專利名稱：大菱鲆彈狀病毒毒株及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)動物疾病病原及分離、體外培養(yǎng)與鑒定技術(shù)，特別涉及海洋養(yǎng)殖魚類病毒的體外增殖、檢測診斷技術(shù)。更具體涉及一種大菱鮃彈狀病毒毒株，還涉及一種大菱鲆彈狀病毒毒株的制備方法，同時還涉及一種生物學(xué)方法在鑒定海水魚類彈狀病毒和海水魚彈狀病毒在細(xì)胞工程疫苗制備中的用途。
背景技術(shù)：
大菱鲆(Scophthalmus maximus，turbour)是一種原產(chǎn)于歐洲的冷水性底棲鰈形目海水魚類，也是當(dāng)?shù)刂暮ＫB(yǎng)殖良種。由于大菱鲆口感爽滑細(xì)嫩而鮮美、骨刺少，無腥異味、鰭邊和皮下有豐富的膠質(zhì)，可與甲魚和海參相比美，是理想的保健和美容食品。大菱鲆性格溫順，無互殘現(xiàn)象，且生長迅速，容易接受配合飼料，食物轉(zhuǎn)換效率高達(dá)1∶1，易于集約化養(yǎng)殖等特點(diǎn)，受到國際海水養(yǎng)殖業(yè)的高度重視，且有比目魚特有身姿，在水體中可營造多姿多彩，輕蝶漫舞的觀賞效果，迅速成為全世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的新貴。我國于90年代初引種，目前在工廠化條件下，5cm的魚苗養(yǎng)殖一年，體重可達(dá)800-1000g。但隨養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，大菱鲆的疾病也日益突出，尤其是病毒引起的病害[Angulo等，1994，J.Fish Dis.17163-169；Breton等，1997，J.Fish Dis，20145-152]，已成為大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的制約因素。
大菱鲆病毒病有些是通過投餌水平傳播，如病毒性神經(jīng)壞死病[Breton等，1997]和傳染性胰臟壞死病[Mortensen等，1995，J World Aqacul.Soci.26217-219]。有些疾病是通過水體或與患病魚直接接觸而傳播的。還有一種球形病毒粒子，直接攻擊大菱鲆的血細(xì)胞，通過影響紅細(xì)胞的功能而造成魚體缺氧[Lamas等，1995，J.Fish Dis，18425-433]。養(yǎng)殖密度增加，為大菱鲆病毒病傳播提供了更多的機(jī)會。
已知的水生動物彈狀病毒多數(shù)是魚類烈性病原體，如病毒性敗血癥病毒(VHSV)是魚類敗血癥的病原體，它們能引起宿主動物嚴(yán)重的致死性疾病，發(fā)病宿主在1周內(nèi)死亡率可達(dá)100％。此外還有梭子魚彈狀病毒(pike fry rhabdovirus)、烏鱧魚彈狀病毒(snakehead rhabdovirus)、鯉春病毒血癥病毒(spring viremia of carp)、藍(lán)點(diǎn)麗魚彈狀病毒(Rio grande cichlid rhabdovirus)和鱸魚彈狀病毒(perch rhabdovirus)多種。這些彈狀病毒都能導(dǎo)致魚類發(fā)病和死亡，造成重經(jīng)濟(jì)大損失。因此，建立相應(yīng)的方法，對大菱鲆病毒病原進(jìn)行分離，尤其是彈狀病毒引起的暴發(fā)性疾病進(jìn)行鑒定，可建立相應(yīng)的早期診斷技術(shù)，并了解其流行趨勢，結(jié)合研制相應(yīng)的病毒疫苗，從而能對其傳播起到有效的監(jiān)控與預(yù)防作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種大菱鲆彈狀病毒毒株，大菱鲆彈狀病毒毒株在CLC0207細(xì)胞中高效增殖，增殖效價可達(dá)到108TCID50/ml。
本發(fā)明的另一個目的還涉及一種制備大菱鲆彈狀病毒毒株的制備方法，該方法簡單易行，并能在體外大量擴(kuò)增鲆魚彈狀病毒，解決了大菱鲆病毒的魚體感染實(shí)驗(yàn)條件難以控制，成本高，重復(fù)性差的問題。
本發(fā)明還涉及一種大菱鲆彈狀病毒毒株在生物學(xué)方法鑒定海水魚類彈狀病毒中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及一種大菱鲆彈狀病毒毒株在準(zhǔn)確有效的魚類彈狀病毒檢測與診斷中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及一種大菱鲆彈狀病毒毒株在海水魚彈狀病毒細(xì)胞工程疫苗制備中的應(yīng)用。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案從患致死性疾病的大菱鲆中分離到一株彈狀病毒，稱為大菱鲆彈狀病毒(Scophthalmus maximus rahbdovirus，SMRV0207)，CCTCC NOV202006經(jīng)對多種魚類細(xì)胞的接種實(shí)驗(yàn)證明，這種病毒可引起宿主細(xì)胞產(chǎn)生裂解性病變。這是一種宿主范圍較廣的魚類彈狀病毒病原。同其它動物的病毒病一樣，迄今尚無藥物能有效控制它們，只有通過病毒疫苗進(jìn)行免疫的途經(jīng)，才為預(yù)防病毒病、保持大菱鲆健康養(yǎng)殖展示希望。本實(shí)驗(yàn)室利用具有魚類細(xì)胞庫的優(yōu)勢條件，通過培養(yǎng)魚類細(xì)胞對養(yǎng)殖大菱鲆是否被病毒感染進(jìn)行常規(guī)檢測時發(fā)現(xiàn)我國沿海某養(yǎng)殖場的大菱鲆被一種彈狀病毒所感染。進(jìn)行魚體攻毒實(shí)驗(yàn)和體外培養(yǎng)細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合電鏡觀察、流式細(xì)胞技術(shù)檢測、以及電泳等生化方法分析，顯示該病毒可以引起宿主細(xì)胞凋亡，證實(shí)了這株彈狀病毒是大菱鲆的致死性病原。為此，我們經(jīng)對該病毒進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)、反復(fù)分離和篩選、測定病毒結(jié)構(gòu)蛋白和進(jìn)行PCR擴(kuò)增等系列研究，獲得了毒力較強(qiáng)(效價為108TCID50/ml)、生物遺傳性能穩(wěn)定、可進(jìn)行純培養(yǎng)的魚類彈狀病毒株SMRV0207。
患病大菱鲆的病癥是在體表、皮膚上出現(xiàn)了許多小泡和出血點(diǎn)，肝臟有深淺不勻花斑，腎組織糜爛，體表病癥出現(xiàn)24小時，病魚就會死亡。取病魚的組織材料，制備成組織勻漿液，接種到敏感細(xì)胞中，進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng)；或取病魚的組織材料直接用戊二醛固定后，制備超薄切片，用于電鏡觀察。
對SMRV0207感染CLC0207細(xì)胞的超薄切片進(jìn)行電鏡觀察，表明與在患病大菱鲆細(xì)胞中所觀察到的情況一致，大菱鲆彈狀病毒形態(tài)特征是細(xì)胞內(nèi)有很多大小為110-150×40-60nm、形態(tài)是一端尖頭、另一端平頭的彈狀病毒。
以患病或?yàn)l死的大菱鲆組織作為材料，從不同方面對其中的彈狀病毒進(jìn)行了體外培養(yǎng)和鑒定。包括A、患病大菱鲆魚組織制備成勻漿液后，感染不同的魚類細(xì)胞，明確CLC0207細(xì)胞對SMRV0207敏感，接種病毒后會產(chǎn)生病變斑，且SMRV0207病毒株在CLC0207細(xì)胞中的增殖效價可達(dá)到108TCID50/ml。
B直接固定新鮮的病魚組織樣品，經(jīng)超薄切片、染色后進(jìn)行超微觀察，明確病毒的大小、形態(tài)及引起宿主細(xì)胞的超微病理變化。


圖1、大菱鲆彈狀病毒SMRV0207的超微形態(tài)，圖中顯示有大量大小為110-150×40-60nm、形態(tài)是一端尖頭、另一端平頭的彈狀病毒。x 30 000圖2、(A)、正常的CLC0207細(xì)胞和(B)、感染SMRV0207，且出現(xiàn)病變的CLC0207細(xì)胞顯微照片。x 40圖3、SMRV0207感染CLC0207細(xì)胞的電鏡照片，感染細(xì)胞中出現(xiàn)空泡。x 4 000具體實(shí)施方式
所有用于細(xì)胞培養(yǎng)和病毒擴(kuò)增的器皿器材、培養(yǎng)基、試劑均要求事先經(jīng)高壓滅菌或過濾除菌等處理，保持無菌。部分常用試劑的配制方法如下磷酸鹽緩沖液(PBS，無Ca++、Mg++)NaCl 8.00gKCl0.20gNa2HPO42.31gKH2PO40.31g溶于500ml雙蒸水中，加入5ml 0.4％酚紅液，攪拌均勻后加雙蒸水至1000ml。10磅15分鐘滅菌備用。
雙抗(青霉素、鏈霉素)溶液將106單位青霉素G和106μg鏈霉素溶解于100ml滅菌的三蒸水中，使每ml青霉素104單位，鏈霉素104μg。
TC119培養(yǎng)基將購置來的TC199培養(yǎng)基粉劑，按說明書要求的量，加入用新鮮的三蒸水稀釋，充分溶解后加入血清(10％新生牛血清)、雙抗，并加入碳酸輕鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4，再用三蒸水定容后，經(jīng)濾器過濾，分裝。
病毒接種和擴(kuò)增的操作步驟
將患病大菱鲆的肝、腎、心、脾組織取出后，剪碎、加入1-2倍體積的PBS進(jìn)行勻漿，再加入雙抗，置冰箱-20℃冰凍過夜，次日取出待其融化后，以1000-2000轉(zhuǎn)/分的速度離心10分鐘，獲SMRV0207病毒粗提液。將制備好的SMRV0207病毒粗提液經(jīng)過濾后，分別接種到已長成單層的CLC0207細(xì)胞中。同時設(shè)有相應(yīng)的正常細(xì)胞對照，并置溫度為20℃的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。利用光學(xué)顯微鏡，對接種了病毒的活體細(xì)胞定時觀察，并與相應(yīng)的正常細(xì)胞作比較。接種病毒后12-24小時，在倒置顯微鏡下可見到在原本致密的CLC0207細(xì)胞單層中，先后出現(xiàn)了病變斑，開始是分散的少量細(xì)胞脫落所形成的小空洞，空洞逐漸增大(圖2)。對在此時段所取的、SMRV0207感染細(xì)胞制備的電鏡樣品進(jìn)行觀察，顯示鱖魚彈狀病毒已在宿主細(xì)胞內(nèi)大量增殖，且細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的病變(圖3)。隨后細(xì)胞單層中尚未脫落的細(xì)胞形成網(wǎng)狀。
一種海水魚彈狀病毒的鑒定方法將待檢魚的組織勻漿液接種到長成單層的CLC0207細(xì)胞(為本發(fā)明所采用細(xì)胞)中，25℃-30℃下培養(yǎng)12小時左右，經(jīng)光鏡觀察，可見是否出現(xiàn)貼壁細(xì)胞局部脫落的現(xiàn)象。收集擴(kuò)增了病毒的細(xì)胞，再進(jìn)行電鏡制樣和觀察，就可較容易確定待檢魚是否被彈狀病毒感染。
一種海水魚彈狀病毒細(xì)胞工程疫苗的制備方法首先獲得了病毒株SMRV0207的純培養(yǎng)物。
其次，篩選到適宜于病毒株SMRV0207高效價增殖的敏感細(xì)胞CLC0207細(xì)胞。
再者，通過后述方法和步驟，可制備魚的彈狀病毒細(xì)胞工程疫苗。CLC0207細(xì)胞用199培養(yǎng)基(商品培養(yǎng)基)+10％小牛血清，置25℃-30℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，長成單層后，接種0.1ml(含105TCID50/ml)的SMRV0207病毒懸液，繼續(xù)培養(yǎng)12-20小時，收集含擴(kuò)增病毒的細(xì)胞液，用0.1-0.5％的甲醛，在30℃-56℃下處理4-6小時，無菌分裝、凍存、就制備出海水魚多抗原組分的細(xì)胞工程彈狀病毒疫苗。該疫苗使用安全，且可批量生產(chǎn)。
由于建立了病毒的體外擴(kuò)增系統(tǒng)，篩選到敏感宿主細(xì)胞，因此，疫苗的免疫效果及安全性實(shí)驗(yàn)可通過這一系統(tǒng)來測定。實(shí)施過程舉例先將CLC0207細(xì)胞傳到96孔細(xì)胞板中，待其長成單層后，分為三組。其中一組為正常細(xì)胞對照；一組接種SMRV0207病毒；另一組先接種疫苗，再用SMRV0207病毒攻毒。經(jīng)顯微觀察，就可知細(xì)胞病變情況及疫苗的免疫保護(hù)率(見表1)。
表1疫苗保護(hù)率測試實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組編號 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞孔數(shù) 出現(xiàn)病變細(xì)胞孔數(shù) 末出現(xiàn)病變細(xì)胞孔數(shù) 保護(hù)率％第1組(細(xì)胞對照組)32032第2組(直接攻毒組)3232 0 0第3組(疫苗保護(hù)組)32131 97％
體外培養(yǎng)的細(xì)胞比動物機(jī)體對毒性及環(huán)境因素的影響更為敏感，因此疫苗的安全性實(shí)驗(yàn)也可借助細(xì)胞來測定。施過程舉例先將CLC0207細(xì)胞傳到24孔細(xì)胞板中，待其長成單層后，分為兩組。其中一組為正常細(xì)胞對照；一組接種SMRV0207疫苗，顯微觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)病變，就可知疫苗是否安全(見表2)。
表2疫苗安全性測試實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組編號 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞孔數(shù) 出現(xiàn)病變細(xì)胞孔數(shù) 未出現(xiàn)病變細(xì)胞孔數(shù) 安全率％第1組(細(xì)胞對照組)12012第2組(接種疫苗組)12012 100
權(quán)利要求
1.一種大菱鲆彈狀病毒毒株，其特征在于大菱彈狀病毒毒株Scophthalmus maximusrahbdovirus，SMRV0207，CCTCC NOV202006。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種大菱鲆彈狀病毒毒株，其特征在于大菱鲆彈狀病毒是大小為110-150×40-60nm、形態(tài)是一端尖頭、另一端平頭的彈狀病毒。
3.一種實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述的一種大菱鲆彈狀病毒毒株的制備方法，其特征在于將患病大菱鲆的肝、腎、心、脾組織取出后，剪碎、加入1-2倍體積的PBS進(jìn)行勻漿，再加入雙抗，置冰箱-20℃冰凍，取出融化后，以1000-2000轉(zhuǎn)/分的速度離心10分鐘，獲SMRV0207病毒粗提液，將SMRV0207病毒粗提液經(jīng)過濾后，分別接種到已長成單層的CLC0207細(xì)胞中，溫度為20℃的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
4.權(quán)利要求1所述的一種大菱鲆彈狀病毒毒株在生物學(xué)方法鑒定海水魚類彈狀病毒中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的一種大菱鲆彈狀病毒毒株在魚類彈狀病毒檢測與診斷中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的一種大菱鲆彈狀病毒毒株在海水魚彈狀病毒細(xì)胞工程疫苗制備中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大菱鲆彈狀病毒毒株及其制備方法和應(yīng)用，大菱鲆彈狀病毒毒株Scophthalmus maximusrahbdovirus，SMRV
文檔編號A61K39/12GK1500866SQ200310116250
公開日2004年6月2日 申請日期2003年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月14日
發(fā)明者張奇亞, 李正秋, 桂建芳 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所