專利名稱：人工重組的流感病毒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人工制造的分子修飾致弱的H5亞型重組流感病毒，及其該病毒的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)是禽類及一些哺乳動物的呼吸系統(tǒng)疾病的重要病原。AIV在分類學(xué)上屬于病毒界(Vira)----正粘病毒科(Orthomyxoviridae)----流感病毒屬(influenza virus A and B)----禽流感病毒(avian influenza virus)。
根據(jù)表面蛋白抗原性不同，禽流感病毒被分為15個血凝素(HA)和9個神經(jīng)氨酸酶(NA)亞型，H5和H7亞型的高致病力禽流感病毒的暴發(fā)和蔓延往往給一個國家或地區(qū)的養(yǎng)禽業(yè)造成毀滅性打擊，被國際獸疫局列為I類烈性傳染病。使用雞胚生長的全病毒滅活疫苗是防制高致病力禽流感的主要可行措施。理想的疫苗株應(yīng)具備與流行株良好的抗原匹配性，對雞及雞胚無致病力及雞胚高滴度生長性等條件。然而，很難從自然界分離具備上述條件的毒株作為疫苗株。反向基因操作技術(shù)的發(fā)展使人工構(gòu)建滿足上述條件禽流感病毒疫苗株成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人工重組的流感病毒，按照病毒命名原則命名為人工制造的H5亞型重組流感病毒A/哈爾濱/Re-1/2003(H5N1)，它是一種防制高致病力禽流感的疫苗，對雞及雞胚無致病力、具有雞胚高滴度適應(yīng)性、適合H5亞型禽流感防制，本發(fā)明包括該病毒的應(yīng)用。
上述的目的通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)人工重組的H5N1亞型流感病毒，株號簡稱為Re-1，保藏號為CCTCC-V200312，具有H5亞型高致病力禽流感病毒A/鵝/廣東/1/96(H5N1)的血凝素(HA)基因，但HA裂解位點氨基酸序列為-RETR-；具有流感病毒A/Hongkong/486/97(H5N1)的神經(jīng)氨酸酶(NA)基因和A/PR/8/34(H1N1)的PB2，PB1，PA，NP，M和NS共6個內(nèi)部基因。
所述的人工重組的H5N1亞型流感病毒，具典型的低致病力H5亞型禽流感病毒分子特征；對雞及雞胚無致病力，具有高度雞胚適應(yīng)性。
一種上述的人工重組的H5N1亞型流感病毒，在防治動物H5亞型流感的疫苗上的應(yīng)用。
這個技術(shù)方案有以下有益效果1.禽流感病毒表面結(jié)構(gòu)蛋白HA是其最主要的免疫原蛋白。H5亞型禽流感病毒HA1-HA2裂解位點的多個堿性氨基酸是決定其高致病力的必要條件，這些堿性氨基酸的缺失或突變將致使其致病力喪失。流感病毒A/PR/8/34(H1N1)株是雞胚高滴度生長適應(yīng)株，其雞胚生長特性與其6個內(nèi)部基因密切相關(guān)。
大多數(shù)人用流感病毒疫苗株為人流感病毒流行株與PR8病毒的2:6重組病毒。流感病毒的基因組由8個分段的負(fù)鏈RNA片段組成，當(dāng)2個病毒共同感染雞胚或細(xì)胞時，其基因組片段會發(fā)生互換，從而產(chǎn)生一些新的重組病毒(reassortant)。利用全病毒滅活疫苗防制人的流感已有30多年的歷史。由于流感病毒的HA基因極易發(fā)生變化，導(dǎo)致流行株的抗原性與疫苗株的抗原性匹配不良，同時現(xiàn)地新分離的抗原性變異株往往缺乏雞胚生長適應(yīng)性。為制備與流行株抗原性一致又具有良好的雞胚生長特性的流感病毒疫苗株，需要通過遺傳重組方法制備一個含有PR8病毒6個內(nèi)部基因和流行株的HA、NA基因的重組病毒，該重組病毒具有與HA和NA基因供體毒株一致的抗原性，同時還具有PR8病毒的雞胚高滴度生長特性。
流感病毒反向基因操作系統(tǒng)(reverse genetics system，RGS)是構(gòu)建2:6重組病毒疫苗株的直接、簡單方法。流感病毒的RGS是指人工制造流感病毒的技術(shù)系統(tǒng)，其基本原理是將病毒基因組cDNA 8個片段的mRNA和vRNA轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染導(dǎo)入適當(dāng)細(xì)胞系，分別在細(xì)胞內(nèi)DNA依賴的聚合酶口聚合酶口的作用下，合成PB1、PB2、PA和NP的mRNA和病毒基因組所有RNA片段，前者指導(dǎo)合成病毒聚合酶系統(tǒng)和NP蛋白并與病毒基因組RNA結(jié)合形成核蛋白復(fù)合體(RNP)后啟動病毒的復(fù)制，制造出完整的病毒粒子。
利用這一技術(shù)，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程中，用流行株的HA和NA基因cDNA的mRNA-vRNA雙向轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒替換PR8病毒的HA、NA基因cDNA的mRNA-vRNA雙向轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，與PR8的6個內(nèi)部基因cDNA的mRNA-vRNA雙向轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞系，可在48小時之內(nèi)救獲(rescue)含有PR8病毒6個內(nèi)部基因和流行株的HA、NA基因的重組病毒。
利用RGS可構(gòu)建分子修飾致弱的禽流感病毒疫苗株。9-11日齡雞胚尿囊腔繁殖的禽流感病毒尿囊液是生產(chǎn)禽流感滅活苗的原材料。高致病力H5亞型禽流感病毒(AIV)可在24小時之內(nèi)致死雞胚，尿囊液病毒含量極低，不利于疫苗生產(chǎn)。禽流感病毒的致病力與其表面結(jié)構(gòu)蛋白HA基因裂解位點的氨基酸序列密切相關(guān)，低致病力AIV的HA裂解位點只有一個堿性氨基酸—精氨酸(R)，高致病力AIV的HA裂解位點含有連續(xù)多個堿性氨基酸。利用PCR突變法缺失AIV的HA裂解位點與致病力相關(guān)的連續(xù)多個堿性氨基酸編碼序列，并用其替換野生HA基因的cDNA mRNA-vRNA雙向轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒進(jìn)行病毒救獲，可獲得對雞胚無致死能力的低致病力疫苗株。美國學(xué)者構(gòu)建了97香港H5亞型人流感病毒HA基因分子修飾致弱的冷適應(yīng)重組病毒和雞胚高滴度適應(yīng)重組病毒。
本發(fā)明是一株對雞及雞胚無致病力、具有雞胚高滴度適應(yīng)性、適合H5亞型禽流感防制的H5亞型禽流感病毒疫苗株。我們以RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)及PCR突變技術(shù)、流感病毒RGS技術(shù)獲得一株人工制造的分子修飾致弱的H5N1亞型重組禽流感病毒。該病毒具有我國H5亞型禽流感病毒流行株特有的抗原性；與我國流行的H5亞型禽流感流行株均為高致病力不同，本發(fā)明的病毒株被徹底致弱，對雞及雞胚無致死能力；同時，本病毒具有良好的雞胚生長特性，是良好的疫苗生產(chǎn)用毒株。
2.本發(fā)明的人工重組的H5N1亞型流感病毒以我國第一株H5N1亞型禽流感病毒GD/96為HA基因供體制造的重組病毒，保持了我國H5亞型禽流感病毒特有的抗原性。H5N1亞型禽流感病毒自1996年在我國廣東省出現(xiàn)后，近年來在我國大范圍流行，給我國養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展帶來很大危害。我們已分離鑒定了近200株流行株，對雞均呈高致病力；雖然遺傳演化分析發(fā)現(xiàn)不同時期和不同地區(qū)分離株基因組有較大變異，但HA基因卻相對保守，均源自GD/96。因此，本發(fā)明Re-1作為疫苗株，對我國H5亞型禽流感具有良好的抗原針對性。
3.本發(fā)明的人工重組的H5N1亞型流感病毒為一株分子修飾致弱的H5亞型重組流感病毒，對雞及雞胚無致病能力。現(xiàn)行使用的禽流感疫苗均為雞胚繁殖的全病毒滅活疫苗，疫苗質(zhì)量與病毒抗原含量直接相關(guān)。自然分離的H5亞型禽流感病毒接種雞胚后在24小時內(nèi)致死雞胚，使病毒繁殖受限，尿囊液中病毒滴度很低，只有濃縮才可制備出合格的疫苗產(chǎn)品；另外，由于其為高致病力毒株，疫苗生產(chǎn)及廢物處理不當(dāng)導(dǎo)致的散毒有可能導(dǎo)致周邊禽類暴發(fā)禽流感。由于缺失了野毒HA裂解位點與致病力相關(guān)的堿性氨基酸序列，并含有雞胚高滴度適應(yīng)株P(guān)R8的6個內(nèi)部基因，本發(fā)明的人工重組的H5N1亞型流感病毒在48小時之內(nèi)不致死雞胚，病毒生長滴度與野毒相比，可提高10倍左右，以此為疫苗株生產(chǎn)疫苗，可大大降低疫苗生產(chǎn)成本，提高疫苗質(zhì)量，同時對環(huán)境安全。
本發(fā)明的
具體實施例方式實施例1人工重組的H5N1亞型流感病毒即人工制造的H5亞型重組流感病毒A/哈爾濱/Re-1/2003(H5N1)，株號簡稱為Re-1，保藏號為CCTCC-V200312，具有H5亞型高致病力禽流感病毒A/鵝/廣東/1/96(H5N1)的血凝素(HA)基因，但HA裂解位點氨基酸序列為-RETR-；具有流感病毒A/Hongkong/486/97(H5N1)的神經(jīng)氨酸酶(NA)基因和A/PR/8/34(H1N1)的PB2，PB1，PA，NP，M和NS共6個內(nèi)部基因。
上述的人工制造的H5亞型重組流感病毒A/哈爾濱/Re-1/2003(H5N1，具典型的低致病力H5亞型禽流感病毒分子特征；對雞及雞胚無致病力，具有高度雞胚適應(yīng)性。
一種上述的人工制造的H5亞型重組流感病毒A/哈爾濱/Re-1/2003(H5N1，在防治動物H5亞型流感的疫苗上的應(yīng)用。
具體制作過程為1.以我國H5亞型高致病力禽流感病毒早期分離株A/鵝/廣東/1/96(GD/96)株RNA為模板，以兩對引物分別擴(kuò)增HA的HA1和HA2兩個片段，兩對引物序列分別為5′-GCGCGCGGATCCTCTTCGAGCAAAAGCAGGGG/5′-TAGTCCTCGAGTCTCTCTTTGAGG 和5′-GCGAGACTCGAGGACTATTTGGAG/5′-GCGCGCAAGCTTATTAACCCTCACTAAAAGTAGAAACAAGGGTGTT.
HA1片段用BamHI和XhoI，HA2分別用XhoI和HindIII酶切后，共同插入BamHI和HindIII酶切的pUC18質(zhì)粒中。該質(zhì)粒中插入的HA基因與野生基因不同，其HA裂解位點的氨基酸序列已由-RERRRKKR-突變?yōu)?RETR-，后者為典型的H5亞型低致病力禽流感病毒HA分子特征1。
2.以上述重組質(zhì)粒為模板，利用一對引物5′-AGCAAAAGCAGGGG/5′AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAATT PCR擴(kuò)增的HA全長cDNA，并插入含有RNA聚合酶I，聚合酶II啟動子的RNA雙向轉(zhuǎn)錄載體pBD的SapI位點，插入基因與調(diào)控元件相對順序為聚合酶II啟動子序列→聚合酶I終止序列→病毒cDNA全序列(起始密碼→終止密碼)→聚合酶II多聚A信號序列→聚合酶I啟動子序列。
3.RT-PCR擴(kuò)增H5N1亞型流感病毒A/Hongkong/486/97的NA基因全基因cDNA，按上述方法插入pBD中。
4.RT-PCR擴(kuò)增流感病毒高滴度雞胚適應(yīng)株A/PR/8/34株的6個內(nèi)部基因PB2，PB1，PA，NP，M及NS基因全基因cDNA，分別按上述方法插入pBD中。
5.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將上述8個基因的雙向表達(dá)質(zhì)粒同時導(dǎo)入單層的293T細(xì)胞，48-72小時后收獲細(xì)胞及上清，接種9-11日齡雞胚尿囊腔，48-72小時后收獲尿囊液并檢測血凝(HA)活性。HA陽性樣品即為救獲的H5亞型低致病力重組病毒，命名為A/Harbin/Re-1/2003，株號為Re-1。
6.RT-PCR擴(kuò)增救獲病毒基因組8個片段，全基因組序列分析確證其6個內(nèi)部基因源自PR8株，HA基因為HA1-HA2裂解位點4個堿性氨基酸缺失、1個堿性氨基酸突變后的GD/96 HA基因，NA基因源自A/Hongkong/486/97株。
7.對雞胚及雞致病力檢驗以0.1ml 104倍稀釋的病毒雞胚尿囊腔培養(yǎng)液接種9-11日齡雞胚尿囊腔，48小時之內(nèi)不致死接種雞胚。以10倍稀釋的病毒尿囊腔培養(yǎng)液0.2ml/只的劑量靜脈注射10只4周齡SPF雞，10日內(nèi)沒有雞只發(fā)病和死亡。
本產(chǎn)品是一株人工制造的分子修飾致弱的H5N1亞型重組流感病毒A/Harbin/Re-1/2003，(Orthomyxoviridae---influenza virus A and B---H5N1subtype influenza virus)，株號為Re-1，保藏號為CCTCC-V200312。它是利用反向基因操作技術(shù)人工制造的含有特殊性狀的重組流感病毒，即以克隆并經(jīng)過分子修飾的禽流感病毒和人流感病毒基因組cDNA為病毒基因組負(fù)鏈RNA和信息mRNA的復(fù)制模板，通過體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)人工制造的重組禽流感病毒。該病毒是致弱的、基因組雜交重組的H5N1亞型禽流感病毒，其對雞及雞胚無致死能力，雞胚生長滴度較高，具有與我國流行的H5亞型禽流感病毒相同的抗原性，是理想的H5亞型禽流感疫苗株。
權(quán)利要求
1.一種人工重組的H5N1亞型流感病毒，其特征是株號簡稱為Re-1，保藏號為CCTCC-V200312，具有H5亞型高致病力禽流感病毒A/鵝/廣東/1/96(H5N1)的血凝素(HA)基因，但HA裂解位點氨基酸序列為-RETR-；具有流感病毒A/Hongkong/486/97(H5N1)的神經(jīng)氨酸酶(NA)基因和A/PR/8/34(H1N1)的PB2，PB1，PA，NP，M和NS共6個內(nèi)部基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人工重組的H5N1亞型流感病毒，其特征是具典型的低致病力H5亞型禽流感病毒分子特征；對雞及雞胚無致病力，具有高度雞胚適應(yīng)性。
3.一種權(quán)利要求1或2所述的人工重組的H5N1亞型流感病毒，在防治動物H5亞型流感的疫苗上的應(yīng)用。
全文摘要
人工重組的流感病毒及其應(yīng)用。本發(fā)明涉及一株人工制造的分子修飾致弱的H5亞型重組流感病毒。H5和H7亞型的高致病力禽流感病毒的暴發(fā)和蔓延往往給一個國家或地區(qū)的養(yǎng)禽業(yè)造成毀滅性打擊，被國際獸疫局列為I類烈性傳染病，然而，很難從自然界分離具備上述條件的毒株作為疫苗株。本產(chǎn)品保藏號為CCTCC－V200312，具有H5亞型高致病力禽流感病毒A/鵝/廣東/1/96(H5N1)的血凝素(HA)基因，但HA裂解位點氨基酸序列為－RETR－；具有流感病毒A/Hongkong/486/97(H5N1)的神經(jīng)氨酸酶(NA)基因和A/PR/8/34(H1N1)的PB2，PB1，PA，NP，M和NS共6個內(nèi)部基因。本品用作防止禽流感疫苗。
文檔編號A61K39/145GK1624116SQ20031010773
公開日2005年6月8日 申請日期2003年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月2日
發(fā)明者陳化蘭, 于康震, 田國彬, 李雁冰 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所