專利名稱：：含有針對約四種引起痤瘡的抗原的混合IgY的雞蛋及其蛋黃粉和混合IgY的生產方法
技術領域：
：該發(fā)明是關于針對痤瘡發(fā)病菌的復合型特殊免疫蛋白生產方法及復合型特殊免疫蛋白的技術。
背景技術：
：在該發(fā)明中，醫(yī)學上稱之為尋常性痤瘡的粉刺(acnevulgaris)是步入青春期的象征，每10名進入青春期的男女中，7～8人有過長青春痘的經驗。隨著女性進入社會的比例上升，隨之而來的精神壓力日益加劇，故在20多歲或30多歲時第一次長痤瘡的女性也在逐漸增加。觀察誘發(fā)痤瘡的原因如下首先、是因為皮脂分泌過分旺盛。在內分泌腺的調節(jié)下，從皮膚皮脂腺分泌出的皮脂分泌過多直接導致皮脂腺繼續(xù)生成，并從皮脂腺排管通過漏斗部，在皮膚表面分泌出皮脂，導致皮脂分泌過多。此外，睪丸激素也會促進皮脂分泌，并激活脂質的生物合成分泌，所以在第二次成長期——青少年期，皮脂腺非常發(fā)達。一般來講，成年男性從睪丸分泌出的睪丸激素促使皮脂分泌保持穩(wěn)定，而女性在排卵后的一定期間內，抗體荷爾蒙的增加會刺激皮脂腺，導致皮脂分泌增加，并在月經后會出現(xiàn)痤瘡惡化的現(xiàn)象。其次、是因為毛孔閉塞。在上述第一個原因中，皮脂的過多分泌會導致漏斗部閉塞，致使毛囊孔和皮脂腺開口部閉塞或變窄，以至無法正常排泄皮脂，使皮脂留在毛漏斗部，變成黑頭粉刺，增加痤瘡桿菌，而桿菌的生成物又會刺激漏斗部的上皮細胞，角質化現(xiàn)象得到亢進，致使皮脂堵塞皮脂腺和毛囊，最終引發(fā)出疹癥狀。第三、隨著皮脂成分變成含有黑色素的黑色凝塊，厭氧性細菌——痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)也會逐漸增加。上述痤瘡丙酸桿菌屬于厭氧性細菌，它主要分布在毛孔周圍或漏斗部，能將皮脂增殖為營養(yǎng)成分，并分泌出脂肪酶，分離出皮脂的主要成分——甘油三酸酯(triglyceride)，生成游離脂肪酸。上述游離脂肪酸會對皮膚上皮起作用，生成各種酵素，破壞毛囊壁，在毛囊周圍的結合組織誘發(fā)炎癥。皮脂腺的肥大增殖、毛囊孔的角質化亢進以及細菌的影響起到復合性作用，惡化痤瘡癥狀，有時這些原因還會單獨誘發(fā)痤瘡癥狀。此外，容易長痤瘡的體質的遺傳性因素、飲食影響以及疲勞和精神壓力也是誘發(fā)痤瘡癥狀的主要原因之一。在誘發(fā)痤瘡的主要原因中，痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)是其原因菌，這是滋生于皮膚里的常在菌，也是引發(fā)原發(fā)性皮膚疾病、痤瘡引起的皮膚疾病和迅速惡化癥狀的原因菌，此外還有粘液誘發(fā)病癥的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。(Francismartineauetal.，1996、ChristianC.etal.、1990)在引發(fā)皮膚及軟組織感染、肺炎、菌血癥等癥狀的G(+)球菌中，最常見的病原菌為金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。(GordonL.Archer.、1996)此外，還有繁殖在不潔皮膚中的大腸菌。目前，治療痤瘡的方法有殺滅痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)的抗生劑或遏制皮脂過多分泌的方法。除了抗生劑以外，目前正在開發(fā)約有40種痤瘡治療劑的后選物質。其中，主要有類維生素A(retinoid)和雄激素拮抗劑等16種痤瘡治療劑得到集中研究和開發(fā)。睪丸激素通過5-α-還原酶(5-α-reductase)轉換成有兩個氫原子的睪丸激素，而它成為在皮脂腺的細胞內生成皮脂的主要物質，促進皮脂生成，目前已有人發(fā)表了關于5-α-還原酶抑制劑(5-α-reductaseinhibitor)的研究報告。(CationsInhibitSpecificallyTypel5α-reductaseFoundinHumanSkin、J.Invest.Dermatol、104、775-778、1995)就5-α-還原酶抑制劑(5-α-reductaseinhibitor)系統(tǒng)，目前正由摩克制藥公司(Merck&Co)開發(fā)研究兩種后選物質，而在抗生劑方面，杜鵑花酸(Skinorenazelaicacid)和局部用喹諾酮(Acuatim、那氟沙星nadifloxacin)分別由德國先靈藥廠(ScheringAG)和日本大冢公司(Otsuka)開發(fā)研究。在相關技術研究方面，作為天然物質，在鹿腳部位發(fā)現(xiàn)的(E)-3-十三碳烯醇-2-one((E)-3-tridecen-2-one)，能有效遏制以皮膚油作為培養(yǎng)基增殖的細菌，這一技術已得到有關部門驗證并已注冊專利。(PharmaprojectsMagazine、July1997)表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的粘液生成能力對細菌的病原性起到重要作用。粘液性物質將覆蓋菌體，并通過外部多糖體形成生體膜。通過粘液性物質形成的粘液層能從抗生劑保護菌體，并阻止宿主的免疫反應——蝕菌作用。據(jù)有關資料顯示，它還能遏制血球凝集素，并損壞宿主的免疫系統(tǒng)。對痤瘡誘發(fā)菌——金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的感染，曾使用過對β-內酰胺酶(beta-lactamase)較穩(wěn)定的青霉素(penicillin)，但在20世紀90年代，發(fā)現(xiàn)有35～66％的金黃色葡萄球菌是甲氧苯青霉素-抵抗性金黃色葡萄球菌(methilline-resistantStaphylococcusaureusMRSA)，從此普遍使用了糖肽(glycopeptide)——萬古霉素(vancomycin)。(GordonL.Archer.、1996、RichardS.schwalbeetal.、1987)1996年以后，在日本、美國和法國發(fā)現(xiàn)了萬古霉素(vancomycin)中呈現(xiàn)出中性耐性的萬古霉素敏感性降低的黃色葡萄球菌(vancomycinintermediateresistantStaphylococcusaureus、VISA)，故在這一領域引起了更大反響。萬古霉素敏感性降低的黃色葡萄球菌(VISA)在多種抗生劑中呈現(xiàn)出了耐性，這表明它能替代目前正在使用的抗生劑，同時還有望成為萬古霉素敏感性降低的黃色葡萄球菌(VISA)感染患者的新的福音。(RichardS.schwalbeetal.、1987、Keiichihiramatsu.、1998)盡管目前已開發(fā)出了上述藥劑等痤瘡治療劑，但痤瘡癥狀仍不斷出現(xiàn)和惡化，其原因很多，且根據(jù)不同人的特點，也有很多差別，但因毛孔在人體中起到免疫作用，故認為痤瘡與人體免疫功能有著最直接的關系。
發(fā)明內容根據(jù)該發(fā)明研發(fā)的含有四種混合菌的抗-復合型特殊免疫蛋白(IgY)雞蛋生產方法旨在解決上述問題，用氫氧化鋁將痤瘡丙酸桿菌抗原、表皮葡萄球菌抗原、金黃色葡萄球菌抗原和大腸菌抗原乳化成混合菌乳液，并用該乳液給小雞進行一次免疫接種，然后再用乳化助劑(ISA25)乳化上述四種抗原，制成混合菌乳液，并以兩個星期為周期，給小雞進行第二次免疫接種，使雞生下含有特殊免疫蛋白的雞蛋。此外，該發(fā)明還旨在在含有蔗糖(Sucrose)0.5％和乙二胺-DI-O-間苯二酚乙酸(Ethylenediamine-di-O-hydroxyphenolaceticacid)0.5％的胰酶大豆肉湯(TrypticsoybrothTSB)中制作痤瘡原因菌里的表皮葡萄球菌，增加病原性的主要原因——表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的粘液量，提供特殊免疫蛋白。圖1是單獨或復合接種痤瘡丙酸桿菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌時的每種特殊免疫蛋白的效價變化所示圖。圖2是單獨或復合接種大腸菌時的抗-大腸菌特殊免疫蛋白的效價變化所示圖。圖3是單獨或復合接種痤瘡丙酸桿菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌時的每種特殊免疫蛋白的平均效價所示圖。圖4是單獨或復合接種大腸菌時的抗-大腸菌特殊免疫蛋白的平均效價所示圖。具體實施方法根據(jù)該發(fā)明研發(fā)的含有四種混合菌的抗-復合型特殊免疫蛋白(IgY)雞蛋生產方法具有如下特點為了實現(xiàn)上述技術課題，該發(fā)明對痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacne)、粘液量增加的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大腸菌(E.coli)進行抗原化處理，并同時給小雞接種，以使每個雞蛋均含有能夠預防痤瘡的復合型特殊免疫蛋白。該發(fā)明中的胰酶大豆肉湯(TrypticsoybrothTSB)含有0.5％能增加表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)粘液量的蔗糖(Sucrose)和0.5％乙二胺-DI-O-間苯二酚乙酸(Ethylenediamine-di-O-hydroxyphenolaceticacid)。在該發(fā)明中，從根據(jù)上述方法生下的含有復合型特殊免疫蛋白的雞蛋中分離出蛋黃，并制成含有復合型特殊免疫蛋白的蛋黃粉末。在該發(fā)明中，生產出針對痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)、粘液量增加的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大腸菌(E.coli)的特殊免疫蛋白的階段如下利用氫氧化鋁乳化而制的痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)、粘液量增加的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大腸菌(E.coli)，制成混合菌乳化液，并用該混合菌乳液給小雞(約為12周齡)接種一次，然后用乳化助劑(ISA25)乳化上述四種同一抗原，制成混合菌乳液，并用該混合菌乳化液給小雞第二次接種，如此共給小雞接種三次，使其生下含有復合型特殊免疫蛋白(IgY)的雞蛋。進一步說明抗原的混合比例和乳化液的比例如下給小雞接種的菌體數(shù)比例為痤瘡丙酸桿菌抗原∶粘液量增加的表皮葡萄球菌抗原∶金黃色葡萄球菌抗原∶大腸菌抗原∶乳化助劑＝3∶1∶1∶1∶4。為此，應將1.0×109/ml痤瘡丙酸桿菌殺菌液抗原0.15ml、1.0×109/ml表皮葡萄球菌殺菌液抗0.05ml、1.0×109/ml金黃色葡萄球菌殺菌液抗原0.05ml、1.0×109/ml大腸菌殺菌液抗原0.05ml與氫氧化鋁0.2ml乳化成0.5ml的混合菌乳液，并在小雞的一條腿上接種一次。將上述四種抗原以同樣的比例混合，并用0.2ml的乳化助劑(ISA25)乳化，制成混合菌乳液，然后以兩個星期為周期，在小雞的一條腿上進行第二次接種0.5ml的混合菌乳液，如此共接種三次。通過給小雞接種上述四種混合抗原，使已被免疫的產蛋雞生下同時擁有抗-痤瘡丙酸桿菌特殊免疫蛋白、抗-表皮葡萄球菌特殊免疫蛋白、抗-金黃色葡萄球菌特殊免疫蛋白和抗-大腸菌特殊免疫蛋白等復合型特殊免疫蛋白(IgY)的雞蛋，并使雞蛋蛋黃含有上述四種混合抗原。在該發(fā)明中，為了增加對抗表皮葡萄球菌的特殊免疫蛋白，在復合型特殊免疫蛋白的生產階段，對粘液量增加的表皮葡萄球菌進行抗原化處理，共給小雞接種三次。詳細說明上述過程如下在添加了0.5％的蔗糖(Sucrose)和0.5％的乙二胺-DI-O-間苯二酚乙酸(ethylenediamine-di-O-hydroxyphenolaceticacid)的胰酶大豆肉湯(TrypticSoyBrothTSB)中進行增菌處理，增加表皮葡萄球菌的粘液量。利用含有0.5％的蔗糖(Sucrose)和0.5％的乙二胺-di-O-間苯二酚乙酸(Ethylenediamine-di-O-hydroxyphenolaceticacid)的胰酶大豆肉湯(TrypticsoybrothTSB)，生成病原性的主要原因——粘液量增加的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)，并增加影響病原性的原因——粘液的特殊免疫蛋白。該發(fā)明還在禽蛋加工廠，對通過上述方法生下的同時含有抗-痤瘡丙酸桿菌特殊免疫蛋白、抗-表皮葡萄球菌特殊免疫蛋白、抗-金黃色葡萄球菌特殊免疫蛋白和抗-大腸菌特殊免疫蛋白的雞蛋進行分離蛋黃和噴霧干燥處理，制作蛋黃粉末。通過該發(fā)明實例及圖表詳細說明該發(fā)明結構如下(該發(fā)明的權利范圍和請求范圍并不局限于如下實例及圖表。)實例1(1)制作痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)抗原痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)是從韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)購買并使用的，該菌的正規(guī)名稱是Propionibacteriumacnes(KCTC3314)。上述抗原是革蘭氏細菌(Gram)培養(yǎng)桿菌，其大小為0.3～1.3μm×1～10μm。該抗原的部分菌體膨大，菌端為尖而多形性，并排列成“V”形。(甲)革蘭氏細菌(Gram)的染色性狀利用棉棒將已增菌的菌體涂抹在載片上面，并在空氣中晾干涂抹的菌體標本，然后又將干燥的標本在火花中通過2～三次予以固定。利用結晶紫試液(alkalinecrystalviolet)染色劑進行兩分鐘處理，并在Kopeloffiodine媒染劑反應兩分鐘，制成丙酮(acetone)和酒精(alcohol)的比例為3∶7的混合試劑。利用鹽基性紅色染料(safranin)進行20秒的對照染色處理，并通過檢鏡，確定是革蘭氏細菌(Gram)培養(yǎng)的桿菌。(乙)固體培養(yǎng)基中的性狀將其涂抹在GAM半固體培養(yǎng)基(GAMsemisolid)上，并在含有二氧化碳(CO2)10％的恒溫器的厭氧性條件下培養(yǎng)4～5天，使其增殖為圓形隆起并具有非透明光澤的菌落。經過一段時間后，菌落的顏色逐漸變成了橙紅色(Salmonpink)。(丙)制作痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes)抗原在5ml的放線菌培養(yǎng)基(Actinomycesbroth)中，對痤瘡丙酸桿菌進行為時3個小時的第一次增菌處理。將第一次增菌液接種到大量放線菌培養(yǎng)基(Actinomycesbroth)中，并在含有10％的二氧化碳(CO2)，溫度為37℃的恒溫器中進行增菌處理。在恒溫器中培養(yǎng)72個小時的菌液中添加甲醛(formaldehyde)，使菌液的濃度變成0.2％，并在室內溫度下進行24個小時的不活化處理。在4,000rpm的條件下，對進行不活化處理的菌液進行20分鐘的離心處理，以獲得細菌，并用滅菌生理鹽水(pH7.2)進行了三次稀釋。將進行不活化處理的菌液涂抹在固體培養(yǎng)基上，確定其為不能增菌的菌體。用滅菌生理鹽水對上述進行不活化處理的菌體進行三次稀釋，并在-20℃的溫度下冷藏，用作抗原。(2)制作表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)抗原表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)是從韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)購買并使用的，該菌的正規(guī)名稱是Staphylococcusepidermidis(KCTC1917)。該抗原是直徑為0.8～1.0μm的球菌，在染色標本屬于革蘭氏細菌(Gram)培養(yǎng)球菌，一般排列成葡萄串形狀，在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的染色標本呈雙球菌、連鎖狀、四分染色體等不規(guī)則的葡萄串排列狀。(甲)革蘭氏細菌(Gram)的染色性狀采用與痤瘡丙酸桿菌相同的方法，這也是葡萄串形狀的革蘭氏細菌(Gram)培養(yǎng)球菌。培養(yǎng)初期，其革蘭氏細菌(Gram)培養(yǎng)的性質非常強烈，但在經過一段時間后，逐漸呈革蘭氏細菌(Gram)陰性。(乙)固體培養(yǎng)基中的性狀在寒天培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24個小時后，菌落的圓形平滑，變成有光澤的半球狀菌落，其直徑為1～2mm。菌落的色素呈白色，在食鹽培養(yǎng)基中顯示出耐鹽性。(丙)在表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)特殊培養(yǎng)基制作抗原在含有5ml的0.5％蔗糖(Sucrose)和0.5％乙二胺-DI-O-間苯二酚乙酸(Ethylenediamine-di-o-hydroxyphenolaceticacid)的TSB(Trypticsoybroth)特殊培養(yǎng)基中，對表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)進行了3個小時的第一次增菌處理，并將增菌的第一次增菌液接種到大量特殊培養(yǎng)基中，然后在37℃恒溫器里進行了搖晃增菌處理。在恒溫器中培養(yǎng)36個小時的菌液中，添加甲醛(formaldehyde)，使菌液的濃度變成0.2％，并在室內溫度下進行了24個小時不活化處理。在4,000rpm的條件下，對進行不活化處理的菌液進行20分鐘的離心處理，獲得細菌，并用滅菌生理鹽水(pH7.2)進行了三次稀釋。將進行不活化處理的菌液涂抹在固體培養(yǎng)基上，確定其為不能增菌的菌體。用滅菌生理鹽水對上述進行不活化處理的菌體進行三次稀釋，并在-20℃的溫度下冷藏，用作抗原。(丁)表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的粘液染色用阿新藍(alcianblue)對利用特殊培養(yǎng)基增殖的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)粘液進行染色處理并確認。(3)制作金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)抗原金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是從韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)購買并使用的，該菌的正規(guī)名稱是金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusKCTC1621)。該抗原為典型的圓形菌，是形成不規(guī)則的葡萄串排列狀的非孢子形成革蘭氏細菌培養(yǎng)(0.5～1.5μm)菌，有時其外表帶有膠囊狀粘液層，作為人體病原性菌，是一種非運動性需氧或通性厭氧性菌。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)抗原制作過程如下將金黃色葡萄球菌接種到胰酶大豆肉湯(Difco)上，并在37℃溫度下培養(yǎng)24個小時。將菌體涂抹在固體培養(yǎng)基上，然后在4℃溫度下保管，并在每7天繼代培養(yǎng)和使用一次。在60℃恒溫水槽中，對培養(yǎng)的菌體進行30分鐘的熱處理，殺滅活的抗原，然后在10,000xg條件下進行15分鐘的離心處理，獲得菌體，并在該菌體中添加生理鹽水，進行三次離心處理，去除菌體內的培養(yǎng)基成分。利用血球計算儀，測定滅活菌體原液的細菌數(shù)量。(4)大腸菌(EnterotoxigenicE.coli)的分離同定和抗原制作(甲)從人體分離并同定大腸菌(EnterotoxigenicEscherichiacoliETEC)用于該實驗的大腸菌(EnterotoxigenicE.coli)是從患有腹瀉癥狀的小兒糞便中分離出來的。人體中的大腸菌具有標準微生物特性，只要是該
技術領域：
的研究人員，均可輕松分離出大腸菌(EnterotoxigenicE.coli)。抗原分離方法如下在漢城大學附屬兒童醫(yī)院提取小兒的腹瀉糞便，并將部分樣本涂抹在半固體培養(yǎng)基上，然后在37℃恒溫器中培養(yǎng)18個小時，并選定一個呈現(xiàn)出α-溶血性的大腸菌菌落。該菌落在麥康凱瓊脂(MacConkeyagar)中培養(yǎng)成粉紅色，將其涂抹在EMB培養(yǎng)基(EMBagar)上，通過呈綠色(metalicgreen)的大腸菌特殊菌落性狀進行確認。將如此分離的大腸菌命名為EB-E01。(乙)確認毒素(Toxin)生產能力通過聚合酶鏈反應(Polymerasechainreaction以下簡稱PCR)法，確認了大腸菌(E.coli)腸毒素(enterotoxigenicity)的主要原因——腸毒素(Entrotoxin)的生產能力。通過采用對熱穩(wěn)定毒素(以下簡稱STheatstabletoxin)STa1基因和熱不穩(wěn)定毒素(以下簡稱LTheatlabletoxin)LTh基因的特殊引物(Primer)的多重(multiplex)PCR方法，進行了擴增。ST毒素確認用引物為有義引物CCCCTCTTTTAGTCAGTC反義引物CCAGCACAGGCAGGATTACA采用了能夠擴增到165bps最終產物的引物。LT毒素確認用引物為有義引物CAGACTATCAGTCAGAGGTTG反義引物TTCATACTGATTGCCGCA采用了能夠擴增到417bps最終產物的引物。在PCR條件中，在預變性溫度(Pre-denaturationtemperature)95℃下進行5分鐘、在變性溫度(Denaturationtemperature)94℃下進行1分鐘、在退火溫度(Annealingtemperature)56℃下進行1分鐘、延伸溫度(Elongationtemperature)72℃下進行1分鐘、在后-延伸溫度(Post-elongationtemperature)72℃下進行了10分鐘擴增。對擴增的產物，以利用瓊脂糖膠(agarosegel)2％的電泳方式進行了確認。經確認，用于該發(fā)明的分離菌株能夠生成ST毒素。(丙)制作大腸菌ETEC(EnterotoxigenicE.coli)抗原將大腸菌ETEC菌株接種到胰酪蛋白胨大豆瓊脂(Trypticasesoyagr)上，并在37℃恒溫器中培養(yǎng)18個小時，然后將一個菌落(colony)接種到5ml的胰化酪蛋白大豆培養(yǎng)基(Trypticasesoybroth)中。經2個小時后，又接種到大量胰化酪蛋白大豆培養(yǎng)基上，并在37℃恒溫器中放置培養(yǎng)了48個小時。在培養(yǎng)的菌液中添加菌液的0.2％的甲醛(formaldehyde)，并在室內溫度下進行了24個小時的不活化處理。在4,000rpm的條件下，再對進行不活化處理的菌液進行20分鐘的離心處理，獲得細菌，并用滅菌生理鹽水(pH7.2)進行了三次稀釋。將菌體浮游在生理鹽水上，使其從410nm變成1.2～1.3的O.D.(OculusDexter)后使用。(5)給小雞接種四種復合抗原(甲)在給12周齡的小雞接種的抗原中，痤瘡丙酸桿菌抗原∶粘液量增加的表皮葡萄球菌抗原∶金黃色葡萄球菌∶大腸菌抗原∶乳化助劑的比例為3∶1∶1∶1∶4，并將1.0×109/ml痤瘡丙酸桿菌殺菌液抗原0.15ml、1.0×109/ml表皮葡萄球菌殺菌液抗0.05ml、1.0×109/ml金黃色葡萄球菌殺菌液抗原0.05ml、1.0×109/ml大腸菌殺菌液抗原0.05ml與氫氧化鋁0.2ml乳化成0.5ml的混合菌乳液，并在小雞的一條腿上接種一次，并從第二次開始，用于增壓的助劑采用乳化助劑(ISA25)，將上述四種抗原乳化成混合菌乳液，然后以兩個星期為周期，在小雞的一條腿上第二次接種0.5ml的混合菌乳液，如此共接種三次。本發(fā)明人通過圖1、圖2、圖3、圖4說明了接種上述四種混合菌乳液的產蛋雞生下的雞蛋，具有富含抗-痤瘡丙酸桿菌特殊免疫蛋白、抗-表皮葡萄球菌特殊免疫蛋白、抗-金黃色葡萄球菌特殊免疫蛋白和抗-大腸菌特殊免疫蛋白等復合型特殊免疫蛋白(IgY)的特點。通過實例2和實例3對此詳細說明如下實例2.蛋黃分離及經過噴霧干燥處理的蛋黃粉末(1)蛋黃分離在禽蛋加工廠，以業(yè)內人士廣知的技術，分離了通過上述方法生下的雞蛋的蛋清和蛋黃。(2)蛋黃粉末利用噴霧干燥器，對分離的新鮮蛋黃進行噴霧干燥處理，生產蛋黃粉末。實例3.特殊免疫蛋白的分離及效價測定(1)特殊免疫蛋白的分離(甲)分離磷脂和水溶性特殊免疫蛋白(IgY)在禽蛋加工廠，分離通過上述方法生下的雞蛋的蛋清和蛋黃，并為在含有抗-復合型特殊免疫蛋白(IgY)的蛋黃中分離出脂肪和脂蛋白(lipoprotein)，以1∶1的比例混合蛋黃和蒸餾水。即，準備稀釋成兩倍的10個蛋黃樣本，并在每個樣本里添加1～10％的硫酸銨，使其完全熔化，然后將完全熔化的10個樣本置于溫度為5℃的室內24個小時，那么根據(jù)每個樣本的濃度，將分離為上層和下層。這時，上層浮有脂質和部分蛋白質，而下層出現(xiàn)微量沉淀。使用硫酸銨的常規(guī)蛋白質分離方法(Mathews1990)是在蛋白質沉淀法中最常見的方法，它是通過添加大量硫酸銨來提高樣本濃度，使蛋白質沉淀量增多，并通過對此進行離心處理制作蛋黃粉末。為將精制度提高到10～20％，通過對其進行離心處理排除沉淀的方法來去除沒用的粗蛋白質，然后添加20％以上的硫酸銨，并采用沉淀的蛋白質。但在該發(fā)明中，為了分離出蛋黃中的脂質，并未采用各種溶媒或溶劑(沉淀劑)，而是利用脂質的浮游性和硫酸銨的凝聚性，解決了分離蛋黃內的脂蛋白或免疫蛋白的難題。(乙)去除脂質、水溶性蛋白質和色素(蛋黃)為了去除留在已分離出脂質的液體中的部分脂質、水溶性蛋白質和色素(蛋黃)，進行了如下實驗制作6個樣本，并分別向每個樣本添加6倍、12倍、18倍、30倍、42倍、48倍、60倍的蒸餾水進行稀釋，然后將它們置于溫度為5℃的室內一天。這時應注意，不能讓已被分離的上清液與沉淀物混淆。稀釋為6倍的樣本出現(xiàn)了沉淀，但上清液中仍殘留著蛋黃特有的黃色，而其沉淀物迅速與上清液混淆；稀釋為12倍、18倍、30倍的樣本也出現(xiàn)了沉淀，而且沉淀物也未與上清液混淆；稀釋為42倍、48倍、60倍的樣本雖然出現(xiàn)了沉淀，但出現(xiàn)了沉淀物與上清液混淆的現(xiàn)象。最合適的沉淀稀釋率為12倍和18倍，其粘度極高，需要用熱水清洗，就像粘有油漆渣一樣，以至于用流淌的自來水也洗不凈。如表1所示，對去除沉淀物的上清液進行特殊免疫蛋白(IgY)效價測定的結果顯示，僅用效價標示的稀釋率中，60倍和6倍的產率(yield)分別為109％和10％，高于標準值。估計這是因為受到水溶性蛋白質等影響，導致稀釋后的效價高于原液中的效價。除了稀釋為12倍和18倍的樣本以外，其余樣本也均超過了100％。最終選定了未出現(xiàn)沉淀物，色素也被完全去除的稀釋率18倍的樣本。表1表2(丙)實驗結果此前，秋田(Akita，1993年)曾采用過利用蒸餾水的稀釋法，在稀釋后，利用右旋糖苷(dextran)、黃原膠(xanthangum)、聚氧乙烯(PEG)、乙醇(ethanol)、硫酸鈉(sodiumsulfate)等沉淀劑進行沉淀，并用離心處理器分離，但該發(fā)明先用少量硫酸銨去除蛋黃中的脂質，將脂質和蛋白質部分凝集到上層，通過其他發(fā)明人經常使用的硫酸銨沉淀法，顛倒順序分離出了蛋白質。即，此前是通過利用硫酸銨的沉淀法進行了分離處理，而該發(fā)明則采用浮游、凝集的方式進行了分離處理。在該發(fā)明中，僅用5％的硫酸銨、蛋黃和蒸餾水(1∶1)，通過脂質和部分蛋白質的重力差別，將它們凝集并去除，然后再用蒸餾水稀釋，使蛋黃的色素和水溶性蛋白質凝集并沉淀。(2)特殊免疫蛋白的效價測定在通過上述過濾方式收集的水溶性蛋白質中，利用如下方式測定出了特殊免疫蛋白(IgY)的含量特殊免疫蛋白(IgY)含量的測定方式采用了酶免法(ELISA)，用緩沖溶液對每個抗原(痤瘡丙酸桿菌、粘液量增加的表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、大腸菌)進行稀釋處理，以使吸光度(O.D.)值從660nm變成0.05。將稀釋的菌體涂抹在微量滴定盤上放置16個小時，然后稀釋該微量滴定盤，并添加過濾的水溶性特殊免疫蛋白，進行反應和稀釋，并添加了以1∶10,000稀釋的IgGAb-HRP。這時，將TMB用作HRP的培養(yǎng)基，并將2Normal-硫磺酸(2N-H2SO4)用作反應終止液，在450nm條件下測定了吸光度。如圖1、圖2、圖3、圖4所示，特殊免疫蛋白(IgY)的含量測定結果如下如圖1和圖3所示，復合接種表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌和大腸菌時，痤瘡丙酸桿菌的特殊免疫蛋白效價要比單獨接種痤瘡丙酸桿菌時多，而復合接種痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸菌時，表皮葡萄球菌的特殊免疫蛋白效價也比單獨接種表皮葡萄球菌多。此外，復合接種痤瘡丙酸桿菌、表皮葡萄球菌和大腸菌時，金黃色葡萄球菌的特殊免疫蛋白效價要比單獨接種金黃色葡萄球菌多。如圖2和圖4所示，復合接種痤瘡丙酸桿菌、表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌時，大腸菌特殊免疫蛋白的平均效價要比單獨接種時高。發(fā)明效果綜上所述，該發(fā)明同時對痤瘡誘發(fā)菌——痤瘡丙酸桿菌、皮膚疾病誘發(fā)菌——表皮葡萄球菌、誘發(fā)化膿性炎癥的金黃色葡萄球菌和大腸菌進行抗原處理，并制成同時含有上述四種抗原的特殊免疫蛋白的復合型特殊免疫蛋白，因而添加了復合型特殊免疫蛋白的防痤瘡化妝品能有效治療皮膚疾病。詳細說明該發(fā)明效果如下首先、在給小雞(約為12周齡)陸續(xù)接種(三次接種×四種菌＝共一二次接種)上述四種痤瘡誘發(fā)菌時，通過一二次痤瘡誘發(fā)菌接種，最大限度地減少壓力，并能增加產蛋雞的產蛋量。據(jù)相關報告內容顯示，如給產蛋雞直接接種上述誘發(fā)菌，就會降低50～60％的產蛋量。如該發(fā)明實例所示，如果雞蛋產量增加，雞蛋內的復合型特殊免疫蛋白也能達到最高值。其次、給小雞接種根據(jù)該發(fā)明研發(fā)的病原性主要原因——粘液量增加的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)，為其進行免疫，能有效增加抗-表皮葡萄球菌的特殊免疫蛋白。序列表<110>雞蛋高新技術有限公司(EggBiotechIncorporation)<120>含有針對約四種引起痤瘡的抗原的混合IgY的雞蛋及其蛋黃粉和混合IgY的生產方法(THEPRODUCTIONMETHODOFEGGCONTAININGMIXIGYABOUTFOURANTIGENCAUSINGACNESANDTHEREOFEGGYOLKPOWDERANDMIXIGY)<130>SPI033238-47<140><141><160>4<170>PatentInversion3.1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1cccctcttttagtcagtc18<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2ccagcacaggcaggattaca20<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3cagactatcagtcagaggttg21<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>4ttcatactgattgccgca18權利要求1.含有四種混合菌的抗-復合型特殊免疫蛋白(IgY)雞蛋生產方法應具有如下特點用氫氧化鋁將痤瘡丙酸桿菌抗原、表皮葡萄球菌抗原、金黃色葡萄球菌抗原和大腸菌抗原乳化成混合菌乳液，并用該乳液給小雞進行一次免疫接種；再用乳化助劑(ISA25)乳化上述四種抗原，制成混合菌乳液，并以兩個星期為周期，給小雞進行第二次免疫接種，使得生下含有特殊免疫蛋白的雞蛋，是一種含有四種混合菌的抗-復合型特殊免疫蛋白(IgY)雞蛋生產方法。2.在第1項中，給小雞接種的菌體數(shù)比例應為痤瘡丙酸桿菌抗原∶表皮葡萄球菌抗原∶金黃色葡萄球菌抗原∶大腸菌抗原∶乳化助劑＝3∶1∶1∶1∶4。為此，應將1.0×109/ml痤瘡丙酸桿菌殺菌液抗原0.15ml、1.0×109/ml表皮葡萄球菌殺菌液抗原0.05ml、1.0×109/ml金黃色葡萄球菌殺菌液抗原0.05ml、1.0×109/ml大腸菌殺菌液抗原0.05ml與氫氧化鋁0.2ml乳化成0.5ml的混合菌乳液，并給小雞進行一次免疫接種的階段；再用乳化助劑(ISA25)乳化上述四種同一比例的同一抗原，制成混合菌乳液，并以兩個星期為周期，給小雞進行第二次免疫接種，使得生下含有特殊免疫蛋白的雞蛋。3.在第1項或第2項中，表皮葡萄球菌利用含有蔗糖0.5％和乙二胺-DI-O-間苯二酚乙酸(Ethylenediamine-di-o-hydroxyphenolaceticacid)0.5％的胰酶大豆肉湯(TrypticSoyBrothTSB)增菌培養(yǎng)，使其粘液量增加。4.將從利用第3項方法生下的雞蛋提取蛋黃，進行分離和噴霧干燥處理，制成蛋黃粉末。5.將從利用第3項方法生下的雞蛋提取的蛋黃，用蒸餾水稀釋的階段在上述稀釋溶液中，添加含有特殊免疫蛋白(IgY)的水溶性蛋白質和足以分離磷脂的3～10％的硫酸銨，以分離磷脂和水溶性蛋白質的階段；然后用蒸餾水稀釋上述分離的溶液，然后置于4～10℃的溫度中進行沉淀。全文摘要該發(fā)明是關于針對痤瘡發(fā)病菌的復合型特殊免疫蛋白生產方法及復合型特殊免疫蛋白的技術。進一步說明如下用氫氧化鋁將痤瘡丙酸桿菌抗原、表皮葡萄球菌抗原、金黃色葡萄球菌抗原和大腸菌抗原乳化成混合菌乳液，并用該乳液給小雞進行一次免疫接種，然后再用乳化助劑(ISA25)乳化上述四種抗原，制成混合菌乳液，并以兩個星期為周期，給小雞進行第二次免疫接種，使雞生下含有特殊免疫蛋白的雞蛋，是一種含有四種混合菌的抗－復合型特殊免疫蛋白(IgY)的雞蛋生產方法。此外，在添加蔗糖和乙二胺－D－O－間苯二酚乙酸的培養(yǎng)基中增加表皮葡萄球菌的粘液量，然后給小雞進行抗原、免疫處理，增加抗體能力。根據(jù)上述方法生下的雞蛋蛋黃粉末或復合型特殊免疫蛋白能有效預防痤瘡。文檔編號A61P17/00GK1611514SQ20031010455公開日2005年5月4日申請日期2003年10月31日優(yōu)先權日2003年10月31日發(fā)明者李南珩,鄭順姬,金美鉉,金相兌,李吉成申請人:雞蛋高新技術有限公司