專利名稱：NF－kappaB活化的促進因子及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及促進轉(zhuǎn)錄因子NF-kappaB(nuclear factor-kappaB)活化的核因子，具體涉及一種促進NF-kappaB(nuclear factor-kappaB)活化的人的特異基因、該基因編碼的蛋白序列以及它們在制備防治與NF-kappaB活化失調(diào)相關疾病的藥物等方面的用途。
背景技術：
NF-kappaB(nuclear factor-kappaB)是一種存在于人體，可在各種類型細胞中廣泛表達的轉(zhuǎn)錄因子，通常與抑制因子IkappaBs(inhibit kappaB)相結(jié)合，以非活性形式存在于細胞質(zhì)中。NF-kappaB調(diào)節(jié)大量與細胞應急狀態(tài)相關的基因的轉(zhuǎn)錄，特別是涉及免疫和炎癥反應的基因的轉(zhuǎn)錄，包括細胞因子(生長因子)、受體、粘附分子、急性期蛋白、病毒基因、轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)因子等。
NF-kappaB在機體免疫應答和炎癥反應中發(fā)揮重要作用。人類許多病癥與NF-kappaB活化的失調(diào)直接相關(Barnes et al.，1997)，如癌癥、神經(jīng)退行性疾病、毛細血管擴張共濟失調(diào)癥、類風濕性關節(jié)炎、哮喘、腸炎以及大量其它炎癥；同時NF-kappaB在某些造血細胞，上皮細胞和淋巴器官結(jié)構發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。近來的研究證明，NF-kappaB家族成員還參與了神經(jīng)突觸的形成和腫瘤的遷移(Karin and Ben-Neriah，2000)。
因此NF-kappaB活化途徑中的關鍵因子均可作為藥物設計篩選的靶標，調(diào)節(jié)NF-kappaB活性的因子的研究為免疫及炎癥的預防和治療提供了新的途徑。例如最有效的抗哮喘藥物腎上腺皮質(zhì)激素是淋巴細胞中NF-kappaB活力的有效抑制物(Auphan et al.，1995)；美國IMMUNEX公司研發(fā)能阻斷腫瘤壞死因子TNF誘導NF-kappaB激活的藥物Enbrel用于治療類風濕性關節(jié)炎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種促進NF-kappaB(nuclear factor-kappaB)活化的cDNA序列，以及該基因編碼的蛋白，為干預NF-kappaB的活化提供藥物設計靶標。
本發(fā)明利用酵母雙雜交篩選獲得了促進NF-kappaB活化的新的調(diào)節(jié)因子。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了具有SEQ ID NO1所示序列的cDNA，命名為NKAP(NuclearNF-kappaB Activating Protein)。實驗結(jié)果證明，NKAP基因及其編碼的NKAP蛋白(具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列)是促進NF-kappaB(nuclear factor-kappaB)活化的調(diào)節(jié)因子。
上述NKAP基因和蛋白是用已知在TNF-R1誘導的NF-kappaB活化過程中發(fā)揮重要作用的激酶RIP作為釣餌，用酵母雙雜交方法篩選與之相互作用的蛋白而得到的。
序列分析表明，NKAP與已知基因沒有明顯的序列同源性并在各物種間序列保守。在293細胞中過量表達NKAP能夠劑量依賴性地活化NF-kappaB。反義RNA實驗進一步證明，NKAP表達量的下降能夠抑制NF-kappaB的活化，并使TNF和IL-1誘導NF-kappaB激活的能力明顯降低。免疫熒光染色的實驗結(jié)果表明NKAP定位于細胞核內(nèi)。以上實驗結(jié)果證明，NKAP是TNF和IL-1激活NF-kappaB信號途徑中一種新的調(diào)節(jié)因子。
因為能夠?qū)F-kappaB活性起調(diào)節(jié)作用的蛋白可作為潛在的蛋白藥物直接調(diào)節(jié)NF-kappaB的活性，或者作為藥物設計的靶標，藥物通過調(diào)節(jié)其的活性間接調(diào)節(jié)NF-kappaB的活化。
本發(fā)明提供的NKAP基因和蛋白可以調(diào)控NF-kappaB的活化，因此可以為干預NF-kappaB活化的藥物篩選的分子提供設計靶標及炎癥的診斷標記。與各種藥物可接受的賦形劑、藥物輔劑配伍后，可以將NKAP基因和蛋白全長分子或片段直接作為蛋白藥物制成各種類型的藥物，增加NF-kappaB的活性；或者針對NKAP設計抑制藥物，通過抑制NKAP來降低NF-kappaB的活性。用于預防或治療與NF-kappaB活化的失調(diào)相關的疾病。


圖1是NKAP對NF-kappaB及NKAP對轉(zhuǎn)錄因子AP-1的效應的熒光報告基因檢測對比結(jié)果。圖中可看出，NKAP能夠活化NF-kappaB，而對AP-1的活性沒有影響。
圖2是NKAP反義RNA穩(wěn)定表達細胞系與對照細胞系的熒光報告基因測試結(jié)果。圖中顯示NKAP表達量的下降能夠抑制NF-kappaB的活化。
具體實施例方式一.材料人胚腎293細胞購自ATCC；細胞培養(yǎng)用DMEM，胎牛血清，0.05％胰酶溶液，丙酮酸鈉溶液，青、鏈酶素溶液購自GIBCO和Hyclone；
酵母培養(yǎng)用Peptone購自Difco，添加劑CSM-Trp-，CSM-Trp-Leu-，CSM-His-Leu-Trp-購自Q-BIO Gene；鮭精DNA購自Roche；哺乳動物細胞表達載體pRK-HA由本實驗室構建；NF-kappaB熒光報告質(zhì)粒由Dr.Gary Johnson(University of Colorado Health ScienceCenter)惠贈；pRL-SV40 Renilla熒光報告質(zhì)粒購于Promega；酵母雙雜交“釣餌”載體pGBT9購自CLONTECH；人B細胞cDNA文庫購自ATCC；大腸桿菌表達載體PET-15b，大腸桿菌BL21(DE3)菌株及鎳離子柱純化試劑盒購自Novagen；含有NKAP部分編碼序列的EST克隆BG391661購自ATCC，用于構建NKAP反義RNA的載體pIRESneo3購自CLONTECH；載體構建所需限制性內(nèi)切酶購自Promega；DNA回收試劑盒Geneclean III Kit購自Q-BIO Gene；DNA序列測定由中國上海生工生物工程公司完成；PCR引物由中國上海生工生物工程公司合成；雙熒光報告基因檢測試劑盒購自Promega；免疫共沉淀所用磁珠Protein G-Sepharose購自Amersham Biosciences；Western blot用硝酸纖維素膜Hybond ECL和HRP偶聯(lián)的羊抗鼠IgG、羊抗鼠兔IgG購自Amersham pharmacia biotech.；化學發(fā)光底物試劑盒購自PIERCE；重組的人TNF，IL-1購自R&D Systems Inc.；HA單克隆抗體購自Sigma；兔抗人NKAP蛋白的多克隆抗體由中科院遺傳所免疫室制備；TXRD偶聯(lián)的羊抗鼠IgG，F(xiàn)ITC偶聯(lián)的羊抗兔IgG，DAPI購自Southern BiotechnologyAssociates Inc.；防淬滅封片劑Gel/mountTM購自Biomeda Corp.；CaCl2，PEG4000，LiAc，DMSO購自Sigma；CsCl購自Fisher Biotech.；β-gal購自Promega；其它化學試劑購自北京化學試劑商店。
二.方法1.質(zhì)粒構建及DNA純化從293細胞cDNA文庫中PCR得到RIP全長分子，構建到酵母雙雜交用，編碼轉(zhuǎn)錄因子Gal4結(jié)合結(jié)構域的載體pGBT9，得到可在酵母細胞中表達的質(zhì)粒pGBT9-RIP；GeneBank檢索及EST(expression sequece tag)序列拼接得到NKAP分子的全長編碼序列，根據(jù)這一序列分別設計5’端及3’端引物，通過PCR從B細胞cDNA文庫中克隆到NKAP全長分子，SalI/NotI或XhoI/BamHI酶切后分別插入哺乳動物細胞表達載體pRK-HA和大腸桿菌表達載體PET-15b中，得到哺乳動物細胞表達質(zhì)粒pRK-HA-NKAP及大腸桿菌表達質(zhì)粒PET-15b-NKAP。
構建的哺乳動物細胞表達質(zhì)粒均參照《分子克隆》(J.薩姆布魯克等，1999)質(zhì)粒大量提取法，經(jīng)CsCl密度梯度超速離心純化。
2.酵母雙雜交篩選參照文獻方法(Chen et al.，2002)。
3.細胞培養(yǎng)和細胞轉(zhuǎn)染人胚腎293細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中37□5％二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
293細胞(1×105)接種于12孔板中，18小時后參照《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克等，1999)進行磷酸鈣介導的轉(zhuǎn)染。
4.熒光報告基因檢測293細胞(～1×105)接種于12孔板中，18小時后進行磷酸鈣介導的轉(zhuǎn)染。每個樣品設三個平行實驗組，適量加入空載體以保持每組轉(zhuǎn)染的DNA總量相等。每孔加入0.1μgNF-kappaB熒光報告質(zhì)粒；為了平衡轉(zhuǎn)染效率，同時加入0.1μg pRL-SV40-Renilla熒光報告質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后14-18小時進行檢測，用Promega公司的熒光檢測試劑盒檢測NF-kappaB熒光報告基因及pRL-SV40-Renilla熒光報告基因的活性，方法分別參照產(chǎn)品說明。
5.免疫共沉淀及Western blot293細胞(～2×106)接種于10cm培養(yǎng)皿中，20小時后用1ml細胞裂解液(20mM Tris，150mM NaCl，1％Triton，1mM EDTA，10μg/ml aprotinin，10μg/ml leupeptin，1mMphenylmethylsulfonyl fluoride pH7.5)裂解細胞，在0.5ml細胞裂解液中加入2μgNKAP的抗血清或免疫前血清，再加入30μl protein A偶聯(lián)的Sepherose，4□旋轉(zhuǎn)混合4小時。磁珠被裂解液清洗三次后，加入2×SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳樣品緩沖液20μl，沸水浴后進行10％SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳，電泳及轉(zhuǎn)膜操作參照《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克等，1999)。硝酸纖維素膜用封閉液5％脫脂奶-TBST(150mM NaCl，25mM Tris，0.05％Tween-20，pH7.5)室溫溫育20mins，加入0.5μg/mlNKAP的抗血清或免疫前血清，室溫溫育2hrs，TBST洗滌三次后加入HRP偶聯(lián)的羊抗鼠IgG或羊抗鼠兔IgG(1∶1000稀釋)，室溫溫育1hrs，TBST洗滌三次后用熒光底物檢測試劑盒檢測。
6.重組蛋白的表達及純化將PET-15b-NKAP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21-DE3，擴增培養(yǎng)至500ml，用1mM IPTG誘導5小時，參照先前的方法(李聯(lián)運等，2001)及Novagen鎳離子柱純化試劑盒說明進行NKAP重組蛋白的純化。
7.反義RNA表達載體的構建及穩(wěn)定表達細胞系的篩選EST克隆BG391661中的表達質(zhì)粒(載體為pCMV-sport6)含有NKAP分子5’端約700bp編碼序列，以及NKAP啟動子之前的145bp非編碼序列。將這一質(zhì)粒用NheI和EcoRI雙酶切后插入載體pIRESneo3相應位點中，由于NheI和EcoRI在這兩個載體多克隆位點上的位置相反，我們得到了NKAP的反義RNA表達載體pIRESneo3-AS-NKAP。
將pIRESneo3-AS-NKAP用磷酸鈣介導法轉(zhuǎn)染入293細胞中，培養(yǎng)24hr后更換培養(yǎng)液，并加入G418(1μg/ml)進行篩選，兩周后挑取單克隆進行克隆培養(yǎng)。
8.免疫熒光染色將293細胞培養(yǎng)于載玻片上，用表達載體或相應的空載體進行轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)20hrs；將細胞用冰預冷的甲醇和丙酮分別固定10mins。經(jīng)PBS漂洗后，用0.1％Trition X-100 PBS浸3mins，分別用HA的單克隆抗體(Sigma)，兔抗人NKAP蛋白抗血清以及對照鼠IgG或兔免疫前血清于37□溫育2hrs，經(jīng)PBS漂洗后，再分別與TXRD偶聯(lián)的羊抗鼠IgG，F(xiàn)ITC偶聯(lián)的羊抗兔IgG于37□蔽光溫育1hr，經(jīng)PBS漂洗后，加DAPI室溫作用5mins，Gel/Mount封片。Lecai DMR/XA(DMRB)熒光顯微鏡100×物鏡觀察。
三.NKAP的克隆及功能鑒定1.NKAP cDNA的克隆我們用RIP全長分子為釣餌，對人B細胞cDNA文庫進行酵母雙雜交篩選。我們一共篩選了5×106個酵母克隆，β-半乳糖染色結(jié)果顯示有26個酵母克隆呈陽性。我們進而分別對這26個克隆中的B細胞cDNA文庫質(zhì)粒進行了序列測定，發(fā)現(xiàn)其中9個克隆文庫質(zhì)粒的插入片段與編碼轉(zhuǎn)錄因子GAL4激活結(jié)構域的基因不在同一個讀碼框架中；在讀碼框架正確的17個克隆中，兩個克隆的插入片段均編碼FADD的部分序列，F(xiàn)ADD是一種已報道的具有死亡結(jié)構域且能夠與RIP結(jié)合的接頭蛋白；另外有3個克隆的插入片段分別編碼不同的未知功能蛋白，其中一個我們命名為NKAP。
我們對測序獲得的NKAP分子部分編碼序列進行了EST(expressed sequece tag)序列檢索及拼接，獲得了NKAP的全長序列(SEQ ID NO1所示)，(起始密碼子位于256-258，中止密碼子位于1501-1503)。在NKAP分子起始密碼子的5’端具有位于同一讀碼框架內(nèi)的終止密碼子(202-204)，而3’端具有poly(A)。根據(jù)這一序列我們設計了5’引物和3’引物，通過PCR從B細胞cDNA文庫中獲得了NKAP全長cDNA。NKAP的全長cDNA為1248bp，編碼416個氨基酸(SEQ ID NO2所示)，序列分析表明，NKAP是一個堿性的蛋白分子，并且在進化過程中非常保守。人與鼠NKAP的氨基酸同源性高達90％。
2.NKAP的蛋白表達我們用純化的NKAP蛋白制備了兔抗人NKAP蛋白的抗血清。Western blot結(jié)果表明制備的抗血清能夠特異性識別293細胞中內(nèi)源性表達的NKAP蛋白。分子量約為52kD，與純化的NKAP蛋白分子量一致，略小于過量表達的HA-NKAP，說明我們克隆到了NKAP的全長分子。
3.NKAP的細胞定位我們用免疫熒光染色研究了NKAP在293細胞中的分布。過量表達pRK-HA-NKAP的293細胞用抗HA的單抗進行染色，結(jié)果顯示過量表達的NKAP聚集于核內(nèi)。用NKAP抗血清標記未轉(zhuǎn)染的293細胞，結(jié)果同樣顯示細胞內(nèi)本底表達的NKAP蛋白定位于核內(nèi)。以上結(jié)果說明NKAP是一個核因子。
4.NKAP的功能鑒定(1)NKAP促進NF-kappaB的活化293細胞中轉(zhuǎn)入0.1μg NF-kappaB或0.1μg AP-1熒光報告質(zhì)粒，0.1μg pRL-SV40 Renilla熒光報告質(zhì)粒以平衡轉(zhuǎn)染效率。同時轉(zhuǎn)入圖中標注量的NKAP表達質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后約16小時檢測熒光報告基因的活性。每一樣品設置三個平行實驗，圖1結(jié)果為三次獨立實驗所得結(jié)果的平均。
NF-kappaB熒光報告基因檢測結(jié)果顯示，NKAP在293細胞中過量表達時，能夠劑量依賴性地活化NF-kappaB(圖1)。為了檢測這種活化作用是否具有特異性，我們同時檢測了NKAP對另一種轉(zhuǎn)錄因子AP-1的效應，結(jié)果表明NKAP對AP-1沒有明顯的激活或抑制作用(圖1)。說明NKAP對NF-kappaB的活化作用是相對特異的。
(2)NKAP抑制TNF和IL-1誘導的NF-kappaB的活化為了檢測NKAP在生理條件下的功能，我們檢測了NKAP表達的缺失能否影響NF和IL-1誘導的NF-kappaB的活化。我們構建了NKAP反義RNA表達質(zhì)粒并將它轉(zhuǎn)入293細胞中，經(jīng)篩選得到穩(wěn)定表達NKAP反義RNA的細胞株AS-NKAP-293，Western blot結(jié)果顯示NKAP的反義RNA能夠抑制NKAP蛋白的表達。
AS-NKAP-293細胞中TNF和IL-1誘導NF-kappaB活化的能力下降。293細胞和AS-NKAP-293細胞中分別轉(zhuǎn)入RIP表達質(zhì)粒或?qū)φ召|(zhì)粒以及0.5μg NF-kappaB熒光報告質(zhì)粒，同時轉(zhuǎn)入0.5μg pRL-SV40 Renilla熒光報告質(zhì)粒以平衡轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后14小時用TNF(20ng/ml)及IL-1(20ng/ml)處理細胞，6小時后檢測熒光報告基因的活性。
熒光報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)入空載體的293細胞相比，AS-NKAP-293細胞中本底水平的NF-kappaB活性明顯降低(圖2)。并且AS-NKAP-293細胞中TNF和IL-1誘導NF-kappaB的激活的能力受到明顯抑制。
以上結(jié)果說明NKAP是一個新的NF-kappaB活化的調(diào)節(jié)因子。
序列表<110>北京大學<120>NF-kappaB活化的促進因子及其用途<130>03-01<160>2<170>Patentln version 3.1<210>1<211>1695<212>DNA<213>人(human)<400>1atattaataa acataaaata cccgccgccc cctccatggt acggtccgga ttcccgggat60tcgtcgaccc cgcgtccgcg gacgcgtggg tcgacccacg cgtccgtttg cagaagtacc120cagaactgtg tccaaggttt cctcaaattt gggctgttcc gcagcggcag gtcccgggaa180ccaaggcaac agacatcttc ctaggctcgc gagagcgccc ccttgtccca cggctgctgg240ggccccccag tagccatggc tccggtgtcc ggctcacgca gcccggatag ggaggcctcg300ggctcggggg gaagacgtcg cagttcgtcg aagagtccga agcccagcaa atctgcccgc360tccccgcggg gccgccgctc tcgctcgcac tcttgctctc ggtccgggga ccggaatgga420ctcacccatc agctgggtgg cctcagccaa ggctcccgaa accagtccta ccgctcacgc480tcgcggtcgc gttctagaga gcggccctct gcgccccggg gcatcccctt cgcttctgcc540tcctcgtcag tctattacgg cagctactcg cgcccctacg ggtgcgacaa gccttggcct600agcctcctcg acaaggagag ggaggagagc cagcggcaga agagattaag tgagagagag660agaattggag aattgggagc tcctgaagta tggggacttt ctccaaagaa tcctgaacca720gattctgatg aacatacacc agtggaggat gaagagccaa agaaaagcac tacttcagct780tctacttcag aagaagaaaa aaagaagaag tctagccgtt caaaagaaag gtccaagaaa840aggagaaaga aaaaatcatc gaaaagaaaa cataagaagt attctgaagt aagcgacagt900gactctgatt ctgaaacaga ctccagtgat gaagataaca aaaggagagc aaagaaagcc960aagaaaaagg aaaagaagaa gaaacacaga tcgaagaaat ataagaaaaa gaggtctaag1020
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Lys Arg Leu Ser Glu Arg Glu Arg Ile Gly Glu Leu Gly Ala Pro Glu130 135 140Val Trp Gly Leu Ser Pro Lys Asn Pro Glu Pro Asp Ser Asp Glu His145 150 155160Thr Pro Val Glu Asp Glu Glu Pro Lys Lys Ser Thr Thr Ser Ala Ser165 170 175Thr Ser Glu Glu Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ser Arg Ser Lys Glu Arg180 185 190Ser Lys Lys Arg Arg Lys Lys Lys Ser Ser Lys Arg Lys His Lys Lys195 200 205Tyr Ser Glu Asp Ser Asp Ser Asp Ser Asp Ser Glu Thr Asp Ser Ser210215 220Asp Glu Asp Asn Lys Arg Arg Ala Lys Lys Ala Lys Lys Lys Glu Lys225 230 235 240Lys Lys Lys His Arg Ser Lys Lys Tyr Lys Lys Lys Arg Ser Lys Lys245 250 255Ser Arg Lys Glu Ser Ser Asp Ser Ser Ser Lys Glu Ser Gln Glu Glu260 265270Phe Leu Glu Asn Pro Trp Lys Asp Arg Thr Lys Ala Glu Glu Pro Ser275280 285Asp Leu Ile Gly Pro Glu Ala Pro Lys Thr Leu Thr Ser Gln Asp Asp290 295 300Lys Pro Leu Asn Tyr Gly His Ala Leu Leu Pro Gly Glu Gly Ala Ala305310 315 320Met Ala Glu Tyr Val Lys Ala Gly Lys Arg Ile Pro Arg Arg Gly Glu325 330 335Ile Gly Leu Thr Ser Glu Glu Ile Ala Ser Phe Glu Cys Ser Gly Tyr340 345350Val Met Ser Gly Ser Arg His Arg Arg Met Glu Ala Val Arg Leu Arg355 360365Lys Glu Asn Gln Ile Tyr Ser Ala Asp Glu Lys Arg Ala Leu Ala Ser370 375380Phe Asn Gln Glu Glu Arg Arg Lys Arg Glu Asn Lys Ile Leu Ala Ser385 390 395 400Phe Arg Glu Met Val Tyr Arg Lys Thr Lys Gly Lys Asp Asp Lys405 41041權利要求
1.具有SEQ ID NO1所示序列的DNA。
2.權利要求1所述DNA調(diào)節(jié)NF-kappaB活化的用途。
3.用權利要求1所述DNA在制備預防或治療與NF-kappaB活化的失調(diào)相關的疾病的藥物的用途。
4.權利要求1所述DNA在篩選干預NF-kappaB活化的藥物的用途。
5.用權利要求1所述DNA作為炎癥的診斷標記的用途。
6.具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
7.權利要求6所述氨基酸序列調(diào)節(jié)NF-kappaB活化的用途。
8.用權利要求6所述氨基酸序列在制備預防或治療與NF-kappaB活化的失調(diào)相關的疾病的藥物的用途。
9.權利要求6所述氨基酸序列在篩選干預NF-kappaB活化的藥物的用途。
10.用權利要求6所述氨基酸序列作為炎癥的診斷標記的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及NF－kappaB活化的促進因子及其用途。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種促進NF－kappaB(nuclear factor－kappaB)活化的人的特異基因。實驗結(jié)果證明，該基因及其編碼的蛋白是促進NF－kappaB活化的調(diào)節(jié)因子，可以為干預NF－kappaB活化的藥物篩選提供設計靶標及炎癥的診斷標記，并且可用于制備與NF－kappaB活化失調(diào)相關疾病的藥物。
文檔編號A61K48/00GK1600789SQ20031011528
公開日2005年3月30日 申請日期2003年11月27日 優(yōu)先權日2003年11月27日
發(fā)明者陳丹英, 舒紅兵, 翟中和 申請人:北京大學