專利名稱：血糖調(diào)節(jié)相關(guān)的新基因、其蛋白產(chǎn)物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與血糖調(diào)節(jié)相關(guān)的新基因，命名為pank4(又稱fang-1)，本發(fā)明還涉及所述基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，以及所述基因和蛋白質(zhì)在血糖調(diào)節(jié)及糖尿病治療中的用途。本發(fā)明的基因初步鑒別為一種新的泛酸激酶基因。
背景技術(shù)：
眾所周知，II型糖尿病是一種多基因遺傳病。目前認為參與胰島素信號傳導(dǎo)途徑、葡萄糖轉(zhuǎn)運途徑、糖原合成途徑、脂肪酸的吸收和合成、脂細胞分化途徑的有關(guān)蛋白質(zhì)分子都可能與糖尿病的發(fā)生相關(guān)。研究糖尿病發(fā)病機理，闡明分子機制、鑒定血糖調(diào)節(jié)基因及其功能的研究對糖尿病的預(yù)防和治療均有十分重要的意義。其中，胰島素信號傳導(dǎo)途徑是目前研究較多的一個領(lǐng)域，該途徑十分復(fù)雜，包括胰島素受體、胰島素受體底物等，并和Akt信號傳導(dǎo)途徑、MAPK信號傳導(dǎo)途徑、CAP/Cb1信號傳導(dǎo)途徑等聯(lián)系在一起。胰島素受體屬于受體酪氨酸激酶，包括IGF-I和IRR。目前至少鑒定了9個胰島素受體激酶底物，其中包括4個胰島素受體底物IRS1、IRS2、IRS3和IRS4。胰島素受體底物(IRS)具有高度同源性，但是作用各異，相互補充。IRS-1基因敲除小鼠表現(xiàn)為出生前和出生后生長遲緩，胰島素耐受，葡萄糖耐受受損等癥狀。IRS-2基因敲除小鼠表現(xiàn)為在肝臟等組織胰島素耐受以及包括腦組織等多個區(qū)域生長缺陷，最終發(fā)展成II型糖尿病。
鑒定糖尿病易感基因是一項艱巨的工作，目前進展緩慢，隨著人類基因組測序工作的結(jié)束，很多科學(xué)家正應(yīng)用全基因組掃描技術(shù)尋找易感基因。但由于糖尿病是一種多基因疾病，它是基因和基因相互作用以及基因和環(huán)境相互作用才誘導(dǎo)糖尿病的發(fā)生，某一個基因單獨與這種疾病的關(guān)聯(lián)也許不強，所以給定位克隆工作帶來很多麻煩。
目前，很多科學(xué)家應(yīng)用差異顯示技術(shù)分離了許多差異表達的基因和疾病基因。差異顯示技術(shù)以RT-PCR為基礎(chǔ)。以寡聚(dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄細胞中所有mRNA，通過不同引物對對所得到的cDNA進行PCR擴增，其中含有一種同位素標(biāo)記dNTP，然后PCR產(chǎn)物在聚丙稀酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影后從凝膠上切下回收差異片段，在確定陽性差異片段后，克隆全長基因。差異顯示的優(yōu)點是簡單快速，該方法不需要特殊的儀器，操作起來比較簡單，能夠在較短時間內(nèi)得到差異顯示圖譜；重復(fù)性高，約90％-95％差異帶能被重復(fù)；敏感性高，只需2ug總RNA用于逆轉(zhuǎn)錄，用4種寡聚(dT)引物和20個AP引物配對PCR反應(yīng)，從統(tǒng)計學(xué)來講可覆蓋98％以上的mRNA。差異顯示已大量用于醫(yī)學(xué)方面的研究。Liang等首先將該技術(shù)用于腫瘤的研究，并分離了差異表達基因(Science 257967-971，1992)，而Nishio Y等人將該技術(shù)應(yīng)用到糖尿病研究，他們將牛主動脈平滑肌細胞在體外不同血糖濃度培養(yǎng)后，差異顯示分離到3個差異表達的cDNA片段(FASEB letter，8103-106，1994)。但是，目前這些研究大多應(yīng)用體外培養(yǎng)細胞作為研究對象，而細胞在體外培養(yǎng)條件下并不能很好地代表他們在機體內(nèi)的正常生理狀態(tài)。本發(fā)明人從整體水平而不是在培養(yǎng)的細胞水平開展研究，進行血糖調(diào)節(jié)相關(guān)基因的分離工作，以作為糖尿病治療的候選基因。本發(fā)明人采用SD大鼠，經(jīng)頸靜脈右心房插管術(shù)，葡萄糖刺激，差異顯示SD大鼠葡萄糖刺激組和非刺激組差異表達的基因。首先得到差異表達的EST，以這些EST為探針篩選大鼠骨骼肌cDNA得到1個全長cDNA，以此為基礎(chǔ)進行進一步的研究，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的新基因是一種新的泛酸激酶基因。
泛酸激酶是CoA合成過程第一步作用的酶，它將泛酸磷酸化，繼而迅速將它轉(zhuǎn)化成CoA，CoA是一個很重要的酰基載體，它主要參與三羧酸循環(huán)，脂肪酸代謝和各類中間代謝反應(yīng)，CoA中的一部分4’-PPA在許多酶系統(tǒng)中是一個重要的前體基團，包括酰基載體蛋白，細菌和真核生物的脂肪酸合成酶，及檸檬酸裂解酶。泛酸激酶在哺乳動物體內(nèi)被認為是CoA合成的限速酶。
泛酸激酶早期研究表明，在分離的灌注心臟中，胰島素被認為是CoA合成的強烈抑制劑，在糖尿病樣的心臟內(nèi)降低胰島素濃度或去除抑制劑，將會使CoA的合成增強。同樣在禁食或糖尿病的動物體內(nèi)降低胰島素的水平也會使得CoA的合成提高。在離體的心臟內(nèi)，Pank的活性將會隨著葡萄糖、丙酮酸、脂肪酸及胰島素升高而降低。而在肝臟內(nèi)泛酸激酶的活性將會隨著糖原、饑餓、高脂、甲抗和糖尿病時升高。
心肌內(nèi)，CoA的合成受到途徑中的第一步的控制，也就是從泛酸到4’-磷酸泛酸。在離體的心臟內(nèi)諸如丙酮酸、β-羥丁酸、軟脂酸、低量的葡萄糖都會抑制泛酸激酶的反應(yīng)。胰島素需要在葡萄糖存在的情況下抑制泛酸激酶的活性。如果沒有葡萄糖或者軟脂酸代替葡萄糖，胰島素將不會起作用，這表明胰島素通過變換碳循環(huán)來行使其功能。由于泛酸激酶的催化反應(yīng)效率受到外源底物的影響，那么在上述底物被利用時，諸如三羧酸循環(huán)或糖酵解等中間產(chǎn)物將會增多，因此泛酸激酶是促進糖代謝的。
總之，上述資料顯示，泛酸激酶可能是血糖控制的很關(guān)鍵的因子。然而，到目前為止還不知道泛酸激酶基因在糖代謝和胰島素信號通路中的靶位點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種分離的核酸分子，其包含編碼一種參與胰島素信號傳導(dǎo)途徑的蛋白質(zhì)的多核苷酸。本發(fā)明的核酸分子是一種新的泛酸激酶基因，其被命名為pank4基因，其來自大鼠，核苷酸序列如SEQID NO1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。本發(fā)明還涉及具有與SEQ ID NO1所述核苷酸序列至少有90％、優(yōu)選地至少95％、96％、97％、98％或99％相同性的核苷酸序列的多核苷酸，或者在嚴格條件下與SEQ ID NO1所述核苷酸序列雜交的多核苷酸。所述的嚴格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如參見Sambrook等人所著《分子克隆實驗手冊》。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的分離的核酸分子的重組載體，包含該重組載體的宿主細胞，以及制造這樣的載體和宿主細胞和使用它們經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生pank4蛋白的方法。本發(fā)明也涉及特異于pank4蛋白的抗體。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知各種合適的表達載體及宿主細胞，表達載體的非限制性例子例如本發(fā)明實施例中使用的真核表達載體pCDNA3.1，原核表達載體pGEX-4T-3(即谷胱甘肽(Gst)載體)等。宿主細胞可以是常規(guī)使用的原核宿主細胞、酵母、哺乳動物細胞、昆蟲細胞等，非限制性例子例如本發(fā)明實施例中使用的大腸桿菌菌株DH5a，和大腸桿菌菌株BL21(DE3)，L-6TG SD大鼠正常肌母細胞株等。
本發(fā)明的pank4基因在血糖刺激后可以高表達，并上調(diào)胰島素受體底物IRS-1的表達，因此本發(fā)明的pank4基因及其蛋白可以用作治療糖尿病的潛在靶點，找到有效降低血糖的基因藥物。


圖1為含有本發(fā)明的pank4基因的表達載體pcDNA3.1-pank4的圖譜。
圖2為胰島素受體底物1(IRS-1)的RT-PCR分析的結(jié)果。其中1和2分別代表GADPH和IRS1的RT-PCR結(jié)果，泳道A和B分別代表來自對照細胞和用pcDNA3.1-pank4轉(zhuǎn)染的細胞的樣品。
圖3示出IRS-1的Northern印跡分析，其中泳道1和2分別代表來自對照細胞和用pcDNA3.1-pank4轉(zhuǎn)染的細胞的樣品。
圖4A-4L為pank4組織分布的免疫組化檢測結(jié)果。
圖5為Pank4的細胞定位結(jié)果。
圖6示出Pank4和Pkm2的體外和體內(nèi)相互作用。
圖7示出Pank4的兩個結(jié)構(gòu)域與Pkm2的體內(nèi)相互作用。
圖8示出Pank4和Pkm2的相互作用的激光共聚焦實驗結(jié)果。
圖9示出Pank4可以上調(diào)Pkm2活性。
具體實施例方式
本發(fā)明的pank4基因是通過將mRNA差異顯示技術(shù)應(yīng)用到動物整體水平而獲得，受高血糖刺激它的表達升高。NCBI分析，Pank4與人的泛酸激酶的同源性很高。同時，Pank4蛋白內(nèi)含有兩個保守的結(jié)構(gòu)域，分別是KOG2201(33aa-378aa)和KOG4584(448aa-768aa)。
免疫組化的實驗，結(jié)果表明本發(fā)明的，Pank4廣泛分布在各組織中(圖4)，同時，可以看出，Pank4多分布于一些需要高能或合成旺盛的細胞群中，比如，腎臟、甲狀腺的分泌管(圖4D、I)，一些正在處于收縮或舒張的骨骼肌和心肌，以及血管平滑肌的某些細胞群中(圖4B、G、K)，還有胰腺的胰島細胞內(nèi)(圖4C)。這些結(jié)果表明Pank4與能量產(chǎn)生有關(guān)。
通過酵母雙雜交實驗，發(fā)現(xiàn)了一個與Pank4相關(guān)的基因，丙酮酸激酶基因(Pkm2)，其一個新的相互作用蛋白，也是在糖酵解中的一個關(guān)鍵酶。在后文所述的實施例中，進一步通過pull-down(Fig6A)、免疫共沉淀實驗(Fig6BC)及共定位實驗(Fig8A-F)驗證了二者的相互作用。從Pank4對Pkm2的活性調(diào)節(jié)和對IRS-1的影響，Pank4可以用于制備調(diào)節(jié)血糖濃度的藥物。
以下將通過實施例進一步描述本發(fā)明。
實施例1 pank4基因的克隆1、制備大鼠血糖自動調(diào)節(jié)模型雄性SD大鼠10只(購自中國中醫(yī)研究院實驗動物中心，鼠齡3個月，體重200～250克，自由飲水?dāng)z食)。分為兩組，即實驗組和對照組每組分別為5只。各組大鼠均進行頸外靜脈一右心房導(dǎo)管插管術(shù)，術(shù)后給足飼料和水，備用。頸外靜脈一右心房導(dǎo)管插管術(shù)方法簡述如下乙醚麻醉動物，在頸部切開皮膚，剝離，顯露頸外靜脈，由引針將硅膠管引入頸外靜脈腔，退出引針，將硅膠管插入右心房，固定導(dǎo)管，由皮下從背頸部引出硅膠管的另一端，封住導(dǎo)管，縫合切口，動物醒后單獨喂養(yǎng)。動物在完全清醒狀態(tài)下進行實驗。實驗組大鼠注射含400mmol/L葡萄糖的生理鹽水0.4ml，10分鐘后再注射0.8ml含400mmol/L葡萄糖的生理鹽水。對照組分別注射同量的不含葡萄糖的生理鹽水。30分鐘后，動物斷頸處死，在無菌條件下，每只大鼠取雙側(cè)股四頭肌共約1g，立即凍存于液氮中。
2.mRNA差異顯示分析依照TRIZOL Reagent試劑盒(GiBcoBRL，USA)，分別提取兩組動物肌肉組織總RNA。以1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性。
利用上述獲得的總RNA進行cDNA第一條鏈的合成，合成按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作(Superscript TM II RT，BRL)。1μg DNase I處理的總RNA與2μl 10μM錨定引物(1# 5’-CGC GGA TCC TTTTTT TTT TTA-3’；2# 5’-CGC GGA TCC TTT TTT TTT TTG-3’；3#5’-CGC GGA TCC TTT TTT TTT TTC-3’)混合。反應(yīng)液70℃溫育10分鐘，然后冰上冷卻。加2μl 10×第一鏈合成反應(yīng)液，2μl 25mMMgCl2，1μl 10mM dNTP，2μl 0.1M DTT。42℃溫育5分。加1μlSuperscript II，反應(yīng)液于42℃溫育50分鐘，然后70℃15分鐘，冰上冷卻。最后加1μl RNaseH 37℃20分鐘降解RNA。-20℃儲存。
隨后進行差異顯示PCR，所用隨機引物共10條。隨機引物參照CloneTech mRNA差異顯示試劑盒，自行設(shè)計，5’加上EcoR I酶切位點。其中，引物序列為1# 5′-CGG AAT TCT CCA GTT CAG-3′；2#5′-CGG AAT TCC AAG CGA GGT-3′；3# 5′-CGG AAT TCC TTG TAGCCA-3′；4# 5′-CGG AAT TCC TTT CTA GCC-3′；5# 5′-CGG AATTCA CCT TGG ACA-3′；6# 5′CGG AAT TCA TGC TGG GGA 3′；7#5′CGG AAT TCT CGG TCA TAG 3′；8# 5′CGG AAT TCA TGC TGGTAG 3′；9# 5′CGG AAT TCG ATC TGA CTG 3′；10# 5′CGG AATTCA TGC TGT ATG 3′。PCR反應(yīng)體系中加入20ng上述cDNA和2.5μci[α-32P]Dctp，0.5U Taq plus II聚合酶(Sangon)，1μl 10×PCR反應(yīng)液，0.5μl 25μM dNTP，1μl 2μM隨機引物和錨定引物，4.35μl水使總體積達到10μl。反應(yīng)條件為一個循環(huán)(94℃5分鐘，40℃5分鐘，72℃5分鐘)，兩個循環(huán)(94℃30秒，40℃40秒，72℃5分鐘)然后30個循環(huán)(94℃30秒，52℃40秒，72℃2分鐘)。短暫離心，收集反應(yīng)液。
上述PCR產(chǎn)物在6％變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳。對X光曝光，獲得mRNA差異顯示圖譜。
3、差異PCR產(chǎn)物的回收、再擴增、純化嚴格確定X-光片與凝膠的相對位置。依據(jù)mRNA差異顯示譜，以清潔手術(shù)刀切取所需凝膠條帶。在0.5ml離心管中用100μlddH2O浸泡凝膠，95℃加熱20分鐘，離心收集。轉(zhuǎn)移上清至另一個離心管，加10μl3M NaAc(pH5.2)、5μl糖原(10mg/ml)，混勻。加450μl無水乙醇，混勻。置-70℃冷凍60分鐘，之后12000rpm離心15分鐘。棄上清，用4℃75％乙醇洗滌沉淀，風(fēng)干。用10μlddH2O溶解。將如此獲得的PCR產(chǎn)物，保存于-20℃。
接著進行差異PCR產(chǎn)物的再擴增。在0.5ml Eppendorf管中建立如下反應(yīng)體系回收的PCR產(chǎn)物(10ng/μl)1μl，引物I(序列1# 5’-CGCGGA TCC TTT TTT TTT TTA-3’，或2# 5’-CGC GGA TCC TTT TTTTTT TTG-3’，或3# 5’-CGC GGA TCC TTT TTT TTTTTC-3’)(50pmol/μl)1μl，引物II(序列1# 5′-CGG AAT TCT CCAGTT CAG-3′或2# 5′-CGG AAT TCC AAG CGA GGT-3′，或3#5′-CGG AAT TCC TTG TAG CCA-3′，或4# 5′-CGG AAT TCC TTTCTA GCC-3′，或5# 5′-CGG AAT TCA CCT TGG ACA-3′，或6# 5′CGG AAT TCA TGC TGG GGA 3′，或7# 5′CGG AAT TCT CGG TCATAG 3′，或8# 5′CGG AAT TCA TGC TGG TAG 3′，或9# 5′CGGAAT TCG ATC TGA CTG 3′，或10# 5′CGG AAT TCA TGC TGT ATG3′)(50pmol/μl)1μl，10×PCR反應(yīng)緩沖液(15mMgCl2)5μl，4×dNTP(各5mM)2μl，Taq聚合酶(1u/μl)2μl，補加去離子水至終體積50μl。94℃變性2分鐘后，進行如下循環(huán)程序30次94℃變性40秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒。30個循環(huán)結(jié)束后，72℃繼續(xù)延伸10分鐘，然后將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠分離。
4、差異cDNA的狹縫雜交分析對上述PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳定量。每種產(chǎn)物個取400ng經(jīng)堿變性處理，用狹縫點膜器(BioRad)點樣于Hybond-N尼龍膜上，以β-肌動蛋白分別作為對照。2XSSC漂洗尼龍膜，涼干。用紫外交聯(lián)方法將PCR產(chǎn)物固定于膜上。
采用上述混合單錨定堿基引物，制備a-32P標(biāo)記的單鏈cDNA探針，用于狹縫雜交和放射自顯影。首先，將上述尼龍膜置于15ml預(yù)雜交液(5×Denhart′s溶液，6×SSC，0.5％SDS)，將鮭精DNA于95℃變性5分鐘后加入68℃預(yù)雜交液至終濃度為100μg/ml。68℃預(yù)雜交2小時。然后加入上述混合cDNA探針，68℃雜交20小時。洗膜條件如下500ml 2×SSC、0.1％SDS室溫短暫漂洗尼龍膜5分鐘，重復(fù)一次；250ml1×SSC、0.1％SDS室溫洗膜30分鐘，重復(fù)一次；250ml 1×SSC、0.1％SDS于65℃洗膜15分鐘，重復(fù)一次；用濾紙吸干尼龍膜，用富士X-光片壓片，于-70℃曝光3-4天。應(yīng)用Pharmacia GelScan XL(2.1版)凝膠掃描軟件包在Pharmacia LKB Ultroscan XL掃描儀上對每一個雜交斑點掃描，以掃描峰的積分值衡量基因序列相對表達量。
6、差異cDNA的克隆和測序以及cDNA文庫篩選根據(jù)狹縫雜交結(jié)果，選擇有明顯差異的PCR產(chǎn)物進行克隆。首先純化PCR產(chǎn)物，按照Promega公司W(wǎng)izardTMPCR DNA PurificationSystem試劑盒說明書操作，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定純化的效果。然后，用玻璃奶回收法回收純化后的DNA片段。將所有差異表達片段全部克隆到Promega公司的pGEM-T克隆載體并測序獲得EST序列。
將3個上調(diào)表達片段和3個下調(diào)表達片段均作為探針雜交篩選文庫，篩庫是根據(jù)已知探針序列篩選cDNA克隆的常用方法。
用大鼠正常骨骼肌文庫(Rat Skeletal Muscle 5’-STRETCH PLUScDNA Library，RL3003b，ClonTech)進行篩選cDNA全長的工作。6個EST(EST89、EST62、EST119、EST17、EST124、EST76)被標(biāo)記探針用經(jīng)典雜交法進行篩選，經(jīng)過三輪的篩選，分別得到EST89、EST62、EST124、EST76單克隆。用EST89篩庫得到的序列經(jīng)分析后確認為全長編碼基因，命名為pank4，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，其全長約2.3kb。
實施例2 pank4真核表達載體的構(gòu)建以上游引物5’-CAT CTC GAG AAA ATG GCG GAG TGC CGG-3’加一個Xho1酶切位點，下游引物5’-CA TGG ATC CTC GGCTGG GAC CTCGTA-3’加入一個BamH I位點，全長pank4基因為模板進行PCR擴增。PCR擴增條件為94℃變性2分鐘，然后進行如下循環(huán)程序30次94℃變性40秒，55℃退火60秒，72℃延伸150秒。30個循環(huán)結(jié)束后，72℃繼續(xù)延伸10分鐘，然后將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠分離，用玻璃奶吸附法回收PCR產(chǎn)物?；厥盏腄NA片段經(jīng)電泳電泳定量，連接至pGEM-T easy載體。用兩種酶Xho1和BamH1將pank4基因編碼區(qū)從pGEM-T easy載體切下來，電泳回收該條帶，與同樣用XhoI和BamHI雙酶切的pcDNA3.1表達載體(Invitrogen)進行連接。得到的質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-pank4(見圖1所示)。
實施例3 pank4能上調(diào)IRS-1的表達本例選用CBRH-7919細胞株進行研究，該細胞株是Wistar大鼠用二乙基亞硝胺誘發(fā)的大鼠肝癌細胞系，得自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所中國科學(xué)院細胞庫。
CBRH-7919細胞分別轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-pank4和空表達載體pCDNA3.1對照組。轉(zhuǎn)染后36小時，棄掉培養(yǎng)液、提取RNA、定量RT-PCR。定量RT-PCR以β-肌動蛋白作為對照。分別選取葡萄糖代謝中的幾個關(guān)鍵酶，葡萄糖激酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、丙酮酸激酶、異檸檬酸脫氫酶基因、胰島素受體，胰島素受體底物1，胰島素受體底物2，胰島素受體底物3，胰島素受體底物4，葡萄糖轉(zhuǎn)運子4，糖原合成酶，乙酰輔酶A羧化酶，GSK1設(shè)計引物，進行定量RT-PCR檢測。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定發(fā)現(xiàn)只有胰島素受體底物1(IRS-1)表達明顯差異，如圖2所示，用Northern印跡進一步驗證RT-PCR結(jié)果，如圖3所示。
實施例4 pank4基因原核表達載體的構(gòu)建1、含有編碼pank4蛋白的抗原決定簇的序列的原核表達載體的構(gòu)建根據(jù)pank4的序列特點，經(jīng)軟件分析確定pank4蛋白的抗原決定簇序列，將其克隆到原核表達載體pGEX-4T-3(Pharmacia)。為便于構(gòu)建表達，我們在5’端引物加入一個BamH I酶切位點(5’引物5’-ATC GGA TCC CTC CTA GTC AAC ATT GGC-3’)，在3’端引物加入一個Xho I酶切位點(3’引物5’-TGC TCG AGT CTG TCCAAT GTC ATT GCT-3’)，模板為全長pank4。PCR擴增條件94℃變性2分鐘，然后進行如下循環(huán)程序30次94℃變性40秒，55℃退火60秒，72℃延伸60秒。30個循環(huán)結(jié)束后，72℃繼續(xù)延伸10分鐘，然后將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠分離，用玻璃奶吸附法回收PCR產(chǎn)物(約300bp)?；厥盏腄NA片段經(jīng)電泳電泳定量?；厥盏腄NA片段經(jīng)電泳電泳定量，連接至pGEM-T easy載體(Promega)。用兩種酶Xho1和BamH1將此片段從pGEM-T easy載體切下來，電泳回收該條帶，與同樣用XhoI和BamHI雙酶切的pGEX-4T-3原核表達載體(Pharmasia)進行連接。命名為pGEX-4T-3-f2。
2.含有pank4全長基因的原核表達載體的構(gòu)建設(shè)計引物，5’端引物加入一個BamH I酶切位點(5’引物5’-AGGA TCC AAA ATG GCG GAG TGC CGG-3’)，在3’端引物加入一個Xho I酶切位點(3’引物5’-AC TCG AGT TGG GAC CTCGTA CTT GAA-3’)，模板為全長pank4。PCR擴增條件94℃變性2分鐘，然后進行如下循環(huán)程序30次94℃變性40秒，62℃退火60秒，72℃延伸2分鐘。30個循環(huán)結(jié)束后，72℃繼續(xù)延伸10分鐘，然后將PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠分離，用玻璃奶吸附法回收PCR產(chǎn)物(約2.3kb)。回收的DNA片段經(jīng)電泳電泳定量。回收的DNA片段經(jīng)電泳電泳定量，連接至pGEM-T easy載體。用兩種酶Xho1和BamH1將此片段從pGEM-T easy載體切下來，電泳回收該條帶，與同樣用XhoI和BamHI雙酶切的pET-30a(+)原核表達載體(Invitrogen)進行連接。命名為pET-30a(+)-pank4。
實施例5 pank4蛋白抗原決定簇的純化及抗體的制備將測序后正確的實施例4.1得到的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，涂布于含有卡那霉素的LB瓊脂板上，37℃培養(yǎng)10-16小時。挑選約5個單菌落接種到含卡那霉素的5ml新鮮LB管中，37℃劇烈搖動培養(yǎng)10-16小時。取上述培養(yǎng)物以1/20的比例接種到兩個含卡那霉素的5ml新鮮LB管，37℃劇烈搖動培養(yǎng)30-60分鐘，使菌液OD600nm達到0.4-0.6。向上述一個轉(zhuǎn)接管中加入終濃度為1mmol/L的IPTG，37℃劇烈搖動培養(yǎng)3-4小時，另一管不誘導(dǎo)作對照。分別用1.5ml離心管收集培養(yǎng)液約1ml，12000rpm，20秒，棄凈上清培養(yǎng)基。保存菌體。菌體沉淀以100ul 1×樣品緩沖液重懸混勻，于100℃水浴10分鐘，SDS-PAGE上樣前12000rpm離心2分鐘。取10-20ul上樣，進行12％SDS-PAGE。按照分子克隆方法制備12％SDS-PAGE分離膠，混勻后，將其灌入制膠板內(nèi)(Bio-Rad公司的Mini-Cell制膠系統(tǒng))，室溫凝固45分鐘。制備5％SDS-PAGE濃縮膠。電泳首先以8V/cm進行，待上樣緩沖液進入分離膠后調(diào)整為15V/cm，電泳約2小時。待溴酚藍即將出膠時，停止電泳。0.25％考馬斯亮藍R250染液染膠2小時，脫色至蛋白帶型清晰可見，分析蛋白表達結(jié)果，將表達量最高的質(zhì)粒和菌株保存起來以后再用。
重組蛋白的大量表達將鑒定后的陽性菌株挑一個單菌落入100ml新鮮LB培養(yǎng)基(含有卡那霉素)。37℃劇烈搖動，培養(yǎng)過夜。將過夜菌液按照1/10比例接種到一個含有500ml LB培養(yǎng)基中(含卡那霉素)，37℃劇烈搖動，培養(yǎng)1-1.5小時，使菌液的OD600nm達到0.4-0.6。加入終濃度為0.5mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達3-4小時。收集培養(yǎng)液，5000rpm離心10分鐘，棄上清，PBS洗菌體沉淀。用PBS按照5ml/g重懸，冰浴下工作，按照參數(shù)為工作10s，冷卻20s，功率300W的條件，超聲波破碎細菌20次。12000rpm離心20分鐘，分別取少量上清和沉淀，進行SDS-PAGE檢測，分析蛋白在胞內(nèi)表達形式。其余于-70℃凍存?zhèn)溆谩?br> 重組蛋白的純化如果表達的蛋白主要存在上清中，直接加入GSH-Sepharose吸附融合蛋白，如果目的蛋白主要在包涵體內(nèi)，則需要將包涵體溶解后再純化。GSH-Sepharose 4B基質(zhì)的處理輕輕搖動裝有GSH-Sepharose4B的瓶子(GSH-Sepharose 4B基質(zhì)保存在乙醇中)，重懸基質(zhì)。取1.33mlGSH-Sepharose 4B基質(zhì)轉(zhuǎn)移到合適的離心管。500g離心5分鐘，去除上清。加入10ml 4℃預(yù)冷的PBS，混勻清洗GSH-Sepharose4B基質(zhì)，將殘留的乙醇洗凈，否則會干擾以后的結(jié)果。500g離心5分鐘，去除上清。加入1ml 1XPBS，用于平衡基質(zhì)。
GSH-Sepharose 4B柱子純化蛋白表達蛋白在包涵體內(nèi)，使用以下方法純化將菌體重懸于20ml STE(10mM Tris.HCl pH8.0，100mM NaCl，1mM EDTA)中。加入溶菌酶(10mg/ml)至終濃度100ug/ml，混勻，冰浴15分鐘。加入1M DTT及10％Sarkosyl至濃度分別為5mM及1.5％，于振蕩器上混合5s。超聲波破菌，超聲12s，冷卻30s，功率300W，超聲15次。4℃離心，12000rpm，20分鐘。上清加入30％TritonX-100至終濃度為3％，4℃旋轉(zhuǎn)儀上充分混合30分鐘。加入200ulGSH-Sepharose 4B，旋轉(zhuǎn)儀上充分混合30分鐘。將上液加到聚丙烯柱上，用10X柱體積的PBS洗3次。將樹脂轉(zhuǎn)移到1.5ml的離心管，加入200ul GST洗脫緩沖液(50mM Tris.HCl，10mM谷胱甘肽)，室溫作用10分鐘。1000rpm 4℃離心2分鐘，上清即為純化蛋白。重復(fù)洗脫2次，然后，福林-酚法測定蛋白濃度，SDS-PAGE檢測蛋白濃度，-70℃凍存待用。
抗體的獲得4只2kg重的新西蘭大白兔，兩只作為實驗組，兩只為對照。第一次基礎(chǔ)免疫1mg抗原(純化的融合蛋白)，加等體積福氏完全佐劑混合，直至形成均勻油包水狀乳液，采用背部皮內(nèi)，腋下等淋巴密集處皮下多點注射，約20-30點。對照50mM Tris.HCl，與佐劑混合。第二次基礎(chǔ)免疫400ug抗原加等體積福氏不完全佐劑混合，同上，多點注射。免疫一周后，從耳緣靜脈取血ELISA測定抗體效價。加強免疫300ug抗原加等體積的福氏不完全佐劑混合，多點注射。根據(jù)ELISA測定抗體效價的結(jié)果，每兩周免疫一次，直到抗體效價達到所需滴度(1∶32)。從頸動脈放血，采集的血液于室溫斜置30分鐘，移到4℃冰箱待血清析出，收集血清后1000rpm離心10分鐘，0.5ml/支分裝，-70℃保存。Western印跡檢測抗體純度較高。
pET-30a(+)-pank4也按同樣方法進行誘導(dǎo)表達。
實施例6 pank4組織分布檢測實驗利用免疫組化的方法進行pank4分布的定位，動物材料為300克重SD大鼠，對其進行麻醉后用PBS緩沖液灌流，充分去除血液的干擾，迅速取出各器官，在4％多聚甲醛(PBS配)中固定，然后石蠟包埋、切片、脫臘、固定，用3％過氧化氫孵育15分鐘，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，用實施例5制得的pank4抗體按1∶200稀釋，4℃孵育過夜。次日用PBS洗三次，每次5分鐘，滴加通用性二抗(羊抗兔)(北京中山生物技術(shù)有限公司)，37℃孵育40分鐘，PBS洗三次，每次5分鐘，DAB(北京中山生物技術(shù)有限公司)顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素染料復(fù)染3分鐘，脫水，封片。顯微鏡下觀察，10×、20×、40×照相。如圖4A-4L所示。圖中，A為肝臟，pank4在新分裂的細胞中分布較廣。B為骨骼肌組織，pank4在某一簇細胞中分布較多，說明它與收縮有關(guān)，從而也說明它也許與能量代謝有關(guān)。C為胰腺組織，可明顯斷定它在胰導(dǎo)的某類細胞中分布廣。D為腎臟組織，圖中可見pank4在腎小管附近有高分布。E為睪丸，如箭頭所指分布于基質(zhì)。F為肺，如箭頭所指分布于基質(zhì)。G為血管，與骨骼肌組織類似，pank4在某一簇細胞中分布較多。H為小腸，在基底細胞中分布。I為甲狀腺，如箭頭所指分布于分泌導(dǎo)管。J為大腦，在神經(jīng)元細胞中分布。K為心肌，與骨骼肌組織類似，pank4在某一簇細胞中分布較多。L為脾，pank4沒有明顯的特征分布。
實施例7 Pank4在細胞中的定位pEGFP-N1載體(Clonetech公司)含有CMV的啟動子和增強子，以Pank4全基因為模板PCR擴增得到Pank4全長克隆到pEGFP-N1，過程如下上游引物為P1(5’-GAA CTC GAG AAA ATG GCG GAGTGC CGG-3’)，含有Xho1酶切位點，下游引物為P2(5’-CAT GGATCC TCG GCT GGG ACC TCG TA-3’)，含有BamH1位點。PCR產(chǎn)物被Xho1-BamH1酶切并連入同樣酶切得到的載體pEGFP-N1中。
L-6TG細胞(中科院上海細胞所)培養(yǎng)在RPM1640培養(yǎng)基中(10％熱滅活的胎牛血清)，細胞以50％比例接種到覆蓋有蓋玻片的六孔板上，24小時后待細胞長到80％時，用Lipofectamine2000將質(zhì)粒pPank4-EGFP-N1轉(zhuǎn)染細胞，pEGFP-N1作為對照，24小時后，于OLYMPUS FV-500共焦激光掃描顯微鏡觀察結(jié)果。
HEK293細胞和Hela細胞(購自中科院上海細胞所)培養(yǎng)在MEM培養(yǎng)基中(10％熱滅活的胎牛血清)，以pPank4-EGFP-N1轉(zhuǎn)染細胞，pEGFP-N1作為對照，轉(zhuǎn)染方法同上。然后于OLYMPUSFV-500顯微鏡觀察結(jié)果。
另外，SD大鼠的骨骼肌細胞以貼塊法原代培養(yǎng)于Dulbeccos改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(10％熱滅活的胎牛血清)37℃，5％CO2。待細胞在蓋玻片上形成單層細胞后固定于4％多聚甲醛(在PBS中配制)，0.1％TritonX-100(在PBS中配制)透化后，以3％BSA(在PBS中配制)37℃封閉，37℃標(biāo)一抗半小時(SD大鼠Pank4蛋白免疫兔子得到的抗體)，PBS洗細胞三次，然后室溫標(biāo)記偶聯(lián)FITC的山羊抗兔二抗約半小時，固定蓋玻片于載玻片上，于OLYMPUSFV-500顯微鏡觀察結(jié)果。
質(zhì)粒pEGFP-Pank4和pEGFP-N1轉(zhuǎn)染到L-6TG、HEK293、HeLa細胞系中的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，綠色熒光蛋白定位于全細胞(圖5A、B、C)，而EGFP-Pank4定位于細胞質(zhì)中(圖5E、F、G)。
SD大鼠骨骼肌原代培養(yǎng)的細胞經(jīng)固定后，以Pank4抗體作為一抗，偶聯(lián)FITC的羊抗兔抗體作為二抗進行免疫熒光實驗，結(jié)果表明Pank4蛋白定位于細胞質(zhì)中(圖5D、H)。
實施例8 pank4基因和蛋白的進一步鑒定酵母雙雜交實驗利用MATCHMAKER Library construction & Screening System(CLONTECH)進行酵母雙雜交實驗，SD大鼠Pank4基因全長克隆到pGBKT7載體(Clonetech)中上游引物P1(5’-A GAA TTC AAAATG GCG GAG TGC CGG-3’)含有EcoRI位點，下游引物P2(5’-AGGA TCC TGG GAC CTC GTA CTT GAA-3’)含有BamHI位點，PCR產(chǎn)物連入T-vector中，然后用EcoRI-BamH1酶切后連入同樣酶切的載體pGBKT7中，重組質(zhì)粒pPank4-GBKT7轉(zhuǎn)化到酵母菌株Y187中在自激活和毒性檢測后，Pank4作為誘餌蛋白與SD大鼠骨骼肌cDNA文庫雜交(SD大鼠骨骼肌cDNA文庫是cDNA片斷以pGADT7-Rec作為載體，并轉(zhuǎn)化到酵母菌株AH109中)，24-26小時后，觀察合子形成后，收集酵母菌，并將其鋪于trp-，leu-，his-，ade-+50mM 3-AT平板上，30℃培養(yǎng)10天左右，按CLONTECHMATCHMAKER文庫構(gòu)建和篩選試劑盒的方法測定β-半乳糖苷酶的活性，篩選陽性克隆。
Pull-down實驗為了進行pull-down實驗，分別在Escherichia coli BL21(DE3)中表達GST-Pank4融和蛋白和GST蛋白。GST和GST-Pank4蛋白按GST基因融合系統(tǒng)指導(dǎo)(Amersham Pharmacia Biotech)提供的方法純化。結(jié)合實驗中，將0.5μg GST和GST-Pank4蛋白分別結(jié)合于20μl以裂解緩沖液(20mM Tris-HCl，pH8.0 at 4℃，1mM EDTA，200mM NaCl，10mM 2-巰基乙醇，25μg/ml PMSF，0.7μg/ml pepstatin，1μg/ml leupeptin，2μg/ml aprotinin，0.5％Nonidet P-40)平衡好的谷胱甘肽-SepharoseTM4B珠(Amersham Pharmacia Biotech)上，然后用各1ml裂解緩沖液漂洗3次。
篩選到的酵母陽性克隆的DNA序列(Pkm2)按讀碼克隆到真核表達載體pCDNA6v5hisB-FIAG(Invitrogen)，HEK293細胞接種到50mm的平板上，重組質(zhì)粒pCDNA6v5hisB-FLAG-Pkm2以Lipofectamine2000試劑(Invitrogen，USA)轉(zhuǎn)染到Hek293細胞中，48小時后收集細胞，裂解緩沖液裂解細胞，4℃條件下將細胞裂解物與結(jié)合好GST蛋白或GST-Pank4蛋白的谷胱甘肽-SepharoseTM4B珠結(jié)合過夜，然后以裂解緩沖液漂洗谷胱甘肽-SepharoseTM4B珠3次，結(jié)合好蛋白的珠加入30μl2×SDS緩沖液，以anti-FLAG作為一抗Western印跡檢測。
免疫共沉淀實驗重組質(zhì)粒pcDNA6v5hisB-FLAG-Pkm2和pcDNA6v5hisB-HA-pank4以Lipofectamine2000試劑(Invitrogen，USA)共轉(zhuǎn)染到Hek293細胞中，48小時后收集細胞，EBC裂解緩沖液(50mM Tris-Cl，pH8.0，120mM NaCl，0.5％Nonidet P-40，5μg/mlleupeptin，10μg/ml aprotinin，50μg/ml PMSF，0.2mM sodiumorthovanadate，100mM NaF)裂解細胞，1,2000rpm離心10分鐘，上清加入anti-HA單克隆抗體(Sigma)或anti-FLAG單克隆抗體(Sigma)結(jié)合1小時，然后加入Protein G sepharose 4 Fast Flow(Amersham Pharmacia)結(jié)合1小時，上清吸去，NETN緩沖液(20mMTris-Cl，pH8.0，1mM EDTA，900mM NaCl，0.5％Nonidet P-40)漂洗sepharose珠5次以上，再用NETN緩沖液(20mM Tris-Cl，pH8.0，1mM EDTA，100mM NaCl，0.5％Nonidet P-40)漂洗1次，以anti-FLAG MoAB或anti-HA MoAB作為一抗western印跡檢測。
將Pank4的KOG2201和KOG4584按氨基酸的順序克隆到載體pcDNA6v5hisB-HA，與Pkm2進行免疫共沉淀試驗，方法如前。
激光共定位實驗HEK293和HeLa細胞接種倒帶有蓋玻片的六孔板上，待細胞長到80％時，脂質(zhì)體的方法將pEGFP-N1-pank4和thepcDNA6v5hisB-FLAG-Pkm2共轉(zhuǎn)染到兩種細胞中，24小時后，細胞4％多聚甲醛(PBS配)，0.1％TritonX-100(PBS配)透化后，3％BSA 37℃封閉30分鐘，anti-FLAG MoAB37℃孵育30分鐘，PBS漂洗3次，Anti-小鼠IgG(H+L)綴合的熒光素(TRITC，Sigma)室溫標(biāo)記3分鐘，綠色熒光和紅色免疫熒光通過OLYMPUS FV-500顯微鏡觀察并分析二者表達重疊情況。
將Pank4的KOG2201和KOG4584按氨基酸的順序克隆到載體pEGFP-N1，與Pkm2進行共定位實驗，方法如前。
丙酮酸激酶活性檢測L-6TG細胞和HEK293T細胞(購自中科院上海細胞所)以pcDNA6v5hisB-HA-pank4和pcDNA6v5hisB-FLAG-Pkm2轉(zhuǎn)染，然后25℃進行丙酮酸激酶的活性檢測。首先細胞冰浴，冰預(yù)冷的PBS洗兩次，裂解緩沖液裂解細胞，然后15000g離心20分鐘。上清以BCA法測定蛋白濃度，酶活反應(yīng)如下50mM Tris-Cl，pH7.6，100mM KCl，5mM MgSO4，2mM ADP(Sigma)，0.2 or 2mM phosphoenolpyruvate(PEP)(Sigma)，0.25mM NADH and 2U乳酸脫氫酶(Sigma)，反應(yīng)半小時后測定340nm下的光吸收。
結(jié)果Pkm2與Pank4相互作用為了尋找與Pank4相互作用的蛋白，以Pank4蛋白作為誘餌蛋白篩選SD大鼠骨骼肌的AD文庫，分離出十個陽性克隆，經(jīng)過在此雜交驗證，序列測定，BLAST分析發(fā)現(xiàn)它們分別是beta-hydroxysteroiddehydrogenase isomerase type II，Rattus norvegicus calcium channel beta1 subunit，Rattus norvegicus glycogen phosphorylase，Rattus norvegicuspyruvate kinase(Pkm2)，Rattus norvegicus glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase.，但是經(jīng)上述pull-down實驗驗證發(fā)現(xiàn)只有Pkm2與Pank4直接相互作用。
通過GST pull-down實驗驗證Pank4是否與Pkm2結(jié)合，首先構(gòu)建表達Pank4-GST融合蛋白和GST蛋白，用重組質(zhì)粒pcDNA6v5hisB-FLAG-Pkm2轉(zhuǎn)HEK293細胞獲得細胞裂解產(chǎn)物，與已經(jīng)結(jié)合了GST蛋白和Pank4-GST蛋白的谷胱甘肽sepharose珠結(jié)合，被蛋白結(jié)合的珠進行western印跡檢測，anti-FLAG單克隆抗體作為一抗。結(jié)果表明，Pkm2蛋白僅與Pank4-GST蛋白結(jié)合，而不與GST蛋白結(jié)合(圖6A)。
重組質(zhì)粒HA-Pank4和FLAG-Pkm2及HA-Pank4和FLAG分別共轉(zhuǎn)染HEK293細胞后，獲得細胞裂解物，對anti-HA單克隆抗體免疫共沉后的proteinG珠以anti-FLAG MoAb進行western印跡檢測，在其對應(yīng)實驗中是對anti-FLAG單克隆抗體免疫共沉后的proteinG珠以anti-HA單克隆抗體進行western印跡檢測結(jié)果(圖6B、C)。
我們利用重組質(zhì)粒pEGFP-Pank4和pFLAG-Pkm2共轉(zhuǎn)染HEK293和HeLa細胞考察Pank4和Pkm2蛋白的定位，Pank4蛋白可以通過綠色熒光蛋白在HEK293細胞和HeLa細胞中的定位來確定。Pkm2蛋白的定位可以通過anti-FLAG抗體進行免疫熒光來確定(圖8A-F)。
KOG2201和KOG4584兩個結(jié)構(gòu)域都與Pkm2相互作用KOG2201和KOG4584分別被克隆到載體pcDNA6v5hisB-HA與Pkm2進行免疫共沉淀實驗，結(jié)果表明，二者均與Pkm2相互作用(圖7A、B)。激光共聚焦實驗也表明兩個結(jié)構(gòu)域分別是與Pkm2共定位的(圖8G-Q)。
Pank4能激活Pkm2首先，質(zhì)粒pcDNA6v5hisB-HA-Pank4和pcDNA6v5hisB-HA轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，提取總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄-PCR反應(yīng)，從圖片9可以看出，在對照組和實驗組中Pkm2的表達量沒有明顯變化。為了分析Pank4是否影響Pkm2的活性，我們將pcDNA6v5hisB-FLAG-Pkm2和pcDNA6v5hisB-FLAG-Pank4、KOG2201、KOG4584以及單獨的載體pcDNA6v5hisB-FLAG-Pkm2和pcDNA6v5hisB-FLAG-Pkm轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，進行激酶活性檢測，結(jié)果表明(圖9)，KOG2201結(jié)構(gòu)域?qū)τ赑km2的活性影響很大，可以很大程度上增強Pkm2的活性，這也許是Pank4激活Pkm2的機制所在，但是KOG4584對Pkm2的活性影響不是很明顯。
序列表<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120>血糖調(diào)節(jié)相關(guān)的新基因、其蛋白產(chǎn)物及其用途<130>I20021195cb<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2322<212>DNA<213>大鼠<220>
<221>CDS<222>(1)..(2322)<223>
<400>1atg gcg gag tgc cgg gcg agt ggc ggc ggg agc ggc ggg gac agt ctg48Met Ala Glu Cys Arg Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ser Leu1 5 10 15gac aag agc atc acg ctg ccc ccc gac gag atc ttc cga aac ctg gag96Asp Lys Ser Ile Thr Leu Pro Pro Asp Glu Ile Phe Arg Asn Leu Glu20 25 30aac gcc aag cgc ttc gcc att gat ata ggt gga tca ctg acc aag ttg 144Asn Ala Lys Arg Phe Ala Ile Asp Ile Gly Gly Ser Leu Thr Lys Leu35 40 45gca tac tat tcc aca gta cag cac aaa gtg gcc aaa gtg agg tct ttt 192Ala Tyr Tyr Ser Thr Val Gln His Lys Val Ala Lys Val Arg Ser Phe50 55 60gac cac cca gga aag gac gca gaa cag gac cat gag ccg ccc tat gag 240Asp His Pro Gly Lys Asp Ala Glu Gln Asp His Glu Pro Pro Tyr Glu65 70 75 80atc tca gtt cag gag gag atc aca gct cgt ctg cat ttc atc aag ttt 288Ile Ser Val Gln Glu Glu Ile Thr Ala Arg Leu His Phe Ile Lys Phe85 90 95gag aac acc tac atg gaa gcc tgc ctg gac ttt atc aga gac cac ctt 336Glu Asn Thr Tyr Met Glu Ala Cys Leu Asp Phe Ile Arg Asp His Leu100 105 110gtc aac act gag acc aag gtc atc cag gcc aca ggg ggt gga gcc tac 384Val Asn Thr Glu Thr Lys Val Ile Gln Ala Thr Gly Gly Gly Ala Tyr115 120 125aag ttc aag gac ctc atc gag gag aag ctg cgt ctg aag gtg gac aaa 432Lys Phe Lys Asp Leu Ile Glu Glu Lys Leu Arg Leu Lys Val Asp Lys130 135 140gag gat gtg atg acc tgc ttg att aag ggg tgc aac ttc gtg ctg aag 480Glu Asp Val Met Thr Cys Leu Ile Lys Gly Cys Asn Phe Val Leu Lys145 150 155 160
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Leu Asn Asp Val Thr Tyr Ser Glu Ser Leu Ile Val Ala Glu Arg Ile660 665 670gca gcc atg gac ccc atc atc tgc act gca ctc aga gaa gac agg cta 2064Ala Ala Met Asp Pro Ile Ile Cys Thr Ala Leu Arg Glu Asp Arg Leu675 680 685ctg ctg gtg cag acc ggt tcc agt ccc cca tgc cta gat ctc agc cgc 2112Leu Leu Val Gln Thr Gly Ser Ser Pro Pro Cys Leu Asp Leu Ser Arg690 695 700cta gat aag gga ctg gct gtg ctg gtg cgg gag cgt ggt gcc gac ctg 2160Leu Asp Lys Gly Leu Ala Val Leu Val Arg Glu Arg Gly Ala Asp Leu705 710 715 720gtg gtc atc gag gga atg ggc cgt gct gtc cac acc aac tac cat gct 2208Val Val Ile Glu Gly Met Gly Arg Ala Val His Thr Asn Tyr His Ala725 730 735ttg ctg cga tgt gag agt ctc aag ctg gcc gtg gtg aag aac gcc tgg 2256Leu Leu Arg Cys Glu Ser Leu Lys Leu Ala Val Val Lys Asn Ala Trp740 745 750ctg gct gag cgt ctg ggt ggc cag ctc ttc agt gtc atc ttc aag tac 2304Leu Ala Glu Arg Leu Gly Gly Gln Leu Phe Ser Val Ile Phe Lys Tyr755 760 765gag gtc cca gcc gag tga 2322Glu Val Pro Ala Glu770<210>2<211>773<212>PRT<213>大鼠<400>2Met Ala Glu Cys Arg Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Asp Ser Leu1 5 10 15Asp Lys Ser Ile Thr Leu Pro Pro Asp Glu Ile Phe Arg Asn Leu Glu20 25 30Asn Ala Lys Arg Phe Ala Ile Asp Ile Gly Gly Ser Leu Thr Lys Leu35 40 45Ala Tyr Tyr Ser Thr Val Gln His Lys Val Ala Lys Val Arg Ser Phe50 55 60Asp His Pro Gly Lys Asp Ala Glu Gln Asp His Glu Pro Pro Tyr Glu65 70 75 80Ile Ser Val Gln Glu Glu Ile Thr Ala Arg Leu His Phe Ile Lys Phe85 90 95
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Arg Leu Lys Gly Pro Pro His Lys Cys Ala Leu Ile Phe Ala Asp Asn610 615 620Ser Gly Ile Asp Ile Ile Leu Gly Val Phe Pro Phe Val Arg Glu Leu625 630 635 640Leu Cys Arg Gly Ile Glu Val Ile Leu Ala Cys Asn Ser Gly Pro Ala645 650 655Leu Asn Asp Val Thr Tyr Ser Glu Ser Leu Ile Val Ala Glu Arg Ile660 665 670Ala Ala Met Asp Pro Ile Ile Cys Thr Ala Leu Arg Glu Asp Arg Leu675 680 685Leu Leu Val Gln Thr Gly Ser Ser Pro Pro Cys Leu Asp Leu Ser Arg690 695 700Leu Asp Lys Gly Leu Ala Val Leu Val Arg Glu Arg Gly Ala Asp Leu705 710 715 720Val Val Ile Glu Gly Met Gly Arg Ala Val His Thr Asn Tyr His Ala725 730 735Leu Leu Arg Cys Glu Ser Leu Lys Leu Ala Val Val Lys Asn Ala Trp740 745 750Leu Ala Glu Arg Leu Gly Gly Gln Leu Phe Ser Val Ile Phe Lys Tyr755 760 765Glu Val Pro Ala Glu770
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，其包含具有選自如下一組的一種核苷酸序列的多核苷酸，所述的組為(a)編碼具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的全長多肽的核苷酸序列；(b)互補于以上(a)的核苷酸序列的核苷酸序列；(c)在嚴格條件下與(a)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1的核酸分子，其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO1所示的核苷酸序列。
3.一種包含權(quán)利要求1或2的核酸分子的表達載體。
4.權(quán)利要求3的表達載體，其為真核表達載體pcDNA3.1-pank4。
5.由權(quán)利要求3的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細胞。
6.一種多肽，其為具有SEQ ID NO2所示的完整氨基酸序列的全長pank4蛋白或其具有生物學(xué)活性的片段。
7.抗權(quán)利要求6的多肽的抗體。
8.權(quán)利要求1或2的核酸分子作為糖尿病治療的靶點的用途。
9.權(quán)利要求1或2的核酸分子或者權(quán)利要求6的多肽在制備治療糖尿病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種與血糖調(diào)節(jié)相關(guān)的新基因，命名為pank4，本發(fā)明還涉及所述基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，以及所述基因和蛋白質(zhì)在血糖調(diào)節(jié)及糖尿病治療中的用途。
文檔編號A61K38/16GK1530444SQ20031011027
公開日2004年9月22日 申請日期2003年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月27日
發(fā)明者李云峰, 常永生, 左瑾, 方福德 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所