專利名稱：珠蚌單體多糖zbp-i和提取方法及在制備腫瘤藥中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥提取物，具體來(lái)說是涉及一種從珠蚌軟體中提取的單體多糖及其在制藥中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
養(yǎng)殖淡水珍珠的蚌類一般采用貝類動(dòng)物三角帆蚌[Hyriopsis cumingii(Lea)]、褶紋冠蚌[Cristaria plicata(Lea)]和圓背角無(wú)齒蚌[Anodontawoodiana(Lea)]，在珍珠長(zhǎng)成并被采收以后，其養(yǎng)殖珍珠的母體(軟體部分)一般即死亡，被作為廢物丟棄或其中的極小部分加工成飼料，曾有報(bào)告從三角帆蚌軟體中提取的多糖有抑瘤作用(中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2003年2月第20卷第1期)、河蚌提取物對(duì)小鼠免疫功能的壇強(qiáng)作用(承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，V01.16，NO.4，1999)、河蚌肉提取物能壇加小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)，能提高小鼠血清溶血素水平，能明顯延長(zhǎng)小鼠的痛閾等(中藥材第21卷第4期1998年4月)。從現(xiàn)有技術(shù)可以看出河蚌肉提取物僅僅是一種含有多種成份的混合物，進(jìn)而提取的粗多糖也只是一類多糖，但對(duì)多糖作更深入的研究尚未見報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
1.發(fā)明目的本發(fā)明的目的是從粗多糖中進(jìn)一步分離純化而得到單體多糖ZBP-I，以及它的藥理藥效作用。
2.技術(shù)方案一種珠蚌單體多糖ZBP-I的提取分離方法，其步驟如下(1)取珠蚌粗多糖粉末溶于蒸餾水中，加至纖維素柱頂端，緩緩放下至多糖溶液全部進(jìn)入纖維柱后，分別用不同溶劑洗脫，收集各洗脫液；(2)將各洗脫液用超濾膜超濾，收集被截留部分；(3)用冷凍干燥或真空干燥各洗脫液超濾截留部分，分別得到多糖I、II、III，其中多糖I為量最大部分；(4)取多糖I溶于水中，用Sephadex G-200柱分離，以蒸餾水洗脫，收集洗脫液；(5)將洗脫液用無(wú)水乙醇沉淀多糖、抽濾、無(wú)水乙醇充分洗滌后，冷凍干燥或真空干燥，得白色針形珠蚌單體多糖ZBP-I(Zhu BangPolysaccharide-I)
上述步驟(1)中取珠蚌粗多糖粉末0.5-2g，按1∶1溶于蒸餾水中，不同溶劑是H2O、硼砂、Na2CO3或NaOH，硼砂濃度為0.05mol，Na2CO3濃度為0.001-0.05mol，NaOH的濃度為0.05mol-0.1mol；步驟(2)中將洗脫液以100000分子量的超濾膜超濾，0.2um膜過濾，步驟(4)中多糖I的用量為80-160mg。
上述步驟(5)中的無(wú)水乙醇用量是洗脫液量的3-8倍，真空干燥的溫度為40℃以下，冷凍干燥溫度為0℃以下。
將珠蚌單體多糖ZBP-I用蒽酮一硫酸法測(cè)定糖含量為99.50％以上，糖組成經(jīng)TLC、HPLC法分析測(cè)定確定該多糖為一葡聚糖，用凝膠色譜、標(biāo)準(zhǔn)分子量法測(cè)定量均分子量約為134萬(wàn)。
3.有益效果(1)珠蚌單體多糖ZBP-I能明顯抑制小鼠移植性腫瘤的生長(zhǎng)。通過單體多糖ZBP-1對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用的研究，結(jié)果顯示能明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.05)，表明該單體多糖為珠蚌制劑中發(fā)揮抗腫瘤作用的主要有效活性成分。
(2)單體多糖ZBP-I有抑制血管生成的作用.腫瘤生長(zhǎng)與血管密切相關(guān)，F(xiàn)olkman等認(rèn)為腫瘤一旦出現(xiàn)，其體積壇加之前必然伴隨會(huì)聚于該腫瘤的新血管的壇加。新血管的生成可以為惡性腫瘤壇殖提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是腫瘤生長(zhǎng)不可缺少的條件，同時(shí)腫瘤的轉(zhuǎn)移依賴于血管的生成，所以抑制新血管的生成，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，以阻斷腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移已成為防治腫瘤的新策略。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠血管環(huán)在單體多糖ZBP-I的作用下，血管側(cè)枝生長(zhǎng)明顯被抑制，即單體多糖可通過影響腫瘤生長(zhǎng)過程中的血管形成來(lái)抑制腫瘤的繼續(xù)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。
(3)能促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞吞噬功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示給予珠蚌單體多糖ZBP-I后小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)明顯升高，表明單體多糖有促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用。
(4)能壇強(qiáng)NK細(xì)胞的殺瘤活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示單體多糖作用于小鼠后對(duì)其NK細(xì)胞的殺瘤活性有壇強(qiáng)作用，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)。
四 具體實(shí)施方式
本發(fā)明的有益效果可以通過以下實(shí)施例作進(jìn)一步的說明實(shí)施例1.珠蚌單體多糖ZBP-I的提取分離方法，其提取步驟為(1)取珠蚌粗多糖粉末0.5g溶于蒸餾水中，加至DEAE-纖維素柱頂端，緩緩放下至多糖溶液全部進(jìn)入纖維柱后，分別用H2O、0.05mol的硼砂、依次用0.001、0.005、0.01、0.015mol的Na2CO3溶液洗脫，收集各洗脫液；(2)將洗脫液以UV檢測(cè)，收集各洗脫液峰合并，以100000分子量超濾膜超濾，截留100000以上分子量部份，用0.2um膜過濾；(3)將各超濾截留部分在40℃下真空干燥，分別得到多糖I、II、III，多糖I為獲得量最多部份；(4)取多糖I 100mg溶于水中，用Sephadex G-200柱分離，以H2O為洗脫液，收集洗出液；(5)用洗出液以5倍量的無(wú)水乙醇沉淀多糖、抽濾、無(wú)水乙醇充分洗滌后，在40℃下真空干燥，得珠蚌單體多糖ZBP-I。
實(shí)施例2、珠蚌單體多糖ZBP-I的抗腫瘤作用(一)、珠蚌單體多糖ZBP-I對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用1.實(shí)驗(yàn)材料動(dòng)物ICR小鼠，Wistar大鼠，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，試劑RPMI-1640，小牛血清，青霉素，硫酸鏈霉素，MTT，DMSO(Sigma)，戊巴比妥鈉，pBR322 DNA/Hae III marlers，Proteinase K、RnaseA(華美生物工程公司)，Agrose(Spanish，20010210)、Tris(Amresco分裝)，溴酚藍(lán)，溴乙錠，MCDB131培養(yǎng)基，EACA，纖維蛋白原，凝血酶。
珠蚌單體多糖ZBP-I、云芝多糖膠囊、環(huán)磷酰胺。
細(xì)胞株S180肉瘤(中科院上海細(xì)胞生物研究所提供)，器材96、24孔板，平皿(NUNC)，syringe一次性濾器(pall)2.實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果取ICR種小鼠48只，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，每組12只，層流架中飼養(yǎng)，珠蚌多糖組尾靜脈注射(0.1、0.2g/kg)、陽(yáng)性對(duì)照組灌胃給予云芝多糖(CVP)(0.4g/kg)、模型組尾靜脈注射給予生理鹽水，7d后，取生長(zhǎng)良好的S180瘤株的荷瘤小鼠(腹水型)在無(wú)菌條件下抽取腹水，以1∶3(V/V)生理鹽水稀釋，取0.2ml(約106個(gè))接種于每只小鼠右側(cè)腋窩皮下處(正常組小鼠除外)，各組繼續(xù)給藥，每日觀察記錄小鼠腋下腫瘤生長(zhǎng)情況。接種后第8d，處死小鼠，剝?nèi)》蛛x瘤組織，稱重，記錄瘤重，并計(jì)算抑瘤率。
抑瘤率＝(1-給藥組瘤重/模型組瘤重)×100％表1 ZBP-I對(duì)S180荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響(x±s)組別劑量(g·kg-1) (動(dòng)物數(shù)) 瘤量(g) 抑制率(％)對(duì)照-- 8 1.72±1.02 --CVP 0.04 11 1.34±0.77 22.25ZBP-1 0.20 12 0.87±0.46**49.660.10 12 0.91±0.44*47.24與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01表1結(jié)果顯示ZBP-I能明顯抑制小鼠移植性腫瘤的生長(zhǎng)，與對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.01，P＜0.05)，抑瘤率分別為49.66％，47.24％，表明該多糖應(yīng)為珠蚌制劑中發(fā)揮抗腫瘤作用的主要有效活性成分。
(二)、珠蚌單體多糖ZBP-I對(duì)血管生成的影響(血管環(huán)培養(yǎng))1.實(shí)驗(yàn)方法纖維蛋白原溶解于MCDB131培養(yǎng)液中，終濃度3mg·ml-1。
腹腔注射戊巴比妥鈉(3mg·kg-1)麻醉大鼠，75％乙醇局部滅菌。
打開腹腔，在緊貼脊柱上剪取一段1cm長(zhǎng)腹主動(dòng)脈，立即放入MCDB131培養(yǎng)液中清洗，分離脈管外纖維性和脂肪性組織。
將動(dòng)脈環(huán)剪成約1mm長(zhǎng)的動(dòng)脈環(huán)，MCDB131培養(yǎng)液沖洗。
在1ml纖維蛋白原中加入100μ·ml-1的凝血酶10μl，混勻，立即加入24孔板中，0.5ml/孔，共12孔。
迅速將動(dòng)脈環(huán)放入纖維蛋白膠中，待其凝固。
膠凝固后，再加入0.5ml MCDB131培養(yǎng)液與5μl EACA，同時(shí)加入多糖溶液，終濃度10μg·ml-1，對(duì)照組加入0.5ml培養(yǎng)基，每組各6孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察血管側(cè)枝生長(zhǎng)情況，并保存圖像。每隔一日換液，重新加藥，藥物作用濃度不變。
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果大鼠動(dòng)脈環(huán)微血管生成情況經(jīng)Leica圖像分析系統(tǒng)分析統(tǒng)計(jì)，以下表格為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。結(jié)果顯示ZBP-I多糖作用后與正常組比較出現(xiàn)微血管生長(zhǎng)數(shù)量(條)明顯減少，統(tǒng)計(jì)有顯著性差異。
表2 ZBP-I對(duì)大鼠主動(dòng)脈血管環(huán)微血管生成的影響(x±s，n＝6)組別濃度 新生微血管數(shù)量(條)(μg·ml-1) 4d 6d 8d10d 12d正常對(duì)照-- 10±322±8 39±1365±2476±28ZBP-I 10 3±1**9±5**14±10**26±13**32±20**腫瘤生長(zhǎng)與血管密切相關(guān)。Folkman等認(rèn)為腫瘤一旦出現(xiàn)，其體積增加之前必然伴隨會(huì)聚于該腫瘤的新血管的增加。新血管的生成可以為惡性腫瘤增殖提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是腫瘤生長(zhǎng)不可缺少的條件；同時(shí)腫瘤的轉(zhuǎn)移依賴于血管的生成。新血管生成過程是原位癌向侵襲性癌轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵點(diǎn)，為腫瘤散播建立了一條捷徑，加速腫瘤的轉(zhuǎn)移過程。所以抑制新生血管的生成，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)以阻斷腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移已成為防治腫瘤的新策略。
從表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠血管環(huán)在多糖的作用下血管側(cè)枝生成明顯被抑制，即多糖ZBP-I可通過影響腫瘤生長(zhǎng)過程中的血管形成來(lái)抑制腫瘤的繼續(xù)生長(zhǎng)。實(shí)施例3珠蚌單體多糖ZBP-I對(duì)免疫系統(tǒng)的影響(一)、珠蚌單體多糖ZBP-I對(duì)免疫低下小鼠白細(xì)胞水平的影響1.實(shí)驗(yàn)材料動(dòng)物ICR及Balb/c種系小鼠，雌雄各半，體重20±2g，由南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心及軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物科提供。
試劑2，4-二硝基氯苯(A.R)，丙酮(A.R)，Na2S，環(huán)磷酰胺，氫化可的松注射液，臺(tái)盼藍(lán)，無(wú)水乙醇(A.R)，EDTA-2Na鹽。
RPMI-1640，小牛血清，Trypsin(Amresco 2430B18)，ConA(Sigma)，LPS(Sigma)，MTT(Sigma 99H5079)，SDS。
2.實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果取ICR小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組，①正常組(ip生理鹽水)；②模型組(ip生理鹽水)；③云芝多糖(IG 0.4g·kg-1)；④⑤多糖ZBP-I組(ip 0.1、0.2g·kg-1)，各組連續(xù)給藥。第7d后，除正常組外，其余各組均腹腔注射環(huán)磷酰胺(10mg·kg-1)，連續(xù)3d。給藥第14d后，小鼠眼眶后靜脈叢取血，EDTA抗凝，測(cè)定其RBC、WBC、HB、PLT等血液指標(biāo)，分析結(jié)果并統(tǒng)計(jì)。
表3 ZBP-I對(duì)免疫抑制小鼠白細(xì)胞水平的影響組別 劑量(g·kg-1) WBC(G·L-1) RBC(T·L-1)Hb(g·L-1) PLT(G·L-1)正常對(duì)照組-- 5.69±2.265.92±1.01 108.02±20.13 545.87±250.89模型對(duì)照組-- 3.06±1.475.85±0.61 109.70±12.42 556.89±206.58CVP 0.40 8.66±4.26**6.02±0.70 109.88±11.48 583.29±130.09ZBP-I 0.20 7.61±3.35**5.61±0.52 106.90±10.89 652.11±169.020.10 4.60±1.01*6.46±0.80 119.50±15.56 617.00±186.38與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01從表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠腹腔注射給予環(huán)磷酰胺后，可見其白細(xì)胞水平明顯下降，小鼠造血系統(tǒng)細(xì)胞增殖分化受到明顯抑制，珠蚌單體多糖ZBP-I在給藥14d后能顯著升高免疫低下小鼠白細(xì)胞水平，并顯示出量效對(duì)應(yīng)關(guān)系。小鼠在體腫瘤的生長(zhǎng)亦造成與注射環(huán)磷酰胺相似的免疫功能低下(白細(xì)胞減少)，珠蚌單體多糖ZBP-I的升白作用即可對(duì)抗這一不利因素，在腫瘤治療中起重要作用，這一作用也是珠蚌單體多糖ZBP-I增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的體現(xiàn)。
(二)珠蚌單體多糖ZBP-I對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響取ICR小鼠40只，雄性，隨機(jī)分為4組，按表中劑量給藥，多糖ZBP-I腹腔注射給予，陽(yáng)性組灌胃給予云芝多糖(CVP)0.4g/Kg，對(duì)照組給予同等體積的生理鹽水，給藥14d后，小鼠每10g體重尾靜脈注射(1/3)稀釋的印度墨汁0.1ml，立即計(jì)時(shí)，并分別于2、10min眼眶取血25ul，加入2ml 0.1％碳酸鈉，于核酸蛋白分析儀600nm處測(cè)定OD值，并稱取肝，脾重量，按公式計(jì)算吞噬指數(shù)(A)。
A＝K1/3×體重/(肝重+脾重)K＝(logOD1-logOD2)/(T2-T1)
表4 ZBP-I對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(x±sd，n＝12)組別 劑量吞噬指數(shù)對(duì)照組--3.784±0.545CVP 0.40 4.413±0.316**ZBP-10.20 4.552±0.574**0.10 4.466±0.447*與對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01從表4實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示給予珠蚌多糖ZBP-I后小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)明顯升高，表明兩劑量都有促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用。
(三)珠蚌單體多糖ZBP-I對(duì)NK細(xì)胞殺瘤活性的影響1.溶液配制MTT(將MTT按1mg·ml-1溶于0.01mol·L-1，pH7.2 PBS，過濾除菌，4℃遮光保存)；溶解液〔DMF(N，N二甲基甲酰胺)按50％體積比加去離子水混合，以20％重量比加入SDS(十二烷基磺酸鈉)〕，60℃使其溶解，然后用80％冰醋酸-20％mol·L-1HCl調(diào)pH至4.7，4℃保存。用前60℃溶開。Tris-NH4Cl緩沖液(0.17mol·L-1Tris與0.16mol·L-1NH4Cl 1∶9混合調(diào)pH7.2)2實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果靶細(xì)胞制備取新傳代24h的BGC-823細(xì)胞，用完全細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度至1×105個(gè)·ml-1。
效應(yīng)細(xì)胞制備將小鼠脫椎處死，浸泡于75％乙醇中5～10分鐘，于超凈工作臺(tái)中取脾臟，在不銹鋼絲網(wǎng)(100目)上捻碎脾組織，細(xì)胞液離心(250g，5min)后棄上清。經(jīng)低滲處理除去紅細(xì)胞，加入含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液1-2ml懸浮脾細(xì)胞。脾淋巴細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)成5×106個(gè)·ml-1濃度。
細(xì)胞毒試驗(yàn)效靶比例為50∶1，將各成分加人96孔平底培養(yǎng)板中，做3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)在多糖劑量組各中加入多糖溶液，終濃度分別為(1、10、100、1000μg·ml-1)，對(duì)照組加入1640培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育4h。
棄上清100μl，加入MTT溶液15μl/孔，繼續(xù)37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育4h后加助溶劑100μl/孔，封口膜封板，于CO2孵箱孵育過夜。
次日用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，測(cè)定波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm結(jié)果計(jì)算NK活性(％)＝{靶細(xì)胞對(duì)照組OD值-(實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組OD值)}/靶細(xì)胞對(duì)照組OD值表5 ZBP-I對(duì)NK細(xì)胞殺瘤活性的影響組別劑量(g·Kg-1) NK活性對(duì)照組 —— 14.7％±4.2％CVP 0.10 26.7％±13.3％*ZBP-1 0.20 25.5％±12.0％*0.10 24.9％±7.3％**與對(duì)照組相比較*P＜0.05，**P＜0.01從表5結(jié)果可看出珠蚌單體多糖ZBP-I高、低劑量的NK細(xì)胞殺瘤活性與對(duì)照組比較有顯著性差異，〔P＜0.05，P＜0.01〕，說明單體多糖作用于小鼠后，對(duì)其NK細(xì)胞的殺瘤活性有增強(qiáng)作用。
權(quán)利要求
1.一種珠蚌單體多糖ZBP-I，其特征是它的組成是葡聚糖，其分子量為134萬(wàn)。
2.一種珠蚌單體多糖ZBP-I的提取分離方法，其步驟如下(1)多糖粉末溶于蒸餾水中，加至纖維素柱頂端，緩緩放下至多糖溶液全部進(jìn)入纖維柱后，分別用不同溶劑洗脫，收集各洗脫液；(2)將各洗脫液用超濾膜超濾，收集被截留部分；(3)用冷凍干燥或真空干燥各洗脫超濾截留部分分別得到多糖I，II，III，其中多糖I為量最大部分；(4)取多糖I溶于水中，用Sephadex G-200柱分離，以蒸餾水洗脫，收集洗脫液；(5)將洗脫液用無(wú)水乙醇沉淀多糖、抽濾、無(wú)水乙醇充分洗滌后，冷凍干燥或真空干燥，得白色針形珠蚌單體多糖ZBP-I(Zhu BangPolysaccharide-I)
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取分離方法，其特征是在步驟1中取粗多糖粉末0.5-2g溶于1∶1的蒸餾水中，硼砂的濃度為0.01-0.05mol，Na2CO3的濃度為0.001-0.05mol、NaOH濃度為0.01-0.05mol。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取分離方法，其特征是在步驟2中用100000分子量以上的超濾膜超濾。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取分離方法，其特征是在步驟4中多糖I的用量80-160mg。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取分離方法，其特征是在步驟5中的無(wú)水乙醇用量是洗脫液量的3-8倍，真空干燥溫度為40℃以下，冷凍干燥溫度為0℃以下。
7.珠蚌單體多糖ZBP-1在制備抗腫瘤藥中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從珠蚌軟件提取的粗多糖中，進(jìn)一步分離純化得到的珠蚌單體多糖ZBP－I，它是一種葡聚糖，其分子量約為134萬(wàn)。它的提取方法是將粗多糖粉末溶于水中，加入纖維素柱內(nèi)，用溶劑洗脫；將洗脫液用超濾膜超濾后真空干燥或冷凍干燥得珠蚌多糖I粉末；再將多糖I溶解于水中，于Sephadex G－200柱分離，洗脫液用乙醇沉淀多糖、抽濾、真空干燥或冷凍干燥得珠蚌單體多糖ZBP－I。該單體多糖ZBP－I具有明顯抑制移植性在體腫瘤的生長(zhǎng)，促進(jìn)白細(xì)胞水平升高，促進(jìn)體內(nèi)單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能，對(duì)天然殺傷性NK細(xì)胞的殺瘤活性有明顯的壇強(qiáng)作用。
文檔編號(hào)A61K31/715GK1544478SQ200310106460
公開日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2003年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月28日
發(fā)明者吳皓, 陳文星, 張莉, 池玉梅, 狄留慶, 陸茵, 蔡皓, 皓 吳 申請(qǐng)人:南京中醫(yī)藥大學(xué)