專利名稱：猴頭菌硫酸酯蛋白多糖、其制備方法和以該化合物為活性成分的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開一種猴頭菌硫酸酯蛋白多糖，同時(shí)提供了其制備方法和以該化合物為活性的藥物組合物，屬于中藥有效成分提取方法及提取物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
本發(fā)明所稱的猴頭菌(Hericium erinoceus(Bull)eers)又稱小刺猴頭菌，其子實(shí)體自古以來(lái)作為上等的滋補(bǔ)佳品。菌絲體培養(yǎng)物多年來(lái)作為原料藥應(yīng)用于臨床。
在我國(guó)市場(chǎng)上以猴頭菌絲體培養(yǎng)物為原料制成的藥品有胃樂新沖劑。盡管該制劑對(duì)胃、十二指腸潰瘍、慢性胃炎等顯示出良好的療效，長(zhǎng)期服用無(wú)毒副作用。但對(duì)菌絲體(子實(shí)體)中有效成分的提取、分離、純化方法及活性成分的基本化學(xué)組成等問題仍未得到解決，長(zhǎng)期以來(lái)一直制約著猴頭菌絲體(子實(shí)體)的開發(fā)和利用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首次確定了從猴頭菌絲體(子實(shí)體)中提取、分離、純化出具有藥用價(jià)值的活性成分猴頭菌硫酸酯蛋白多糖。并研究了其中硫酸基的含量、糖、蛋白的含量，糖的種類及其糖苷鍵的連接位置。
本發(fā)明提供了從猴頭菌絲體(子實(shí)體)中提取上述物質(zhì)的制備方法。適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了以活性猴頭菌硫酸酯蛋白多糖組分為主要藥物或與其它藥物組方用于治療急、慢性胃炎、胃潰瘍、慢性萎縮性胃炎，提高免疫力、抗癌、降血脂的藥物。
本發(fā)明給出猴頭菌硫酸酯蛋白多糖的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)HPGPC分析結(jié)果表明該化合物是一單一對(duì)稱峰，為均一多糖；測(cè)得分子量為1.6～2.6×104，氨基酸分析發(fā)現(xiàn)，該化合物以Ser和Lys的含量最高，相對(duì)百分含量分別為23％和27％，組成糖分析結(jié)果表明該化合物主要由Ara、Man、Glc三種單糖組成，摩爾比為1∶8.37∶27.24；元素分析結(jié)果S的含量最高(7.4％)，還含有Na-6.5％，K-1.2％，F(xiàn)e-0.84％，Ca-3.63％等金屬離子；紅外光譜分析結(jié)果證明有S＝O雙鍵和C-O-S特征吸收峰。
綜合上述分析結(jié)果，該化合物是由蛋白、糖、硫酸基三大部分組成的硫酸酯蛋白多糖，各部分含量為糖62.52％，蛋白7.49％，硫酸基(按-SO3計(jì))18.50％，金屬離子12.6％，總和為101.30％；并能證明蛋白是以結(jié)合形式和糖鏈聯(lián)接在一起。
猴頭菌硫酸酯蛋白多糖是通過(guò)以下兩種常規(guī)的提取方法獲得的。
方法1將猴頭菌絲發(fā)酵浸膏，加水稀釋1～2倍，脫脂棉濾過(guò)，濾液加乙醇至醇濃度為80％，離心，收集沉淀，真空干燥得猴頭多糖粗品，將粗品配成水溶液，加乙醇至醇濃度為60％，離心、收集沉淀，加少量水溶解，凍干制成成品。
方法2取猴頭菌子實(shí)體，加水10～20倍量煎煮，濾過(guò)取濾液，反復(fù)1～3次，合并濾液，濃縮至浸膏，加乙醇至醇濃度為80％，離心，收集沉淀，真空干燥，制得粗多糖部分，將粗多糖加水溶解，加乙醇至乙醇濃度為60％，離心，收集沉淀，加少量水溶解，凍干制成成品。
經(jīng)過(guò)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)篩選，上述化合物具有治療急、慢性胃炎、胃潰瘍、慢性萎縮性胃炎，提高免疫力、抗癌、降血脂等作用。
按藥劑學(xué)方法，可以將本發(fā)明的猴頭菌硫酸酯蛋白多糖制備成多種臨床藥物劑作為治療急、慢性胃炎、胃潰瘍，慢性萎縮性胃炎，提高免疫力、抗癌、降血脂的藥物，所說(shuō)的藥劑是任何一種藥劑學(xué)上所說(shuō)的劑型，特別是作為各種口服制劑。
本發(fā)明的藥物組合物含有治療有效量的上述化合物為活性成分，以及含有一種或多種藥學(xué)以上可以接受的載體。
上文的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體。
本發(fā)明可以組合物的形式通過(guò)口服、直腸、靜脈、肌肉注射或胃腸外給藥方式施用于這種治療的患者。按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備各種劑型如片劑、顆粒劑、沖劑、膠囊、栓劑、噴霧劑、緩釋劑和注射劑。也可使其活性成分與一種或多種載體或藥物混合，制成所需劑型。
本發(fā)明的藥物優(yōu)選含有1％-99％的猴頭菌硫酸酯蛋白多糖和99％-1％的賦形劑(包括其它配伍的藥物)，優(yōu)選含有30％-80％的猴頭菌硫酸酯蛋白多糖和70％-20％的藥用賦形劑(包括其它配伍用的藥物)，最好含有60％-70％的猴頭菌硫酸酯蛋白多糖和40％-30％的賦形劑(包括其它配伍的藥物)。
下述的藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)了猴頭菌硫酸酯蛋白多糖藥物制劑具有治療急、慢性胃炎、胃潰瘍、慢性萎縮性胃炎，提高免疫力、抗癌、降血脂等藥理活性。
一、猴頭菌硫酸酯蛋白多糖對(duì)慢性萎縮性胃炎的作用1、實(shí)驗(yàn)材料及方法1.1動(dòng)物Wistar雄性大鼠，購(gòu)自長(zhǎng)春高新醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，合格10-5112，體重220-260g。
1.2藥物藥名、來(lái)源、批號(hào)、配制方法。
1.3模型的制備1.3.1慢性萎縮性胃炎模型1.3.1.1佐劑抗原的制備取160-180gWistar大鼠，將其饑餓24h后處死取胃黏膜，每只鼠胃黏膜加生理鹽水3ml，利用組織勻漿機(jī)將其打勻，然后加入等體積液體石臘制備成均勻的乳劑，備用。
1.3.1.2.模型的制備取220-260g大鼠90只，在每只大鼠2點(diǎn)背部皮下注射佐劑抗原2ml，每點(diǎn)1ml，2周后重復(fù)1次，再1周后又重復(fù)1次，共免疫3次；自免疫起每隔3天給大鼠灌服豬膽汁2ml/只(膽汁∶甘油＝1∶1)；同時(shí)除灌服豬膽汁當(dāng)天外，每天連續(xù)灌服35天55□熱水。
1.3.1.3.動(dòng)物處理首次免疫35天處死10只大鼠取胃作組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)，可見胃黏膜腺體變薄，胃腺體減少，個(gè)別胃可見有潰瘍、出血、黏膜下大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。
1.3.2應(yīng)激性胃潰瘍模型的制備饑餓24h的大鼠頭朝下將四肢綁扎固定好，18h后處死大鼠，取胃，計(jì)腺胃部出現(xiàn)的潰瘍數(shù)。
1.3.3幽門結(jié)扎性胃潰瘍模型取大鼠，在全麻、無(wú)菌操作下，結(jié)扎幽門。術(shù)后將大鼠禁食、禁水，并防止吞食鼠糞等。18h后，處死大鼠，取胃，計(jì)腺胃部出現(xiàn)的潰瘍數(shù)。
1.3.4.分組及給藥將余下大鼠隨機(jī)分為六組，即模型對(duì)照組，每天給予常水4ml/只，陽(yáng)性藥組，每天給胃樂新沖劑0.68g/kg，猴頭菌硫酸酯蛋白多糖1H，0.306g/kg猴頭菌硫酸酯蛋白多糖1L，0.15g/kg猴頭菌硫酸酯蛋白多糖2H、0.4g/kg猴頭菌硫酸酯蛋白多糖2L。0.2g/kg每天給藥1次，連續(xù)給藥30天，并于每周稱重1次。
1.3.5.對(duì)胃酸及胰淀粉酶的影響動(dòng)物末次給藥后禁食24小時(shí)，處理動(dòng)物，開腹，結(jié)扎幽門、賁門端及約5cm一段十二指腸，并向其內(nèi)分別注射生理鹽水2ml和1ml。收集胃液測(cè)定胃液總酸度，收集腸液測(cè)定胰淀粉酶。
1.3.6.對(duì)胃粘膜病理組織學(xué)變化的影響動(dòng)物自胃竇沿小彎至賁門取材，包埋切片。采用x2檢驗(yàn)。
2.結(jié)果2.1.對(duì)胃酸及胰淀粉酶的影響(見表1.)表1.猴頭菌硫酸酯蛋白多糖1、猴頭菌硫酸酯蛋白多糖2對(duì)慢性萎縮性胃炎大鼠胃酸及胰淀粉酶的影響(x±SD)劑量 動(dòng)物數(shù) 胃酸 胰淀粉酶組 別g/kg 只PH值 OD模型對(duì)照組 蒸餾水4ml 103.31±0.100.14±0.02陽(yáng)性藥 0.68 103.82±0.960.15±0.04猴頭菌硫酸酯蛋白多糖10.30 104.11±0.50*0.16±0.03猴頭菌硫酸酯蛋白多糖10.15 103.62±0.510.15±0.04猴頭菌硫酸酯蛋白多糖20.40 104.09±1.040.15±0.03猴頭菌硫酸酯蛋白多糖20.20 104.31±0.89**0.17±0.02**
注與模型對(duì)照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。1菌絲體；2子實(shí)體由表1可知，猴頭菌硫酸酯蛋白多糖1、猴頭菌硫酸酯蛋白多糖2均可抑制胃酸升高和胰淀粉酶的下降。0.30g/kg猴頭菌硫酸酯蛋白多糖1及0.20g/kg猴頭菌硫酸酯蛋白多糖2對(duì)對(duì)慢性萎縮性胃炎大鼠胃酸升高有明顯的抑制作用，0.20g/kg猴頭菌硫酸酯蛋白多糖2對(duì)對(duì)慢性萎縮性胃炎大鼠胰淀粉酶的下降顯著的抑制作用。
2.2.對(duì)胃黏膜組織形態(tài)學(xué)的影響表2.對(duì)慢性萎縮性胃炎胃粘膜組織形態(tài)學(xué)的影響劑量動(dòng)物數(shù) 胃粘膜變薄 胃腺的減少 血管充血或組別g/kg 只 陰性陰性 出血陰性模型對(duì)照組蒸餾水4ml 129 10 7陽(yáng)性藥0.68 125 54猴頭菌硫酸酯蛋白多糖1 0.30 123*3*4猴頭菌硫酸酯蛋白多糖1 0.15 105 54猴頭菌硫酸酯蛋白多糖2 0.40 126 66猴頭菌硫酸酯蛋白多糖2 0.20 112*3*3注同表1。1菌絲體；2子實(shí)體從附表及表2可見，模型組胃黏膜變薄、腺體減少等現(xiàn)象的陰性率還是明顯高于給藥組，并伴有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)及肌層增厚而猴頭菌硫酸酯蛋白多糖1高劑量及猴頭菌硫酸酯蛋白多糖2低劑量對(duì)上述現(xiàn)象均有明顯的抑制作用而且未見肌層增厚現(xiàn)象。
2.3.對(duì)慢性萎縮性胃炎大鼠體重變化的影響見表3
表3. 對(duì)慢性萎縮性胃炎大鼠體重變化的影響劑量 動(dòng)物數(shù) 體重變化組別g/kg只 0周 1周 2周 3周 4周模型對(duì)照組 蒸餾水4ml 12 256.6±18.6 262.8±17.9 281.0±25.5 280.4±27.0 283.7±27.3陽(yáng)性藥 0.6812 257.9±17.5 264.4±22.5 274.5±23.2 275.3±23.4 280.9±24.0猴頭菌硫酸酯蛋白多糖1 0.3012 258.6±17.8 265.2±23.6 272.4±23.3 270.4±21.9 278.3±23.4猴頭菌硫酸酯蛋白多糖1 0.1512 254.1±19.1 271.6±25.0 278.4±29.3 275.3±32.2 283.7±31.7猴頭菌硫酸酯蛋白多糖2 0.4012 262.8±17.7 280.2±26.3 291.8±27.3 281.6±24.9 290.6±29.5猴頭菌硫酸酯蛋白多糖2 0.2011 259.1±19.1 274.5±28.6 276.7±20.3 272.1±21.1 283.4±22.0表3表明，猴頭菌硫酸酯蛋白多糖1、猴頭菌硫酸酯蛋白多糖2對(duì)慢性萎縮性胃炎大鼠體重的變化無(wú)影響。
上述結(jié)果表明，0.30mg/Kg猴頭菌硫酸酯蛋白多糖1、0.20mg/Kg猴頭菌硫酸酯蛋白多糖2對(duì)大鼠慢性萎縮性胃炎有一定的治療作用。
二、猴頭菌硫酸酯蛋白多糖對(duì)胃潰瘍的作用1.對(duì)大鼠應(yīng)激性胃潰瘍的影響見表4。
表4. 對(duì)大鼠應(yīng)激性胃潰瘍的影響組別 劑量g/kg 動(dòng)物數(shù)只 潰瘍點(diǎn)數(shù)模型對(duì)照組 蒸餾水4ml10 34.03±14.54陽(yáng)性藥 0.68 10 15.06±13.68**猴頭菌硫酸酯蛋白多糖1 0.30 10 16.84±9.31**猴頭菌硫酸酯蛋白多糖1 0.15 10 21.29±10.84**猴頭菌硫酸酯蛋白多糖2 0.40 10 12.62±10.7**猴頭菌硫酸酯蛋白多糖2 0.20 10 18.43±6.09**注同表1。
2.對(duì)大鼠幽門結(jié)扎性潰瘍的影響見表5.
表5. 對(duì)大鼠幽門結(jié)扎性胃潰瘍的影響組別 劑量g/kg 動(dòng)物數(shù)只 潰瘍點(diǎn)數(shù)模型對(duì)照組 蒸餾水4ml 10 31.05±14.34陽(yáng)性藥 0.6810 18.06±7.38**猴頭菌硫酸酯蛋白多糖1 0.3010 15.86±9.58**猴頭菌硫酸酯蛋白多糖1 0.1510 18.24±10.31*猴頭菌硫酸酯蛋白多糖2 0.4010 15.62±10.63**猴頭菌硫酸酯蛋白多糖2 0.2010 19.83±8.72*注同表1。
結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本品對(duì)胃潰瘍及慢性萎縮性胃炎均有良好的治療作用。
三、猴頭菌硫酸酯蛋白多糖的抗衰老作用1、對(duì)果蠅飛翔能力的影響取剛羽化尚未交配的果蠅成蟲，乙醚麻醉后按雌雄分組、每組50只，對(duì)照組置基礎(chǔ)培養(yǎng)基中飼養(yǎng)，給藥組培養(yǎng)基中另加猴頭多糖，含量分別為0.2％和0.5％，均在25±1℃相對(duì)密度65％的暗箱中培養(yǎng)。每2d更換一次培養(yǎng)基，40d后觀察尚存果蠅的飛翔情況，計(jì)算飛翔百分率，結(jié)果見表，表明與對(duì)照組比較，給藥組果蠅飛翔能力均有不同程度的提高，其中0.5％菌絲體多糖對(duì)雄果蠅飛翔能力的提高較為顯著，最高可達(dá)120％，對(duì)劑量的影響，有的隨劑量增加而提高，有的則無(wú)顯著性差異。至于性別的影響，一般來(lái)說(shuō)，雌性比雄性顯著。
表對(duì)果蠅飛翔能力的影響組別劑量(g/kg) 性別 動(dòng)物數(shù)只) 存活數(shù)(只) 存活率(％) 飛翔率(％)對(duì)照組 雌性261142.31硫酸酯蛋白0.2 雌性382668.42***61.7多糖(菌絲體) 0.5 雌性302066.67***57.6硫酸酯蛋白0.2 雌性372362.10***46.8多糖(子實(shí)體) 0.5 雌性382771.05***67.9對(duì)照組 雄性381231.58硫酸酯蛋白0.2 雄性392461.54***94.9多糖(菌絲體) 0.5 雄性181372.22***129.0硫酸酯蛋白0.2 雄性221254.50***72.6多糖(子實(shí)體) 0.5 雄性361952.76***66.9***P＜0.012、對(duì)剛孵化果蠅和小鼠主肌組織脂褐質(zhì)含量的影響果蠅分組和給藥同上，飼養(yǎng)40d后，各組果蠅分成若干標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本中果蠅6只，按文獻(xiàn)方法測(cè)定其熒光強(qiáng)度。
另取雄性小鼠，體重25±1g，隨機(jī)分成5組，分別ip不同劑量的多糖，每天一次，對(duì)照組ip等量生理鹽水，連續(xù)13d后，測(cè)定心肌組織脂褐質(zhì)含量。
結(jié)果見表，表明；各給藥組果蠅脂褐質(zhì)含量均比對(duì)照組明顯降低，其中尤以對(duì)雄性果蠅脂褐質(zhì)含量的影響更明顯，最高可降42％，劑量加大，作用更明顯；ip子實(shí)體多糖100，50mg/kg，小鼠心肌脂褐質(zhì)含量分別下降27.4％和17.6％，而ip菌絲體多糖同樣劑量，則分別下降14.1％和2.7％，表明子實(shí)體蛋白多糖的作用較差。
表對(duì)果蠅和小鼠心肌組織脂褐質(zhì)含量的影響(X±S)組別 性別 動(dòng)物數(shù)只) 劑量(％或mg/kg×d) 褐質(zhì)含量飛翔率(％)對(duì)照組 雄性7 56.51±9.27硫酸酯蛋白 雄性60.2％46.76±4.50**17.3多糖(子實(shí)體) 雄性60.5％39.66±3.15***29.8硫酸酯蛋白 雄性60.2％50.15±9.18*11.3多糖(菌絲體) 雄性70.5％31.20±4.71***42.3對(duì)照組 雌性5 16.48±1.35硫酸酯蛋白 雌性50.2％14.75±1.73*10.5多糖(子實(shí)體) 雌性50.5％13.88±1.34**15.8硫酸酯蛋白 雌性60.2％15.45±2.80*6.2多糖(菌絲體) 雌性60.5％14.06±1.80**14.7P＞0.05；**P＜0.013、對(duì)小鼠腦和肝臟中SOD含量的影響取健康雄性小鼠，分組和給藥同前，ip子實(shí)體多糖和菌絲體多糖(50，100mg/kg)13d后將小鼠處死，立即取出腦和肝臟，用生理鹽水洗凈、吸干、稱重，以0.5mol/L pH7.8磷酸鹽緩沖液5ml制成勻漿，2000r/min離心5min，取上清液，采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD活力，F(xiàn)olin-酚法測(cè)蛋白質(zhì)含量，結(jié)果見表，表明給藥組小鼠腦和肝臟中SOD和比活力均明顯增加，例如子實(shí)體多糖50mg/μg，對(duì)腦和肝臟SOD活力最多可分別提高71％和56％，而菌絲體多糖的作用稍差。劑量的影響則無(wú)一定的規(guī)律。
表對(duì)小鼠腦和肝臟中SOD含量的影響SOD含量劑量 動(dòng)物數(shù)組別腦增高％ 肝 增高％(g/kg) (只)對(duì)照組 865.38±8.0156.03±8.08硫酸酯蛋白100×138 104.62±12.28***60.0 86.03±4.46***53.50多糖(菌絲體) 50×13 8 112.01±25.28***71.30 87.57±22.07***56.30硫酸酯蛋白100×138 103.40±26.12***58.10 27.55±13.43***38.40多糖(子實(shí)體) 50×13 8 94.88±13.31***45.30 81.22±8.65***48.0***P＜0.01四、猴頭菌硫酸酯蛋白多糖的免疫調(diào)節(jié)作用1、胸腺細(xì)胞(前T細(xì)胞)增殖反應(yīng)參考Mosmann方法稍加改進(jìn)。無(wú)菌摘取胸腺，剔除周圍脂肪，剪碎組織置鋼性細(xì)胞篩擠壓，同時(shí)用含有10％FCS(小牛血清)的培養(yǎng)基(RPMI-1640，每毫升含100u的青霉素G和100μg的鏈霉素以及3μg的二性霉素B，美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品)沖洗，制成單個(gè)胸腺細(xì)胞懸液，洗滌2次(1500r/min，5min)，重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)至1×107/ml，并加入96孔平底培養(yǎng)板，每孔100μl，再加入各樣品，每孔μl，使每孔的總體積為200μl，重復(fù)3份。置5％CO2/95％空氣(無(wú)菌)，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，在培養(yǎng)結(jié)束前4h，加入MTT(pH6.9，磷酸鹽緩沖液(PBS)配制)每孔10μl，使終濃度達(dá)到0.5mg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)后，用96孔平板離心機(jī)離心(1500r/min，10min)，棄上清，經(jīng)PBS洗滌1次后，每孔加入100μl含0.04mol/L HCl的酸化異丙醇(50ml異丙醇+濃HCl 0.167ml)，振蕩(微型振蕩器)約5～10min后，用DG-II型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，測(cè)定各樣品光密度OD值，選擇波長(zhǎng)為570nm和630 nm(參考波長(zhǎng))。
2、脾臟淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)參考Mosmann方法稍加改進(jìn)。無(wú)菌取脾臟，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，并采用低滲法破壞紅細(xì)胞，洗滌后，重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整至5×106/ml。操作步驟與胸腺細(xì)胞增殖反應(yīng)相同。
結(jié)果1、胸腺細(xì)胞(前T細(xì)胞)增殖反應(yīng)猴頭菇多糖不同劑量與ConA聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)小鼠胸腺細(xì)胞有顯著的促進(jìn)增殖作用。當(dāng)Con A濃度在2μg/ml時(shí)(n＝3，下同)，加入猴頭菇多糖濃度為0、0.78、1.56、3.12、6.25、12.5、25μg/ml，胸腺細(xì)胞增殖的OD值分別為0.14±0.01、0.15±0.01、0.17±0.02、0.20±0.01*、0.25±0.02*、0.35±0.03**、0.44±0.01**(與對(duì)照組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01)。當(dāng)單獨(dú)使用猴頭菇多糖(同上各濃度，n＝3，對(duì)照組)時(shí)均未顯示促進(jìn)作用。猴頭菇多糖協(xié)同Con A對(duì)胸腺細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，并隨多糖濃度的提高而增強(qiáng)。
2、脾臟淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)單獨(dú)使用猴頭菇多糖，對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞有顯著的促進(jìn)增殖的作用。但對(duì)由LPS激活的B淋巴細(xì)胞增殖，猴頭茹多糖未見有協(xié)同作用。
五、猴頭菌硫酸酯蛋白多糖的抗疲勞作用1、對(duì)小鼠血清LDH活力的影響在實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)第60天分別采尾血，用乳酸脫氫酸試劑盒(由北京中生生物工程高技術(shù)公司生產(chǎn))測(cè)定血清LDH活力。小鼠實(shí)驗(yàn)前后血清LDH活力的變化見表。
表猴頭菌實(shí)體(菌絲體)對(duì)小鼠血清乳酸脫氫酶(LDH)活力的影響動(dòng)物數(shù)(只)組別實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)后對(duì)照組 12 427±47 449±54猴頭菌硫酸酯蛋白多糖I 12 429±59 617±53**猴頭菌硫酸酯蛋白多糖II 12 431±31 533±35*結(jié)果表明，I組實(shí)驗(yàn)以后LDH活力比實(shí)驗(yàn)前增加44％，比對(duì)照組實(shí)驗(yàn)后增加37％，差異極顯著(P＜0.01)；II組實(shí)驗(yàn)后LDH活力比實(shí)驗(yàn)前增加24％，比對(duì)照組實(shí)驗(yàn)后增加19％，差異顯著(P＜0.05)；而對(duì)照組實(shí)驗(yàn)前后LDH活力無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
2、對(duì)小鼠血乳酸的影響實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)第60天分別讓小鼠在30±2℃水中游泳40min。泳前安靜時(shí)及泳后20，50min各采尾血一次，用全血乳酸分光光度法測(cè)定血乳酸含量。小鼠實(shí)驗(yàn)前后血乳酸含量的變化見表。
表猴頭子實(shí)體(菌絲體)對(duì)小鼠血乳酸含量的影響動(dòng)物數(shù)組別實(shí)驗(yàn)前 鍛煉后20分鐘 鍛煉后50分鐘(只)實(shí)驗(yàn)前對(duì)照組 1211.48±0.37 21.12±12.28 17.60±1.01猴頭菌硫酸酯蛋白多糖I1211.74±0.21 20.78±2.0316.28±0.35猴頭菌硫酸酯蛋白多糖II 1210.03±0.56 21.43±0.7517.03±0.72實(shí)驗(yàn)后對(duì)照組 1211.16±0.72 20.31±0.9715.98±0.37猴頭菌硫酸酯蛋白多糖I1210.20±0.27 15.20±0.28*9.64±0.44**猴頭菌硫酸酯蛋白多糖II 1210.46±0.43 16.04±0.59*10.00±0.67**結(jié)果表明，I、II組和對(duì)照組血乳酸的安靜值及運(yùn)動(dòng)后20，50min血乳酸值均無(wú)顯著差異(P＞0.05)；對(duì)照組實(shí)驗(yàn)前后血乳酸值也無(wú)顯著差異(P＞0.05)。I、II組第60天運(yùn)動(dòng)后20，50min血乳酸值不僅明顯低于對(duì)照組，也低于本組實(shí)驗(yàn)前的水平(P＜0.05或P＜0.01)。
小鼠運(yùn)動(dòng)后20-50min血乳酸的清除速率是以運(yùn)動(dòng)后20min的血乳酸值減去運(yùn)動(dòng)后50min的血乳酸值，所得差再除以30min得出的。計(jì)算結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)第60天猴頭菇I組運(yùn)動(dòng)后血乳酸的清除速率比對(duì)照組提高43％(P＜0.05)，比本組實(shí)驗(yàn)前提高43％(P＜0.05)；猴頭菇II組運(yùn)動(dòng)后血乳酸的清除速率比對(duì)照組提高36％(P＜0.05)，比本組實(shí)驗(yàn)前提高27％(P＜0.05)。
3、對(duì)小鼠血清BUN的影響實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)第60天分別讓小鼠在30±2℃水中游泳1h，泳前安靜時(shí)及泳后1.5h各取尾血一次，用尿素氮試劑盒(由保定長(zhǎng)城臨床試劑公司生產(chǎn))測(cè)定血清BUN含量。將測(cè)得的小鼠運(yùn)動(dòng)后BUN含量減去安靜值，即得BUN增量值。用I、II組運(yùn)動(dòng)后BUN的增量與對(duì)照組進(jìn)行比較，結(jié)果實(shí)驗(yàn)第60天I、II組的BUN增量不僅低于對(duì)照組，而且也低于本組實(shí)驗(yàn)前的水平，差異極顯著(P＜0.01)。
4、對(duì)小鼠肝糖原、肌糖原含量的影響在實(shí)驗(yàn)第60天將小鼠斷頭處死，立即取肝臟和后肢肌肉，用三氯醋酸沉淀蛋白，用酒精沉淀糖原，用蒽酮比色法測(cè)定糖原含量。小鼠實(shí)驗(yàn)后肝糖原及肌糖原的的含量見表。
表猴頭子實(shí)體(菌絲體)菇對(duì)小鼠肝糖原和肌糖原含量的影響動(dòng)物數(shù)(只)組別肝糖原肝肉糖原對(duì)照組1236.50±4.253.05±0.15猴頭菌硫酸酯蛋白多糖I1259.00±5.31*5.25±0.27*猴頭菌硫酸酯蛋白多糖II 1258.50±7.28*4.95±0.53*結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)第60天I組的肝糖原比對(duì)照組增加62％，肌糖原增加72％(P＜0.05)；II組肝糖原比對(duì)照組增加60％，肌糖原增加62％(P＜0.05)。
5、對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的影響實(shí)驗(yàn)第60天將小鼠置30±2℃水中游泳，直至全部淹死為止，記錄每只小鼠游泳時(shí)間。各組小鼠游泳時(shí)間為I組(n＝12)174±18min，II組(n＝12)169±20min，對(duì)照組(n＝12)128±13min。結(jié)果表明，I、II組運(yùn)動(dòng)耐力明顯強(qiáng)于對(duì)照組(P＜0.05)。
本實(shí)驗(yàn)所作運(yùn)動(dòng)耐力測(cè)定結(jié)果足以證明猴頭菌子實(shí)體(菌絲體)能促進(jìn)小鼠新陳代謝，具有明顯的抗疲勞作用。
六、HEPS對(duì)S180肉瘤和荷瘤小鼠免疫臟器的影響1.1材料1.1.1猴頭多糖本室制備1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，體重18～22g。
1.1.3動(dòng)物分組與劑量設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按體重隨機(jī)分為4組，1個(gè)溶劑對(duì)照組，3個(gè)劑量的實(shí)驗(yàn)組(分別為100、200、400mg/kg體重)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物以0.1mL/10g體重灌胃，每天1次，連續(xù)15d。
1.2方法1.2.1抗S180肉瘤試驗(yàn)及對(duì)荷瘤小鼠免疫臟器的分離稱重?zé)o菌操作，取小鼠腹腔傳代9d的S180腹水瘤(北京市腫瘤防治研究所提供)，調(diào)細(xì)胞濃度為4×109/L，接種在小鼠右前腋部皮下，每只0.2mL。接種后次日給藥，最后一次給藥24h后處死動(dòng)物，取瘤塊稱重，按下式計(jì)算藥物的抑瘤率。
腫瘤抑制率＝(C-T)/C×100％(T為給藥組平均瘤重，C為對(duì)照組平均瘤重)，處死小鼠后立即分離胸腺和脾臟，剔除周圍結(jié)締組織和脂肪，生理鹽水漂洗后用濾紙吸去表面水分，扭力天平稱重。
2 結(jié)果2.1 HEPS對(duì)S180肉瘤和荷瘤小鼠免疫臟器的影響HEPS100、200、400mg/kg體重3個(gè)劑量組連續(xù)15d經(jīng)口灌胃均可顯著抑制S180生長(zhǎng)，抑瘤率達(dá)59.12％～66.5％。與陰性對(duì)照組比較P＜0.01，其中200mg/kg組抑瘤率達(dá)66.5％，3個(gè)劑量組與對(duì)照組比較均可顯著增加荷瘤小鼠的胸腺及脾臟重量(P＜0.01)，見表1。3個(gè)劑量組兩兩比較，脾指數(shù)、胸腺指數(shù)、瘤重各項(xiàng)差異均無(wú)顯著性。
表1 HEPS對(duì)S180肉瘤及荷瘤小鼠免疫器官的影響(X±S)瘤重 抑瘤率 脾指數(shù)組別 動(dòng)物數(shù)胸腺指數(shù)mg/gg％ mg/g生理鹽水組 10 1.9±0.6 2.5±0.44.8±1.0HEPS 100mg/kg組10 0.7±0.51)59.454.1±0.51)7.8±1.11)HEPS 200mg/kg組10 0.6±0.71)66.504.4±0.61)8.0±0.81)HEPS 400mg/kg組10 0.7±0.61)59.124.3±0.51)7.9±0.61)
本次實(shí)驗(yàn)以移植的S180肉瘤觀察了HEPS的抗腫瘤效果，結(jié)果顯示HEPS3個(gè)劑量組都可顯著抑制S180肉瘤的生長(zhǎng)，表明HEPS具有抗腫瘤作用。這一結(jié)果與有關(guān)多糖類成分抑瘤效應(yīng)的結(jié)果是一致的。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在進(jìn)一步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)或改變都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
實(shí)施例1取猴頭菌絲體浸膏100g，加水稀釋，攪拌2小時(shí)，離心(3000轉(zhuǎn))20分鐘，上清液加乙醇至醇濃度為80％，離心(3000轉(zhuǎn))20分鐘，收集沉淀，加少量水溶解，真空干燥為粗品多糖。將粗品多糖加水溶解，加乙醇至醇濃度為60％，離心(3000轉(zhuǎn))20分鐘，收集沉淀，加少量水溶解，冷凍干燥即得。
實(shí)施例2取猴頭菌絲體浸膏100g，加水稀釋，攪拌2小時(shí)，離心(3000轉(zhuǎn))20分鐘，上清液加乙醇至醇濃度為80％，離心(3000轉(zhuǎn))20分鐘，收集沉淀，加少量水溶解，真空干燥為粗品多糖。將粗品多糖加水溶解，加乙醇至醇濃度為80％，離心(3000轉(zhuǎn))20分鐘，收集沉淀，加少量水溶解，冷凍干燥即得。
實(shí)施例3取猴頭子實(shí)體100g，洗凈，加30倍量水，煎煮3小時(shí)，濾過(guò)，反復(fù)3次，合并3次煎煮液，濃縮至800ml，加乙醇至醇濃度為80％，收集沉淀，真空干燥得粗多糖。取粗多糖，加適量水稀釋，攪拌，加乙醇至醇濃度為60％，收集沉淀，加少量水溶解，冷凍干燥即得。
實(shí)施例4取猴頭子實(shí)體100g，洗凈，加30倍量水，煎煮3小時(shí)，濾過(guò)，反復(fù)3次，合并3次煎煮液，濃縮至800ml，加乙醇至醇濃度為80％，收集沉淀，真空干燥得粗多糖。取粗多糖，加適量水稀釋，攪拌，加乙醇至醇濃度為80％，收集沉淀，加少量水溶解，冷凍干燥即得。
實(shí)施例5任意稱取實(shí)施例1～4中所得的猴頭菌硫酸酯蛋白多糖1000g，藥用淀粉500g，混合均勻，用適量乙醇制粒，經(jīng)整粒機(jī)整粒，壓片，每片0.25g，口服，每次1-2片，每日兩次。其它項(xiàng)目應(yīng)符合中華人民共和國(guó)藥典2000版片劑項(xiàng)目有關(guān)要求。
實(shí)施例6任意稱取實(shí)施例1～4中所得的猴頭菌硫酸酯蛋白多糖原料500g，藥用淀粉500g，混合均勻，裝入0#膠囊，每粒0.30g，每次口服1-2粒，每日兩次。其它項(xiàng)目應(yīng)符合中華人民共和國(guó)藥典2000版膠囊項(xiàng)目有關(guān)要求。
實(shí)施例7任意稱取實(shí)施例1～4中所得的猴頭菌硫酸酯蛋白多糖原料100g，淀粉1000g，糖粉400g，混合均勻，用適量乙醇制粒，干燥、整粒、分裝即得。口服，一次5g，一日兩次。其它項(xiàng)目應(yīng)符合中華人民共和國(guó)藥典2000版顆粒劑項(xiàng)目有關(guān)要求。
實(shí)施例8取實(shí)施例1～4中所得的猴頭菌硫酸酯蛋白多糖原料1kg，按滴丸常規(guī)制法制成滴丸，每粒0.2g。其它項(xiàng)目應(yīng)符合中華人民共和國(guó)藥典2000版滴丸項(xiàng)目有關(guān)要求。
權(quán)利要求
1.一種猴頭菌硫酸酯蛋白多糖，其特征在于分子量為1.6～2.6×104，是由蛋白、糖、硫酸基三大部分組成的硫酸酯蛋白多糖，各部分含量為糖62.52％，蛋白7.49％，硫酸基(按-SO3計(jì))18.50％，金屬離子12.6％，總和為101.30％；是以結(jié)合形式和糖鏈聯(lián)接在一起；HPGPC分析是一單一對(duì)稱峰，為均一多糖；由Ara、Man、Glc三種單糖組成，摩爾比為1∶8.37∶27.24；元素分析結(jié)果S的含量7.4％；紅外光譜分析結(jié)果證明有S＝O雙鍵和C-O-S特征吸收峰。
2.一種猴頭菌硫酸酯蛋白多糖的提取工藝，其特征在于將猴頭菌絲發(fā)酵浸膏，加水稀釋1～2倍，脫脂棉濾過(guò)，濾液加乙醇至醇濃度為80％，離心，收集沉淀，真空干燥得猴頭多糖粗品，將粗品配成水溶液，加乙醇至醇濃度為60％，離心、收集沉淀，加少量水溶解，凍干制成成品。
3.一種猴頭菌硫酸酯蛋白多糖的提取工藝，其特征在于取猴頭菌子實(shí)體，加水10～20倍量煎煮，濾過(guò)取濾液，反復(fù)1～3次，合并濾液，濃縮至浸膏，加乙醇至醇濃度為80％，離心，收集沉淀，真空干燥，制得粗多糖部分，將粗多糖加水溶解，加乙醇至乙醇濃度為60％，離心，收集沉淀，加少量水溶解，凍干制成成品。
4.藥物組合物，其中含有權(quán)利要求1的猴頭菌硫酸酯蛋白多糖為主要藥物并含有常規(guī)藥用載體。
5.權(quán)利要求1所述的猴頭菌硫酸酯蛋白多糖，在治療急、慢性胃炎、胃潰瘍、慢性萎縮性胃炎的醫(yī)用用途。
6.權(quán)利要求1所述的猴頭菌硫酸酯蛋白多糖，在提高免疫力、治療抗癌的醫(yī)用用途。
7.權(quán)利要求1所述的猴頭菌硫酸酯蛋白多糖，在降血脂的醫(yī)用用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所說(shuō)藥物，是任何一種藥劑學(xué)上所說(shuō)的劑型。
全文摘要
本發(fā)明公開一種猴頭菌硫酸酯蛋白多糖，同時(shí)提供了其制備方法和以該化合物為活性的藥物組合物，分子量為1.6～2.6×10
文檔編號(hào)A61K38/02GK1546533SQ20031011586
公開日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2003年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月3日
發(fā)明者高其品, 姜瑞芝, 楊勇杰 申請(qǐng)人:高其品, 姜瑞芝