專利名稱:鏈結(jié)合的方法
本發(fā)明提供一種將人類松弛素的A鏈和B鏈或者人類松弛素的A鏈類似物和B鏈類似物進行結(jié)合，以有效的產(chǎn)率產(chǎn)生具有生物活性的人類松弛素或人類松弛素類似物產(chǎn)物的方法。具體地說，本發(fā)明包括在PH值大于7.0，并且在使人類松弛素B鏈溫和變性的條件下，將還原的人類松弛素A鏈及B鏈或它們的類似物發(fā)生結(jié)合的方法。通過將混和物維持在自15℃至30℃左右的溫度下，并在反應(yīng)過程中逐漸地暴露于空氣氧中，為此該條件提供了一個形成具有生物學活性的人類松弛素或其類似物的環(huán)境。本發(fā)明也提供具有生物學活性的人類松弛素的類似物。本發(fā)明還進一步提供一種以人類松弛素或其類似物作為唯一活性劑用以引產(chǎn)的方法。
人類松弛素是一種卵巢肽可在分娩前使產(chǎn)道發(fā)生變化，從而促進分娩出生過程。Hisaw，F(xiàn).L.，Pros.Soc.Exp.Biol.Med.23，661-663(1926)，Schwabe，C.etal.Biochem.Biophys.Res.Comm.75，503-570(1977);James，R.etal;Nature 267，544-546(1977)。松弛素在懷孕期發(fā)性激素中占支配地位，但在非孕期女性及男性中也檢測出它的存在。Bryant-Greenwood，GD.，Endocrine Reviews 3，62-90(1982)and Weiss，G.，Ann.Rev.Physiol.46，43-52(1984)。
取自于豬、鼠、虎鯊(Tiger shark)角鯊及人類的松弛素的氨基酸順序已經(jīng)被建立。該激素由二條肽鏈組成，稱為A鏈及B鏈，并以雙硫鍵相連接，A鏈上有一鏈內(nèi)雙硫鍵因而以此方式與胰島素A鏈相似。然而，松弛素與其它肽類激素，包括胰島素在內(nèi)的驚奇而又重要的區(qū)別在于它的令人注意的由于種源的不同造成化學結(jié)構(gòu)的變異。例如，豬、鼠及人類松弛素有50%以上的氨基酸位置是不同的。這些區(qū)別解釋了不同種的松弛素之間低的免疫交叉反應(yīng)性和許多其它觀察到的專一性生物活性上的區(qū)別。
DNA重組技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)使得人們能對編碼人類松弛素的基因進行分離并確定其特性。Hudson，P.et al.，Nature 301，628-631(1984)and Hudson，P.et al.，The EMBO Journal 3，2333-2339(1984).對c DNA及基因組克隆核苷酸順序的分析揭示了人類松弛素的結(jié)構(gòu)組織包括一個信號肽，具有25個殘基，隨后有一個大約32至33個氨基酸的B鏈、一個大約有105個氨基酸的C肽及一個24氨基酸的A鏈。對于人類松弛素，有一個基因內(nèi)區(qū)擾亂了C肽的編碼區(qū)域。比胰島素C肽長得多的松弛素C肽的生理作用及負責從A鏈及B鏈端除去C肽的酶的性質(zhì)尚未弄清楚。
對于人類的松弛素而言，有兩個獨立的基因順序已經(jīng)被確定了。Id.在懷孕期這些基因中僅有一個基因(H2)在卵巢中獲得表達，然而究竟其另一個的基因在其它組織位點被表達呢，或是它代表了一個假基因呢，這一點還不清楚。人類的這兩個松弛素基因在核苷酸及氨基酸上顯示了互相間的相當多的同系性，尤其是對于B肽及C肽而言。然而，也存在著一些值得注意的順序上的歧異，特別是在A鏈及B鏈的末端氨基區(qū)域。參見圖1。從H2松弛素在卵巢中被合成及得到表達的這一事實，可推測該順序參與了孕期生理變化。最近的論文中，報導了約翰斯通等(Johnston et al.，)曾對合成的人類松弛素(H2)及某些人類松弛素類似物的生物學活性進行了測定。Johnston，P.D.et al.，In PeptidesStructure and Function，Proc.，Ninth American Peptide Symposium，Deber，C.M.，Hruby，V.I.and Kopple，F(xiàn).D.(eds.)(Pierce Chem.Co.，1985)他們確定了對于生物學活性所必需的松弛素核心及可替代甲硫氨酸而不影響其生物活性的某些氨基酸。
Id。
表1對已知的不同種的松弛素氨基酸的順序作了比較。除了六個半胱氨酸殘基及位于側(cè)翼的甘氨酸殘基外，僅有B-鏈上的位于7位上的異亮氨酸、12位及16位上的精氨酸及32位上的亮氨酸被保留。半胱氨酸殘基無疑對維持整個雙硫鍵構(gòu)型是必需的。Blundell，T.et al.InBigazzi，M.，Greenwood，F(xiàn).C.，Gaspari，F(xiàn).(eds.)Biology of Relaxin and its Role in the Human，(Excerpta Medica，Amsterdam，1983)pp.14-21.值得注意的是，在松弛素分子中，即含有松弛素蛋白質(zhì)的活性部位的A鏈及B鏈中的絕大多數(shù)位置上的氨基酸是隨種源而變化的。這一點事實上與所有的包括胰島素在內(nèi)的其它肽激素族形成了鮮明的差別。松弛素結(jié)構(gòu)的另一特點為B鏈的氨基及羧基末端區(qū)域長度的變化及A鏈具有一個較短的氨基末端。
松弛素的化學合成特別困難，其原因極大地是因被分離的B鏈的不尋常的溶解性及其結(jié)構(gòu)特點。Tregear，G.W.et al.，InBigazzi，M.，Greenwood，F(xiàn).C.and Gaspari，F(xiàn).(eds.)Biology of Relaxin and its Role in the Human，(Excerpta Medica，Amsterdam，1983)，pp.42-55。
如上所述，人類松弛素，事實上是哺乳動物松弛素普遍地與胰島素有某些結(jié)構(gòu)上的相似點。胰島素與松弛素都在兩條鏈的鏈間及鏈內(nèi)具有雙硫鍵。James，R.et al.，Nature 267;544(1977)and Schwabe，C.and Mc Donald，J.R.Science 197，914(1977)。因而，足以推斷曾成功地運用于胰島素的合成方法也同樣可用于松弛素。Busse，W.D.and Carpenter，F(xiàn).H.，Biochemistry 15 1649(1976)，Katsoyannis，P.G.et al.，Biochemistry 6，2656(1967)andKung，Y.T.et al.，Scientia Sinica 15 544(1966)，采格·G等人及格林沃特·F.C.，愛勒斯維亞等人企圖利用半胱氨酸巰基的選擇性保護單獨鏈方法合成松弛素。Tregear，G.et al.，InRelaxin，G.D.Bryant-Greenwood，Niall，H.D.and Greenwood，F(xiàn).C.(eds.)Elsevier，New York，1981，他們發(fā)現(xiàn)通過胰島素法制備的合成肽檢測出與松弛素相似的生物反應(yīng)活力，但專一性活力及結(jié)合產(chǎn)率非常低。在151是同樣的(Id at 151)。豬的松弛素的結(jié)合產(chǎn)率低的一個原因為全長的豬的松弛素B-鏈在PH10.5溶液中的不溶性造成的。采格及休泊等人(Tregear et al.，Supra.)在兩個方面對現(xiàn)有的胰島素的化合方法作了改進用丙酮沉淀混和的豬巢松弛素鏈以除去還原劑，以及在氧化步驟中加入0.5MNaCl。結(jié)果提高了豬松弛素的產(chǎn)率。同時請參見歐洲專利申請第83.304662.6號及歐洲專利申請第83307553.4號。
張斯等人(chance et al.，)在1983年12月20日發(fā)行的美國專利第4，421，685號揭示了用硫醇還原劑在水介質(zhì)中于控制的PH及溫度下，在同一個單一步驟中完成還原和氧化反應(yīng)，使S-磺化形式的胰島素A和胰島素B鏈結(jié)合以生產(chǎn)胰島素或其類似物的方法。這一用于改進上述胰島素合成的方法被發(fā)現(xiàn)不能運用于人類松弛素的合成。
人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在特定的反應(yīng)條件下，并對條件進行控制，可將人類松弛素還原鏈結(jié)合起來以產(chǎn)生達到有用水平的人類松弛素或其類似物。因而，本發(fā)明的一個目的是提供一種人類松弛素的A鏈及B鏈結(jié)合的方法，至于這些鏈的來源則與本發(fā)明無關(guān)，例如，可以用化學合成或通過重組DNA技術(shù)，以可被利用的得率產(chǎn)生具生物活性的人類松弛素。
本發(fā)明的另一方面是生產(chǎn)具有生物學活性的人類松弛素的類似物。
本發(fā)明的再一方面是以人類松弛素或其類似物來作為引產(chǎn)的用途。
本發(fā)明是針對使人類松弛素A鏈或其類似物與人類松弛素B鏈或其類似物的結(jié)合，以生產(chǎn)具有生物學活性的人類松弛素或其類似物的方法。具體地說，該方法包括在PH值大于7.0而使人類松弛素B鏈在溫和變性的條件下，將還原的人類松弛素A鏈或其類似物與人類松弛素B鏈或其類似物發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，并在反應(yīng)的過程中使之逐漸地暴露于空氣氧中的方法。
附圖簡要說明圖1AB顯示了人類松弛素H1及H2與人類胰島素及豬(P)及鼠(R)松弛素之間缺乏同系性。數(shù)碼系統(tǒng)是以H2松弛素為基準的。松弛素的雙硫鍵為A10-A15，A11-B11及A24-B23。
圖2(a)及圖2(b)分別顯示H2(B33 A24)BL y s4BA l a2 5]]>與H2(B33 A24)的體外鏈結(jié)合反應(yīng)的高壓液相色譜法時程曲線(HPLC time course)。圖中對顯于人類松弛素類似物或人類松弛素及一個可能的重要分子內(nèi)A鏈氧化中間物的形成的體外結(jié)合反應(yīng)時程進行了描繪。描繪了基因2A及B鏈肽轉(zhuǎn)化至H2人類松弛素類似物及H2人類松弛素。層析采用一個Synchropak R P-C4(4.6×250mm，300 )。在0.05%(TFA)三氟乙酸、H20緩沖液中的乙腈液線性梯度(在500分鐘內(nèi)梯度濃度15→60%)流速為1ml/min。
圖3顯示結(jié)合了人類基因-2松弛素H2(B2-33 A24)BL y s4BA l a2 5]]>的鏈與天然人類松弛素結(jié)合的鏈生物活性(MPS)。
圖4顯示了將各種不同劑量的人類松弛素的類似物，H2(B2-33 A24)
及H2(B33 A24)
用于靈長目動物的改進的畢曉普氏計分法計分(Bishop score)。
此處所稱之“人類松弛素”或“人類松弛素類似物”是指可改變產(chǎn)道以加快生育過程的一類功能蛋白。據(jù)了解改變產(chǎn)道包括諸如子宮頸的成熟、孕期子宮之子宮內(nèi)膜的變厚及增進該區(qū)域的血管形成作用，以及對膠原蛋白合成的影響等生理作用。人類松弛素同樣可存在于女性乳房中并且可能與乳汁生成有關(guān)。人類松弛素同樣被發(fā)現(xiàn)也存在于人類之精液中并可能促進人類精子的泳動能力。人類松弛素對子宮頸產(chǎn)生的作用可以增加精子穿過子宮頸的能力。人類松弛素可以提高皮膚彈性，對結(jié)締組織產(chǎn)生影響。
人類松弛素類似物除了功能上的定義外，在結(jié)構(gòu)上是指一類具有包括人類松弛素A鏈及B鏈的基本結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。人類松弛素之類似物通過與人類松弛素A鏈和/或B鏈上的一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失、增加或修飾而與天然產(chǎn)生之人類松弛素不同，但須補充說明的是人類松弛素類似物卻保留了類似松弛素的生物學活性。這些人類松弛素之類似物的例子如下，但不盡于此一條全長的A鏈及一條羧基末端縮短的B鏈，H1(B2-27 A24)BA l a2 5]]>;H2(B2-25 A24);H2(B33 A24);H2(B33 A24)
H2(B2-33 A24)
H2(B2-33 A24)
及H2(B33 A24)
命名法如下H1、H2是指編碼人類松弛素的兩條人類基因。H2已明確為在人類卵巢中表達，而H1僅為一基因組克隆。A及B分別指人類松弛素的兩條鏈。A或B后的數(shù)字是指鏈的長度，即A或B鏈包含的氨基酸數(shù)目。氨基酸以慣用的三字母符號來表示。氨基酸符號之前的下標是指明該氨基酸位于A鏈或B鏈，而氨基酸符號之后的上標則是標明該氨基酸在鏈中的位置。
松弛素A鏈及B鏈或其類似物的鏈可以用經(jīng)典的蛋白合成方法來獲得，包括用在溶液中或用固相技術(shù)或用DNA重組技術(shù)或從人類松弛素來制取或合用上述的方法，例如，用化學合成制一條鏈而用DNA重組制另一條鏈。單獨的肽鏈通過固相合成方法來合成，Barany，G.and Merrifield，R.B.(1980)in The Peptides 2，1-284.Gross，E.and Meienhofer，J.Eds.Academic Press，New York.被保護的N-叔丁基氧碳羰氨基酸系購自Peninsula實驗室公司(Peninsula Laboratories Inc.)采用了以下的側(cè)鏈保護作用精氨酸，甲苯磺酰基、天冬酰胺，呫噸基;天冬氨酸，芐基酯;半胱氨酸，甲氧芐基;谷氨酰胺，呫噸基、谷氨酸，芐基酯;組氨酸，甲苯磺?；?賴氨酸，鄰-氯芐基氧羰基;絲氨酸，芐基;蘇氨酸，芐基;酪氨酸，2，6-二氯芐基。首位氨基酸用在二甲基甲酰胺中的氟化鉀與氯甲基聚苯乙烯(1%二乙烯基苯)成酯。取代水平為0.6毫克當量/克。用存在于二氯甲烷中的二環(huán)己基碳二亞胺(蒸餾的)使和氨基酸偶合。精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸及半胱氨酸殘基在二氯甲烷/二甲基甲酰胺為50/50的介質(zhì)中偶合。用45%三氟乙酸、5%苯甲醚、5%乙二硫醇及45%二氯甲烷除去叔丁基氧羰基團。在偶合之前先用10%的三乙胺的二氯甲烷溶液進行中和。用苯甲醚及甲基乙硫醚的液態(tài)無水氟化氫(3∶1∶20V/V/V)溶液，于0℃作用一小時以使之從樹脂上裂解并去除所有的保護基團。用10%含水乙酸從樹脂上洗出A鏈粗品并通過冷凍干燥。B鏈粗產(chǎn)物首先用80%含水乙腈洗滌然后用30%含水乙酸洗下，最后用水稀釋并冷凍干燥而使之從樹脂上除去。肽的粗品被溶解于100毫摩爾的二硫蘇糖醇，然后用含0.1%三氟乙酸的10%乙腈水液進行稀釋至大體積。該溶液注入5×55cm的用多孔層實心球C18(300A 15-20微米)填充的柱中，用0.1%三氟乙酸水液洗滌，并用乙腈進行梯度洗脫。含肽的組份被收集并冷凍干燥，然后分析氨基酸組成、氨基酸序列并進行反相HPLC分析。當采用先前的胰島素或豬松弛素方法時，半胱氨酸殘基不由磺化作用或其它衍生作用進行保護。Means，G.E.and Feeney，R.E.，Chemical Modification of Proteins(1971)本發(fā)明通過將人類松弛素A鏈及B鏈處于還原態(tài)的方法提高了產(chǎn)率及肽的溶解性。還原的并被冷凍干燥的A鏈及B鏈被直接地用于所有重組合反應(yīng)，而不轉(zhuǎn)化為其磺酸化衍生物，也不使用其它的半胱氨酸巰基保護基。
在執(zhí)行本發(fā)明之方法時，人類松弛素A鏈和B鏈或其類似物的A鏈及B鏈結(jié)合以形成人類松弛素或其類似物的作用可以發(fā)生在兩種鏈的比例變化十分大的范圍內(nèi)。當然結(jié)合作用固然受到存在較少量A鏈或B鏈的限制。過量的B鏈抑制鏈的結(jié)合，而A鏈的摩爾數(shù)略微大于或等于B鏈則較佳。盡管并非是必要的，但一般地慣用的A鏈與B鏈的重量比例在大約1∶0.5至大約3.0∶1的范圍內(nèi)。實行本發(fā)明采用的最佳的A鏈與B鏈的重量比在大約自1∶1至大約2.5∶1的范圍內(nèi)。還經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在這較佳范圍之內(nèi)的某些比例對于生產(chǎn)某種特殊的松弛素類似物特別有利。因而，對于結(jié)合人類松弛素A鏈及B鏈以生產(chǎn)去甲硫氨酸(desmethionine)的松弛素，A鏈與B鏈優(yōu)先采用比例在大約1.2∶1至大約2∶1的范圍。
另一個可使本發(fā)明的方法在最佳水平實行的重要的參數(shù)為反應(yīng)介質(zhì)中的蛋白質(zhì)濃度。本方法可在一個非常廣泛的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)執(zhí)行。但是，一般地，蛋白質(zhì)的濃度是在大約每毫升反應(yīng)介質(zhì)中含0.1至大約10毫克的范圍內(nèi)。蛋白質(zhì)的濃度最好是在大約每毫升0.5至大約5毫克的范圍內(nèi)。進一步還發(fā)現(xiàn)，在較后的這個范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的最佳濃度取決于欲生產(chǎn)的人類松弛素。
本發(fā)明的方法是在一個含水介質(zhì)中進行的。在室溫下所測的介質(zhì)PH值一般在大約7.0至大約12的范圍內(nèi)。優(yōu)先采用自大約7.5至大約11.0的范圍內(nèi)，并最好是維持在大約自8.0至大約10.6的范圍內(nèi)。可以加入合適的緩沖劑以使介質(zhì)PH值維持在需要的范圍內(nèi)。典型的緩沖劑有，例如，甘氨酸鹽(glycinate)、碳酸鹽(carbonate)、三羥基甲基甲胺、焦磷酸鹽及其它可以將PH值控制在上述范圍內(nèi)的緩沖劑。普通且較好的緩沖劑為三羥基甲基甲胺(PH8至9)及甘氨酸鹽(glycinate)(PH9.5至11.0)。
混合反應(yīng)在大約15℃至大約30℃的溫度下進行，而且在大約自20℃至大約25℃的溫度較好，且最好是在室溫下。
緩沖劑的濃度一般在自大約0.025M至大約0.2M的范圍內(nèi)。濃度在自大約0.05M至大約0.15M范圍內(nèi)較好，且最好是大約0.1M。
本發(fā)明方法的條件之一是使該反應(yīng)發(fā)生在對暴露于空氣氧進行控制的環(huán)境。據(jù)發(fā)現(xiàn)，控制氧化可以通過首先將所有溶液用氮吹氣來實現(xiàn)，使反應(yīng)開始時發(fā)生在一個封閉氮吹氣容器，然后在封閉容器中，可以通過敞開空氣而直接與空氣接觸，也可將氧氣通入介質(zhì)而使之與氧氣接觸。
本發(fā)明的方法的另一個條件是，該反應(yīng)發(fā)生在一個使人類松弛素B鏈溫和變性的條件下。變性劑有尿素、胍鹽酸鹽及其它的高離液序列劑(chaotropic agent)、鹽類、洗滌劑及有機溶劑(乙腈、乙醇、二甲基甲酰胺等等)，這些一般的熟練操作人員所知的變性劑均可使用。較好地采用一定體積百分比(低于10%)的尿素及乙腈等有機溶劑來獲得使人類松弛素B鏈溫和變性的條件。
人類松弛素A鏈及B鏈以游離的半胱氨酸還原態(tài)形式被引入合適的含水介質(zhì)中。從PH2水溶液中，先加入新鮮原料5mg/mlA鏈，繼而加新鮮原料5mg/mlB鏈以開始反應(yīng)。用Na OH來調(diào)節(jié)的PH值。每步反應(yīng)均用RP-4反相分析HPLC來監(jiān)測以期最大程度形成結(jié)合的松弛素，然后加入冰醋酸使PH值至4以終止反應(yīng)。Snyder，L.R.and Kirkland，J.J.in Introduction toModern Liquid Chromatography(1979)混合物繼而在16，318g′s下離心30分鐘，上清液用制備型反相HPLC來純化。Id.據(jù)觀察，在室溫之下進行結(jié)合反應(yīng)對于產(chǎn)生有效產(chǎn)率的人類松弛素至關(guān)重要。用Synchropak RP-4(4.6×250mm，300
)反相柱進行高性能液相色譜分析工作。用Synchropak RP-4(1×50cm，300
)或手填的多孔層實心球RP-4或RP-18(5×50cm)300
反相柱來進行準備工作。分析型的HPLC用一個沃特系統(tǒng)(water′s system)來進行。制備型的HPLC用一個沃特系統(tǒng)或Prep500來進行。
一旦反應(yīng)完成之后，可用蛋白質(zhì)分離技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)的多種方法的任何一種，將人類松弛素或松弛素類似物進行分離。提純松弛素的最為常見的方法是層析技術(shù)。這些技術(shù)可容易地應(yīng)用于本發(fā)明方法以分離人類松弛素。這些技術(shù)包括凝膠過濾、離子交換層析或反相HPLC。
分離方案的一例為將含總量為0.5至1克松弛素肽的反應(yīng)上清液負載于一個(15-20微米)的多孔層實心球C4 300
(5×50cm)柱上進行。采用含0.1%TFA的20%至40%乙腈水溶液的梯度(每分鐘變化0.5%)洗脫來完成純化。流速為20毫升/分鐘，每隔1.0分鐘收集組份。用一個多孔層實心球(5微米)C4 300
(4.6×250mm)層析柱及含0.1%TFA的25%乙腈水溶液同溶劑洗脫來監(jiān)測純化過程。含主要產(chǎn)物的組份收集后進行冷凍干燥以用作進一步的分析。用生物測定對人類松弛素及人類松弛素類似物進行測試。用重量在18至20g的Charles River albino c FW雌鼠進行鼠恥骨聯(lián)合測試(murine pubic symphysis assay MPS)J.St.Louis，Can.J.Physiol.Pharmacol.59 507-512(1981)。雌二醇藥引液(Primingsolution)是含有5μg雌二醇17β-丙酸環(huán)戊酯(cyclopentylpropionate)的0.1ml花生油。人類松弛素的劑量溶液分別為含有松弛素2.5、5.0、10.0、20.0、40.0及80.0μg/ml的含1%苯并紅紫素的水溶液。當鼠被隔離至少6天，體重為18-20g時，分別給于雌二醇藥引液皮下注射。整整七天之后，對鼠進行0.2ml相應(yīng)劑量人類松弛素的皮下注射。注射人類松弛素之后18至20小時后，用頸部脫臼法殺死小鼠并暴露出恥骨間韌帶。用測微計對其進行測量。
Charles River albino Sprague-Dawley種衍生的體重為200～300克的雌性鼠作子宮收縮測試(RUC)。雌二醇的藥引液(Priming)為含200μg雌二醇17β-丙酸環(huán)戊酯(cyclopentylpr opionate)的0.1ml花生油。人類松弛素原液(stock solution)的濃度為0.1毫克/毫升消毒注射水(Invenex)。當鼠被隔離至少六天之后，對之分別進行雌二醇藥引液(Priming)皮下注射。注射之后16至20小時內(nèi)用二氧化碳窒息殺死鼠。每只鼠子宮解剖出來并分成四片，去掉角并從側(cè)面分割。將組織懸浮于夾套水浴溫床保持37℃的含35ml充氣霍姆斯林格溶液(Holmans Ringer Solution)的水浴中。用以等摩爾數(shù)的氯化鉀代替百分之二十的氯化鈉的Ringer溶液使組織引起收縮。當達到穩(wěn)定期后，水浴中加入一定濃度的松弛素。對于標準曲線，水浴內(nèi)每35ml中的豬松弛素的劑量為0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4及12.8微克松弛素。
對人類松弛素引起非人類靈長目動物懷孕期子宮頸成熟進行了測定。人類松弛素對交配后懷孕期為130天至160天的獼猴進行測定，群體的懷孕期為168±6天。動物被穿上有鏈條的外衣。該有鏈條的外衣能使導液管連續(xù)地進入并放在股動脈管或頸動脈及內(nèi)部頸靜脈管等。對大多數(shù)動物，在羊膜囊內(nèi)放置一壓力傳感器及與子宮表面相連的電極以測定子宮的收縮活力。松弛素和以前獲得的血樣一起通過連續(xù)靜脈輸注一小時，輸注期間及輸注之后，從第一個小時中的間隔15分鐘至有規(guī)律的間隔24小時。松弛素劑量在10μg至100μg的范圍內(nèi)，通過結(jié)構(gòu)、失色情況、位置、膨脹及胎兒相對于子宮頸的位置和子宮下段的質(zhì)量來對子宮頸進行打分。在大多數(shù)的情形下，由二個人獨立地對子宮頸進行測定及打分。作為對照的猴子系采用同樣的方式輸注鹽水(one)或?qū)⒑镒泳S持于群體中但不對之進行輸注，每隔一周進行子宮頸檢查。
用Western吸印法(Western blots)及尿素聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)。隨后用Bethesda研究實驗室小冊子上提供的低分子量15%的聚丙烯酰胺、尿素、板膠(slab gels)對分子量進行檢定。對該方法作了一些改進。凝膠電泳系在4℃的冷房中，在100V恒壓下持續(xù)運轉(zhuǎn)15小時。樣品被置于100mM磷酸鈉、PH7.2，7M尿素0.01%溴酚藍中，及用于還原樣品為50mM新配的DTT。上樣前，將1至10μg所有肽在90℃下保溫2～3分鐘。凝膠在放樣品前在90℃下保溫2～3分鐘。在0.2%甲醛、20%乙醇及6.2%乙酸(均為V/V)溶液中定影及脫色15～30分鐘及作Western分析(Towbin，H.et al.，PNAS(1979)76;4350-4354)之后，凝膠用考馬斯(Coomassie)藍染色(凝膠在10ml乙酸加上90ml 25%乙醇中的(0.25%重量/體積)考馬斯藍R-250的溶液浸泡1.5小時)，銀著色(silver stain)(Oakley，B.R.et al.Analytical Biochem.(1980)105，361-363)，使凝膠顯現(xiàn)。
對A鏈及B鏈的專一的抗體，通過用有明礬沉淀的佛羅因德佐劑參與的游離肽按Eddie，L.W.et al.(1986)The Lancet 1，1344-1346.所述之方法對新西蘭白兔進行免疫以增進免疫性。測定同樣是必需的，由每一免疫性所獲之抗血清對A鏈用bb測定，對B鏈用ccc測定。稀釋500倍，保溫并用硝化纖維素濾紙過濾2小時，至過夜。濾紙洗過后與125 I-蛋白質(zhì)A一起保溫2時，干后置于X射線膠片前。
以下的例子用作對本發(fā)明的方法進行描述。所舉之例僅用于說明而不是對本發(fā)明之范圍進行限定。
例1天然人類松弛素H2(B33 A24)以固態(tài)凍干粉形式將還原之松弛素A鏈(10mg)加入反應(yīng)混和物。還原之松弛素B鏈(5.63mg)亦以固態(tài)凍干粉形式加入。在室溫下(25℃左右)如上將凍干粉形式的松弛素A鏈加入，繼而加入松弛素B鏈(用NaOH將PH調(diào)至10.5)。在10ml小瓶中進行結(jié)合。反應(yīng)用RP-4反相分析HPLC進行監(jiān)測以期最大限度地形成重組合的松弛素。由于天然形式的H2 B鏈的不溶性，根據(jù)本發(fā)明它和A鏈的重組合須在以下條件最終反應(yīng)條件為0.1M甘氨酸，PH10.5，1mMEDTA，2.5mMDTT，3%1-丙醇，3%乙腈及1M尿素。在室溫下，對反應(yīng)液在敞開于空氣中的情況下攪拌28小時。用分析反相HPLC對松弛素的形成進行監(jiān)測，并用上述方式終止反應(yīng)。高性能液相色譜分析(HPLC)表明松弛素的產(chǎn)量為1.87mg，即19.5% B-鏈結(jié)合。
混和物用制備型RP-4反相HPLC(1×25cm)RP-4 Synchropak 300A進行純化。對出峰流份進行收集并脫去HPLC溶劑后直接應(yīng)用。據(jù)聚丙烯凝膠電泳，氨基酸分析HPLC，氨基末端順序測定及生物測試判斷，該人類松弛素是十分純的。
例2人類松弛素類似物H2(B33 A24)
還原的人類松弛素A鏈(200mg)被溶于40ml水(PH2.0)中。還原的人類松弛素B鏈(B33BL y s4A l a2 5]]>)(100mg)被溶于20ml水(PH2)中。將取自PH2水中的預(yù)備的新鮮原料的A鏈首先加入一個165ml小瓶繼而加入修飾的B鏈在室溫(～25℃)用(NaOH將PH調(diào)整至大約8.0)。進行A及B鏈類似物溶液結(jié)合。用RP-4反相HPLC對反應(yīng)進行監(jiān)測以求最大限度地形成結(jié)合的人類松弛素類似物。根據(jù)本發(fā)明，對于這個人類松弛素類似物采用以下條件反應(yīng)B0.1M三羥甲基甲胺(Tris)PH8.0，1mMEDTA，2m MDTT，24℃。反應(yīng)時敞開于空氣中并劇烈攪拌。加入冰醋酸使PH值至4以終止該結(jié)合反應(yīng)。
混和物用制備型多孔層實心球C4柱300
(5×50cm)HPLC進行純化。收集人類松弛素類似物的出峰部份(洗脫體積大約140ml)再凍干，回收35mg松弛素即20.3%B鏈結(jié)合。用聚丙烯凝膠電泳，氨基酸分析，氨基末端順序測定，HPLC(參見圖2a)及生物測試判斷，該人類松弛素類似物相當純。
例3人類松弛素類似物H2(B2-33 A24)
將還原狀人類松弛素A鏈(41.5mg)溶于8ml H2O(PH2.0)。氨基末端第一個氨基酸被刪去的還原狀人類松弛素B鏈(B2-33
)(23mg被溶于4ml水(PH2)中。首先加入A鏈，繼而加入修飾的B鏈都是用上述PH2水中的新鮮原料在室溫(～25℃)下于33ml小瓶中(并用NaOH調(diào)PH至8.0)進行A鏈及B鏈類似物溶液的結(jié)合。用RP-4反相HPLC對反應(yīng)進行監(jiān)測以期最大限度地使人類松弛素類似物結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明，對于該松弛素類似物采用如下條件反應(yīng)D0.1 M三羥甲基甲胺(Tris)，PH8，25℃;通N2并與開始1-2小時在氮氣氛下進行攪拌。然后，反應(yīng)在與空氣敞開情況下進行并進行劇烈攪拌。加入冰醋酸調(diào)PH到4以終止結(jié)合反應(yīng)。
用制備型多孔層實心球HPLC C4 300 A(5×80cm)對混和物進行純化。收集松弛素類似物的出峰部分(洗脫體積大約為140ml)，然后凍干，回收得到人類松弛素類似物16mg，即40.3%的B鏈結(jié)合。用聚丙烯凝膠電泳，氨基酸分析、氨基末端順序分析、HPLC(參見圖2a)及生物測試，判斷出該人類松弛素類似物是十分純的。
例4人類松弛素類似物H2(B2-33 A24)
還原的人類松弛素A鏈(41.5mg)溶于8ml水(PH2.0)。還原的氨基末端第一氨基酸被刪去的)人類松弛素B鏈(B2-33
)(23mg)溶于4ml水(PH2)中。取上述PH2的水中的新鮮原料，首先加入A鏈繼而加入經(jīng)修飾的B鏈，用NaOH調(diào)PH至8.0，在室溫下(～25℃)于一個33ml小瓶中進行A及B鏈類似物的結(jié)合。用RP-4反相HPLC對反應(yīng)進行監(jiān)測以期最大限度地形成結(jié)合的人類松弛素類似物。根據(jù)本發(fā)明，該松弛素類似物采用如下條件反應(yīng)D0.1M三羥甲基甲胺(Tris)PH8，25℃;通入N并于開始之1～2小時于氮的氣氛下攪拌。然后反應(yīng)在向空氣敞開并劇烈攪拌的情況下進行。加入冰醋酸至PH為4以終止聯(lián)合反應(yīng)。
用制備型多孔層實心球柱C4 300 (5×80cm)HPLC提純混和物。收集松弛素富含區(qū)組份(洗脫體積大約為140ml)，并冷凍干燥，回收得到7.5mg人類松弛素類似物，即18.9%B鏈結(jié)合。用聚丙烯凝膠電泳，氨基酸分析，氨基末端順序測定，HPLC(參見圖2a)及生物學測試，判斷出該松弛素類似物相當純。
例5人類松弛素類似物H2(B33 A24)
還原的人類松弛素A鏈(200mg)溶于40ml水(PH2.0)。還原的人類松弛素B鏈(B33
)(100mg)溶于20ml水(PH2)。
取自上述新鮮原料的PH2的水溶液，在165ml小瓶中首先加入A鏈，繼而加入修飾了的B鏈在室溫(～25℃)(用NaOH將PH值調(diào)至大約8.0)下使A鏈及B鏈類似物進行結(jié)合。用RP-4反相HPLC對反應(yīng)進監(jiān)測，以期使人類松弛素類似物發(fā)生最大限度的結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明，該人類松弛素類似物采用的下條件反應(yīng)B0.1M甘氨酸鈉，PH8.0，1mMEDTA，2mMDTT，24℃。反應(yīng)在敞開于空氣情況下，進行劇烈攪拌條件下進行。加入冰醋酸調(diào)PH值至4以終止聯(lián)合反應(yīng)。
用制備型多孔層實心球柱C4 300
(5×50cm)HPLC提純混和物。收集富含人類松弛素類似物的組份(洗脫體積大約為140ml)，然后凍干，回收16mg松弛素，即9.3%B鏈發(fā)生聯(lián)合。用聚丙烯酰胺凝膠電泳，氨基酸分析，氨基末端順序測定、HPLC(參見圖2a)及生物測試，判斷該人類松弛素類似物相當純。
例6生物測試在電刺激收縮存在的情況下，用鼠子宮收縮性體內(nèi)生物測試來測定人類松弛素對平滑肌的松弛作用。J.St.Louis，(1981)Can.J.Physiol.Pharmacol.59.507-512。用鼠恥骨間聯(lián)合韌帶體內(nèi)生物測試來測定松弛素對結(jié)締組織的改變作用，Steinetz，B.G.et al.(1960)Endocrinology 67，102.以H2(B2-33 A24)H2(B33 A24)
，H2(B33 A24)
以及以下的H2(B2-33 A24)
的pyro-Glu形式及H2(B33 A24)
的生物學劑量效應(yīng)對比表明了在MPS及RUC測試中的生物學活性。人類松弛素類似物及人類松弛素的MPS數(shù)據(jù)示于圖3。如圖3，MPS劑量效應(yīng)表明天然人類松弛素與H2(B2-33 A24)
之間的等效性。然而，豬松弛素顯出與其它松弛素的不平行響應(yīng)。所有的人類松弛素的類似物與天然順序人類松弛素在MPS生物測試上基本上不可分辨。
由于可獲得的提純的H2(B33 A24)的數(shù)量限制，僅能在劑量范圍的高端進行比較。結(jié)果表明天然人類松弛素與其類似物之間活性的相同性。人類松弛素劑量響應(yīng)曲線斜率可能和它的類似物的響應(yīng)曲線斜率有所差別。
在RUC生物測試中人類松弛素與其類似物的斜率是相同的。
例7人類松弛素對懷孕期靈長目動物的作用用上述的方法，對交配后懷孕期為130至160天中的獼猴進行H2(B33 A24)
及H2(B2-33 A24)
兩種人類松弛素類似物的測定。用改進的畢曉普Bishop打分法對觀察到的參數(shù)打分，7個獨立的不同劑量的輸注引起子宮頸平均變化值為3.7單位。該數(shù)據(jù)如圖4所示，其中還顯示了100、50及10μg劑量的個別輸注，及所有其它10μg輸注的平均值及兩種對照。(除兩點而每點至少代表4只猴子外)非輸注對照猴每點為2至15次測驗，并標出了平均值。一般，隨著孕期的發(fā)展，子宮頸對較少劑量的松弛素，或在此階段早期的反復施用松弛素更為敏感。高劑量松弛素(100或50μg)即使在孕期的較早階段(130-140天)可以對子宮頸的成熟產(chǎn)生顯著的變化(包括1至10分的變化)。子宮頸的變化似乎與子宮電肌動活性或子宮內(nèi)壓力等任何連貫變化無關(guān)。該結(jié)果表明，結(jié)合的人類松弛素對于在懷孕期最后第三階段引成靈長目動物子宮頸成熟具有高度的效力。
本發(fā)明的人類松弛素及其類似物可用現(xiàn)知方法制成藥用配方，諸如人類松弛素或其類似物配以藥物上可接受的載體。如標準配方論文，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences by E.W.Martin.所述，可采用合適的賦形劑及其配方，包括其它必要的人類蛋白，例如人類血清白蛋白。
權(quán)利要求
1.一種將人類松弛素A鏈或其類似物與人類松弛素B鏈或其類似物結(jié)合以生產(chǎn)人類松弛素或其類似物的方法，其特征為，包括將還原態(tài)A鏈及還原態(tài)B鏈在PH值從大約7.0至大約12的水介質(zhì)中混合，并使之處于使松弛素B鏈溫和變性的條件下，以形成人類松弛素或其類似物。
2.由權(quán)利要求
1所述之方法，其特征為，其中還原態(tài)的人類松弛素A鏈及還原態(tài)的人類松弛素B鏈分別具有由天然存在人類松弛素H2)所代表的氨基酸順序。
3.由權(quán)利要求
1所述之方法，其特征為，其中還原態(tài)的人類松弛素A鏈及還原態(tài)的人類松弛素B鏈分別具有由天然存在人類松弛素(H1)所代表的氨基酸順序。
4.由權(quán)利要求
1所述之方法，其特征為，其中還原態(tài)人類松弛素A鏈為所述A鏈之類似物。
5.由權(quán)利要求
1所述之方法，其特征為，其中還原態(tài)的人類松弛素B鏈為所述B鏈之類似物。
6.由權(quán)利要求
1所述之方法，其特征為，其中還原態(tài)人類松弛素B鏈至少具有二十五個氨基酸并可達到并包括三十三個氨基酸，并可帶有取代基，取代基至少為在所述鏈上有一個蛋氨酸取代。
7.由權(quán)利要求
1所述之方法，其特征為，其中還原態(tài)的人類松弛素B鏈被縮短至三十二個氨基酸，在其鏈的4位上有一個賴氨酸，在25位上有一個丙氨酸。
8.由權(quán)利要求
1所述之方法，其特征為，其中所述混合是在自大約15℃至大約30℃的溫度下進行的。
9.由權(quán)利要求
1所述之方法，其特征為，其中所述混合是在室溫下進行的。
10.由權(quán)利要求
1所述之方法，其特征為，其中還原態(tài)的人類松弛素A鏈在其鏈上的1位有一個Pyro-Glu。
11.人類松弛素類似物H2(B 33 A 24)
12.人類松弛素類似物H2(B 2-33 A 24)
13.人類松弛素類似物H2(B 2-33 A 24)
14.人類松弛素類似物H2(B 33 A 24)
15.一種引產(chǎn)的方法，其特征為，該方法施用含作為唯一活性劑的人類松弛素及作為藥物上可接受載體的藥物配方。
16.一種引產(chǎn)的方法，其特征為，該方法施用含作為唯一活性劑的人類松弛素類似物及藥物可接受載體的藥物配方。
專利摘要
一種結(jié)合人類松弛素A鏈及B鏈以生產(chǎn)人類松弛素或新穎的人類松弛素類似物的方法，包括將還原態(tài)的人類松弛素A鏈及還原態(tài)人類松弛素B鏈在pH值自大約7.0至大約12的水介質(zhì)中，在室溫及使松弛素B鏈溫和變性的條件下，結(jié)合以形成人類松弛素或新穎的人類松弛素類似物。
文檔編號C07K14/64GK87104447SQ87104447
公開日1988年2月10日 申請日期1987年6月23日
發(fā)明者約翰·帕里·波尼爾, 波兒·道格拉斯·約翰斯通 申請人:基因技術(shù)公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan