專利名稱：不飽和脂肪酸修飾的胰島素及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及采用不飽和脂肪酸或其衍生物對(duì)胰島素進(jìn)行化學(xué)修飾，制備得到可以用于治療糖尿病的口服藥物胰島素類似物及其制備方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種常見的多發(fā)性代謝疾病，國內(nèi)外發(fā)病率均呈上升趨勢(shì)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，全國現(xiàn)有糖尿病患者3000萬人以上，糖尿病的發(fā)病率已高達(dá)3.2％。糖尿病是引起人類死亡占第三位的主要原因。胰島素是治療糖尿病的特效性多肽激素化合物，迄今為止尚無更有效的替代藥物。但是，由于胰島素是一種蛋白質(zhì)，易被胃腸道蛋白水解酶降解而失活，因此只能注射，不能口服。胰島素依賴型糖尿病人必須每日使用胰島素以降低血糖，維持生命的正常代謝。頻繁注射用藥，給需終身用藥的病人帶來極大的痛苦和不便。因此研究開發(fā)安全、方便而有效的胰島素非注射給藥途徑已經(jīng)成為世界各國醫(yī)藥界廣泛關(guān)注的重要課題。
口服胰島素一直是醫(yī)生和糖尿病患者夢(mèng)寐以求的藥物，但迄今尚未取得突破性進(jìn)展。為了解決給藥途徑，延緩胰島素在體內(nèi)的降解或排泄，近年來國內(nèi)外對(duì)胰島素新劑型開展了廣泛研究，有經(jīng)口服、鼻腔、舌下、眼部、直腸、透皮吸收等多種途徑給藥，其中口服給藥是最受病人歡迎的途徑，成為目前倍受親睞的研究熱點(diǎn)，但國際上至今尚無較好的口服制劑。
化學(xué)修飾是口服胰島素的重要研究課題之一?，F(xiàn)有技術(shù)通過對(duì)胰島素進(jìn)行化學(xué)修飾，增強(qiáng)胰島素抵抗蛋白水解酶的破壞作用，進(jìn)而研制出適于口服的胰島素。Kuraray Co.，Ltd.的專利EP 0 511600 A2合成了[protein][Z]n的衍生物，其中[protein]為多肽蛋白質(zhì)包括胰島素，[Z]為-CO-W-COOH，式中W為長(zhǎng)鏈的可含雜原子的碳水基團(tuán)。N.Ekwuribe等人(專利PCT Int.Appl.WO 0078302)將一種低聚物共價(jià)連接到重組人胰島素上得到胰島素類似物M2，其口服降糖作用起效快，降糖效果與皮下注射相當(dāng)，劑量為皮下注射的2倍，美國Protein Delivery公司正進(jìn)行臨床試驗(yàn)。Novo Nordisk A/S申請(qǐng)的專利WO 95/07931以及EliLilly公司的兩個(gè)專利EP 0 712861 A2及EP 0 712862 A2也分別介紹了化學(xué)修飾胰島素的合成方法。但有關(guān)給藥安全性及患者進(jìn)餐前后對(duì)用藥的影響等仍在研究之中，迄今尚無臨床試驗(yàn)成功的報(bào)道。本研究組曾申請(qǐng)了發(fā)明專利“治療糖尿病的口服藥脂肪二酰氨基酸胰島素及其合成方法”(專利申請(qǐng)?zhí)?11284998.6)，此項(xiàng)發(fā)明采用的修飾劑為脂肪族二元羧酸的單氨基酸衍生物，得到的修飾胰島素可提高其抗酶解能力，但該修飾劑的活化中間體合成產(chǎn)率較低。本發(fā)明采用的修飾劑不飽和脂肪酸的活化中間體相對(duì)合成產(chǎn)率較高，而且不飽和脂肪酸是細(xì)胞膜磷脂的重要成分，是人體必需脂肪酸，無毒、無害、無刺激性，用其修飾胰島素具有良好的生物安全性，能夠提高胰島素的抗酶解能力，增強(qiáng)藥物的透膜吸收。本發(fā)明修飾胰島素所采用的基團(tuán)與上述提及的專利所采用的都不同。本發(fā)明的化學(xué)修飾胰島素目前尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在采用化學(xué)修飾的方法在胰島素的合適部位共價(jià)結(jié)合一種不飽和脂肪酸或其衍生物，保護(hù)胰島素易被胰蛋白酶進(jìn)攻的位點(diǎn)，使胰島素能夠抵抗胰蛋白酶的降解作用。
具體是將單不飽和脂肪酸(Monounsaturated fatty acid，MUFA)及不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid，PUFA)或其衍生物共價(jià)結(jié)合到胰島素(Insulin，Ins)的特定部位，得到MUFA-Ins或PUFA-Ins。所選修飾劑PUFA，存在于動(dòng)物體內(nèi)，是微生物和原生動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的物質(zhì)。已有的研究主要采用直鏈飽和脂肪酸(Saturaed fatty acid，SFA)共價(jià)修飾胰島素。美國關(guān)于食物中脂肪酸與胰島素抵抗的研究顯示，正常人空腹胰島素水平與脂肪、SFA攝入呈正相關(guān)，而與MUFA、PUFA攝入呈負(fù)相關(guān)；SFA攝入過多與高胰島素血癥、胰島素抵抗有關(guān)。SFA使細(xì)胞膜堅(jiān)韌，而PUFA有利于膜的流動(dòng)性。PUFA主要包括ω-3、ω-6、ω-9系列，其中ω-3和ω-6PUFA具有較重要的生物學(xué)意義，如亞油酸(LA)和亞麻酸(LNA)是人體必需脂肪酸，分別是ω-6和ω-3高不飽和脂肪酸(HUFA)的前體；HUFA中花生四烯酸(AA)參與多種生理代謝功能，二十二碳六烯酸(DHA)是腦和視網(wǎng)膜的重要脂質(zhì)成分。PUFA是細(xì)胞膜磷脂的重要成分，其成分的改變可影響膜的流動(dòng)性和某些酶的活性以及激素與受體的結(jié)合和信號(hào)的傳遞。細(xì)胞膜的生物起源和完整性需要PUFA。PUFA可促進(jìn)細(xì)胞膜的流動(dòng)性和組裝；對(duì)基因表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用；可有效防治心血管疾??；可促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育等。為此，本發(fā)明采用PUFA為修飾劑對(duì)胰島素進(jìn)行化學(xué)修飾。利用這些具有重要生理功能的PUFA作為化學(xué)修飾基團(tuán)不僅可以保護(hù)胰島素免受胰蛋白酶等的破壞，提高胰島素的穩(wěn)定性，增加胰島素的脂溶性，促進(jìn)胰島素的透膜吸收，而且還可促進(jìn)體內(nèi)PUFA的平衡，從而維護(hù)人體的正常生理機(jī)能。
該物質(zhì)的化學(xué)通式為CnH2(n-m)+1CO-Ins或CnH2(n-m)+1CONHCHRCO-Ins式中CnH2(n-m)+1CO-為直鏈不飽和脂肪酸酰基(n＝17、19、21，m＝1～6)，對(duì)應(yīng)的不飽和脂肪酸可以是C17H33COOH(油酸)，C17H31COOH(亞油酸，LA)，C17H29COOH(亞麻酸，LNA)，C19H31COOH(花生四烯酸，AA)，C19H29COOH(二十碳五烯酸，EPA)，C21H33COOH(二十二碳五烯酸，DPA)，C21H31COOH(二十二碳六烯酸，DHA)等；R為賴氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸的側(cè)鏈。CnH2(n-m)+1CO-Ins的合成反應(yīng)式如下

具體合成的步驟是①將一定量的不飽和脂肪酸(UFA)水浴加熱至50～60℃，然后向其中滴加三氯化磷(PCl3)，PCl3的摩爾數(shù)為UFA的1/2至2/3。滴加完畢，繼續(xù)在50～60℃下攪拌反應(yīng)4～5小時(shí)。停止反應(yīng)后，分去下層亞磷酸。上層液體減壓蒸出過量三氯化磷，剩余液體即不飽和脂肪酰氯；②將苯并三唑溶于乙醚中，加入與苯并三唑等摩爾的三乙胺(TEA)，然后在0～10℃下向其中滴加不飽和脂肪酰氯，不飽和脂肪酰氯的摩爾數(shù)為苯并三唑的1.02～1.05倍。滴加完畢后，在15～20℃下攪拌反應(yīng)2～3小時(shí)；停止反應(yīng)后，減壓過濾，濾除白色沉淀物，得澄清濾液。將濾液減壓濃縮至干，加入丙酮溶解，冷卻結(jié)晶。過濾，得白色針狀結(jié)晶，真空干燥至恒重，即得不飽和脂肪酰苯并三唑(I)，產(chǎn)率約10～30％；③胰島素的?；磻?yīng)在水和N-甲基-吡咯烷酮的混合溶劑中進(jìn)行。在0℃下將一定量的胰島素溶解在N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶劑中，水的體積百分含量為25％～75％，再加入摩爾數(shù)約為胰島素用量30～50倍的TEA。
④將摩爾數(shù)為胰島素用量的2～3倍的不飽和脂肪酰苯并三唑(I)溶解于N-甲基-吡咯烷酮中，將不飽和脂肪酰苯并三唑(I)的N-甲基-吡咯烷酮溶液加入到步驟③制備的胰島素溶液中，在0℃下攪拌反應(yīng)2～3小時(shí)；⑤向反應(yīng)混合物中加入丙酮至有沉淀生成，冷凍離心，去掉上清，沉淀經(jīng)冷凍干燥至恒重，得到不飽和脂肪酸酰基化胰島素(II)(CnH2(n-m)+1CO-Ins)，其產(chǎn)率(按胰島素的加入量計(jì))大于95％。CnH2(n-m)+1CONHCHRCO-Ins的合成反應(yīng)式如下

具體合成的步驟是①將氨基酸溶于等摩爾的氫氧化鈉溶液，再加入上述溶液3～5倍體積的四氫呋喃(THF)，在0～10℃下，緩慢滴加與氨基酸等摩爾的不飽和脂肪酰氯，同時(shí)緩慢滴加0.1mol/L的氫氧化鈉或碳酸鈉溶液，使反應(yīng)體系pH值控制在8.5～10；滴加完畢，在0～10℃攪拌反應(yīng)2小時(shí)后，升溫至20～30℃，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2～3小時(shí)。停止反應(yīng)后，用鹽酸酸化至pH2～3，加入與混合液等體積的石油醚，去水層，待有機(jī)層冷卻結(jié)晶，過濾得不飽和脂肪酰氨基酸(III)，產(chǎn)率40～60％；②將不飽和脂肪酰氨基酸(III)溶于THF中，加入與式(III)化合物等摩爾的苯并三唑，攪拌溶解。冰浴下，緩慢滴加等摩爾的二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的THF溶液，滴完后，0℃下繼續(xù)攪拌反應(yīng)2小時(shí)，升溫至20℃，繼續(xù)攪拌2～3小時(shí)；減壓過濾，濾除白色不溶物，將濾液減壓濃縮后，冷卻結(jié)晶；過濾，得白色粉狀物，真空干燥至恒重，即得不飽和脂肪酰氨基酸?；讲⑷?IV)，按式(III)化合物的用量計(jì)，產(chǎn)率約30～60％；③在0℃下將一定量的胰島素溶解在N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶劑中，水的體積百分含量為25％～75％，再加入摩爾數(shù)約為胰島素用量30～50倍的三乙胺(TEA)；④將摩爾數(shù)為胰島素用量2～3倍的式(IV)化合物溶解于N-甲基-吡咯烷酮中，將式(IV)化合物的N-甲基-吡咯烷酮溶液加入到上述胰島素溶液中，在0℃下攪拌反應(yīng)2～3小時(shí)；⑤加丙酮入反應(yīng)混合物中至有沉淀生成，冷凍離心，去掉上清，沉淀經(jīng)冷凍干燥，得到不飽和脂肪酰氨基酸?；葝u素(V)(CnH2(n-m)+1CONHCHRCO-Ins)，產(chǎn)率80～95％。
所得修飾胰島素用反相高效液相色譜(RP-HPLC)分析。色譜系統(tǒng)為Agilent 1100，色譜柱為Phenomenex公司的Jupiter C18反相柱(250×4.6mm，5μm，30nm)；流動(dòng)相A為磷酸鹽緩沖液(pH3.0)，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫，流速1ml/min，進(jìn)樣量20μl，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)214nm。流動(dòng)相梯度如下0min 74％A-26％B
4min 70％A-30％B8min 70％A-30％B14min 64％A-36％B25min 64％A-36％B相同的色譜條件下，未修飾的豬胰島素的保留時(shí)間(tR)為9.5min，而修飾胰島素的tR均大于9.5min。
動(dòng)物試驗(yàn)采用正常小鼠考察所得修飾胰島素的降血糖活性，并與天然胰島素對(duì)照；同時(shí)用胰蛋白酶對(duì)修飾胰島素進(jìn)行體外降解試驗(yàn)。
取24只體重約30g昆明小鼠，禁食12小時(shí)，隨機(jī)分成四組。將修飾胰島素和胰島素分別用磷酸鹽緩沖溶液(pH＝7.4)配成0.18IU/ml的注射液，小鼠腹膜皮下注射0.1ml/只(0.6IU/kg體重)?？瞻捉M注射等量的磷酸鹽緩沖溶液(pH＝7.4)。尾靜脈采血，測(cè)定不同時(shí)間的血糖值。結(jié)果證明，與胰島素相比，修飾胰島素不僅保持降糖活性，而且在體內(nèi)持續(xù)作用時(shí)間延長(zhǎng)，如圖1所示。
將上述修飾胰島素用磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4)配成36IU/ml，加入一定量的胰蛋白酶(胰島素∶胰蛋白酶＝25∶1)，在37℃下保溫2h、4h、6h、8h、10h、12h，取體重約30g禁食12小時(shí)的昆明小鼠(每組不少于6只)，皮下注射0.1ml/只(0.6IU/kg體重)，尾靜脈采血，測(cè)定注射后40min的血糖值。體外抗酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所得修飾胰島素抵抗胰蛋白酶降解作用的能力提高，即使酶解12h仍然有一定的降糖作用；而未修飾的胰島素酶解4～6h生物活性喪失。如圖2所示。


圖1胰島素(Ins)和修飾胰島素(C17H33CO-Ins與C17H31CO-Ins)的降血糖作用縱坐標(biāo)為實(shí)測(cè)血糖平均值(P＜0.05)，單位為mmol/L；橫坐標(biāo)為時(shí)間，單位為分鐘(min)○標(biāo)記的曲線為空白組，●標(biāo)記的曲線為胰島素組，▲標(biāo)記的曲線為油酸修飾胰島素(C17H33CO-Ins)，■標(biāo)記的曲線為亞油酸修飾胰島素(C17H31CO-Ins)。
圖2酶解時(shí)間對(duì)胰島素(Ins)和修飾胰島素(C17H33CO-Ins與C17H31CO-Ins)降糖能力的影響 縱坐標(biāo)為相對(duì)降糖率(％)，橫坐標(biāo)為酶解時(shí)間，單位為小時(shí)(h)，●標(biāo)記的曲線為胰島素組，▲標(biāo)記的曲線為油酸修飾胰島素(C17H33CO-Ins)，■標(biāo)記的曲線為亞油酸修飾胰島素(C17H31CO-Ins)相對(duì)降糖率指已酶解的胰島素(或修飾胰島素)注射后40min引起的血糖降低值除以未酶解的胰島素(或修飾胰島素)注射后40min引起的血糖降低值。
具體實(shí)施例方式
例1油酸修飾胰島素(C17H33CO-Ins)的制備稱取56.4g油酸(0.2mol)，水浴加熱至50℃，滴加13.7g(0.1mol)三氯化磷，30min滴完，然后在60℃攪拌反應(yīng)5h。停止反應(yīng)后，分去下層亞磷酸。上層液體減壓蒸出過量三氯化磷，得淺棕色刺激性氣味液體即油酰氯，收率98.8％。
稱取0.595g苯并三唑(5mmol)溶于10ml無水乙醚，加入0.5g三乙胺(5mmol)。在10℃下緩慢滴加油酰氯1.55g(5.1mmol)，30min內(nèi)滴完。然后，繼續(xù)在15℃下攪拌反應(yīng)3h。反應(yīng)混合物過濾除去白色沉淀物。將澄清的濾液減壓蒸發(fā)至干。殘留物中加入5ml丙酮，冷卻至0℃，析出白色針狀結(jié)晶。過濾得白色針狀晶體0.6g，真空干燥至恒重，即油酰苯并三唑，產(chǎn)率31.5％。
在0℃下，將100mg豬胰島素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及0.7ml二次水的混合溶劑中，攪拌下加入0.08mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M油酰苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下攪拌反應(yīng)150min。停止反應(yīng)，向反應(yīng)混合物中加入22.5ml冰冷的丙酮，冷凍離心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷凍干燥，得白色粉狀物，即油酸?；葝u素C17H33CO-Ins。RP-HPLC測(cè)得C17H33CO-Ins的保留時(shí)間為13.5min。
例2亞油酸?；葝u素(C17H31CO-Ins)的制備稱取7g亞油酸(0.025mol)，水浴加熱至50℃，加入1.8g(0.013mol)三氯化磷，然后在55℃，攪拌反應(yīng)4.5h。停止反應(yīng)后，分去下層亞磷酸，得淺棕色刺激性氣味液體，即亞油酰氯。
稱取0.595g苯并三唑(5mmol)溶于10ml無水乙醚，加入0.5g三乙胺(5mmol)。在10℃下緩慢滴加亞油酰氯1.55g(5.1mmol)，30min內(nèi)滴完。然后，繼續(xù)在15℃下攪拌反應(yīng)3h。反應(yīng)混合物過濾除去白色沉淀物。將澄清的濾液減壓蒸發(fā)至干。殘留物中加入5ml丙酮，冷卻至0℃，析出白色針狀結(jié)晶。過濾得白色針狀晶體，真空干燥至恒重，即亞油酰苯并三唑。
在0℃下，將100mg豬胰島素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及0.7ml二次水的混合溶劑中，攪拌下加入0.08mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M亞油酰苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下攪拌反應(yīng)150min。停止反應(yīng)，向反應(yīng)混合物中加入22.5ml冰冷的丙酮，冷凍離心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷凍干燥，得白色粉狀物，即亞油酸?；葝u素C17H31CO-Ins。RP-HPLC測(cè)得C17H31CO-Ins的保留時(shí)間為15.3min。
例3亞油酸?；葝u素(C17H31CO-Ins)的制備稱取7g亞油酸(0.025mol)，水浴加熱至50℃，加入1.8g(0.013mol)三氯化磷，然后在60℃，攪拌反應(yīng)5h。停止反應(yīng)后，分去下層亞磷酸，得淺棕色刺激性氣味液體，即亞油酰氯。
稱取0.595g苯并三唑(5mmol)溶于10ml無水乙醚，加入0.5g三乙胺(5mmol)。在10℃下緩慢滴加亞油酰氯1.58g(5.2mmol)，30min內(nèi)滴完。然后，在15℃下繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h。反應(yīng)混合物過濾除去白色沉淀物。將澄清的濾液減壓蒸發(fā)至干。殘留物中加入7ml丙酮，冷卻至0℃，析出白色針狀結(jié)晶。過濾得白色針狀晶體，真空干燥至恒重，即亞油酰苯并三唑，產(chǎn)率約28％。
在0℃下，將100mg豬胰島素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及0.5ml二次水的混合溶劑中，攪拌下加入0.1mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M亞油酰苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下攪拌反應(yīng)180min。停止反應(yīng)，向反應(yīng)混合物中加入22.5ml冰冷的丙酮，冷凍離心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷凍干燥，得白色粉狀物，即亞油酸?；葝u素C17H31CO-Ins，收率96％。RP-HPLC測(cè)得C17H31CO-Ins的保留時(shí)間為15.3min。
例4亞油酸?；葝u素(C17H31CO-Ins)的制備稱取0.595g苯并三唑(0.005mol)溶于10ml無水乙醚，加入1.4g亞油酸。冰浴下，邊攪拌邊緩慢滴加1.04g(0.005mol)DCC的無水乙醚溶液。滴加完畢后，冰浴下繼續(xù)攪拌反應(yīng)3h。然后，升溫至20℃，繼續(xù)攪拌2h。停止反應(yīng)后，減壓過濾，濾除白色不溶物。將濾液減壓濃縮后，置冰箱冷凍，析出白色針狀結(jié)晶。過濾，得白色針狀晶體，真空干燥至恒重，即得亞油酰苯并三唑，產(chǎn)率約30％。
在0℃下，將100mg豬胰島素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及0.7ml二次水的混合溶劑中，攪拌下加入0.08mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M亞油酰苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下攪拌反應(yīng)120min。停止反應(yīng)，向反應(yīng)混合物中加入22.5ml冰冷的丙酮，冷凍離心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷凍干燥，得白色粉狀物，即亞油酸?；葝u素C17H31CO-Ins，收率95％。RP-HPLC測(cè)得C17H31CO-Ins的保留時(shí)間為15.3min。
例5亞油酸?；葝u素(C17H31CO-Ins)的制備按上例方法合成亞油酰苯并三唑。在0℃下，將100mg豬胰島素溶于1.5mlN-甲基吡咯烷酮及0.5ml二次水的混合溶劑中，攪拌下加入0.1mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M亞油酰苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下攪拌反應(yīng)150min。停止反應(yīng)，向反應(yīng)混合物中加入22.5ml冰冷的丙酮，冷凍離心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷凍干燥，得白色粉狀物，即亞油酸?；葝u素C17H31CO-Ins，收率95％。RP-HPLC測(cè)得C17H31CO-Ins的保留時(shí)間為15.3min。
例6花生四烯酸?；葝u素(C19H31CO-Ins)的制備稱取0.595g苯并三唑(5mmol)溶于10ml無水乙醚，加入1.52g花生四烯酸。冰浴下，邊攪拌邊緩慢滴加1.04g(0.005mol)DCC的無水乙醚溶液。滴加完畢后，冰浴下繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h。然后，升溫至20℃，繼續(xù)攪拌2h。停止反應(yīng)后，減壓過濾，濾除白色不溶物。將濾液減壓濃縮后，置冰箱冷凍，析出白色針狀結(jié)晶。過濾，得白色針狀晶體，真空干燥至恒重，即得花生四烯酰苯并三唑。
在0℃下，將100mg豬胰島素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及0.7ml二次水的混合溶劑中，攪拌下加入0.08mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M花生四烯酰苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下攪拌反應(yīng)180min。停止反應(yīng)，向反應(yīng)混合物中加入22.5ml冰冷的丙酮，冷凍離心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷凍干燥，得白色粉狀物，即花生四烯酸?；葝u素C19H31CO-Ins。RP-HPLC測(cè)得C19H31CO-Ins的保留時(shí)間為16.8min。
例7亞油酰甘氨酸?；葝u素(C17H31CONHCH2CO-Ins)的制備將1.5g(0.02mol)甘氨酸和0.8g(0.02mol)氫氧化鈉溶于15ml水，加入4倍體積的THF。在冰浴下，緩慢滴加亞油酰氯，同時(shí)緩慢滴加氫氧化鈉溶液，使反應(yīng)體系pH保持在8.5～9.5，加畢，攪拌反應(yīng)2h后，調(diào)溫至20℃，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h。停止反應(yīng)，用鹽酸酸化至pH2～3，加入30ml石油醚，分出水層。有機(jī)層冷卻結(jié)晶，過濾得亞油酰甘氨酸，產(chǎn)率約50％。
將1.68g(0.005mol)亞油酰甘氨酸溶于20mlTHF中，加入0.595g(0.005mol)苯并三唑，攪拌溶解。冰浴下，緩慢滴加1.04g(0.005mol)DCC的THF溶液。滴加完畢后，冰浴下繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h。然后，升溫至20℃，繼續(xù)攪拌3h。停止反應(yīng)后，減壓過濾，濾除白色不溶物。將濾液減壓濃縮后，冷卻結(jié)晶。過濾，得白色粉狀物，真空干燥至恒重，即得亞油酰甘氨酸苯并三唑，產(chǎn)率約30％。
在0℃下，將100mg豬胰島素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及0.7ml二次水的混合溶劑中，攪拌下加入0.08mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M亞油酰甘氨酸苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下攪拌反應(yīng)180min。停止反應(yīng)，向反應(yīng)混合物中加入30ml冰冷的丙酮，冷凍離心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷凍干燥，得白色粉狀物，即亞油酰甘氨酸酰化胰島素C17H31CONHCH2CO-Ins。RP-HPLC測(cè)得其保留時(shí)間為15.8min。
例8亞麻酰丙氨酸酰化胰島素(C17H29CONHCH(CH3)CO-Ins)制備將1.78g(0.02mol)丙氨酸和0.8g(0.02mol)氫氧化鈉溶于15ml水，加入4倍體積的THF。在冰浴下，緩慢滴加γ-亞麻酰氯，同時(shí)緩慢滴加氫氧化鈉溶液，使反應(yīng)體系pH保持在8.5～9.5，加畢，攪拌反應(yīng)2h后，調(diào)溫至20℃，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h。停止反應(yīng)，用鹽酸酸化至pH2～3，加入30ml石油醚，分出水層。有機(jī)層冷卻結(jié)晶，過濾得亞麻酰丙氨酸。
將0.87g(0.0025mol)亞麻酰丙氨酸溶于10mlTHF中，加入0.298g(0.0025mol)苯并三唑，攪拌溶解。冰浴下，緩慢滴加0.52g(0.0025mol)DCC的THF溶液。滴加完畢后，0℃下繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h。然后，升溫至20℃，繼續(xù)攪拌3h。停止反應(yīng)后，減壓過濾，濾除白色不溶物。將濾液減壓濃縮后，冷卻結(jié)晶。過濾，得白色粉狀物，真空干燥至恒重，即得亞麻酰丙氨酸苯并三唑。
在0℃下，將100mg豬胰島素溶于1.4mlN-甲基吡咯烷酮及0.7ml二次水的混合溶劑中，攪拌下加入0.08mlTEA。然后，一次性加入0.3ml0.1M亞麻酰丙氨酸苯并三唑的N-甲基吡咯烷酮溶液。0℃下攪拌反應(yīng)180min。停止反應(yīng)，向反應(yīng)混合物中加入30ml冰冷的丙酮，冷凍離心(-10℃，10000rpm)，去掉上清，沉淀物冷凍干燥，得白色粉狀物，即亞麻酰丙氨酸?；葝u素C17H29CONHCH(CH3)CO-Ins。RP-HPLC測(cè)得其保留時(shí)間為15.8min。
權(quán)利要求
1.一種化學(xué)修飾的胰島素，其化合物通式為CnH2(n-m)+1CO-Ins，式中CnH2(n-m)+1CO-為直鏈不飽和脂肪酸?；琻＝17、19、21，m＝1～6；Ins為胰島素。
2.按照權(quán)利要求1的化學(xué)修飾的胰島素，所說的直鏈不飽和脂肪酸酰基可以為下列不飽和脂肪酸之一油酸C17H33COOH、亞油酸C17H31COOH、亞麻酸C17H29COOH、花生四烯酸C19H31COOH、二十碳五烯酸C19H29COOH、二十二碳五烯酸C21H33COOH、二十二碳六烯酸C21H31COOH。
3.權(quán)利要求1的化學(xué)修飾胰島素的制備方法，合成路線和具體合成的步驟如下 ①將不飽和脂肪酸與滴加進(jìn)入的三氯化磷在50～60℃下攪拌反應(yīng)4～5小時(shí)，然后分液、上層液體蒸餾制得不飽和脂肪酰氯；②將苯并三唑溶于乙醚中，加入三乙胺，0～10℃下滴加不飽和脂肪酰氯，滴加完畢后，在15～20℃下攪拌反應(yīng)2～3小時(shí)；過濾、結(jié)晶即得不飽和脂肪酰苯并三唑(I)；③在0℃下將胰島素溶解在N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶劑中，再加入三乙胺；④將不飽和脂肪酰苯并三唑(I)溶解于N-甲基-吡咯烷酮中，將式(I)化合物的N-甲基-吡咯烷酮溶液加入到步驟③的胰島素溶液中，在0℃下攪拌反應(yīng)2～3小時(shí)；⑤向反應(yīng)混合物中加入丙酮至有沉淀生成，離心、干燥，即得到不飽和脂肪酸?；葝u素(II)。
4.按照權(quán)利要求3的化學(xué)修飾胰島素的制備方法，步驟①所述的PCl3的摩爾數(shù)為不飽和脂肪酸的1/2至2/3；步驟②所述的三乙胺與苯并三唑等摩爾；所述的不飽和脂肪酰氯的摩爾數(shù)為苯并三唑用量的1.02～1.05倍；步驟③所述的N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶劑，水的體積百分含量為25％～75％；所述的三乙胺摩爾數(shù)約為胰島素用量的30～50倍；步驟④所述的不飽和脂肪酰苯并三唑(I)的摩爾數(shù)為胰島素用量的2～3倍。
5.一種化學(xué)修飾的胰島素，其化合物通式為CnH2(n-m)+1CONHCHRCO-Ins式中CnH2(n-m)+1CO-為直鏈不飽和脂肪酸?；?，n＝17、19、21，m＝1～6；Ins為胰島素。
6.按照權(quán)利要求5的化學(xué)修飾的胰島素，所說的直鏈不飽和脂肪酸?；梢詾橄铝胁伙柡椭舅嶂挥退酑17H33COOH、亞油酸C17H31COOH、亞麻酸C17H29COOH、花生四烯酸C19H31COOH、二十碳五烯酸C19H29COOH、二十二碳五烯酸C21H33COOH、二十二碳六烯酸C21H31COOH；R為賴氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸的側(cè)鏈。
7.權(quán)利要求6的化學(xué)修飾胰島素的制備方法，合成路線和具體合成的步驟如下CnH2(n-m)+1CONHCHRCO-Ins的合成反應(yīng)式如下 (V)①將氨基酸溶于氫氧化鈉溶液，再加入上述溶液3～5倍體積的四氫呋喃，在0～10℃下，滴加不飽和脂肪酰氯，同時(shí)滴加0.1mol/L的氫氧化鈉或碳酸鈉溶液，控制體系pH值在8.5～10；滴完后，0～10℃攪拌反應(yīng)2小時(shí)后，升溫至20～30℃，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2～3小時(shí)；停止反應(yīng)后，用鹽酸酸化至pH2～3，加入與混合液等體積的石油醚，去水層，冷卻結(jié)晶，得不飽和脂肪酰氨基酸(III)；②將不飽和脂肪酰氨基酸(III)溶于四氫呋喃中，加入苯并三唑，攪拌溶解；冰浴下滴加二環(huán)己基碳二亞胺的四氫呋喃溶液，滴完后，0℃下繼續(xù)攪拌反應(yīng)2小時(shí)，升溫至20℃，繼續(xù)攪拌2～3小時(shí)；過濾，將濾液濃縮、結(jié)晶、干燥，即得不飽和脂肪酰氨基酸?；讲⑷?IV)；③在0℃下將一定量的胰島素溶解在N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶劑中，再加入三乙胺；④將摩爾數(shù)為胰島素用量2～3倍的不飽和脂肪酰氨基酸?；讲⑷?IV)溶解于N-甲基-吡咯烷酮中，將式(IV)化合物的N-甲基-吡咯烷酮溶液加入到上述胰島素溶液中，在0℃下攪拌反應(yīng)2～3小時(shí)；⑤加丙酮入反應(yīng)混合物至有沉淀生成，離心、干燥，得不飽和脂肪酰氨基酸?；葝u素(V)。
8.按照權(quán)利要求7的化學(xué)修飾胰島素的制備方法，步驟①所述的氫氧化鈉溶液、不飽和脂肪酰氯的用量等摩爾于氨基酸的用量；步驟②所述的苯并三唑和二環(huán)己基碳二亞胺的用量等摩爾于不飽和脂肪酰氨基酸(III)的用量；步驟③所述的N-甲基-吡咯烷酮和二次水的混合溶劑，水的體積百分含量為25％～75％；所述的三乙胺摩爾數(shù)為胰島素用量的30～50倍。
9.權(quán)利要求1和5的化學(xué)修飾胰島素在用于制備治療糖尿病的口服藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種可以用于治療糖尿病的口服藥物的不飽和脂肪酸或其衍生物修飾的胰島素及其制備方法。本發(fā)明旨在保護(hù)胰島素易被胰蛋白酶進(jìn)攻的位點(diǎn)，使胰島素能夠抵抗胰蛋白酶的降解作用。合成方法是采用化學(xué)修飾的方法在胰島素的合適部位共價(jià)結(jié)合一種不飽和脂肪酸或其衍生物。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，與胰島素相比，修飾胰島素不僅保持降糖活性，而且在被試驗(yàn)動(dòng)物的體內(nèi)持續(xù)作用時(shí)間延長(zhǎng)，抗胰蛋白酶降解的能力明顯提高。
文檔編號(hào)A61P3/00GK1528790SQ20031011124
公開日2004年9月15日 申請(qǐng)日期2003年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月17日
發(fā)明者黃開勛, 黃濤, 徐輝碧 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)