及一種使用權(quán)利要求1中的組合物保護(hù)和/或修復(fù)DNA免于氧化損傷的方法，所述方法包括以下步驟估計(jì)樣品中折疊的DNA的量，在DNA暴露在DNA氧化損傷試劑之前或者之后，將所述組合物混合到所述DNA中，并確定混合物中表示折疊的DNA的百分比，其表示了對(duì)DNA氧化損傷的防護(hù)和/或修復(fù)。
背景技術(shù)：
在吠陀經(jīng)中，將牛產(chǎn)品與神酒進(jìn)行了比較(梨俱吠陀10.15pp.47)。在印度草醫(yī)學(xué)中，牛尿是潘克戈亞(Panchagavya)的成分之一。根據(jù)沙許拉特(Susrut)，牛尿具有若干藥物特性(45/221，pp-61，72，220，221)。沙拉克(Charak)[斯洛卡(Solka)-100 pp.72]也描述了其性質(zhì)。牛尿被廣泛地應(yīng)用于印度草醫(yī)學(xué)中，用以純化否則會(huì)具有毒性的某些材料(pp.73)。然而，文獻(xiàn)和經(jīng)文中沒(méi)有提到尿或其蒸餾物作為保護(hù)細(xì)胞免受DNA損傷和染色體變異的保護(hù)者的作用。為了研究牛尿蒸餾物的性質(zhì)，申請(qǐng)人得到了KamdhenuArk，這是由Govigyan Anusandhan Kendra(GVAK)，Nagpur(印度)制備銷售的牛尿蒸餾物。這種尿蒸餾物被建議用于口服以增進(jìn)大眾健康(general health)和控制體重增加、浮腫、胃痛、消化不良、皮膚病以及心臟問(wèn)題等。KamdhenuArk的生產(chǎn)過(guò)程表明，牛尿應(yīng)該是新鮮并且不含氨。在NEERI進(jìn)行的試驗(yàn)顯示，牛尿的貯藏會(huì)導(dǎo)致氨的形成，這可以從下面的表1中看出。
表1牛尿中氨的含量

申請(qǐng)人以前的工作是關(guān)于香煙煙霧產(chǎn)生的氧化損傷能夠被維生素C防止。作者證實(shí)，將亞臨床或者維生素C少量缺乏的豚鼠(guinea pig)暴露在香煙煙霧中會(huì)引起膜蛋白的氧化以及肺微粒體蛋白大量氧化降解。進(jìn)一步，共軛二烯烴、丙二醛和熒光色素的形成表明，暴露于煙霧也可以誘導(dǎo)微粒體脂質(zhì)過(guò)氧化。然而，當(dāng)對(duì)豚鼠喂食維生素C時(shí)，則產(chǎn)生對(duì)蛋白質(zhì)的損傷和脂類過(guò)氧化的完全防護(hù)作用。同時(shí)，當(dāng)中止暴露在香煙煙霧并進(jìn)行抗壞血酸治療后，煙誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)和脂類的損傷得到逆轉(zhuǎn)。如果推廣到人的話，這個(gè)結(jié)果提示相對(duì)大劑量的維生素C可以保護(hù)吸煙者免受香煙煙霧引起的氧化損傷以及相關(guān)聯(lián)的退化性疾病。(Panda，chattopadhyay和Chatterjee；free radicalbiology & medicine，Vol.29，No.2，pp.115-124，2000)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是開(kāi)發(fā)一種防止和矯正DNA損傷的天然組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)主要目的是開(kāi)發(fā)一種防止和矯正DNA損傷的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是開(kāi)發(fā)一種制備RCUD的工藝。
主要目的是提供Kamdhenu Ark作為DNA損傷保護(hù)物的新應(yīng)用。
發(fā)明的另一個(gè)目的是提供去除Kamdhenu Ark中氨的方法，其目的是去除氨的毒性(如果有的話)并提高其防護(hù)DNA損傷的活性。
發(fā)明的另一個(gè)目的是鑒定重蒸Kamdhenu Ark作為DNA損傷保護(hù)劑的活性成分。
一種對(duì)于保護(hù)和/或修復(fù)DNA免于氧化損傷有用的組合物，所述組合物包含重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)，其中RCUD含有苯甲酸和己酸成分，組合物中氨的含量范圍是5-15mg/L，并選擇性含有抗氧化劑；以及一種使用權(quán)利要求1中的組合物保護(hù)和/或修復(fù)DNA免于氧化損傷的方法，所述方法包括以下步驟確定樣品中折疊的DNA的量，在DNA暴露在氧化損傷DNA的試劑之前或者之后，將所述組合物混合到所述DNA中，并確定混合物中折疊的DNA的百分比，用以表示對(duì)DNA氧化損傷的防護(hù)和/或修復(fù)。


圖1表示的是在注射重蒸Kamdhenu-Ark后GCMS的探測(cè)器響應(yīng)。
本發(fā)明是尋找具有保護(hù)暴露在DNA損傷化學(xué)試劑的細(xì)胞免于DNA損傷的性質(zhì)的天然抗氧化劑的結(jié)果。在這方面的努力中，通過(guò)對(duì)按照古代經(jīng)文和文獻(xiàn)描述，給牛專門喂食含有特殊草藥，并對(duì)牛的尿進(jìn)行蒸餾而制備了Kamdhenu Ark。這些牛是在GVAK，Deolapar(Nagpur區(qū))在GVAK，Nagpur的發(fā)明人的嚴(yán)格監(jiān)督下飼養(yǎng)的。在所得到的蒸餾物(大約400ml/批)中加入加入10-25ml(25％)正磷酸(分析純)進(jìn)行重蒸餾，使蒸餾的Ark的pH值降低至2以下。將重蒸和改良的Ark用于所有以后進(jìn)行的NEERI實(shí)驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式
一種對(duì)于保護(hù)和/或修復(fù)DNA免于氧化損傷有用的組合物，所述組合物包含重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)，其中RCUD含有苯甲酸和己酸成分，組合物中氨的含量范圍是5-15mg/L，并選擇性含有抗氧化劑；以及一種使用權(quán)利要求1中的組合物保護(hù)和/或修復(fù)DNA免于氧化損傷的方法，所述方法包括以下步驟確定樣品中折疊的DNA的量，在DNA暴露在氧化損傷DNA的試劑之前或者之后，將所述組合物混合到所述DNA中，并確定混合物中折疊的DNA的百分比，用以表示對(duì)DNA氧化損傷的防護(hù)和/或修復(fù)。
本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，其中一種對(duì)于保護(hù)和/或修復(fù)DNA免于氧化損傷有用的組合物，所述組合物包含重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)，其中RCUD含有苯甲酸和己酸成分，組合物中氨的含量范圍是5-15mg/L，并選擇性含有抗氧化劑。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，其中RCUD是無(wú)色的。
在本發(fā)明的又一種實(shí)施方式中，其中RCUD是水溶性的。
在本發(fā)明的再一種實(shí)施方式中，其中RCUD具有大約1.006的比重。
在本發(fā)明的又一種實(shí)施方式中，其中RCUD具有3.0-5.0范圍內(nèi)的pH值。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，其中RCUD氨氮(NH3N)的含量在5-15mg/L的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，其中RCUD所含揮發(fā)性脂肪酸的含量在1000-3000mg/L的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，其中抗氧化劑從包含揮發(fā)性酸、喹啉和烴衍生物的組中選擇。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，其中揮發(fā)性脂肪酸是乙酸、丙酸和丁酸的衍生物。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，其中揮發(fā)性脂肪酸的衍生物是乙酸-2-丙烯酯；乙酸巰基甲酯；2-丁烯二腈；富馬腈(Fumanonitrile)；2，2，3-三氯丙酸、3-氯丙酸、3-甲基-2-戊烯酸；異戊酸；3-羥基丁酸乙醚；4-甲基-2-三甲基苯甲酸；(鄰-三乙基硅烷氧基)苯基三乙基甲硅烷基乙酸；3-苯基丙酸(肉桂酸)；巰基乙酸；1-氫吲哚-3-ol-醋酸酯；乙酸苯酯；3-甲基喹啉。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，其中喹啉從包含3-甲硫基喹啉和3-甲基喹啉的組中選擇。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，其中組合物聞起來(lái)像尿。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，其中組合物被用作藥物組合物。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，其中組合物用于分析遺傳材料。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，其中一種使用權(quán)利要求1中的組合物保護(hù)和/或修復(fù)DNA免于氧化損傷的方法，所述方法包括以下步驟·估計(jì)樣品中折疊的DNA的量，·在DNA暴露在氧化損傷DNA的試劑之前或者之后，將所述組合物混合到所述DNA中，以及·確定混合物中折疊的DNA的百分比，其表示對(duì)DNA氧化損傷的防護(hù)和/或修復(fù)。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，其中DNA被從包含放線菌素D、二氧化錳(MnO2)和過(guò)氧化氫(H2O2)的組中選擇的化合物所損傷。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，其中所述組合物大約增強(qiáng)150-250倍抗基因毒性效果。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，其中一種去除牛尿蒸餾物中的氨以得到重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)的方法，所述方法包括下列步驟使用濃度為82％-88％的正磷酸對(duì)牛尿蒸餾物進(jìn)行重蒸，并得到重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，其中一種如權(quán)利要求15中所述的方法，其使用正磷酸處理將蒸餾物的pH值降低至2以下。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，其中一種權(quán)利要求15所述的方法，其中在大約100℃的溫度下對(duì)蒸餾物進(jìn)行重蒸。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，其中權(quán)利要求15所述的方法，其中重蒸可以幫助去除牛尿的毒性。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，其中權(quán)利要求15所述的方法，其中所述方法使蒸餾物的氨水平從1000-1500mg/L濃度范圍降低到5-15mg/L范圍。
公開(kāi)了一種包含抗氧化劑的含有牛尿蒸餾物的藥物組合物，其中該牛尿蒸餾物的含量可有效防護(hù)DNA損傷。抗氧化劑可以是揮發(fā)性脂肪酸。
本發(fā)明涉及低氨含量的重蒸的牛尿蒸餾物在DNA損傷保護(hù)中的新應(yīng)用。DNA是危險(xiǎn)化學(xué)品和廢物最主要的細(xì)胞靶位之一，其可以在暴露之后因堿基改變和糖磷脂骨架斷裂而被損傷。
如果細(xì)胞內(nèi)發(fā)生DNA損傷，與基因組完整性和DNA損傷修復(fù)機(jī)制相關(guān)的基因會(huì)被誘導(dǎo)，其結(jié)果是，將細(xì)胞周期阻止在G1期。接著，損傷的DNA被修復(fù)，進(jìn)而被阻止的細(xì)胞周期也得到恢復(fù)，細(xì)胞進(jìn)入S期(DNA合成期)。然而，如果損傷不能夠被修復(fù)的話，在正常情況下執(zhí)行修復(fù)任務(wù)的同樣基因會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡(程序式細(xì)胞死亡)，從而維持系統(tǒng)不含有缺陷的細(xì)胞。本發(fā)明直接參與幫助由損傷DNA的化學(xué)試劑例如過(guò)氧化氫(H2O2)、放線菌素D和二氧化錳(MnO2)引起的損傷修復(fù)。
氨來(lái)源于牛尿中的尿，是由存在于大量微生物內(nèi)的脲酶的酶水解作用產(chǎn)生的。盡管氨對(duì)人的健康是有毒的，但在Kamdhenu Ark中的劑量并未對(duì)人的健康或者健康人帶來(lái)負(fù)面作用。然而，在人使用之前，將其從Ark中去除掉至少對(duì)于敏感人群是理想的。因此，對(duì)從GVAK，Nagpur獲得的Kamdhenu Ark使用正磷酸處理后進(jìn)行再次蒸餾。重蒸餾的過(guò)程需要將10-25ml(85％)正磷酸(分析純)加入到400ml K-Ark中以使其pH值降低至2以下，這可以將氨固定在殘留物中。重蒸餾是在大約100℃的溫度下進(jìn)行的，并檢測(cè)了蒸餾物中的氨。據(jù)檢測(cè)，蒸餾物中氨的水平是5-15mg/L。去除氨的結(jié)果是，細(xì)胞毒性表現(xiàn)消失，而該毒性表現(xiàn)是可以在重蒸前含氨的K-Ark中觀察到的。使用氨水平在5到15mg/L之間變化的Kamdhenu-Ark(RCUD)進(jìn)行以后的實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明是設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，證明Kamdhenu-Ark具有作為保護(hù)暴露于DNA損傷化學(xué)試劑的細(xì)胞免于DNA損傷的保護(hù)者性質(zhì)。
牛尿作為Panchagavya的一個(gè)組分被認(rèn)為可以引起體重減少、消除某些心臟疾病、消化不良、胃痛和水腫。然而，其在防止DNA損傷方面的作用還沒(méi)有在任何文獻(xiàn)和經(jīng)文中被提到過(guò)。所以，申請(qǐng)人認(rèn)為確定重蒸Kamdhenu-Ark在體外保護(hù)暴露于DNA損傷化學(xué)試劑的細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷的效率是值得的。申請(qǐng)人還用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)對(duì)重蒸Kamdhenu-Ark進(jìn)行了分析，并鑒定出可能作為抗氧化劑的成分，其與其他已知的保護(hù)DNA損傷的抗氧化劑作用方式相似。
發(fā)明涉及牛尿蒸餾物作為細(xì)胞DNA損傷化學(xué)試劑例如放線菌素、過(guò)氧化氫和二氧化錳的防護(hù)物的新應(yīng)用。在重蒸牛尿蒸餾物中鑒定的化合物擔(dān)當(dāng)抗實(shí)施例在下面的步驟中，證明了Kamdhenu Ark對(duì)放線菌素D、H2O2和MnO2所引起的DNA損傷的防護(hù)作用。在這方面的努力中，申請(qǐng)人測(cè)驗(yàn)了放線菌素D、H2O2和MnO2對(duì)多形核白細(xì)胞的DNA損傷作用以及按上述方法得到的測(cè)試組分經(jīng)過(guò)改良的Kamdhenu Ark(重蒸牛尿蒸餾物)所產(chǎn)生的保護(hù)作用。這些實(shí)驗(yàn)將在下面的實(shí)施例中介紹。
不論是預(yù)先用重蒸牛尿蒸餾物對(duì)多形核白細(xì)胞處理，還是在加入DNA損傷化學(xué)試劑時(shí)再用用重蒸牛尿蒸餾物對(duì)多形核白細(xì)胞處理，都觀察到對(duì)DNA損傷的防護(hù)作用。
事實(shí)上，重蒸牛尿蒸餾物對(duì)由于上述DNA損傷試劑所引起的DNA損傷也有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的減輕作用。
下面提供的實(shí)施例僅僅是本申請(qǐng)的發(fā)明的詳細(xì)描述，而不應(yīng)理解為對(duì)本實(shí)施例-I詳細(xì)闡述重蒸牛尿蒸餾物介導(dǎo)的對(duì)DNA損傷化學(xué)試劑放線菌素-D引起的多形核白細(xì)胞的DNA損傷的防護(hù)作用(表-2)。
表2放線菌素D所誘導(dǎo)的DNA損傷以及重蒸牛尿蒸餾物(改良的K-Ark)的保護(hù)作用各組的百分比

結(jié)果是5組實(shí)驗(yàn)的平均值。*P值是與陰性對(duì)照(0.1％DMSO)比較計(jì)算得到的。測(cè)試的K-Ark劑量是60μl，NS＝不顯著。
已知的DNA損傷化學(xué)試劑放線菌素-D所引起的DNA損傷在統(tǒng)計(jì)上顯著的；P值＜0.001。
如果將體積為30μl的牛尿蒸餾物未經(jīng)過(guò)改良的Kamdhenu Ark與放線菌素D同時(shí)加入，與對(duì)照組比較盡管觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的DNA損傷，但還是有少許減輕作用的。另一方面，30μl和60μl的重蒸牛尿蒸餾物與放線菌素D同時(shí)加入時(shí)，對(duì)DNA損傷有減輕作用。所觀察到的異?？赡苁怯捎谖锤牧嫉腒amdhenu Ark中含有氨。在暴露到放線菌素之前，用60μl的重蒸牛尿蒸餾物預(yù)處理多形核白細(xì)胞(PMNs)的結(jié)果是，沒(méi)有產(chǎn)生顯著的DNA損傷，這表明重蒸牛尿蒸餾物可以保護(hù)細(xì)胞免受DNA損傷。
在暴露到放線菌素-D之后，再用重蒸牛尿蒸餾物對(duì)PMNs進(jìn)行后處理，也不會(huì)引起統(tǒng)計(jì)上顯著的DNA損傷。
實(shí)施例-2詳細(xì)闡述重蒸牛尿蒸餾物介導(dǎo)的對(duì)DNA損傷化學(xué)試劑過(guò)氧化氫(H2o2)引起的多形核白細(xì)胞的DNA損傷的保護(hù)作用(表-3)。
表3過(guò)氧化氫(H2O2)所引起的DNA損傷以及重蒸牛尿蒸餾物的保護(hù)作用各組的百分比

(接下頁(yè))
(接上頁(yè))

結(jié)果是5組實(shí)驗(yàn)的平均值。*P值是與陰性對(duì)照(0.1％DMSO)比較計(jì)算得到的。測(cè)試的K-Ark劑量是60μl，NS＝不顯著。已知的DNA損傷化學(xué)試劑過(guò)氧化氫(H2O2)所引起的DNA損傷是統(tǒng)計(jì)上顯著的；(P值＜0.001)。
用60μl的重蒸牛尿蒸餾物預(yù)處理多形核白細(xì)胞(PMNs)的結(jié)果是，暴露于H2O2的細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生顯著的DNA損傷，并且牛的重蒸產(chǎn)物表現(xiàn)出重蒸牛尿蒸餾物可以保護(hù)細(xì)胞免受DNA損傷。
在PMNs暴露于過(guò)氧化氫10分鐘后，同時(shí)加入H2O2和重蒸牛尿蒸餾物，如此用重蒸牛尿蒸餾物進(jìn)行后處理，得到了同樣的結(jié)果，也沒(méi)有產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)上顯著的DNA損傷。
實(shí)施例-3詳細(xì)闡述重蒸牛尿蒸餾物介導(dǎo)的對(duì)DNA損傷化學(xué)試劑二氧化錳(MnO2)引起的多形核白細(xì)胞的DNA損傷的保護(hù)作用(表-4)。
表4二氧化錳(MnO2)所引起的DNA損傷以及重蒸牛尿蒸餾物的保護(hù)作用各組的百分比

結(jié)果是5組實(shí)驗(yàn)的平均值。*P值是與陰性對(duì)照(0.1％DMSO)比較計(jì)算得到的。測(cè)試的K-Ark劑量是60μl，NS＝不顯著。已知的DNA損傷化學(xué)試劑二氧化錳所引起的DNA損傷是統(tǒng)計(jì)上顯著的；(P值＜0.001)。將多形核白細(xì)胞(PMNs)同時(shí)暴露到MnO2和60μl重蒸牛尿蒸餾物中，未觀察到統(tǒng)計(jì)上顯著的DNA損傷。
實(shí)施例-4詳細(xì)闡述重蒸牛尿蒸餾物(1μl濃縮物)介導(dǎo)的對(duì)DNA損傷化學(xué)試劑過(guò)氧化氫(H2O2)引起的多形核白細(xì)胞的DNA損傷的保護(hù)(表-5)
表5過(guò)氧化氫(H2O2)所引起的DNA損傷以及重蒸牛尿蒸餾物(1μl濃縮物)的保護(hù)作用各組的百分比

結(jié)果是5組實(shí)驗(yàn)的平均值。*P值是與陰性對(duì)照(0.1％DMSO)比較計(jì)算得到的。測(cè)試的K-Ark劑量是60μl，NS＝不顯著。已知的DNA損傷化學(xué)試劑過(guò)氧化氫(H2O2)所引起的DNA損傷是統(tǒng)計(jì)上顯著的；(P值＜0.001)。
用1μl重蒸牛尿蒸餾物和H2O2同時(shí)處理多形核白細(xì)胞(PMNs)的結(jié)果是沒(méi)有觀察到統(tǒng)計(jì)上顯著的DNA損傷，這說(shuō)明重蒸牛尿蒸餾物在1μl的水平能夠保護(hù)細(xì)胞免受DNA損傷。
實(shí)施例-5詳細(xì)闡述牛尿蒸餾物(1μl濃縮物)與重蒸牛尿蒸餾物(1μl濃縮物)對(duì)DNA損傷化學(xué)試劑過(guò)氧化氫(H2O2)引起的多形核白細(xì)胞的DNA鏈斷裂的保護(hù)作用的比較(表-6)。
表6牛尿蒸餾物(1μl濃縮物)與重蒸牛尿蒸餾物(1μl濃縮物)對(duì)過(guò)氧化氫(H2O2)所引起的DNA鏈斷裂保護(hù)作用的比較各組的百分比

結(jié)果是5組實(shí)驗(yàn)的平均值。*P值是與陰性對(duì)照(0.1％DMSO)比較計(jì)算得到的。測(cè)試的K-Ark劑量是60μl，NS＝不顯著。已知的DNA損傷化學(xué)試劑過(guò)氧化氫(H2O2)所引起的DNA損傷是統(tǒng)計(jì)上顯著的；(P值＜0.001)。
用1μl牛尿蒸餾物和H2O2同時(shí)處理多形核白細(xì)胞(PMNs)表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)上顯著的DNA損傷。然而，重蒸牛尿蒸餾物可以保護(hù)細(xì)胞免受DNA損傷。
本發(fā)明是尋找具有保護(hù)暴露在DNA損傷化學(xué)試劑的細(xì)胞免于DNA損傷的性質(zhì)的天然抗氧化劑的結(jié)果。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將重蒸牛尿蒸餾物作為針對(duì)DNA損傷化學(xué)試劑的陽(yáng)性試劑進(jìn)行試驗(yàn)。
在一種實(shí)施方式中，發(fā)現(xiàn)重蒸牛尿蒸餾物含有抗氧化劑例如1)苯甲酸和己酸。在另一種實(shí)施方式中，重蒸牛尿蒸餾物用作放線菌素D所引起的DNA損傷的陽(yáng)性試劑。
在一種實(shí)施方式中，發(fā)現(xiàn)重蒸牛尿蒸餾物含有抗氧化劑例如1)苯甲酸和己酸。在另一種實(shí)施方式中，重蒸牛尿蒸餾物用作針對(duì)H2O2所引起的DNA損傷的保護(hù)試劑。
在一種實(shí)施方式中，發(fā)現(xiàn)重蒸牛尿蒸餾物含有抗氧化劑。在另一種實(shí)施方式中，重蒸牛尿蒸餾物用作針對(duì)MnO2所引起的DNA損傷的陽(yáng)性試劑。
在另一種實(shí)施方式中，重蒸牛尿蒸餾物作為針對(duì)DNA損傷化學(xué)試劑的保護(hù)試劑的效果是通過(guò)在PMN暴露到DNA損傷化學(xué)試劑之前的預(yù)處理、同時(shí)處理以及后處理進(jìn)行研究的。
在另一種實(shí)施方式中，牛尿蒸餾物表現(xiàn)出具有損傷DNA的性質(zhì)，這可以通過(guò)重蒸將牛尿蒸餾物中的氨從1000-1500mg/L去除到5-15mg/L來(lái)減輕。
在另一種實(shí)施方式中，60μl重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)可以為暴露到放線菌素D的PMN提供保護(hù)。
在另一種實(shí)施方式中，60μl重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)可以為暴露到MnO2的PMN提供保護(hù)。
在另一種實(shí)施方式中，60μl重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)可以為暴露到H2O2的PMN提供保護(hù)。
在另一種實(shí)施方式中，1μl重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)可以為暴露到H2O2的PMN提供保護(hù)。
試劑的制備●溶液A ●平衡鹽溶液(BSS)
5mM葡萄糖●溶液B ●溶液C 9M-尿素 10mM-NaOH 2.5mM-EDTA 0.1％十二烷基硫酸鈉●溶液D 0.2N-NaOH●溶液E1M-葡萄糖100μl-巰基乙醇●溶液F 6.7μg/mL溴化乙啶●1μg/ml放線菌素D的0.1％DMSO(二甲基亞砜)溶液●H2O2 150μM●MnO2 250ppm或者250mg/L(貯存)DNA損傷以及RCUD對(duì)其保護(hù)的分析將15ml溶液A加入到5ml全血中，充分混合并在2-4℃下保持30分鐘。將混合物以800×g離心10分鐘。去掉上清，用平衡鹽溶液清洗沉淀，以800×g離心10分鐘后去掉清洗液。將此步進(jìn)行兩次。用溶液B溶解包含外周多形核白細(xì)胞(PMN)的沉淀。
分別用10μl放線菌素D、10μl H2O2和2.5-20mg/Ml(終體積)的MnO2處理1ml含有大約1×106細(xì)胞的懸浮于溶液B中的PMN；還有一個(gè)試管中加入0.1％DMSO(陰性對(duì)照)作為對(duì)照。在每個(gè)試管中加入BBS溶液以補(bǔ)足2ml。將混合物在5％CO2、95％的濕度的恒溫箱中于37℃孵育1小時(shí)。孵育后，在每個(gè)試管中加入5ml冰冷的0.9％ NaCl，800g離心10分鐘，去掉上清。在每個(gè)試管的沉淀中加入1.5ml溶液B。將試管(對(duì)照和三個(gè)試驗(yàn)組)充分混合并把混合物平均地分配到三個(gè)試管中，0.2ml/試管，標(biāo)記為B、P和T，接著加入200μl溶液C。充分混勻后，將三個(gè)試管B、P和T在冷的條件(0℃)下保持10分鐘以裂解細(xì)胞。
在試管T中加入400μl溶液E。之后在所有試管B、P和T中均加入200μl溶液D。將試管保持在0℃30分鐘。接著，對(duì)試管B中的物質(zhì)進(jìn)行三次30秒的超聲降解處理。進(jìn)一步，將B、P和T在20℃孵育1個(gè)小時(shí)。在試管B和P中，加入400μl溶液E并在0℃孵育10分鐘。在所有試管中，均加入1.5ml溶液F后在渦流混合器上進(jìn)行勻漿處理，之后在520nm的激發(fā)光和590nm的發(fā)射光下進(jìn)行15分鐘的熒光光譜分析。使用下面的公式確定殘余雙鏈DNA的百分比.[Krishnamurthi等(2003)和Birnboim、Jevcak(1981)]。
其中，P、B和T是590nm處的發(fā)射熒光。
將含有大約1×106細(xì)胞的懸浮在溶液B中的PMN置于四個(gè)試管A、B、C和D中。在試管B中加入60μl重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)后，37℃孵育10分鐘。在試管C中加入DNA損傷化學(xué)試劑(放線菌素D或者H2O2或者M(jìn)nO2)后，在37℃孵育10分鐘，之后加入60μl RCUD。在試管A中，只加入60μl RCUD，用BSS補(bǔ)足體積。將混合物在95％的濕度的5％CO2恒溫箱中37℃下孵育1個(gè)小時(shí)。其他步驟按照在C和D中描述的進(jìn)行。
參考文獻(xiàn)1.Krishnamurthi，K.，Saravana Devi，S.，Chakrabarti，T.含淤泥提取物的PAH對(duì)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞培養(yǎng)的基因毒性作用(Genotoxic effects of PAHcontaining sludge extracts in Chinese hamster ovary cell cultures)Biomedical andEnvironmental Sciences 2003，16(1)，76-89。
2.Bimboim H.C和J.J.Jevcak(1981)用于快速檢測(cè)低計(jì)量輻射對(duì)人類白細(xì)胞造成的DNA鏈斷裂的熒光方法(Fluorometric Method for Rapid Detectionof DNA strand breaks in Human white blood cells produced by low Doses ofRadiation)Cancer Res.，411889-1892.
權(quán)利要求
1.一種對(duì)于防護(hù)和/或修復(fù)DNA氧化損傷有用的組合物，所述組合物包含重蒸牛尿蒸餾物RCUD，其中RCUD含有苯甲酸和己酸成分，組合物中氨的含量范圍是5-15mg/L，并選擇性含有抗氧化劑。
2.權(quán)利要求1所述的組合物，其中RCUD是無(wú)色的。
3.權(quán)利要求1所述的組合物，其中RCUD是水溶性的。
4.權(quán)利要求1所述的組合物，其中RCUD的比重大約為1.006。
5.權(quán)利要求1所述的組合物，其中RCUD的pH值在3.0-5.0的范圍內(nèi)。
6.權(quán)利要求1所述的組合物，其中RCUD氨氮(NH3N)的濃度在5-15mg/L的范圍內(nèi)。
7.權(quán)利要求1所述的組合物，其中RCUD中揮發(fā)性脂肪酸的含量在1000-3000mg/L的范圍內(nèi)。
8.權(quán)利要求1所述的組合物，其中抗氧化劑從包含揮發(fā)性酸、喹啉和烴衍生物的組中選擇。
9.權(quán)利要求1所述的組合物，其中揮發(fā)性脂肪酸是乙酸、丙酸和丁酸的衍生物。
10.權(quán)利要求9所述的組合物，其中揮發(fā)性脂肪酸的衍生物是乙酸-2-丙烯酯，乙酸巰基甲酯，2-丁烯二腈，富馬腈，2，2，3-三氯丙酸，3-氯丙酸，3-甲基-2-戊烯酸，異戊酸，3-羥基丁酸乙酯，4-甲基-2-三甲基苯甲酸，(鄰-三乙基硅烷氧基)苯基三乙基甲硅烷基乙酸，3-苯基丙酸(肉桂酸)，巰基乙酸，1-氫吲哚-3-ol-乙酸酯，乙酸苯酯，3-甲基喹啉。
11.權(quán)利要求9所述的組合物，其中喹啉從包含3-甲硫基喹啉和3-甲基喹啉的組中選擇。
12.權(quán)利要求1所述的組合物，其中組合物聞起來(lái)像尿。
13.權(quán)利要求1所述的組合物，其中組合物用作藥物組合物。
14.權(quán)利要求1所述的組合物，其中組合物用于分析遺傳材料。
15.一種使用權(quán)利要求1的組合物防護(hù)和/或修復(fù)DNA氧化損傷的方法，所述方法包括以下步驟確定樣品中折疊的DNA的量，在DNA暴露在氧化損傷DNA的試劑之前或者之后，將所述組合物混合到所述DNA中，以及確定混合物中折疊的DNA的百分比，其表示的是對(duì)DNA氧化損傷的防護(hù)和/或修復(fù)。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中DNA被從包含放線菌素D、二氧化錳MnO2和過(guò)氧化氫H2O2的組中選擇的化合物所損傷。
17.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述組合物大約增強(qiáng)150-250倍的抗基因毒性效果。
18.一種去除牛尿蒸餾物中的氨以得到重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)的方法，所述方法包括下列步驟使用濃度為82％-88％的正磷酸對(duì)牛尿蒸餾物進(jìn)行重蒸餾，并得到重蒸牛尿蒸餾物RCUD。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中使用正磷酸處理將蒸餾物的pH值降低至2以下。
20.權(quán)利要求18所述的方法，其中在大約100℃的溫度下對(duì)蒸餾物進(jìn)行重蒸餾。
21.權(quán)利要求18所述的方法，其中重蒸餾有助于去除牛尿的毒性。
22.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述方法使蒸餾物中氨的濃度從1000-1500mg/L降低到5-15mg/L。
全文摘要
一種對(duì)于防護(hù)和/或修復(fù)DNA氧化損傷有用的組合物，所述組合物包含重蒸牛尿蒸餾物(RCUD)，其中RCUD含有苯甲酸和己酸成分，組合物中氨的含量范圍是5－15mg/L，并選擇性含有抗氧化劑；以及一種使用權(quán)利要求1中的組合物防護(hù)和/或修復(fù)DNA氧化損傷的方法，所述方法包括以下步驟確定樣品中折疊的DNA的量，在DNA暴露在氧化損傷DNA的試劑之前或者之后，將所述組合物混合到所述DNA中，并確定混合物中折疊的DNA的百分比，其表示對(duì)DNA氧化損傷的防護(hù)和/或修復(fù)。
文檔編號(hào)A61K45/06GK1771045SQ03826375
公開(kāi)日2006年5月10日 申請(qǐng)日期2003年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月31日
發(fā)明者查卡巴提·他潘, 薩拉瓦納·德維·斯萬(wàn)賽, 克里什那莫提·坎南, 都塔·迪潘威塔, 辛·里施·那瑞恩, 曼辛卡·蘇尼爾·巴克里施那, 道爾·蘇伊什·哈里鮑 申請(qǐng)人:印度科學(xué)工業(yè)研究所