專利名稱：玉足海參多糖在制備抗凝血藥及血管生成抑制劑中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及中藥提取物的用途，尤其是涉及一種從玉足海參(Hojothurialeucospilota)中提取的多糖YC在制藥領域中的應用。
背景技術：
玉足海參(Hojothuria leucospilota)，又稱烏參。系廣東省、海南島一帶的民間藥。由玉足海參中提取的總多糖中分離純化得到的一種硫酸粘多糖(以下簡稱多糖YC)，其主要功能為滋陰養(yǎng)血，溫經通絡，補腎益精。對從玉足海參中提取的多糖(YC)在抗凝血、改善血液流變學及抑制血管生成方面的研究目前尚未見報道，臨床上也未見玉足海參多糖(YC)進行抗凝血，改善血液流變學及抗血管生成的應用。

發(fā)明內容
1.發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于提供玉足海參多糖YC的新用途，即在制藥領域中的新應用。
2.技術方案本發(fā)明涉及玉足海參多糖YC在制備抗凝血藥中的應用。
還涉及玉足海參多糖YC在制備血管生成抑制劑的藥中的應用。
為了更好地理解本發(fā)明的實質，下面將玉足海參多糖YC的藥理試驗及實驗結果來說明其在制藥領域中的新用途。
以下是玉足海參多糖YC抗凝作用及抗血管生成作用的研究，實驗方法及結果如下(1)取健康ICR小鼠按不同劑量(41.6mg/kg、10.4mg/kg、5.2mg/kg、2.6mg/kg、1.3mg/kg)尾靜脈注射玉足海參多糖YC，給藥30分鐘后眼眶取血，用玻片法和毛細管法同時測量其凝血時間，以41.6mg/kg劑量尾靜脈注射受試小鼠，其凝血時間均大于10分鐘，與對照組相比，均有顯著性差異(P＜0.01)。
(2)按不同劑量給家兔連續(xù)灌胃玉足海參多糖YC10天。于第10天給藥1h后，取動脈血，抗凝，分離血漿，測定白陶土部分凝血活酶時間(APTT)。有效劑量范圍為25～100mg/kg，結果表明，玉足海參多糖可以延長家兔白陶土部分凝血活酶時間，與對照組相比，有顯著性差異(P＜0.01)。
(3)按不同劑量給家兔連續(xù)灌胃玉足海參多糖YC10天。于第10天給藥1h后，取動脈血，抗凝，分離血漿，測定凝血酶原時間(PT)。有效劑量范圍為25～100mg/kg，結果表明，玉足海參多糖可以延長家兔凝血酶原時間，與對照組相比，有顯著性差異(P＜0.01)。
(4)按不同劑量給家兔連續(xù)灌胃玉足海參多糖YC10天。于第10天給藥1h后，取動脈血，抗凝，分離血漿，測定血漿復鈣時間。有效劑量范圍為25～100mg/kg，結果表明，玉足海參多糖可以延長家兔血漿復鈣時間，與對照組相比，有顯著性差異(P＜0.01)。
(5)按不同劑量給家兔連續(xù)灌胃玉足海參多糖YC10天。于第10天給藥1h后，取動脈血，抗凝，分離血漿，測定ADP和AA誘導的血小板聚集率。有效劑量范圍為25～100mg/kg，結果表明，多糖YC終濃度為41.48和20.74mg/kg兩個劑量均有抑制ADP誘導的體外血小板聚集的作用，與正常組比較有顯著性差異。當用大劑量時(154mg/kg)，對AA誘導的血小板聚集率有一定的抑制作用。
(6)按不同劑量給家兔連續(xù)灌胃玉足海參多糖YC10天。于第10天給藥1h后，取動脈血，用血栓儀測定5分鐘內體外血栓形成度。有效劑量范圍為25～100mg/kg，結果表明，多糖YC可以降低家兔體外形成血栓長度(P＜0.05)，減輕血栓濕重(P＜0.01)和干重(P＜0.01)。
(7)采用體外三位立體血管生成模型，向培養(yǎng)體系中加入不同濃度的玉足海參多糖YC，觀察玉足海參多糖YC對血管生成的作用。有效劑量范圍為1.7～166.7μg/ml。結果表明，玉足海參多糖YC能顯著抑制芽生高峰期時的芽生內皮細胞數，各給藥組管腔結構較正常組顯著減少，表明多糖YC有明顯的抗血管生成作用。
(8)采用[3H]摻入法測定玉足海參多糖YC對體外培養(yǎng)的內皮細胞的增殖有何作用。有效劑量范圍為10～500μg/ml。結果表明，各給藥組能顯著抑制人臍靜脈內皮細胞的DNA、RNA和蛋白質的合成，對內皮細胞增殖呈顯著的抑制作用。
3.有益效果(1)玉足海參多糖YC具有明顯的抗凝血作用。玉足海參多糖YC能顯著性延長APTT、PT、血漿復鈣時間、對血小板聚集也有一定抑制作用，能顯著性減少體外血栓的形成。其抗凝血作用呈良好的量效關系，且作用與肝素相似，表明玉足海參多糖YC可用于抗凝血。
(2)玉足海參多糖YC有抑制血管生成的作用。許多疾病與血管生成異常關系非常密切，如腫瘤生長與血管生成密切相關，F(xiàn)olkman等認為腫瘤一旦出現(xiàn)，其體積增加之前必然伴隨會聚于該腫瘤的新生血管的增加；患有視網膜病變的糖尿病病人視網膜上的血管是增生的。此外，諸如關節(jié)炎、牛皮癬等疾病也與血管生成過度相關。實驗結果顯示，大鼠主動脈環(huán)在玉足海參多糖YC的作用下，血管生成明顯被抑制(P＜0.05，P＜0.01)。進一步的研究表明，玉足海參多糖YC還能夠顯著性抑制體外培養(yǎng)的內皮細胞的增殖。實驗結果顯示，玉足海參多糖YC可以通過抑制內皮細胞增殖來抑制血管生成。
具體實施例方式
本發(fā)明的有益效果可以通過以下實施例作進一步說明實施例1.玉足海參多糖YC抗凝作用研究。
(一)玉足海參多糖YC對小鼠凝血時間的影響。
1.實驗材料動物ICR小鼠，由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。
試劑生理鹽水、玉足海參多糖YC2.實驗方法與結果取健康ICR小鼠55只，隨機分成6組，除最大劑量組為5只外其余每組各10只。玉足海參多糖YC組尾靜脈注射(41.6mg/kg、10.4mg/kg、5.2mg/kg、2.6mg/kg、1.3mg/kg)給予YC、正常組尾靜脈注射等體積生理鹽水。每只受試小鼠用玻片法及毛細管法測凝血時間，給藥組與正常組比較，并根據所得數據畫出量效關系圖。
玉足海參多糖YC以41.6mg/kg劑量尾靜脈注射，5只受試小鼠用玻片法及毛細管法所測凝血時間均＞10分鐘(其中一只死亡)，除了最小劑量1.3mg/kg外，其余各組玻片法和毛細管法所測凝血時間與對照組相比，均有顯著性差異(P＜0.01)。見表1和

圖1。
表1玉足海參多糖YC對小鼠凝血時間的影響(X±SD，n＝10)組別 劑量 毛細管法(秒) 玻片法(秒)生理鹽水組10ml/kg 107±76.8 125.2±71.5玉足海參多糖YC41.6mg/kg600±0**600±0**10.4mg/kg446.8±247.6**389.1±242.1**5.2mg/kg 422.4±190.2**420.8±199.5**2.6mg/kg 331.3±174.8**358±194.9**1.3mg/kg 113.1±59.6 172.9±140.7注與對照組相比，**P＜0.01。玉足海參多糖YC41.6mg/kg劑量組的小鼠數n＝5。
(二)玉足海參多糖對家兔白陶土部分凝血活酶時間的影響(APTT)1.實驗材料動物青紫蘭家兔，由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。
試劑生理鹽水、玉足海參多糖YC、阿斯匹靈、白陶土2.實驗方法與結果取家兔24只，隨機分為4組，按5ml/kg連續(xù)灌胃10天。于第10天給藥1h后，頸動脈放血。以1.34％草酸鈉按9∶1抗凝采血，混勻后3000rpm離心10min，分離血漿備用。取試管5只，每管中加入充分混勻的白陶土部分凝血活酶和血漿各0.1ml搖勻，37℃水浴中孵育3min，其間輕輕振搖試管，再加入已加溫到37℃的0.025mol/L氯化鈣溶液0.1ml，同時開始計時，每隔15s取出試管輕輕傾斜，直到自陶土顆粒聚集變粗，凝固成塊為止。
表2.玉足海參多糖對家兔白陶土部分凝血活酶時間的影響(X±SD，n＝6)組別給藥途徑劑量(mg/kg×d) 白陶土部分凝血活酶時間(S)對照組 ig 等體積蒸餾水23.08±7.86YC組ig 100×10 37.25±5.91**YC組ig 25×10 42.00±6.96**阿司匹林組 ig 82×10 35.17±3.95**與對照組比較**P＜0.01結果表明，玉足海參多糖可以延長家兔白陶土部分凝血活酶時間(P＜0.01)。
(三)玉足海參多糖對家兔凝血酶原時間的影響(PT)1.實驗材料動物青紫蘭家兔，由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。
試劑生理鹽水、玉足海參多糖、阿斯匹靈、氯化鈣2.實驗方法與結果取家兔24只，分組及給藥同前。于第10天給藥1h后頸動脈放血，以3.8％枸椽酸鈉按9∶1抗凝采血，混勻后3000rpm離心10min，分離血漿備用。取試管3支，先加入凝血活酶和0.025mol/L氯化鈣各0.1ml，再加入血漿0.1ml，混勻后立即放入37℃水浴中溫育，同時開始計時，每隔2～3s傾斜試管1次，記錄纖維蛋白凝固液面不動所需時間。
表3.玉足海參多糖對家兔凝血酶原時間的影響(X±SD，n＝6)組別給藥途徑劑量(mg/kg×d) 凝血酶原時間(s)對照組 ig 等體積蒸餾水 13.88±0.96YC組ig 100×1029.90±3.82**YC組ig 25×10 25.40±7.00**阿司匹林組 ig 82×10 21.93±1.78**與對照組比較**P＜0.01結果表明，玉足海參多糖可以延長家兔凝血酶原時間(P＜0.01)。
(四)玉足海參多糖YC對家兔復鈣時間的影響1.實驗材料動物青紫蘭家兔，由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。
試劑生理鹽水、玉足海參多糖YC、阿斯匹靈2.實驗方法與結果取家兔24只，分組及給藥同前。于第10天給藥1h后頸動脈放血，以3.8％枸椽酸鈉按9∶1抗凝采血，混勻后3000rpm離心10min，分離血漿備用。取試管3支，每管各先加入血漿0.1ml，隨即放入37℃水浴中溫育1分鐘，然后加入0.025mol/L氯化鈣各0.1ml，混勻后再次放入37℃水浴中溫育，同時開始計時，每隔2～3s傾斜試管1次，記錄纖維蛋白凝固液面不動所需時間。
表4.玉足海參多糖對家兔復鈣時間的影響(X±SD，n＝10)組別給藥途徑劑量(mg/kg×d) 時間(s)對照組 ig 等體積生理鹽水 23.83±5.53YC組ig 100×10 47.67±7.93**YC組ig 25×10 46.00±8.15**阿司匹林組 ig 82×10 43.50±3.89**與對照組比較**P＜0.01結果顯示，玉足海參多糖YC多糖可以顯著延長家兔復鈣時間(P＜0.01)。
(五)玉足海參多糖YC對ADP和AA誘導的家兔血小板聚集的影響1.實驗材料動物青紫蘭家兔，由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。
試劑生理鹽水、玉足海參多糖YC、阿斯匹靈、ADP、AA2.實驗方法與結果青紫蘭家兔用普魯卡因頸部局部麻醉，頸動脈插管放血，3.8％的枸櫞酸鈉1∶9抗凝，以800r/min離心10min，取富血小板血漿(PRP)，剩余部分以3000r/min離心10min，取貧血小板血漿(PPP)，聚集誘導劑用ADP(濃度40nmol/L)和AA(濃度2mg/ml)，每管PRP中加入不同藥物10μl，對照的PRP中加入緩沖液10μl，相對的PPP管中則加入相應的藥物，37℃溫育5分鐘，然后按文獻方法用PAPER-I型血小板聚集及血凝測定儀檢測血小板聚集率。
(1)ADP誘導的血小板聚集率的影響結果玉足海參多糖YC終濃度為41.48和20.74μg/ml兩個劑量均有抑制ADP誘導的體外血小板聚集的作用，與正常組比較差異有高度顯著性，二個陽性對照藥也有抑制血小板聚集的作用，其中又以脈絡寧為最強(見表5)。
表5玉足海參多糖YC對ADP誘導的家兔體外血小板聚集率的影響(X±SD)組別 終濃度例1min聚集率 最大聚集率 5min聚集率 抑制率(μg/ml) 數(％) (％) (％) (％)正常 等容積1229.33±2.9338.51±3.98 32.63±7.86脈絡寧100％ 6 3.67±1.51②5.72±1.79②0.33±0.82②85.15肝素鈉18.52 6 19.50±2.88②22.17±2.56②16.67±4.27②42.43玉足多糖 41.48 6 19.33±1.97②③23.17±2.62②③20.33±2.58②③39.8320.74 6 21.67±0.52②③25.90±2.63②③18.33±2.88②③32.7512.96 6 30.00±4.60 34.97±4.14 29.17±4.75 9.19注與正常組比較①P＜0.05，②P＜0.01；與12.96μg/ml劑量組比較③P＜0.01(下同)。
(2)AA誘導的家兔體外血小板聚集率的影響結果提示玉足海參多糖YC在終濃度為41.48μg/ml和低分子肝素鈉在18.52μg/ml時對AA誘導的體外血小板聚集均未見明顯的抑制作用，在加大劑量后玉足海參多糖YC(154.1μg/ml)和低分子肝素鈉(148.1μg/ml)才表現(xiàn)出微弱的抑制作用。脈絡寧注射液則對AA誘導的體外血小板聚集有明顯的抑制作用(見表6)。
表6玉足海參多糖YC對AA誘導的家兔體外血小板聚集率的影響(X±SD)組別終濃度例 1min聚集率 最大聚集率 5min聚集率抑制率(μg/ml) 數 (％) (％) (％) (％)正常等容積832.88±3.8351.59±2.64 51.59±2.64脈絡寧 25％ 59.80±2.78②18.94±8.24②15.20±9.73②63.29肝素鈉 148.1 631.00±1.1648.05±4.10①48.05±4.10①6.8618.52 525.20±5.59①50.00±3.3550.00±3.35 3.08YC組154.1 628.75±3.9545.70±5.08①45.70±5.08①11.4241.8 527.20±3.90①50.02±2.9550.02±2.95 3.04實驗結果提示玉足海參多糖YC對弱誘導劑ADP誘導的體外血小板聚集有一定的抑制作用，而對強誘導劑AA誘導的血小板聚集抑制作用不明顯，說明本品抑制血小板聚集的作用較弱。
(六)玉足海參多糖YC多糖對家兔體外血栓形成的影響1.實驗材料動物青紫蘭家兔，由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。
試劑生理鹽水、玉足海參多糖YC、阿斯匹靈2.實驗方法與結果青紫蘭家兔用普魯卡因頸部局部麻醉，頸動脈插管放血，3.8％的枸櫞酸鈉1∶9抗凝，以800r/min離心10min，取富血小板血漿(PRP)，剩余部分以3000r/min離心10min，取貧血小板血漿(PPP)，聚集誘導劑用ADP(濃度40nmol/L)和AA(濃度2mg/ml)，每管PRP中加入不同藥物10μl，對照的PRP中加入緩沖液10μl，相對的PPP管中則加入相應的藥物，37℃溫育5分鐘，然后按文獻方法用PAPER-I型血小板聚集及血凝測定儀檢測血小板聚集率。
表7.玉足海參多糖YC對家兔體外血栓形成的影響(X±SD，n＝6)組別劑量(mg/kg×d) 長度(cm) 濕重(g)干重(mg)對照組 等體積生理鹽水 11.58±3.44 0.4597±0.082 122.33±48.45YC組100×10 6.23±2.61*0.1663±0.078**26.62±22.69**YC組25×10 7.03±3.13**0.1998±0.0086***19.45±18.31**阿司匹林組 82×10 3.47±2.09**0.1093±0.0082***18.98±21.69***與對照組比較*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001結果表明，玉足海參多糖YC可以降低家兔體外形成的血栓長度(P＜0.05)，減輕血栓濕重(P＜0.01)和干重(P＜0.01)。
實施例2.玉足海參多糖YC抗血管生成作用研究方法及劑量如下1.實驗材料動物雄性SD大鼠，由南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供試劑M199培養(yǎng)基、堿性成纖維母細胞生長因子(bFGF)、Fibrinogen、烏拉坦、玉足海參多糖YC器械手術器械、高壓滅菌鍋、培養(yǎng)皿、48空培養(yǎng)板、超凈工作臺、恒溫細胞培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡2.實驗方法及結果取8～12周齡的SD雄性大鼠2只，烏拉坦麻醉后打開胸腔，剪取胸主動脈。在預冷的PBS液中分離除去血管外組織并洗去管內淤血，將動脈條剪成1mm后的動脈環(huán)備用。吸取400μl用M199配制的Fibrinogen，加2μl 25U/ml的thrombin混勻后立即加入到48孔板內，放入血管環(huán)。待膠凝固后加入600μ1的無血清M199培養(yǎng)基。給藥組培養(yǎng)基由550μl無血清M199培養(yǎng)基加50μl藥液組成；聯(lián)合給藥組則由500μl無血清M199培養(yǎng)基加50μl A藥及50μl B藥組成。隔天換液并計數芽生細胞數及管腔結構數，作統(tǒng)計學處理。
結果顯示，玉足海參多糖YC能夠顯著性抑制芽生高峰期(7day)時的芽生內皮細胞數。各給藥組管腔結構較正常組顯著減少，見表8和表9。表明玉足海參多糖YC有明顯的抗血管生成作用。
表8玉足海參多糖YC對芽生內皮細胞數的影響組別 劑量 3day 5day 7day正常組等量培養(yǎng)基 1.52±1.152.72±1.61 2.82±1.84bFGF組41.7ng/ml 2.01±1.443.61±2.03*3.64±1.37*YC大劑量組166.7μg/ml1.34±1.042.36±1.66 2.23±1.26YC中劑量組16.7μg/ml 1.22±0.682.63±1.43 1.90±0.91**YC小劑量組1.7μg/ml 1.23±0.872.58±1.85 1.77±1.12**與對照組比較*p＜0.05 **P＜0.01表9玉足海參多糖YC對管腔結構數的影響組別劑量 7day 9day 11day 13day 15day正常組 等量培養(yǎng)基 1.12±0.72 1.42±0.82 1.44±0.75 1.27±0.721.13±0.54bFGF組 41.7ng/ml1.24±0.62 1.47±0.79 1.46±0.68 1.61±0.80*1.32±0.67YC大劑量組 166.7μg/ml 0.84±0.42*0.85±0.34***0.89±0.36***0.88±0.33**0.82±0.25**YC中劑量組 16.7μg/ml 0.82±0.32*0.86±0.40***0.87±0.37***0.85±0.31**0.80±0.32**YC小劑量組 1.7μg/ml0.84±0.35*1.03±0.45*0.93±0.44**0.97±0.480.96±0.48與對照組比較*p＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.01實施例3.玉足海參多糖YC抑制體外培養(yǎng)的內皮細胞的增殖作用的研究。
1.實驗材料細胞株HUVEC(人臍靜脈內皮細胞)試劑1640培養(yǎng)基、堿性成纖維母細胞生長因子(bFGF)、[3H]-TdR、[3H]-UdR、[3H]-Leu、玉足海參多糖YC器械計數器、烘箱、96孔細胞培養(yǎng)板、倒置顯微鏡2.實驗方法及結果取對數生長期的HUVEC細胞，消化計數，配成4×104個/毫升的細胞懸液，以0.2ml/孔接種于96孔板，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時。棄上清，換含不同藥物濃度的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時。在終止作用前6小時加放射性同位素0.5μGi/孔，6小時后棄去培養(yǎng)液，每孔加0.1ml消化液，于37℃消化30分鐘。用多頭細胞樣品收集器將每孔細胞分別收集于醋酸纖維濾膜上，蒸餾水沖洗20次。取下此膜，置80℃烘箱中干烤15分鐘。置閃爍杯中，加閃爍劑4ml。暗處放置15分鐘后測cpm值，計算藥物對內皮細胞增殖的影響。
結果發(fā)現(xiàn)，各給藥組能顯著性抑制HUVEC的DNA、RNA及蛋白質的合成，對內皮細胞增殖呈顯著的抑制作用，見表10。
表10玉足海參多糖YC多糖對內皮細胞增殖的影響(X±SD，n＝4)組別 劑量 DNA RNA 蛋白質正常組等量培養(yǎng)基781.9±192.28675.3±82.89 4249.4±468.5725ng/ml 915.0±358.84992.2±31.36***4572.7±369.87bFGF組50ng/ml 1280.9±325.07*1080.0±71.90***5195.6±214.81*100ng/ml 1121.9±178.12*978.4±61.39**5143.9±308.16*1μg/ml 748.8±213.20748.6±74.87 3546.3±778.67YC組 10μg/ml 477.6±57.62*710.0±55.54 3207.0±236.83**100μg/ml 393.9±126.69*466.9±84.81*3404.4±234.47*500μg/ml 371.7±73.01**420.3±56.20**2963.7±169.16**與對照組比較*p＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.00權利要求
1.玉足海參多糖YC在制備抗凝血的藥中的應用。
2.玉足海參多糖YC在制備用于血管生成抑制劑的藥中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從玉足海參(Hojothurialeucospilota)中提取的總多糖中分離純化得到的一種硫酸粘多糖(YC)在制藥領域中的新用途。該多糖具有明顯的抗凝血、抑制血小板聚集、抗血栓作用，表現(xiàn)為玉足海參硫酸粘多糖對小鼠凝血時間影響的量效關系明顯；能顯著性延長家兔白陶土部分凝血活酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)、家兔復鈣時間；能顯著性抑制ADP誘導的家兔體外血小板聚集，顯著減少家兔體外血栓的形成，改善血液流度學，同時還具有顯著性抑制血管的芽生及血管網絡的形成、抑制內皮細胞增殖的作用，從而抑制體外血管的生成?？捎糜诳鼓?，血液流變異常及血管生成增多密切相關疾病的防治。
文檔編號A61P7/00GK1554360SQ20031011271
公開日2004年12月15日 申請日期2003年12月22日 優(yōu)先權日2003年12月22日
發(fā)明者陸茵, 王愛云, 陳文星, 孟政杰, 趙萬洲, 陸 茵 申請人:南京中醫(yī)藥大學