專利名稱:蛋白質(zhì)及其制備方法，adn的順序，抗體及其用途，痘病病毒，被轉(zhuǎn)化或感染的細(xì)胞用于預(yù) ...的制作方法
本發(fā)明涉及制備抗血吸蟲病的疫苗。
血吸蟲病(或者住血吸蟲病)是遍及熱帶和亞熱帶地區(qū)的危害人類地寄生蟲所造成的疾病(除了北美地區(qū)以外)，這種疾病同樣蔓延到北非洲，並在埃及嚴(yán)重擴(kuò)延在西班牙和葡萄牙也有所發(fā)現(xiàn)。
這種疾病影響了世界上2-4億的人口，能造成血吸蟲病的寄生蟲是形狀較小的扁平的蠕蟲，其中通過淡水軟體動物作為中間宿主以進(jìn)行其生命的再生循環(huán)。由此可見，這種疾病能隨著熱帶地區(qū)開發(fā)灌溉渠網(wǎng)和河壩而擴(kuò)延。
我們知道造成人類血吸蟲病的病原體有五種最廣泛流行的是曼蚊血吸蟲病(S.mansoni)，它一般在非洲和美洲蔓延;還有兩種，即住血吸蟲病(S.haematobium)和插入血吸蟲病(S.intercalatum)，它們一般多發(fā)現(xiàn)于非洲;另外的兩種是日本血吸蟲病(S.japonicum)和湄公血吸蟲病(S.mekongi)，一般多發(fā)現(xiàn)于亞洲。
我們有必要了解和掌握寄生蟲的生活習(xí)性，以便能制定防止這種疾病的整體戰(zhàn)略。
實(shí)際上，寄生蟲幾乎完全適應(yīng)宿主的天然防御當(dāng)其成年時，它能完全躲避免疫機(jī)構(gòu)，並在靠近腸壁的血管或膀胱中生存5-20年(指曼蚊血吸蟲或住血吸蟲)寄生蟲在人體中不再生繁殖，但雌蟲每天能產(chǎn)下3000個卵。這些蟲卵和寄生蟲新陳代謝的排泄物不斷出現(xiàn)于宿主的循環(huán)機(jī)構(gòu)中，從而導(dǎo)致各種紊亂(腸系統(tǒng)紊亂，輸尿系統(tǒng)紊亂，全身虛弱，貧血，肉芽腫及毛細(xì)血管堵塞，從而導(dǎo)致組織的纖維織炎和嚴(yán)重的肝炎)。
具有距的這些卵能穿透腸壁和膀胱壁，並在其中造成了微小的損傷，然后被排泄出去。如果它們能較快地接觸到水，它們就在水中變成纖毛幼蟲(纖毛蚴)，並在水中游動直至穿入軟體動物內(nèi)。在這中間宿主中，幼蟲繼續(xù)不斷地進(jìn)行無性繁殖，生產(chǎn)出能在水中自由游動的許多尾蚴(被單個纖毛蚴染污的軟體動物，在8-10個月生存期中能生產(chǎn)出50000以上的尾蚴)。
尾蚴是只能生存1-2天的浮生幼蟲，當(dāng)它迂到哺乳動物，尤其是人體時，能穿透皮膚。在皮膚中，它能轉(zhuǎn)變成血吸蟲蚴體，即未成熟的寄生蟲，然后隨著人體的血循環(huán)相繼地傳到心臟、肺，並最終達(dá)到肝臟，就是在肝臟循環(huán)系統(tǒng)中這些蚴體變成了成蟲。雄蟲與雌蟲在其中交配，雌蟲定居于由雄蟲的軀體合攏所構(gòu)成的溝渠中，這對雌雄結(jié)合體最終定居于人體腹部的血管中，其中雌蟲開始產(chǎn)卵了。
使血吸蟲蚴體完全成熟變成一個成蟲，需要半個月的時間。在成蟲階段，寄生蟲是吸附在宿主的分子表面上，借助這種掩敝，使它能逃躲免疫的識別和保護(hù)機(jī)構(gòu)。此外，寄生蟲本身分泌出能夠抑制免疫的物質(zhì)。每一對血吸蟲在其宿主中能生存若干年，並且每天能產(chǎn)下數(shù)以千計的蟲卵。
現(xiàn)有一種抗成年寄生蟲的有效藥物，即吡喹酮，但是其價格太昂貴，以致于不可能考慮在發(fā)展中國家普遍使用之。而且這種藥也不能作為防止再傳染的預(yù)防藥。然而，在病染地區(qū)，當(dāng)?shù)鼐用駝t往往是接觸到受這些幼蟲染污的水。
因此，預(yù)防這種疾病的最大希望只能寄托在制備能抗未成年寄生蟲，即血吸蟲蚴體的有效疫苗上。這種疫苗應(yīng)該可用于兒童以預(yù)防初級傳染，並且能用于已染上疾病，並用吡喹酮藥治療過的病人，以避免再次被傳染。
這種疫苗應(yīng)該包含一種或多種重要的血吸蟲蚴體的抗原，而且應(yīng)能誘導(dǎo)一種有效的免疫反應(yīng)，以使幼蟲在未逃躲宿主的保護(hù)機(jī)構(gòu)前能被治住。
當(dāng)前的研究工作(請閱1985年的Capron和Dessaint評論)能夠鑒別出數(shù)量有限的出現(xiàn)在寄生蟲及其幼蟲表面上的蛋白質(zhì)抗原，而且它們在誘導(dǎo)免疫性反應(yīng)方面扮演了重要的角色。
1985年Balloul等人闡明了其中之一的上述抗原在用由凝膠提純的曼蚊血吸蟲病提取物對老鼠實(shí)施免疫以后，誘導(dǎo)抗體能識別出一種被稱作P28的28Kd抗原，它是出現(xiàn)在寄生蟲的幼蟲和成蟲上。這些相同的抗體能識別活體外的寄生蟲的RNAm提取物的轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物和血吸蟲蚴體中被標(biāo)記為1125I的一個外蛋白質(zhì)。
這些抗體，抗-P28雖然本身不能中和血吸蟲蚴體，但能激活細(xì)胞毒的細(xì)胞反應(yīng)，從而能殺死血吸蟲蚴體。
把提純的蛋白質(zhì)P28接種到試驗(yàn)用的大鼠和小鼠身上。這些免疫過的動物，在試驗(yàn)過程中具備高度的保護(hù)作用，以抗血吸蟲蚴體的傳染(Balloul等人，1986年)。
上述試驗(yàn)表明了抗原P28具有重要的誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的作用。
本發(fā)明涉及CADN順序的鑒別和測定，該順序是為抗原P28或至少為一個多肽密碼的，該多肽包含P28的抗原決定基，這些抗原決定基被用于抗天然的蛋白質(zhì)P28的抗體所識別。
這就是為什么本發(fā)明首先涉及如圖1所示的為成熟蛋白質(zhì)P28密碼的ADN順序。
本發(fā)明同樣涉及一種蛋白質(zhì)，其中的合成是被CADN所操縱，該合成可以在不同的宿主細(xì)胞、細(xì)菌、酵母或超細(xì)胞中進(jìn)行，這取決于CADN被插入的載體和它所屬的表達(dá)的控制信號。
據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)能表現(xiàn)出與出現(xiàn)在血吸蟲蚴體的天然蛋白質(zhì)P28相同的一級結(jié)構(gòu)。然而它也可以是后者(即天然蛋白質(zhì)P28)的衍生物，或是不完全的蛋白質(zhì)P28，然而它包含用于被抗體識別的，因而用于誘導(dǎo)免疫的重要的抗原決定基。這種蛋白質(zhì)或不完全的蛋白質(zhì)，還能被融合到別的蛋白質(zhì)上(或蛋白質(zhì)的片段)，這可依據(jù)相應(yīng)的ADN片段的基因操作法，以便有助于宿主細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的更好的表達(dá)或誘發(fā)其排出細(xì)胞外。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，在各種不同宿主細(xì)胞中的外來基因的表達(dá)和克隆(無性繁殖)的工藝技術(shù)。這些工藝將在以后的實(shí)例中敘述，不過還可能用上其它的載體和其它的宿主細(xì)胞。
在E.coli(大腸桿菌)的情況下，在細(xì)菌中的P28基因的表達(dá)是采用含有啟動子λPL和CⅡrbs作為核糖核蛋白體的固定部位的載體而取得的。所得的雜種蛋白質(zhì)包含一段蛋白質(zhì)CⅡ和蛋白質(zhì)P28，或者一段蛋白質(zhì)P28。
在宿主是酵母的情況下，例如，啤酒酵母(S.cerevisiae)，可以采用酵母的質(zhì)粒載體，其在酵母中包含有一個功能性的復(fù)制原點(diǎn)，例如質(zhì)粒2μ的復(fù)制原點(diǎn)和如URA3的選擇基因。在這種情況下，所用的啟動子是基因PGK的啟動子，即部位5′的PGK基因，它能導(dǎo)致一個融合蛋白質(zhì)，或者一個成熟的蛋白質(zhì)。
當(dāng)宿主是哺乳動物的細(xì)胞時，最好采用痘病病毒作為表達(dá)載體，例如疫苗的病毒，其中為蛋白質(zhì)密碼的基因，在基因的表達(dá)順序的操縱下被痘病病毒所安置。這重組病毒包含為本發(fā)明的蛋白質(zhì)密碼的基因，它最好是被插入在疫苗的TK基因中，並處于強(qiáng)的啟動子，如疫苗的7.5K蛋白質(zhì)的啟動子的操縱下。為本發(fā)明的蛋白質(zhì)密碼的基因同樣可被融合到一個為功能性信號順序密碼的區(qū)域，例如白氨酸(interleukine)或狂犬病的糖蛋白質(zhì)的信號順序，以確保使蛋白質(zhì)排出細(xì)胞外，在這種情況下相應(yīng)的蛋白質(zhì)是包含一部分非來源于血吸蟲蚴體的蛋白質(zhì)的雜種蛋白質(zhì)。
為本發(fā)明的蛋白質(zhì)密碼的基因同樣可以被融合到為狂犬病的病毒的糖蛋白質(zhì)的跨膜帶密碼的區(qū)域中，以確保使蛋白質(zhì)固定在受染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜中。
本發(fā)明同樣涉及被本發(fā)明的蛋白質(zhì)的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，以及該蛋白質(zhì)的制備方法，其特點(diǎn)是據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)這些宿主細(xì)胞並回收這些蛋白質(zhì)。
當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員已知取決于宿主的蛋白質(zhì)的培養(yǎng)、回收和分離方法。
本發(fā)明還最終涉及用于抗血吸蟲病的疫苗的藥劑組合物，其特點(diǎn)至少在醫(yī)藥上可接受的載體中包含有據(jù)本發(fā)明的痘病病毒或蛋白質(zhì)。
本發(fā)明特別涉及活的疫苗，其特點(diǎn)它們包含表達(dá)據(jù)本發(fā)明蛋白質(zhì)的活的重組疫苗的病毒，而且可用于在醫(yī)藥上可接受的載體中。
這些疫苗最好是制成藥用的方式，例如注射劑，而醫(yī)藥上可接受的載體可以是用于注射的含水載體。
接種的方法應(yīng)該適應(yīng)所用的疫苗的形式(活的病毒或蛋白質(zhì))。
最后，本發(fā)明涉及用于抗本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗血清。
此外，本發(fā)明還闡明了重組蛋白質(zhì)P28(或P28Ⅰ)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的酶活性。
谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶是廣泛分布的酶，存在于植物和動物中，而且在各種分子的解毒反應(yīng)中起作用(狂犬病的親電子化合物，內(nèi)長植物的超氧化物，烷基化劑(agents alkylants)，除莠劑……)。
1986年Smith等人的研究工作表明日本血吸蟲寄生蟲能合成出谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，它在抗由受染宿主的免疫性影響的細(xì)胞所產(chǎn)生的自由基因方面能起到保護(hù)寄生蟲的作用。
本發(fā)明更特別涉及闡明了在E.coli或啤酒酵母(S.cerevisiae)中合成的，由曼蚊血吸蟲衍生出的蛋白質(zhì)P28Ⅰ的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性，其中有關(guān)的疫苗抗原已如上所述。
本發(fā)明還特別涉及已如上所述的蛋白質(zhì)的應(yīng)用，它可以作為，如蛋白質(zhì)P28，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性的顯示劑。
本發(fā)明也涉及被前述的蛋白質(zhì)的表達(dá)阻斷所感染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的應(yīng)用，它可以用作顯示谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性的介質(zhì)。
這些蛋白質(zhì)和細(xì)胞可以在實(shí)施谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性的微生物的轉(zhuǎn)化過程中作為轉(zhuǎn)化劑加以應(yīng)用。
本發(fā)明還詳述，為次級蛋白質(zhì)P28密碼的，而且被用于抗天然蛋白質(zhì)P28的抗體所識別的CADN順序的測定和鑒別。實(shí)際上本發(fā)明涉及如圖16所示的為成熟的蛋白質(zhì)P28Ⅱ密碼的ADN順序。
本發(fā)明還涉及一種蛋白質(zhì)，其中的合成是受CADN或一段CADN所操縱，該蛋白質(zhì)是被用于抗天然蛋白質(zhì)P28的抗體所識別。
本發(fā)明還涉及并入了為成熟蛋白質(zhì)P28Ⅱ或P28Ⅱ片段密碼的CADN的細(xì)胞。
在以后的實(shí)例中雖然蛋白質(zhì)只是在細(xì)菌，E.coli中被表達(dá)，然而它的合成可以在不同的宿主細(xì)胞，細(xì)菌，酵母或超細(xì)胞中實(shí)施，這取決于插入CADN的載體，這已如前所述。
P28Ⅱ基因的表達(dá)，如上所述，可以用含有啟動子λPL和核糖核蛋白體CⅡrbs的固定部位的載體所實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明還涉及通過培養(yǎng)前述的細(xì)胞，以制備該蛋白質(zhì)。
本發(fā)明還涉及用于治療和預(yù)防血吸蟲病的藥用組合物，其特點(diǎn)如前所述，它至少含有一種作為活性劑的蛋白質(zhì)。
當(dāng)然，如果CADN是被并入到如疫苗的痘病病毒中，那么這種痘病病毒在某些情況下，可以直接作為疫苗用劑加于利用。
同樣可以培養(yǎng)用于抗這些蛋白質(zhì)的抗體。這些抗體和蛋白質(zhì)可以用作診斷血吸蟲病的藥劑。
在本發(fā)明中附圖所示的基因的核苷酸順序或者蛋白質(zhì)的氨基酸不是無關(guān)緊要的部分，而是本發(fā)明和本發(fā)明說明書的不可分割的部分。
下面的實(shí)例是用于闡明本發(fā)明的其他的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。
用附圖加以闡述本說明書。
本文附圖如下說明
圖1表示減去λTG06，λTG08，λTG09，λTG10和λTG11順序的CADN的完整順序。
開相從第7個核苷酸開始，該相為其分子量為28Kd的211氨基酸的多肽密碼的。
圖2表示通過把λTG06的插入物ECORⅠ合并到PTG1924所構(gòu)成的PTG44。PTG1924是用相中的ECORⅠ部位，從PTG908衍生出來的，並位于CⅡ的起始密碼子上游的46Pb.PTG44是為分子量為25Kd的融合蛋白質(zhì)CⅡ/P28密碼的。
圖3表示被插入于PTG44的表達(dá)阻斷所密碼的融合蛋白質(zhì)CⅡ/P28的順序。
圖4表示在丙烯酰胺-SDS凝膠電泳和染成Coomassie蘭色以后E.coli TGE901 PTG44的全部提取物和不溶解部分的提取物。
箭頭指示25Kd蛋白質(zhì)的位置。
A.TGE901 PTG44在30℃時的全部提取物。
B.同一提取物中的非溶解部分。
C.在37℃下誘導(dǎo)7個小時后TGE901 PTG44的全部提取物。
D.同一提取物的非溶解部分。
E.在42℃下誘導(dǎo)7個小時后TGE901 PTG44的全部提取物。
F.同一提取物的非溶解部分。
G.可溶解于SDS(0.2%)的F部分。
H.在42℃下控制培養(yǎng)7個小時以后的TGE901 PTG1924的全部提取物。
I.同一個提取物的非溶解部分。
圖5表示在丙烯酰胺-SDS凝膠電泳和染成Coomassie蘭色以后，生成被結(jié)構(gòu)PTG1885和PTG1886所密碼的蛋白質(zhì)P28的啤酒酵母(S.Cerevisiae)TGy1SP4的提取物。
A.TGy1SP4/PTG1885(28kd的未融合蛋白質(zhì))的提取物。
B.TGy1SP4對照培養(yǎng)的提取物。
C.TGy1SP4/PTG1886(30Kd的融合蛋白質(zhì))的提取物。
圖6表示在“Western blot”中能用天然的P28的特定的兔子的抗體所分析的能生成成熟的或融合物的28Kd蛋白質(zhì)的啤酒酵母(S.cerevisiae)和E.coli的提取物。這些固定的抗體是被抗-兔的抗體所識別，並被生物素所標(biāo)記，而且接著這復(fù)合物被抗生蛋白鏈菌素-過氧化酶所顯示並被HRP(多孔氧化鋁-bioRad)所染色。
A.E.Coli TGE901 PTG44的全部提取物。
B.同一個提取物的非溶解部分。
C.能生成成熟蛋白質(zhì)的啤酒酵母(S.Cerevisiae)TGy1SP4/PTG1885的全部提取物。
D.能生成被融合在PGK的22個第一氨基酸的成熟蛋白質(zhì)的啤酒酵母TGy1SP4/PTG1886的全部提取物。
E.負(fù)對照的啤酒酵母(S.Cerevisiae)的提取物。F、G、與C和D相同的提取物，濃度低2倍。
圖7表示相中ECORⅠ的部位，它在人類的白氨酸(interleu-kine)2的9個第一氨基酸的CADN區(qū)配中被誘變劑所操縱。
圖8表示通過把λTG06和λTG09的ECORⅠ片段插入到PTG188-Ⅰ的ECORⅠ部位所形成的PTG45和PTG46的構(gòu)成(請見圖7的構(gòu)成)。
圖9表示被PTG45所密碼的融合蛋白質(zhì)IL2/P28的結(jié)構(gòu)。人們標(biāo)記信號肽的存在，該信號肽可以使含有P28最大部分的24Kd蛋白質(zhì)排泄出去。
圖10表示被PTG46所密碼的融合蛋白質(zhì)IL2/P28的結(jié)構(gòu)。信號肽可以使含有抗原P28的中心部分的16Kd蛋白質(zhì)排泄出去。
圖11表示為IL2/P28密碼的，並在7.5K疫苗的啟動子控制下放置的基因，在帶有疫苗基因TK的質(zhì)粒中的插入。通過雙重組的表達(dá)阻斷在病毒的基因組中的插入進(jìn)入到TK順序。
圖12表示在細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)BHK21中;排出的蛋白質(zhì)被老鼠或兔子的專門抗體天然P28所檢測，其中的培養(yǎng)介質(zhì)BHK21是被重組病毒VV.TG.P28 Sm-1和VV.TG.P28 Sm-2所感染。
A和D VV、TG、P28 Sm-1的殘留
B和E VV、TG、P28 Sm-2的殘留
C和F 被未馴化VV所感染的培養(yǎng)的殘留
A、B、C 被兔子的抗體所檢測
D、E、F 被老鼠的抗體所檢測
編號與獨(dú)立的分離物相對應(yīng)。
圖13是被用天然蛋白質(zhì)P28的“Western blot”試驗(yàn)所作的抗-P28抗體的檢測，其中是在被E.Coli所合成的蛋白質(zhì)CⅡ/P28所免疫的老鼠血清中進(jìn)行的。
-NRS對比的老鼠血清，未被接種
-SR28-20，J8，J11，J16，J23是接種蛋白質(zhì)CⅡ/P28以后第8，11，16和23天所取的老鼠血清
-SR28用天然蛋白質(zhì)P28接種后老鼠的血清。
圖14表示圖13中的所有血清的生物活性，是在抗血吸蟲蚴體的從屬-細(xì)胞毒素-嗜曙紅細(xì)胞(Cytotoxicité-éosinophile-dépendante)試驗(yàn)中測得的(見表Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ)。
-SR28-20表示抗克隆片段20KDa的抗血清，它是進(jìn)行第二次注射以后在不同時間所回收的曼蚊血吸蟲的28KDa抗原
-SR-28表示抗天然P28的抗血清，它是在第二次注射后第14天回收的。
圖15表示如下的曲線
-鼠肝的GT(9μg，6μg)
-E.Coli的原始提取物，對照(o)，和TGE901/PTG54(
)
-啤酒酵母(S.Cerevisiae)的原始提取物，對照(
)，被質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的(Δ)和TGy2SP13b/PTG2800(+)。
圖16a和16b表示蛋白質(zhì)P28Ⅱ的CADN的順序，以及跟隨本文中三個相的相應(yīng)的蛋白質(zhì)的順序。
圖17表示用Coomassie染成蘭色后E.Coli提取物的在丙烯酰胺凝膠中的電泳
A，C和F 全部提取物
B、D和E 同一個提取物中的非溶解部分
A、B、C、D E.coli TGE901/PTG56
E、F E.Coli TGE901/PTG908(對照載體)
G 分子量的記號
例1
為蛋白蛋P28密碼的CADN的克隆和鑒定
用于克隆為抗原P28密碼的基因的策略，其中的順序尚未為人所知，已經(jīng)借助于抗P28的多克隆的抗體，去鑒別出在E.Coli中寄生蟲的CADN庫的表達(dá)產(chǎn)物。這些抗體是用在凝膠中分裂的曼蚊血吸蟲寄生成蟲的提取物的老鼠和兔子的免疫所誘導(dǎo)。
CADN庫的制備
用血吸蟲成蟲的提取物ARN，通過MLV的逆轉(zhuǎn)錄酶的作用合成出互補(bǔ)的ADN小段，用核酸酶S1處理，通過Coli的聚合酶的Klenow片段的作用而生成雙小段的ADN，以生成其自由末端，人們在蔗糖級度上選擇所尋求的片段大小，也就是說500-4000Pb，借助于合成接受體5′-AATTCCCCCCCCCCC-3′(Bouc等人，1986年)向這些片段加入殘留物dG，而且將它們插入到噬菌體的衍生物λgt10的ECoRⅠ部位(Huynh，1984年)。
在上述連接后，把這些重組的噬菌體裝入試管中，接著把形成的噬菌體2×106庫，通過在E.Coli POP101的接種而被放大(Lathe，1977年)。
放大后，把噬菌體用PEG濃縮，用兩次離心提純到Clcs級度，從而提取它們的ADN。CADN的插入是通過ECoRⅠ的消化作用而取得的，而且提純到蔗糖級度，在使CADN和E.Coli的β-半乳糖苷糖的基因融合以后，接著把500-2000Pb的部分插入到表達(dá)載體中，即在乳糖啟動子操縱下能表達(dá)外來基因的噬菌體的衍生物λgt11(young和Davis，1983年)。
庫的篩選和挑選物的選擇
在E.Coliy1090接種λgt11庫(young和Davis，1983年)以形成稀釋液(即在直徑90mm的盒中有1×105噬菌體)作為樣本。
在42℃下和有異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃苷的條件中，在乳糖啟動子的操縱下開始表達(dá)蛋白質(zhì)。
用硝化纖維素過濾器吸附這些合成的蛋白質(zhì)，以便在有特別的兔子抗體P28存在下進(jìn)行接種。這個固定的抗體被次級抗-兔抗體所識別，並用生物素標(biāo)記，接著把這復(fù)合物用抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶反應(yīng)以顯示之，然后用HRP(多孔氧化鋁-Bio Rad)染色。
這種用抗體的測定能夠鑒定重組的噬菌體，其中CADN的插入導(dǎo)致帶有抗原決定部位的部分蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的合成，這些抗原決定部位(基)是被特種的抗體，抗-P28所識別的。
第一次挑選，選用了三個獨(dú)立的分離物，λTG06，λTG08和λTG09，它們分別包含CADN在650，700和350堿基對上的插入。
被這些挑選物攜帶的插入物的核苷酸順序部分重迭，並且包含其分子量是28Kd，一個假定的蛋白質(zhì)的C-末端區(qū)域。合成一個被標(biāo)記為32P的，並與λTG06插入的密碼的區(qū)域的5′端互補(bǔ)的合成核苷酸5′-GGAATAGTTGGTTTGATT-3′，而且將其用于篩選在λgt10中的CADN庫。
由此，可以分離出兩個新的挑選物，λTG10和λTG11，這兩個都含有為211氨基酸的蛋白質(zhì)密碼的完整的核苷酸順序，28Kd的PM。
測定被重組噬菌體所攜帶的CADN順序及相應(yīng)的蛋白質(zhì)
圖1中顯示了CADN的完全順序(由不同的挑選物的順序的測定所證實(shí))和作為其來源的氨基酸的一級結(jié)構(gòu)。
其結(jié)果和發(fā)表的東西中實(shí)際上沒有提供任何有關(guān)天然的基因轉(zhuǎn)譯的初級產(chǎn)品和有關(guān)前體以及先于成熟蛋白質(zhì)的信號肽的存在的情況。
然而，初級氨基酸的確切定位不在本發(fā)明的上下文中，因?yàn)橛糜诜蛛x基因和其表達(dá)所采取的策略包括了對出現(xiàn)在P28的主要抗原決定部位的研究，而這些抗原決定部位是被宿主的免疫系統(tǒng)所識別的。
這種論據(jù)適用于下列實(shí)例中，這些實(shí)例描述了在不同的有機(jī)體中重要的抗原決定部位的表達(dá)。
抗原P28的表達(dá)
用于表達(dá)位于P28的抗原性的抗原決定部位所發(fā)展的一般策略是把CADN的克隆過的片段融合成為已被有效表達(dá)和特征化的蛋白質(zhì)的N-末端的區(qū)域密碼的核苷酸順序。一般所得的雜種蛋白質(zhì)也被抗天然的成熟的P28的抗體所識別，而且它可能導(dǎo)致抗寄生蟲的免疫反應(yīng)。通過這種假設(shè)，可以用不同系統(tǒng)的宿主分析融合蛋白質(zhì)的免疫學(xué)特性，如下列實(shí)例所述，或在活體內(nèi)或在活體外同時進(jìn)行上述分析。
例2
在E.Coli中的表達(dá)
為了制取在E.Coli中抗原P28的表達(dá)，可以用在專利申請83，00909所述的，表達(dá)質(zhì)粒的衍生物PTG908去合成融合蛋白質(zhì)，其中的結(jié)構(gòu)如圖3中所示。
載體PTG908含有復(fù)制原點(diǎn)，入噬菌體的啟動子PL和包括基因CⅡ的N-端末端，以及位于轉(zhuǎn)譯的啟動信號下游的限制部位的CⅡ的核糖核蛋白體的固定順序。用密碼子ATG下游的39pb的BamHⅠ部位，通過含有下列寡聚物的雙小段接合體插入ECoRⅠ部位
5′-dGATCCGAATTCG-3′
3′-GCTTAAGCCTAGd-5′
合成的質(zhì)粒，PTG1924，包括單獨(dú)的ECoRⅠ部位與相中的GAA密碼子，以及基因CⅡ的啟動密碼子，所有來自λgt11的重組體的CADN的插入，該重組體在用抗-P28血清挑選以后給出了正的信號，都是直接插入到這個部位的。當(dāng)插入出現(xiàn)在正確的方向上，這就給出一個為基因CⅡ的N-端末端密碼的，並用為抗體P28或其部分抗體密碼的CADN的順序延長的核苷酸的順序。
其中的一個合成的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，PTG44，它在ECoRⅠ部位上含有自λTG06衍生的片段的插入，如圖2所示。圖3中示出了計有25Kd分子量的CⅡ-P28融合蛋白質(zhì)的順序。
被PTG44所轉(zhuǎn)化的E.Coli的培養(yǎng)物N4830在LB介質(zhì)中不斷增長，直至DO600為0.2。然后，通過加溫至42℃，反應(yīng)8個小時就導(dǎo)致了融合蛋白質(zhì)的合成。
培養(yǎng)終了，用Coomassie染成蘭色，在丙烯酰胺凝膠中分析細(xì)胞提取物(圖4)，在用聲處理使細(xì)胞溶解以后，就從所得的不溶解物部分回收融合產(chǎn)物CⅡ-P28。在有0.2%SDS的參與反應(yīng)的條件下，通過對不溶解物部分的提取，就能回收純度為80%的蛋白質(zhì)，用“Wistern blot”對最終制備物分析后，顯示出這種特制的蛋白質(zhì)有效地被用于抗天然的P28的抗原的兔子的抗體所識別(圖5)。
例3
在啤酒酵母(S.Cerevisiae)中的表達(dá)
通過在酵母中表達(dá)P28的CADN能得到兩種結(jié)構(gòu)。第一種是包含N-端，酵母的磷酸甘油酸酯激酶(PGK)的22個第一氨基酸的融合蛋白質(zhì);第二種是與天然成熟蛋白質(zhì)相似的蛋白質(zhì)。
帶有為PGK和P28密碼的基因的融合的載體的構(gòu)成(PTG1886)。
1)包括蛋白質(zhì)P28的CADN的λTG10的ECoRⅠ插入是引入到往返于Coli-酵母之間的質(zhì)粒中，PTG836。
·這質(zhì)粒是PBR322的衍生物，它包含2微米酵母的質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)，基因URA3(專利84.12598)和酵母的基因PGK(Hitzemann等人，1982年)。
·ECoRⅠ的單獨(dú)部位，通過插入下列的合成接合體，被引入到BamHI部位(位于PGK起始因子密碼子下游的20密碼子)和Sal1部位(出現(xiàn)于PBR322順序中)之間的位置
5′GATCTGAATTCAGATCTC-3′
3′-ACTTAAGTCTAGAGAGCT-5′
所得的質(zhì)粒是PTG1880。
·在正確的方向上把λTG10的ECoRⅠ片段插入到PTG1880的ECoRⅠ部位，就得到PTG1883。
2)為了使PTG848插入到酵母的表達(dá)載體中，應(yīng)得到被質(zhì)粒所攜帶的表達(dá)阻斷PGK-P28(法國專利85.06672)。在這里需要在噬菌體M13中的中間操作。
·為了得到M13TG1884，把含有表達(dá)阻斷PGK-P28的HindⅢ-BglⅡ片段插入到居于HindⅢ和BamHⅠ兩個部位之間的M13TG131中(Kieny等人，1983年)。
·這種結(jié)構(gòu)，在有相鄰的限制部位的情況下，能得到SmaⅠ-BglⅡ片段的相同的表達(dá)阻斷。
·接著把這片段引入到表達(dá)載體pTG848的SmaⅠ和BglⅡ兩個部位之間的位置上。
·所得的質(zhì)粒是PTG1886。
3)用質(zhì)粒PTG1886轉(zhuǎn)化酵母TGy1SP4。
用“Western blot”方法和在丙烯酰胺-SDS凝膠上的電泳分析這些培養(yǎng)物的原始的細(xì)胞提取物。在圖5和圖6顯示出明顯的一個新的蛋白質(zhì)帶，30Kd的PM，即所期望的融合蛋白質(zhì)PGK-P28，而且它是被用于抗血吸蟲的天然的提取物P28的抗體所識別。
在啟動子PGK操縱下，只包含P28的CADN的表達(dá)載體的構(gòu)成
1)在上文所述的M13TG1884構(gòu)成中，根據(jù)克隆技術(shù)蛋白質(zhì)P28的起始因子密碼子是在基因PGK的22個第一密碼子和8個密碼子的前面(特別是殘基dc)。在寡核苷酸的存在下，這些附加的90堿基對被活體外的M13TG1884的致突變所缺失
5′-CAACAAAATATAAACA
GCTGGCGAGCATATC-3′
它是接著開始于密碼P28的順序的核苷酸的，PGK的mRNA前導(dǎo)順序的16個第一核苷酸。在這兩個順序之間存在ATG，它同時是PGK的起始因子ATG和P28的起始因子ATG。
2)正確缺失的衍生物，M13TG1884m被SmaⅠ和BlgⅡ，以及帶有未被融合的P28的CADN的順序所消化(融合)，在PGK啟動子的操縱下被放置，而且被插入到表達(dá)載體PTG884中(如上所述)，以便得到PTG1885。
3)用質(zhì)粒PTG1885轉(zhuǎn)化酵母TGy1SP4。
用“Western blot”方法和在丙烯酰胺-SDS凝膠上電泳分析這些培養(yǎng)物的原始細(xì)胞提取物，圖5和圖6中清楚顯示了一個2Kd的PM的新的蛋白質(zhì)帶，它是被用于抗血吸蟲的天然的提取物P28的抗體所識別。
例4
在重組疫苗的病毒中的表達(dá)
a)表達(dá)融合到第一氨基酸IL-2的P28的重組疫苗的病毒的構(gòu)成。
把被噬菌體λTG06和λTG09所攜帶的CADN引入到一些適合的載體中，以便今后能被插入到疫苗的病毒的基因組中，而且能被表達(dá)到哺乳動物的細(xì)胞中。
本發(fā)明的這些載體可衍生一些用于表達(dá)人類的白氨酸-2(interleukine-2-humaine)的載體(見法國專利FR8509480)。同樣地人們已制備出PTG188的衍生物，它包括在核苷酸區(qū)域中的ECORⅠ部位，它是在天然的白氨酸-2的N-末端丙氨酸殘基下游的9個氨基酸(圖7)。在正確方向上把λTG06和λTG09的CADN插入到ECoRⅠ部位和PTG188-Ⅰ部位之間，以便能得到為分子量分別是24Kd和16Kd的融合蛋白質(zhì)IL-2/P28密碼的質(zhì)粒PTG45和PTG46(圖8)，如在圖9和10中所示。在該結(jié)構(gòu)的上游的信號肽能使蛋白質(zhì)排出到培養(yǎng)介質(zhì)中。
質(zhì)粒PTG45和PTG46的重要部分包括被為融合蛋白質(zhì)IL2-P28密碼的順序所中斷的病毒基因TK，該IL2-P28在有效的啟動子操縱下被插入，即疫苗的蛋白質(zhì)7.5K的啟動子。
插入在疫苗的基因TK中的這些順序可以在疫苗的病毒基因組中被雙倒易重組合所轉(zhuǎn)移(圖11)，這如前已述(Panicalli和Paoletti，1982年;Mackett等人，1982年;Kieny等人，1984年)。
這些包括λTG06和λTG09的CADN衍生物的重組病毒VV.TG.P28Sm-1和VV.TG.P28Sm-2是被用來感染單層細(xì)胞BHK21在37℃下反應(yīng)24個小時后，對培養(yǎng)的殘留物進(jìn)行分析，以測定融合蛋白質(zhì)IL-2/P28是否存在，其中在硝化纖維素過濾中吸附，並用天然P28的特種的老鼠或兔子的抗體進(jìn)行接種。
用抗兔子和老鼠的整體免疫球蛋白的含生物素的抗血清進(jìn)行接種，以便檢測出固定的抗體。接著用抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶反應(yīng)和在染料HRP(Bio-Rad)的存在下進(jìn)行最終染色，以呈現(xiàn)出這個復(fù)合物。
此外，對于VV·TG·P28Sm-1和VV·TG·P28Sm-2，這些特種的抗原(100ng/ml以上)可以在培養(yǎng)介質(zhì)中檢測出來(圖12)，這是對不同的獨(dú)立的重組體而言的。然而，只用原始病毒感染的細(xì)胞的殘留物不能給出有意義的信號。
b)表達(dá)融合到狂犬病的糖蛋白的信號肽的P28的重組疫苗病毒的構(gòu)成(VV·TG·1184)。
噬菌體M13TG177的構(gòu)成
噬菌體M13TG169(法國專利86.05043)包括密碼病毒的env基因HIV-1的，並處于為狂犬病的糖蛋白質(zhì)的信號肽密碼的順序的5′-末端和為狂犬病的糖蛋白質(zhì)的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域以及跨膜區(qū)域密碼的順序的3′-末端的兩旁的順序。
把ECORⅠ部位引入到M13TG169的HindⅢ和KpnⅠ兩個部位之間，以形成M13TG179，其結(jié)構(gòu)如下
S狂犬病的糖蛋白的信號。
TM狂犬病的糖蛋白的跨膜區(qū)域。
處于信號肽下游的ECORⅠ部位被借助于如下寡核苷酸的局部致突變所消去。
5′GGGGAAATCGTAATC 3′
所得的噬菌體M13TG177具有單一的ECORⅠ部位。
噬菌體M13TG1105的構(gòu)成
把包含密碼P28的順序的λTG10的受限片段ECORⅠ插入到M13TG177中，以便形成M13TG1105，其結(jié)構(gòu)如下
噬菌體M13TG1108的構(gòu)成
連著信號肽S的這兩個第一氨基酸是被用下列寡核苷酸的局部致突變所融合，形成與密碼P28的順序相連的相。
5′CTTGATATGCTCGCCAGCAATAGGGAATTTCCCAAA3′
所生成的噬菌體叫M13TG1108。
質(zhì)粒PTG1184的構(gòu)成
用PstⅠ部分消化噬菌體M13TG1108，以便分離含有為P28密碼的整個順序的片段，而且把PstⅠ插入到質(zhì)粒PTG186POLy的PstⅠ部位上，以便形成PTG1184。
c)表達(dá)融合到信號肽和狂犬病的糖蛋白質(zhì)的跨膜的P28的重組疫苗的病毒的構(gòu)成(VV·TG·1185)。
噬菌體M13TG1109的構(gòu)成
在噬菌體M13TG1108中，用下列寡核苷酸把轉(zhuǎn)譯的終端的密碼子前面的最后一個氨基酸與TM跨膜區(qū)域的第一個氨基酸相融合
5′TGCACTCAGTAATACATAGAAGGGAGTTGCAGGCCT3′
生成的噬菌體叫M13TG1109
質(zhì)粒PTG1185的構(gòu)成
如同構(gòu)成PTG1184一樣，噬菌體M13TG1109被PstⅠ部分消化，而含有為P28密碼的整個順序的片段被插入到PTG186POLy的PstⅠ部位上，以便形成PTG1185。
d)病毒VV·TG·1184和1185的特征化。
如前述，用質(zhì)粒PTG1184和1185轉(zhuǎn)錄為疫苗的病毒的基因組中的P28密碼的基因。
病毒VV·TG·1184表達(dá)融合到狂犬病的糖蛋白質(zhì)的信號肽的P28。
病毒VV·TG·1185表達(dá)融合到狂犬病的糖蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域和信號肽的P28。
在16個小時中，用VV·TG·1184或1185的病毒感染細(xì)胞BHK21，經(jīng)加入蛋氨酸35S4個小時后，借助于用來抗P28的兔子的抗體使標(biāo)記的蛋白質(zhì)免疫沉淀。在VV、TG、1184病毒的情況下，顯示了一個表示28Kd分子量的帶，這種蛋白質(zhì)同樣大量存在于培養(yǎng)基的殘留物中，表明蛋白質(zhì)的排出。
在VV·TG·1185的情況下，顯示了一個表示35Kd分子量的帶，在培養(yǎng)基的殘留物中，不存在這種蛋白質(zhì)，表明這種蛋白質(zhì)被狂犬病的糖蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域扣留在細(xì)胞膜中。
例5
用以基因方法生產(chǎn)的抗原P28對動物注射疫苗
對含有一個或多個天然P28的大抗原決定基的重組蛋白質(zhì)的生物效應(yīng)進(jìn)行分析，並與用從成熟的寄生蟲的所有提取物中分離出來的成熟的天然P28進(jìn)行大鼠免疫試驗(yàn)所觀察到的反應(yīng)進(jìn)行比較。同時被如E.Coli或啤酒酵母(S.Cerevisiae)的微生物或被重組疫苗的病毒所生產(chǎn)的融合蛋白質(zhì)都可以被使用以達(dá)到接近的效果，但是只有用融合蛋白質(zhì)CⅡ/P28制備的產(chǎn)品在下文中有所闡述。
對大鼠的免疫處理
用50μg的融合蛋白質(zhì)CⅡ/P28(例2)和輔藥Freund通過腹膜內(nèi)注射向三個月的“Fisher”雄鼠(20個)進(jìn)行免疫處理。這些動物在兩個星期以后接受第二次劑量的注射，從第8天開始抽取抗血清。
把每個含有5個標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)量的4“Pools”血清進(jìn)行三次試驗(yàn)，以測得識別天然蛋白P28和對于血吸蟲蚴體的血清的細(xì)胞毒性的抗體的存在。
特種抗體的測試
用E.Coli的CⅡ/P28蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行免疫的大鼠的血清在“Western-blot”中進(jìn)行試驗(yàn)，以測試其抗成年寄生蟲的全部提取物的P28的反應(yīng)，該P(yáng)28是在丙烯酰胺-SDS凝膠中被電泳而分離出來的。圖13清楚地顯示了被這些血清所作的對天然蛋白質(zhì)P28的識別。
到第23天這反應(yīng)到達(dá)了最大程度，而且實(shí)際上與用天然抗原所免疫的動物的血清所作的試驗(yàn)所能觀察到的反應(yīng)強(qiáng)度是相同的。
對依賴嗜曙紅細(xì)胞的細(xì)胞毒性的估價
根據(jù)Capron等人所描寫的工藝方法(1981年)進(jìn)行依賴嗜曙紅細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗(yàn)以估價相同的血清
在每一個欲試驗(yàn)的血清在場(未加熱)或者在適當(dāng)?shù)目刂葡潞陀惺仁锛t細(xì)胞在場時(含有40-70%嗜曙紅細(xì)胞的“Lou”大鼠的非粘著的腹膜細(xì)胞)對50個蔓蚊血吸蟲蚴體進(jìn)行接種。在200μl總體積中對于每個血吸蟲蚴體，反應(yīng)混合物包含了6000個效應(yīng)細(xì)胞。在37℃下接種48個小時以后，用顯微鏡觀察並估量血吸蟲蚴體的死亡百分比例。
表Ⅰ中所示的結(jié)果清楚地顯示出細(xì)胞毒因子的存在能夠?qū)е卵x蚴體的較高的死亡率，這比率接近用蔓蚊血吸蟲染污的大鼠血清所誘導(dǎo)的比率。
闡明IgE在細(xì)胞毒性反應(yīng)中的特殊的作用
用加熱的血清(在56℃加熱2個小時)和補(bǔ)體的附加的加熱血清實(shí)施同樣的細(xì)胞毒性試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果列于表Ⅱ中，並顯示出細(xì)胞毒性的相應(yīng)的因子是熱敏感性的，而且顯示出所喪失的活性不能被補(bǔ)體的添加所補(bǔ)償。
此外，人們能夠通過被大鼠的IgE的特種的山羊的抗血清的吸附作用，有選擇地消去欲研究的血清的IgE，而這種抗血清是被偶聯(lián)到瓊脂糖(Sépharose B.)這些被處理和透析過的血清進(jìn)行了其依賴嗜曙紅細(xì)胞的細(xì)胞毒的活性試驗(yàn)。
表Ⅲ顯示出，老鼠血清在IgE方面的有選擇的衰竭阻止了細(xì)胞毒性的表達(dá)。后者對被蛋白質(zhì)CⅡ/P28免疫的大鼠的血清的IgE是很特效的。
闡明動物的預(yù)防尾蚴的試驗(yàn)注射
把一種在E.coli或在酵母中生產(chǎn)的P28抗原，在氫氧化鋁的存在下，注射到Fischer大鼠身上(如前所述)，或者用表達(dá)抗原P28的疫苗的病毒，VV·TG·1185(每個動物用5×107ufp重組病毒)注射該大鼠。
而只用氫氧化鋁注射到對照試驗(yàn)用的老鼠。
免疫以后六周，這些試驗(yàn)用的動物通過皮下途徑被1000個尾蚴所感染(它們是被血吸蟲病感染的幼蟲)。
接種試驗(yàn)以后21天，解剖這些試驗(yàn)用的老鼠，並檢查它們體內(nèi)的寄生蟲成蟲，用生理水通過對肝臟靜脈的灌注而取出這些寄生蟲，然后計算其數(shù)。
人們發(fā)現(xiàn)相對于對照試驗(yàn)來說，所試驗(yàn)的大鼠中的寄生蟲量是減少了。
用在E.Coli所生產(chǎn)的抗原，64±4%
用在酵母所生產(chǎn)的抗原，70±10%
用疫苗所生產(chǎn)的抗原，60±8%
例6
在表達(dá)mansoni血吸蟲的蛋白質(zhì)P28的啤酒酵母(S.Cerevisiae)的提取物TGy2sp13b/PTG2800和E.Coli的提取物TGE901/PTG54中展示了谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性(通過在Ura3基因的起動部位的170Pb的缺失，PTG2800只不同于在例3中所述的PTG1894)。
把培養(yǎng)物進(jìn)行離心，並將其底部渣放入緩沖液變成懸浮液(100mM Tris-Hcl，PH＝7.5，1mM DTT)。用玻璃珠研磨酵母;用超聲波處理細(xì)菌。離心該提取物以除去細(xì)胞殘存物，測定殘存物的活性(據(jù)1974年Habig等人以及1986年Moore
表Ⅰ
依賴嗜曙紅細(xì)胞的細(xì)胞毒性的試驗(yàn)對被在
E.Coli中生產(chǎn)的蛋白質(zhì)CⅡ/P28免疫的大鼠的血清的研究
抗體的來源 血清的最終稀釋 接種以后48個小時的細(xì)胞毒性%
被CⅡ/P28免疫的大鼠的
血清(取樣)
第8天 1/16 60.5±2.5
1/32 55.5±5
1/64 6.5±6.5
第10天 1/16 85.5±0.5
1/32 76±3.5
1/64 57±4.7
第16天 1/16 85.5±0.5
1/32 78±6
1/64 52±3
第23天 1/16 88±3.5
1/32 92±0
1/64 52±11.5
被S.mansoni感 1/16 97±1
染的大鼠的血清
健康大鼠的血清 1/16 0
表Ⅱ
依賴嗜曙紅細(xì)胞的細(xì)胞
毒性對加入補(bǔ)體的研究
被在E.Coli生產(chǎn)的蛋白質(zhì)CⅡ/P28免疫 接種以后48小
的大鼠的血清免疫以后16天(最終稀釋1/16) 時的細(xì)胞毒性%
未加熱的血清 85.5±0.5
加熱的血清 26.5±5.5
加熱血清+豚鼠的補(bǔ)體 38.5±0.5
加熱血清+加熱的豚鼠的補(bǔ)體 21.5±1.5
表Ⅲ
依賴嗜曙紅細(xì)胞的細(xì)胞毒性對
加入同型物IgE的抗體的研究
抗體的來源 接種以后48小時的細(xì)胞毒性%
被在E.Coli中生產(chǎn)的CⅡ/P28
免疫的大鼠的血清(取樣)
第16天 48.5
第23天 40
健康大鼠的血清 0
抗-IgE菌落的流出物
第16天 0
第23天 0
健康大鼠的血清 0
等人所公開出版的工藝)。在分光光度計的盤盆中把40-100μl的未加工提取物，10μl的100mM CDNB試劑(在100%乙醇中的1氯-2，4-二硝基苯的溶液)和1ml的100mM KH2PO4(PH6.5)/2.5mM谷胱甘肽一起混合。
把其最終濃度是9μg和6μg的大鼠的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(以σ(Sigma))用作為正的對照。
把帶有不包含順序P28的載體的E.Coli提取物TGE901/PTG959和帶有不包含順序P28的載體的啤酒酵母的提取物TGy2SP13b和TGy2Sp13b/PTG848用作為負(fù)的對照。
把所有的細(xì)菌和酵母的提取物都調(diào)成這樣的濃度，即總蛋白質(zhì)含量是0.33mg/ml。
在包含有谷胱甘肽-轉(zhuǎn)移酶的上述盤盆中顯示了黃色。在15分鐘中的每分鐘，用340nm分度光度計測定D.O.的變化。
在圖15中顯示的結(jié)果表明含有重組蛋白質(zhì)P28的E.Coli和啤酒酵母(S.Cerevisiae)的提取物具有很強(qiáng)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性。
例7 庫的篩選和挑選物λTG07的選擇
在例1中所述的CADN庫，λgt11的篩選能夠揭示各種類型的挑選物。
通過用大鼠的多克隆(Polyclonal)抗體的免疫檢測(通過注射從血吸蟲提純的P28誘導(dǎo)的)可以選擇新的挑選物，λTG07，它不能被合成探針?biāo)R別。而這些探針如在例1中所述，是被用于選擇挑選物λTG10和λTG11，而且其中的順序是不同的。由于該蛋白質(zhì)能被相同的抗體，抗-P28所識別，該新的蛋白質(zhì)就被稱作P28Ⅱ(而原先已被鑒別的是叫P28Ⅰ)。
例8 由噬菌體攜帶的CADN的順序λTG07的測定
把CADN的各種限制片段在M13中重克隆，以便被序列化。
CADN的完整順序和我們可以推斷的氨基酸的初級結(jié)構(gòu)(在本文的三個相中)如圖16a和16b所表示。
例9 由CADN順序開始的BamHⅠ部位的創(chuàng)立
為了方便于CADN在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中的插入，人們通過操縱致突變，創(chuàng)立了由密碼順序開始的BamHⅠ部位。
該致突變實(shí)施于在M13的被克隆的ADN上，接著進(jìn)行低(寡)聚物合成，它是如圖1a所示的順序的核苷酸18-38的互補(bǔ)的21-部分，除了要調(diào)動的一些核苷酸之外
因此，可以以BamHⅠ片段的形式回收CADN的順序，第二個BamHⅠ部位出現(xiàn)在M13的多連鎖，在密碼順序的下游位置。
例10 在E.Coli中蛋白質(zhì)P28Ⅱ的表達(dá)
以BamHⅠ的形式回收為P28Ⅱ密碼的CADN順序，而且引入到表達(dá)載體PTG908中，在BamHⅠ部位中。
所得的重組體的結(jié)構(gòu)與圖2中所圖示的相同。
該載體含有一個復(fù)制原點(diǎn)，λ噬菌體的啟動子PL和包括基因CⅡ的N-端末端的CⅡ的核糖體的固定順序，還有一個在轉(zhuǎn)移的起始部位的下游的39pb的BamHⅠ限制部位。
相中的基因CⅡ的N-端末端上還出現(xiàn)CADN-P28Ⅱ的插入。
選擇了在其正確方向上攜帶插入的重組質(zhì)粒PTG56，其結(jié)構(gòu)已為順序分析儀所鑒定。
在介質(zhì)LB中培養(yǎng)了被質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化的E.Coli培養(yǎng)物TGE901，直至DO600是0.2;接著用8個小時，在42℃溫度下誘導(dǎo)了蛋白質(zhì)CⅡ-P28Ⅱ的合成。
培養(yǎng)結(jié)束后，用超聲波處理之，以回收細(xì)胞提取物，而且在丙烯酰胺-SDS上電泳和用Coomassie染成蘭色以后，對其進(jìn)行分析(圖17)。
在TGE901/PTG56提取物中可清楚見到清晰的28K的分子量的帶(圖17A、B、C、D帶)。
用“Western blot”對E.Coli的蛋白質(zhì)提取物的提純制備物的分析顯示出它能被用于抗從寄生蟲中提純的天然P28的大鼠抗體所識別。
一直在尋找可能存在的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的酶活性，然而該試驗(yàn)是陰性的。所得的陰性結(jié)果表明在2個蛋白質(zhì)P28的順序之間不存在同系物。
例11 用E.Coli生產(chǎn)的抗原P28Ⅱ接種的大鼠
據(jù)例5所述的方法給大鼠進(jìn)行接種，然后用依賴嗜曙紅細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗(yàn)測試它們的血清。
列于表Ⅳ中的結(jié)果表明，這些血清的細(xì)胞毒能力可以與被第一抗原P28Ⅰ或天然P28所免疫的大鼠的細(xì)胞毒能力相匹敵。
表Ⅳ
依賴嗜曙紅細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗(yàn)對用在E.Coli
中生產(chǎn)的天然蛋白質(zhì)P28，CⅡ-P28和
CⅡ-P28Ⅱ所免疫的大鼠的血清的研究
用在E.Coli中生產(chǎn)的蛋白質(zhì)P28Ⅱ所免疫的老鼠的抗體沒有識別蛋白質(zhì)P28Ⅰ。同樣地，用在E.Coli中生產(chǎn)的蛋白質(zhì)P28Ⅰ所免疫的大鼠的抗體沒有識別蛋白質(zhì)P28Ⅱ。然而，這兩類抗體能識別從血吸蟲提純的天然P28的制品，而且這些用于抗天然P28的抗體能識別這兩個蛋白質(zhì)的重組體。
這種結(jié)果被理解為由于從血吸蟲提純的天然蛋白質(zhì)P28的制備的不均一性的緣故。在天然蛋白質(zhì)P28在凝膠上的兩個方面的移動以后或者在活體外的血吸蟲在ARNm上的轉(zhuǎn)譯以后的令人注意的免疫沉淀現(xiàn)象，顯示出較小帶的存在，它把28K的帶分成兩半(由J.M.Balloul，R.J.Pierce，J.M.Grzych和A.Capron所出版的圖片。出現(xiàn)在1985年Mol.Biochem.Parasitology17期，105-114頁)。這個較小的帶應(yīng)該是P28Ⅱ。
菌株的儲存保藏
下列菌株都保藏于法國、巴黎。28rue du Docteur Roux-75724PARIS，的國家微生物培養(yǎng)物保藏中心(Collection Nationale de Culture de Microorganismes)。
在例2中所述的被質(zhì)粒PTG44所轉(zhuǎn)化的Ecoli的菌株N4830的保藏號碼是1986年6月6日Ⅰ562。
菌株TGE901/PTG56被保藏于法國，巴黎。25rue du Docteur Roux的全國微生物培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號是1987年4月3日的Ⅰ656。
Capron，A.et Dessaint，J.P.(1985)Ann.Rev.Immunol.3，455-476
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權(quán)利要求
1、一種含有被用于抗天然蛋白質(zhì)P28的抗體所識別的蛋白質(zhì)P28的抗原決定基的蛋白質(zhì)。
2、據(jù)權(quán)利要求
1的蛋白質(zhì)，其特征在于涉及到一個包含一部分非來源于血吸蟲蚴體的蛋白質(zhì)的雜種蛋白質(zhì)。
3、據(jù)權(quán)利要求
1-2中之一的蛋白質(zhì)，其特征在于含有蛋白質(zhì)P28的完整順序。
4、據(jù)權(quán)利要求
1的蛋白質(zhì)，其特征在于它是一個其合成是被圖16中的CADN所操縱的蛋白質(zhì)或是這CADN的一個片段，該蛋白質(zhì)是被用于抗天然蛋白質(zhì)P28的抗體所識別。
5、據(jù)權(quán)利要求
1-4中任一的蛋白質(zhì)，其特征在于它是由細(xì)菌所制得的。
6、據(jù)權(quán)利要求
1-5中任一的蛋白質(zhì)，其特征在于它是由酵母或細(xì)胞培養(yǎng)所制得的。
7、并入據(jù)權(quán)利要求
1-6中任一蛋白質(zhì)的表達(dá)載體或阻斷的細(xì)胞。
8、據(jù)權(quán)利要求
7的細(xì)胞，其特征在于涉及一個細(xì)菌，該細(xì)菌在細(xì)菌啟動子的操縱下，被包含為據(jù)權(quán)利要求
1-5中任一的蛋白質(zhì)密碼的基因的質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化。
9、據(jù)權(quán)利要求
7的細(xì)胞，其特征是涉及一個酵母，該酵母在酵母啟動子的操縱下，被包含為據(jù)權(quán)利要求
1-4或6中任一蛋白質(zhì)密碼的基因的質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化。
10、據(jù)權(quán)利要求
8或9中之一的細(xì)胞，其特征是可進(jìn)行密碼的基因是由圖16中的CADN的整個順序或部分順序所組成。
11、痘病病毒，其特征是它包含一個為據(jù)權(quán)利要求
1-4中任一個蛋白質(zhì)密碼的，并在能夠表達(dá)基因的成分的控制下被痘病病毒安插的基因。
12、據(jù)權(quán)利要求
11的痘病病毒，其特征在于該痘病病毒是疫苗的病毒。
13、據(jù)權(quán)利要求
12的痘病病毒，其特征是能夠表達(dá)基因的這些成分包括疫苗的7.5K基因的病毒性啟動子。
14、據(jù)權(quán)利要求
13的痘病病毒，其特征是能夠表達(dá)基因的這些成分包括一個能為信號順序和兔子的糖蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域進(jìn)行密碼的順序。
15、被據(jù)權(quán)利要求
11-14中任一個痘病病毒感染的哺乳動物的細(xì)胞。
16、據(jù)權(quán)利要求
1-6中任一個蛋白質(zhì)的制備方法，其特征是在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中培養(yǎng)據(jù)權(quán)利要求
7-10或15中任一個細(xì)胞，而且隨后回收該蛋白質(zhì)。
17、為據(jù)權(quán)利要求
1-6中任一個蛋白質(zhì)P28進(jìn)行密碼的ADN的順序。
18、據(jù)圖1的ADN的順序。
19、據(jù)圖16的ADN的順序。
20、特別用于預(yù)防血吸蟲病的藥劑組合物，其特征是它至少包括據(jù)權(quán)利要求
1-6中任一個蛋白質(zhì)或者據(jù)權(quán)利要求
11-14中任一個痘病病毒作為活性劑。
21、據(jù)權(quán)利要求
20的藥用組合物，其特征是它包括據(jù)權(quán)利要求
11-14中任一個活的痘病病毒作為活性劑。
22、據(jù)權(quán)利要求
20的藥用組合物，其特征是它包括據(jù)權(quán)利要求
11-14中任一個死的痘病病毒作為活性劑。
23、據(jù)權(quán)利要求
20-22中任一個的藥用組合物，其特征是以可供給人體或動物打針的形式存在。
24、可用于抗據(jù)權(quán)利要求
1-6中任一個蛋白質(zhì)的，或可被據(jù)權(quán)利要求
11-14中任一個痘病病毒誘導(dǎo)的抗體。
25、據(jù)權(quán)利要求
24的抗體或據(jù)權(quán)利要求
1-6中任一個蛋白質(zhì)的用途，即作為診斷血吸蟲病的制劑。
26、據(jù)權(quán)利要求
1-6中任一個蛋白質(zhì)的用途，即作為谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性的顯示劑。
27、據(jù)權(quán)利要求
26的用途，其特征在于它涉及蛋白質(zhì)P28I。
28、據(jù)權(quán)利要求
7-10或15中任一個細(xì)胞的用途，即作為谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性的顯示劑。
29、實(shí)施谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性的微生物轉(zhuǎn)化方法，其特征在于使用一個可用作據(jù)權(quán)利要求
26或27中任一的用途的蛋白質(zhì)或者一個可用作據(jù)權(quán)利要求
28的用途的細(xì)胞，作為轉(zhuǎn)化劑。
專利摘要
本發(fā)明旨在制備抗血吸蟲病的疫苗，它涉及一個包括蛋白質(zhì)P28的抗原決定基的蛋白質(zhì)，一個包括為該蛋白質(zhì)進(jìn)行密碼的基因的痘病病毒，一個并入該蛋白質(zhì)的表達(dá)載體的細(xì)胞，該蛋白質(zhì)的制備方法，一個為蛋白質(zhì)P28密碼的ADN的順序，藥劑組合物，抗該蛋白質(zhì)的抗體及其作為診斷血吸蟲病的藥劑的用途。
本發(fā)明還涉及該蛋白質(zhì)作為谷胱甘肽—S—轉(zhuǎn)移酶活性的顯示劑的用途。
文檔編號C07K19/00GK87106696SQ87106696
公開日1988年4月27日 申請日期1987年8月22日
發(fā)明者保羅·桑德米耶爾, 簡·馬克·巴魯爾, 雷蒙德·彼爾斯, 簡馬里·格茨奇, 馬里·保羅·基尼, 格拉德·洛森, 安德里·卡普羅恩, 簡·彼里·利科 申請人:特朗斯吉恩有限公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan