專利名稱：一種治療白癜風(fēng)的黑素細胞懸液制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物制品領(lǐng)域，涉及一種治療白癜風(fēng)的懸液制劑，具體涉及一種治療白癜風(fēng)的黑素細胞懸液制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
白癜風(fēng)是一種原發(fā)性的局限或泛發(fā)的色素脫失性皮膚疾病，正常人群發(fā)病率為1-2％。研究認為其發(fā)病機制是多基因遺傳的、在多種內(nèi)外因子的激發(fā)下表現(xiàn)為免疫功能紊亂，導(dǎo)致黑素細胞的破壞，終致色素脫失，病理表現(xiàn)為皮損處黑素細胞消失。臨床上表現(xiàn)的色素脫失斑給病人生理和病理上帶來極大負擔(dān)。目前尚無有確切療效的治療方法，部分頑固型患者對于常規(guī)口服或外用藥治療反應(yīng)不佳。對于頑固型白癜風(fēng)，國內(nèi)主要采用自體表皮移植術(shù)，但存在供皮及取皮區(qū)留下疤痕讓患者難以接受等問題。國外采用自體黑素細胞培養(yǎng)移植治療，但患者可能存在的黑素細胞功能異常則會影響自體黑素細胞培養(yǎng)后移植的療效。自Eisinger和Markjo首次使用化學(xué)促分裂劑12-o-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA，12-o-Tetradecanoyl phorbol-13-Acetate)，霍亂毒素(CT，choleratoxin)體外培養(yǎng)黑素細胞獲得成功以來，這種培養(yǎng)方法一直被廣泛應(yīng)用。但TPA在促黑素細胞分裂的同時使黑素細胞表達黑素瘤相關(guān)抗原并刺激黑素細胞表達HLA-DR抗原，從而使培養(yǎng)黑素細胞的臨床應(yīng)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種治療頑固性白癜風(fēng)的黑素細胞懸液制劑及其制備方法。
本發(fā)明采用正常人包皮環(huán)切術(shù)后廢棄的組織，用鄭氏法分離表真皮后由表皮基底層處獲取黑素細胞，然后應(yīng)用體外細胞培養(yǎng)技術(shù)，由培養(yǎng)液中加入生理分泌的生物因子促黑素細胞分裂，進行細胞培養(yǎng)和擴增及鑒定，調(diào)節(jié)細胞密度1-10×105/mL，制成黑素細胞懸液制劑。
本發(fā)明改進了黑素細胞培養(yǎng)促分裂因子的成分，以生理分泌的bFGF、ET-1及α-MSH等生物因子(可市購)取代化學(xué)促分裂劑TPA、CT，建立安全高效的純化黑素細胞培養(yǎng)方法。黑素細胞在已知的生物反應(yīng)器中和微載體系統(tǒng)中經(jīng)貼壁，懸浮，大量培養(yǎng)和擴增，用分子生物學(xué)、免疫組化和超微結(jié)構(gòu)測定等鑒定培養(yǎng)后黑素細胞的形態(tài)和功能狀態(tài)，并經(jīng)冷凍，復(fù)蘇后保持一定的活率和維持其生物學(xué)特性，制成黑素細胞懸液制劑，用高壓高速液體流透皮注射技術(shù)簡化異體黑素細胞移植的操作方法后供臨床試驗應(yīng)用。
本發(fā)明的制備方法包括下述步驟，1、黑素細胞的培養(yǎng)及凍存和復(fù)蘇，2、在生物反應(yīng)器中和微載體系統(tǒng)中大量培養(yǎng)和擴增，3、黑素細胞的形態(tài)和功能及遺傳性狀穩(wěn)定性生物學(xué)鑒定，4、制備黑素細胞懸液制劑。
本發(fā)明利用正常人來源的黑素細胞，經(jīng)安全、高效的體外純化培養(yǎng)后進行同種異體移植治療難制性白癜風(fēng)。經(jīng)臨床試用，證實黑素細胞同種異體移植治療白癜風(fēng)可治療頑固性白癜風(fēng)，且效果佳。
本發(fā)明用于頑固性白癜風(fēng)的治療具有以下優(yōu)點1)避免了表皮移植方法中所需大量的取皮區(qū)，解決了供皮問題，能減少移植治療的痛苦，2)避免了因白癜風(fēng)患者自身黑素細胞的遺傳缺陷造成表皮移植和自體細胞移植的失敗，為白癜風(fēng)的治療提供新的手段，3)為無細胞培養(yǎng)條件的醫(yī)院提供方便，擴展黑素細胞移植治療白癜風(fēng)的工作范圍。


圖1是體外培養(yǎng)黑素細胞生物學(xué)鑒定結(jié)果，多巴染色陽性。
圖2是體外培養(yǎng)黑素細胞脫黑素染色結(jié)果。
圖3是體外培養(yǎng)黑素細胞的透視電鏡超微結(jié)構(gòu)。
具體實施例方式
實施例1 黑素細胞的培養(yǎng)及凍存和復(fù)蘇取包皮環(huán)切術(shù)標本，去除皮下組織后分割成2×2cm的小片，0.25％胰蛋白酶4℃消化過夜。將消化后的表皮置于MCDB153培養(yǎng)液中，吹打成單細胞懸液，離心后計數(shù)。按4～6×106/ml的密度接種于φ＝35mm或60mm培養(yǎng)皿中，2～3周后傳代2-5代，常規(guī)方法凍存，備用。
所述MCDB153培養(yǎng)液中，其成分為堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)0.1～1.0ng/ml，內(nèi)皮素(ET-1)2～15nmol/L，黑素細胞刺激激素(MSH)2～15nmol/L，氫化考的松0.5mg/ml，青霉素100U/ml，鏈霉素0.1mg/ml，兩性霉素0.5mg/ml。
實施例2 黑素細胞的形態(tài)和功能及遺傳性狀穩(wěn)定性生物學(xué)鑒定采用特殊染色即多巴染色和脫黑素染色、免疫組化方法以及透射電鏡技術(shù)對體外培養(yǎng)的黑素細胞的生物學(xué)特性進行鑒定。結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的黑素細胞的結(jié)構(gòu)和功能保持正常。
1.多巴染色證實黑素細胞的多巴酶功能正常，脫黑素染色從另一側(cè)面證實細胞內(nèi)的黑素是真正的黑素。
2.已知常規(guī)方法進行遺傳性狀鑒定，結(jié)果表明，HMSA-5、HMSA-1、HMB45單克隆抗體證實培養(yǎng)的黑素細胞無間變和惡變，遺傳性狀穩(wěn)定。
3.形態(tài)和功能電鏡結(jié)果顯示，黑素細胞內(nèi)與合成功能有關(guān)的細胞器非常豐富，如核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和高爾基復(fù)合體等，含有不同階段的黑素小體，黑素小體的分布、輸送均正常。
實施例3 同種異體黑素細胞移植實驗黑素細胞表面HLA-DR抗原的表達由于在排斥免疫反應(yīng)中，HLA-II類抗原，特別是HLA-DR抗原是強有力的免疫原，本發(fā)明對正常人黑素細胞表面HLA-DR抗原的表達進行免疫組化測定，結(jié)果證實，正常人黑素細胞表面不表達HLA-DR抗原，為同種異體移植的可行性提供了理論依據(jù)。
黑素細胞同種異體移植體外模型實驗黑素細胞與同種異體淋巴細胞混合培養(yǎng)，作為同種異體黑素細胞移植的體外模型，觀察體外實驗的排斥反應(yīng)。采用3H-dTR摻入同位素液態(tài)閃爍計數(shù)法測定淋巴細胞的轉(zhuǎn)化增殖率，并用透射電鏡觀察混合培養(yǎng)后黑素細胞的超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，1.黑素細胞對同種異體淋巴細胞的轉(zhuǎn)化增殖率與ConA刺激淋巴細胞轉(zhuǎn)化增殖的陽性對照比較，黑素細胞的促淋巴細胞轉(zhuǎn)化增殖的特異性抗原作用較弱。
2.黑素細胞對不同病期白癜風(fēng)患者淋巴細胞的影響，顯示黑素細胞對活動期白癜風(fēng)患者淋巴細胞的刺激作用相對較強，而穩(wěn)定期患者和正常人對照組結(jié)果差異無顯著性。
3.電鏡結(jié)果顯示同種異體的淋巴細胞對黑素細胞無明顯損傷，黑素細胞經(jīng)混合培養(yǎng)后，細胞的形態(tài)完整，黑素合成功能正常，胞體和樹突無損傷。細胞內(nèi)細胞器豐富，胞漿內(nèi)可見大量的不同階段黑素小體。
4.正常人黑素細胞的促淋巴細胞轉(zhuǎn)化增殖的特異性抗原作用較弱。同種異體淋巴細胞對黑素細胞超微結(jié)構(gòu)無破壞作用。
黑素細胞同種異體移植動物實驗將取自黑色的C57BL/6的無毛紅皮3天小鼠的黑素細胞經(jīng)體外培養(yǎng)后，移植給白色的昆明小鼠和白色的ICR小鼠。觀察4個月，在注入MC部位無紅腫等炎癥反應(yīng)。表明，體外培養(yǎng)的純化的MC抗原性弱，不引起宿主的排斥反應(yīng)。
實施例4 黑素細胞同種異體移植的臨床試驗制備細胞懸液0.25％胰蛋白酶將培養(yǎng)的黑素細胞37℃消化10分鐘，加入10％小牛血清MCDB153培養(yǎng)液中止反應(yīng)。將細胞懸液集于離心管，1500轉(zhuǎn)/分離心5～10分鐘。用緩沖液D-Hanks液洗滌3～4次，調(diào)節(jié)細胞密度2-3×105/mL，制備細胞懸液以備用。
臨床試用，選擇穩(wěn)定期患者23例64處皮片進行黑素細胞的同種異體移植，患者皮損處吸皰準備用負壓為80.0kPa的真空泵在患者皮損處吸取直徑0.8cm~1.0cm的水皰，使表、真皮分離。
細胞移植用針筒抽去皰液，注入上述細胞懸液0.2～0.3mL，包扎固定。結(jié)果顯示，患者在培養(yǎng)MC移植后2周隨訪，無紅腫等炎癥反應(yīng)，大部分患者皮損處皰液吸收，皰壁脫落，色素出現(xiàn)；隨訪至1月～4月，色素持續(xù)存在。證實黑素細胞同種異體移植治療白癜風(fēng)可治療頑固性白癜風(fēng)，且效果佳。
權(quán)利要求
1.一種治療白癜風(fēng)的黑素細胞懸液制劑，其特征是以黑素細胞為活性成分，緩沖液D-Hanks為溶劑，制成黑素細胞懸液制劑，所述黑素細胞密度為1-10×105/mL。
2.按權(quán)利要求1所述的黑素細胞懸液制劑，其特征是所述黑素細胞密度為2-3×105/mL。
3.按權(quán)利要求1所述的黑素細胞懸液制劑，其特征是所述黑素細胞是采用正常人術(shù)后廢棄組織獲取后，應(yīng)用體外細胞培養(yǎng)技術(shù)，由培養(yǎng)液中加入生理分泌的生物因子取代化學(xué)促分裂劑TPA、CT，促黑素細胞分裂，進行細胞培養(yǎng)和擴增及鑒定所得。
4.按權(quán)利要求3所述的黑素細胞懸液制劑，其特征是所述黑素細胞通過0.25％胰蛋白酶37℃消化10分鐘，加入10％小牛血清MCDB153培養(yǎng)液中止反應(yīng)，1500轉(zhuǎn)/分離心5～10分鐘，用D-Hanks液洗滌后，制備成黑素細胞懸液。
5.按權(quán)利要求3所述的黑素細胞懸液制劑的制備方法，其特征是所述生理分泌的生物因子是堿性成纖維細胞生長因子bFGF、內(nèi)皮素ET-1及黑素細胞刺激激素α-MSH生物因子。
6.按權(quán)利要求5所述的方法，其特征是所述成分，bFGF濃度是0.1～1.0ng/ml，ET-1濃度是2～15nmol/L，MSH濃度是2～15nmol/L。
7.一種治療白癜風(fēng)的黑素細胞懸液制劑的制備方法，包括下述步驟，1)黑素細胞的培養(yǎng)及凍存和復(fù)蘇，2)在生物反應(yīng)器中和微載體系統(tǒng)中大量培養(yǎng)和擴增，3)黑素細胞的形態(tài)和功能及遺傳性狀穩(wěn)定性生物學(xué)鑒定，4)制備黑素細胞懸液制劑。
全文摘要
本發(fā)明屬生物制品領(lǐng)域，涉及一種治療白癜風(fēng)的懸液制劑，具體涉及一種治療白癜風(fēng)的黑素細胞懸液制劑及其制備方法。本發(fā)明利用正常人來源的黑素細胞，以生理分泌的生物因子取代化學(xué)促分裂劑TPA、CT促黑素細胞分裂，制成黑素細胞懸液制劑。經(jīng)臨床試用，證實本發(fā)明黑素細胞同種異體移植可治療頑固性白癜風(fēng)，且效果佳。本發(fā)明解決了表皮移植供皮問題，能減少移植治療的痛苦，避免了因白癜風(fēng)患者自身遺傳缺陷造成表皮移植和自體細胞移植的失敗，為白癜風(fēng)的治療提供新的手段，為基層醫(yī)院提供方便，擴展黑素細胞移植治療白癜風(fēng)的工作范圍。
文檔編號A61P17/00GK1544091SQ20031010890
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月27日
發(fā)明者鄭志忠, 項蕾紅, 祝綠川, 何怡, 黃瓊 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院