專利名稱：人的腫瘤－睪丸抗原h(huán)ca587的抗原決定簇多肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類抗原決定簇多肽，尤其涉及人的腫瘤-睪丸抗原HCA587上的抗原決定簇多肽，并進一步涉及這些抗原肽及其衍生物在肝癌及其它腫瘤的治療、診斷和預(yù)防中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤的發(fā)生是一個多階段、多步驟的過程，這一過程中伴隨著機體許多的細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)的改變，出現(xiàn)多種基因表達異常，包括癌基因的激活和/或抑癌基因滅活，激發(fā)異常的信號傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡異常，從而使得細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，并隨著各種分子異常的累積，腫瘤出現(xiàn)進展、轉(zhuǎn)移。因此，了解這些在腫瘤發(fā)生過程中、在腫瘤組織中特異表達的基因?qū)τ谀[瘤發(fā)生發(fā)展機制的闡明、臨床的診斷和治療都具有重要意義。
原發(fā)性肝細(xì)胞癌是人類原發(fā)性肝癌中最常見的一種類型，也是全世界最常發(fā)生的惡性腫瘤之一，尤其在東南亞及非洲，它的發(fā)病率更高。除了極高的發(fā)病率外，肝細(xì)胞癌還以高惡性度和高死亡率著稱，如果不進行治療，從診斷到死亡的預(yù)期壽命約是6個月，5年存活率小于3％；若單純行手術(shù)治療，小肝癌的五年存活率為62.7％，大肝癌的僅為37.1％。就中國而言，每年約有110,000人死于肝癌，占全世界每年肝癌死亡人數(shù)的四分之一。這種高死亡率，主要是由于早期肝癌缺乏特異臨床癥狀，導(dǎo)致大部分患者就診遲，而又缺乏有效治療手段及術(shù)后易復(fù)發(fā)所致。發(fā)病率高、惡性度高、診斷遲、治療方法少、預(yù)后差，是肝癌的幾大特點。盡管國內(nèi)外科研人員都對肝癌進行了多方面的研究，但目前肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機理還不太清楚，對肝癌的治療也主要是采取手術(shù)治療及局部或全身化療，但術(shù)后生存期仍不盡人意。因此，尋求針對肝癌及其它腫瘤的新的免疫治療手段已成為科研工作者義不容辭的責(zé)任。
要進行腫瘤的免疫治療，首先需要得到腫瘤抗原。在二十世紀(jì)的最后十年，隨著免疫學(xué)理論方法和分子生物學(xué)方法的飛速發(fā)展，克隆腫瘤抗原已成為腫瘤免疫研究及治療的重要方面。大量可以誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答的腫瘤抗原的發(fā)現(xiàn)，為腫瘤的免疫治療開辟了新的紀(jì)元。
迄今為止，為了尋找腫瘤特異性或相關(guān)性抗原用于腫瘤的免疫治療，人們已經(jīng)建立了多種方法來分離腫瘤抗原。利用CTL篩選cDNA文庫轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，人們從黑色素瘤中鑒定了第一個腫瘤抗原MZ-D2(由MAGE-A1基因編碼)。十多年來，CTL方法雖然有了許多改進，但其煩瑣的步驟及較長篩選周期，制約了它的廣泛使用。
尋找腫瘤特異組織特異表達的腫瘤-睪丸抗原(cancer-testis antigen，CT)進行腫瘤的免疫治療已成為腫瘤免疫學(xué)的研究熱點。近年來由Pfreundschuh和他的同事們創(chuàng)建的一種新的篩選策略稱為SEREX(Serological Identification of Recombinant Expression Cloing)(Sahin U，etal.Natl Acad Sci U S A.1995 Dec 5；92(25)11810-3)。利用它可以直接鑒定在腫瘤病人體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG抗體應(yīng)答的腫瘤抗原。SEREX方法已經(jīng)在一系列組織類型腫瘤中得到應(yīng)用，包括乳腺癌、黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、星形細(xì)胞瘤、食管癌、小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、惡性間皮瘤、胃癌、胰腺癌和淋巴瘤。通過SEREX方法已鑒定了一些非常有價值的抗原如MAGE-1、HOM-MEL-40、NY-ESO-1、SSX2、SCP-1、CT7、NY-ESO-1和SCP-1。利用NY-ESO-1多肽疫苗進行的晚期黑色素癌病人的臨床治療實驗證實了以上理論。在接受治療的12位病人中，7位為NY-ESO-1血清抗體陰性，5位為陽性；前者經(jīng)疫苗免疫后，4/7的病人發(fā)生了NY-ESO-1多肽疫苗特異性的CTL和CD4+的DTH應(yīng)答，后者雖未檢測到NY-ESO-1特異性T細(xì)胞應(yīng)答的變化，但3/5例病人的病情得到了控制。這些臨床實驗的初步結(jié)果，為腫瘤多肽疫苗的免疫治療提供了希望。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供來源于腫瘤-睪丸抗原HCA587的、能與人類HLA分子結(jié)合的、并能通過殺傷性T淋巴細(xì)胞導(dǎo)致靶細(xì)胞裂解的抗原決定簇多肽及其應(yīng)用。
本發(fā)明進一步提供了編碼上述多肽序列的DNA片段及其應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明提供的一種人的腫瘤-睪丸抗原HCA587上的抗原決定簇多肽，該多肽能與人類HLA分子結(jié)合，并能通過殺傷性T淋巴細(xì)胞導(dǎo)致靶細(xì)胞裂解。
所述的人腫瘤-睪丸抗原HCA587上的抗原決定簇多肽，優(yōu)選為下述九肽序列FLAKLNNTV、TLDEKVAEL、VIWEVLNAV、KVLEFLAKL、VMASESLSV、LLIIILSVI；本發(fā)明的人腫瘤-睪丸抗原HCA587上的抗原決定簇多肽，優(yōu)選為包含一段或幾段下述九肽序列的多肽，該九肽序列為FLAKLNNTV、TLDEKVAEL、VIWEVLNAV、KVLEFLAKL、VMASESLSV、LLIIILSVI；該抗原決定簇多肽是9以上的氨基酸序列，它含有上述6種九肽序列的一種或幾種。
本發(fā)明還提供了編碼人腫瘤-睪丸抗原HCA587上的抗原決定簇多肽的DNA序列。
所述的編碼多肽的DNA序列優(yōu)選為編碼下列多肽序列FLAKLNNTV、TLDEKVAEL、VIWEVLNAV、KVLEFLAKL、VMASESLSV、LLIIILSVI；還優(yōu)選該編碼多肽的DNA序列，所編碼的多肽包含一段或一段以上的選自下列的氨基酸序列FLAKLNNTV、TLDEKVAEL、VIWEVLNAV、KVLEFLAKL、VMASESLSV、LLIIILSVI。
本發(fā)明還進一步提供了所述的抗原決定簇多肽的應(yīng)用。
上述任何一種或多種多肽和佐劑聯(lián)合后制成的多肽疫苗能在腫瘤，如肝癌、黑色素瘤等患者臨床治療中使用。
包含上述任何一種多肽能制備成腫瘤的診斷和預(yù)防試劑。該多肽與人類HLA分子的聚合物、化合物或復(fù)合物(如二聚體、四聚體及八聚體等)聚合，制備成HLA-多肽復(fù)合物試劑，能用于檢測腫瘤病人體內(nèi)針對腫瘤細(xì)胞的特異性應(yīng)答T細(xì)胞，從而評估腫瘤患者的免疫功能狀態(tài)、判斷腫瘤患者的預(yù)后及腫瘤高危人群中的預(yù)防。
本發(fā)明更進一步提供了編碼上述抗原決定簇多肽序列的DNA的應(yīng)用。
作為本發(fā)明的另一部分，即編碼這些多肽的核苷酸序列(亦被稱“mini-genes”)，它們可構(gòu)建在適當(dāng)?shù)谋磉_載體中，在啟動子的作用下進行表達，從而可制備成特異性的基因疫苗，用于腫瘤患者的基因治療。需要指出的是，這些表達序列不僅可包含同一編碼多肽序列的多拷貝重復(fù)，亦可是不同多肽編碼序列的組合。其它任何包含這些編碼多肽序列的重組載體形式、或重組細(xì)胞形式(如真核或原核細(xì)胞)都可作為基因疫苗產(chǎn)品的組成部分，因此都是本發(fā)明需要保護的內(nèi)容。


圖1為HCA587蛋白序列圖2為肝癌患者TIL細(xì)胞對負(fù)載HCA587抗原多肽T2細(xì)胞的殺傷其中1No.1號肽；2No.2號肽；3No.3號肽；4No.4號肽；5No.5號肽；6No.6號肽；7單純T2細(xì)胞對照圖3肝癌患者TIL細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞的殺傷其中1SK-MEL37細(xì)胞系；2NA8-MEL；3單純SK-MEL37細(xì)胞對照；4單純NA8-MEL細(xì)胞對照；5單純TIL細(xì)胞對照具體實施方式
實施例1.CT抗原HCA587的基因發(fā)現(xiàn)過程為了篩選原發(fā)性肝細(xì)胞癌中異常表達的CT抗原，我們利用Stratagene公司的cDNA synthesis Kit、Uni-ZAP XR載體和Gigapack IIIGOLD packaging extract試劑盒，選取了肝細(xì)胞癌患者的組織標(biāo)示進行SEREX方法的篩選。
首先按TRIzol試劑盒(Gibco公司)的操作說明提取肝癌及癌旁組織總RNA，步驟共包括組織勻漿、抽提、RNA沉淀、洗滌和溶解，提取好的RNA以適量的DEPC處理過的超純水溶解沉淀。紫外分光光度計測定樣品的OD260和OD280值，甲醛變性凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量(28S和18S rRNA的比例)。
采用Promega公司PolyATract mRNA分離試劑盒(Promega，Madison，WI)分離mRNA，其基本原理是用帶有親和素的磁珠在磁場的作用下貼壁于管壁的同時，可與生物素化的oligo(dT)結(jié)合，通過oligo(dT)與mRNA3’端的PolyA尾互補雜交使mRNA得到分離純化。操作流程主要包括探針退火、洗滌鏈親和素結(jié)合的磁珠、Oligo(dT)-mRNA雜交體的捕獲、洗滌及mRNA的洗脫，最后用紫外分光光度檢測mRNA的濃度和純度。
肝癌組織cDNA表達文庫的構(gòu)建使用ZAP-cDNA Gigapack III Gold克隆試劑盒。簡言之，模板mRNA為5ug，以GAGA序列+XhoI識別位點序列(CTCGAG)+Poly(dT)18為引物，在MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成第一條cDNA鏈。再以第一條cDNA鏈為模板，以經(jīng)RNaseH酶切的RNA片段為引物，在DNA聚合酶I的作用下合成第二條cDNA鏈。雙鏈cDNA在pfuDNA聚合酶的作用下末端補平，經(jīng)T4連接酶平端連接EcoR I接頭、再經(jīng)Xho I酶切，使雙鏈cDNA的兩端分別形成XhoI和EcoR I的互補序列。經(jīng)SizeSep400 Spun Columns分子篩層析，將酶切的小片段(小于400bp)除去后，將cDNA定向連接在Uni-ZAP XR噬菌體載體上。帶有插入片段的連接載體經(jīng)包裝抽提物包裝成為噬菌體顆粒，最后轉(zhuǎn)化宿主菌XL1-Blue MRF’細(xì)胞，形成初級文庫。
包裝形成的初級文庫經(jīng)滴度和重組效率測定后，以約5×104集落/板的密度接種噬菌體于宿主菌XL1-Blue MRF’，經(jīng)37℃6-8小時生長后，加適量的SM緩沖液4℃孵育過夜，最后收獲形成的噬菌體即為擴增的cDNA文庫。
擴增的文庫加氯仿至終濃度為0.3％(v/v)可于4℃短期儲存；加DMSO至終濃度為7％(v/v)可于-70℃長期保存。
篩選肝癌組織cDNA表達文庫采用的抗體篩選法。同體或異體肝癌病人的血清作為自然抗體的來源。將文庫以SM進行稀釋后與宿主菌XL1-Blue MRF’細(xì)胞混勻鋪板，約104/133cm平板。42℃孵育3.5小時后，蓋上經(jīng)IPTG浸泡后晾干的NC膜，37℃孵育5小時。作好標(biāo)記后將膜取出，TNT漂洗，在封閉液中過夜。加1∶15000稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgG(H+L)二抗，室溫?fù)u動1小時，TNT洗三次，TBS洗兩次，加入BCIP/NBT顯色液顯色。此時顯色的克隆為二抗陽性克隆，用細(xì)針頭在陽性位置扎孔作為標(biāo)記。在此過程中保持NC膜的濕潤。標(biāo)記好的NC膜用大量TBS室溫洗三次，每次15分鐘。加入1∶500稀釋的病人血清，室溫?fù)u動1小時，TNT洗三遍；再加入1∶15000稀釋的二抗，室溫?fù)u動1小時，TNT洗三次，TBS洗兩次，加入BCIP/NBT顯色液顯色。沒有針孔標(biāo)記的陽性噬斑為對病人血清反應(yīng)的陽性克隆。根據(jù)NC膜的定位標(biāo)記挑取瓊脂板上相應(yīng)位置的噬菌斑，加入1ml SM/氯仿噬菌體保存液中。
第一輪挑取的陽性克隆按一定稀釋度稀釋后重新與宿主菌混合鋪板，重復(fù)上述方法進行第二輪篩選。一般經(jīng)過3-4輪篩選，可得到分離良好的單克隆陽性噬菌斑。
取適量的保存在SM緩沖液中的陽性克隆與宿主菌XL1-BlueMRF’及輔助剪切噬菌體混合，加入3ml LB液，37℃孵育2.5～3小時，65～70℃孵育20分鐘，離心后所得上清含有切割后形成的pBluescript噬菌粒。取適量此上清加入到新鮮制備的SOLR菌中，接種LB/AMP板，37℃過夜培養(yǎng)后，取單一菌落，用QIAprep Miniprep試劑盒提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoR I和Xho I酶切，確定插入片段的大小。有相同酶切圖譜的克隆判定為同一基因，不同大小插入片段的克隆由賽百盛公司和上?；倒居肨3、T7或M13引物，在ABI Prism全自動序列測定儀(PerkinElmer)上進行核酸序列測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過數(shù)據(jù)庫相似性搜索，HCA587在核苷酸水平上沒有相似性較高的基因(全序列對比＜85％)，因此它們是一種新的抗原編碼基因。通過RACE方法獲得全長后，經(jīng)Sequenin軟件向DDBJ/EMBL/GenBank申請登錄全長新的cDNA序列，獲取的查詢號為AF151378。
實施例2.HCA587重組蛋白的表達及在腫瘤組織中的分布(1)重組pQE30-HCA587蛋白的表達根據(jù)HCA587的核苷酸序列設(shè)計特異性引物，在上下游引物的5’端分別合成BamHI、HindIII酶切位點，P15’ATCGGATCCCCTCCCGTTCCAGGCGT3’，P25’ACTAAGCTTTCACTCAGAAAAGGAGAC3’，以正常睪丸組織的cDNA為模板，PCR擴增出HCA587全長ORF，PCR產(chǎn)物和pGEM-Teasy載體連結(jié)后，轉(zhuǎn)化DH5a，挑取含正確插入HCA587的陽性克隆，分別用BamHI和HindIII雙酶切HCA587-pGEMT-easy質(zhì)粒和pQE-30載體，電泳后凝膠回收HCA587和pQE-30片段，T4連結(jié)酶過夜連結(jié)后，轉(zhuǎn)化XL-Blue感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒(pQE-30/HCA-587)，酶切鑒定重組載體。取構(gòu)建正確的重組載體轉(zhuǎn)化M15感受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素和卡那霉素抗性篩選為陽性的克隆接種于5ml LB液體培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素和25μg/mL卡那霉素)，37℃過夜培養(yǎng)，然后以1∶100稀釋于200mL LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD＝0.6時，加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續(xù)于37℃振蕩培養(yǎng)4.5h，離心收集細(xì)菌。用細(xì)菌裂解緩沖液懸浮離心收集的細(xì)菌，加入溶菌酶至終濃度0.1mg/ml，室溫放置30min后，超聲破碎，13000rpm離心30min(4℃)，分別收集上清和沉淀。參照Qiagen公司說明書，利用自該公司購買的鎳離子親和層析柱(Ni-NTA)進行親和層析。
純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳的純化蛋白按上述方法電轉(zhuǎn)移至經(jīng)甲醇浸泡后的PVDF膜上，考馬斯亮藍(lán)染色后，50％甲醇脫色至滿意為止，在PE/ABI491測序儀上進行重組蛋白的氨基酸序列測定(HCA587蛋白序列見圖1)。結(jié)果證明，我們已成功獲取重組的HCA587蛋白。Western實驗進一步證實，該重組蛋白能與抗體陽性患者的血清反應(yīng)，說明其具有與天然蛋白相似的結(jié)構(gòu)。
(2)HCA587在腫瘤組織中的分布HCA587重組蛋白100ug和福氏完全佐劑混勻后，皮內(nèi)多點免疫家兔，共進行四次免疫(1次/2周)后，取血后分離免疫血清進行抗體滴度測定，ELISA結(jié)果顯示，抗體滴度達1∶25600，經(jīng)PolyA柱純化IgG后，用免疫組化的方法分析HCA587蛋白在各種正常和腫瘤組織中的蛋白分布。
收集正常組織標(biāo)本和各種腫瘤組織的石蠟和冰凍切片，使用1∶4000稀釋抗體用ABC方法進行組化染色，后經(jīng)DAB顯色，蘇木素復(fù)染后觀察HCA587在組織中的表達情況，結(jié)果可見，HCA587在正常組織中除睪丸和小腦的Pukenji細(xì)胞有表達外，其它組織均為陰性；而在腫瘤組織中HCA587呈不同組織的、不同比例的異源性表達，見表1。
表1.HCA587在腫瘤組織中的表達組織類型 組化染色(陽性數(shù)/總數(shù))黑色素瘤 3/6肺癌 2/11乳腺癌 1/5胰腺癌 2/11淋巴瘤 2/10頭頸部癌 1/4
卵巢癌 1/2精原細(xì)胞癌 1/2前列腺癌0/10腎細(xì)胞癌0/3脂肪肉瘤0/3結(jié)腸癌 0/3尿道膀胱癌 0/3血管瘤 0/1由該表可以看出，HCA587在不同的腫瘤組織中的表達比例不同，這對HCA587多肽免疫應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)作用。
實施例3.T2結(jié)合試驗分析HCA587要誘發(fā)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，首先要求該蛋白被APC細(xì)胞處理后，相應(yīng)多肽和其HLA分子結(jié)合，提呈到細(xì)胞表面。因此，我們首先用Dr.Kenneth Parker發(fā)明的模型(Parker，K.C.，et al.1994.J.Immunol.152163)預(yù)測HCA587蛋白序列中能和HLA-A2結(jié)合的多肽(網(wǎng)址http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)，結(jié)合其它HLA-A2預(yù)測結(jié)合多肽軟件篩選出9個較為可能的HCA587和HLA-A2結(jié)合的抗原多肽，體外用多肽合成儀合成所有的預(yù)測多肽(見表2)，用HPLC進行純化，純度達99％，然合用細(xì)胞系CEMX721.174.T2(簡稱T2)進行HLA-A2結(jié)合試驗。因為，T2細(xì)胞只表達HLA-A2分子，而不能將內(nèi)源性多肽提呈到細(xì)胞表面，因此其是一個理想的細(xì)胞免疫應(yīng)答研究的細(xì)胞系。1×106T2細(xì)胞經(jīng)無血清1640培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)36小時后，加入2μgβ2-微球蛋白5μg，同時加入各種合成的能和預(yù)測HLA-A2結(jié)合的HCA587九肽50μg，其中設(shè)立來源于流感病毒已知和HLA-A2結(jié)合的九肽(序列編號NO.10)(見表2)為陽性對照和不加多肽的陰性對照，37℃培養(yǎng)1 8小時后，用BSS-2％NCS的緩沖液洗滌2遍后，加入B77.2單抗100μl，冰上染色40分鐘后，用BSS-2％NCS的緩沖液再洗2遍后，加入FITC標(biāo)記的二抗進行間接染色，冰上40分鐘后，BSS-2％NCS的緩沖液洗滌后，加入FACS保存液保存，流式分析結(jié)果。
表2. HCA587抗原編碼肽的T2結(jié)合試驗編號 位置 序列 熒光指數(shù)#1317 FLAKLNNTV3.362140 TLDEKVAEL5.623248 VIWEVLNAV3.014313 KVLEFLAKL2.975356 VMASESLSV2.476229 LLIIILSVI2.767228 SLLIIILSV1.408361 SLSVMSSNV1.539190 ELLFGLALI1.3410 Flu68 GILGFVFTL2.96#熒光指數(shù)(肽結(jié)合管平均熒光指數(shù)-二抗對照管平均熒光指數(shù))/(空白管平均熒光指數(shù)-二抗對照管平均熒光指數(shù))由T2結(jié)合試驗可以看出，其中能和T2結(jié)合的HCA587九肽為序列編號No.1-No.6，我們知道，抗原肽引起機體免疫應(yīng)答的前提是其首先能和機體的HLA分子形成復(fù)合體，而上述6種多肽能和T2細(xì)胞表面表達的HLA分子呈現(xiàn)一定的親和結(jié)合能力，說明其可能是HCA587蛋白中能引起特異性免疫應(yīng)答的抗原決定簇。而其余合成肽不能與T2的HLA-A2分子結(jié)合，說明其可能很難誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
實施例4 HCA587多肽在正常人中免疫應(yīng)答的分析能和T2的HLA-A2分子結(jié)合的多肽不一定都能引起機體產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答，下面這一試驗將用ELISPOT分析能引起特異性γ-干擾素產(chǎn)生的CTL的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
取HLA-A2陽性的正常人PBMCs的單核細(xì)胞在含GM-CSF1000u/ml，IL-4 500u/ml及10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)8天，第8天收獲懸浮的樹突狀細(xì)胞(DC)，DC用10μg/ml的T2結(jié)合試驗陽性的HCA587合成九肽及2.5μg/ml β2微球蛋白在無血清RPMI-1640中進行加載，37℃，5％CO22小時，經(jīng)60Coγ射線3000Gy照射，洗去多余的抗原肽后，DC以1×105/孔，加入和陽性磁珠分離的CD8+T細(xì)胞孔，混勻后，在含IL-210u/ml和500U/mlIL-6的10％AB血清1640進行培養(yǎng)，每隔2天換液，一周后，用同樣的方法培養(yǎng)DC后，加載抗原肽，反復(fù)刺激CD8+T細(xì)胞，經(jīng)4次刺激后，收獲CD8+T細(xì)胞進行ELIPOT試驗。
ELISPOT方法檢測CD8+T細(xì)胞被HCA587抗原肽刺激后分泌IFNγ的能力。簡述如下，96孔平底硝酸纖維素板(Millititer，Millipore)用抗人IFNγ單抗(1-D1k；2μg/ml于PH9.6碳酸鹽緩沖液中；MABTECH，德國)包被，4℃過夜；第二天經(jīng)0.05％Tween PBS洗滌后，該板用10％AB血清的1640培養(yǎng)液室溫避光封閉1小時，經(jīng)0.05％Tween PBS洗滌后，每孔加入5×104經(jīng)7天誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞(Effector Cells，E)并分為兩組，即效應(yīng)細(xì)胞與T2細(xì)胞組(E+T2)、效應(yīng)細(xì)胞與T2細(xì)胞加載抗原肽組(E+T2(肽))，每組各做兩復(fù)孔；單純T2細(xì)胞和T2細(xì)胞在含10μg/ml抗原肽的無血清RPMI-1640中，37℃，5％CO2孵育2小時，經(jīng)1000Gy照射，洗去多余的抗原肽后作為刺激細(xì)胞，以1×105/孔加入各效應(yīng)細(xì)胞孔；該反應(yīng)體系在不含細(xì)胞因子及血清的1640培養(yǎng)液中，37℃，5％CO2孵育18-20小時后，用0.05％Tween PBS充分沖洗培養(yǎng)板以去除殘留細(xì)胞；隨后加入生物素標(biāo)記的抗人IFN-γ二抗(0.2μg/ml，7-B6-1-biotin；MABTECH)，在37℃孵育2小時后，洗板，再加入堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素(1μg/ml；MABTECH)在室溫避光孵育1小時；洗板后，加入底物BCIP-NBT顯色液(NCBI，Sigma產(chǎn)品)避光顯色5分鐘，用自來水沖洗，終止反應(yīng)；待反應(yīng)板晾干后，于解剖顯微鏡下計數(shù)每孔呈黑紫色的斑點數(shù)；每組斑點數(shù)均由兩復(fù)孔的平均值得出；抗原特異的CD8+T細(xì)胞頻數(shù)＝(E+T2(肽))組斑點數(shù)-(E+T2)組斑點數(shù)。
結(jié)果在2×104CD8+細(xì)胞中，產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞數(shù)分別為序列編No.173、序列編No.245、序列編No.353、序列編No.466、序列編No.532、序列編No.627。
本試驗說明，正常人在序列編號No.1-No.6的HCA587多肽的反復(fù)刺激下，能在體外成功誘導(dǎo)針對HCA587多肽的特異性細(xì)胞免疫免疫。
實施例5 HCA587多肽在肝癌患者外周血中免疫應(yīng)答的分析在本實驗中，我們將進一步證實，在肝癌病人體內(nèi)存在針對HCA587多肽的特異性免疫應(yīng)答細(xì)胞。
收集HCA587蛋白表達陽性、血清抗體陽性的肝癌患者外周血PBMC，經(jīng)貼壁分離培養(yǎng)DC后，用HCA587合成多肽加載后，刺激經(jīng)陽性磁珠分離的CD8+T細(xì)胞，實驗步驟同實施例4，唯一不同的是，正常人一般需4輪刺激，而肝癌病人我們只刺激1-2次，目的是擴增已對HCA587蛋白產(chǎn)生特異應(yīng)答的CTL細(xì)胞。結(jié)果可見，在肝癌患者體內(nèi)確實存在針對HCA587蛋白的特異性CTL細(xì)胞。
實施例6肝癌患者TIL細(xì)胞對HCA587多肽負(fù)載的T2細(xì)胞的殺傷試驗本實驗分離肝癌患者淋巴結(jié)或腫瘤組織浸潤的淋巴細(xì)胞(TIL)，用51Cr殺傷試驗證實天然存在于患者體內(nèi)的針對HCA587多肽的TIL細(xì)胞。
在無菌條件下將切除新鮮瘤體組織去除壞死部分與結(jié)締組織，用RPMI1640培養(yǎng)液沖洗干凈，移至無菌平皿內(nèi)用手術(shù)剪將腫瘤組織剪碎至1-2mm3小塊，置于3600u DNA酶、50ug膠原酶和125u透明酶的RPMI1640培養(yǎng)液40ml中，混勻并移至有磁棒的無菌三角瓶內(nèi)，于37℃恒溫的磁力攪拌器上攪拌1-2小時。用200目孔徑的不銹鋼濾網(wǎng)將酶消化后的細(xì)胞懸液過濾，以除去未消化好的腫瘤組織塊。經(jīng)1500r/min收集單個細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞2次，將細(xì)胞再懸起，用梯度離心分離TIL細(xì)胞。于無菌管內(nèi)分層放入100％及75％的淋巴細(xì)胞分離液，其上再沿管壁輕輕加入細(xì)胞懸液，經(jīng)2000r/min離心20min，收集100％分離界面上的細(xì)胞為富含TIL細(xì)胞的懸液，再用RPMI 1640培養(yǎng)液將TIL細(xì)胞洗2次，以除去分離液。TIL細(xì)胞在含0.24mM Asn，0.55mM Arg，1.5mM Gln，10％pooled human AB serum，100U/mlIL-2，and 10ng/ml ofIL-7的Iscove′s Dulbecco培養(yǎng)基中生長2-3周。
用標(biāo)準(zhǔn)方法對T2細(xì)胞進行51Cr標(biāo)記，洗滌3遍后，加入10μg/mlHCA587抗原肽及2.5μg/mlβ2微球蛋白的無血清1640，室溫培養(yǎng)1小時后，加入效應(yīng)細(xì)胞TIL，效靶比為30∶1，在37℃5％CO2培養(yǎng)箱中孵育4小時。然后200g離心5分鐘，收獲上清測定放射活性，結(jié)果見圖2。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，序列編號No.1-No.6是較好的HLA-A2限制性的HCA587特異性TIL的刺激劑。
實施例7腫瘤細(xì)胞系的殺傷試驗在本實驗中，用51Cr殺傷試驗證實TIL細(xì)胞(見實施例6)對于表達或不表達HCA587蛋白的HLA-A2腫瘤細(xì)胞系的殺傷能力。
細(xì)胞系NA8-MEL(HLA-A2+，HCA87-)，SK-MEL37(HLA-A2+，HCA587+)被分別用51Cr標(biāo)記，具體步驟參見實施例6。結(jié)果見圖3。顯示，SK-MEL37細(xì)胞系能被TIL細(xì)胞特異性殺傷，而NA8-MEL卻不能被殺傷。這說明TIL細(xì)胞不僅能殺傷外源加載于T2細(xì)胞上的抗原肽，而且能殺傷腫瘤細(xì)胞內(nèi)源提呈的HCA587抗原肽。
libing-sequence(161)SEQUENCE LISTING<110>北京大學(xué)<120>人的腫瘤-睪丸抗原HCA587的抗原決定簇多肽及其用途<130>FPI03161<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>373<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Met Pro Pro Val Pro Gly Val Pro Phe Arg Asn Val Asp Asn Asp Ser1 5 10 15Pro Thr Ser Val Glu Leu Glu Asp Trp Val Asp Ala Gln His Pro Thr20 25 30Asp Glu Glu Glu Glu Glu Ala Ser Ser Ala Ser Ser Thr Leu Tyr Leu35 40 45Val Phe Ser Pro Ser Ser Phe Ser Thr Ser Ser Ser Leu Ile Leu Gly50 55 60Gly Pro Glu Glu Glu Glu Val Pro Ser Gly Val Ile Pro Asn Leu Thr65 70 75 80Glu Ser Ile Pro Ser Ser Pro Pro Gln Gly Pro Pro Gln Gly Pro Ser85 90 95Gln Ser Pro Leu Ser Ser Cys Cys Ser Ser Phe Ser Trp Ser Ser Phe100 105 110Ser Glu Glu Ser Ser Ser Gln Lys Gly Glu Asp Thr Gly Thr Cys Gln115 120 125Gly Leu Pro Asp Ser Glu Ser Ser Phe Thr Tyr Thr Leu Asp Glu Lys130 135 140Val Ala Glu Leu Val Glu Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Glu Ala Glu Glu145 150 155 160Pro Val Thr Glu Ala Glu Met Leu Met Ile Val Ile Lys Tyr Lys Asp165 170 175Tyr Phe Pro Val Ile Leu Lys Arg Ala Arg Glu Phe Met Glu Leu Leu180 185 190Phe Gly Leu Ala Leu Ile Glu Val Gly Pro Asp His Phe Cys Val Phe195 200 205Ala Asn Thr Val Gly Leu Thr Asp Glu Gly Ser Asp Asp Glu Gly Met210 215 220
libing-sequence(161)Pro Glu Asn Ser Leu Leu Ile Ile Ile Leu Ser Val Ile Phe Ile Lys225 230 235 240Gly Asn Cys Ala Ser Glu Glu Val Ile Trp Glu Val Leu Asn Ala Val245 250 255Gly Val Tyr Ala Gly Arg Glu His Phe Val Tyr Gly Glu Pro Arg Glu260 265 270Leu Leu Thr Lys Val Trp Val Gln Gly His Tyr Leu Glu Tyr Arg Glu275 280 285Val Pro His Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg290 295 300Ala His Ser Glu Ser Ile Lys Lys Lys Val Leu Glu Phe Leu Ala Lys305 310 315 320Leu Asn Asn Thr Val Pro Ser Ser Phe Pro Ser Trp Tyr Lys Asp Ala325 330 335Leu Lys Asp Val Glu Glu Arg Val Gln Ala Thr Ile Asp Thr Ala Asp340 345 350Asp Ala Thr Val Met Ala Ser Glu Ser Leu Ser Val Met Ser Ser Asn355 360 365Val Ser Phe Ser Glu370<210>2<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Phe Leu Ala Lys Leu Asn Asn Thr Val1 5<210>3<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Thr Leu Asp Glu Lys Val Ala Glu Leu1 5<210>4<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Val Ile Trp Glu Val Leu Asn Ala Val1 5<210>5<211>9
libing-sequence(161)<212>PRT<213>Homo sapiens<400>5Lys Val Leu Glu Phe Leu Ala Lys Leu1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>6Val Met Ala Ser Glu Ser Leu Ser Val1 5<210>7<211>9<212>PRT<213>Homo sapiens<400>7Leu Leu Ile Ile Ile Leu Ser Val Ile1 權(quán)利要求
1.一種人的腫瘤-睪丸抗原HCA587上的抗原決定簇多肽，該多肽能與人類HLA分子結(jié)合，并能通過殺傷性T淋巴細(xì)胞導(dǎo)致靶細(xì)胞裂解。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽選自下列氨基酸序列FLAKLNNTV；TLDEKVAEL；VIWEVLNAV；KVLEFLAKL；VMASESLSV；LLIIILSVI。
3.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽包含一段或一段以上的選自下列的氨基酸序列FLAKLNNTV；TLDEKVAEL；VIWEVLNAV；KVLEFLAKL；VMASESLSV；LLIIILSVI。
4.一種編碼權(quán)利要求1所述多肽的DNA序列。
5.如權(quán)利要求4所述的DNA序列，其特征在于，該多肽選自下列氨基酸序列FLAKLNNTV；TLDEKVAEL；VIWEVLNAV；KVLEFLAKL；VMASESLSV；LLIIILSVI。
6.如權(quán)利要求4所述的DNA序列，其特征在于，該多肽包含一段或一段以上的選自下列的氨基酸序列FLAKLNNTV；TLDEKVAEL；VIWEVLNAV；KVLEFLAKL；VMASESLSV；LLIIILSVI。
7.一種權(quán)利要求1所述的多肽在制備治療腫瘤的多肽疫苗中的應(yīng)用。
8.一種權(quán)利要求1所述的多肽在制備腫瘤的診斷和預(yù)防試劑中的應(yīng)用。
9.一種權(quán)利要求1所述的DNA序列在制備治療腫瘤的基因疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人的腫瘤－睪丸抗原HCA587上的抗原決定簇多肽，該多肽及其衍生物能與人類HLA分子結(jié)合，并能通過殺傷性T淋巴細(xì)胞導(dǎo)致靶細(xì)胞裂解。本發(fā)明進一步公開了這些抗原肽及其衍生物在肝癌及其它腫瘤的治療、診斷和預(yù)防中的應(yīng)用。
文檔編號A61P35/00GK1621414SQ200310116838
公開日2005年6月1日 申請日期2003年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月28日
發(fā)明者陳慰峰, 李兵, 王月丹 申請人:北京大學(xué)