專利名稱：乙型肝炎病毒單克隆抗體可變區(qū)序列以及含有所述可變區(qū)的基因工程抗體及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及針對乙型肝炎病毒preS1的新鼠單克隆抗體可變區(qū)序列，包括重鏈和輕鏈可變區(qū)及其保守性變異體，編碼該變區(qū)氨基酸序列的核酸分子，包含該核酸分子的重組表達載體以及宿主細胞，由所述可變區(qū)序列組裝成的基因工程抗體，包含該基因工程抗體的融合蛋白，由該基因工程抗體與一種或多種治療乙型肝炎病毒的藥物分子偶聯(lián)的復合物，該基因工程抗體用于制備診斷、預防和/或治療乙型肝炎病毒的藥物的用途，以及包含該基因工程抗體和藥學可接受的載體和/或佐劑的藥物組合物。
背景技術：
在我國每年平均有200萬人患肝炎，其中50％為乙型肝炎感染，并有約1億人左右為乙型肝炎表面抗原(HBsAg)攜帶者。世界衛(wèi)生組織1996年的統(tǒng)計顯示，全世界至少有30％的人口約20億人感染過乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)，其中約3.5億人為慢性HBV攜帶者(chronic HBV carriers)(The world health report 1996-Fightingdisease，fostering development)。由HBV感染引發(fā)的慢性肝病和肝癌是人類最嚴重的健康問題之一。更為突出的問題是，目前世界上仍存在3億多的成年慢性HBV攜帶者和數(shù)千萬的慢性肝病患者(Alper等人，1989.新英格蘭醫(yī)學雜志(N Engl J Med.)321(11)708-712；Belloni等人，1998.疫苗(Vaccine).16(4)399-402)，如得不到有效的治療，將意味著未來30-40年間有數(shù)千萬人可能因肝硬化或肝癌而死亡。
目前，人們對乙型肝炎病毒的認識已提高到分子水平。有關HBV的基因組結構、編碼蛋白、合成途徑、裝配途徑等問題已基本被闡明。
HBV是已知最小的真核細胞DNA病毒之一，是一種逆轉錄病毒，基因組結構相當精密、獨特，為一全長約3.2kb的小環(huán)形DNA。HBVDNA雙鏈長度不對稱，全長的負鏈與病毒mRNA互補；正鏈僅5’末端固定，長度約1700-2600nt。HBV負鏈有4個開放閱讀框S、C、P和X，分別編碼膜蛋白、核殼、聚合酶和HBX蛋白。S開讀框分別編碼S基因、preS2區(qū)和preS1區(qū)，三者各有其起始密碼ATG。HBV由大、中、主蛋白三種外膜蛋白包裹毒粒，使病毒能夠附著和侵入新的肝細胞。主蛋白即HBsAg，由226個氨基酸組成。中蛋白即preS2+HBsAg，由281個氨基酸組成。大蛋白即preS1+preS2+HBsAg，由389-400個氨基酸組成(Lau等人，1993.柳葉刀(Lancet)，3421335-1340；駱抗先.乙型肝炎-基礎與臨床(第一版)，北京人民衛(wèi)生出版社，1997，p13-16)。一般認為，preS1和主蛋白的功能與其空間構型相關，preS2功能與其一級結構密切相關。一個典型的HBV攜帶者血液中preS1、preS2和S的摩爾比約為1∶20∶10000(駱抗先.乙型肝炎-基礎與臨床(第一版)，北京人民衛(wèi)生出版社，1997，p30-32)。
HBV感染具有較嚴格的宿主種屬特異性和組織嗜性，較為確切的證據(jù)顯示它只對人和黑猩猩具有感染性，主要侵害肝組織(Barker等人，1975.感染性疾病雜志(J Infect Dis)，132(4)451；Barker等人，1975.Am J Med Sci，270(1)189)。膜蛋白決定了HBV的感染嗜性，膜蛋白通過與肝細胞膜上受體的結合介導病毒吸附和進入肝細胞(De等人，1997.病毒性肝炎雜志(J Viral Hepat)，4(3)145-153)。目前多數(shù)人認為preS1是病毒與肝細胞膜受體的結合部位，因為preS1 21-47合成肽及其相應抗體可以體外抑制HBV與人肝癌細胞的結合，preS121-47的變異可導致HBV失去感染力。
preS蛋白在T細胞水平有較強的免疫原性，在preS區(qū)亦含有中和抗體的靶表位，preS抗體對宿主亦有保護作用。兩個來自preS1的多肽12-47和94-117和佐劑KLH偶聯(lián)后免疫，均使猩猩得到保護(Neurath等人，1989.疫苗(Vaccine)，7(3)234-236)。臨床上，preS抗體的出現(xiàn)常被看作是HBV感染清除的早期標志。研究顯示抗preS1抗體是急性自限性乙肝患者HBV清除時出現(xiàn)最早的一種膜抗體。研究發(fā)現(xiàn)在產生抗preS1(21-47)陰性的人群中，僅有7.6％(5/66)的患者成功地清除了病毒(Alberti等人，1990.肝臟病學(Hepatology)，12(2)199-203)。Coursaget等(1999.病毒學研究(ResVirol)，141(5)563-570)。Coursaget等(1999.病毒學研究(Res Virol)，141(5)563-570)對不同HBV感染人群的preS1抗體應答進行了研究，發(fā)現(xiàn)急性自限性乙肝、慢性乙肝患者的抗preS1(21-47)檢出率分別為37％和1％。在Mi等(1999.中華醫(yī)學雜志(Chin Med J(Engl))，112(4)321-324)的研究中，發(fā)現(xiàn)急性自限性乙肝患者血清中抗preS1的出現(xiàn)與ALT水平的升降相關。
至今為止，人類病毒病的預防主要還是以病毒疫苗為主，而病毒病的治療除特異性抗病毒抗體外，任何病毒感染尚無特異性藥物治療。由于目前大多數(shù)抗病毒藥物僅能通過抑制HBV復制來緩解炎癥活動性，尚無法徹底清除病毒，故在臨床試驗中，標準的抗病毒治療終點是慢性HBV感染者血清HbeAg的消失(抗HBe陽轉或無均可)及血清HBV DNA水平降低至無法檢出，而不是病毒的完全清除。
抗體分子的特性為專一針對某種抗原?？共《究贵w以其特異性結合不同病毒蛋白的特性而顯示出不同的功能。許多抗病毒的多克隆抗體、單克隆抗體以及不同形式的基因工程重組抗體由于其特異性結合病毒表面蛋白或病毒胞膜糖蛋白，可以包裹病毒顆粒、阻斷病毒吸附、誘導體內殺傷細胞功能等機理來中和和阻斷病毒感染，因此，可用于制備抗病毒抗體藥。
1984年Morrison等人將鼠單抗可變區(qū)與人IgG恒定區(qū)在基因水平上連接在一起，構建成功了第一個基因工程抗體即人-鼠嵌合抗體(human-mouse chimeric antibody)。此后，各種基因工程抗體大量涌現(xiàn)。1986年，Jones等人用鼠源單抗的CDR區(qū)置換人IgG的CDR區(qū)，成功構建了第一個改形抗體(reshaped antibody)，也稱CDR移植抗體(CDR grafting antibody)。此外，包括Fab、Fv、scFv、diabody、單域抗體等在內的多種單價小分子抗體以及發(fā)展迅猛的雙特異性抗體、多特異性抗體陸續(xù)構建成功。
應用人源噬菌體抗體庫技術和抗體工程平臺技術，抗病毒感染治療性的人源或人源化基因工程抗體的研究已取得了很大進展。目前，乙肝病毒(HBV)人源抗病毒基因工程抗體獲得實驗室階段成功。
抗乙肝病毒HBsAg的重組Fab抗體國內外均有成功的報道。
由于HBsAg基因工程疫苗的及HBsAg純化的商品化，獲得人源抗HBsAg的重組抗體相對較其他抗病毒抗體容易，獲得Fab抗體往往具有與HBsAg較高的親和力。然而，當前的HBV基因工程抗體研究，多數(shù)都以HBsAg作為靶抗原。但臨床研究表明，preS1的消失常預示著病程的良好進展(Delfini等人，1989.醫(yī)學病毒學雜志(J Med Virol)，28(3)169-175)，preS1抗體的出現(xiàn)則被看作是HBV感染清除的早期標志(Budkowska等人，1986.肝臟病學(Hepatology)，6(3)360-368)。PreS1可能含肝細胞膜受體結合位點和病毒中和表位，preS1抗體可能通過兩種機制參與病毒的清除1.preS1抗體的調理作用可清除循環(huán)中游離的病毒；2.preS1抗體的中和作用可阻止新生病毒對肝細胞的再感染。
針對preS1抗原的基因工程抗體的研究尚未取得成功。目前只有張志超等人(2002.生物化學與生物物理進展(Prog Biochem Biophys)，29(4)572-575)進行了高親和力抗preS1(20-47)的人源單鏈抗體的篩選研究，噬菌體抗體庫進行3輪淘選后，抗原抗體反應結果顯示，從免疫庫中獲得了親和力10-7～10-8M的抗preS1的單鏈抗體，高于從天然抗體庫獲得的結果(10-6～10-7M)。Budkowska等人(1995.病毒學雜志(J Virol)，69840-848)報道了鼠單克隆抗體5a19，識別preS1(36-43)的一個線性表位，Maeng等人(2000.病毒學(Virology)，2709-16)證明此單抗能阻止HBV進入培養(yǎng)的人肝細胞，Pizarro等人(2001.FEBS Lett，509(3)463-468)進一步獲得其重鏈和輕鏈可變區(qū)，對它的抗原結合動力學等方面進行了研究。Choi等人(1998.雜交瘤(Hybridoma)，17535-540)從天然重組抗體庫中篩選出人重組Fab抗體片段，識別preS1，隨后提高了其親和力(Park等人，2000.生物化學與生物物理研究通訊(Biochem Biophys ResCommu)，275553-557)。但是還沒有進一步研究和應用的報道。
因此，在現(xiàn)有的抗病毒抗體藥中，由于人源基因工程抗體尚未完全成熟，血源性免疫球蛋白抗體制品仍然占市場主導，例如，Bayer公司生產的抗HBV病毒高效免疫球蛋白BayHep BTM及美國Nabi公司生產的Nabi-HBTM，由來源于抗乙肝病毒HbsAg抗體高的供體血漿提純制備而成。
本發(fā)明人針對乙型肝炎病毒preS1為靶點設計并制備鼠單克隆抗體。在此基礎上用RT-PCR法擴增出所述單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)編碼基因，進一步組裝成單鏈抗體(scFv)，并在大腸桿菌中得到了良好表達。經純化后的4D11單鏈抗體保留了原鼠單單克隆抗體特異性結合preS1(21-47)的能力。為成功研制本發(fā)明所述的基因工程重組抗體奠定了基礎。

發(fā)明內容
除非另外定義，這里所用的所有技術和科學名詞都表達的是在本發(fā)明涉及領域里的熟練技術人員所理解的通常含義。這里所用的命名和在細胞培養(yǎng)、分子遺傳學、核酸化學、免疫學實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規(guī)步驟。
本發(fā)明一方面涉及可特異性結合乙型肝炎病毒preS1的鼠單克隆抗體的可變區(qū)序列，其中1)重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO1所示，或者是該序列經一個或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾保守性突變而獲得的保守性變異體；2)輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ IDNO2所示，或者是該序列經一個或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾保守性突變而獲得的保守性變異體。
抗體包含通過二硫橋連接在一起的多肽鏈集合體，稱為輕鏈和重鏈的兩條多肽主鏈構成抗體的所有主要結構類別(同型物)。重鏈和輕鏈都進一步分為稱作可變區(qū)和恒定區(qū)的一些亞區(qū)。重鏈包括單個的可變區(qū)和三個不同的恒定區(qū)，輕鏈則包括單個可變區(qū)(不同于重鏈的可變區(qū))和單個的恒定區(qū)(不同于重鏈的恒定區(qū))。重鏈和輕鏈的可變區(qū)負責抗體的結合特異性。
“重鏈可變區(qū)”是指一種多肽，(1)其長度為110至125個氨基酸；(2)其氨基酸順序相應于本發(fā)明單克隆抗體從重鏈N末端氨基酸開始的重鏈氨基酸順序。同樣，“輕鏈可變區(qū)”是指一種多肽，(1)其長度為95至115個氨基酸；(2)其氨基酸順序相應于本發(fā)明單克隆抗體從輕鏈N末端氨基酸開始的輕鏈氨基酸順序。
本發(fā)明所用的術語”保守性變異體”是指基本上保留了其母本的特性，如基本的免疫學生物特性、結構特性、調節(jié)特性或生化特性的變異體。一般的，多肽的保守性變異體之氨基酸序列不同于母本多肽。但是差異是有限的，以使與母本多肽之序列與保守性變異體總體上非常相似，并且在許多區(qū)域是相同的。保守性變異體和母本多肽氨基酸序列上的差異可以是例如一個或多個氨基酸殘基及其任一組合的替換、添加和刪除。替換或插入的氨基酸殘基可由遺傳密碼編碼，也可不由遺傳密碼編碼。多肽的保守性變異體可以自然產生，或者它可以是非自然產生的變異體。多肽之非自然產生的保守性變異體可通過誘變技術或直接合成而產生。
本發(fā)明還涉及一種由所述的可變區(qū)序列中重鏈可變區(qū)部分或其保守性變體，和/或輕鏈可變區(qū)部分的氨基酸序列或其保守性變異體組裝成的基因工程抗體，其仍保留特異結合乙型肝炎病毒preS1的能力。
在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述的基因工程抗體，為包含所述preS1的鼠單克隆抗體的可變區(qū)序列中重鏈可變區(qū)氨基酸序列或其保守性變異體，和/或輕鏈可變區(qū)氨基酸序列或其保守性變異體的單鏈抗體、嵌合單克隆抗體、改形單克隆抗體、或其他人源化形式的單克隆抗體，或所述抗體的片段，其仍保留特異結合乙型肝炎病毒preS1的能力。
本發(fā)明又一方面，涉及一種包含兩種或兩種以上述基因工程抗體或所述抗體片段的融合蛋白，其仍保留特異結合乙型肝炎病毒preS1的能力。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述融合蛋白為雙特異抗體。具體的，所述融合蛋白可以為包含選自至少一種本發(fā)明所述的單鏈抗體、或嵌合單克隆抗體、或改形單克隆抗體、或其他人源化形式單克隆抗體，或保留特異結合乙型肝炎病毒噴入preS1的能力的所述抗體片段的融合蛋白。
本發(fā)明再一方面涉及一種復合物，其包含選自至少一種上述的基因工程抗體，或其保留特異結合乙型肝炎病毒preS1的能力的片段，以及與之相偶聯(lián)的一種或多種治療乙型肝炎的藥物分子。目前已知的具有乙型肝炎治療效果的藥物均能夠用于與本發(fā)明所述的基因工程抗體偶聯(lián)，用以制備所述復合物，以增強治療效果。
本發(fā)明還涉及一種核酸分子，其編碼preS1的鼠單克隆抗體所述的可變區(qū)氨基酸序列之重鏈可變區(qū)，其具有如SEQ ID NO3所示的核苷酸序列或其簡并性序列；或者其編碼preS1的鼠單克隆抗體可變區(qū)氨基酸序列之輕鏈可變區(qū)，其具有如SEQ ID NO4所示的核苷酸序列或其簡并性序列。
本發(fā)明還涉及一種包含上述核酸分子的重組表達載體。和經上述重組表達載體轉化的宿主細胞，其能夠表達本發(fā)明所述的基因工程抗體，或其保留特異結合乙型肝炎病毒preS1的能力的片段。
適用于表達本發(fā)明所述核酸分子的包括但不限于染色體的、非染色體的和合成的DNA序列，例如，SV40的衍生物、細菌質粒、噬菌體DNA、酵母質粒、衍生于質粒和噬菌體DNA結合的載體、病毒DNA、桿狀病毒、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒及偽狂犬病毒。不過，只要能在宿主中復制和存活，其它載體也可以利用。
特別值得提及的是，本發(fā)明也包括含有上述本發(fā)明核酸分子的編碼序列的重組構建體。該構建體包括載體，如質?；虿《据d體，其中正向或反向插入了本發(fā)明的一個序列。在此實施方案的一個優(yōu)選方面，該構建體還包含調節(jié)序列，例如啟動子，它被有效地連接到該序列上。對于本領域技術人員來說，許多載體和啟動子都是已知的，并可通過商業(yè)途徑獲得。下面列舉幾種載體。細菌的pQE-70、pQE-60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pBSKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)、pTRC99a、pKK223-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；真核的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。不過，只要是能在宿主中復制和存活，其它質粒或載體也可應用。
啟動子區(qū)域可以利用CAT(氯霉素轉移酶)載體或其它具有選擇標記的載體從想要的基因中選擇出來。pKK232-8和pCM7是兩個合適的載體。特稱的細菌啟動子包括LacI、LacZ、T3、T7、gpt、PR、PL和trp。真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆轉錄病毒的LTR和小鼠金屬硫蛋白I。合適載體和啟動子的選擇應在本領域普通的技術水平之內。
合適的DNA序列可以通過許多方法插到載體中。通常，DNA序列用本領域中已知的方法插入到合適的限制性內切酶位點上。這些方法相信處于本領域技術人員的知識范圍內。
表達載體中的DNA序列被有效地與一個合適的表達控制序列(啟動子)連在一起，從而指導mRNA的合成。下面提到的是這種啟動子的代表LTR或SV40啟動子、大腸桿菌的Lac或trp啟動子、噬菌體的PL啟動子以及已知控制原核或真核細胞或其病毒中基因表達的其它啟動子。表達載體也包含翻譯起始所需要的核糖體結合位點和轉錄終止子。載體還可以具有增強表達的合適序列。
此外，表達載體優(yōu)選包含能提供表型特征的一個或多個選擇標記基因，以便于轉化宿主細胞的篩選，例如真核細胞的培養(yǎng)可用二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，大腸桿菌則可用四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述合適的DNA序列、合適的啟動子或控制序列的載體可以用于轉化合適的宿主，讓宿主表達該蛋白。
宿主細胞是用本發(fā)明上述載體進行遺傳工程化(轉導、轉化或轉染)的，載體可以是一個克隆載體或表達載體，如質粒、病毒粒子、噬菌體等等。工程化的宿主細胞能在為適于活化啟動子、篩選轉化子或擴增DRC2基因而改變的傳統(tǒng)營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件諸如溫度、pH等與被選擇的細胞原來所用的表達條件一致，對于本領域普通技術人員來說是很明顯的。
本發(fā)明所述基因工程抗體均能夠通過基因工程的方法由適當?shù)乃拗骷毎磉_。本發(fā)明可以使用多種表達宿主細胞，如原核宿主細胞，包括但不限于大腸桿菌、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬等的菌株；真核宿主，包括但不限于曲霉屬、酵母屬等的菌株，以及哺乳動物細胞、植物細胞等。本發(fā)明上述述目標產物的表達并不局限于具體的表達載體和表達宿主，只要其能夠表達本發(fā)明所述的基因工程抗體，其保守性變異體。從這些講授看，合適宿主的選擇應該在本領域技術人員的知識范圍內。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及包含上述構建體的宿主細胞。宿主細胞可以是高等真核細胞，比如哺乳類細胞，或者是低等真核細胞，比如酵母細胞，還可以是原核細胞，比如細菌細胞。將構建體導入宿主細胞的方法有磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、電穿孔或基因槍方法。
宿主細胞中的構建體能夠通過傳統(tǒng)的方法產生重組序列編碼的基因產物。另一途徑是，可用傳統(tǒng)的肽合成儀合成本發(fā)明的多肽。
在合適的啟動子控制下可以在哺乳類細胞、酵母、細菌或其它細胞中表達成熟蛋白。利用由本發(fā)明的DNA構建體衍生的RNA，也可以用無細胞翻譯體系產生這種蛋白質。適合于原核和真核宿主的克隆和表達載體Sambrook等人已在《分子克隆實驗指南》(第二版，冷泉港出版社，紐約，1989)中進行了描述。
在高等真核生物中，編碼本發(fā)明所述可變區(qū)序列的DNA的轉錄可以通過在載體中插入一增強子序列而被提高。增強子是DNA的順式作用因子，通常有大約10-300bp，作用于啟動子，提高它的轉錄。例如，SV40的位于復制起點后側100-270bp處的增強子，巨細胞病毒早期啟動子增強子、位于復制起點后側的多形瘤增強子及腺病毒增強子。
通常，重組表達載體包含復制起點和用于轉化宿主細胞的選擇標記，例如大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因和啤酒酵母TRP1基因，還包含從高效表達基因而來的啟動子，從而介導下游結構序列的轉錄。這些啟動子可以從編碼糖酵解酶的操縱子中得來，諸如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、因子、酸性磷酸酶或熱休克蛋白。異源的結構序列以適當?shù)姆轿慌c翻譯起始和終止序列以及其它優(yōu)選的序列裝配在一起?？蛇x擇的情況是，異源的序列可以編碼一個融合蛋白，該蛋白含有一個N末端確認肽，表現(xiàn)出預期的特征，例如所表達的重組產物的穩(wěn)定化和提純簡化。
細菌適用的有效表達載體這樣來構建將編碼目的蛋白的結構DNA序列隨同適當?shù)姆g起始和終止信號被插入到帶有一個功能啟動子的可操縱的閱讀框中。載體應包含一個或多個表型選擇標記和復制起點，復制起點保證了載體在宿主中能保留下來，更理想的是能使載體得到擴增。適于轉化的原核宿主有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏菌以及假單孢菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬的各種細菌，其它的宿主也可以被選擇。
根據(jù)本發(fā)明制備的單克隆抗體重鏈可變區(qū)及輕鏈可變區(qū)序列，以及根據(jù)遺傳密碼子的簡并性產生的不同變體，本領域技術人員可用多種方法制備包含上述核苷酸序列之重組表達載體，以及由所得重組表達載體轉化的宿主細胞。宿主細胞的選擇和轉化為本領域技術人員周知，只要其能夠表達本發(fā)明所述的單克隆抗體，其保守性變異體，或單鏈抗體或嵌合抗體或改形抗體或其他人源化形式的單克隆抗體或抗體片段，或融合蛋白或雙特異抗體或其他形式的多肽或多肽類似物。
因此，本發(fā)明還涉及一種包含編碼本發(fā)明所述的單克隆抗體，其保守性變異體，或單鏈抗體或嵌合抗體或改形抗體或其他人源化形式的單克隆抗體或抗體片段，或融合蛋白或雙特異抗體或其他形式的多肽或多肽類似物等之核酸分子的重組表達載體。以及由所述重組表達載體轉化的宿主細胞。本發(fā)明可以使用多種表達宿主細胞，如原核宿主細胞，包括但不限于大腸桿菌、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬等的菌株；真核宿主，包括但不限于曲霉屬、酵母屬等的菌株，以及哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等。本發(fā)明上述目標產物的表達并不局限于具體的表達載體和表達宿主，只要其能夠表達本發(fā)明所述的單鏈抗體，其保守性變異體，或單鏈抗體或嵌合抗體或改形抗體或其他人源化形式的單克隆抗體或抗體片段，或融合蛋白或雙特異抗體或其他形式的多肽或多肽類似物。
本發(fā)明所述的單鏈抗體，其保守性變異體，或單鏈抗體或嵌合抗體或改形抗體或其他人源化形式的單克隆抗體或抗體片段，或融合蛋白或雙特異抗體或其他形式的多肽或多肽類似物的應用和產生也是熟知的。
作為一個代表性的但非限定性的例子，細菌適用的有效表達載體包括一個選擇標記和細菌的復制起點，它衍生于從商業(yè)途徑獲得的、具有眾所周知的克隆載體pBR322(ATCC37017)的遺傳元件的質粒。這些商業(yè)化的載體包括諸如pKK223-3(Pharmacia)和pGEM1(Promega)等。pBR322的“骨架”部分與合適的啟動子和被表達的結構序列組合在一起。
在轉化合適的宿主菌株和宿主菌株生長到恰當?shù)募毎芏戎?，用適當?shù)姆椒?例如溫度轉變或化學藥品誘導)誘導所選擇的啟動子，并將細胞再培養(yǎng)一段時間。
通常用離心的方法收獲細胞，用物理或化學的方法破碎細胞，將粗提物保留以進一步純化。用于表達蛋白的微生物細胞可以用任何便捷的方法破碎，包括凍融循環(huán)、超聲波、機械破碎，或者使用細胞溶解劑，這些方法都是本領域的技術人員熟知的。
各種哺乳動物細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)也能用于表達重組蛋白。哺乳類表達系統(tǒng)的例子有Gluzman(Cell 23175，1981)所描述猴腎成纖維細胞的COS-7細胞系，及其它的能表達相容載體的細胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK細胞系。哺乳類表達載體包括復制起點、適當?shù)膯幼印⒃鰪娮蛹叭魏伪匦璧暮颂求w結合位點、多腺苷化位點、拼接供體和受體位點、轉錄終止序列和5’側翼非轉錄序列。衍生于SV40拼接序列的DNA序列和多腺苷化位點可用于提供所需要的非轉錄遺傳元件。
多肽可以從重組細胞培養(yǎng)物中回收和純化出來，回收和純化的方法有硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和植物凝集素層析。形成成熟蛋白的完整構象需要蛋白質的再折疊步驟。高效液相層析(HPLC)應用于最后的純化步驟。
本發(fā)明另一方面還涉及所述的基因工程抗體或其保留特異結合乙型肝炎病毒preS1的能力的片段用于制備診斷、預防和/或治療乙型肝炎病毒的藥物的用途。
本發(fā)明又一方面還涉及一種治療乙型肝炎病毒感染的藥物組合物，其包含治療有效量的本發(fā)明所述的基因工程抗體，或其保留特異結合乙型肝炎病毒preS1的能力的片段或保守性變體，以及藥學可接受的載體和/或佐劑。
本發(fā)明中，“治療有效量”是指能夠對受試個體產生有效保護以及中和病毒的量。本領域技術人員知曉，所述“治療有效量”隨治療方案、病程、治療對象的狀況以及所用單克隆抗體或其片段的不同而不同。結合本領域已知的文獻和教導以及相應的臨床規(guī)范，臨床醫(yī)生應當能夠憑借其經驗得出所用單克隆抗體的“治療有效量”。優(yōu)選的，本發(fā)明中所述治療有效量為每千克體重0.001mg-20mg，特別優(yōu)選為0.01-10mg，更優(yōu)選為0.1mg-10mg。所述治療有效量為每千克體重0.0001mg-0.1mg，特別優(yōu)選為0.001-0.06mg，更優(yōu)選為0.01mg-0.04mg。
本發(fā)明更進一步涉及一種用于預防和/或治療乙型肝炎病毒感染的方法，其包括將預防有效量或治療有效量的至少一種本發(fā)明所述的基因工程抗體或其保留特異結合乙型肝炎病毒preS1能力的片段或保守性變異體施用于患者。
本發(fā)明所述“預防有效量”，是指能夠在接種的個體中足以引發(fā)免疫保護反應的量。本領域技術人員知曉，所述“預防有效量”隨免疫接種的方式、時機、給藥對象以及所用單克隆抗體或其片段的不同而不同。結合本領域已知的文獻和教導以及相應的臨床規(guī)范，本領域技術人員應當能夠通過有限的試驗得出所用單克隆抗體的“預防有效量”。優(yōu)選的，本發(fā)明中所述預防/免疫有效量為每次免疫千克體重0.0001mg-0.1mg，特別優(yōu)選為0.001-0.06mg，更優(yōu)選為0.01mg-0.04mg。
類似地，“治療有效量”是指能夠對受試個體產生有效保護以及中和病毒的量。本領域技術人員知曉，所述“治療有效量”隨治療方案、病程、治療對象的狀況以及所用單克隆抗體或其片段的不同而不同。結合本領域已知的文獻和教導以及相應的臨床規(guī)范，臨床醫(yī)生應當能夠憑借其經驗得出所用單克隆抗體的“治療有效量”。優(yōu)選的，本發(fā)明中所述治療有效量為每千克體重0.001mg-20mg，特別優(yōu)選為0.01-10mg，更優(yōu)選為0.1mg-10mg。所述治療有效量為每千克體重0.0001mg-0.1mg，特別優(yōu)選為0.001-0.06mg，更優(yōu)選為0.01mg-0.04mg。
本發(fā)明利用本領域熟知的方法方便地從分泌4D11鼠單克隆抗體的雜交瘤細胞系中獲得編碼本發(fā)明單克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的編碼序列。本領域內熟練的技術人員可方便地利用這些編碼序列分析出對于單克隆抗體結合特異性重要的氨基酸區(qū)域，如存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定簇互補區(qū)域(CDR)CDR1、CDR2和CDR3，其相應的氨基酸序列構成了抗體的特異性抗原結合區(qū)域。利用這些氨基酸序列，用重組方法可制得具有與單克隆抗體相同或相似特異結合能力的多肽，如將抗體重鏈可變區(qū)基因與輕鏈可變區(qū)基因順序連接表達而成的單鏈抗體(ScFv)；將抗體重鏈可變區(qū)基因與輕鏈可變區(qū)基因或CDRs基因置換到人類抗體的相應位置，表達出更接近于人類抗體而又具有原單克隆抗體結合特異性的人源單克隆抗體如嵌合抗體或改形抗體；也可以與另一個或多個單克隆抗體共同構建成多種形式的雙特異抗體或多特異抗體；等等。
單克隆抗體作為載體，攜帶毒素蛋白、放射性核素以及藥物在腫瘤的臨床治療中具有極大的應用潛力，但常用的鼠源性單克隆抗體在臨床的應用中具有許多限制其療效和使用的障礙，最主要的是鼠單抗對人體而言具有較強的免疫原性，可產生較強的人抗鼠抗體(humananti-mouse antibody，HAMA)反應。本發(fā)明通過基因工程技術改造，構建成了保留原鼠單抗特異的抗原結合活性的單鏈抗體，可以很大程度地降低抗體的鼠源性，降低人體對抗體的排斥反應。單鏈抗體的分子較小，穿透力強，更易到達病灶的核心部位。根據(jù)診斷或治療的需要，還可以進一步制備出多種用途的新型抗體。


圖1示乙型肝炎病毒preS1與GST的重組融合表達與純化產物的SDS-PAGE電泳結果。第1道為蛋白分子量標記；第2道為菌體裂解液；第3道為Glutathione-Sepharose 4B柱純化后的GST-preS1重組抗原圖2示preS1單抗與HBV天然抗原的結合能力。3H5，1G5，6F1，7B6，2A6，7H11，4D11為抗乙型肝炎病毒preS1 21-47合成肽的鼠單克隆抗體。
圖3示4D11單鏈抗體表達和初步純化的SDS-PAGE電泳結果。第第1道為蛋白分子量標記；第2道為菌體裂解液；第3道為菌體超聲上清液；第4道為菌體超聲沉淀；第5道為2mmol/L尿素洗滌上清；第6道為4mmol/L尿素洗滌上清；第7道為8mmol/L尿素洗滌上清。
圖4示4D11單鏈抗體初純品在His柱純化過程中各部分收集液SDS-PAGE電泳結果。第1道為過柱前樣品即初純品；第2道為穿透峰；第3道為第一次洗滌液；第4道為第二次洗滌液；第5道為第一次洗脫液；第6道為第二次洗脫液；第7道為第三次洗脫液；第8道為第四次洗脫液；第9道為再生液。
下面結合具體實施例與附圖，對本發(fā)明進一步加以描述。所述實施例旨在以舉例方式具體闡明本發(fā)明。載體和宿主的選擇以及試劑的濃度、溫度和其他變量的值只是舉例說明本發(fā)明的應用，而不構成對本發(fā)明的限制。
實施例實施例1用做抗原的GST-preS1融合蛋白的制備目的基因的分離、克隆利用蛋白酶K-酚氯仿法，從我室保存的慢性乙肝患者血清標本(編號263)中的提取HBV DNA。將血清裝入新的滅菌過的1.5mlEppendorf管，每管200ul。在每管中加入STE 156ul，10％SDS 40ul和100×蛋白酶K 4ul。然后在56℃中水浴2-3小時，每隔一段時間輕輕搖晃混勻一次。加入400ul的酚氯仿異戊醇，搖勻后靜置5-10分鐘，不宜劇烈。12000g離心10分鐘。小心將上清取出，加入兩倍體積以上(780ul)的無水乙醇和終濃度為0.3M的NaAc(40ul)，置于液氮中3分鐘。12000g離心10分鐘。迅速棄去乙醇，再用70％乙醇洗一遍。在恒溫器(55℃)干燥5分鐘左右至無乙醇氣味，再加入20ulddH2O溶解。
設計多條引物，PCR分段分離HBV基因，并克隆至pMD 18-T載體進行測序?？寺≠|粒pT-preS包含全長的preS1和preS2基因。另行設計兩條特異引物S1F(5’-AGA TCT CAT ATG AAA AAA TGGTCT TCC AAA CCT CG-3’)、S1R(GGA TCC GGC CTG AGG ATGACT G-3’)用來亞克隆preS1基因，引物的5’末端或3’末端均添加了1-2個內切酶識別位點。以pT-preS為模板，S1F-S1R為引物擴增357bppreS1基因。PCR產物回收后與pMD 18-T連接，得到克隆質粒pT-preS1。考慮到preS1的分子量較小，我們選擇了融合型原核表達質粒pGEX-20T作為表達質粒。GST可作為載體蛋白提高乙肝抗原的免疫原性。選用該質粒的另外的好處是該表達系統(tǒng)具有穩(wěn)定、高效等優(yōu)點，且表達的融合蛋白也易于用親和層析進行純化。用pGEX-20T構建的重組質粒表達出來的產物為GST和preS1的融合蛋白，其中26kD的GST蛋白位于融合蛋白的氨基端。BamH I/Ec0R I雙酶切處理表達質粒pGEX-20T，乙醇沉淀法回收線性載體。用Bgl II/EcoR I雙酶切pMD 18-T質粒，膠回收試劑盒回收preS1片段。用T4連接酶將目的片段與pGEX-20T連接，得到pGEX-20T-preS1質粒。
重組蛋白在大腸桿菌中的表達將pGEX-20T-preS1質粒轉化E.coli ER2566菌株，從平板上挑取單菌落接種到2ml的LB(含Ap抗生素)液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。取200ul過夜培養(yǎng)液接種于2ml LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)2小時，至OD6000.6左右。加入IPTG終濃度達0.5mM，28℃或37℃誘導培養(yǎng)4小時。取1ml菌液，離心收集菌體，扣干。用60ul水懸浮菌體，加入30ul 3×SDS-PAGE凝膠加樣緩沖液，沸水浴5分鐘。12000g離心10分鐘。取5ul菌體裂解液上清上樣，用12％SDS-PAGE電泳分析。由圖1可知工程菌的全菌裂解物可觀察到一條明顯的誘導蛋白帶，表達蛋白約為菌體總蛋白的10％，實際分子量大小與理論預期值39kD近似，重組蛋白主要以可溶性形式存在。
可溶性抗原的純化挑單菌落接種于25ml LB(含Ap抗生素)，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。將250ml菌液按1∶4擴種，至1000ml。37℃振蕩培養(yǎng)，至OD6001.0左右。使菌液冷卻，加IPTG至終濃度為0.2mM，28℃，誘導4小時。收休菌體，4℃ 10000g離心4分鐘。PBS洗滌后，再以適量PBS將菌體懸浮。冰水浴，超聲破碎。超聲條件如下輸出控制-7，占空因數(shù)-70％，工作時間-35sec。重復7-9次，每次間隔5分鐘。收集上清并過柱純化。輕搖介質瓶，使介質Glutathione-Sepharose 4B混勻，吸取1.33ml體積介質勻漿(介質比為75％，即1.33ml體積介質漿中含1ml介質)上柱。輕敲柱子除去氣泡，讓柱子自然流干。用10ml 4℃預冷的BVS平衡柱。堵住下樣口，上樣。室溫下孵育30分鐘，其間應不斷輕搖柱子，以達以良好的結合效果。打開下樣口，讓穿透峰自然流下，讓柱子流干。用10ml4℃預冷的1×PBS洗柱，重復3次。堵信下樣口，加入1ml的谷胱甘肽洗脫緩沖液，室溫下孵育30分鐘，其間應不斷輕搖柱子，以達到良好的洗脫效果。打開下樣口，用1.5ml的離心管收集樣品。重復洗脫多次，直到用力搖樣品時觀察不到氣泡時為止。SDS-PAGE結果顯示(圖1)純化后的重組抗原的純度在85％以上。
實施例2雜交瘤細胞系4D11的產生小鼠免疫及脾細胞與雜交瘤的融合純化的Dane顆粒靜脈免疫6～8周齡雌性BALB/c小鼠，2w后用50ug重組抗原GST-preS1與CFA混合后肌肉注射免疫小鼠。30天后，尾靜脈加強注射5μg不加佐劑的抗原，之后72小時取眼球血檢測效價。殺死小鼠，收集血液，取脾制備脾細胞懸液(懸于預冷的RPMI 1640培養(yǎng)基中)，細胞計數(shù)板細胞計數(shù)。按1/6于脾細胞的數(shù)量取培養(yǎng)的SP2/0小鼠骨髓瘤細胞，混合后離心，利用聚乙二醇(PEG 1500)使脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合。將細胞懸液與等體積的飼養(yǎng)細胞混合后，分置于96孔細胞培養(yǎng)板中(200μl/孔)于5％二氧化碳培養(yǎng)箱(ESPEC BNA-311)37℃培養(yǎng)。3天后，用HT培養(yǎng)基(黃嘌呤(hypoxanthn，H)1.361mg+胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)0.388mg，加RPMI1640(GIBCO公司)培養(yǎng)基至100mL。45～50℃條件下溶解后，過濾除菌。)半保留換液。7天后，用2147合成肽包被板，利用如下述酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測96孔細胞培養(yǎng)板中所得雜交瘤細胞上清培養(yǎng)液。對于ELISA檢測為陽性的細胞克隆，利用有限稀釋法進行克隆化。
ELISA檢測法21-47合成肽溶解于0.05mol/L碳酸包被緩沖液(20.02g Na2CO3，2.52g NaHCO3加去離子水至1升，pH為9.5)中，濃度約為3μg/ml，在96孔聚乙烯微量滴定板的各孔表面上吸附2小時(37℃)，再置于4℃過夜。用PBST洗滌液(8.0g NaCl、0.2g KH2PO4、2.9gNa2HPO4·12H2O、0.2g KCl和0.5ml吐溫20，加去離子水至1升，pH為7.4)洗滌滴定板以除去未結合的抗原蛋白。然后用200μl/孔的封閉液(1×PBS溶液，組成同前)中加入2％明膠、0.2％酪蛋白和2％蔗糖)37℃封閉2小時。甩凈、拍干后真空封閉，4℃保存。
檢測時，于每孔中加入100μl細胞培養(yǎng)液上清；每塊96孔微量滴定板設一陽性對照，加入100μl小鼠抗GST-preS1多抗血清(1∶100稀釋使用)；另設一陰性對照，加入100μl HT細胞培養(yǎng)液。37℃溫浴30分鐘，用PBST洗滌液洗5遍，拍干后加入過氧化物酶結合的羊抗鼠免疫球蛋白(HRP-GAM Ig，DAKO公司)，37℃溫浴30分鐘，取出后用PBST洗滌液洗5遍，拍干后先后加入底物液A、B各50μl(底物液A成分為13.42g Na2HPO4·12H2O、4.2g檸檬酸·H2O和0.3g過氧化氫，用去離子水中調節(jié)體積為700ml；顯色液B成分為0.2g四甲基聯(lián)苯胺、20ml二甲基甲酰胺用去離子水中調節(jié)體積為700ml)，37℃顯色10分鐘，加入50μl終止液(2M H2SO4)終止反應，并于酶標儀上檢測各孔的OD450值，通常以OD450值高于陰性對照2倍以上者視為陽性。
單克隆抗體腹水的獲得及純化取10周齡的健康Balb/c小鼠，腹腔注射福氏不完全佐劑，每只0.5ml。2～7天后，收集克隆化的雜交瘤細胞，離心去上清，加入不含血清的培養(yǎng)基，調節(jié)細胞密度至2×105～2×106個/ml，每只小鼠注射0.5ml。7～10天后小鼠腹部增大，開始收集腹水。3000rpm離心15分鐘，吸取中間澄清部分的液體，0.45μm的微孔濾膜過濾除菌，分裝后-20℃保存。
將處理好的腹水用0.02mol/L、pH7.4的PBS(81ml 0.2mol/LNa2HPO419ml 0.2mol/L NaH2PO4，加生理鹽水至100ml)對倍稀釋，攪拌下逐滴緩慢加入硫酸銨(濃度達到50％飽和度)，4℃過夜。4℃，12000rpm離心15分鐘，棄上清，將沉淀溶于原腹水體積2倍的PBS中。攪拌下逐滴緩慢加入硫酸銨，使硫酸銨濃度達到33％飽和度，4℃靜置過夜。4℃，12000rpm離心15分鐘，棄上清，將沉淀溶于原腹水體積2倍的PBS中。攪拌下逐滴緩慢加入硫酸銨，(濃度達到50％飽和度)，4℃過夜。4℃，12000rpm離心15分鐘，棄上清。將沉淀溶于適量的PBS中，裝入透析帶中，放入50～100倍含20mmol/L NaCl，pH7.8的120mmol/L Tris-HCl緩沖液中4℃攪拌下脫鹽12小時左右，期間更換3次以上透析液。取出后分裝-20℃保存。
以上述方法，篩選出了7株分泌抗HBV preS1(21-47)單克隆抗體的雜交瘤細胞株(3H5、1G5、6F1、7B6、2A6、7H11、4D11)。
實施例3、ELISA檢測4D11單抗與HBV天然抗原的結合能力按109vge/孔包被Dane顆粒(含少量的管狀顆粒和管狀顆粒，被作為HBV天然抗原使用)，37溫育2小時后4過夜。PBST洗板一次，封閉液37封閉2小時。加稀釋后的純化單克隆抗體，所有樣品均為雙孔重復)0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37孵育30分鐘，PBST洗滌5次。于反應孔中加入羊抗鼠酶標抗體0.1ml。37孵育30分鐘，PBST洗滌5次。加底物液顯色15分鐘后終止反應，并于酶標儀上檢測各孔的OD450值。結果(圖2)顯示，所有7種preS1單抗均可以識別HBV天然抗原。作為陰性對照，戊型肝炎病毒(HEV)的單抗E1、E2不能識別病毒天然抗原。相同濃度下(20ug/ml)，7種preS1單抗中，4D11與HBV天然抗原的結合能力最強。
實施例4、4D11單克隆抗體輕鏈基因和重鏈基因可變區(qū)的分離半貼壁培養(yǎng)107個4D11鼠源雜交瘤細胞，吹管吹起貼壁細胞使懸浮，轉移到新的4ml離心管中，1500rpm離心3min，收集沉淀的細胞，重懸于100μl無菌PBS(pH7.45)中，轉移到一新的1.5ml離心管中。加入800μl Trizol(Roche，Germany)，輕輕顛倒混勻，靜置10min。加入200μl氯仿，劇烈振蕩15s，靜置10min，4℃ 12000rpm離心15min，轉移上層液體至一新的1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻，靜置10min。4℃ 12000rpm離心10min，棄上清，加入600μl 75％乙醇洗滌，4℃ 12000rpm離心5min，棄上清，沉淀于60℃真空抽干5min。透明的沉淀溶于70μl DEPC H2O中，分裝成兩管，每管35μl。其中1管加入各0.5μl反轉錄引物MFdR1(5’-ACT AGT ACA ATC CCT GGG CAC AAT-3’)/MFdR2(5’-ACT AGT CTT GGG TAT TCT AGG CTC-3’)，另一管加入各0.5μl反轉錄引物MKCR1(5’-TCT AGA ATT AAC ACT CAT TCCTGT TGA A-3’)/MVkR(5’-CCC AAG CTT ACT GGA TGG TGGGAA GAT GGA-3’)。每管再加入1μl dNTP(上海生工)，置72℃水浴10min，立即放到冰浴中置5min，加入10μl 5x反轉錄緩沖液，1μl AMV(10u/μl，Pormega)，1μl Rnasin(40u/μl，Promega)，混勻后于42℃將RNA反轉錄成重鏈Fd和輕鏈的cDNA。
抗體基因分離聚合酶鏈式反應(PCR)法，使用Novagen公司的Ig-Prime kits以及另外設計合成的5條上游輕鏈可變區(qū)引物和5條下游輕重鏈引物(上海博亞公司合成)，模板即為以上合成的4D11 重鏈Fd和輕鏈的cDNA。
輕鏈可變區(qū)基因的分離使用K輕鏈的MuIgkVL5’-A至G的7組上游引物和另設計合成的5條上游引物，即VkF1(5′-CCA CCA TggAgA CAg ACA CAC-3′)/VkF2(5′-TTT TCA AgT gCA gAT TTTCAg-3′)/VkF3(5′-ATg gAg(A/T)CA CA(g/T)(A/T)CT CAg gTC-3′)/VkF4(5′-TCC ACC ATg(g/T)CC CC(A/T)(A/g)CT CAg-3′)/VkF5(5′-ACC ATg AAg TTg CCT gTT Agg-3′)，下游引物為MVJkR(5’-CCg TTT(T/g)AT(T/C)TC CAg CTT ggT(g/C)CC-3’)。分別使用這些上游引物和MVJkR組成引物對，以4D11輕鏈cDNA為模板進行PCR擴增。PCR條件為94℃ 5min，94℃ 30s 52℃ 1min 72℃ 40s35循環(huán)，72℃ 15min。結果有5條上游引物與MVJkR組合能擴增出與預期大小一致的片段，分別回收并克隆至pMD 18-T載體，送至上海博亞公司測序，序列經blast比對后確定由MuIgkVL5’-G2(5’-CGA CAT GGT(C/T)CT(C/T)AT(A/C/G)TC CTT GCT GTTCTG G-3’)/MVJkR及VkF5/MVJkR兩對引物都能擴增出4D11輕鏈可變區(qū)序列，(見SEQ ID NO4)，其推測的氨基酸序列見SEQ IDNO2。
重鏈可變區(qū)基因的分離使用IgG的MuIgGVH5’-A至F的6組上游引物，下游引物為MVDJhR(5’-C ggT gAC Cg(T/A)ggT(C/g/T)CCTTg(g/A)CC CCA-3’)，模板為4D11 重鏈Fd的cDNA，進行梯度PCR擴增。PCR擴增條件為94℃5min，94℃ 30s 55℃ 40s 72℃ 40s，35個循環(huán)，72℃ 15min。結果有5條上游引物與MVDJhR組合可擴增出約400bp條帶，分別回收并克隆至pMD 18-T載體，送至上海博亞公司測序，序列經blast比對后確定MuIgGVH5’-C2(5’-CGA CATGG(A/C/G) TTG G(C/G)T GTG GA(A/C)CTT GC(C/T)ATTCCT-3’)/MVDJhR、MuIgGVH5’-C2(5’-CGA CAT GG(A/C/G)TTGG(C/G)T GTG GA(A/C)CTT GC(C/T)ATT CCT-3’)/MVDJhR引物對可擴增出4D11重鏈可變區(qū)序列(見SEQ ID NO3)，其推測的氨基酸序列見SEQ ID NO1。
實施例5、4D11單鏈抗體的克隆、表達、純化及活性測定將4D11抗體基因的重鏈和輕鏈可變區(qū)通過(GGGGS)3短肽連接成單鏈抗體DNA片段。以4D11HF1(5′-ggA TCC CAG ATT CAGCTG CAG CAG TC-3’)/4D11HR1(5′-gCT ACC ACC CCC TCC AgATCC gCC ACC TCC AgA AgA TTC CgT gAC CgA g-3’)為引物對擴增出4D11重鏈基因可變區(qū)片段，以4D11KF1(5′-A TCT ggA ggg ggTggT AgC ggT ggA ggC ggg AgT gAT gTT gTg ATg ACC C-3’)/4D11KR1(5′-gTC gAC CCgTTT gAT TTC CAg CTT gg-3’)引物對擴增出4D11輕鏈基因可變區(qū)片段。分別回收兩個片段，再以這兩個片段互為引物及模板在新的PCR系統(tǒng)中進行重疊延伸，得到少量完整單鏈抗體片段，然后以完整片段為模板，以4D11HF1/4D11KR1為引物進行大量擴增，回收單鏈抗體片段，克隆至pMD 18-T載體中。再從得到的質粒中以BamH I/Sal I酶切回收到單鏈抗體片段，克隆到相同酶切的pTO-T7原核表達載體中。將得到的重組質粒pTO-T7-4D11轉化ER2566大腸桿菌菌株，挑單菌落于500ml LB(含Kan100ug/ml)培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，菌液OD600值達0.8左右，0.2mmol/L的IPTG誘導，30℃表達6hr后收獲菌體，超聲破碎，15000rpm離心10min，沉淀溶于與上清等體積的20mmol/L Tris-HCl(pH7.6)中，取等量上清和沉淀溶液進行SDS-PAGE電泳。堆積膠濃度為5％，分離膠濃度為12％。發(fā)現(xiàn)表達蛋白質達菌體總蛋白量的15％左右，主要以不溶性的包涵體形式存在。超聲沉淀用2％Triton洗滌兩次后，分別用2M、4M、8M尿素溶解，各部分溶解液經12％SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)單鏈抗體主要溶解于8M尿素中(圖3)。將溶解于8M尿素中的單鏈抗體蛋白用8M尿素稀釋至50-100ng/ml，逐步對1x PBS透析復性，之后再濃縮6倍，12000rpm離心10分鐘去除沉淀，將最終得到的單鏈抗體溶液用間接ELISA法進行活性測定。包被的抗原為preS1的21-47合成肽，單鏈抗體初純品經倍比梯度稀釋后，各取100ul至孔中，反應1小時后洗滌，再加入1∶2000稀釋HRP標記的羊抗Histag酶標抗體，反應30分鐘后顯色15分鐘，讀板。結果初純品原液的OD值為3.210，稀釋8倍后為0.687(表1)。表明表達的4D11單鏈抗體有很好的特異性結合抗原的活性。
表1.間接ELISA檢測4D11 scFv的抗原結合活性將4D11 scFv初純品進一步經His柱純化，以提高純度進行親和力常數(shù)測定。His柱用去離子水洗三遍，然后用1x抽提Buffer(pH7.0PBS)洗一遍。懸浮Talon樹脂，吸1ml到柱子里，除掉乙醇，用20ml的PBS分兩次平衡柱子。除掉PBS，加入2.5ml復性好的4D11-scFv(0.283mg/ml)和2ml PBS，混勻，置4℃2h。收集穿透峰，然后用PBS洗3遍，每次2分鐘。加1x洗滌Buffer(PBS，含5mM咪唑，pH7.0)1.2ml到柱子，混勻，靜置5min，收集洗滌液，重復此步驟三遍，均收集洗脫液。加1x洗脫Buffer(PBS，含150mM咪唑，pH7.0)1.2ml到柱子，混勻，靜置5min，收集洗脫液，重復此步驟三遍，均收集洗脫液。加5ml MES再生。對所收集的溶液進行SDS-PAGE電泳，銀染結果(圖4)可知4D11 scFv經His柱純化后的純度達到95％以上，對純化過程中的各部分收集液進行間接ELISA檢測，結果見表2，發(fā)現(xiàn)第一次和第二次洗脫液的活性較高，OD420分別為1.403和1.008。
表2.間接ELISA檢測His柱純化過程中各部分收集液的活性一次一次洗 二次洗 三次洗洗脫液對原液穿透峰 再生洗滌 脫 脫 脫 照OD4203.2750.1090.0331.403 1.008 0.183 0.055 0.044
序列表<110>廈門大學養(yǎng)生堂有限公司<120>乙型肝炎病毒單克隆抗體可變區(qū)序列以及含有所述可變區(qū)的基因工程抗體及其用途<130>IDC030094<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>119<212>PRT<213>artificial<400>1Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr1 5 10 15Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr20 25 30Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ile Lys Tyr Asn Glu Asn Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Thr Arg Pro Ala Asn Met Ile Thr Thr Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100105 110Thr Ser Val Thr Glu Ser Ser115<210>2<211>113<212>PRT<213>artificial<400>2Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly1 5 10 15Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser20 25 30Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro50 55 60Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile65 70 75 80Ser Arg Leu Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Thr85 90 95Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105 110Arg
<210>3<211>357<212>DNA<213>genome<400>3cagatccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctgggacttc agtgaagata 60tcctgcaagg cttctggcta caccttcact gactactata taaactgggt gaagcagaag120cctggacagg gacttgagtg gattggatgg atttttcctg gaagcggtaa tattaagtac180aatgagaact tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca catcctccaa cacagcctac240atgcaactca gcagcctgac atttgaggac actgctgtct atttctgtac aagacccgct300aatatgatta cgacgcttgc ttactggggc caaggaacct cggtcaccga atcttct 357<210>4<211>339<212>DNA<213>genome<400>4gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60atctcttgca gatctagtca gagccttgta tacagtaatg gaaacaccta tttacactgg120tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt180tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc240agcagactgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct cteaaactac acatgttcct300ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaacgg 339
權利要求
1.可特異性結合乙型肝炎病毒preS1的鼠單克隆抗體的可變區(qū)序列，其中1)重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO1所示，或者是該序列經一個或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾保守性突變而獲得的保守性變異體；2)輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，或者是該序列經一個或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾保守性突變而獲得的保守性變異體。
2.一種由權利要求1所述的可變區(qū)序列中重鏈可變區(qū)部分或其保守性變體，和/或輕鏈可變區(qū)部分的氨基酸序列或其保守性變異體組裝成的基因工程抗體，其仍保留特異結合乙型肝炎病毒preS1的能力。
3.權利要求2所述的基因工程抗體，其為包含權利要求1所述的可變區(qū)序列中重鏈可變區(qū)氨基酸序列或其保守性變異體，和/或輕鏈可變區(qū)氨基酸序列或其保守性變異體的單鏈抗體、嵌合單克隆抗體、改形單克隆抗體、或其他人源化形式的單克隆抗體，或所述抗體的片段，其仍保留特異結合乙型肝炎病毒preS1的能力。
4.一種包含至少一種選自權利要求2所述基因工程抗體或所述抗體片段的融合蛋白，其仍保留特異結合乙型肝炎病毒preS1的能力。
5.權利要求4所述的融合蛋白，其為雙特異抗體。
6.一種復合物，其包含選自至少一種權利要求2所述的基因工程抗體或其保留特異結合乙型肝炎病毒preS1的能力的片段，以及與之相偶聯(lián)的一種或多種治療乙型肝炎的藥物分子。
7.一種核酸分子，其編碼權利要求1所述的可變區(qū)氨基酸序列之重鏈可變區(qū)，其具有如SEQ ID NO3所示的核苷酸序列或其簡并性序列；或者其編碼權利要求1所述的可變區(qū)氨基酸序列之輕鏈可變區(qū)，其具有如SEQ ID NO4所示的核苷酸序列或其簡并性序列。
8.一種包含權利要求7所述核酸分子的重組表達載體。
9.一種經權利要求8所述重組表達載體轉化的宿主細胞，其能夠表達權利要求2所述的基因工程抗體或其保留特異結合乙型肝炎病毒preS1的能力的片段。
10.權利要求2所述的基因工程抗體或其保留特異結合乙型肝炎病毒preS1的能力的片段用于制備診斷、預防和/或治療乙型肝炎病毒的藥物的用途。
11.一種藥物組合物，其包含治療有效量的權利要求2所述的基因工程抗體或其保留特異結合乙型肝炎病毒preS1的能力的片段或其保守性變體，以及藥學可接受的載體和/或佐劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對乙型肝炎病毒preS1的新鼠單克隆抗體可變區(qū)序列，包括重鏈和輕鏈可變區(qū)及其保守性變異體，編碼該可變區(qū)氨基酸序列的核酸分子，包含該核酸分子的重組表達載體以及宿主細胞，由所述可變區(qū)序列組裝成的基因工程抗體，包含該基因工程抗體的融合蛋白，由該基因工程抗體與一種或多種治療乙型肝炎的藥物分子偶聯(lián)的復合物，該基因工程抗體用于制備診斷、預防和/或治療乙型肝炎病毒的藥物的用途，以及包含該基因工程抗體和藥學可接受的載體和/或佐劑的藥物組合物。
文檔編號A61P1/16GK1609123SQ200310101630
公開日2005年4月27日 申請日期2003年10月23日 優(yōu)先權日2003年10月23日
發(fā)明者張軍, 羅文新, 顧穎, 李利峰, 朱子恒, 夏寧邵 申請人:廈門大學, 養(yǎng)生堂有限公司