專利名稱:類毒素制備的新方法
本發(fā)明涉及類毒素的制備。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種化學(xué)滅活，特別是用過(guò)氧化氫滅活毒素，并由此制備非細(xì)胞的解毒疫苗的新方法。
百日咳是一種由百日咳桿菌引起的傳染病。通過(guò)免疫接種可有效地控制這一疾病的發(fā)病率。當(dāng)前國(guó)家和世界衛(wèi)生組織建議嬰兒應(yīng)進(jìn)行免疫接種，以預(yù)防百日咳的發(fā)病和蔓延。
三種類型的疫苗已用于抗百日咳桿菌的免疫接種。最為廣泛使用的疫苗系由全部已不再存活的百日咳桿菌體組成。這種疫苗雖對(duì)預(yù)防疫病是有效的，但存在下列幾個(gè)問(wèn)題1)施用后引起局部紅斑，2)疫苗的施用伴隨著誘發(fā)高熱、全身性煩躁和不適，3)據(jù)稱在某些情況下可引起嚴(yán)重的神經(jīng)病學(xué)后遺癥。另一種疫苗是將百日咳組分制備成尿素浸出物的形式。這種制品大約在1969年至1974年期間使用過(guò)，但后來(lái)已從市場(chǎng)上消失了。在日本，正在使用的一種新的百日咳疫苗系從百日咳桿菌的培養(yǎng)物上清液中制得。這種物質(zhì)包含所有的培養(yǎng)物上清液蛋白質(zhì)，由于生物體培養(yǎng)的變異性，最終組成可能不盡相同。此外，使用戊二醛或甲醛作為滅活劑有時(shí)會(huì)產(chǎn)生易于回復(fù)成活性毒素的聚集物。人們認(rèn)為這些醛導(dǎo)致了席夫堿的生成，后者是化學(xué)不穩(wěn)定物質(zhì)，因此使類毒素易于回復(fù)成活性毒素。用迄今為止所知的方法制備諸如破傷風(fēng)、白喉、和霍亂毒素之類的其他毒素亦具有類似的弊端。因此，對(duì)于一種用來(lái)制備基本上無(wú)不良組分和效應(yīng)的既安全又穩(wěn)定的非細(xì)胞性毒素之改進(jìn)方法的需求是十分明顯的。
因此，本發(fā)明的目的在于制備一種用化學(xué)方法對(duì)其毒素已不可逆地滅活的類毒素。
本發(fā)明的另一目的是制備一種無(wú)內(nèi)毒素或其他常易產(chǎn)生有害副作用的毒性物質(zhì)之類雜質(zhì)的百日咳疫苗。
本發(fā)明的又一目的是提供一種保護(hù)易感宿主免遭百日咳侵襲的方法，該法系通過(guò)向所述宿主施用按照本發(fā)明所制備的致免疫量的抗原而達(dá)到上述的保護(hù)作用。
隨著以下對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述，本發(fā)明之其他目的和優(yōu)點(diǎn)將是顯而易見(jiàn)的。
當(dāng)結(jié)合附圖閱讀下述詳細(xì)說(shuō)明時(shí)，將能更好地理解本發(fā)明的上述和其他目的、特點(diǎn)以及許多附帶的優(yōu)點(diǎn)，其中圖1表示用過(guò)氧化氫滅活百日咳毒素的動(dòng)力學(xué)，在方法章節(jié)中所述的標(biāo)準(zhǔn)條件下，用過(guò)氧化氫處理百日咳毒素。按圖中所指明的時(shí)間取出反應(yīng)混合物(△，□，○)的試樣，并用酶結(jié)合免疫吸附劑測(cè)定法分析其血細(xì)胞凝集活性(△，▲)，轉(zhuǎn)導(dǎo)子腺苷二磷酸-核糖基化活性(□，■)和抗原活性(用ELISA測(cè)定法)(○，●)。對(duì)于用同樣方法但不用過(guò)氧化氫處理的百日咳毒素也進(jìn)行這些測(cè)試(▲，■，●)。通過(guò)添加過(guò)氧化氫酶使反應(yīng)終止。
圖2是前類毒素和PTH-06類毒素的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，圖中自左至右的線條(lanes)表明1-蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物;2，3，4-PTH-06的兩倍稀釋液;5-蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物;6，7，8-前類毒素的兩倍稀釋液;9-蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物。
圖3表示百日咳類毒素的穩(wěn)定性。用批號(hào)為PTH-04的吸附百日咳類毒素，以圖中所示劑量對(duì)小鼠進(jìn)行免疫接種。免疫接種所用的PTH-04是在兩周內(nèi)配制的(●，■)，在4℃下保存了6個(gè)月(○，□)，在免疫接種后2周(○，●)，和4周(□，■)，用酶結(jié)合免疫吸附劑測(cè)定法、CHO細(xì)胞抑制、和防御百日咳桿菌體對(duì)大腦內(nèi)的侵襲來(lái)測(cè)定血清抗體。
本發(fā)明的上述和其他目的系通過(guò)一種制備類毒素及其疫苗的方法而實(shí)現(xiàn)的，其中類毒素的具體制備方法如下用足以化學(xué)滅活其毒素，但保留其致免疫性質(zhì)量的氧化劑處理至少部分提純或分離的毒素，然后分離出完整的類毒素或其部分。
此處所用的術(shù)語(yǔ)“氧化劑”意指能氧化肽鏈某些特定位置上之毒素的任何試劑，而在這些特定位置上產(chǎn)生半胱氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸和/或酪氨酸之類的氨基酸殘基。這類氧化劑可以是有機(jī)物或金屬。較佳的氧化劑可列舉如下過(guò)氧化氫、過(guò)氧化鈉、N-氯-4-甲基-苯磺酰胺鈉鹽(氯胺-T)、過(guò)甲酸、過(guò)氧化二噁烷、過(guò)碘酸、高錳酸鈉、次氯酸鈉、以及該技術(shù)領(lǐng)域：
中所熟知的其他類似物質(zhì)。其中尤以過(guò)氧化氫為更佳，因其操作容易、價(jià)格低、且易于得到。
除特別另行定義外，本文所用的全部科學(xué)或技術(shù)術(shù)語(yǔ)均具有如本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域：
中普通熟練人員通常所理解的同樣意義。以下引用的所有參考資料均列在文內(nèi)，以供參考。雖然文內(nèi)所述的類似或等同的方法和物質(zhì)均可用于本發(fā)明的實(shí)施或文內(nèi)所提到的試驗(yàn)，但以下將對(duì)較佳的方法和物質(zhì)進(jìn)行描述。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“基本上”提純或分離系指毒素至少已被分離和/或提純至這樣一種程度，以至在類毒素施用到宿主中后無(wú)這類可能引起有害反應(yīng)的微粒狀或可溶性細(xì)菌污染物或雜質(zhì)。
應(yīng)當(dāng)注意，起始物質(zhì)不必是提純的細(xì)菌制劑。僅部分分離或提純的制劑也可用于本文所述的方法。除用氧化劑處理外，此法的主要步驟與Sekura等在Journal of Biol.Chem.25814647-14651 1983中業(yè)已描述的方法相似(上述文獻(xiàn)列于此處僅供參考)，以下將以百日咳毒素作為說(shuō)明性例子進(jìn)行概要描述。
物料-Affi一凝膠藍(lán)(100-200目)系從Biorad得到，溴化氰活化的瓊脂糖4 B從Pharmacia購(gòu)得，而由Spiro法制備的胎球蛋白則從Gibco得到。絲狀血凝素和百日咳毒素來(lái)自Tohama菌株，以及對(duì)付這些蛋白質(zhì)的抗體均按“Cowell et al.，Seminar in Infectious Diseases Vol.IVBacterial Vaccines，4371-379(1982)所述的方法制備。百日咳桿菌菌株系來(lái)自保存在“Pertussis Branch，Office of Biologics，Bethesda，MD.”中的收集品。該研究中所用的其他物料均為試劑級(jí)，并從普通供應(yīng)廠商購(gòu)得。
胎球蛋白親和樹脂系按照制造廠商所推薦的方法將200毫克胎球蛋白與25克溴化氰活化的瓊脂糖4 B相結(jié)合而予以制備。
生物培養(yǎng)物-在37℃溫度下，將凍干的百日咳桿菌敞開在Bordet-Gemgou血瓊脂板上，并繁殖二代。然后使這兩個(gè)板的生長(zhǎng)物分別用來(lái)接種起始培養(yǎng)物[置于500毫升燒瓶中的200毫升Stainer-Scholte介質(zhì)(Hewlett et al.，J.Bacteriol.127890-898，1976)]，并讓其在37℃下培養(yǎng)過(guò)夜，同時(shí)加以攪拌。盛有1.3升Stainer-Scholte介質(zhì)的Fernback燒瓶(2.8升)用起始培養(yǎng)物中的生長(zhǎng)物接種，直至初始A650在0.05-0.1之間。接著在36℃溫度下，使細(xì)菌在轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分的回轉(zhuǎn)搖動(dòng)器中培養(yǎng)約40至60小時(shí)，直至A650達(dá)到2.5-2.8。當(dāng)然，細(xì)菌可在該技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)熟知的其他條件下生長(zhǎng)，而且容積可按需要適當(dāng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。此外，也可使用其他的百日咳桿菌菌株。
百日咳毒素的測(cè)定-可使用該技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)熟知的幾種方法來(lái)測(cè)定該毒素。對(duì)于提純過(guò)程中所用的常規(guī)快速測(cè)定法，系按“Irons et al.，Biochim.Biophys.Acta 580175-185(1979)中所述的方法，用鵝的紅細(xì)胞測(cè)定百日咳毒素的血細(xì)胞凝集活性。促進(jìn)淋巴細(xì)胞增多的活性系按“Sato et al.，Infect.Immun.6899-904(1972)中所述的方法進(jìn)行測(cè)定。注射后三天，血中白細(xì)胞比本底增加10，000白細(xì)胞/升時(shí)的物料量，定義為一個(gè)單位促進(jìn)淋巴細(xì)胞增多的活性。高純百日咳毒素制劑的血細(xì)胞凝集活性和促進(jìn)淋巴細(xì)胞增多的活性分別約為150，000單位/毫克和30，000單位/毫克。毒素也可用常規(guī)酶結(jié)合免疫吸附劑測(cè)定法(ELTSA)確定。提純后的山羊抗百日咳毒素用于覆蓋固定相。固定相與含有抗原的制劑反應(yīng)后，再使其與抗體-堿性磷酸酶加合物反應(yīng)，并按標(biāo)準(zhǔn)方法用所產(chǎn)生的堿性磷酸酶活性測(cè)定百日咳毒素。一種類似的方法用于測(cè)定絲狀血凝素。
其他方法-按照“Reisfield et al.，Nature 195281-283(1962)”的方法在酸性凝膠體系中進(jìn)行電泳測(cè)定。十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠電泳系按Laemmli，Nat.New Biol.227680-685(1970)中所述的方法進(jìn)行。SDS-凝膠電泳的試樣系按下述方法制備在有或沒(méi)有2%β-巰基乙醇的情況下，用1%SDS處理最終體積為100微升的10-50微克蛋白質(zhì)，并在100℃溫度下加熱2分鐘左右。對(duì)于二維電泳，先用Laemmli凝膠對(duì)未還原試樣進(jìn)行處理。然后從這些凝膠中切下幾條，并使其在含有1%β-巰基乙醇的流動(dòng)緩沖液中浸泡1小時(shí)。經(jīng)流動(dòng)緩沖液充分洗滌后，使流動(dòng)凝膠沿著凝膠帶(條)澆注，并在第二維進(jìn)行電泳。凝膠用考馬斯藍(lán)染色(Oak-ley et al.Anal.Biochem.105361-363，1980)。Kodak KAR-2膠片用于經(jīng)過(guò)標(biāo)記的蛋白質(zhì)的放射自顯技術(shù)中。密度測(cè)定法采用Biomed密度計(jì)在633毫微米下進(jìn)行。
氨基酸分析系按照“Oliveira et al.，J.Biol.Chem.254489-502(1979)”中所述的方法進(jìn)行。在還原和未還原試樣(按上述對(duì)SDS復(fù)合體所述的方法制備)用標(biāo)準(zhǔn)碘乙酰胺反應(yīng)后，對(duì)羧甲基半胱氨酸進(jìn)行測(cè)定。
蛋白質(zhì)系用牛的血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)樣，按“Lowry et al.，J.Biol.Chem.193265-275(1951)”中所述的方法測(cè)定。鑒于許多試樣含有對(duì)該測(cè)定方法有干涉的物質(zhì)，所以采用由5%三氯乙酸處理蛋白質(zhì)試樣后所得的沉淀物進(jìn)行測(cè)定。
百日咳毒素的提純一通過(guò)將菌株165的培養(yǎng)物在6000×g和4℃溫度下離心分離30分鐘，以得到其上清液。用鹽酸將上清液的PH值調(diào)節(jié)到6.0，并添加Affi-凝膠鹽(每升上清液中含有10毫升填充樹脂)。所產(chǎn)生的懸浮液在4℃下攪拌48小時(shí)。使樹脂沉降2小時(shí)左右后，將上清液虹吸出來(lái)。其后的提純步驟系在25℃左右的溫度下進(jìn)行。然后將樹脂充填到柱(6×7厘米)中，并以約250毫升/小時(shí)的流量，用450毫升PH為6.0的0.25M磷酸鈉、450毫升PH為7.4的0.05M三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(緩沖液A)和450毫升含有0.75M氯化鎂的緩沖液A進(jìn)行洗提。匯集具有活性的級(jí)分，用等體積的水稀釋后，將其加到胎球蛋白-瓊脂糖柱(2.5×7厘米)，再用下述溶液以40毫升/時(shí)左右的流量洗提40毫升緩沖液A、40毫升含有1M氯化鈉的緩沖液A、以及40毫升含有4M氯化鎂的緩沖液A。匯集含有百日咳毒素的級(jí)分，并使之通過(guò)(流量為30毫升/時(shí))與含有0.5M氯化鈉的緩沖液A達(dá)到平衡的Sephadex G-25(2.5×35厘米)柱。然后通過(guò)添加硫酸銨固體(0.65克/毫升)，并在4℃下攪拌過(guò)夜，以使蛋白質(zhì)沉淀析出。將在20.000×g和4℃下離心分離30分鐘而收集得到的沉淀物再懸浮在緩沖液A中，并在溶液中加入硫酸銨固體(0.65克/毫升)。在這種4℃緩沖液中，毒素可穩(wěn)定地保存幾個(gè)月。
由上述方法制備的百日咳毒素是由不完全相同的亞單元所組成的簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)，經(jīng)在15% SDS凝膠上的電泳所測(cè)得的分子量約為31.000，26.000，25.000和11.500。
用過(guò)氧化氫滅活百日咳毒素為準(zhǔn)備與過(guò)氧化氫的反應(yīng)，使按上述方法制備的百日咳毒素轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)濃度約為0.1-0.5毫克/毫升的合適緩沖液中。諸如硼酸鹽、碳酸鹽、三羥甲基氨基甲烷、磷酸鹽、高氯酸鹽、以及該技術(shù)領(lǐng)域：
中熟知的類似鹽類均為合適的緩沖劑，而反應(yīng)的PH值可在約3.5至8.5或更大的范圍內(nèi)變化，所以反應(yīng)的PH值本身不是一個(gè)重要因素這一點(diǎn)是明白的。當(dāng)滅活在較佳的PH值-8.5下進(jìn)行時(shí)，則較佳反應(yīng)混合物含有PH為8.5的0.1M硼酸釣;PH為8.5的0.001M的二胺四乙酸鈉;0.0001M硫酸鐵或其他金屬鹽，如氯化鐵、硫酸亞鐵或硫酸鐵、以及諸如氯化鈷、氯化鉻之類的其他金屬鹽;1.2%過(guò)氧化氫;以及直至10%飽和濃度的硫酸銨溶液、反應(yīng)速率取決于過(guò)氧化氫、硫酸鐵和乙二胺四乙酸鈉(EDTA)濃度。由于滅活作用能被EDTA之類的螯合劑中斷或控制，因此鐵離子或諸如以上提到的其他微量金屬鹽或離子是必不可少的。反應(yīng)一般約在37℃下進(jìn)行，通過(guò)測(cè)定轉(zhuǎn)導(dǎo)子(transducin)的百日咳毒素催化腺苷二磷酸-核糖基化和鵝的紅細(xì)胞百日咳毒素催化的凝集作用而監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)行的程度。對(duì)于用過(guò)氧化氫滅活的時(shí)間相關(guān)性示于圖1。此外，還示出了表示所生成的類毒素在百日咳毒素ELISA中作為抗原的反應(yīng)性的數(shù)據(jù)。適合用作百日咳疫苗的百日咳類毒素制劑系用這一方法得到，反應(yīng)時(shí)間約為2小時(shí)。通過(guò)添加EDTA或其他螯合劑，或者添加過(guò)氧化氫酶和/或在諸如Sephadex G25之類介質(zhì)上的凝膠過(guò)濾可抑制與過(guò)氧化氫的反應(yīng)。
百日咳類毒素的特性對(duì)于由上述方法制備的類毒素制劑中的各種生物活性進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，結(jié)果歸納在表1和圖1中。名稱PTH-04 PTH-05和PTH-06系指所制備的具體批量制劑。名詞“類毒素”和“前類毒素”分別指用氧化劑處理前、后的毒素制劑。這些數(shù)據(jù)表明，用過(guò)氧化氫處理百日咳毒素所產(chǎn)生的制劑的無(wú)毒性的，但仍具有與專門對(duì)付天然毒素的抗體進(jìn)行交叉反應(yīng)的免疫決定子，由此表明由過(guò)氧化氫處理過(guò)的毒素保留著有效的抗原性能。
表1三批前類毒素和百日咳類毒素的殘余生物活性PTH-04測(cè)試體系 前類毒素 類毒素蛋白質(zhì)(μg/ml) 454 220HAa28，000 ＜230LPAb25，000 ＜23HSAc1.3×10-62.9×10-2TDd未測(cè)出 8.6×103CHO細(xì)胞(ng/ml)e未測(cè)出未測(cè)出PTH-05 PTH-06前類毒素 類毒素 前類毒素 類毒素566 173 256 173159，000 ＜578 50，000 46211,000 ＜29 5700 ＜296.7×10-6＞3.5×10-26.5×10-5＞3.5×10-21.2×1064.2×1035.8×1053.8×1030.31 ＞1040.31 ＞3.4×103a 血凝反應(yīng)以單位/毫克蛋白質(zhì)表示;
b 促進(jìn)淋巴細(xì)胞增多的活性以單位/毫克蛋白質(zhì)表示;
c 組胺敏化活性-半致死量(LD50)所需的毫克數(shù);
d 轉(zhuǎn)導(dǎo)子活性的腺苷二磷酸-核糖基化，以毫微克活性百日咳毒素/毫克蛋白質(zhì)表示;
e 誘發(fā)細(xì)胞聚集所需的最終蛋白質(zhì)濃度。
在硫酸鐵存在下，用過(guò)氧化氫處理所制備的百日咳類毒素制劑的氨基酸分析證明了在其組成中的一些重要變化。如表2中所示，用硫酸鐵處理導(dǎo)致半胱氨酸、蛋氨酸和酪氨酸的減少。可能相應(yīng)于磺基丙氨酸或者蛋氨酸亞砜或砜的早期洗脫氨基酸的出現(xiàn)是與蛋氨酸和半胱氨酸殘基的氧化相一致的。在微量金屬存在下，通過(guò)氧化氫處理所達(dá)到化學(xué)改性的性質(zhì)是不易回復(fù)變異(逆轉(zhuǎn))的，這表明由些產(chǎn)生的類毒素抗御向活性毒素回復(fù)變異的穩(wěn)定性。
雖然最好用微量金屬來(lái)催化反應(yīng)，但對(duì)于本發(fā)明范圍內(nèi)所考慮的各種毒素的氧化劑處理并非必不可少的。
表2PTH-04及其前類毒素的選擇氨基酸組成氨基酸 前類毒素 類毒素磺基丙氨酸和蛋氨酸(0) ＜0.01 0.18半脫氨酸 0.13 ＜0.06蛋氨酸 0.15 ＜0.02酪氨酸 0.72 0.31氨基酸含量用相對(duì)于丙氨酸的摩爾比表示。
磺基丙氨酸和蛋氨酸(0)的茚三酮色值是丙氨酸和蛋氨酸的平均值。
過(guò)氧化氫滅活的百日咳毒素之SDS-凝膠電泳相對(duì)于未處理的毒素來(lái)說(shuō)有一些變化(圖2)。S1亞單元(Mr＝31，000)有移向較高分子量的明顯移動(dòng)，而蛋白質(zhì)帶則較為彌散。與未處理的毒素相比較，S2(Mr＝26，000)和S3(Mr＝25，000)亞單元的分辨率減少。在11，000和25，000之間的分子量區(qū)間可看到微量可染色物質(zhì)。類毒素和百日咳毒素的S4，5(Mr＝11，000)組分是相似的。這些變化與過(guò)氧化氫對(duì)蛋白質(zhì)的化學(xué)改性是相一致的。下述觀點(diǎn)是一種假設(shè)而未與任何理論相聯(lián)系在S3和S4，5帶之間觀察到的彌散物質(zhì)可能是這些多肽有限分裂的結(jié)果。
吸附的百日咳類毒素之制備為了將百日咳類毒素用作百日咳疫苗，將其吸附在鋁佐劑之類的合適佐劑上。為此，使用了Alhydrogel(Superfos Kemi a/s)，但其他吸附劑，如磷酸鋁或氫氧化鋁，或其鹽也同樣可以使用。若每毫克鋁吸附20-200微克百日咳類毒素，則給出的最終蛋白質(zhì)濃度為20-200微克/毫升。通常，吸附過(guò)程系在PH為7.4，溫度為4℃的普通磷酸鹽緩沖鹽水中進(jìn)行24-28小時(shí)，同時(shí)伴有攪拌。就在吸附之前，使類毒素溶液通過(guò)0.22微米過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾，以予以滅菌，并加入乙基汞硫代水楊酸鈉(重量與體積之比為1∶10000)作為防腐劑。當(dāng)然也可使用該技術(shù)領(lǐng)域：
中熟知的其他吸附劑、佐劑、防腐劑或添加劑。此外，百日咳類毒素本身是致免疫的。
對(duì)百日咳類毒素的血清應(yīng)答如酶結(jié)合免疫吸附劑測(cè)定法所表明的那樣，用吸附的百日咳類毒素對(duì)小鼠進(jìn)行免疫接種所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答與劑量和時(shí)間有關(guān)(表3，圖3)。從中可以看出百日咳類毒素使用量在3至75微克范圍內(nèi)的劑量應(yīng)答，其中75微克的劑量在2周和4周均給出最高應(yīng)答。在所有類毒素劑量下，免疫接種后4周所產(chǎn)生的抗體量都比免疫接種后兩周的高。通過(guò)監(jiān)測(cè)血清抗體抑制活性百日咳類毒素對(duì)CHO細(xì)胞作用的能力而測(cè)得的血清應(yīng)答顯現(xiàn)出類似的特性(表4，圖3)。這種應(yīng)答與劑量和時(shí)間有關(guān)。在免疫接種后二周，未觀察到顯著量的百日咳毒素抑制抗體，但4周后，抑制效價(jià)增加，在75微克劑量下具有最大應(yīng)答。
表3用吸附的百日咳類毒素和US-8標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞百日咳疫苗免疫接種的小鼠中的百日咳毒素抗體(抗體采用酶結(jié)合免疫吸附劑測(cè)定法測(cè)定)PTH-06 US-8 標(biāo)準(zhǔn)(μg) 2周 4周 Dil. 2周 4周75A59 118 1/10 16 2550A41 71 1/50 7 2310A17 34 1/250 7 650B48 80 PHS 7 610C35 41PBS 8 4PTH-04 PTH-05(μg) 2周 4周 (μg) 2周 4周75 123 431 75 101 35225 65 163 25 64 1748 40 96 8 22 603 7 31 3 8 19PBS 7 6 PBS 7 6a 小鼠用整批號(hào)為PTH-06-75的類毒素進(jìn)行免疫接種;
b 小鼠用整批號(hào)為PTH-06-50的類毒素進(jìn)行免疫接種;
c 小鼠用整批號(hào)為PTH-06-10的類毒素進(jìn)行免疫接種。
用PTH-04、PTH-05和PTH-06中任一種百日咳類毒素，或美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞百日咳疫苗，即US-8對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射，注射量為0.5毫升。2或4周后對(duì)小鼠抽血化驗(yàn)，由酶結(jié)合免疫吸附劑法測(cè)得的這些小鼠的百日咳毒素抗體以平均值表示。
表4用吸附的百日咳類毒素和US-8標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞百日咳疫苗進(jìn)行免疫接種的小鼠之血清抑制活性(活性采用CHO細(xì)胞測(cè)定法測(cè)定)(平均值為10～11只/每組)。
PTH-04 PTH-05(μg) 2周 4周 (μg) 2周 4周75 ＜5 85 75 ＜5 1225 ＜5 25 25 ＜5 ＜58 ＜5 10 8 ＜5 103 ＜5 ＜5 3 ＜5 ＜5PBS ＜5 ＜5 PBS ＜5 ＜5PTH-06＊US-8 標(biāo)準(zhǔn)(μg) 2周 4周 Dil. 2周 4周75a＜5 91 1/10 ＜5 ＜550a＜5 43 1/50 ＜5 ＜510a＜5 9.4 1/250 ＜5 ＜550b＜5 38 PBS ＜5 ＜510c＜5 41PBS ＜5 ＜5a 小鼠用整批號(hào)為PTH-06-75的類毒素進(jìn)行免疫接種;
b 小鼠用整批號(hào)為PTH-06-50的類毒素進(jìn)行免疫接種;
c 小鼠用整批號(hào)為PTH-06-10的類毒素進(jìn)行免疫接種。
用PTH-04、PTH-05、PTH-06中任一種百日咳類毒素，或美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞百日咳疫苗，即US-8對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)的注射，注射量為0.5毫升。2或4周后對(duì)小鼠抽血化驗(yàn)，應(yīng)用方法章節(jié)(Methods Section)中所述的CHO細(xì)胞測(cè)定法測(cè)出這些小鼠的血清對(duì)百日咳毒素的抑制活性。
吸附百日咳類毒素也被證明在羅猴中能產(chǎn)生免疫應(yīng)答(表5和表6)。用酶結(jié)合免疫吸附劑法測(cè)得的百日咳毒素特效抗體所產(chǎn)生的應(yīng)答與從百日咳痊愈病人所取血清中觀察到的應(yīng)答現(xiàn)象相類似，其中在相同參照血清的條件下，病人ELISA應(yīng)答的平均數(shù)值為115。免疫應(yīng)答也導(dǎo)致生成能抑制在CHO細(xì)胞測(cè)定法中百日咳毒素的抗體。ELISA應(yīng)答和在CHO細(xì)胞測(cè)定法中的抑制效價(jià)發(fā)現(xiàn)都與劑量有關(guān)，在施用加強(qiáng)劑量后，上述相應(yīng)數(shù)值也隨之增大。
表5吸附的百日咳類毒素(PTH-05)注射入幼羅猴后，用ELISA確定的百日咳毒素抗體ELISA單位(應(yīng)答者)類毒素(微克) n- 0天 21天100 9 1.8 42(7)50 9 2.2 29(6)10 9 2.4 11(3)PBS 3 2.3 2.3(0)ELISA單位(應(yīng)答者)28天 42天 71天 92天95(9) 58(9) 29(7) 85(9)65(9) 27(6) 25(8) 59(8)28(7) 18(6) 20(5) 29(7)2.6(0) 3.3(0) 5.4(0) 2.8(0)按上表所示的劑量，在0天、21天和71天用吸附的百日咳類毒素PTH-05對(duì)幼羅猴進(jìn)行免疫接種。這些試樣的百日咳毒素抗體系用幾體平均數(shù)表示，上表括弧內(nèi)的數(shù)字是較免疫接種前抗體水平升高4倍或4倍以上的猴子應(yīng)答者的數(shù)目。
表6用吸附的百日咳類毒素(PTH-05)進(jìn)行注射的幼羅猴的百日咳抑制抗體(CHO細(xì)胞測(cè)定法)
抑制效價(jià)的倒數(shù)和類毒素(μg) n＝ 0天 21天100 9 ＜5(9) 16(7)50 9 ＜5(0) 7(6)10 9 ＜5(0) 12(3)PBSa2 ＜5(0) ＜5(0)(應(yīng)答者數(shù)目)28天 42天 71天 92天23(9) 44(9) 6(4) 20(8)17(9) 22(6) ＜5(0) 10(7)17(7) 14(6) 6(3) 9(6)＜5(0) ＜5(0) ＜5(0) ＜5(0)a 因一只羅猴的初始CHO細(xì)胞效價(jià)的測(cè)定值為10，故將其從該組中排除。測(cè)定結(jié)果用幾何平均數(shù)和應(yīng)答者的數(shù)目表示，此處應(yīng)答者指定為抑制效價(jià)等于或大于10的猴子(示于上表括弧內(nèi))。
百日咳類毒素的效能對(duì)百日咳類毒素是否具有保護(hù)小鼠免遭百日咳桿菌體對(duì)大腦內(nèi)侵襲的能力進(jìn)行了檢驗(yàn)(表7，圖3)。采用3批百日咳類毒素疫苗進(jìn)行試驗(yàn)，在第二周末計(jì)算得到的半數(shù)有效量(ED-50)(蛋白質(zhì)微克數(shù))的數(shù)值如下對(duì)PTH-04為44微克(將8微克的數(shù)據(jù)點(diǎn)排除)對(duì)PTH-05為51微克，對(duì)PTH-06-75為30微克。雖然百日咳類毒素表現(xiàn)出能保護(hù)小鼠免遭病菌對(duì)大腦的侵襲，但其效能不足以符合目前聯(lián)邦法規(guī)(FDA)的規(guī)定。吸附百日咳類毒素給出下述數(shù)值小于10個(gè)小鼠保護(hù)單位/毫克蛋白質(zhì)。所推薦的10-75微克的類毒素劑量將產(chǎn)生不足0.4小鼠保護(hù)單位/人的劑量。
百日咳類毒素疫苗的效能是通過(guò)向小鼠施用致死劑量的百日咳類毒素而進(jìn)行評(píng)價(jià)的(表8)。計(jì)算得到的半數(shù)有效量的蛋白質(zhì)量如下對(duì)PTH-04為5.2微克，對(duì)PTH-05為41微克，而對(duì)PTH-06-50為4.9微克。在這一測(cè)定中，PTH-05的低效能反映了這批疫苗在標(biāo)準(zhǔn)CHO-細(xì)胞抑制測(cè)定中誘發(fā)抑制抗體的低效能(表4)。
表7用吸附的百日咳類毒素US-8標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞百日咳疫苗保護(hù)小鼠遭百日咳桿菌對(duì)大腦內(nèi)的侵襲(幸存者數(shù)目/總數(shù))PTH-06 US-8 標(biāo)準(zhǔn)疫苗(μg) 2周 4周 Dil. 2周 4周75A7/11 6/8 1/10 6/10 6/1150A4/10 5/11 1/50 2/10 2/1110A2/11 2/11 1/250 0/11 0/1150B5/11 7/11 PBS 0/11 0/1110C5/11 7/11PBS 0/11 0/10PTH-04 PTH-05(μg) 2周 4周 (μg) 2周 4周75 4/9 11/11 75 3/11 2/1125 2/11 5/11 25 0/11 1/118 4/10 3/11 8 0/11 0/113 0/11 2/11 3 0/11 0/11PBS 0/11 0/11 PBS 0/11 0/11a 小鼠用整批的PTH-06-75進(jìn)行免疫接種;
b 小鼠用整批的PTH-06-50進(jìn)行免疫接種;
c 小鼠用整批的PTH-06-10進(jìn)行免疫接種。
向小鼠腹膜內(nèi)注射0.5毫升的PTH-04、PTH-05-05或PTH-06這三種百日咳類毒素中的任一種，或者美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞百日咳疫苗-US-8，2或4周后，按方法章節(jié)(Methods Section)所述的那樣，向小鼠大腦內(nèi)注射百日咳桿菌體，使其感染。感染后14天(按聯(lián)邦法規(guī)的規(guī)定)，記錄幸存者的數(shù)目。
表8用百日咳類毒素和美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)百日咳疫苗-US-8保護(hù)小鼠免遭百日咳毒素的侵襲注射劑量 幸存數(shù)目/受侵襲的總數(shù)(μg蛋白質(zhì)) PTH-04 PTH-05 PTH-06-50 US-8a50 10/12 8/10 9/10 0/1010 10/12 0/10 9/10 0/102 0/12 0/10 0/10 0/10PBS 0/12 0/10 0/10 0/10a US-8標(biāo)準(zhǔn)疫苗的施用量為0.05微升、0.01微升或0.02微升，其中所含百日咳類毒素的劑量分別為50、10和2微克。
向小鼠注射0.5毫升上表所示的各種百日咳類毒素，或者美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)百日咳疫苗-US-8稀釋劑，然后再給予這些小鼠下述劑量的百日咳毒素對(duì)于用PTH-04注射的小鼠，所給劑量為5.2×LD50;對(duì)于用PTH-05、PTH-06和US-8注射的小鼠，所給劑量為15.4×LD50。結(jié)果表明，PTH-04、PTH-05和PTH-06的半數(shù)有效量(ED50)分別為5.2、41.0和4.9微克。
活性百日咳毒素的效用若在小鼠用吸附的百日咳類毒素進(jìn)行免疫接種前一小時(shí)，接受非致死、非致免疫劑量的活性百日咳毒素，則根據(jù)小鼠大腦內(nèi)感染模式進(jìn)行判斷，可以看出在效能方面的顯著變化(表9)?；钚园偃湛榷舅匕霐?shù)有效量從51微克降低至12.5微克。根據(jù)酶結(jié)合免疫吸附劑測(cè)定或CHO-細(xì)胞抑制效價(jià)判斷，疫苗效能的這種增加仿佛并非由增強(qiáng)免疫應(yīng)答所致。應(yīng)當(dāng)注意，這是目前用來(lái)使全部細(xì)胞百日咳疫苗標(biāo)準(zhǔn)化的試驗(yàn)。鑒于活性百日咳毒素可能產(chǎn)生有害反應(yīng)，此處用于產(chǎn)生非細(xì)胞百日咳疫苗的方法目的是使活性百日咳毒素減少至最低水平。
表9同時(shí)注射百日咳類毒素PTH-05和亞致死的非致免疫劑量的百日咳毒素(0.1微克)時(shí)，對(duì)抗毒素水平和保護(hù)小鼠遭百日咳桿菌對(duì)大腦內(nèi)侵襲的影響注射的類毒素 對(duì)大腦內(nèi)的侵襲(存活數(shù)/總數(shù))毒素- 毒素+ 毒素-(μg) 2周 4周 2周 4周 2周75 3/11 2/11 9/11 8/11 101±2525 0/11 1/11 5/10 5/11 64±318 0/11 0/11 3/11 4/11 22±103 0/11 0/11 1/10 7/11 8±3ELISA測(cè)定 CHO細(xì)胞測(cè)定毒素+ 毒素- 毒素+4周 2周 4周 2周 4周 2周 4周352±173 80±24 252±80 ＜5 12 ＜5 12174±72 44±22 138±92 ＜5 4 ＜5 460±27 36±17 106±50 ＜5 ＜5 ＜5 ＜519±11 27±12 70±20 ＜5 ＜5 ＜5 ＜5小鼠單用吸附的PTH-05免疫接種，或免疫接種前1小時(shí)在靜脈內(nèi)注射0.1微克百日咳毒素。對(duì)小鼠抽血化驗(yàn)血清，在第二天，按本文所述的方法在大腦內(nèi)注射百日咳桿菌體。由酶結(jié)合免疫吸附劑測(cè)定法所測(cè)得的百日咳毒素抗體以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示;而用CHO細(xì)胞測(cè)定法所測(cè)得的百日咳毒素抗體則用幾何平均數(shù)表示。
佐劑含量對(duì)百日咳類毒素效能的影響使批號(hào)為PTH-06的百日咳類毒素以不同的佐劑/蛋白質(zhì)比(表10)配制后，用酶結(jié)合免疫吸附劑測(cè)定法(表3)、CHO細(xì)胞抑制效價(jià)(表4)和小鼠抵抗力(表7)來(lái)監(jiān)測(cè)其效能。這些判據(jù)一致表明，疫苗的效能隨著鋁與蛋白質(zhì)之比的增加而增強(qiáng)。由10微克批號(hào)為PTH-06-10的類毒素所誘發(fā)的應(yīng)答與50微克批號(hào)為PTH-06-75的類毒素所誘發(fā)的相同。
表10批號(hào)PTH-04、PTH-05、PTH-06-75，PTH-06-50以及PTH-06-10中的蛋白質(zhì)和鋁含量蛋白質(zhì) Alhydrogel批號(hào) (μg/mL) (mg Al+++/mL)PTH-04 190 0.95PTH-05 140 0.75PTH-06-75 150 1.0PTH-06-50 100 1.0PTH-06-10 20 1.0在4℃下使類毒素吸附在Alhydrogel上48小時(shí)，同時(shí)緩緩地進(jìn)行攪拌。然后將盛有整批PTH-06類毒素的瓶送到藥劑部門(Pharmacy Section);CC，NIH，以轉(zhuǎn)入5.0毫升小瓶中，每只瓶的盛裝量為2.2毫升。
吸附百日咳類毒素的毒性穩(wěn)定性吸附的百日咳類毒素在4℃下存放直至6個(gè)月后，根據(jù)酶結(jié)合免疫吸附劑測(cè)定法，在CHO細(xì)胞測(cè)定中百日咳毒素抑制抗體的誘發(fā)，以及小鼠保護(hù)來(lái)判斷，其效能無(wú)明顯變化。腹膜注射吸附的百日咳類毒素的小鼠，經(jīng)3周的觀察，根據(jù)白細(xì)胞計(jì)數(shù)和對(duì)組胺的敏化作用判斷，無(wú)毒性顯現(xiàn)(表11)。將非吸附的百日咳類毒素在37℃下保存3周以上，由轉(zhuǎn)導(dǎo)子的腺苷二磷酸-核糖基化作用的測(cè)定表明，未產(chǎn)生向活性毒素的回復(fù)變異(逆轉(zhuǎn))(表12)。
表11批號(hào)為PTH-05的吸附百日咳類毒素的促進(jìn)淋巴細(xì)胞增多活性和組胺敏化活性免疫接種 白細(xì)胞數(shù)目后天數(shù) 百日咳毒素Alhydrogel PTH-053 34，200 4，300 3，4007 23，600 4，300 5，60014 9，600 3，300 5，70021 4，100 4，000 3，900組胺侵襲(幸存者數(shù)目/總數(shù))侵襲后天數(shù)百日咳毒素Alhydrogel PTH-054 0/5 5/5 5/58 0/4 5/5 5/515 0/5 4/5 4/522 0/4 3/5 3/5以5只小鼠為一組，向各組小鼠腹膜內(nèi)注射下述任一制劑10毫升PTH-05，1.0毫升含有0.75毫克以Alhydrogel形式存在的鋁的PBS，1.0毫升含有百日咳毒素的PBS。在免疫接種后第3、第7、第14和第21天對(duì)小鼠進(jìn)行抽血檢查，并將它們的平均白細(xì)胞計(jì)數(shù)列入表內(nèi)。第二天從腹膜內(nèi)向小鼠注射劑量為10微克/克體重的鹽酸組胺，這一劑量較之規(guī)定值大10倍。各組(每組包括5只小鼠)的幸存者數(shù)目示于表中。
表12在37℃下經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間保存后的百日咳類毒素制劑的轉(zhuǎn)導(dǎo)子腺苷二磷酸-核糖基化作用活性保存在37℃ 腺苷二磷酸-核糖基化作用活性(單位/毫升)下的天數(shù) PTH-04 PTH-050 ＜30 2708 ＜30 ＜3014 ＜30 5225 ＜30 37將過(guò)氧化氫滅活的百日咳毒素制劑保存表中所指明的天數(shù)后，用轉(zhuǎn)導(dǎo)子作為受體測(cè)定其腺苷二磷酸-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性。數(shù)據(jù)系以標(biāo)準(zhǔn)百日咳毒素制劑為基準(zhǔn)而進(jìn)行計(jì)算，并以毫微克毒素/毫升為單位表示。
由本文所列數(shù)據(jù)可以清楚地看出，如上所述用過(guò)氧化氫處理百日咳毒素能產(chǎn)生化學(xué)不可逆的抗原，這種抗原是安全(無(wú)毒)的，并無(wú)通常在已有技術(shù)制劑中所遇到的有害影響。而且制劑是穩(wěn)定的，具有致免疫性和預(yù)防百日咳感染的能力。當(dāng)然，文內(nèi)通過(guò)百日咳毒素的具體例子所闡明的新方法并不僅僅限于百日咳毒素。該法是普遍適用的，同樣可用于破傷風(fēng)、白喉、霍亂等其他毒素的制備。
顯然，本發(fā)明的毒素也可用于包含致免疫量的類毒素和藥學(xué)上可接受的載體的藥劑，而所說(shuō)載體可以是諸如消毒生理鹽水、無(wú)毒生理緩沖劑、或該技術(shù)領(lǐng)域：
中熟知的類似物質(zhì)。當(dāng)然，消毒劑、添加劑和佐劑，如鋁化合物以及該技術(shù)領(lǐng)域：
中熟知的一類物質(zhì)均可用于這類制劑中。
應(yīng)該明白，本文所述的例子和實(shí)施例僅用于說(shuō)明的目的，根據(jù)本發(fā)明所作的各種變換和變化對(duì)該技術(shù)領(lǐng)域：
的熟練人員將是顯而易見(jiàn)的，因而包括在本申請(qǐng)文件的原理和范圍內(nèi)，以及所附權(quán)利要求
書的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種類毒素的制備方法，它包括用一定量氧化劑處理至少部分分離的毒素，以對(duì)所說(shuō)毒素進(jìn)行化學(xué)滅活，但同時(shí)保留其致免疫性，此后從中獲得滅活的毒素或其部分。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所說(shuō)氧化劑能夠在毒素鈦鏈中特定位置上對(duì)毒素進(jìn)行氧化，而在這些位置上產(chǎn)生選自由半胱氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸和酪氨酸所組成的這一組中的氨基酸殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的方法，其特征在于所說(shuō)氧化劑選自由過(guò)氧化氫、過(guò)氧化鈉、N-氯-4-甲基-苯磺酰胺鈉鹽(氯胺-T)、過(guò)甲酸、過(guò)氧化二惡烷、高磺酸、高錳酸鈉、次氯酸鈉、及其混合物所組成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的方法，其特征在于所說(shuō)氧化劑是過(guò)氧化氫。
5.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的方法，其特征在于所說(shuō)氧化劑是氯胺-T。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征是在微量金屬存在下處理所說(shuō)的毒素。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的方法，其特征在于所說(shuō)金屬離子選自由亞鐵、鐵、鈷和鉻所組成的組。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所說(shuō)化學(xué)滅活是通過(guò)添加螯合劑予以控制的。
9.根據(jù)權(quán)利要求
8所述的方法，其特征在于所說(shuō)螯合劑是乙二胺四乙酸鹽。
10.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其特征在于所說(shuō)毒素是細(xì)菌毒素。
11.根據(jù)權(quán)利要求
10所述的方法，其特征在于所說(shuō)毒素是百日咳毒素。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求
1所述方法制備的類毒素。
13.根據(jù)權(quán)利要求
12所述的類毒素，其特征在于所說(shuō)類毒素配以鋁化合物佐劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求
13所述的類毒素，其特征在于所說(shuō)類毒素在低溫下保存。
15.根據(jù)權(quán)利要求
12所述的類毒素，其特征在于向宿并施用致免疫量的所說(shuō)類毒素后，該類毒素能在所說(shuō)宿主中誘發(fā)保護(hù)抗體。
16.根據(jù)權(quán)利要求
15所述的類毒素，其特征在于所說(shuō)類毒素是百日咳類毒素。
17.一種藥劑，它包括權(quán)利要求
12所述的致免疫量的類毒素和藥學(xué)上可接受的載體。
18.根據(jù)權(quán)利要求
17所述的藥劑，其特征在于所說(shuō)類毒素是百日咳類毒素。
19.根據(jù)權(quán)利要求
18所述的藥劑，其特征在于所說(shuō)類毒素配以鋁鹽佐劑。
20.一種在敏感宿主中誘發(fā)抗百日咳桿菌的防護(hù)免疫力的方法，它包括向敏感宿主施用按權(quán)利要求
1所述方法制備的致免疫量的百日咳類毒素。
專利摘要
本文描述了一種用氧化劑處理毒素而制備類毒素的方法。文內(nèi)也闡述了按此方法制備抗百日咳疫苗的方法。
文檔編號(hào)A61P31/04GK87104279SQ87104279
公開日1988年1月20日 申請(qǐng)日期1987年6月16日
發(fā)明者羅納德D·塞庫(kù)拉 申請(qǐng)人:羅納德D·塞庫(kù)拉導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan