專利名稱：一種含豬免疫球蛋白的口服藥物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種口服藥物制劑，尤其是預(yù)防和治療病毒性或/和細(xì)菌感染性疾患的口服藥物制劑。
背景技術(shù)：
病毒性或/和細(xì)菌感染性疾患一般是用抗生素類(lèi)藥物治療，該類(lèi)藥物易產(chǎn)生抗藥性，有的藥物，例如青霉素對(duì)一些人易引起過(guò)敏，嚴(yán)重的可能會(huì)致命。
早在18世紀(jì)，人們就發(fā)現(xiàn)母乳喂養(yǎng)的嬰兒比人工喂養(yǎng)者對(duì)胃腸道等疾病有較強(qiáng)的抵抗力。20世紀(jì)初，進(jìn)一步的研究將此現(xiàn)象解釋為母乳中含有豐富的免疫球蛋白(Immunoglobulin，簡(jiǎn)稱lg)，其含有IgA及少量的IgM。由于IgA，IgM均具有J鏈，能接納分泌片，分泌片是由粘膜上皮細(xì)胞合成，可保護(hù)球蛋白免遭多種蛋白酶的水解破壞而且耐酸耐堿，并且能穿透組織，所以可被嬰兒吸收，增強(qiáng)抗病能力。1981年上海兒科研究所和新華醫(yī)院將人乳制備成霧化劑“乳清液”，治療嬰幼兒呼吸道合胞病毒性肺炎，每日劑量2mg干凍乳清液，并以抗生素作對(duì)照，取得滿意的療效。
除了在人乳中，免疫球蛋白Ig還存在于人血中。常規(guī)使用的人丙球、人胎球的血制品都具有增加機(jī)體免疫能力，可用于防治人類(lèi)傳染性疾病。但是這類(lèi)制劑通常是以注射方式給藥，如頗為臨床重視的藥物——人丙種球蛋白注射劑，血制品以注射方式給藥已成為血源性感染的主要途徑。而且，這類(lèi)制劑的免疫球蛋白成分單一，主要為IgG，而免疫活力最高的IgM含量極少，因而藥劑的效果不是最優(yōu)。另外，來(lái)源于人血的材料通常不易獲得，所以藥劑的成本很高。
美國(guó)專利3,903,262和4,186,192中制備的牛血漿免疫球蛋白給乳兒服用，結(jié)果表明其對(duì)鏈球菌有免疫調(diào)理作用，可有效地控制鏈球菌的感染。至今為止尚無(wú)有關(guān)豬血清免疫球蛋白的研究報(bào)告。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服已有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種成本低廉、不會(huì)引起人類(lèi)血源性感染、安全、無(wú)毒的、免疫性能好的、不會(huì)產(chǎn)生抗藥性或引起過(guò)敏的、預(yù)防和治療病毒性或/和細(xì)菌感染性疾患的口服藥物制劑。
本發(fā)明的目的是通過(guò)提供含豬免疫球蛋白的口服藥物制劑來(lái)達(dá)到的。我國(guó)是養(yǎng)豬大國(guó)，豬的來(lái)源廣。豬血清中的IgG含量(49.0％)雖然低于人(78.9％)的1.6倍，但I(xiàn)gM含量(30.2％)高于人(7.9％)的3.8倍，IgA的含量(20.7％)高于人(13.2％)的1.6倍。將豬血進(jìn)行綜合利用，提取豬免疫球蛋白制備本發(fā)明的口服藥物制劑，克服了人血制品及以注射方式給藥存在的容易造成血源性感染、免疫活力最高的IgM含量極少、以及人血的材料通常不易獲得，藥劑成本高的缺陷，也克服了抗生素藥易導(dǎo)致抗藥性和可能引起過(guò)敏的弊端。
本發(fā)明提供的一種口服藥物制劑，含有一種豬免疫球蛋白。所述的豬免疫球蛋白可以按照常規(guī)或已知的方法從豬血清中分離出的具有生物活性的豬免疫球蛋白。
所述的豬免疫球蛋白可以通過(guò)包括以下步驟的方法制得(1)分離血清按照常規(guī)方法從豬血中分離出血清；(2)除雜蛋白按照常規(guī)或已知方法從步驟(1)所得的血清中除去雜蛋白；(3)濃縮及病毒滅活用常規(guī)或已知的方法將步驟(2)所得物濃縮除去小分子雜質(zhì)并進(jìn)行病毒滅活，即得豬免疫球蛋白。
所述步驟(1)可以采用靜置或離心分離的方法，例如在4～10℃下靜置豬血，收集上清液，或在2～8℃下以3000～6000rpm的轉(zhuǎn)速離心5～30分鐘，收集血清。
所述步驟(2)采用常規(guī)或已知的方法在保持豬免疫球蛋白生物活性的條件下，除去雜蛋白。所述的常規(guī)方法包括利用利凡諾除去雜蛋白的利凡諾法。
采用利凡諾法去除雜蛋白，是利用利凡諾與雜蛋白結(jié)合形成沉淀，以達(dá)到除去雜蛋白的目的。該方法可以包括以下步驟(i)加入利凡諾于所述步驟(1)得到的血清中依次加入血清體積30～100v％的注射用水(或蒸餾水)，血清體積30～100v％的、濃度為1～10wt％的利凡諾液，血清體積0.01～0.5v％的辛酸，將混合液攪拌均勻，靜置5～30分鐘，除去上浮物；(ii)除去利凡諾將上述步驟所得物離心分離，除去沉淀，例如，在2～8℃條件下以3000～6000rpm的轉(zhuǎn)速離心5～30分鐘；將所得上清液加入吸附劑以吸附剩余的利凡諾，攪拌均勻后，過(guò)濾除去吸附劑。
所述的吸附劑可以是通常用于吸附利凡諾的吸附劑，例如，活性炭或硅藻土。所述吸附劑的用量以使所述上清液中剩余的利凡諾含量可達(dá)到藥學(xué)上常規(guī)指標(biāo)為宜，例如，可加入上清液質(zhì)量0.01～0.1wt％的活性炭。
所述步驟(3)可以采用常規(guī)或已知的方法對(duì)步驟(2)所得蛋白進(jìn)行濃縮，可以采用常規(guī)的超濾膜包超濾濃縮，去除水和鹽及其他小分子化合物。所述的超濾膜包可以用通常用來(lái)分離蛋白等大分子物質(zhì)與水、鹽及其他小分子化合物的超濾膜包，例如截流分子量為5萬(wàn)至10萬(wàn)的超濾膜包。所述的超濾濃縮步驟可進(jìn)行一次或一次以上的多次。在所述的超濾濃縮前或一次超濾濃縮后可按照常規(guī)方法對(duì)濃縮所得物進(jìn)行病毒滅活，例如，將濃縮所得物以50～100K超濾膜包超濾濃縮至蛋白濃度為2.0～4.0g/100ml，在40～70℃水浴中加熱6～15小時(shí)；病毒滅活后所得物可再進(jìn)行所述的超濾膜包超濾濃縮，即得豬免疫球蛋白原液。
在分離豬免疫球蛋白的過(guò)程中，含豬免疫蛋白的液體的pH值可保持在6.0～8.0，優(yōu)選6.4～7.4。如需要時(shí)，可加入調(diào)節(jié)pH值的常規(guī)物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)pH值。
本發(fā)明提供的口服藥物制劑可以由豬免疫球蛋白加入注射用水(或蒸餾水)，經(jīng)按照常規(guī)方法除菌過(guò)濾、分裝制得。本發(fā)明提供的口服藥物制劑中，豬免疫球蛋白的含量可以按照口服所需劑量調(diào)節(jié)，例如，可以是1.0～99.9g/100ml，優(yōu)選1.0～50g/100ml，更優(yōu)選1.5～25g/100ml。
本發(fā)明提供的口服藥物制劑還可以含有藥學(xué)上可用的輔料。所述的藥學(xué)上可用的輔料包括可穩(wěn)定豬免疫球蛋白的物質(zhì)，可調(diào)節(jié)本發(fā)明口服藥物制劑pH值的緩沖液，以及藥學(xué)上可用的防腐劑。還可包括可調(diào)節(jié)本發(fā)明口服藥物制劑口味的物質(zhì)。所述可穩(wěn)定豬免疫球蛋白的物質(zhì)可以是在藥學(xué)上通常用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的物質(zhì)，例如山梨醇、甘油等。所述可調(diào)節(jié)本發(fā)明口服藥物制劑口味的物質(zhì)可以是在藥學(xué)上通常用于調(diào)節(jié)口服劑口味的物質(zhì)，例如山梨醇、甘油等。所述可調(diào)節(jié)本發(fā)明口服藥物制劑pH值的緩沖液，可以是藥學(xué)上通常使用的緩沖液，例如磷酸鹽緩沖液。所述可調(diào)節(jié)本發(fā)明口服藥物制劑pH值的緩沖液最好是所調(diào)節(jié)的pH值范圍為6.4～7.4。所述的防腐劑是藥學(xué)上通常使用的防腐劑，例如丁香油。
所述輔料可以先混合、滅菌后，直接加入豬免疫球蛋白原液中混合后，再加入注射用水(或蒸餾水)；也可以加入豬免疫球蛋白與注射用水(或蒸餾水)的混合液中；還可以先與注射用水(或蒸餾水)混合，再加入豬免疫球蛋白。所得含豬免疫球蛋白、輔料與水的混合物經(jīng)按照常規(guī)方法除菌過(guò)濾、分裝制得本發(fā)明提供的口服藥物制劑。所述各輔料也可以在滅菌后，在加入水，加入豬免疫球蛋白原液與注射用水(或蒸餾水)混合物，或加入豬免疫球蛋白原液的不同順序的步驟之中或之間分別加入。所述滅菌的方法可以是常規(guī)的滅菌方法。
在制備本發(fā)明的含豬免疫球蛋白的口服藥物制劑的過(guò)程中，含豬免疫球蛋白的液體的pH值可保持在6.0～8.0，優(yōu)選6.4～7.4。
本發(fā)明提供的口服藥物制劑可作預(yù)防和治療病毒性或/和細(xì)菌感染性疾患的口服藥物。所述的病毒性或/和細(xì)菌感染性疾患包括病毒性感冒，流感，麻疹，腹瀉，尤其是人輪狀病毒腹瀉，腮腺炎等疾患。
與已有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的含豬免疫球蛋白的口服藥物制劑有許多優(yōu)益之處。本發(fā)明藥物制劑是以口服方式給藥，不會(huì)引起人類(lèi)血源性感染的，且安全，無(wú)毒，不引起過(guò)敏癥。與成分單一的人丙球蛋白、人胎球蛋白不同，本發(fā)明提供的口服藥物制劑中含有三種免疫球蛋白IgIgM、IgA和IgG，其中除IgG的含量比人血清中的含量低外，另外兩種免疫球蛋白均比人血清中的含量高，尤其是免疫活力最高的IgM，其含量高于人3.8倍，IgA含量高于人1.6倍，因而藥效高，適用于防治多種病毒性或/和細(xì)菌感染性疾病。本發(fā)明提供的含豬免疫球蛋白的口服藥物制劑成本低，克服了人血的材料通常不易獲得，由人血制備免疫球蛋白制劑成本高的缺陷，也不存在抗生素藥易導(dǎo)致抗藥性和可能引起過(guò)敏的弊端。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明口服藥物制劑不受胃液破壞，在腸中穩(wěn)定6小時(shí)以上，足以充分發(fā)揮藥效；口服后，Ig能在消化道粘膜面中留存，可阻止病原微生物向宿主細(xì)胞粘附，擔(dān)負(fù)著局部屏障作用而具有抗感染能力。本發(fā)明口服藥物制劑對(duì)多種細(xì)菌有凝集作用，凝集活性與人體丙種球蛋白相近；對(duì)小鼠痢疾桿菌及綠膿桿菌的感染模型有較好的治療作用；對(duì)人輪狀病毒感染的細(xì)胞株有抑制細(xì)胞病變(CPE)的抗病毒作用；對(duì)人輪狀病毒腸炎有明顯療效。
具體實(shí)施例方式
下面將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，這些描述并不是對(duì)本發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步的限定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，對(duì)本發(fā)明內(nèi)容所作的等同替換，或相應(yīng)的改進(jìn)，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1、制備本發(fā)明口服藥物制劑Y-1將新鮮豬血10000g在2℃條件下以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，收集血清約4500g；向得到的血清中依次加入血清體積30v％的注射用水，血清體積30v％的、濃度為1％的利凡諾液，血清體積0.01v％的辛酸，將混合液攪拌均勻，靜置5分鐘，除去上浮物；將得到的清液在2℃條件下以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，除去沉淀；向上清液中加入上清液質(zhì)量0.01wt％的活性炭，攪拌均勻后，過(guò)濾；將濾液以80K超濾膜包超濾濃縮至蛋白濃度為2.0g/100ml，在40℃水浴中加熱15小時(shí)；將所得液以100K超濾膜包再進(jìn)行超濾濃縮，除菌過(guò)濾后，得到35g免疫球蛋白原液，本發(fā)明口服藥物制劑Y-1。
實(shí)施例2、制備本發(fā)明口服藥物制劑Y-2將新鮮豬血10000g在8℃條件下以6000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，收集血清約4600g；向得到的血清中依次加入血清體積100v％的注射用水，血清體積100v％的、濃度為10％的利凡諾液，血清體積0.5v％的辛酸，將混合液攪拌均勻，靜置30分鐘，除去上浮物；將得到的清液在8℃條件下以6000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，除去沉淀；向上清液中加入上清液質(zhì)量0.1wt％的活性炭，攪拌均勻后，過(guò)濾；將濾液以50K超濾膜包超濾濃縮至蛋白濃度為4.0g/100ml，在70℃水浴中加熱6小時(shí)；將所得液以100K超濾膜包再進(jìn)行超濾濃縮，除菌過(guò)濾后，得到35g免疫球蛋白原液，得到本發(fā)明口服藥物制劑Y-2。
實(shí)施例3、制備本發(fā)明口服藥物制劑Y-3將新鮮豬血10000g在6℃條件下以4500rpm的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，收集血清約4400g；向得到的血清中依次加入血清體積60v％的注射用水，血清體積60v％的、濃度為5％的利凡諾液，血清體積0.2v％的辛酸，將混合液攪拌均勻，靜置15分鐘，除去上浮物；將得到的清液在6℃條件下以4500rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，除去沉淀；向上清液中加入上清液質(zhì)量0.05wt％的活性炭，攪拌均勻后，過(guò)濾；將濾液以100K超濾膜包超濾濃縮至蛋白濃度為3.0g/100ml，在60℃水浴中加熱10小時(shí)；將所得液以80K超濾膜包再進(jìn)行超濾濃縮，除菌過(guò)濾后，得到35g免疫球蛋白原液，本發(fā)明口服藥物制劑Y-3。
實(shí)施例4、制備本發(fā)明口服藥物制劑K-1、K-2、K-3、K-4、K-5將實(shí)施例1制得的豬免疫球蛋白原液分別用注射用水稀釋至含豬免疫球蛋白1.0g/100ml、2.0g/100ml、5.0g/100ml、10.0g/100ml、50.0g/100ml，除菌過(guò)濾后，制得本發(fā)明口服藥物制劑K-1、K-2、K-3、K-4、K-5。
實(shí)施例5、制備本發(fā)明口服藥物制劑K-6、K-7、K-8、K-9、K-10將實(shí)施例3制得的豬免疫球蛋白原液分別加入80％山梨醇、甘油、0.04M磷酸鹽緩沖液以體積比10∶4∶25組成的輔料后，再加入10倍于80％山梨醇體積比的注射用水，將其稀釋至含豬免疫球蛋白1.0g/100ml、2.0g/100ml、5.0g/100ml、10.0g/100ml、50.0g/100ml，除菌過(guò)濾后，制得本發(fā)明口服藥物制劑K-6、K-7、K-8、K-9、K-10。
實(shí)施例6、制備本發(fā)明口服藥物制劑K-11取100ml的80％山梨醇、40ml甘油、250ml磷酸鹽緩沖液(磷酸二氫鈉0.6克，磷酸氫二鈉2.5克溶于適量蒸餾水以使所得溶液為250ml)，與適量水混合，煮沸，冷卻，加入天然丁香油3.3ml，混合均勻，加入含20克豬免疫球蛋白的實(shí)施例3制得的豬免疫球蛋白原液，加入水至混合液為1000ml，冷藏靜置后，除菌過(guò)濾，即得本發(fā)明口服藥物制劑K-11，其含豬免疫球蛋白2.0g/100ml。
實(shí)施例7、使用本發(fā)明藥物制劑進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)將金葡球菌、乙型鏈球菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、變形桿菌制備成9億/ml的菌液。
將實(shí)施例1制得的本發(fā)明藥物制劑Y-1及對(duì)比制劑人丙球蛋白注射液(意大利HAIMA產(chǎn)品)均用無(wú)菌生理鹽水稀釋為含蛋白質(zhì)100mg/ml的溶液；分別用肉湯培養(yǎng)基作倍比稀釋成9管，每管各加入上述菌液0.1ml，搖勻，于37℃下放置24小時(shí)，讀取結(jié)果，記錄的抑菌作用，另加生理鹽水對(duì)照管一支作對(duì)比，結(jié)果列于表1。
表1、本發(fā)明藥物制劑對(duì)常見(jiàn)腸道菌的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果蛋白質(zhì)含量10 52.5 1.25 0.6 0.3 0.15 0.08 0.04 鹽水(mg/ml) PH PH PH PHPH PH PHPHPH對(duì)照金葡球菌 ++ ++ ++ ++++ ++ --------乙型鏈球菌++ ++ ++ ++++ ++ --------痢疾桿菌 ++ ++ ++ ++++ ±- --------傷寒桿菌 ++ ++ ++ ++++ -+ --------副傷寒桿菌++ ++ ++ ++++ -± --------變形桿菌 ++ ++ ++ ±+ -- -- --------注P本發(fā)明藥物制劑，H對(duì)比制劑人丙球蛋白，+有抑菌作用，±可疑，-無(wú)抑菌作用由表1的結(jié)果可知，本發(fā)明提供的藥物制劑對(duì)金葡球菌、乙型鏈球菌、痢疾桿菌的最低抑菌稀釋度(效價(jià))為1∶32～64，其抑菌作用與含人丙球蛋白的制劑相似，對(duì)傷寒桿菌、副傷寒桿菌、變形桿菌的最低抑菌稀釋度(效價(jià))為1∶16～32，其抑菌作用稍優(yōu)于含人丙球蛋白的制劑。
從以上結(jié)果可看出本發(fā)明提供的口服藥物制劑對(duì)金葡球菌、乙型鏈球菌、痢疾桿菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、變形桿菌均有明顯的抗菌作用，其性能與含人丙球蛋白的制劑相似或稍優(yōu)。
實(shí)施例8、使用本發(fā)明口服藥物制劑進(jìn)行凝集實(shí)驗(yàn)將大腸桿菌、痢疾桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、鼠傷寒桿菌、豬霍亂桿菌制備成9億/ml的菌液。
將實(shí)施例2制得的本發(fā)明口服藥物制劑Y-2及對(duì)比制劑人丙球蛋白注射液(意大利HAIMA產(chǎn)品)均用無(wú)菌生理鹽水稀釋為含蛋白質(zhì)10mg/ml的溶液；分別用肉湯培養(yǎng)基作倍比稀釋成9管，另有一鹽水對(duì)照管，每管各加入上述菌液0.5ml，搖勻，于37℃下放置24小時(shí)，讀取結(jié)果，記錄的免疫活性的凝集結(jié)果列于表2。
表2、本發(fā)明口服藥物制劑與對(duì)比制劑免疫活性的凝集效價(jià)比較蛋白質(zhì)含量105 2.5 1.25 0.625 0.3 0.15 0.08 0.04 鹽水(mg/ml) PHPHPHPHPH PH PHPHPH 對(duì)照大腸桿菌 ++++++++++ ++ ------ --痢疾桿菌 ++++++++++ ++ ------ --綠膿桿菌 ++++++++++ +- +----- --變形桿菌 ++++++++++ -- ------ --傷寒桿菌 ++++++++-+ -+ ------ --副傷寒桿菌++++++++++ +- ------ --鼠傷寒桿菌+++++++++± -- ------ --豬霍亂桿菌++++++++++ +- ±- ---- --注P本發(fā)明藥物制劑，H對(duì)比制劑人丙球蛋白，+凝集，±可疑凝集，-不凝集由表2的結(jié)果可知，本發(fā)明提供的口服藥物制劑對(duì)多種細(xì)菌有凝集作用，其中對(duì)大腸桿菌、痢疾桿菌、變形桿菌、副傷寒桿菌的凝集效價(jià)與含人丙球蛋白的制劑相同，對(duì)綠膿桿菌、豬霍亂桿菌的凝集效價(jià)比含人丙球蛋白的制劑稍高，對(duì)傷寒桿菌略低于含人丙球蛋白的制劑。
從以上結(jié)果可看出本發(fā)明提供的口服藥物制劑對(duì)大腸桿菌、痢疾桿菌、變形桿菌、副傷寒桿菌、綠膿桿菌、豬霍亂桿菌、傷寒桿菌均有明顯的抗菌作用，其性能與含人丙球蛋白的制劑相似。
實(shí)施例9、使用本發(fā)明口服藥物制劑對(duì)綠膿桿菌感染動(dòng)物的保護(hù)試驗(yàn)取綠膿桿菌接種于肉湯培養(yǎng)基，經(jīng)37℃下24小時(shí)孵育，按預(yù)先所測(cè)的半數(shù)致死量(LD50＝1∶113稀釋度)，將菌液配成1∶20(5.6×LD50相當(dāng)于LD90)，1∶40(2.8×LD50)，1∶80(1.4×LD50)，1∶160(0.7×LD50)四個(gè)不同稀釋濃度。
取體重20～22g的昆明種小白鼠128只分4大組，每組32只，每組按菌液再分四小組，每小組8只小鼠，分組如下A本發(fā)明藥物制劑組，感染鼠，實(shí)施例4制得的K-2給藥2mg/鼠；B對(duì)比制劑人丙球蛋白組，感染鼠，用人丙球蛋白(意大利HAIMA產(chǎn)品)給藥2mg/鼠；C生理鹽水陰性對(duì)照組，感染鼠，不用藥；D生理鹽水未感染控制組，未感染鼠，不用藥。
將A、B組分別用無(wú)菌生理鹽水按所含蛋白質(zhì)配成2mg/0.5ml溶液，每鼠各灌胃0.5ml，C組用無(wú)菌生理鹽水灌胃0.5ml，連續(xù)3天后，將上述不同稀釋度的菌液0.3ml分別接種于小鼠腹腔，3小時(shí)后再服藥一次，觀察期間繼續(xù)服藥3天，并記錄死亡數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所列。
表3本發(fā)明藥物制劑對(duì)綠膿桿菌感染動(dòng)物的保護(hù)試驗(yàn)(存活數(shù)/觀察數(shù))菌液稀釋倍數(shù)1∶201∶40 1∶80 1∶160LD50倍數(shù)5.6 2.81.4 0.7A組 3/8*8/8***Δ 8/8***Δ 8/8*ΔB組 2/8*7/8***8/8***8/8*C組 0/8 1/82/8 8/8D組 8/8***8/8***8/8***8/8*注與鹽水組對(duì)比*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01本發(fā)明藥物制劑與對(duì)比制劑人丙球?qū)Ρ圈＞0.05，ΔΔP＜0.05，ΔΔΔP＜0.01由表3數(shù)據(jù)可知，本品對(duì)綠膿桿菌感染的小鼠有明顯的抗感染保護(hù)作用，其作用略強(qiáng)于人丙球蛋白。
實(shí)施例10、使用本發(fā)明藥物制劑對(duì)痢疾桿菌感染動(dòng)物的保護(hù)試驗(yàn)取痢疾桿菌接種于5％酵母肉湯培養(yǎng)基，經(jīng)37℃下24小時(shí)孵育，按預(yù)先所測(cè)的半數(shù)致死量(LD50＝1∶64稀釋度)，將菌液配成1∶10稀釋度(6.4×LD50相當(dāng)于LD90)。
取體重20±2g的昆明種小白鼠80只分4組，分組如下A本發(fā)明藥物制劑組，感染鼠，用實(shí)施例4制得K-2給藥2mg/鼠；B對(duì)比制劑組，感染鼠，用人丙球蛋白(意大利HAIMA產(chǎn)品)給藥2mg/鼠；C生理鹽水陰性對(duì)照組，感染鼠，不用藥；D生理鹽水未感染控制組，未感染鼠，不用藥。
將A、B組分別用無(wú)菌生理鹽水按所含蛋白質(zhì)配成2mg/0.5ml溶液，每鼠灌胃0.5ml，C、D組用無(wú)菌生理鹽水灌胃0.5ml，連續(xù)3天后，將上述稀釋度的菌液0.3ml分別接種于小鼠腹腔，觀察期間繼續(xù)服藥3天，并記錄死亡數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所列。
表4、本發(fā)明藥物制劑對(duì)痢疾桿菌感染動(dòng)物的保護(hù)試驗(yàn)組別鼠數(shù) 1d 2d 3d 死亡數(shù) 存活數(shù) 存活率統(tǒng)計(jì)A組 204206 14 70.0％***ΔB組 205208 12 60.6％***C組 2018 1019 1 5.0％D組 200000 20 100.0％ ***注與鹽水組對(duì)比*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01本發(fā)明藥物制劑與對(duì)比制劑人丙球?qū)Ρ圈＞0.05，ΔΔP＜0.05，ΔΔΔP＜0.01由表4數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明藥物制劑對(duì)痢疾桿菌感染的小鼠有明顯的抗感染保護(hù)作用，其作用略強(qiáng)于人丙球蛋白。
實(shí)施例11、使用本發(fā)明藥物制劑對(duì)白色葡萄球菌感染動(dòng)物的保護(hù)試驗(yàn)取白色葡萄球菌、痢疾桿菌，經(jīng)普通肉湯培養(yǎng)基接種，37℃下培養(yǎng)6小時(shí)后，分別用生理鹽水稀釋成1000-2000個(gè)/ml菌液。將本發(fā)明提供的口服藥物制劑Y-3稀釋成含蛋白質(zhì)100mg/10ml的溶液。對(duì)比制劑溶液含人丙球蛋白(意大利HAIMA產(chǎn)品)100mg/10ml。
取試管6支，分兩種細(xì)菌組，按以下五組加入各組分A本發(fā)明制劑組I本發(fā)明制劑10mg/1ml，豚鼠新鮮血液0.5ml，菌液0.5ml；B對(duì)比制劑組I人丙球蛋白10mg/1ml，豚鼠新鮮血液0.5ml，菌液0.5ml；C本發(fā)明制劑組II本發(fā)明制劑10mg/1ml，生理鹽水0.5ml，菌液0.5ml；D對(duì)比制劑組II人丙球蛋白10mg/1ml，生理鹽水0.5ml，菌液0.5ml；
E對(duì)照組生理鹽水1ml，豚鼠新鮮血液0.5ml，菌液0.5ml；將A、B、C、D、E各試管內(nèi)成分混均后，置37℃水浴中，作用2小時(shí)后，取出0.1ml注入無(wú)菌平皿，加入予溶并已冷至50度左右的營(yíng)養(yǎng)瓊脂，作傾注培養(yǎng)，每管傾注八個(gè)平皿，37℃孵育24小時(shí)后，讀取每組八個(gè)平皿的菌落數(shù)并計(jì)算均數(shù)，按統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。
表5、體外抑菌試驗(yàn)組別白色葡萄球菌菌落痢疾桿菌菌落A本發(fā)明制劑組I 42.2±4.2***Δ## 20.8±4.1***ΔΔ###B對(duì)比制劑組I 44.1±5.3***###25.4±3.3***##C本發(fā)明制劑組II 47.2±4.1***Δ27.1±3.9***ΔD對(duì)比制劑組II51.4±4.4***29.7±3.8***E對(duì)照組 59.6±4.9 36.9±4.8注與對(duì)照組對(duì)比*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01本發(fā)明制劑組與對(duì)比制劑組對(duì)比ΔP＞0.05，ΔΔP＜0.05，ΔΔΔP＜0.01模仿體液環(huán)境與否對(duì)比#P＞0.05，##P＜0.05，###P＜0.01由表5數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明制劑對(duì)白色葡萄球菌與痢疾桿菌均有抑菌作用。與對(duì)照組相比，均有非常顯著差異(P＜0.01)。這種抑菌作用在模仿體液環(huán)境的條件下，其抑菌作用更強(qiáng)(P＜0.05，P＜0.01)，說(shuō)明本發(fā)明藥物制劑還發(fā)揮了免疫因素的作用。本發(fā)明制劑與人丙球蛋白相比，其作用略強(qiáng)，在模仿體液環(huán)境的條件下，本發(fā)明制劑對(duì)痢疾桿菌的作用強(qiáng)于人丙球蛋白(P＜0.05)。
實(shí)施例12、使用本發(fā)明藥物制劑進(jìn)行抗人輪狀病毒實(shí)驗(yàn)(1)人輪狀病毒(Wa株)毒力測(cè)定用CV-1細(xì)胞(輪狀病毒易感細(xì)胞)，培養(yǎng)液(Eagle(MEM)培養(yǎng)液)中加入10倍稀釋的5種濃度的人輪狀病毒W(wǎng)a株培養(yǎng)液，在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)后，觀察細(xì)胞病變(CPE)，每濃度3孔，重復(fù)3次，計(jì)算病毒半數(shù)感染劑量(TCID50)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，人輪狀病毒W(wǎng)a株對(duì)CV-1細(xì)胞株的TCID50＝10-4.5，實(shí)驗(yàn)中取用50 TCID50，即10-2.8稀釋度。
(2)藥物毒性測(cè)定用實(shí)施例3制得的本發(fā)明藥物制劑Y-3及對(duì)比制劑人丙球蛋白(上海血制品研究所，濃度10g％)分別用培養(yǎng)液按1∶2，1∶5，1∶10，1∶20，1∶50，1∶100，1∶200稀釋，接種CV-1細(xì)胞(24孔板)，0.2ml/孔，每濃度3孔，重復(fù)3次。在37℃下吸附1小時(shí)，加入0.8ml維持液(Eagle(MEM)培養(yǎng)液，新生牛血清，胰蛋白酶)，繼續(xù)培養(yǎng)7天后，每日觀察細(xì)胞病變情況(CPE)，以不出現(xiàn)CPE的最高稀釋度為無(wú)細(xì)胞毒濃度(最大無(wú)毒濃度TD0)，也即本發(fā)明藥物制劑及對(duì)比制劑人丙種球蛋白的實(shí)驗(yàn)起始濃度。用Reed-Muench法計(jì)算半數(shù)中毒濃度(TD50)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6-1、6-2。
表6-1、本發(fā)明藥物制劑的藥物毒性本發(fā)明制劑1∶21∶5 1∶10 1∶20 1∶50 1∶100 1∶200 對(duì)照組 TD0稀釋倍數(shù) 最大無(wú)毒濃度蛋白濃度420 16884 42 16.88.4 4.2 0mg％+++ ++---- --- --- --- --- --- 84三次+++ +-+--- --- --- --- --- --- 84實(shí)驗(yàn)結(jié)果+++ ++---- --- --- --- --- --- 84合計(jì) 9/9 3/90/9 0/9 0/9 0/9 0/9 0/9 84表6-2、對(duì)比制劑人丙球的藥物毒性對(duì)比制劑稀1∶21∶5 1∶10 1∶20 1∶50 1∶100 1∶200 對(duì)照組 TD0釋倍數(shù)最大無(wú)毒濃度蛋白濃度1000400200 100 40 20 20 0mg％+++ ++++++ +++ --- --- --- --- 40三次+++ ++++++ +-- --- --- --- --- 40實(shí)驗(yàn)結(jié)果+++ ++++++ ++- --- --- --- --- 40合計(jì) 9/9 9/99/9 6/9 0/9 0/9 0/9 0/9 40由表6可知，本發(fā)明藥物制劑對(duì)CV-1細(xì)胞的毒性比對(duì)比制劑人丙球蛋白約小一倍。
(3)體外抗人輪狀病毒藥效實(shí)驗(yàn)生長(zhǎng)成片的24孔板培養(yǎng)的CV-1細(xì)胞加入50 TCID50的輪狀病毒W(wǎng)a株，吸附1小時(shí)后，用實(shí)施例4制得的本發(fā)明藥物制劑K-3及對(duì)比制劑人丙球蛋白分別從無(wú)細(xì)胞毒濃度(TD0)起，二倍稀釋7個(gè)濃度，將各稀釋度藥物分別加入細(xì)胞孔內(nèi)，每濃度3孔，0.2ml/孔，加入無(wú)血清維持液0.8ml，繼續(xù)培養(yǎng)7天，以病毒對(duì)照孔完全出現(xiàn)細(xì)胞病變CPE作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7-1、7-2所列。
對(duì)照孔(無(wú)藥物組)中CV-1細(xì)胞，經(jīng)病毒作用后孔出現(xiàn)CPE細(xì)胞圓縮，邊緣模糊，脫落。而用藥各孔在按無(wú)細(xì)胞毒濃度(TD0)1∶64稀釋時(shí)，均表現(xiàn)為CPE抑制，與正常細(xì)胞對(duì)照無(wú)明顯差異，說(shuō)明本發(fā)明制劑和對(duì)比制劑均可抗解病毒對(duì)細(xì)胞的危害。
表7-1、本發(fā)明藥物制劑的抗輪狀病毒作用蛋白濃度 MTC84 42 21 10 5.22.61.3 0.650mg％最小有效濃度三次 --- --- --- --- --------- +++ +++ 1.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果--- --- --- --- --------- -++ +++ 1.3--- --- --- --- --------- +++ +++ 1.3合計(jì) 0/9 0/9 0/9 0/9 0/90/90/9 8/9 9/9 1.3表7-2、對(duì)比制劑人丙球的抗輪狀病毒作用蛋白濃度 MTC40 20 10 52.5 1.250.62 0.310mg％ 最小有效濃度三次 --- --- --- --- --- --- +++ +++ +++ 1.25實(shí)驗(yàn)結(jié)果--- --- --- --- --- --- +++ +++ +++ 1.25--- --- --- --- --- --- +++ +++ +++ 1.25合計(jì) 0/9 0/9 0/9 0/9 0/9 0/9 9/9 9/9 9/9 1.25本發(fā)明制劑治療指數(shù)TI＝最大無(wú)毒濃度(TD0)/最小有效濃度(MTC)＝84/1.3＝64.6對(duì)比制劑治療指數(shù)TI＝最大無(wú)毒濃度(TD0)/最小有效濃度(MTC)＝40/1.25＝32由以上結(jié)果可知，本發(fā)明藥物制劑對(duì)人輪狀病毒W(wǎng)a株感染的CV-1細(xì)胞株有明顯的抗病毒作用，抗病毒最小有效濃度(MTC＝1.3mg％)比最大無(wú)毒濃度(84mg％)小64倍。
實(shí)施例13、本發(fā)明藥物制劑在動(dòng)物腸內(nèi)、及人工腸液、胃液中的持續(xù)時(shí)間將本發(fā)明實(shí)施例3制得的豬免疫球蛋白作為抗原(使蛋白量為10mg/ml)，加等量福氏完全佐劑，在家兔足掌接種，制備“兔抗豬”球蛋白抗體，用瓊脂單擴(kuò)散法測(cè)知其效價(jià)為1∶40，置冰箱備用。
取體重20±2g的昆明種小白鼠，按0.2ml/只將本發(fā)明實(shí)施例1制得的豬免疫球蛋白(使蛋白量為10mg/ml)從小白鼠腹部的小切口注入十二指腸段內(nèi)，分別在注射后0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h，取出腸段，每時(shí)間組5只小鼠，剪碎，在6ml巴比妥緩沖液(pH 8.6)內(nèi)漂洗，析出洗滌液，與上述1∶40倍稀釋的“兔抗豬”球蛋白抗體作瓊脂單擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，所得的沉淀環(huán)直徑與工作曲線進(jìn)行比較，最低測(cè)定濃度為0.01mg/ml，線形范圍為0.02～0.33mg/ml，根據(jù)量效關(guān)系及稀釋倍數(shù)繪出工作曲線，計(jì)算球蛋白含量，并計(jì)算檢品內(nèi)球蛋白的半衰期，列于表8-1。
表8-1本發(fā)明藥物制劑品在動(dòng)物腸內(nèi)的留存量(mg)的歷時(shí)變化標(biāo)本號(hào)0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h1 2.002.001.701.301.140.920.642 2.102.101.661.321.100.920.683 1.951.901.761.341.060.960.604 2.152.101.861.561.161.000.695 2.102.101.881.581.060.860.62平均值2.062.041.771.421.100.930.65標(biāo)準(zhǔn)差±0.08 ±0.09 ±0.09 ±0.14 ±0.06 ±0.05 ±0.04由表8-1可知，在腸內(nèi)6小時(shí)后，腸內(nèi)球蛋白含量為0.65±0.04mg，占原用量的32％，說(shuō)明本發(fā)明藥物制劑口服后至少維持6小時(shí)，從半衰期推算，在12小時(shí)后仍能發(fā)生有效作用。
將本發(fā)明實(shí)施例3制得的豬免疫球蛋白稀釋成蛋白量為10mg/ml，將此溶液0.5ml加入按美國(guó)藥典法制備的人工腸液，置37℃水浴作用0h、0.5h、1h、2h、3h、4h、6h，各個(gè)時(shí)間各取樣作醋酸纖維素膜電泳，用氨基黑染色，洗脫，經(jīng)752分光光度計(jì)，于640nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度值，同時(shí)用鎢酸鈉沉淀法及凱氏半微量定氮法測(cè)定球蛋白含量，結(jié)果列于表8-2。
表8-2本發(fā)明藥物制劑在人工腸液中的留存量(mg)的歷時(shí)變化標(biāo)本號(hào)0h 0.5h1h 2h 3h 4h 6h1 5.024.843.122.76 1.290.97 0.472 5.355.124.663.11 2.061.55 0.583 4.844.033.363.02 1.341.01 0.394 5.124.914.332.31 1.691.25 0.59平均值5.084.723.872.80 1.591.20 0.51標(biāo)準(zhǔn) ±0.21 ±0.47 ±0.73 ±0.36 ±0.36 ±0.27 ±0.09由表8-2可知，本發(fā)明藥物制劑在人工腸液中6小時(shí)后仍有0.51±0.09mg，占原用量的10％(即稀釋10倍)。
將本發(fā)明實(shí)施例3制得的豬免疫球蛋白稀釋成蛋白量為10mg/ml，將此溶液0.5ml加入按美國(guó)藥典法制備的人工胃液，置37℃水浴中，用電磁攪拌器攪拌，作用0h、0.5h、1h、2h、3h、4h、6h，各個(gè)時(shí)間各取樣作醋酸纖維素膜電泳，每組重復(fù)4次，用氨基黑染色，洗脫，經(jīng)752分光光度計(jì)，于640nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度值，同時(shí)用鎢酸鈉沉淀法及凱氏半微量定氮法測(cè)定球蛋白含量，結(jié)果列于表8-3。
表8-3本發(fā)明藥物制劑在人工胃液中的留存量(mg)的歷時(shí)變化標(biāo)本號(hào)0h 0.5h 1h 2h 3h 4h 6h1 5.045.00 5.045.004.785.045.002 4.964.96 4.944.914.834.914.953 5.095.04 5.055.094.964.934.884 4.934.83 4.854.834.804.874.92平均值5.014.96 4.974.964.844.944.94標(biāo)準(zhǔn)差±0.07 ±0.09 ±0.09 ±0.11 ±0.08 ±0.07 ±0.05由表8-3可知，本發(fā)明藥物制劑在pH 4.5的人工胃液中6小時(shí)后，并未受胃酸及胃蛋白酶水解，仍保持原用量的96.7％以上。說(shuō)明本發(fā)明藥物制劑在人工胃液中的穩(wěn)定性很好，可以耐受胃酸及胃蛋白酶的破壞。取各時(shí)間的樣品進(jìn)行醋酸纖維薄膜電泳也能顯示同樣的電泳區(qū)帶圖型。
由表8-1、8-2、8-3數(shù)據(jù)可知，本品不受胃液破壞，在腸中穩(wěn)定6小時(shí)以上，足以充分發(fā)揮藥效。
實(shí)施例14、本發(fā)明藥物制劑對(duì)應(yīng)激小鼠痢疾模型的防治試驗(yàn)取痢疾桿菌接種于5％酵母肉湯培養(yǎng)基，經(jīng)37℃下24小時(shí)孵育。取體重10±2g的昆明種小白鼠80只，實(shí)驗(yàn)前用截肢法形成應(yīng)激狀態(tài)小鼠(正常小鼠難以形成腸道感染，故采用應(yīng)激小鼠)，隨機(jī)分為四組A組本發(fā)明藥物制劑組(使用實(shí)施例3制備的Y-3)；B組對(duì)比制劑組(用人丙球蛋白，意大利HAIMA產(chǎn)品)；C組生理鹽水陰性對(duì)照組；D組正常動(dòng)物未感染控制組。
用菌液0.5ml/鼠灌胃，同時(shí)用藥液2mg/20g鼠灌胃，連用三天。記錄每日稀便發(fā)生率及存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表9。
表9本發(fā)明藥物制劑對(duì)應(yīng)激小鼠痢疾模型的防治試驗(yàn)組別 鼠數(shù) 稀便數(shù) 稀便發(fā)生率死亡數(shù) 存活數(shù) 存活率A201/20 20.0％***317 85.0％B205/20 25.0％***317 85.0％C2019/2095.0％ 13 7 45.0％D200/20 0.0％***020 100/0％注**P＜0.05，***P＜0.01由表9可見(jiàn)，用本發(fā)明藥物制劑對(duì)痢疾桿菌灌胃感染的應(yīng)激小鼠灌胃給藥，有明顯的抗感染保護(hù)作用。稀便緩解率與鹽水對(duì)照組相比有顯著意義(P＜0.05)；存活率也有顯著意義(P＜0.05)，其作用略強(qiáng)于人丙球蛋白組。
實(shí)施例15、本發(fā)明藥物制劑對(duì)人輪狀病毒的中和阻斷效價(jià)取本發(fā)明藥物制劑Y-1、Y-2、Y-3各0.1ml，用生理鹽水按1∶10的比例稀釋，加入0.1ml人輪狀病毒懸液(用前以磷酸鹽緩沖液稀釋10倍)，混合均勻，37℃水浴中放置1小時(shí)，將混勻液滴入ELISA板(抗人輪狀病毒ELISA阻斷法診斷盒，安徽醫(yī)學(xué)科研所制，陽(yáng)性對(duì)照液1支，陰性對(duì)照液1支，酶標(biāo)記抗體1支，洗液10×1支，底物A(四甲聯(lián)苯胺TMB)1支，底物B(十二烷基硫酸鈉)1支)孔，再加陽(yáng)性對(duì)照液及陰性對(duì)照液，每孔均0.05ml。
立即加酶標(biāo)記抗體，每孔0.05ml，輕輕搖勻后，置于37℃水浴中60分鐘，將洗液用蒸餾水作10倍稀釋后，洗板孔6次，每次1分鐘，均甩干。
取底物A、B液，各0.05ml，滴入板孔，混勻，顯蘭色者為陰性，不顯色者為陽(yáng)性。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表10。
表10本發(fā)明藥物制劑對(duì)人輪狀病毒的中和阻斷效價(jià)稀釋倍數(shù) 1∶11∶101∶1001∶10001∶10000 對(duì)照Y-1+ + + - - -Y-2+ + - - - -Y-3+ + - - - -從表10可見(jiàn)，本發(fā)明藥物制劑對(duì)人輪狀病毒的中和阻斷效價(jià)為1∶100。
實(shí)施例16、本發(fā)明藥物制劑的急性毒性試驗(yàn)取體重18-20g的昆明種小白鼠和體重210-260g的Wistar種大白鼠，雄雌各半，用藥前禁食12小時(shí)，用實(shí)施例2制備的本發(fā)明藥物制劑Y-2稀釋后分別腹腔注射及灌胃給藥，觀察7天，測(cè)定死亡數(shù)及死亡率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表11。
表11本發(fā)明藥物制劑的急性毒性實(shí)驗(yàn)劑量動(dòng)物 用藥動(dòng)物數(shù) 2h 1d2d3d4d5d6d7d死亡數(shù) 死亡率g/kg4020 00 0 0 0 0 0 0 00％小鼠 灌胃2820 00 0 0 0 0 0 0 00％2020 00 0 0 0 0 0 0 00％4020 00 0 0 0 0 0 0 00％小鼠 腹腔2820 00 0 0 0 0 0 0 00％2020 00 0 0 0 0 0 0 00％灌胃4020 00 0 0 0 0 0 0 00％大鼠腹腔4020 00 0 0 0 0 0 0 00％小鼠及大鼠灌胃及腹腔注射給藥，在40g/kg計(jì)量下，20只動(dòng)物觀察7天，無(wú)一死亡，根據(jù)Wright法則，可有99.9％機(jī)率認(rèn)為L(zhǎng)D50肯定大于40g/kg，該劑量比小鼠有效量(0.1g/kg)及人用藥量(0.003g/kg)大400及13000倍，說(shuō)明毒性極低，安全性很大。
實(shí)施例17、本發(fā)明藥物制劑的長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)用實(shí)施例制得的本發(fā)明藥物制劑Y-3對(duì)兩組(A、B)家犬(4月齡左右，體重3.0-5.0kg，共12只，分成三組，各四只，雄雌各半)，分別按每天2.7g/kg和9.0g/kg的量灌胃給藥90天。另一組為生理鹽水對(duì)照組(C)。給藥前后分別做肝、腎功能和血常規(guī)檢查。90天后處死動(dòng)物，取心、肝、脾、腎、腎上線、腦、胃、小腸、睪丸、卵巢等11種臟器做病理檢查。
兩組不同劑量的實(shí)驗(yàn)組，給藥期間無(wú)動(dòng)物死亡，用藥前后的肝、腎功能及血常規(guī)指標(biāo)均正常，與對(duì)照組想比較，差異無(wú)明顯性。在服藥期間動(dòng)物活動(dòng)正常，毛發(fā)、糞便均無(wú)異常，體重增加曲線與正常動(dòng)物相同。給藥90天后，對(duì)心、肝、腎、腦等11種內(nèi)臟器官進(jìn)行切片檢查，均未見(jiàn)特殊病理性變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明本發(fā)明藥物制劑長(zhǎng)期毒性很小。
實(shí)施例18、本發(fā)明藥物制劑的致敏性實(shí)驗(yàn)取體重250-300g豚鼠16只，雄雌各半，分為四組致敏(各四只)A組本發(fā)明藥物制劑灌胃致敏組，以1g/kg劑量，對(duì)豚鼠灌胃致敏；B組本發(fā)明藥物制劑皮內(nèi)注射致敏組，用1∶5稀釋液0.4ml/kg灌胃；C組鹽水口服對(duì)照組，用生理鹽水10ml/kg灌胃；D組組織胺皮內(nèi)注射對(duì)照組，按0.2mg/kg皮內(nèi)注射。
致敏10天后，進(jìn)行發(fā)敏攻擊。本發(fā)明藥物制劑組不論何法致敏，均用灌胃法發(fā)敏攻擊。在發(fā)敏攻擊后觀察記錄動(dòng)物表現(xiàn)，并繼續(xù)飼養(yǎng)，一周后再同樣攻擊一次，記錄動(dòng)物豎毛，抓鼻，氣急，噴涕或驚厥等過(guò)敏現(xiàn)象。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表12。
表12本發(fā)明藥物制劑致敏性實(shí)驗(yàn)(n＝4)第10天攻擊發(fā)敏時(shí) 第22天再次攻擊發(fā)敏時(shí)組別豎毛 抓鼻 氣急 噴涕 驚厥 死亡 豎毛 抓鼻 氣急 噴涕 驚厥 死亡A 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0B 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0C 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0D 4 4 3 3 0 0 4 4 3 2 1 0
由表12可見(jiàn)，本發(fā)明藥物制劑在兩次發(fā)敏攻擊時(shí)，均未出現(xiàn)明顯過(guò)敏反應(yīng)，說(shuō)明本發(fā)明藥物制劑無(wú)明顯致敏性。
實(shí)施例19、本發(fā)明藥物制劑的初步穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)使用實(shí)施例1-3制備的本發(fā)明藥物制劑Y-1、Y-2、Y-3進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)在室溫下保存兩年后，三種樣品的性狀、pH值、澄清度、含量、鑒別、衛(wèi)生學(xué)檢查等各項(xiàng)指標(biāo)均符合要求。
將裝有三種樣品的棕色口服液瓶置于2000-4000Lx照度下，用照度計(jì)(ST-80C，北京師范大學(xué)光學(xué)儀器廠出品)測(cè)試照度，照射10天，三種樣品的性狀、pH值、澄清度、含量、鑒別、衛(wèi)生學(xué)檢查等各項(xiàng)指標(biāo)幾無(wú)變化。
實(shí)施例20、本發(fā)明藥物制劑治療輪狀病毒腸炎的實(shí)驗(yàn)選急性腹瀉起病48小時(shí)以內(nèi)，每天排蛋花湯樣或水樣便5次以上，用ELISA法檢查糞便檢出人輪狀病毒的、年齡6～24月男或女性輪狀病毒腸炎患者。試驗(yàn)組用實(shí)施例6制備的本發(fā)明藥物制劑K-11給藥，每支口服液10ml，0.5ml/kg，tid，口服。對(duì)照組用安慰劑(含有與本發(fā)明藥物制劑同樣含量的輔料)給藥，0.5ml/kg，tid，口服。療程3～5天。因本病具有自限性，5～7天即可痊愈，因此在用藥后48小時(shí)及72小時(shí)觀察患者的大便次數(shù)及性狀變化，作為療效的主要指標(biāo)，其結(jié)果見(jiàn)表13-15。
表13. 用藥后大便次數(shù)變化情況用藥后48小時(shí)用藥后72小時(shí)大便次數(shù)分級(jí) 治療組 率(％)對(duì)照組 率(％) 治療組 率(％)對(duì)照組 率(％)大便次數(shù)≤2次(人)42 (32.8)21 (18.3) 62 (48.4)39 (33.9)大便次數(shù)減至用藥前1/3(人)39 (30.5)21 (18.3) 31 (24.2)28 (24.3)大便次數(shù)減至用藥前1/2(人)22 (17.2)29 (25.2) 18 (14.1)27 (23.5)無(wú)變化(人) 25 (19.5)44 (38.3) 17 (13.3)21 (18.3)合計(jì) 128 (100) 115 (100) 128 (100) 115 (100)Ridit分析U＝3.86 P＜0.01 U＝3.15 P＜0.01
表14 用藥后大便性狀變化情況用藥后48小時(shí)用藥后72小時(shí)大便性狀 試驗(yàn)組 對(duì)照組 試驗(yàn)組 對(duì)照組大便成形(人) 18(14.1)4(3.5) 51(39.8)18(15.7)糊狀便(人)54(42.2)30(26.1)56(43.8)66(57.4)蛋花便或水樣便(人)56(43.7)81(70.4)21(16.4)31(26.9)合計(jì) 128(100)115(100)128(100)115(100)Ridit分析 U＝3.15 P＜0.01 U＝3.58 P＜0.01表15 雙盲對(duì)照試驗(yàn)組用藥后療效分析用藥后48小時(shí) 用藥后72小時(shí)療效評(píng)價(jià)試驗(yàn)組 對(duì)照組 x2值P 試驗(yàn)組 對(duì)照組 x2值P有效率(％) 45.317.4 21.67 ＜0.0173.551.312.7 ＜0.01痊愈率(％) 14.13.5 8.24＜0.0138.314.816.9 ＜0.01Ridit分析U＝3.47 P＜0.05 U＝3.90 P＜0.05雙盲對(duì)照的試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明藥物制劑組用藥后大便次數(shù)迅速減少、大便性狀改善，用藥后48小時(shí)試驗(yàn)液組及對(duì)照組有效率分別為45.3％(58/128)、17.4％(20/115)，二組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有非常顯著性差異(P＜0.01)，在給藥后72小時(shí)比較，試驗(yàn)組與對(duì)照組的有效率分別為73.5％及51.3％，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異(x2＝12.7，P＜0.01)，兩組的痊愈率分別為38.3％及14.8％，統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(x2＝16.9，P＜0.01)。以上結(jié)果表明本發(fā)明藥物制劑確有減輕癥狀、縮短病程的作用。
全部受試者均未見(jiàn)支氣管痙攣、皮疹及藥物熱等過(guò)敏反應(yīng)現(xiàn)象，在用藥前后進(jìn)行肝、腎功能檢查的42例患者均未見(jiàn)異常，表明本發(fā)明藥物制劑臨床上應(yīng)用是安全的。
權(quán)利要求
1.一種口服藥物制劑，其特征在于含有豬免疫球蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的口服藥物制劑，其特征在于還含有藥學(xué)上可用的輔料。
3.如權(quán)利要求2所述的口服藥物制劑，其特征在于所述的輔料包括藥學(xué)上可用的穩(wěn)定豬免疫球蛋白的物質(zhì)，藥學(xué)上可用的調(diào)節(jié)所述藥物制劑pH值的緩沖液，以及藥學(xué)上可用的防腐物質(zhì)。
4.如權(quán)利要求3所述的口服藥物制劑，其特征在于所述的輔料還含有藥學(xué)上可用的調(diào)節(jié)所述藥物制劑口味的物質(zhì)。
5.如權(quán)利要求3或4所述的口服藥物制劑，其特征在于所述的穩(wěn)定豬免疫球蛋白的物質(zhì)是山梨醇和/或甘油。
6.如權(quán)利要求3或4所述的口服藥物制劑，其特征在于所述調(diào)節(jié)所述藥物制劑口味的物質(zhì)是山梨醇和/或甘油。
7.如權(quán)利要求3或4所述的口服藥物制劑，其特征在于所述調(diào)節(jié)所述藥物制劑pH值的緩沖液是磷酸鹽緩沖液，其pH值范圍為6.4～7.4。
8.如權(quán)利要求4所述的口服藥物制劑，其特征在于所述的防腐物質(zhì)是丁香油。
9.如權(quán)利要求1所述的口服藥物制劑，其特征在于所述的豬免疫球蛋白是通過(guò)包括以下步驟的方法制得(1)分離血清按照從豬血中分離出血清；(2)除雜蛋白從步驟(1)所得的血請(qǐng)中除去雜蛋白；(3)濃縮及滅病毒將步驟(2)所得物濃縮除去小分子雜質(zhì)并病毒滅活，即得豬免疫球蛋白。
10.如權(quán)利要求9所述的口服藥物制劑，其特征在于所述步驟(2)包括以下步驟(i)加入利凡諾將向所述步驟(1)得到的血清中加入血清體積30～100v％的注射用水或蒸餾水，血清體積30～100v％的、濃度為1～10wt％的利凡諾液，血清體積0.01～0.5v％的辛酸，將混合液攪拌均勻，靜置5～30分鐘，除去上浮物；(ii)除去利凡諾將所述步驟(i)所得物離心分離，除去沉淀；將所得上清液加入吸附劑以吸附剩余的利凡諾，攪拌均勻后，過(guò)濾除去吸附劑。
11.如權(quán)利要求9或10所述的口服藥物制劑，其特征在于在所述分離制備豬免疫球蛋白的過(guò)程中，含豬免疫蛋白的液體的pH值保持在6.0～8.0。
12.如權(quán)利要求11中所述的口服藥物制劑，其特征在于所述的pH值范圍為6.4～7.4。
13.權(quán)利要求1、3、9、或10所述的口服藥物制劑在生產(chǎn)預(yù)防和治療病毒性或/和細(xì)菌感染性疾患的口服藥物中的用途。
14.如權(quán)利要求13所述的用途，其中所述的疾患是毒性感冒、流感、麻疹、腹瀉、人輪狀病毒腹瀉、腮腺炎。
15.一種制備豬免疫球蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟(1)分離血清按照從豬血中分離出血清；(2)除雜蛋白從所述步驟(1)所得的血請(qǐng)中按以下步驟除去雜蛋白(i)加入利凡諾將向所述步驟(1)得到的血清中加入血清體積30～100v％的注射用水或蒸餾水，血清體積30～100v％的、濃度為1～10wt％的利凡諾液，血清體積0.01～0.5v％的辛酸，將混合液攪拌均勻，靜置5～30分鐘，除去上浮物；(ii)除去利凡諾將所述步驟(i)所得物離心分離，除去沉淀；將所得上清液加入吸附劑以吸附剩余的利凡諾，攪拌均勻后，過(guò)濾除去吸附劑；(3)濃縮及滅病毒將所述步驟(2)所得物濃縮除去小分子雜質(zhì)并病毒滅活，即得豬免疫球蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種預(yù)防和治療消化道感染性疾病的口服藥物制劑，其含有豬免疫球蛋白。該豬免疫球蛋白可以是從豬血清中分離出的具有生物活性的豬免疫球蛋白。分離方法包括從豬血中分離出血清，除去血清中的雜蛋白，及將所得物濃縮除去小分子雜質(zhì)并病毒滅活。本發(fā)明提供的口服藥物制劑還可以含有藥學(xué)上可用的輔料。本發(fā)明的口服藥物制劑可用于預(yù)防和治療病毒性感冒，流感，麻疹，腮腺炎，腹瀉，尤其是人輪狀病毒腹瀉等病毒性和/或細(xì)菌感染性疾患。本發(fā)明的藥物制劑以口服方式給藥，不引起人類(lèi)血源性感染，安全，無(wú)毒，無(wú)抗藥性，不引起過(guò)敏癥；且產(chǎn)品性能穩(wěn)定，成本低廉。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1544090SQ20031011372
公開(kāi)日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2003年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月21日
發(fā)明者杜心江 申請(qǐng)人:三九宜工生化股份有限公司